CN111744004B - 阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化及肿瘤免疫治疗药物中的应用 - Google Patents

阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化及肿瘤免疫治疗药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及阿必鲁肽在制备免疫活化药物、抗肿瘤免疫活化药物、肿瘤免疫治疗药物以及抗肿瘤药物上的用途。本发明公开了阿必鲁肽的免疫活化活性及其抗肿瘤免疫活化活性，本发明还公开了阿必鲁肽的肿瘤免疫治疗作用和治疗肿瘤的作用。本发明的结果显示阿必鲁肽在体外显著刺激免疫细胞增殖，阿必鲁肽在体内外显著刺激干扰素γ(IFN‑γ)的释放，阿必鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上显著抑制肿瘤生长、显著延长荷瘤小鼠的生存期，具有明确的广谱抗肿瘤免疫治疗作用，结果还显示阿必鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上具有基本的安全性。所有这些结果揭示了阿必鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物上的应用价值和前景。

Description

阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化及肿瘤免疫治疗药物中的 应用
技术领域
本发明涉及肿瘤治疗尤其是肿瘤免疫治疗领域，具体来说是指阿必鲁肽的肿 瘤免疫治疗用途和抗肿瘤免疫活化用途。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。传统的手术、放疗、化疗等方案在一定程 度上抑制了肿瘤的进展，但难以控制肿瘤的复发、转移。随着不断出现的令人振 奋的临床研究结果，抗肿瘤免疫治疗给肿瘤患者带来了希望。免疫系统具有识别 并清除异己的能力，肿瘤在发生发展过程中不仅通过多种途径抑制免疫系统的先 天性免疫反应，也通过限制自身“新”抗原的“展示”和启动免疫检查点等诸多方法 来“麻痹”浸润的免疫效应细胞，从而达到逃避免疫识别和免疫清除的目的。如何 有效的活化抗肿瘤免疫反应，解除免疫逃避，从而达到免疫清除的效果，一直是 肿瘤免疫治疗领域所追求的目标。
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)是人体内分泌的一种内源性多肽，它是胰高血糖 素原基因经组织特异性的翻译后加工得到的30个氨基酸的肽类激素。GLP-1通 过与其受体GLP-1R结合，刺激胰岛素分泌，起到降低血糖的作用。GLP-1还可 以通过多种途径产生降低体重的效果，包括抑制胃肠道蠕动和胃液分泌、抑制食 欲及摄食、延缓胃内容物排空等等。除此之外，GLP-1还可作用于中枢神经系 统(尤其是下丘脑)，从而使人产生饱胀感并降低食欲。GLP-1还具有许多生理功 能，比如降脂、降压、保护心血管系统，再比如通过作用于中枢增强学习和记忆 功能、保护神经等等。目前为止，并未出现其具有免疫活化或者具有抗肿瘤免疫 活化的报道。
GLP-1的半衰期极短，仅有1.5～2分钟，无法在临床上用于糖尿病和其他 病症的治疗。因此，目前制药领域都是在尝试研发半衰期长的胰高血糖素样肽-1 受体(GLP-1R)的人工合成激动剂，期望延长半衰期、又具有GLP-1类似的活 性和功能。阿必鲁肽(Albiglutide；商品名Tanzeum)是一种新型的长效胰高血 糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂。它是葛兰素史克公司研制的一种结合饮食与 运动用于改善2型糖尿病成人患者的血糖控制药物，只需要1周注射1次。目前 为止还没有利拉鲁肽用于肿瘤治疗或者抗肿瘤的报道，也没有其具有免疫活化或 者抗肿瘤免疫活化的数据或者结果的报道。我们在筛选具有免疫活化功能的上市 多肽类药物时发现其具有令人意想不到的功能——免疫活化作用，因此，我们尝 试将其应用于抗肿瘤免疫活化和抗肿瘤免疫治疗。
发明内容
本发明的目的是通过体外研究揭示阿必鲁肽的免疫活化活性及其在制备活 化抗肿瘤免疫药物上的应用；通过多个体内动物模型，确认阿必鲁肽的免疫活化 作用及其在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用。
本发明在体外确认了阿必鲁肽在制备免疫活化药物上的应用。进一步，本发 明在多个体内模型上确认了阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化药物上的应用，在体 内确认了阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用。同时，也确认了阿必鲁 肽的基本安全性。
本发明内容概括如下：
(1)阿必鲁肽在体外显著刺激免疫细胞增殖，显著刺激干扰素γ(IFN-γ)的 释放，具有明确的免疫活化作用，揭示了阿必鲁肽在制备免疫活化药物上的应用。
(2)阿必鲁肽在体内显著刺激干扰素γ(IFN-γ)的释放，具有明确的免疫活 化作用，揭示了阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化药物上的应用。
(3)阿必鲁肽在体内显著抑制肿瘤生长，显著延长荷瘤小鼠的生存期，具 有明确的抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的 应用。
(4)阿必鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上显著抑制肿瘤生长、显著延长荷 瘤小鼠的生存期，这些肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌、肝癌、腹水癌、淋巴瘤和黑 色素瘤，具有广泛的作用范围，具有明确的广谱抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了阿 必鲁肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的广泛应用价值。
(5)阿必鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上具有基本的安全性，这些肿瘤包 括：乳腺癌、结肠癌、肝癌、腹水癌、淋巴瘤和黑色素瘤，揭示了阿必鲁肽在制 备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用价值和前景。
(6)而且，非常重要的一点是，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷 瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
总的来说，阿必鲁肽可以用来制备刺激免疫细胞增殖药物，阿必鲁肽可以用 来制备增强干扰素γ(IFN-γ)表达药物，阿必鲁肽可以用来制备免疫活化药物，阿 必鲁肽可以用来制备抗肿瘤免疫活化药物，阿必鲁肽可以用来制备抗肿瘤免疫治 疗药物，阿必鲁肽可以用来制备抗肿瘤药物。而且，由于是在免疫健全、血糖正 常的小鼠上荷瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
附图说明
图1阿必鲁肽对外周血单核细胞(PBMC)的增殖刺激作用
图2阿必鲁肽对外周血单核细胞(PBMC)分泌IFN-γ的刺激作用
图3小鼠黑色素瘤模型上阿必鲁泰的抗肿瘤免疫治疗效果(A)Elispot结果(B) 不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(C)不同处理组小鼠的生存期变 化(D)不同处理之后小鼠的体重变化情况
图4小鼠乳腺癌模型上阿必鲁泰的抗肿瘤免疫治疗效果(A)Elispot结果(B) 不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(C)不同处理组小鼠的生存期变 化(D)不同处理之后小鼠的体重变化情况
图5小鼠结肠癌模型上阿必鲁泰的抗肿瘤免疫治疗效果(A)Elispot结果(B) 不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(C)不同处理组小鼠的生存期变 化(D)不同处理之后小鼠的体重变化情况
图6小鼠肝癌模型上阿必鲁泰的抗肿瘤免疫治疗效果(A)Elispot结果(B) 不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(C)不同处理组小鼠的生存期变 化(D)不同处理之后小鼠的体重变化情况
图7小鼠淋巴瘤模型上阿必鲁泰的抗肿瘤免疫治疗效果(A)Elispot结果(B) 不同处理之后肿瘤体积随着时间的变化情况(C)不同处理组小鼠的生存期变 化(D)不同处理之后小鼠的体重变化情况
图8小鼠腹水癌模型上阿必鲁泰的抗肿瘤免疫治疗效果(A)Elispot结果(B) 不同处理组小鼠的生存期变化(C)不同处理之后小鼠的体重变化情况
具体实施方式
实施例1在外周血单核细胞上检测多肽药物的免疫活化功能
一、实验方法
1、筛选对象的确定
我们利用DrugBank数据库检索多肽药物，排除FDA批准的用于感染性疾病 治疗、血液系统疾病治疗、肿瘤治疗和免疫调节的多肽，留下的这些多肽所获批 的功能与肿瘤治疗和免疫调控是没有关系的。功能集中为治疗激素失调、治疗性 功能障碍、治疗糖尿病、治疗胃肠消化道疾病、治疗遗传性疾病、治疗心血管疾 病、治愈骨病、治疗神经系统疾病、治疗呼吸紊乱、治疗眼障碍治疗吸收不良症。
这当中包括用于糖尿病治疗的多肽药物。另外，也检索了中国上市的特有的用于糖尿病治疗的多肽药物。在汇总FDA和中国SFDA批准的用于糖尿病治疗的多肽 药物之后，我们通过各种途径购买获得这些多肽用于本发明的体内外活性检测和 确认。我们首先在外周血单核细胞上筛选这批多肽的免疫活化功能，筛选发现其 中一种糖尿病治疗多肽——阿必鲁肽具有较强的免疫活化功能。阿必鲁肽购自 selleck公司(目录号：S3734)，用PBS溶解。
2、阿必鲁肽对外周血单核细胞(PBMC)的增殖刺激作用的检测
无菌条件下取健康志愿者的外周血,利用肝素抗凝,然后使用淋巴细胞分离 液分离外周血单核细胞(PBMC),细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI-1640细胞 培养基当中，调整PBMC细胞浓度为3×105/ml,将PBMC接种到96孔细胞板, 每孔200μl,加入阿必鲁肽至终浓度为1μmol/L,用PBS作为对照，37℃5％的 CO2条件下培养72h。72h之后用碧云天的增强型CCK-8试剂盒(货号C0042) 检测细胞的增殖情况。
3、阿必鲁肽对外周血单核细胞(PBMC)的IFN-γ刺激分泌的检测
无菌条件下取健康志愿者的外周血,利用肝素抗凝,然后使用淋巴细胞分离 液分离外周血单核细胞(PBMC),细胞重悬在含10％胎牛血清的RPMI-1640细胞 培养基当中，调整PBMC细胞浓度为3×105/ml,将PBMC接种到96孔细胞板, 每孔200μl,加入阿必鲁肽至终浓度为1μmol/L,用PBS作为对照，37℃5％的CO2条件下培养72h。72h之后离心取上清液，用Invitrogen的ELISA试剂盒 (货号88-7316-76)检测细胞的IFN-γ刺激分泌情况。
二、实验结果
阿必鲁肽能够显著刺激外周血单核细胞(PBMC)的增殖。图1的结果显示， PBMC在经过PBS对照和阿必鲁肽处理培养72h之后，CCK-8试剂盒检测450nm 处的平均吸光值A450分别为0.6234和0.9175，阿必鲁肽处理组是PBS对照组 的接近1.5倍，而且两组之间有极显著差异(P<0.01),阿必鲁肽能够显著刺激 PBMC的增殖。这样的初步结果说明阿必鲁肽具有一定的免疫活化作用，这一结 果也大大出乎我们的预料，这一结果暗示阿必鲁肽可能具有用于抗肿瘤或者抗病 毒的潜在治疗作用。
阿必鲁肽能够显著刺激外周血单核细胞(PBMC)的IFN-γ的分泌。图2的结 果显示，PBMC在经过PBS对照和阿必鲁肽处理培养72h之后，IFN-γ的ELISA 试剂盒检测PBMC细胞胞外清液当中IFN-γ的浓度，结果显示PBS对照和阿必 鲁肽处理组胞外IFN-γ的浓度分别为59和594pg/ml，两组之间有极显著差异 (P<0.01)，结果说明阿必鲁肽能够显著刺激PBMC分泌IFN-γ。这样的结果既 肯定了前面的增殖刺激实验，也能够说明阿必鲁肽具有确定的免疫活化作用，这 一结果也大大出乎我们的预料，这一结果暗示阿必鲁肽具有用于抗肿瘤或者抗病 毒的潜在治疗作用。
三、实验小结
本实施例的以上结果非常有趣，第一次检测到阿必鲁肽在体外具有明确的免 疫活化作用，而且由于细胞选用的是正常健康志愿者的外周血PBMC，所以体外 的免疫活化作用并不依赖于PBMC来源者是不是2型糖尿病患者，也就是说阿 必鲁肽的这一活性和功能并不依赖于其已有的功能、与已有功能无关。在确认其 具有明确的免疫活化的基础上，下一步我们将在多个肿瘤模型上检测其抗肿瘤免 疫治疗作用，以及在体内动物模型上的免疫活化作用。
实施例2正常小鼠黑色素瘤模型上观察阿必鲁肽的治疗效果
一、实验方法
我们选用的是正常健康小鼠C57BL/6，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是想 在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(黑色素瘤模型)，然后观察治疗效果和免 疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果阿必鲁肽有 效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
选用6-8周龄C57BL/6小鼠，在右侧腋窝建立皮下黑色素瘤模型。每只小鼠 一侧接种5×106个B16/F10黑色素瘤细胞，6天左右之后测量肿瘤大小至约 200mm3，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：PBS对照组(200μl PBS) 和阿必鲁肽腹腔注射治疗组(阿必鲁肽剂量为1000μg/kg，注射体积200μl)，每 天腹腔注射1次。阿必鲁肽开始处理的当天记为第0天，在第0天阿必鲁肽和 PBS处理前测量瘤子体积、小鼠称重。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。 其中每组当中随机取6只在第7次注射之后的12小时，取出瘤子，使用Abcam的小鼠Interferon gamma ELISPOT试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做ELISpot 检测，检测肿瘤组织当中IFN-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿 瘤体积，体重，至肿瘤体积大于2000mm3判定小鼠死亡或者在肿瘤体积大于 2000mm3之前实际死亡的也判定为死亡，记录小鼠生存期(生存期起算日为荷瘤 之日起)。肿瘤体积公式为V＝0.5×长×宽2。
二、实验结果
在正常小鼠黑色素瘤模型上，PBS对照和阿必鲁肽7次腹腔注射处理之后， 使用Interferon gamma ELISPOT试剂盒检测IFN-γ的分泌情况，图3A结果显示 PBS对照和阿必鲁肽处理组IFN-γ的ELISPOT分别为183和642spots/2×105细胞，两组之间有极显著差异(P<0.01),与PBS对照组比较，阿必鲁肽处理组 是对照组的3倍多、能够显著刺激IFN-γ的分泌。这样的结果既充分肯定了前 面阿必鲁肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明确的免 疫活化作用。
图3B的结果显示，在正常小鼠黑色素瘤模型上，PBS对照和阿必鲁肽腹腔 注射处理之后，注射处理之后的第6天和第9天的结果显示阿必鲁肽处理组能够 显著性抑制瘤子体积的增长(P<0.05)。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免疫 活化功能的结果是一致的，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免 疫治疗作用。
图3C的结果显示，在正常小鼠黑色素瘤模型上，PBS对照组，在荷瘤之后 的第17天就开始出现小鼠死亡，至第23天小鼠全部死亡。而阿必鲁肽处理组到 第21天才开始出现小鼠死亡，直到第33天小鼠全部死亡。阿必鲁肽腹腔注射可 以显著性的延长黑色素瘤荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外 免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直 接说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图3D的结果显示，在正常小鼠黑色素瘤模型上，PBS对照腹腔注射处理之 后，第3天、第6天和第9天的结果显示小鼠体重有极其微弱的改变，而阿必鲁 肽处理组体重也有不显著的变化。两个处理组在第3天、第6天和第9天之间比 较没有显著性的差异(P>0.8)。结果说明，从体重的结果说明阿必鲁肽的安全性。
三、实验小结
正常小鼠黑色素瘤模型的体内结果显示阿必鲁肽具有明确的免疫活化作用 和抗肿瘤免疫治疗作用，阿必鲁肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即阿 必鲁肽具有显著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常 的小鼠上荷瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
实施例3正常小鼠乳腺癌模型上观察阿必鲁肽腹腔注射的治疗效果
一、实验方法
我们选用的是正常健康BALB/c雌性小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要 是想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(乳腺癌模型)，然后观察治疗效果和 免疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果阿必鲁肽 有效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
选用6-8周龄BALB/c雌性小鼠，在右侧腋下脂肪垫处建立皮下乳腺癌模型。 每只小鼠一侧接种5×106个小鼠4T1乳腺癌细胞，8天左右之后测量肿瘤大小至 约200mm3，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：PBS对照组(200μl PBS) 和阿必鲁肽腹腔注射治疗组(阿必鲁肽剂量为500μg/kg，注射体积200μl)，每 天注射1次。阿必鲁肽开始处理的当天记为第0天，在第0天阿必鲁肽和PBS 处理前测量瘤子体积、小鼠称重。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其 中每组当中随机取6只在第7次注射之后的12小时，取出瘤子，使用Abcam的 小鼠Interferon gamma ELISPOT试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做ELISpot检测，检测肿瘤组织当中IFN-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿 瘤体积，体重，至肿瘤体积大于2000mm3判定小鼠死亡或者在肿瘤体积大于 2000mm3之前实际死亡的也判定为死亡，记录小鼠生存期(生存期起算日为荷瘤 之日起)。肿瘤体积公式为V＝0.5×长×宽2。
二、实验结果
图4A的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽7次腹 腔注射处理之后，使用Interferon gamma ELISPOT试剂盒检测IFN-γ的分泌情 况，结果显示PBS对照和阿必鲁肽处理组IFN-γ的ELISPOT分别为206和698 spots/2×105细胞，两组之间有极显著差异(P<0.01),与PBS对照组比较，阿 必鲁肽处理组是对照组的3倍多、能够显著刺激IFN-γ的分泌。这样的结果既 肯定了前面阿必鲁肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有 明确的免疫活化作用。
图4B的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽腹腔注 射处理之后，与对照组相比，第6天和第9天的结果显示阿必鲁肽处理组能够显 著性抑制瘤子体积的增长(P<0.05)。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免疫活 化功能的结果是一致的，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫 治疗作用。
图4C的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，PBS对照组，在荷瘤之后的 第18天就开始出现小鼠死亡，至第24天小鼠全部死亡。而阿必鲁肽处理组到第 22天才开始出现小鼠死亡，直到第31天小鼠全部死亡。阿必鲁肽腹腔注射可以 显著性的延长黑色素瘤荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免 疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接 说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图4D的结果显示，在正常小鼠乳腺癌模型上，PBS对照腹腔注射处理之后， 第3天、第6天和第9天的结果显示小鼠体重有极其微弱的改变，而阿必鲁肽处 理组体重也有不显著的变化。两个处理组在第3天、第6天和第9天之间比较没 有显著性的差异(P>0.6)。结果说明，从体重的结果说明阿必鲁肽的安全性。
三、实验小结
正常小鼠乳腺癌模型的体内结果显示阿必鲁肽具有明确的免疫活化作用和 抗肿瘤免疫治疗作用，阿必鲁肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即阿必 鲁肽具有显著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的 小鼠上荷瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
实施例4正常小鼠结肠癌模型上观察阿必鲁肽的治疗效果
一、实验方法
我们选用的是正常健康BALB/c雌性小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要 是想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(结肠癌模型)，然后观察治疗效果和 免疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果阿必鲁肽 有效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
选用6-8周龄BALB/c雌性小鼠，在右侧腋下脂肪垫处建立皮下结肠癌模型。 每只小鼠一侧接种5×105个小鼠CT26结肠癌细胞，10天左右之后测量肿瘤大小 至约200mm3，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：PBS对照组(50μl PBS) 和阿必鲁肽腹腔注射治疗组(阿必鲁肽剂量为500μg/kg，注射体积200μl)，每 天注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其中每组当中的6只在 第7次注射之后的12小时，取出瘤子，使用Abcam的小鼠Interferon gamma ELISPOT试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做ELISpot检测，检测肿瘤组织 当中IFN-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿瘤体积，体重，至肿 瘤体积大于2000mm3判定小鼠死亡或者在肿瘤体积大于2000mm3之前死亡，记 录小鼠生存期，阿必鲁肽开始处理的当天记为第0天，在第0天阿必鲁肽和PBS 处理前测量瘤子体积、称重。肿瘤体积公式为V＝0.5×长×宽2。
mouse IFN-γ的qRT-PCR引物：
forward 5’-ACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCA-3’
reverse 5’-TGACCTCAAACTTGGCAATACTCA-3’。
二、实验结果
图5A的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽7次腹 腔注射处理之后，使用Interferon gamma ELISPOT试剂盒检测IFN-γ的分泌情 况，结果显示PBS对照和阿必鲁肽处理组IFN-γ的ELISPOT分别为237和513 spots/2×105细胞，两组之间有显著差异(P<0.05),与PBS对照组比较，阿必 鲁肽处理组是对照组的2倍多、能够显著刺激IFN-γ的分泌。这样的结果既肯 定了前面阿必鲁肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明 确的免疫活化作用。
图5B的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽腹腔注 射处理之后，与对照组相比，第6天和第9天的结果显示阿必鲁肽处理组能够抑 制瘤子体积的增长，第6天可以显著抑制肿瘤体积(P<0.05)。这样的结果与前 面阿必鲁肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，也能够直接说明阿必鲁肽在体 内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图5C的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，PBS对照组，在荷瘤之后的 第20天开始出现小鼠死亡，至第24天小鼠全部死亡。而阿必鲁肽处理组到第 24天才开始出现小鼠死亡，直到第31天小鼠全部死亡。阿必鲁肽腹腔注射可以 显著性的延长结肠癌荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免疫 活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说 明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图5D的结果显示，在正常小鼠结肠癌模型上，PBS对照腹腔注射处理之后， 第3天、第6天和第9天的结果显示小鼠体重有极其微弱的改变，而阿必鲁肽处 理组体重也有不显著的变化。两个处理组在第3天、第6天和第9天之间比较没 有显著性的差异(P>0.4)。结果说明，从体重的结果说明阿必鲁肽的安全性。
三、实验小结
正常小鼠结肠癌模型的体内结果显示阿必鲁肽具有明确的免疫活化作用和抗肿瘤作用，阿必鲁肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即阿必鲁肽具有显著 的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤， 所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
实施例5正常小鼠肝癌模型上观察阿必鲁肽的治疗效果
一、实验方法
我们选用的是正常健康C57BL/6小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是 想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(肝癌模型)，然后观察治疗效果和免疫 活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果阿必鲁肽有效 的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
选用6-8周龄C57BL/6小鼠，在右侧腋下脂肪垫处建立皮下肝癌模型。每只 小鼠一侧接种1×106个小鼠H22肝癌细胞，8天左右之后测量肿瘤大小至约 200mm3，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：PBS对照组(50μl PBS) 和阿必鲁肽腹腔注射治疗组(阿必鲁肽剂量为500μg/kg，注射体积200μl)，每 天注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其中每组当中的6只在 第7次注射之后的12小时，取出瘤子，使用Abcam的小鼠Interferongamma ELISPOT试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做ELISpot检测，检测肿瘤组织 当中IFN-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿瘤体积，体重，至肿 瘤体积大于2000mm3判定小鼠死亡或者在肿瘤体积大于2000mm3之前死亡，记 录小鼠生存期，阿必鲁肽开始处理的当天记为第0天，在第0天阿必鲁肽和PBS 处理前测量瘤子体积、称重。肿瘤体积公式为V＝0.5×长×宽2。
mouse IFN-γ的qRT-PCR引物：
forward 5’-ACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCA-3’
reverse 5’-TGACCTCAAACTTGGCAATACTCA-3’。
二、实验结果
图6A的结果显示，在正常小鼠肝癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽7次腹腔 注射处理之后，使用Interferon gamma ELISPOT试剂盒检测IFN-γ的分泌情况， 结果显示PBS对照和阿必鲁肽处理组IFN-γ的ELISPOT分别为188和787 spots/2×105细胞，两组之间有显著差异(P<0.05),与PBS对照组比较，阿必 鲁肽处理组是对照组的4倍左右、能够显著刺激IFN-γ的分泌。这样的结果既 肯定了前面阿必鲁肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有 明确的免疫活化作用。
图6B的结果显示，在正常小鼠肝癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽腹腔注射 处理之后，与对照组相比，第3天、第6天和第9天的结果显示阿必鲁肽处理组 能够显著抑制瘤子体积的增长(P<0.05)。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免 疫活化功能的结果是一致的，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤 免疫治疗作用。
图6C的结果显示，在正常小鼠肝癌模型上，PBS对照组，在荷瘤之后的第 18天开始出现小鼠死亡，至第25天小鼠全部死亡。而阿必鲁肽处理组到第21 天才开始出现小鼠死亡，直到第33天小鼠全部死亡。阿必鲁肽腹腔注射可以显 著性的延长肝癌荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免疫活化 功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说明阿 必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图6D的结果显示，在正常小鼠肝癌模型上，PBS对照腹腔注射处理之后， 第3天、第6天和第9天的结果显示小鼠体重有极其微弱的改变，而阿必鲁肽处 理组体重也有不显著的变化。两个处理组在第3天、第6天和第9天之间比较没 有显著性的差异(P>0.6)。结果说明，从体重的结果说明阿必鲁肽的安全性。
三、实验小结
正常小鼠肝癌模型的体内结果显示阿必鲁肽具有明确的免疫活化作用和抗 肿瘤作用，阿必鲁肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即阿必鲁肽具有显 著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤， 所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
实施例6正常小鼠淋巴瘤模型上观察阿必鲁肽的治疗效果
一、实验方法
我们选用的是正常健康BALB/c小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是想 在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(淋巴瘤模型)，然后观察治疗效果和免疫 活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果阿必鲁肽有效 的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
选用6-8周龄BALB/c小鼠，在右侧腋下脂肪垫处建立皮下淋巴瘤模型。每 只小鼠一侧接种5×105个小鼠A20淋巴瘤细胞，8天左右之后测量肿瘤大小至约 200mm3，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：PBS对照组(50μl PBS) 和阿必鲁肽腹腔注射治疗组(阿必鲁肽剂量为500μg/kg，注射体积200μl)，每 天注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其中每组当中的6只在 第7次注射之后的12小时，取出瘤子，使用Abcam的小鼠Interferon gamma ELISPOT试剂盒(货号：ab64029)对肿瘤组织做ELISpot检测，检测肿瘤组织 当中IFN-γ的分泌情况。每组余下的6只，继续跟踪测量肿瘤体积，体重，至肿 瘤体积大于2000mm3判定小鼠死亡或者在肿瘤体积大于2000mm3之前死亡，记 录小鼠生存期，阿必鲁肽开始处理的当天记为第0天，在第0天阿必鲁肽和PBS 处理前测量瘤子体积、称重。肿瘤体积公式为V＝0.5×长×宽2。
mouse IFN-γ的qRT-PCR引物：
forward 5’-ACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCA-3’
reverse 5’-TGACCTCAAACTTGGCAATACTCA-3’。
二、实验结果
图7A的结果显示，在正常小鼠淋巴瘤模型上，PBS对照和阿必鲁肽7次腹 腔注射处理之后，使用Interferon gamma ELISPOT试剂盒检测IFN-γ的分泌情 况，结果显示PBS对照和阿必鲁肽处理组IFN-γ的ELISPOT分别为204和773 spots/2×105细胞，两组之间有显著差异(P<0.05),与PBS对照组比较，阿必 鲁肽处理组是对照组的4倍不到、能够显著刺激IFN-γ的分泌。这样的结果既 肯定了前面阿必鲁肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有 明确的免疫活化作用。
图7B的结果显示，在正常小鼠淋巴瘤模型上，PBS对照和阿必鲁肽腹腔注 射处理之后，与对照组相比，第3天、第6天和第9天的结果显示阿必鲁肽处理 组能够显著抑制瘤子体积的增长(P<0.05)。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外 免疫活化功能的结果是一致的，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿 瘤免疫治疗作用。
图7C的结果显示，在正常小鼠淋巴瘤模型上，PBS对照组，在荷瘤之后的 第19天开始出现小鼠死亡，至第23天小鼠全部死亡。而阿必鲁肽处理组到第 23天才开始出现小鼠死亡，直到第31天小鼠全部死亡。阿必鲁肽腹腔注射可以 显著性的延长淋巴瘤荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面阿必鲁肽体内外免疫 活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致的，能够直接说 明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图7D的结果显示，在正常小鼠淋巴瘤模型上，PBS对照腹腔注射处理之后， 第3天、第6天和第9天的结果显示小鼠体重有极其微弱的改变，而阿必鲁肽处 理组体重也有不显著的变化。两个处理组在第3天、第6天和第9天之间比较没 有显著性的差异(P>0.6)。结果说明，从体重的结果说明阿必鲁肽的安全性。
三、实验小结
正常小鼠淋巴瘤模型的体内结果显示阿必鲁肽具有明确的免疫活化作用和抗肿瘤作用，阿必鲁肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即阿必鲁肽具有显著 的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤， 所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
实施例7正常小鼠腹水癌模型上观察阿必鲁肽的治疗效果
一、实验方法
我们选用的是正常健康C57BL/6小鼠，小鼠免疫健全、血糖正常，主要是 想在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤(腹水癌模型)，然后观察治疗效果和免 疫活化作用。由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷瘤，所以如果阿必鲁肽有 效的话，那么这样的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
正常小鼠腹水癌模型上观察阿必鲁肽腹腔注射的治疗效果选用6-8周龄 C57BL/6小鼠在腹腔建立腹水瘤模型。每只小鼠腹腔接种1×107个H22细胞，第 8天左右看到小鼠有腹水，将小鼠随机分成2组，每组12只，分别是：PBS对 照组(200μl PBS)和阿必鲁肽腹腔注射治疗组(阿必鲁肽剂量为1000μg/kg， 注射体积200μl)，每天注射1次。按照分组，接种小鼠饲养于清洁级动物房。其 中每组当中的6只在第7次注射之后的12小时，取出腹水，使用Abcam的小鼠Interferon gamma ELISPOT试剂盒(货号：ab64029)对腹水做ELISpot检测，检测腹水当中IFN-γ的分泌情况；用qRT-PCR的方法检测腹水当中IFN-γ的mRNA 水平。每组余下的6只，动态监测体重，直至小鼠死亡，记录小鼠生存期，阿必 鲁肽开始处理的当天记为第0天，在第0天阿必鲁肽和PBS处理前称重。
mouse IFN-γ的qRT-PCR引物：
forward 5’-ACACCTGATTACTACCTTCTTCAGCA-3’
reverse 5’-TGACCTCAAACTTGGCAATACTCA-3’。
二、实验结果
图8A的结果显示，在正常小鼠腹水癌模型上，PBS对照和阿必鲁肽7次腹 腔注射处理之后，使用Interferon gamma ELISPOT试剂盒检测IFN-γ的分泌情 况，结果显示PBS对照和阿必鲁肽处理组IFN-γ的ELISPOT分别为225和562 spots/2×105细胞，两组之间有显著差异(P<0.05),与PBS对照组比较，阿必 鲁肽处理组是对照组的2倍多、能够显著刺激IFN-γ的分泌。这样的结果既肯 定了前面阿必鲁肽体外免疫活化的结果，也能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明 确的免疫活化作用。
图8B的结果显示，在正常小鼠腹水癌模型上，PBS对照组，在注射腹水癌 细胞H22之后的第15天开始出现小鼠死亡，至第27天小鼠全部死亡。而阿必 鲁肽处理组到第21天才开始出现小鼠死亡，直到第38天小鼠全部死亡。阿必鲁 肽腹腔注射可以显著性的延长腹水癌荷瘤小鼠的生存期。这样的结果与前面阿必 鲁肽体内外免疫活化功能的结果是一致的，与显著抑制肿瘤生长的结果也是一致 的，能够直接说明阿必鲁肽在体内具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用。
图8C的结果显示，在正常小鼠腹水癌模型上，PBS对照腹腔注射处理之后， 第3天、第6天和第9天的结果显示小鼠体重有极其微弱的改变，而阿必鲁肽处 理组体重也有不显著的变化。两个处理组在第3天、第6天和第9天之间比较没 有显著性的差异(P>0.3)。结果说明，从体重的结果说明阿必鲁肽的安全性。
三、实验小结
正常小鼠腹水癌模型的体内结果显示阿必鲁肽具有明确的免疫活化作用和 抗肿瘤作用，阿必鲁肽的抗肿瘤作用是通过活化免疫来实现的，即阿必鲁肽具有 显著的活化抗肿瘤免疫的作用。而且，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷 瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
具体实施方式部分的总结：
(1)阿必鲁肽在体外能够显著刺激免疫细胞增殖，显著刺激干扰素γ(IFN-γ) 的分泌释放，具有明确的免疫活化作用，揭示了阿必鲁肽在制备免疫活化药物上 的应用。
(2)阿必鲁肽在体内能够显著刺激干扰素γ(IFN-γ)的释放，具有明确的免 疫活化作用，揭示了阿必鲁肽在制备免疫活化药物上的应用，进一步的揭示了阿 必鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化药物上的应用。
(3)阿必鲁肽在体内能够显著抑制肿瘤生长，显著延长荷瘤小鼠的生存期， 具有明确的抗肿瘤免疫治疗作用，揭示了阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上 的应用。
(4)阿必鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上能够显著抑制肿瘤生长、显著延 长荷瘤小鼠的生存期，这些肿瘤包括：乳腺癌、结肠癌、肝癌、腹水癌、淋巴瘤 和黑色素瘤，具有广泛的作用范围，具有明确的广谱抗肿瘤免疫治疗作用，揭示 了阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物上的广泛应用价值。
(5)阿必鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上具有基本的安全性，这些肿瘤包 括：乳腺癌、结肠癌、肝癌、腹水癌、淋巴瘤和黑色素瘤，揭示了阿必鲁肽在制 备抗肿瘤免疫治疗药物上的应用价值和前景。
(6)而且，非常重要的一点是，由于是在免疫健全、血糖正常的小鼠上荷 瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。
总的来说，阿必鲁肽可以用来制备刺激免疫细胞增殖药物，阿必鲁肽可以用 来制备增强干扰素γ(IFN-γ)表达药物，阿必鲁肽可以用来制备免疫活化药物，阿 必鲁肽可以用来制备抗肿瘤免疫活化药物，阿必鲁肽可以用来制备抗肿瘤免疫治 疗药物，阿必鲁肽可以用来制备抗肿瘤药物。而且，由于是在免疫健全、血糖正 常的小鼠上荷瘤，所以阿必鲁肽的功能并不依赖于其已有功能——降血糖。

Claims (2)

1.阿必鲁肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征为所述肿瘤为乳腺癌、腹水癌和黑色素瘤。
2.阿必鲁肽在制备抗肿瘤免疫治疗药物中的应用，其特征为所述肿瘤为乳腺癌、腹水癌和黑色素瘤。
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