CN111789939A - 利拉鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及肿瘤生物治疗领域，具体涉及利拉鲁肽在制备免疫活化药物、抗肿瘤免疫活化药物、肿瘤免疫治疗药物以及抗肿瘤药物上的用途。本发明公开了利拉鲁肽的免疫活化活性及其抗肿瘤免疫活化活性，本发明还公开了利拉鲁肽的肿瘤免疫治疗作用和治疗肿瘤的作用。本发明的结果显示利拉鲁肽在体内外显著刺激干扰素γ的释放，利拉鲁肽在多个体内动物肿瘤模型上显著抑制肿瘤生长、显著延长荷瘤小鼠的生存期，具有明确的广谱抗肿瘤免疫治疗作用。所有这些结果揭示了利拉鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物上的应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及利拉鲁肽用于肿瘤免疫治疗的用途，利拉鲁肽用于抑制促肿瘤炎症的用途，利拉鲁肽在制备抗肿瘤免疫药物中的用途，以及利拉鲁肽在制备增强自然杀伤(natural killer,NK)细胞功能药物中的用途。
背景技术
肿瘤是威胁人类健康的重大疾病。传统的手术、放疗、化疗等方案在一定程度上抑制了肿瘤的进展，但难以控制肿瘤的复发、转移。21世纪新兴的免疫治疗给患者带来了新的曙光，然而仍存在一些障碍使其无法达到长期的治疗效果，或更广泛的应用在肿瘤治疗中。肿瘤微环境(tumor microenvironment,TME)被认为是不可忽略的一个免疫抑制性环境，一方面帮助肿瘤逃避机体免疫系统攻击，另一方面削弱免疫治疗诱导的抗肿瘤免疫应答(Zou,Nat Rev Cancer,2005)。
促肿瘤相关性炎症是肿瘤的十大特征之一，介导肿瘤的发生、血管生成、侵袭、转移及免疫逃逸(Douglas,et al.,Cell,2011)。核因子活化B细胞κ轻链增强子(nuclearfactor-kappa B,NF-κB)和信号转导与转录激活因子(signal transducer and activatorof transcription3,STAT3)是介导炎症的两个核心转录因子，在TME内常处于持续活化状态，其调控表达的肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-6(interleukin-6,IL-6)、前列腺素2(prostaglandin2,PGE2)等均是抑制抗肿瘤免疫的介质：1)抑制细胞毒性T细胞的功能2)抑制NK细胞的功能3)诱导髓源性抑制性细胞(myeloid-derived suppressor cells,MDSCs)、调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)的产生，活化其功能。抑制NF-κB、STAT3通路的活化，以及阻断炎症介质已被证实具有提高抗肿瘤免疫应答的作用(Kyohei,et al.,Immunol Cell Biol,2017)。
人体自分泌的胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)通过与其受体GLP-1R结合，刺激胰岛素分泌，起到降低血糖的作用。但由于其半衰期极短(1.5～2分钟)，无法在临床上用于糖尿病的治疗。利拉鲁肽是经过修饰的GLP-1类似物，具有比天然GLP-1更长的半衰期(长达13小时)，属临床治疗糖尿病的长效GLP-1R激动剂之一(ElbrondB,et al.,Diabetes Care,2002)。目前为止还没有利拉鲁肽用于抗肿瘤免疫治疗的报道，我们偶然的机会发现利拉鲁肽对炎症相关的NF-κB和STAT3通路的活化具有抑制作用，而NF-κB和STAT3通路的活化与肿瘤的发生发展具有很强的相关性，因此，我们尝试将其应用到抗肿瘤免疫活化和抗肿瘤免疫治疗中。
发明内容
本发明的目的是通过研究利拉鲁肽对肿瘤炎症通路的抑制作用，探索其对抗肿瘤免疫的影响，提供利拉鲁肽在抗肿瘤免疫药物制备中的应用。
本发明在体外、体内探究利拉鲁肽对肿瘤炎症通路活化的抑制作用，以及对免疫细胞功能的调控作用。进一步，本发明找出利拉鲁肽治疗肿瘤作用依赖的具体免疫细胞类型。最后，本发明建立多种肿瘤模型，包括肝细胞肝癌，结肠癌，乳腺癌等，验证利拉鲁肽治疗肿瘤的效果。
本发明的结果概括为：
(1)利拉鲁肽显著抑制肿瘤组织内、及免疫细胞杀伤肿瘤细胞诱导的NF-κB、STAT3通路的活化，抑制其下游基因TNF-α、IL-6、IL-1β的表达。
(2)利拉鲁肽增强体外免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力，促进干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的释放，在体内具有增强小鼠肿瘤微环境内抗肿瘤免疫应答的作用，。
(3)利拉鲁肽治疗肿瘤的作用依赖于机体的NK细胞。清除NK细胞阻断了利拉鲁肽的治疗效果，清除CD8 T细胞对治疗效果无影响。
(4)利拉鲁肽具有显著抑制肿瘤生长的作用。
所有这些结果揭示了利拉鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物和抗肿瘤药物上的应用价值和前景。
附图说明
图1为实施例1在体外验证利拉鲁肽抑制炎症增强抗肿瘤免疫的作用：
TNF-α是活化NF-κB的重要炎症因子，TNF-α与受体结合后，下游的IκBα发生磷酸化后降解，NF-κB入核，调控下游基因的转录。IL-6是活化STAT3通路的关键因子，STAT3活化后同样发生磷酸化，形成p-STAT3。本实施例第一部分，首先选取人、鼠肝癌细胞系LM3、Hepa1-6，在含或不含利拉鲁肽的条件下，加入TNF-α、IL-6刺激，检测下游IκBα、p-IκBα、STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平。图1.A、B分别为利拉鲁肽对TNF-α活化NF-κB通路的抑制作用、对IL-6活化STAT3通路的抑制作用。
既往研究表明炎症因子如IL-6抑制免疫细胞的功能，实施例1第一部分的结果表明利拉鲁肽可抑制IL-6对STAT3的活化，因此实施例1第二部分探究利拉鲁肽抑制炎症后能否提高免疫细胞的活化和功能。分离人外周血淋巴细胞，在一定条件下刺激培养，形成具有杀伤肿瘤细胞作用的NKT细胞。NKT细胞在体外可模拟体内免疫细胞杀伤肿瘤细胞的过程，释放IFN-γ。用不同浓度利拉鲁肽预处理人肝癌细胞LM3-luciferase，再将NKT细胞与LM3-luciferase细胞共培养。利用ELISpot方法检测IFN-γ的释放、qRT-PCR方法检测IFN-γ在mRNA水平的表达、以及荧光素酶检测法检测肿瘤细胞的活率，判断NKT细胞的活化功能和杀伤功能。另外，在含或不含利拉鲁肽的条件下，加入IL-6诱导STAT3活化，观察炎症通路活化对NKT细胞溶瘤能力的抑制作用，以及利拉鲁肽阻断该通路活化后恢复NKT细胞功能的作用。图1.C为利拉鲁肽下调NKT细胞杀伤肿瘤细胞诱导的炎症介质表达，图1.D为利拉鲁肽促进NKT释放IFN-γ的结果，图1.E为利拉鲁肽促进NKT细胞杀伤能力的结果，图1.F为利拉鲁肽阻断IL-6对NKT细胞溶瘤能力的抑制作用。
图2为实施例2体内验证利拉鲁肽抑制炎症增强抗肿瘤免疫反应的作用:
C57BL/6小鼠皮下注射Hepa1-6细胞，建立小鼠肝癌模型。待肿瘤大小达到一定体积后，给予利拉鲁肽300μg/kg/d瘤内注射治疗，每天一次。在治疗第9天，处死小鼠，分离肿瘤组织，提取肿瘤组织蛋白，WB检测IκBα、p-IκBα、STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平；提取肿瘤组织RNA，qRT-PCR测定IFN-γ在mRNA水平表达的差异；另取肿瘤组织研磨消化至单细胞悬液，取2×105个细胞种于提前包被的ELISpot板内，按照操作手册测定IFN-γ分泌量。图2.A为WB结果显示利拉鲁肽对肿瘤组织炎症水平的抑制作用，图2.B为肿瘤组织内免疫负调控炎症因子在mRNA水平表达的相对量，图2.C为肿瘤组织内IFN-γ在mRNA水平表达的变化，以及肿瘤组织内免疫细胞功能的比较。
图3为实施例3具体探究利拉鲁肽调控免疫细胞的种类：
CD8 T细胞和NK细胞是参与抗肿瘤免疫应答的两种主要细胞。因此，在建立小鼠肿瘤模型后，实施例3分别清除了小鼠的CD8 T细胞或NK细胞，后续给予利拉鲁肽治疗，监测其治疗效果。图3.A分别对应治疗3天后、6天后、9天后各组小鼠肿瘤的大小，图3.B为肿瘤大小、小鼠体重变化的概括。
图4为实施例4探究利拉鲁肽治疗肝癌的效果：
分别建立小鼠皮下肝癌模型、肝癌腹水瘤模型，给予利拉鲁肽治疗，监测肿瘤生长速度以及生存期。图4.A为利拉鲁肽抑制小鼠皮下肝癌生长的作用，图4.B为利拉鲁肽对小鼠体重的影响，图4.C为利拉鲁肽延长腹水瘤模型小鼠生存期作用。
图5为实施例5探究利拉鲁肽治疗结肠癌的效果：
建立小鼠皮下结肠癌模型(恶液质模型)，给予利拉鲁肽治疗，监测肿瘤生长速度以及小鼠体重。图5.A为利拉鲁肽抑制小鼠结肠癌生长的作用，图5.B利拉鲁肽抑制恶液质进展的作用。
图6为实施例6探究利拉鲁肽治疗乳腺癌的效果：
建立小鼠皮下乳腺癌模型，给予利拉鲁肽治疗，监测肿瘤生长速度以及小鼠体重。图6.A为利拉鲁肽抑制小鼠皮下乳腺癌生长的作用，图6.B为利拉鲁肽对小鼠体重的影响。
具体实施方式
实施例1利拉鲁肽在体外通过抑制炎症促进抗肿瘤免疫
1.实验材料与方法
1.1实验试剂
人重组TNF-α(10620-HNAE)、小鼠重组TNF-α(50349-MNAE)、人重组IL-6(10395-HNAE)、小鼠重组IL-6(50136-MNAE)购于北京义翘神州生物科技有限公司。
1.2细胞系
人肝癌细胞HCC-LM3、小鼠肝癌细胞Hepa1-6购于中国科学院典型培养物种保藏委员会细胞库，LM3-luciferase由南京鼓楼医院肝胆外科研究所赠送。细胞使用含10％胎牛血清,2mM谷氨酰胺,100U/ml青霉素和1μg/ml链霉素的DMEM(均购于Invitrogen)培养于37℃、5％CO2、湿度稳定的细胞培养箱。
1.3 NKT细胞培养
分离健康成年志愿者外周血淋巴细胞，稀释细胞浓度至1×106/ml，接种于普通培养瓶，使用含IFN-γ、甘露聚糖肽、自体血清的GT-T551培养基培养。第2天，将细胞转移至事先包被CD3抗体的培养瓶中培养。第3天，在培养基中加入IL-2继续培养。每天观察，按需补充培养基。约两周后，流式细胞仪FACS Calibur(BD)检测分析CD8、NKG2D双阳性细胞所占比例。上述操作过程均符合研究伦理要求。
1.4蛋白提取、定量，Western Blot(WB)分析：
根据实验时间点消化、收取、洗涤细胞，获得细胞沉淀。加入RIPA裂解液，重复震荡-冰浴过程3次。12000g，4℃离心10min，取上清液即蛋白溶液，酶标仪(Molecular Devices)检测蛋白吸光度，根据标准品拟合的曲线计算蛋白浓度。剩余蛋白变性，保存待用。
根据目的蛋白分子量大小配制SDS-PAGE分离胶和浓缩胶，每个样品上样30～50μg，蛋白样品一端加入5μl Marker，恒压电泳(浓缩胶80V30min，分离胶110V约70min)。将凝胶上蛋白转入PVDF膜，封闭。孵育一抗，过夜。第二天，洗去多余的一抗，孵育二抗。利用化学发光液在免疫印迹曝光系统(北京赛智)曝光，获取图像，必要时用ImageJ软件分析条带的灰度，计算各条带的平均灰度值。
1.5细胞RNA提取及qRT-PCR检测：
使用Trizol(Invitrogen)试剂提取细胞内总RNA，然后用RT-PCR Master Mix试剂盒(TaKaRa)按照说明书将RNA逆转录为cDNA，最后进行实时定量PCR检测。使用Viia7(ABI)和SYBR Green(Roche)检测目的基因的表达。引物由金斯瑞公司合成,序列见表1，结果分析采用-2△△Ct方法计算各基因的相对表达水平，根据对照组基因表达量计算各组基因相对表达量。
表1引物序列：
1.6流式细胞分析：
取100μl2×106/ml的细胞悬液，加入相应的抗体，避光孵育30min。PBS洗涤、重悬。检测并分析结果：根据抗体的荧光标记选择合适的检测通道进行流式检测，流式结果使用FLOWJO软件分析。
1.7酶联免疫吸附测定(ELISA)
将用包被液稀释的抗体加入到塑料板孔内，过夜包被，洗去多余游离的抗体。收集细胞培养上清，加入到塑料板孔内，在其余孔内加入倍比稀释的标准抗原，37℃孵育30min，洗涤除去未结合物质。加入酶标抗体，37℃孵育10min，洗涤。加底物显色，待出现明显颜色时，终止反应，酶标检测仪检测吸光度，根据标准曲线计算待测抗原含量。
1.8利拉鲁肽抑制肿瘤细胞炎症通路的作用：
将5×105个人/鼠肝癌细胞接种于6孔板内，用含浓度梯度为10、20μM的利拉鲁肽的培养基培养24h，加入TNF-α(10ng/ml)刺激2h或IL-6(25ng/ml)刺激30min后收取细胞蛋白，WB检测IκBα、p-IκBα、STAT3、p-STAT3的蛋白表达水平。
1.9利拉鲁肽促进NKT细胞杀伤肿瘤细胞的作用：
将LM3-luciferase细胞以2×105个/ml的密度接种于12孔板，利拉鲁肽预处理细胞12h，随后按5:1的比例加入NKT细胞：
在共培养12h后，收集细胞RNA,q-PCR检测TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ等在mRNA水平的表达。收取培养上清，ELISA检测IFN-γ的含量。
分别在共培养12h、24h后，去除细胞培养液。每孔加入100μl裂解液，吹打，静置5min，每孔吸出100μl至黑色不透光96孔板。将含荧光素酶底物的试剂在37℃预热后加入裂解后的液体中，立即置于GloMaxTM96生物发光仪(Promega)测定荧光值。
在共培养体系中加入IL-6(25ng/ml)，培养24h后按照上述方法测定荧光值，计算活细胞比例。
2.实验结果
TNF-α刺激诱导IκBα发生磷酸化形成p-IκBα，随后p-IκBα通过泛素化作用降解，表现在p-IκBα较空白对照组升高(图1.A)。在泛素化降解前，总IκBα水平不变(Hepa1-6)，发生泛素化降解后，总IκBα水平较对照组下降(HCC-LM3)。在利拉鲁肽处理组，TNF-α刺激后，p-IκBα水平明显低于单独刺激组(HCC-LM3/Hepa1-6)，总IκBα水平较单独刺激组明显升高(HCC-LM3)或保持不变(HCC-Hepa1-6)。对于IL-6诱导STAT3发生的磷酸化，利拉鲁肽处理组p-STAT3水平显著低于单独IL-6刺激组，且存在剂量依赖性(图1.B)。即利拉鲁肽对TNF-α诱导的NF-κB活化、IL-6诱导的STAT3通路活化均具有抑制作用。
NKT细胞杀伤肿瘤细胞的过程诱导TNF-α、IL-6、IL-1β的上调，利拉鲁肽预处理组炎症因子的上调水平显著受到抑制(图1.C)，但NKT细胞释放的抗肿瘤反应因子IFN-γ在mRNA及蛋白水平均高于未处理组(图1.D)。进一步，利用荧光素酶活性检测分析肿瘤细胞的活力，结果表明利拉鲁肽可以促进NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤，且具有浓度依赖性，而单独的利拉鲁肽对肿瘤细胞无毒性作用(图1.E)。为了进一步说明利拉鲁肽活化NKT细胞的功能与其抗炎作用相关，我们在共培养体系中加入了IL-6。结果证实，在含有IL-6的条件下，NKT细胞的功能显著受到抑制(图1.F)。综上结果表明，负调控NKT细胞功能的炎症因子抑制免疫细胞的功能，而利拉鲁肽可以通过抑制炎症因子的表达恢复免疫细胞的功能。
3.实验小结
本实验结果说明利拉鲁肽具有抑制肿瘤细胞NF-κB、STAT3通路活化的作用，且下调免疫细胞杀伤肿瘤细胞所诱导的炎症因子表达，增强NKT细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。
实施例2利拉鲁肽在体内通过抑制肿瘤组织炎症促进抗肿瘤免疫
1.实验材料与方法
1.1酶联免疫斑点实验(ELISpot)
备注：所用的试剂盒为鼠IFN-γELISpot试剂盒(3321-2A,Mabtech)。
1)用70％乙醇处理ELISpot板2min，弃去乙醇，PBS清洗5次。
2)每孔加入100μl15μg/ml的小鼠IFN-γ抗体，包被过夜。
3)加入待测细胞悬液，置于细胞培养箱中培养12-48h。
4)弃掉细胞悬液，PBS清洗，加入检测抗体，室温孵育2h。
5)弃掉检测抗体，加入链霉亲和素ALP，室温孵育1h。
6)弃掉ALP，PBS清洗，加入显色底物BCIP/NBT-plus，直至斑点形成。
7)自来水洗涤终止反应，室温干燥，读取结果。
1.2小鼠实验
4-6周龄雄性C57BL/6小鼠购于南京大学－南京生物医药研究院，均通过实验动物质量检测合格，所有实验操作及处置方法均符合实验动物管理规范及动物保护条例。小鼠饲养于温度22±2
湿度60±10％，12/12h光/暗环境中，可任意饮水和摄取食物。
小鼠右腋皮下注射5×106个Hepa1-6细胞，待肿瘤长径大0.4～0.5cm时，将小鼠分为对照组、治疗组两组，每组5只，治疗组给予利拉鲁肽瘤内注射治疗，300μg/kg/只，1次/天，对照组给予等量PBS。至治疗第9天，处死小鼠，分离肿瘤组织，提取组织蛋白及RNA，检测NF-κB、STAT3通路活化水平。另外将部分组织研磨、消化、过筛至单细胞悬液。将2×105细胞种于提前包被的ELISpot板内，按照操作手册测定IFN-γ分泌量，读取结果。
2.实验结果
利拉鲁肽治疗组肿瘤组织p-IκBα、p-STAT3蛋白表达水平显著低于对照组(图2.A)，其下游TNF-α、IL-6在mRNA水平同样低于对照组(图2.B)，说明肿瘤组织内NF-κB通路、STAT3通路的活化受到抑制。另外，利拉鲁肽治疗后，肿瘤组织内IFN-γ在mRNA及蛋白水平均显著上调(图2.C)，说明利拉鲁肽显著增强了肿瘤局部抗肿瘤免疫应答。
3.实验小结
实施例2在体内实验层面证实了利拉鲁肽通过抑制NF-κB通路、STAT3通路增强抗肿瘤免疫的作用。
实施例3NK细胞介导利拉鲁肽治疗肿瘤作用
1.实验材料与方法
1.1抗体清除实验：
将C57BL/6小鼠分为4组，对照组、治疗组、治疗组+CD8T细胞清除组、治疗组+NK细胞清除组，每组6只。每只皮下注射5×106 Hepa1-6细胞，待肿瘤长径达0.4～0.5cm时，腹腔注射500μg/只抗CD8αmAb(BE0017，BioXcell)清除CD8T细胞，或抗NKmAb(BE0036，BioXcell)清除NK细胞，24h后取小鼠眼眶静脉血，流式细胞检测分析CD8T细胞或NK细胞清除率，证实细胞清除后，开始给予利拉鲁肽300μg/kg/只瘤内注射治疗，1次/天。每3天测量并记录一次肿瘤大小及体重。
1.2小鼠外周血分离、检测：
麻醉小鼠，用含肝素的取血毛细吸管，于小鼠内眦与眼球之间斜角缓慢插入至球后静脉丛，收集血液约200μl，加入对应的抗体：抗CD8-PerCp(46-0083-80，eBioscience)或抗NK1.1-FITC(553164，BD)，按照流式细胞检测步骤分析CD8T细胞、NK细胞的清除率。
2.实验结果
在治疗第3、6、9天后，利拉鲁肽治疗组小鼠的肿瘤体积均显著低于对照组；清除CD8 T细胞+利拉鲁肽治疗组，小鼠肿瘤体积与单独利拉鲁肽治疗组无差异；清除NK细胞+利拉鲁肽治疗组，小鼠肿瘤体积与对照组组无差异。体重结果显示处理组之间无显著性差异，提示利拉鲁肽具有一定的安全性。
3.实验小结
实施例一、二结果表明，利拉鲁肽可以通过抑制炎症增强免疫细胞的功能。在抗肿瘤免疫反应中，CD8 T细胞和NK细胞分别是介导获得性、固有抗肿瘤免疫应答的主要细胞，为了进一步探究利拉鲁肽作用的具体免疫细胞类型，我们利用中和抗体分别清除了小鼠的CD8T细胞、NK细胞，再给予利拉鲁肽治疗。结果表明，清除CD8 T细胞不影响利拉鲁肽的治疗效果，而清除NK细胞却完全阻断了利拉鲁肽的治疗效果。由此得出结论，利拉鲁肽治疗肿瘤的作用依赖于NK介导的抗肿瘤免疫应答。而且，体重结果显示利拉鲁肽具有一定的安全性。
实施例4利拉鲁肽治疗小鼠肝癌的作用
1.实验材料与方法：
1.1小鼠皮下肝癌模型建立及治疗：
4-6周龄雌性Balb/c小鼠购于南京大学－南京生物医药研究院，均通过实验动物质量检测合格，所有实验操作及处置方法均符合实验动物管理规范及动物保护条例。小鼠饲养于温度22±2
湿度60±10％，12/12h光/暗环境中，可任意饮水和摄取食物。
小鼠右腋皮下注射1×106个H22细胞，待肿瘤长径达0.4～0.5cm时，治疗组给予利拉鲁肽300μg/kg/只瘤内注射，1次/天。每2～3天测量并记录一次肿瘤大小及体重。小鼠体积按照公式：体积＝长径×短径×短径/2计算。
1.2小鼠腹水瘤肝癌模型建立及治疗：
4-6周龄雄性C57BL/6小鼠购于南京大学－南京生物医药研究院，均通过实验动物质量检测合格，所有实验操作及处置方法均符合实验动物管理规范及动物保护条例。小鼠饲养于温度22±2
湿度60±10％，12/12h光/暗环境中，可任意饮水和摄取食物。
小鼠腹腔注射1×106个H22细胞，注射一周后，治疗组给予利拉鲁肽300μg/kg/只腹腔注射，1次/天。每天监测小鼠生存状态，统计小鼠生存期，小鼠呈严重病危濒死状态及直接死亡算作死亡标准。
2.实验结果：
2.1皮下瘤模型结果：
在每一个监测时间点，小鼠肿瘤平均体积仅为对照组的40～50％(图4.A)。利拉鲁肽治疗组小鼠体重较对照组降低，早期(治疗5天内)下降明显，但比例均在5％以内；治疗一周后，两组小鼠体重差异变小(图4.B)。体重结果显示利拉鲁肽具有一定的安全性。
2.2腹水瘤模型结果：
利拉鲁肽治疗组小鼠平均生存期显著延长(图4.C)。
3.实验小结：
该实验结果说明，利拉鲁肽具有治疗小鼠肝癌实体瘤和腹水癌的作用。而且利拉鲁肽具有一定的安全性。
实施例5利拉鲁肽治疗小鼠结肠癌的作用
1.实验材料与方法：
4-6周龄雄性Balb/c小鼠购于南京大学－南京生物医药研究院，均通过实验动物质量检测合格，所有实验操作及处置方法均符合实验动物管理规范及动物保护条例。小鼠饲养于温度22±2
湿度60±10％，12/12h光/暗环境中，可任意饮水和摄取食物。
本实验选用的C26细胞是一种可以复制肿瘤恶液质的细胞，小鼠右腋皮下注射1×106C26细胞，待肿瘤长径达0.4～0.5cm时，治疗组给予利拉鲁肽300μg/kg/只腹腔注射，1次/天。每2～3天测量并记录一次肿瘤大小及体重。小鼠体积按照公式：体积＝长径×短径×短径/2计算，小鼠恶液质进展的评估标准：体重下降>5％，轻度；体重下降>10％，中度；体重下降>15％，重度。
2.实验结果：
在每一个监测时间点，治疗组小鼠肿瘤平均体积仅为对照组的30～50％(图5.A)。治疗9天后，对照组小鼠体重下降均超出15％，进展到重度恶液质阶段；而治疗组小鼠，处在轻度、中度、重度恶液质的比例分别为60％、20％、20％(图5.B)，说明利拉鲁肽具有一定的对抗肿瘤恶液质的效应。
3.实验小结：
本实验结果说明，利拉鲁肽具有抑制小鼠皮下结肠癌肿瘤生长的作用。同时，实验所建立的为典型的恶液质模型，对照组小鼠体重随肿瘤进展逐渐下降，治疗组小鼠体重下降速度缓于对照组，说明恶液质进展得到控制，利拉鲁肽具有明确的对抗肿瘤恶液质的效应。
实施例6利拉鲁肽治疗小鼠乳腺癌的作用
1.实验材料与方法：
4-6周龄雌性Balb/c小鼠购于南京大学－南京生物医药研究院，均通过实验动物质量检测合格，所有实验操作及处置方法均符合实验动物管理规范及动物保护条例。小鼠饲养于温度22±2
湿度60±10％，12/12h光/暗环境中，可任意饮水和摄取食物。
小鼠右腋皮下注射1×1064T1细胞，待肿瘤长径达0.4～0.5cm时，治疗组给予利拉鲁肽300μg/kg/只瘤内注射，1次/天。每2～3天测量并记录一次肿瘤大小及体重。小鼠体积按照公式：体积＝长径×短径×短径/2计算。
2.实验结果：
在每一个监测时间点，治疗组小鼠肿瘤平均体积仅为对照组的40～50％(图6.A)。利拉鲁肽治疗组小鼠体重较对照组降低，早期(治疗5天内)下降明显，但比例均在5％以内；治疗一周后，两组小鼠体重差异变小(图6.B)。
3.实验小结：
该实验结果说明，利拉鲁肽具有治疗小鼠乳腺癌的作用。
实施例部分的总结：
利拉鲁肽显著抑制肿瘤组织内、及免疫细胞杀伤肿瘤细胞诱导的NF-κB、STAT3通路的活化，抑制其下游基因TNF-α、IL-6、IL-1β的表达；利拉鲁肽增强体外免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力，促进干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)的释放，在体内具有增强小鼠肿瘤微环境内抗肿瘤免疫应答的作用；利拉鲁肽治疗肿瘤的作用依赖于机体的NK细胞。利拉鲁肽具有显著抑制实体瘤和腹水癌的作用，具有明确的对抗肿瘤恶液质的效应，利拉鲁肽具有一定的安全性。
所有这些结果揭示了利拉鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物和抗肿瘤药物上的应用价值和前景。
统计方法：
结果使用Mean±SD进行表示，两组间的均值比较采用配对t检验，P<0.05为具有统计学差异，#P>0.05,*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。体外实验均为2或3次以上重复的结果。作图软件为Graphpad Prism(version6.0)。
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Claims (11)
1.利拉鲁肽在制备抑制NF-κB通路活化或者STAT3通路活化药物中的应用。
2.利拉鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化药物中的应用。
3.如权利要求2所述的利拉鲁肽在制备抗肿瘤免疫活化药物中的应用，其特征为所述免疫活化包括促进干扰素γ表达分泌、下调NKT免疫细胞在杀伤肿瘤细胞时所诱导的炎症介质的表达，并促进NKT对肿瘤细胞的杀伤能力。
4.利拉鲁肽在制备抑制肿瘤微环境中促肿瘤炎症药物中的应用。
5.利拉鲁肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
6.如权利要求5所述的利拉鲁肽在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征为所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肝癌实体瘤和肝癌腹水癌。
7.利拉鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用。
8.如权利要求7所述的利拉鲁肽在制备肿瘤免疫治疗药物中的应用，其特征为所述肿瘤包括乳腺癌、结肠癌、肝癌实体瘤和肝癌腹水癌。
9.利拉鲁肽在制备NK细胞介导的抗肿瘤免疫治疗药物中的应用。
10.利拉鲁肽在制备治疗肿瘤恶液质药物中的应用。
11.如权利要求10所述的利拉鲁肽在制备治疗肿瘤恶液质药物中的应用，其特征为所述恶液质为结肠癌的癌性恶液质。
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