CN108066762B - Glp-1受体激动剂类药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及胰高血糖素样肽‑1(GLP‑1)受体激动剂在制备治疗或预防患者罹患的肿瘤的药物中的用途；GLP‑1受体激动剂在制备治疗或预防伴癌糖尿病的药物中的用途。本发明涉及GLP‑1受体激动剂，特别是艾塞那肽‑4具有显著增高细胞毒性T细胞，降低调节性T细胞，最终提高细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例的调节机制，并显著提高Th1型炎性细胞因子IFN‑γ和IL‑2的分泌水平。从而能够显著抑制免疫缺陷或低下的患者，特别是2型糖尿病患者体内的肿瘤。本发明还涉及GLP‑1受体激动剂在制备增加患者免疫力的药物中的用途。

Description

GLP-1受体激动剂类药物的用途

技术领域

本发明涉及高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂用于治疗或预防患有免疫缺陷类疾病的患者所患癌症的用途，胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备治疗或预防伴癌糖尿病的药物中的用途，胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备增加患者免疫力的药物中的用途。

背景技术

糖尿病是威胁人类健康的三大疾病之一，发病率极高，且呈逐年上升趋势，其显著临床症状是血和尿中的葡萄糖含量超出正常范围，伴随“三多一少”即多食、多饮、多尿及消瘦。其中II型糖尿病患者占90％以上。长期以来人们主要通过磺酰脲类和双胍类等药物来治疗糖尿病，但这些药物副作用较大，长期使用会导致胰腺β细胞衰竭。

人体内分泌一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)。GLP-1是胰高血糖素原基因经组织特异性的翻译后加工得到的30个氨基酸长的肽类激素。GLP-1通过多种途径产生降低体重的作用，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌，抑制食欲及摄食，延缓胃内容物排空。此外，GLP-1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)，从而使人体产生饱胀感和食欲下降。除此之外，GLP-1还具有许多其他生物学特性及功能，例如，GLP-1可能发挥降脂、降压作用，从而对心血管系统产生保护作用；它还可通过作用于中枢增强学习和记忆功能，保护神经。

GLP-1可以在血糖较高时通过与GLP-1受体结合来刺激胰岛素分泌，从而降低血糖。但GLP-1在体内会迅速被二肽基肽酶IV(DPP-IV)降解失活，其半衰期不足2分钟，所以限制了其临床应用。为了克服这一问题，研究人员开发了GLP-1受体激动剂和DPP-IV的抑制剂来分别抵制和降低上述活性。

近年来，对GLP-1受体激动剂，例如GLP-1类似物艾塞那肽-4(Exendin-4)的研究进展较快，应用于治疗糖尿病的效果较好。天然艾塞那肽-4存在于美洲一种毒蜥的唾液中，是一种含有39个氨基酸的多肽(其序列为HGEGTFTSDLSKQMEEEAVRLFIEWLKNGGPSSGAPPPS)，分子量约4.186kD。已知，艾塞那肽-4的生理功能主要包括：(1)促进胰岛素的分泌，抑制胰高血糖素的释放，从而达到降血糖效果；(2)通过减缓胃肠道的蠕动，使食物的吸收减慢，从而降低食物中的葡萄糖在血液中出现的高峰；(3)减缓胃肠道蠕动，增加饱足感，使人食欲下降，从而减轻体重；(4)刺激胰岛细胞增殖，抑制β细胞凋亡，从而增加胰岛β细胞数量；(5)增加外周组织对胰岛素的敏感性(Meier,2012)。此外，艾塞那肽-4的促胰岛素分泌作用依赖于葡萄糖浓度，用于糖尿病治疗时不会引起低血糖，因而在II型糖尿病治疗方面有较好的应用前景。艾塞那肽-4(Exenatide)是2005已经在美国获批的用于治疗糖尿病的药物。此外，目前也有多项研究证明艾塞那肽-4在多种人体组织中具有抗氧化应激及抗炎作用(Leeet al.,2012,Chen et al.,2013)。

另外，糖尿病常常引发全身多种失调，并导致多种并发症，其中癌症已经变成糖尿病患者中导致死亡的主要原因。糖尿病患者罹患癌症后使用常规的抗癌药往往会导致糖尿病患者病情加重。一方面，化疗会严重破坏患者的血糖水平，单一的放、化疗，会抑制、降低病人的免疫功能，会破坏甚至摧毁病人的免疫功能，将加速中晚期病人的死亡。而广泛用于缓解癌症患者恶心的糖皮质激素药物将促进胰岛素抵抗，这导致了糖尿病的病情加重。而另一方面，众所周知，胰岛素虽然是体内调节血糖的重要荷尔蒙，但是体内过高浓度的胰岛素却有可能增加癌细胞增生，减少癌细胞凋亡，从而促进恶性肿瘤产生。

也有研究利用治疗糖尿病的药物，例如艾塞那肽-4、二甲双胍等，来治疗癌症，然而对其抗癌效果的结论极不统一，有文章报道在体外实验和裸鼠模型中，艾塞那肽-4可以降低肠癌，乳腺癌和前列腺癌的生长(Nomiyama et al.,2014,Koehler and Drucker,2006,Koehler et al.,2011)。然而，也有的文章认为这类药物反而具有促癌作用。例如有研究发现胰高血糖素和艾塞那肽-4均可以刺激胰岛β细胞的增殖和再生(Tourrel et al.,2001)。更为有意思的是，艾塞那肽-4还被发现可促进肠道肿瘤块的大小和数量(Koehleret al.,2015)。因此，有必要进一步研究这些药物对肿瘤生长的作用，并研究其抗/促癌机制。

因而，仍然存在明确常规使用的治疗糖尿病的药物对患有癌症的糖尿病患者的使用存在的潜在的毒副作用以及相关机制的需求；同时仍然存在寻求适于糖尿病等免疫缺陷或免疫低下患者使用的有效的抗癌药物的需求。

发明内容

针对上述问题，本发明建立了荷瘤糖尿病小鼠模型，并基于该小鼠模型系统研究了降糖药胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，例如艾塞那肽-4和双胍类药物例如二甲双胍对荷瘤糖尿病小鼠癌细胞的作用，并意想不到地揭示了二者不同的作用机制。

根据本文以下将详述的实施例，出乎发明人的意料，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂例如艾塞那肽-4能够引起特异性的肿瘤免疫应答，伴随有细胞毒性T细胞和调节性T细胞比例的增高，以及对肿瘤生长的明显抑制；而同样令人意外的是，双胍类药物例如二甲双胍显示出免疫负调节的作用，伴随有细胞毒性T细胞和调节性T细胞比例的降低，并且有明显的促进肿瘤生长的负面效果。

因此，本发明第一方面的目的在于提供GLP-1受体激动剂在制备治疗或预防患者罹患的肿瘤的药物中的用途，其中所述患者的肿瘤免疫细胞的功能缺陷或低下。

所述GLP-1受体激动剂为选自以下组中的至少一种：艾塞那肽(Exenatide)、利西拉肽(Lixisenatide)、利拉鲁肽(Liraglutide)、阿必鲁泰(Albiglutide)、度拉糖肽(Dulaglutide)、他司鲁肽(Taspoglutide Acetate)和艾塞那肽(Exendin-4)。优选为艾塞那肽-4。

本发明所针对的患者具体是糖尿病患者、HIV患者、接受化学治疗的患者和/或使用免疫抑制剂的患者。特别是糖尿病患者，更特别是II型糖尿病患者。

本发明中，除非特别指明，糖尿病指I型糖尿病和II型糖尿病。

根据本发明的一个实施方式，所述罹患的肿瘤由选自病毒、细菌和其他病原体(如寄生虫)，以及炎症性肠疾病中至少一种诱发的肿瘤。

目前已知有多种病原体具有高概率的诱发癌症的作用。这些病原体例如但不限于：病毒，如：人类疱疹病毒(EBV)、乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)、人类乳头瘤病毒(HPV)、人类T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、人类疱疹病毒第8型(HHV8)等；细菌，如：幽门螺旋杆菌；其他诸如寄生虫的病原体，如：肝吸虫、血吸虫等。

根据本发明的一个实施方式，所述罹患的肿瘤是HPV诱发的肿瘤。

根据本发明的具体实施方式，所述罹患的肿瘤选自如下组中的至少一种：HPV诱发的宫颈癌，EBV诱发的鼻咽癌，HBV和/或HCV诱发的肝癌，HCV引起的非何奇金式淋巴瘤，HTLV-1病毒引发的T细胞白血病，HHV8引起的卡波西肉瘤，肝吸虫、血吸虫所引发的胆管癌，幽门螺旋杆菌诱发的胃癌，和炎症性肠疾病引起的肠癌。

本发明第二方面的目的在于提供胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备治疗或预防伴癌糖尿病的药物中的用途，所述伴癌糖尿病优选为伴癌的II型糖尿病。

术语“伴癌糖尿病”指糖尿病患者同时患有肿瘤/癌症或存在明确的患肿瘤/癌症风险。

明确的患癌风险例如，但不限于：家族史，基因突变，被病毒、细菌和/或寄生虫等病原体感染，患有炎症性疾病，长期吸烟史，从事高患癌风险的职业，居住在高患癌比例的地区等等。

根据本发明的一个实施方式，所述伴癌糖尿病尤其为伴有由选自病毒(如人类疱疹病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、人类T淋巴细胞病毒、人类疱疹病毒第8型)、细菌(如幽门螺旋杆菌)和其他病原体(如肝吸虫，血吸虫等)中至少一种诱发的肿瘤或有患肿瘤风险的糖尿病；更尤其为人类乳头瘤病毒诱发的肿瘤或有患肿瘤风险的糖尿病。

根据本发明的一个实施方式，明确的患癌风险尤其是指被病原体(这些病原体例如但不限于：病毒，如：人类疱疹病毒EBV、乙型肝炎病毒HBV和丙型肝炎病毒HCV、人类乳头瘤病毒HPV、人类T淋巴细胞病毒HTLV-1病毒、人类疱疹病毒第8型HHV8等；细菌，如：幽门螺旋杆菌；其他诸如寄生虫的病原体，如：肝吸虫、血吸虫等)感染以及患有炎症性肠病症。尤其指受HPV感染的糖尿病患者。

根据本发明的更具体的实施方式，所述伴癌糖尿病优选为伴有选自由人类乳头瘤病毒诱发的宫颈癌，人类疱疹病毒诱发的鼻咽癌，乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒诱发的肝癌，丙型肝炎病毒引起的非何奇金式淋巴瘤，人类T淋巴细胞病毒引发的T细胞白血病，人类疱疹病毒第8型引起的卡波西肉瘤，肝吸虫、血吸虫所引发的胆管癌、幽门螺旋杆菌诱发的胃癌，和炎症性肠疾病引起的肠癌所组成组中的至少一种癌症或有患癌症风险的糖尿病。

本发明第三方面的目的在于提供胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂在制备增加患者免疫力的药物中的用途，其中所述患者为糖尿病患者、HIV患者、接受化学治疗的患者和/或使用免疫抑制剂的患者。

根据本发明的一个实施方式，所述增加患者免疫力是增加细胞毒性T细胞的数量，降低调节性T细胞的数量，和/或导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例增加中的一种、任意两种或三种同时获得的作用，和/或炎性细胞因子(诸如IFN-γ和IL-2)的分泌水平增加。

特别地，所述增加患者免疫力是增加细胞毒性T细胞的数量，降低调节性T细胞的数量，和/或导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例增加。根据本发明更具体的实施方式，与所述GLP-1受体激动剂给药前相比，所述GLP-1受体激动剂的给药使所述细胞毒性T细胞的数量增加约2～20％、优选约8～15％，使调节性T细胞的数量下降约2～10％、优选约4～8％，并且使细胞毒性T细胞和调节性T细胞的数量的比例增加1.6～3.0、优选2.1～2.5。

根据本发明的实施方式，所述GLP-1受体激动剂进一步使炎性细胞因子增加和/或使抑制性细胞因子降低。特别地，所述GLP-1受体激动剂使炎性细胞因子IFN-γ和IL-2增加，和/或使抑制性细胞因子IL-10降低。

根据本发明更具体的实施方式，与所述GLP-1受体激动剂给药前相比，所述GLP-1受体激动剂的给药使炎性细胞因子IFN-γ增加约500～1300pg/ml、优选约700～1000pg/ml，使炎性细胞因子IL-2增加约500～1500pg/ml、优选约800～1000pg/ml，和/或使抑制性细胞因子IL-10降低约150～300pg/ml、优选约200～250pg/ml。

根据本发明的优选实施方式，所述增加患者免疫力是增加细胞毒性T细胞的数量，降低调节性T细胞的数量，和/或导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例增加；同时使炎性细胞因子IFN-γ和IL-2增加和/或使抑制性细胞因子IL-10降低。

具体的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂如以上在第一方面中所详述。

本发明中提及的糖尿病患者、HIV患者、接受化学治疗的患者和/或使用免疫抑制剂的患者，因其免疫系统功能低下或缺陷，因而与健康人群相比，更易于罹患癌症，特别是在以上第一方面中详述的由病毒、细菌、诸如寄生虫的其他病原体以及炎性病症诱导的癌症。

在以下将详述的实施例中，本发明人意外地观察到诸如艾塞那肽-4的GLP-1受体激动剂具有显著的抑制荷瘤糖尿并小鼠的肿瘤生长的作用。通过进一步的免疫学研究，观察到艾塞那肽-4引起特异性的肿瘤免疫应答，从而首次清楚地揭示了诸如艾塞那肽-4的GLP-1受体激动剂的免疫调节机制，尤其是针对免疫低下或缺陷患者，对癌症的免疫调节机制。并同时首次从免疫学的角度揭示了诸如二甲双胍的双胍类降糖药物对癌症的负面作用机制。为糖尿病等免疫低下或缺陷的癌症患者的用药提供了明确的选择方案，并提供了可实现的有效治疗方案。

因此，本发明第四方面的目的还在于提供双胍类药物在制备治疗或预防无癌糖尿病的药物中的用途。所述无癌糖尿病优选为无癌的II型糖尿病。

术语“无癌糖尿病”指未同时患任何癌症的糖尿病，或没有任何明确的患癌风险的糖尿病。

明确的患癌风险如以上第二方面所定义。

根据本发明的一个实施方式，所述无癌糖尿病尤其为没有伴有由选自病毒(如人类疱疹病毒、乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒、人类乳头瘤病毒、人类T淋巴细胞病毒、人类疱疹病毒第8型)、细菌(如幽门螺旋杆菌)和其他病原体(如肝吸虫，血吸虫等)中任一种诱发的肿瘤或肿瘤风险的糖尿病；更尤其为没有人类乳头瘤病毒诱发的肿瘤或没有患肿瘤风险的糖尿病。

根据本发明的更具体的实施方式，所述无癌糖尿病优选为没有伴有选自由人类乳头瘤病毒诱发的宫颈癌，人类疱疹病毒诱发的鼻咽癌，乙型肝炎病毒和/或丙型肝炎病毒诱发的肝癌，丙型肝炎病毒引起的非何奇金式淋巴瘤，人类T淋巴细胞病毒引发的T细胞白血病，人类疱疹病毒第8型引起的卡波西肉瘤，肝吸虫、血吸虫所引发的胆管癌、幽门螺旋杆菌诱发的胃癌，和炎症性肠疾病引起的肠癌所组成组中的任一种癌症或没有患癌症风险的糖尿病。

根据本发明的实施方式，还提供双胍类药物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的用途，该药物不用于罹患肿瘤的糖尿病患者，即禁止双胍类药物用于罹患肿瘤的糖尿病患者。

所述双胍类药物为二甲双胍、苯乙双胍、丁二胍中的至少一种，优选为二甲双胍。

由于本发明揭示的双胍类药物对特异性的癌症免疫的负调节作用，因而对于免疫低下或缺失型癌症有显著的促癌作用。作为安全且有效的治疗糖尿病，特别是II型糖尿病的传统药物，到目前为止，并未揭示出二甲双胍的免疫调节机制，以及由此带来的对癌症患者的毒副作用。因而，双胍类药物应排除在癌症糖尿病患者的用药考虑之外。

本发明关于双胍类药物的所述用途在于所述双胍类药物对患癌的糖尿病人，特别是非胰岛素依赖的糖尿病人的禁用。

根据一个实施方式，提供双胍类药物在制备治疗或预防糖尿病的药物中的用途，其中所述制备包括提供糖尿病药物说明书以载明所述双胍类药物的促癌副作用和/或针对特异性癌症免疫应答的负调节作用。

其中所述促癌副作用是指与不使用双胍类药物相比，对癌症的发生和/或发展无任何抑制和/或减缓的作用，或者甚至具有促进和/或加速癌症的发生和/或发展的作用。例如，加速肿瘤的增殖。

所述针对特异性癌症免疫应答的负调节作用是指降低细胞毒性T细胞的数量，增加调节性T细胞的数量，和/或导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例降低中的一种、任意两种或三种同时获得的作用；和/或炎性细胞因子(诸如IFN-γ和IL-2)的分泌水平增加。

所述针对特异性癌症免疫应答的负调节作用是尤其指导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例降低；更尤其指降低细胞毒性T细胞的数量和/或增加调节性T细胞的数量，导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例降低。

特别地，根据本发明更具体的实施方式，与所述双胍类药物给药前相比，所述双胍类药物的给药使所述调节性T细胞的数量增加约4.0～15.7％、优选约7.3～11.5％，和/或使细胞毒性T细胞和调节性T细胞的数量的比例降低0.2～0.6、优选0.3～0.4。

根据本发明的实施方式，所述双胍类药物进一步使炎性细胞因子降低和/或使抑制性细胞因子增加。特别地，所述双胍类药物使炎性细胞因子IFN-γ和IL-2降低和/或使抑制性细胞因子IL-10增加。

根据本发明更具体的实施方式，与所述双胍类药物给药前相比，所述双胍类药物的给药使抑制性细胞因子IL-10增加约303.8～687.8pg/ml、优选约327.8～469.8pg/ml。

根据本发明的优选实施方式，所述针对特异性癌症免疫应答的负调节作用是增加调节性T细胞的数量，和/或导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例降低；同时使抑制性细胞因子IL-10增加。

根据另一个实施方式，本发明提供双胍类药物在制备用于对无癌糖尿病患者治疗或预防糖尿病的药物中的用途。

其中，本文所述的无癌糖尿病患者是指未患有任何癌症或无潜在患癌风险的糖尿病患者，特别是II型糖尿病患者。

根据本发明的一个实施方式，无癌糖尿病患者尤其是指未被诊断患有由病毒、细菌、诸如寄生虫的其他病原体以及炎症性肠病症诱导的肿瘤(所述肿瘤如在第一方面中所详述的)。更尤其是未被诊断患有由HPV诱发的肿瘤。

根据本发明的具体实施方式，无癌糖尿病患者具体是指未被诊断患有选自如下组中的任何一种癌症：HPV诱发的宫颈癌，EBV诱发的鼻咽癌，HBV和/或HCV诱发的肝癌，HCV引起的非何奇金式淋巴瘤，HTLV-1病毒引发的T细胞白血病，HHV8引起的卡波西肉瘤，肝吸虫、血吸虫所引发的胆管癌，幽门螺旋杆菌诱发的胃癌，和炎症性肠疾病引起的肠癌。

无潜在患癌风险的糖尿病患者是指不存在明确的患癌风险的糖尿病患者，尤其是II型糖尿病患者。

明确的患癌风险如以上第二方面所定义。

根据本发明的一个实施方式，无潜在患癌风险的糖尿病患者尤其是指未被如上定义的病原体感染以及无炎症性肠病症的糖尿病患者。本发明通过系统研究，出乎意料地发现虽然二甲双胍和艾塞那肽-4对于血糖水平都具有明显的降低作用，但是艾塞那肽-4可在降低患者血糖的同时，显著增高细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例，从而显著抑制肿瘤的生长；而二甲双胍具有相反的免疫调节机制，其降低细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例，显示出促肿瘤生长的作用，因此罹患肿瘤的糖尿病患者应禁用二甲双胍，二甲双胍仅适用于未患癌和/或没有患癌风险的糖尿病患者。

因此，本发明揭示并证实了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，例如艾塞那肽-4能够显著抑制免疫缺陷或低下患者(尤其是糖尿病患者)的肿瘤。由于GLP-1受体激动剂，如艾塞那肽-4已经在美国被批准用于糖尿病的治疗，因此与对糖尿病患者可引起较强副作用的常规化疗药物相比，可同时治疗糖尿病及抑制/缩小肿瘤的艾塞那肽-4具有显著优势。

附图说明

通过参考附图对下列优选实施方式的描述，本发明的特征和优点将更加明显，并将显示出本发明其它的特征和优点。在附图中：

图1.示出了Cup-1肿瘤细胞系在糖尿病小鼠体内的致肿瘤性的检测结果。图1分别示出了在5周龄、10周龄和20周龄的db/db糖尿病小鼠和m+/db对照组小鼠颈部接种Cup-1细胞后，肿瘤移植物的生长曲线。在皮下注射2×10⁷Cup-1细胞到小鼠颈部后，每两天检测一次肿瘤组织的长和短径。每个点代表的是均值±标准误差(n＝10)。*,

糖尿病组和对照组比较。

图2.示出了经艾塞那肽-4和二甲双胍对糖尿病荷瘤小鼠治疗后对肿瘤生长的影响。其中，雄性糖尿病小鼠和对照组小鼠皮下注射2×10⁷Cup-1细胞后建立模型后，腹腔内注射艾塞那肽-4(10或30nM/kg)或PBS，合共13天(A、C、E、G)，经口灌胃二甲双胍(250或400mg/kg)或PBS，合共13天(B、D、F、H)。每两天测一次肿瘤大小并计算肿瘤体积。图2中分别示出了肿瘤生长曲线(A,B)和曲线下面积的柱状图(C,D)；经艾塞那肽-4/二甲双胍处理13天后切下来的肿瘤的照片(E,F)；以及切下来的肿瘤重量(n＝10)(G,H)；(I)示出了糖尿病荷瘤小鼠经药物处理的时间表。各数据用均值±标准误差来显示。Ex-4 30和Ex-4 10代表荷瘤鼠经过不同浓度(10或30nM/kg体重)的艾塞那肽-4的处理；Met 250和Met 400代表荷瘤鼠经过不同浓度(400或250mg/kg体重)的二甲双胍的处理。**p<0.05，**^#p<0.01，和各自的对照组(PBS处理组)比较。

图3.示出了艾塞那肽-4和二甲双胍对db/db和m+/db糖尿病荷瘤小鼠的血糖水平的影响的结果图。向接种了2×10⁷Cup-1细胞的雄性db/db和db/m+小鼠，每日腹腔内注射艾塞那肽-4(10或30nM/kg体重)、经口灌胃二甲双胍(400或250mg/kg体重)，均以PBS为对照。A、D分别示出艾塞那肽-4/二甲双胍组每隔一天测量的随机血糖水平曲线图；B、E分别示出在艾塞那肽-4/二甲双胍处理第9天进行OGTT的血糖水平曲线图；C、F分别示出B、E中血糖的AUC值的柱状图。各数据表示为均值±标准误差。Ex-4 30表示经30nM/kg体重的艾塞那肽处理的小鼠；Ex-4 10表示经10nM/kg体重的艾塞那肽处理的小鼠。Met 400表示经400mg/kg体重的二甲双胍处理的小鼠；Met 250表示经250mg/kg体重的二甲双胍处理的小鼠。**p<0.05，**^#p<0.01，和各自的对照组(PBS处理组)比较(n＝10)。

图4.示出了艾塞那肽-4和二甲双胍处理后，糖尿病荷瘤小鼠的抗肿瘤T细胞和调节性T细胞(T_reg)免疫应答反应的结果图。雄性糖尿病小鼠和对照组小鼠皮下注射2×10⁷Cup-1细胞建立模型后，腹腔内注射艾塞那肽-4(10或30nM/kg)，合共13天；经口灌胃二甲双胍(250或400mg/kg)，合共13天。各组均以PBS为对照。13天后处死小鼠，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液，使用荧光抗体进行染色。A、D分别示出经艾塞那肽-4/二甲双胍处理后，通过将脾脏中的IFN-γ⁺CD⁸⁺T细胞的总数除以CD⁴⁺Foxp3⁺T细胞的总数，得到CD⁸⁺/T_reg比率的图。B、E分别示出经艾塞那肽-4/二甲双胍处理后，IFN-γ⁺CD⁸⁺T细胞占脾脏中总CD³⁺T细胞的百分比图。C、F分别示出经艾塞那肽-4/二甲双胍处理后，T_reg占脾脏中的总CD⁴⁺T细胞的百分比图。图中的各点代表单只小鼠相应的数值(来自两次实验，6～10只小鼠/组)。G示出对经艾塞那肽-4和二甲双胍处理的荷瘤小鼠中的肿瘤特异性CD⁸⁺T淋巴细胞进行免疫荧光染色的代表性照片。对从艾塞那肽-4(30nM)和二甲双胍(400mg/kg)处理的小鼠获得的肿瘤的CD⁸⁺T细胞(红色)进行染色。放大倍数：×200。使用单因素ANOVA来计算统计学显著性。*p<0.05，**p<0.01，和各自的对照组(PBS处理组)比较。

图5.示出了不同剂量的艾塞那肽-4和二甲双胍诱导E7-特异性细胞毒性T细胞免疫反应效应结果图。雄性糖尿病小鼠和对照组小鼠皮下注射2×10⁷Cup-1细胞建立模型后，腹腔内注射艾塞那肽-4(10或30nM/kg)，合共13天；并经口灌胃二甲双胍(250或400mg/kg)，合共13天；均以PBS为对照。13天后处死小鼠，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液。收集效应细胞(脾细胞)和目标靶细胞(Cup-1细胞)以不同比例(如5:1，15:1和45:1)混合进行细胞毒性实验。裂解的比率可用以下公式来详细计算：100×(A-B)/(C-D)，A是实验效应细胞的信号值，B是效应细胞的自发背景荧光值，C是目标靶细胞最大信号值，D是目标靶细胞的自发背景荧光值。结果用细胞毒性比率±标准误差来表示。*p<0.05(n＝10)。

图6.示出了经艾塞那肽-4和二甲双胍处理后的糖尿病荷瘤小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子的释放水平的结果图。雄性糖尿病小鼠和对照组小鼠皮下注射2×10⁷CUP-1细胞建立模型后，腹腔内注射艾塞那肽-4(10或30nM/kg)，合共13天；经口灌胃二甲双胍(250或400mg/kg)，合共13天；均以PBS为对照。13天后处死小鼠，无菌取出脾脏，制成单细胞悬液。图6中分别示出了IFN-γ(A，E)、IL-2(B，F)、IL-4(C，G)、IL-10(D，H)在经PHA(植物血凝素)刺激(10μg/mL)后的细胞培养上清液中的水平的图。各数据以均值±标准误差显示，**p<0.05(n＝10)。

图7.示出了艾塞那肽-4对HCT116直肠癌细胞增殖的影响的柱状图。收集20名糖尿病病人和健康献血者的外周血20毫升，分离外周血单核细胞(PBMC)。再加入PHA(1ug/mL)和LPS(脂多糖)(2ug/mL)，阴性对照不加艾塞那肽-4，在CO₂培养箱分别培养48小时，收集PBMC培养上清液。取出各组上清液与HCT116肿瘤细胞株共培养，MTT法检测肿瘤细胞株HCT116癌细胞株的增殖水平(OD值表示)。各数据以均值±标准误差显示，**p<0.05(n＝10)。

具体实施方式

II型糖尿病(T2DM)和癌症都是以多重病因、多重机制和多种表型为特征的复杂疾病的典型例子。有学者认为T2DM与所有部位患癌症(除前列腺癌之外)的风险增加相关，但是对其潜在的机制知之甚少，可能通过多种激素(胰岛素、胰岛素样生长因子1/IGF1、脂肪因子)、免疫学通路(炎症)或代谢(高血糖)通路来介导。

T细胞在对肿瘤细胞的免疫监视以及肿瘤消除方面起着很重要的作用。癌症生物学中，已经证明存在免疫应答的调节异常，特别是细胞介导的免疫力的调节异常，其以具有免疫抑制性质的Th2辅助细胞释放抑制性细胞因子和调节性T细胞(T_reg)增高为特征。另一方面，Th1辅助细胞，例如CD⁸⁺T细胞在抑制肿瘤生长的过程中起作用。在与病毒抗原相关的肿瘤中，特异性CD⁸⁺T细胞的活性增加被认为是宿主介导的抗肿瘤应答，其中特异性CD⁸⁺T细胞的活性增加以Th1细胞释放的促炎性细胞因子所介导的溶细胞(CTL)活性增加为特征。在患上皮性卵巢癌的患者中，CD³⁺CD⁴⁺T细胞(T_reg)亚群数量和/或功能增高引起肿瘤浸润，从而导致卵巢癌患者的存活率降低相关。在患肝细胞癌且经历了切除手术的患者中，瘤内高数量的活化CD⁸⁺细胞毒性细胞(CTL)及低数量的T_reg预示着整体存活率较高和无肿瘤生存率的延长(Gao et al.,2007,Curiel et al.,2004)。

糖尿病常常伴随肥胖和轻度感染，造成以炎症和糖脂毒性为特征的微环境，很多学者认为这种微环境可能促进癌症生长。糖尿病可引起非特异和特异性免疫应答失调(Geerlings and Hoepelman,1999)。慢性高血糖可激活炎症和细胞周期之间关联的信号传导途径，最后导致细胞生长的失调(Rao Kondapally Seshasai et al.,2011)。目前比较多的证据显示恶性肿瘤可吸引调节性T细胞(T_reg)到肿瘤组织附近以抑制效应性细胞毒性T细胞的对肿瘤的直接杀伤功能。在体内实验中，使用CD25单抗来清除抑制性T细胞可增强抗肿瘤T细胞免疫应答，并可导致肿瘤消退(Onizuka et al.,1999)。另外，免疫应答受损的病人(例如糖尿病病人)更易于发生HPV相关疾病(Scott et al.,2001)。本发明人和其他研究者报道了在患II型糖尿病的患者体内，无论是否有并发症，均存在炎性细胞因子的异常活化。由此推测有缺陷的细胞免疫应答和炎性介质(诸如细胞因子)的变化有可能解释了糖尿病和癌症之间存在共同的发病机理(Lee et al.,2010)。所有这些有关证据均显示糖尿病和癌症之间的紧密联系(Gao et al.,2007)。

最近，几篇研究暗示了II型糖尿病与患宫颈癌和口咽癌的风险增加相关，而宫颈癌和口咽癌往往都与人类乳头瘤病毒(HPV)感染相关(Liu et al.,2015,Navarro-Meza etal.,2011,Lee et al.,2010)。高危品种的人类乳头瘤病毒(HPV)与很多肿瘤疾病的发生发展密切相关，包括宫颈癌，口咽癌，肛门癌，阴道癌，阴茎癌和肛门癌。Navarro-Meza等人揭示了高血糖促进HPV感染，并且可能是宫颈癌前病变发展为宫颈癌的风险因素(Navarro-Meza et al.，2011)。此外，在患II型糖尿病的西班牙和日本女性中，宫颈癌的发病率升高。而且，在墨西哥进行的基于横断面人群的研究中也揭示出了类似的结果。患II型糖尿病的女性发展成宫颈癌的风险显著增加(OR＝2.34；95％CI:1.51-3.62)。另外，糖尿病病人生殖道疣的发生更广泛，而且疾病的复发率也明显高于非糖尿病人群，其中生殖道疣也与HPV感染相关。尽管流行病的观察指出糖尿病可能促进HPV的致病率，其分子生物学的机制却还未清楚及等待确认。

已经明确了HPV(特别是HPV-16和HPV-18)在导致人类癌症中的因果作用。慢性HPV感染几乎是导致所有宫颈癌、30～60％的口咽癌和约40％的阴道、外阴和肛门癌的原因。其致病的病理学机制已经被广泛研究并已证明HPV E7就是该病毒导致肿瘤的肿瘤促癌基因之一，即是肿瘤相关抗原。另外，在HPV感染相关的宫颈癌患者血清中，炎症细胞因子例如TNF-α、IL-1α和IL-6水平升高(Castle et al.,2001,Salard et al.,1998)，这表明患者体内存在全身系统性炎症。

虽然HPV可能引起了肿瘤形成，但宿主/环境的辅助因素的存在对于癌症的充分发展也是必需的。有趣的是，尽管高危人类乳头瘤病毒的感染很常见，但只有一小部分的感染个体最终成癌。毫无疑问，与宿主本身的因素和其他环境因素的交叉反应最终决定HPV导致肿瘤的多级步骤。

如上文所述，虽然也有研究利用治疗糖尿病的药物，例如艾塞那肽-4、二甲双胍等，来治疗癌症，然而对其抗癌效果的结论极不统一，如前述背景技术部分所述有的文章认为这类药物反而具有促癌作用。

另外，目前积累的证据均显示二甲双胍与糖尿病肿瘤的发病和致死率呈负相关，但最近的一些流行病学的研究却显示出相抵触的实验结论。比如说，二甲双胍对于结、直肠癌细胞系的增殖并没有抑制作用，对于癌细胞凋亡也没有促进作用(Sui et al.,2014)。另一研究显示二甲双胍不能抑制乳腺癌的发生和发展(Thompson et al.,2015)。

艾塞那肽-4和二甲双胍都是抗糖尿病药物，但是通过不同的机制来降低血糖。二甲双胍作为双胍类药物降低肝葡萄糖的生成，而艾塞那肽-4作为GLP-1受体刺激剂通过升高餐后胰岛素的释放并且抑制胰高血糖素来降低血糖。本发明人的研究组曾报道I和II型糖尿病患者外周血单核细胞(PBMC)的炎性反应增强，经艾塞那肽-4体外处理之后其炎性反应水平会降低(He et al.,2013)。II型糖尿病患者口服GLP-1刺激剂也可观察到相似的结果(Hogan et al.,2014)。这些发现暗示，艾塞那肽-4可能通过活化免疫细胞中的GLP-1受体来调节糖尿病中的失调的免疫力，这不依赖于它的降血糖效果。

为了寻求免疫功能调节异常是否对T2DM引致的癌症产生生物学作用，本发明人研究了艾塞那肽-4/二甲双胍对以下几个方面的直接影响：1)CD⁸⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和/或Foxp³⁺调节性T细胞(T_reg)之间的平衡，2)促炎性细胞因子的变化，以及3)它们对肿瘤生长的作用。

在本发明的上下文中，调节性T细胞(T_reg)和效应性T细胞之间的平衡是癌症生物学中的重要的决定性因素。叉头转录因子P3(Foxp3)是T_reg的发育和功能中的调节通路的关键因子。表达Foxp3的CD⁴⁺T_reg的水平是抑制针对肿瘤的免疫的关键因素，而具有溶细胞活性(CTL)的CD⁸⁺T淋巴细胞的变化可能具有抗肿瘤效果。在患肝细胞癌和卵巢癌的患者中，发现肿瘤内活化的CTL的CD⁸⁺T淋巴细胞数量相对于T_reg数量的高比例与良好的临床结果有关。

致癌性病毒，如HPV，可刺激细胞增殖及干扰细胞凋亡来促进肿瘤发生。病毒性病原体可以制造出一种炎症性的环境来促进癌症生长，以受感染细胞和周边组织分泌的IL-1β、TNF-α和IL-6升高为特征(Read and Douglas,2014)。在此研究中，我们选择HPV16E7来诱导生成肿瘤细胞系(Cup-1)，就是因为它具有高免疫原性，可吸引免疫细胞，如巨噬细胞，自然杀伤细胞和淋巴细胞并释放大量的细胞因子。另外，由于其抗原主要位于细胞内，病毒持续感染而不容易被识别及攻击(Read and Douglas,2014)。

为寻求以高血糖、肥胖和炎症为特征的微环境与HPV等病原体的致癌性质间是否存在相互作用，以及对癌细胞生长有何种作用，本发明人开发了接种有经HPV感染的Cup-1肿瘤细胞的糖尿病小鼠模型，并且通过体内和体外实验，检测艾塞那肽-4和二甲双胍对肿瘤生长的作用，并且检验了CD⁸⁺CTL、Foxp³⁺T_reg和促炎性细胞因子的相关变化。

本发明的糖尿荷瘤小鼠模型比裸鼠荷瘤小鼠模型更有利的是，此模型的建立允许我们进行宿主免疫系统对抗肿瘤的研究，证实了糖尿病微环境对于肿瘤生长的促进作用，同时为进一步的药物筛选提供了非常有价值的平台。和对照组小鼠相比较，本发明中建立的糖尿荷瘤小鼠表现出随着年龄的增大和血糖水平的升高，其肿瘤的生长水平加速(详见以下实施例1和图1)。

在该糖尿病荷瘤小鼠模型的基础上，本发明人研究了艾塞那肽-4和二甲双胍的降糖作用以及对肿瘤生长的影响。有意思的是，艾塞那肽-4和二甲双胍同样具有降糖作用，但只有艾塞那肽-4可以引起特异性的肿瘤免疫应答，伴随有细胞毒性T细胞和调节性T细胞比例的增高，抑制肿瘤的生长；而二甲双胍显示出免疫负调节的作用，伴随有细胞毒性T细胞和调节性T细胞比例的降低，促进肿瘤的生长。

结果发现，与PBS的阴性对照组相比，艾塞那肽-4处理13天后，艾塞那肽-4处理组的肿瘤消退；与其相反，二甲双胍组的肿瘤持续增长(详见以下实施例2和图2)。进一步检测了经二甲双胍和艾塞那肽-4治疗过的小鼠的脾细胞培养上清液中细胞因子的水平。发现与PBS的阴性对照组相比，小鼠的脾细胞在体外与E7多肽共刺激后(详见以下实施例4和图4)，艾塞那肽-4组中脾淋巴细胞显示出CD⁸⁺细胞毒性T细胞和FoxP³⁺抑制性T细胞的比例显著增高，并伴随有炎性细胞因子IFN-γ、IL-2的增高；而在二甲双胍处理组中，我们发现脾细胞显示出CD⁸⁺细胞毒性T细胞和FoxP³⁺抑制性T细胞的比例降低，并伴随有抑制性细胞因子IL-10和IL-4水平升高。这表明艾塞那肽-4可以促进T细胞的免疫分化向着Th1主导的方向进行，而二甲双胍可促进Th2型免疫应答。

这些结果证明了艾塞那肽-4独立于降糖作用之外的多能作用，其中包括对于特异性抗肿瘤免疫应答的促进作用，而二甲双胍呈现出对于肿瘤细胞具有剂量依赖性的促肿瘤生长的作用。由糖尿病和癌症共享的多条通路可能解释了不同的降血糖药物对不同癌症类型的多样化效果。

不受任何理论的限制，本发明首次建立了糖尿病荷瘤小鼠模型，确认了糖尿微环境对于肿瘤生长的促进作用，并验证了糖尿病荷瘤小鼠的抗肿瘤免疫应答系统失调，促炎症和抗炎症的细胞因子水平失常。本发明证明了艾塞那肽-4可直接作用于糖尿病荷瘤小鼠脾脏的调节性T细胞和细胞毒性T细胞，从而抑制糖尿病小鼠的肿瘤增长。

上述结果与文献报道一致。有报道，肿瘤病人如果显示出高调节性T细胞和低细胞毒性T细胞的水平，预后会比较差；相反，预后好的病人表现为低调节性T细胞和高活性的细胞毒性T细胞(Gao et al.,2007)。在患肝细胞癌和卵巢癌的患者中，肿瘤内活化的CTL的CD⁸⁺T淋巴细胞数量相对于T_reg数量的高比例与良好的临床结果有关(Gao et al.,2007,Curiel et al.,2004)。

因此，胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂例如艾塞那肽-4通过提高活化的CTL的CD⁸⁺T淋巴细胞数量相对于T_reg数量的比例，能够治疗或预防患有免疫缺陷类疾病的患者所患癌症。而双胍类药物例如二甲双胍通过降低活化的CTL的CD⁸⁺T淋巴细胞数量相对于T_reg数量的比例，促进了肿瘤的生长，因此应禁止在罹患癌症的肿瘤患者中使用。

实施例

材料与方法

小鼠

5、10和20周龄的雄性db/db糖尿病小鼠和它们的db/m+对照组小鼠购买自Jackson实验室(美国Bar Harbor,ME)。所有的小鼠均被饲养于无菌环境中。可任意饮水和服用食物，光照每天12小时。

糖尿病荷瘤小鼠用药，剂量及实验的起始点：

对于1)db/db糖尿病小鼠和2)db/m+对照组小鼠(每组10只)，分别给予以下药物组合之一，分别是艾塞那肽-4、二甲双胍，剂量如下：

-全剂量的糖尿病药物，以期达到正常血糖水平；

-半剂量的糖尿病药物，以使血糖水平处于亚健康状态；

-正常盐水对照组。

肿瘤生长测定

第0天，皮下注射Cup-1癌细胞株(由HPV16E7+EJ-ras共同诱导产生，香港中文大学威尔斯亲王医院微生物学系赠送)肾癌细胞入10周龄的糖尿病小鼠和对照组小鼠的颈部(每组10只)。然后进行艾塞那肽-4、二甲双胍(阳性对照)、PBS(阴性对照)的处理。在艾塞那肽-4组，腹腔内注射PBS或低浓度(10nmol/kg)或高浓度(30nmol/kg)的艾塞那肽-4，连续处理13天。在二甲双胍组，经口灌胃PBS或低浓度(250mg/kg)或高浓度(400mg/kg)的二甲双胍，连续处理13天。每两天检测并记录肿瘤体积。用游标卡尺从体外测量肿瘤的长径和短径，根据下列公式计算肿瘤体积：V＝(a×b²)×0.5236(V表示肿瘤体积，a为肿瘤最长径，b为肿瘤垂直方向的最大横径)；生存时间(计算生存期，绘制生存曲线)等。

口服糖耐量试验(OGTT)

口服糖耐量实验(OGTT)将使用20％的糖溶液，小鼠禁食16小时，糖溶液按照2g/kg体重经口灌胃。在0分钟，30分钟，60分钟和120分钟4个时间点由血糖测试试剂盒(wakoautokit，Wako，labassay，日本)检测尾静脉血糖水平，实验步骤参考说明书。

脾细胞的准备

新鲜分离的脾脏被马上放置于5ml的冰冻PBS中，在无菌过滤器上碾碎并通过滤网滤过，用PBS洗两次。用红细胞裂解液(BD，MA，美国)裂解红细胞，用PBS清洗两次，用加了10％FBS(Invitrogen，MA，美国)，pH7.4的RPMI1640全细胞培养液(Invitrogen，MA，美国)悬浮并计数，用于进一步的应用。

免疫荧光染色

经液氮速冻的肿瘤组织被切成4微米厚，用以下抗体染色：大鼠抗小鼠CD8抗体(1：200)(BD，CA，美国)。肿瘤组织切片先用0.1％BSA进行阻断1小时，然后和大鼠抗小鼠CD8抗体在4度冻房孵育过夜。然后用PBS洗三次，每次5分钟。继续和荧光素相连的抗大鼠二抗(1：400)室温孵育1小时。染过色的切片用PBS洗三次，然后用含DAPI染色成分的染料覆盖液(Invitrogen,Carlsbad,CA，美国)染核并覆盖。所有染色的组织切片都暂存于4度，用德国进口Zeiss可处理图像的显微镜照相(Carl Zeiss,Hamburg,德国)，用相机拍照(Diagnostic Instruments Inc.,Sterling Heights,Michigan,美国)放大倍数是200倍。

细胞毒性实验

II型糖尿病db/db模型鼠经过13天艾塞那肽-4或二甲双胍处理后被处死。脾脏被无菌取下，脾淋巴细胞被分离。在红细胞被裂解掉并经过清洗步骤后，单个细胞悬浮液制备完成。脾淋巴细胞在含有丙二醇甲醚醋酸酯(PMA)和E7^49-57多肽(Synpeptide Co.Ltd，上海)的RPMI1640全培养液中孵育5天。此细胞在应用非放射性细胞毒性反应试剂盒(CytoTox96Non-radioactive Cytotoxicity Assay(Promega))检测CTL反应中用作效应细胞。含有人类乳头瘤病毒16型E7癌基因和EJ-ras癌基因的被称作Cup-1的细胞用作目标靶细胞。简要的概述一下实验步骤，将目标靶细胞和效应细胞混合并重悬于RPMI1640全细胞培养液中，1×10⁴个靶细胞和不同浓度的效应细胞以不同的比例混合并放置于96孔圆底板中37℃孵育，4个小时后，短暂离心培养板，收集上清，每孔50微升，用来检测目标靶细胞被攻击死亡之后释放到上清中的乳酸脱氢酶(LDH)。裂解的比率可用以下公式来详细计算：100×(A-B)/(C-D)，A是实验效应细胞的信号值，B是效应细胞的自发背景荧光值，C是目标靶细胞最大信号值，D是目标靶细胞的自发背景荧光值。

细胞内细胞因子染色和流式细胞分析

糖尿病荷瘤小鼠被艾塞那肽-4或二甲双胍处理13天后处死。新鲜处理脾脏准备脾淋巴细胞。在进行细胞内细胞因子染色之前，每个处理组的脾淋巴细胞都与5μg/ml E7多肽(aa49-57)(Synpeptide Co.Ltd，上海)共孵育16小时，此多肽含有MHC I类表位，用以检测E7特异性CD8+T细胞。细胞表面标记CD4和CD8还有细胞内细胞因子IFN-γ或FoxP3染色抗体(BD，CA，美国)被用作流式细胞术的分析。

脾细胞培养上清液中的细胞因子的含量

每组小鼠的脾细胞培养上清液经48小时培养后被收集并储存于-80℃，以用作后续使用Milliplex MAP试剂盒进行多能细胞因子免疫检测，Milliplex MAP试剂盒来源于Merck公司(Merck Millipore,Billerica,MA,美国)。

MTT检测法(体外抗肿瘤实验)

将对数生长期的CUP-1肿瘤细胞用0.25％胰蛋白酶消化，然后用含10％胎牛血清的DMEM完全培养液制成细胞悬液，分别将肿瘤细胞稀释至5.0×10⁴/mL，再将其接种至96孔培养板中，每孔200μL，于37℃、5％CO₂的培养箱内培养24h。待细胞完全贴壁后，Cup-1实验组每孔加入含10nmol/l艾塞那肽-4的DMEM培养液200μL。Cup-1肿瘤细胞组进行单浓度50μg·mL^-1测定。阴性对照组加入含等体积药物溶剂的DMEM培养液200μL；另单设不含细胞的DMEM培养液200μL为空白对照组。每一个浓度设3个平行孔，培养72h后各孔分别加入5g·L^{- 1}MTT溶液20μL，再培养4h后，分别加入DMSO 200μL，15min后用酶标仪在90nm测定各孔吸收度(A)值。计算药物各个浓度对肿瘤细胞的抑制率。抑制率(％)＝[1-(A实验-A空白)/(A对照-A空白)]×100％。

统计分析

小鼠的数据用均值±标准差/标准误差来表示。组间差异的统计学分析用的是单因素ANOVA，然后使用Dunnett’s post检验或T检验(如适用)。如p值小于0.05被认为是具有统计学意义。

实施例1、CUP-1肿瘤细胞系在糖尿病小鼠中的致瘤性

为了研究糖尿病对于HPV16E7介导的肿瘤发生的影响，按照前述方法，将HPV阳性癌症细胞株(Cup-1)皮下注射入db/db糖尿病小鼠和db/m+对照组小鼠的颈部区域。和裸鼠的反应相似，3天后即可以出现肉眼可见的肿瘤突起。有趣的是，糖尿病小鼠和对照组小鼠身上癌细胞株的生长曲线具有明显差异。在癌细胞接种后第3-7天，糖尿病小鼠身上的肿瘤体积增大了6倍。相应的，非糖尿病对照组小鼠身上的肿瘤体积只是扩增了1.5倍，并在第七天开始萎缩。在第29天，对照组小鼠身上的Cup-1肿瘤完全被清除。在第14天，db/db鼠的肿瘤体积几乎是对照组小鼠的4倍(1256.9±31.4vs 314.4±22.1mm³,P<0.001)。具体变化参见图1及下表1。

表1：不同周龄的糖尿病小鼠接种Cup-1细胞后第15、30、45天时的肿瘤体积。

*p<0.05，和对应的5周龄的小鼠比较；

和对应的10周龄的小鼠比较；每个值代表的是均值±标准误差(n＝10)。

切下来的肿瘤的组织学检查结果证明了无论是糖尿病小鼠还是对照组小鼠皮下切出的Cup-1肿瘤异种移植物都表现出典型的增殖和癌变属性，比如说高核-浆比和高细胞密度。糖尿病小鼠中，组织呈现的细胞核的多态性和有丝分裂相明显增多。因此，可以得出结论，db/db糖尿病小鼠可以促进荷瘤小鼠的肿瘤生长并延迟肿瘤清除。

实施例2、艾塞那肽-4抑制肿瘤生长，而二甲双胍诱导肿瘤生长

1)艾塞那肽-4诱导的肿瘤消退

按照图2I中示出的处理的方案，使用不同剂量的艾塞那肽-4，处理带有CUP-1肿瘤的10周龄的db/db小鼠。在向雄性糖尿病小鼠和对照小鼠皮下注射肿瘤细胞的同时，皮下注射不同浓度的艾塞那肽-4(分别为10或30nM/kg体重)或PBS对照，处理13天。如图2A所示，我们给10周龄的db/db糖尿荷瘤小鼠皮下注射不同剂量的艾塞那肽-4。13天给药期后处死这批老鼠并把肿瘤仔细切下称重并在深冻冰箱中储存用以后续实验。以糖尿病荷瘤小鼠的肿瘤体积的曲线下面积为指标。

在db/db小鼠中，艾塞那肽-4显示出对抑制肿瘤生长具有剂量依赖性效果(图2A)。经30nM/kg艾塞那肽-4处理的db/db实验组具有肿瘤体积的最小曲线下面积(AUC)(平均值±SD)(3500.7±210.3mm³)，然后是经10nM/kg艾塞那肽-4处理的db/db实验组(4020.2±251.2mm³)和经PBS(对照)处理的db/db实验组(4497.2±197.4mm³)(图2C)。在艾塞那肽-4处理13天之后，处死所有小鼠，并且切除CUP-1肿瘤进行称重。图2E示出了从不同实验组小鼠切除出的CUP-1肿瘤的代表性照片。在db/db小鼠中，经30nM/kg艾塞那肽-4处理的实验组小鼠的实验结束时的肿瘤重量比经PBS处理的实验组低54.2％(0.22±0.07vs.0.48±0.12g,P<0.001，图2G)。尽管肿瘤体积的AUC在经10nM/kg艾塞那肽-4处理的实验组和经PBS处理的实验组之间是类似的，但是在处理结束时，经10nM/kg艾塞那肽-4处理的实验组的肿瘤重量小于经PBS处理的实验组的肿瘤重量(0.31±0.11vs.0.48±0.12g,p＝0.036)。

在db/m+对照组小鼠中也观察到艾塞那肽-4显著的抑制肿瘤的效果，只是程度较小(图2C)。经艾塞那肽-4处理的db/m+小鼠在处理的第9天至第11天示出了肿瘤体积的减小。经30nM/kg艾塞那肽-4处理的db/m+小鼠中的肿瘤体积的AUC比经PBS处理的db/m+小鼠小22％(1645.1±397.4vs.2200.0±408.4mm³,P＝0.041,图2C)。

2)二甲双胍诱导的肿瘤发展

另外，还测试了二甲双胍的抗肿瘤和降低血糖的效果。二甲双胍是T2D患者的经典抗糖尿病药物，与艾塞那肽-4的设置类似。小鼠经口灌胃给定的二甲双胍(250mg/kg体重或400mg/kg体重)或PBS，给药持续13天。每隔一天，监控一次Cup-1肿瘤的生长。在二甲双胍处理结束时，经250mg/kg或400mg/kg处理的db/db实验组的Cup-1肿瘤的体积分别比经PBS处理的实验组大118％和215％(二甲双胍250和二甲双胍400vs.PBS:678.9±58.9和981.5±31.6vs.311.3±8.7mm³,P<0.001)(图2B和图2D)。在13天处理的过程中，二甲双胍以剂量依赖的方式促进肿瘤生长。与经PBS处理的实验组相比，经250mg/kg和400mg/kg二甲双胍处理的实验组的肿瘤体积AUC分别增加39.4％和89.8％(二甲双胍250和二甲双胍400vs.PBS:4507.7±348.0和6137.1±288.1vs.3233.4±132.8mm³,P＝0.038)。在二甲双胍处理13天之后，处死小鼠，并且切除CUP-1肿瘤。图2F示出了从不同实验组切除的CUP-1肿瘤的代表性照片。在db/db小鼠中，经400mg/kg二甲双胍处理的实验组的肿瘤块比对照组的肿瘤块重208.3％(0.74±0.02vs.0.24±0.02g,P<0.001)。经250mg/kg二甲双胍处理的实验组小鼠也具有增大的肿瘤块(met 250vs.PBS:0.42±0.03vs.0.24±0.02g,P＝0.034，图2H)。

二甲双胍在db/m+小鼠中也显示出促肿瘤的效果，但效果小很多。经400mg/kg二甲双胍处理的db/m+小鼠从处理第9天至第11天，CUP-1肿瘤体积增加。在经400mg/kg二甲双胍处理的db/m+小鼠中，肿瘤体积的AUC比经PBS处理的实验组大53.9％(1576.6±49.5vs.1024.0±132.7mm³,P＝0.029，图2D)。相反，250mg/kg二甲双胍没有改变db/m+小鼠中的CUP-1肿瘤的生长。对于肿瘤生长曲线和切除的肿瘤块，经250mg/kg二甲双胍处理和经PBS处理的实验组是相当的(图2H)。

以上实验(1)和(2)揭示，艾塞那肽-4在糖尿病(db/db)小鼠中以剂量依赖的方式抑制CUP-1肿瘤的生长，而在非糖尿病(db/m+)小鼠中的抑制程度较低。与此相比，二甲双胍在糖尿病(db/db)小鼠中以剂量依赖的方式反而促进CUP-1肿瘤的生长，在非糖尿病(db/m+)小鼠中的这一作用较小。

实施例3、艾塞那肽-4和二甲双胍都减轻db/db小鼠的高血糖症

进一步测定了以上实施例2中各组动物的血糖水平。与经PBS处理的实验组相比，每日给药10nM/kg或30nM/kg的艾塞那肽-4，以剂量依赖的方式降低了db/db小鼠的血糖水平(图3A)，30nM/kg的剂量显著性降低了db/db小鼠的血糖水平。基于在第9天进行的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)结果，经艾塞那肽-4处理的db/db实验组使血糖水平降低至低于经PBS处理的db/db实验组的水平。与经PBS处理的实验组(40407.8±9390.8)相比，艾塞那肽-4处理在所有时间点(0,30,60和120分钟)都降低了血糖(BG)浓度(图3B和图3C)，其中经30nm/kg艾塞那肽-4处理的实验组具有最小的BG的AUC(22268.0±4751.8)，接着是经10nM/kg艾塞那肽-4处理的实验组(31060.7±8257.8)(图3C)。

在db/db小鼠中，持续13天每日给药二甲双胍，以剂量依赖的方式减轻了高血糖症，其中与经PBS处理的实验组中27.8-30.4mmol/l的RBG范围(平均值：28.7mmol/l)相比，在经400mg/kg二甲双胍处理的实验组中RBG范围为19.2-23.0mmol/l(平均值：20.9mmol/l)，在经250mg/kg二甲双胍处理的实验组中RBG范围为是22.5～25.8mmol/l(平均值：24.6mmol/l)(图3D)。在OGTT过程中，二甲双胍在所有时间点(0,30,60和120分钟)都降低了BG水平，其中经400mg/kg二甲双胍处理的实验组达到显著性差异(图3E)。在OGTT过程中，与经250mg/kg处理的实验组的54014.3±2446.4和经PBS处理的实验组中的63214.7±2949.5相比，BG的AUC在经400mg/kg处理的实验组中是31859.1±3045.6(图3F)。在非糖尿病(db/m+)小鼠中，使用二甲双胍进行处理没有改变BG。

这表明艾塞那肽-4和二甲双胍在db/db小鼠中都能降低BG，但糖尿病小鼠在OGTT过程中的BG的随机血糖(RBG)和AUC高于非糖尿病的同胎小鼠(db/m+)(P<0.001)。

实施例4、在患肿瘤的db/db小鼠中，艾塞那肽-4和二甲双胍对肿瘤特异性CD⁸⁺T淋巴细胞和肿瘤特异性Foxp³⁺CD⁴⁺CD²⁵⁺调节性T(T_reg)细胞的作用

在证明了艾塞那肽-4在db/db小鼠中抑制Cup-1肿瘤生长之后，发明人进一步研究了艾塞那肽-4对应宿主抗肿瘤免疫应答中的影响。

T_reg细胞和效应T细胞是癌症生物学中的重要决定因素。表达Foxp3的CD⁴⁺调节性T细胞(T_reg)的数目增加在肿瘤免疫抑制中是一关键要素，同时具有CTL活性的CD⁸⁺T淋巴细胞的增加则具有抗肿瘤活性。因此，发明人重点研究了这两种免疫细胞应答。

按照与实施例2的相同处理方法，对雄性db/db糖尿病小鼠和对照组小鼠分别接种2×10⁷个Cup-1细胞并经艾塞那肽-4或二甲双胍处理13天。在第13天，荷瘤小鼠的脾细胞被无菌取出并制成单细胞悬液，和HPV16E7(aa49-57)多肽进行过夜孵育后，进行CD⁸⁺IFN-γT细胞毒性杀伤细胞和CD⁴⁺CD²⁵⁺Foxp3调节性T细胞的特异性染色。经流式细胞方法，确定分泌E7特异性IFN-γ的CD8+T细胞和Foxp³⁺CD⁴⁺CD²⁵⁺Treg细胞的在患肿瘤的db/db小鼠中的数目(图4)。

结果表明，与经PBS处理的对照相比，艾塞那肽-4以剂量依赖的方式，使分泌E7特异性IFN-γ的CD⁸⁺T细胞(图4B)显著增加，而Foxp³⁺CD⁴⁺CD²⁵⁺Treg细胞显著减少(图4C)，同时CTL/T_reg比率增加(图4A)。这些应答是肿瘤特异性的，因为在不经E7^49-57肽刺激的脾淋巴细胞中没有发现CD⁸⁺T细胞应答。结果显示，从db/db糖尿病小鼠收获的脾淋巴细胞中的CD⁸⁺细胞毒性T细胞显著高于对照db/m+小鼠中的CD⁸⁺T细胞。而T_reg细胞的结果相反，从db/db糖尿病小鼠收获的脾淋巴细胞中的T_reg细胞显著低于正常对照小鼠。经艾塞那肽-4处理使得CD⁸⁺细胞毒性T细胞数目增加，并且显著降低T_reg细胞的数目。因此，db/db糖尿病小鼠中的CD⁸⁺细胞毒性T细胞与T_reg细胞的数目比率(CTL/T_reg)显著高于对照组。

然而，于此相反，经二甲双胍处理的db/db糖尿病小鼠相对于对照组小鼠，分泌E7特异性IFN-γ的CD⁸⁺T细胞数目基本保持不变(图4E)，而Foxp³⁺CD⁴⁺CD²⁵⁺T_reg细胞数目增加(图4F)，因此CTL/T_reg相应比率减小了(图4D)。

具体数据参见下表2。

表2：经艾塞那肽-4或二甲双胍处理诱导CD⁸⁺T细胞与T_reg细胞的数目和比例。

在卵巢癌中，高Foxp3表达预示整体较差且无进展的存活率。这些T_reg细胞通过特异性抑制扩增的CD⁸⁺T细胞的细胞毒性，而终止CD⁸⁺T细胞介导的肿瘤排斥。

除了在db/db小鼠中诱导CD⁸⁺T细胞与T_reg的比率增加之外，艾塞那肽-4还提高了CD⁸⁺T细胞在肿瘤浸润细胞中的比例。使用免疫荧光染色，观察到肿瘤浸润CD⁸⁺T细胞在经艾塞那肽-4处理的db/db小鼠的肿瘤组织切片中的积累增加，而使用二甲双胍处理没有得到这样的结果。相比之下，CD⁸⁺T的积累在未经处理和经二甲双胍处理的db/db小鼠中是类似的(图4G)。这些数据解释了实施例2中观察到的在经艾塞那肽-4处理的db/db小鼠中的肿瘤生长消退，而经二甲双胍处理的db/db小鼠中的肿瘤生长反而被促进。

实施例5、艾塞那肽-4和二甲双胍在患肿瘤的小鼠中对肿瘤特异性细胞毒性杀伤力(CTL)的影响

接着检验了预先使用艾塞那肽-4和二甲双胍进行处理是否会改变CD⁸⁺T对Cup-1细胞的CTL活性。在体外，使用HPV16E7多肽，对从经艾塞那肽-4或二甲双胍处理的小鼠中收获的脾淋巴细胞培养物进行再刺激。检测效应细胞的CTL细胞毒活性。雄性db/db糖尿病小鼠和对照组小鼠分别接种2×10⁷个Cup-1细胞并接受艾塞那肽-4(A)或二甲双胍(B)处理13天。在第13天，荷瘤小鼠的脾细胞被无菌取出并制成单细胞悬液，和E7多肽进行过夜孵育，之后5天后，作为效应细胞用于细胞毒性T细胞反应。细胞毒性T细胞的杀伤活性是用乳酸脱氢酶释放实验来检测的。Cup-1肿瘤细胞作为靶细胞，来检测细胞毒性杀伤比率(特异性杀伤)。

在艾塞那肽-4的不同剂量处理的小鼠组中可见剂量依赖性的HPV16E7特异性的细胞毒功能变强，而二甲双胍组却没有观测到明显作用。如图5A所示，艾塞那肽-4处理可以显著提高HPV-特异性细胞毒CTL反应的水平，结果显示艾塞那肽-4处理可以剂量依赖性地增强糖尿病荷瘤小鼠细胞毒性T细胞杀伤能力。而二甲双胍倾向于抑制细胞毒性T细胞杀伤能力，如图5B所示。

实施例6、艾塞那肽-4和二甲双胍对于糖尿荷瘤小鼠脾细胞培养上清液中细胞因子的作用

接种了Cup-1肿瘤细胞的糖尿病小鼠，经过13天高浓度艾塞那肽-4或二甲双胍的处理之后被处死。脾细胞培养液在37度孵育箱中与HPV16E7^49-57多肽共孵育48小时，收集细胞培养上清，储存于-80℃用于检测免疫细胞分泌细胞因子和趋化因子的能力。如图6所示，艾塞那肽-4处理后的荷瘤小鼠释放出更高水平的炎性细胞因子IFN-γ和IL-2；并显示出低水平的抑制性细胞因子IL-10(p<0.05)。在二甲双胍处理组中，脾细胞培养上清中IFN-γ的水平没有显著变化；IL-4和IL-10的水平显著升高(p<0.05)。

上述结果说明进一步证明了艾塞那肽-4处理提高了CD⁸⁺细胞毒性T细胞的活性，降低了T_reg细胞的活性；而二甲双胍处理提高了T_reg细胞的活性。

实施例7、艾塞那肽-4抑制HCT116直肠癌细胞的增殖

持续的病毒感染可能在肿瘤发展中起到重要作用(McCracken et al.,2007；Notoet al.,2012)。有证据显示慢性乙肝病毒感染以及血糖升高(A1c>7％)与肝癌的高患病率紧密相关(Yang et al.,2013)。本发明人进一步研究了艾塞那肽-4是否也抑制人结肠癌细胞的增殖。之前的研究使用肠癌和肝癌细胞株，证实了高血糖和炎症介质-病原成分为脂多糖(LPS)可协同刺激肿瘤生长(He L,2014)。

收集20名糖尿病病人和健康献血者的外周血20毫升，乙二胺(EDTA)抗凝后经密度梯度法，分离外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。红细胞裂解和洗涤三次后，PBMC计数达5×10⁶细胞/毫升。在96孔板上的PBMC(100ul)中，加入10nmol/L的艾塞那肽-4新鲜配制溶液，再加入PHA(1ug/mL)和LPS(2ug/mL)，阴性对照不加艾塞那肽-4，在CO₂培养箱分别培养48小时，收集PBMC培养上清液。II型糖尿病外周血PBMC培养上清液与人结肠癌细胞株HCT116共培养24小时，细胞增殖实验检测可见II型糖尿病病人PBMC培养上清液可促进人结肠癌细胞的增殖水平，使用艾塞那肽-4共培养可一定程度上抑制人结肠癌细胞的增殖(如图7所示)。

结论

本发明首次发现，糖尿病微环境对于人类乳头瘤病毒HPV16E7诱导的肾肿瘤生长具有促进作用，并与糖尿病小鼠体内低下的细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例有关。另外，二甲双胍和艾塞那肽对于血糖水平都具有明显的降低作用，但只有艾塞那肽-4可抑制人类乳头瘤病毒HPV16E7诱导的肾肿瘤的肿瘤生长，因为它可显著增高细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例。二甲双胍反而可促进人类乳头瘤病毒HPV16E7诱导的肾肿瘤的生长，此现象可能与细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例降低相关。本发明揭示了糖尿病与癌症之间复杂的关系与免疫失调节有关，并进一步揭示了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂，例如艾塞那肽-4是一种肿瘤免疫调节剂，可刺激细胞毒性T细胞(CTL)的增加，降低调节性T细胞(T_reg)，并最终提高细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例，从而能够显著抑制并缩小糖尿病小鼠的肿瘤，从而证实了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂用于特异性抗肿瘤细胞的免疫功能的缺陷或低下患者的癌症治疗的新用途，特别是用于治疗或预防伴癌糖尿病中的新用途。同时，因为双胍类药物，例如二甲双胍降低了细胞毒性T细胞/调节性T细胞的比例，促进了糖尿病小鼠的肿瘤生长，因此应当禁止双胍类药物用于罹患肿瘤的糖尿病患者。也就是说，双胍类药物仅适用于治疗或预防无癌糖尿病。

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Claims (6)

1.胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备治疗或预防患者罹患的肿瘤的药物中的用途，其中，所述患者的肿瘤免疫细胞的功能缺陷或低下，所述罹患的肿瘤选自由病毒诱发的肾癌，

其中，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂为Exendin-4，

所述患者是糖尿病患者，且

所述病毒为人类乳头瘤病毒HPV16。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述糖尿病患者为II型糖尿病患者。

3.胰高血糖素样肽-1受体激动剂在制备增加患者免疫力的药物中的用途，其中所述患者为糖尿病患者，所述患者罹患有肿瘤，所述肿瘤选自人类乳头瘤病毒HPV16诱发的肾癌，

其中，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂为Exendin-4，和

所述增加患者免疫力是增加细胞毒性T细胞的数量，降低调节性T细胞的数量，和/或导致细胞毒性T细胞的数量和调节性T细胞的数量的比例增加。

4.如权利要求3所述的用途，其中，与所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂给药前相比，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂的给药使所述细胞毒性T细胞的数量增加2～20％，使调节性T细胞的数量下降2～10％，并且使细胞毒性T细胞和调节性T细胞的数量的比例增加1.6～3.0。

5.如权利要求3所述的用途，其中，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂使炎性细胞因子IFN-γ和IL-2增加和使抑制性细胞因子IL-10降低。

6.如权利要求3所述的用途，其中，与所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂给药前相比，所述胰高血糖素样肽-1受体激动剂的给药使炎性细胞因子IFN-γ增加500～1300pg/ml，使炎性细胞因子IL-2增加500～1500pg/ml，和/或使抑制性细胞因子IL-10降低150～300pg/ml。

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