CN110891611B - 水凝胶交联透明质酸前药组合物和方法 - Google Patents

水凝胶交联透明质酸前药组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及包含交联透明质酸(HA)或其衍生物或盐的水凝胶前药组合物，其中所述交联剂系统包含生物可降解的间隔子，其中所述交联HA包含缀合的药物‑接头，并且其中所述接头能够在生理条件下释放药物。本发明还涉及用于制备所述水凝胶前药组合物的方法。本发明还涉及用于使用所述水凝胶组合物治疗眼部病症的方法。

Description

水凝胶交联透明质酸前药组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年3月22日提交的美国临时申请序列号62/475,094的优先权，将所述临时申请的公开内容通过引用并入本文。
序列表
本申请含有通过EFS-Web提交并且通过引用以其整体特此并入的序列表。在2018年3月21日创建的所述ASCII副本命名为P34128_WO_Sequence Listing.txt并且大小为38,048字节。
技术领域
本发明涉及药物组合物、相关制备方法和使用所述药物组合物治疗一种或多种眼部病症的方法。
背景技术
失明的主要原因是不能充分治疗眼睛的某些疾病。主要限制是缺乏将药物或治疗剂引入眼睛中并且在其中以治疗有效浓度维持这些药物或药剂持续必要的持续时间的合适的选择。全身给予可能不是理想的解决方案，因为通常为了获得有效的眼内浓度，需要不可接受的高水平的全身给药，并且药物的不可接受的副作用的发生率增加。在许多情况下，简单的眼部滴注或施用不是可接受的替代方案，因为药物可能通过泪液作用被快速冲走或者从眼睛内进入体循环中被耗尽。局部滴眼剂治疗受到吸收不良、需要经数天至数年的时间频繁和/或长期给药、房水的快速更新、泪膜的产生和移动以及其他原因的限制，这可能在疗法完成或递送适当剂量之前有效地去除治疗剂。
眼内注射的优点在于它们相对于其他递送机制(如局部递送)可以为眼睛的靶位置(例如，视网膜)提供增强的生物利用度。然而，它们也有缺点并且可能出现各种不同的并发症。例如，玻璃体内注射可能导致将不期望的高浓度治疗剂递送至靶位置或其他地方，特别是当治疗剂相对可溶时。另外，眼内注射对患者来说是非常不愉快的。此外，由于眼内注射本身可能引起并发症(如眼内炎和视网膜脱落)，因此非常希望在注射之间具有尽可能长的持续时间，同时在眼睛中保持药物的治疗水平。
除前述之外，由于药剂在注射后通常可以快速分散在眼睛内，通过玻璃体内注射递送的治疗剂可能缺乏作用的持续时间。特别不希望持续时间的这种缺乏，因为这可能需要更高的注射频率。例如，兰尼单抗和哌加他尼分别每4周和6周通过眼内注射来给予患者，这对患者来说是非常不愉快的体验。
因此，人们普遍认识到眼科领域将受益于更持久的配方。通过为眼睛提供延长的治疗剂递送同时最小化与患者对规定的治疗性医疗方案的依从性相关的问题，所述配方将有益于患者护理和眼部健康。
血管内皮生长因子(VEGF)(由刺激血管发生和血管生成的细胞产生的信号蛋白)的表达在各种眼部病症中(如在某些形式的黄斑变性和视网膜病变中)起重要作用。
用于治疗此类眼部病症的多种药物(如兰尼单抗、阿柏西普和哌加他尼)在售。每4周和8周通过眼内注射向患者施用。
鉴于前述情况，需要提供一种至少部分地克服这些缺点的给予形式。
发明内容
本发明提供了交联透明质酸(HA)药物缀合物、药物组合物和使用此类缀合物治疗眼部适应症的方法、以及制备所述缀合物的方法。
在某些实施方案中，本发明提供了交联HA药物缀合物，其包含多个透明质酸聚合物2A和多个透明质酸聚合物2B，其中：
每个2A包含多个线性连接单元，所述单元基本上由以下组成：
每个2B包含多个线性连接单元，所述单元基本上由以下组成：
其中
未标记的虚线表示与用#标记的虚线处的相邻单元或与氢的附接点，
用#标记的虚线表示与未标记的虚线处的相邻单元或与羟基的附接点；并且
用*标记的虚线表示在2A的单元Z3和2B的单元Z4之间的交联附接点，使得至少一个2A与至少一个2B交联；
药物是治疗剂；
Ra1和Ra2各自独立地是氢；C1-4烷基；碱金属离子、铵离子、碱土金属离子或其他合适的抗衡离子；
L2是可逆的前药接头；
L4是任选地生物可降解的间隔子，并且在Z2和Z4中可以相同或不同；
2A总共包含s个单元，其中s是从25至2500，其中；
2A中Z1单元的数目是从约0.8s至约0.99s，并且
Z3单元的数目是从约0.2s至约0.01s；
2B总共包含t个单元，其中t是从25至2500，其中；
2B中Z1单元的数目是从约0.75t至约0.94t；
Z2和Z4单元的组合数目是从约0.25t至约0.06t；
Z2单元的数目是至少0.01t；并且
Z4单元的数目是至少0.01t。
在某些实施方案中，s是从50至2000。
在某些实施方案中，s是从75至1500。
在某些实施方案中，s是从75至1000。
在某些实施方案中，s是从80至500。
在某些实施方案中，s是从100至250。
在某些实施方案中，s是从100至200。
在某些实施方案中，s是从200至800或从300至600。
在某些实施方案中，t是从50至2000。
在某些实施方案中，t是从75至1500。
在某些实施方案中，t是从75至1000。
在某些实施方案中，t是从80至500。
在某些实施方案中，t是从100至250。
在某些实施方案中，t是从100至200。
在某些实施方案中，t是从200至800或从300至600。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.91s至约0.98s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.8s至约0.99s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.82s至约0.99s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.84s至约0.99s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.86s至约0.99s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.88s至约0.99s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.9s至约0.99s。在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.92s至约0.97s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.93s至约0.96s。
在某些实施方案中，2A中Z1单元的数目是从约0.94s至约0.95s。
在某些实施方案中，2A中Z3单元的数目是从约0.2s至约0.01s。
在某些实施方案中，2A中Z3单元的数目是从约0.18s至约0.01s。
在某些实施方案中，2A中Z3单元的数目是从约0.16s至约0.01s。
在某些实施方案中，2A中Z3单元的数目是从约0.14s至约0.01s。在某些实施方案中，2A中Z3单元的数目是从约0.12s至约0.01s。
在某些实施方案中，2A中Z3单元的数目是从约0.10s至约0.01s。
在某些实施方案中，Z3单元的数目是从约0.09s至约0.02s。
在某些实施方案中，Z3单元的数目是从约0.08s至约0.03s。
在某些实施方案中，Z3单元的数目是从约0.07s至约0.04s。
在某些实施方案中，2B中Z1单元的数目是从约0.88s至约0.92s。
在某些实施方案中，2B中Z1单元的数目是从约0.86s至约0.94s。
在某些实施方案中，2B中Z1单元的数目是从约0.89s至约0.91s。
在某些实施方案中，2B中Z1单元的数目是从约0.86s至约0.94s。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.25t至约0.05t。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.23t至约0.05t。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.21t至约0.05t。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.19t至约0.05t。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.17t至约0.05t。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.15t至约0.05t。
在某些实施方案中，2B中Z2和Z4单元的组合数目是从约0.13t至约0.05t。
在某些实施方案中，Z2和Z4单元的组合数目是从约0.12t至约0.06t。
在某些实施方案中，Z2和Z4单元的组合数目是从约0.11t至约0.07t。
在某些实施方案中，Z2和Z4单元的组合数目是从约0.25t至约0.06t。
在某些实施方案中，Z2单元的数目是从0.02t至0.12t。
在某些实施方案中，Z2单元的数目是从0.04t至0.10t。
在某些实施方案中，Z2单元的数目是从0.06t至0.08t。
在某些实施方案中，Z2单元的数目是从0.07t至0.08t。
在某些实施方案中，Z2单元的数目是从0.075t至0.08t。
在某些实施方案中，Z2单元的数目是0.077t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.01t至0.12t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.02t至0.12t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.04t至0.10t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.06t至0.08t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.01t至0.04t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.02t至0.03t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是从0.02t至0.025t。
在某些实施方案中，Z4单元的数目是0.023t。
在某些实施方案中，将药物与间隔子L4偶联的可逆的前药接头L2具有式XIIa：
其中
虚线表示通过形成酰胺键与药物化合物(未示出)的氮的附接；
-X-是-C(R4R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4R4a)-C(R5R5a)-；-C(R5R5a)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-O-；-O-C(R4R4a)-；或-C(R7R7a)-；
X1是C；或S(O)；
-X2-是-C(R8R8a)-；或-C(R8R8a)-C(R9R9a)-；
＝X3是＝O；＝S；或＝N-CN；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R4、-R4a、-R5、-R5a、-R6、-R8、-R8a、-R9、-R9a独立地选自-H；和C1-6烷基；
-R3、-R3a独立地选自-H；和C1-6烷基，条件是如果-R3、-R3a中的一个或二者不是-H，则它们通过SP3杂化碳原子和与它们附接的N连接；
-R7是-N(R10R10a)；或-NR10-(C＝O)-R11；
-R7a、-R10、-R10a、-R11各自独立地是-H；或C1-10烷基；
任选地，-R1a/-R4a、-R1a/-R5a、-R1a/-R7a、-R4a/-R5a、-R8a/-R9a中的一对或多对形成化学键；
任选地，-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R4/-R4a、-R5/-R5a、-R8/-R8a、
-R9/-R9a中的一对或多对和与它们附接的原子连接在一起以形成C3-10环烷基；或3元至10元杂环基；
任选地，-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7a、-R4/-R5、-R4/-R6、-R8/-R9、-R2/-R3中的一对或多对和与它们附接的原子连接在一起以形成环A；
任选地，R3/R3a和与它们附接的氮原子连接在一起以形成3元至10元杂环；
环A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；3元至10元杂环基；和8元至11元杂双环基；并且
其中式XIIa的基团经-L4取代，条件是式(XIIa)中用星号标记的氢不被-L4或其他取代基替代；
其中-L4-是单化学键或如本文所定义的间隔子部分。
在某些实施方案中，可逆的前药接头L2具有式VIIa：
其中：
每个星号代表与间隔子L4的独立附接位点。
在某些实施方案中，可逆的前药接头L2与间隔子L4一起具有式VIIc：
其中：
最右边的波浪线代表与药物的氮原子的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸2B的单元Z2的附接点。
在某些实施方案中，连接透明质酸聚合物2A与透明质酸聚合物2B的间隔子L4(通过连接聚合物2A的单元Z3与聚合物2B的单元Z4)具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z3的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z4的附接点。
在某些实施方案中，连接透明质酸聚合物2A与透明质酸聚合物2B的间隔子L4可以在取向上反转，使得上式的最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z4的附接点；并且最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z3的附接点。
在某些实施方案中，连接可逆的前药接头L2与透明质酸聚合物2B的间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与L2的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z2的附接点；
其中：
L1是间隔子；并且
L3是生物可降解的间隔子。
在某些实施方案中，单元Z4是其中L1、L3和Ra2是如本文所定义的。
在某些实施方案中，单元Z2是
其中L1、L2、L3和Ra2是如本文所定义的。
在某些实施方案中，连接透明质酸聚合物2A与透明质酸聚合物2B的间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z3的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z4的附接点；
LA是间隔子；
LB是间隔子；并且
LC是生物可降解的间隔子。
在某些实施方案中，连接透明质酸聚合物2A与透明质酸聚合物2B的间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z3的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z4的附接点。
在某些实施方案中，连接可逆的前药接头L2与透明质酸聚合物2A的间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与L2的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z2的附接点；
其中：
LA是间隔子；
LB是间隔子；并且
LC是生物可降解的间隔子。
在某些实施方案中，LA是任选经取代的和/或任选经打断的C1-10亚烷基。
在某些实施方案中，LA是直链C2-4亚烷基。
在某些实施方案中，LB是直链-(O)-C1-5亚烷基。
在某些实施方案中，LC是：
其中m是从0至10，n是从1至4，并且o是从1至4。
在某些实施方案中，LC是：
在某些实施方案中，连接可逆的前药接头L2与透明质酸聚合物2B的间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z3的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z4的附接点。
在某些实施方案中，单元Z4是：
其中Ra2是如本文所定义的。
在某些实施方案中，单元Z2是：
其中L2、Ra2和药物是如本文所定义的。
在某些实施方案中，单元Z2是：
其中Ra2和药物是如本文所定义的。
在某些实施方案中，组合的可逆的前药接头L2与间隔子L4一起具有式VIId：
其中：
最右边的波浪线代表与药物的氮原子的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸2B的单元Z2的附接点。
在某些实施方案中，药物是抗体。
在某些实施方案中，所述抗体是VEGF拮抗剂。
在某些实施方案中，所述抗体是抗VEGF抗体片段。
在某些实施方案中，所述抗体片段是Fab抗体片段。
在某些实施方案中，所述Fab抗体片段是兰尼单抗或
在某些实施方案中，所述抗体包含以下六个高变区(HVR)：
(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Ile或His，X2是Ala或Arg，X3是Tyr或Lys，X4是Thr或Glu，X5是Arg、Tyr、Gln或Glu，X6是Ala或Glu，X7是Lys或Glu，并且X8是Gly或Glu；
(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Arg；
(e)包含X1ASFLYS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X1是Ser或Met；以及
(f)包含X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Gln、Asn或Thr，并且X2是Ala、Asn、Gln或Arg。
在某些实施方案中，所述抗体包含以下六个HVR：
(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)、GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO:21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，所述抗体包含以下六个HVR：
(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，所述抗体还包含以下重链可变(VH)结构域框架区(FR)：
(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H1；
(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H2；
(c)包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H3；以及
(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H4。在某些实施方案中，所述抗体还包含以下轻链可变(VL)结构域FR：
(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；
(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；
(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及
(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
在某些实施方案中，所述抗体包含以下六个HVR：
(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，所述抗体还包含以下VL结构域FR：
(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；
(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；
(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的FR-L3；以及
(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
在某些实施方案中，所述抗体包含以下六个HVR：
(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；
(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；
(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；
(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；
(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及
(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。
在某些实施方案中，所述抗体还包含以下VL结构域FR：
(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；
(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-L2；
(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-L3；以及
(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
在某些实施方案中，所述抗体还包含以下VH结构域FR：
(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；
(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；
(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及
(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-H4。
在某些实施方案中，所述抗体还包含以下VH结构域FR：
(e)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列的FR-H1；
(f)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；
(g)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及
(h)包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-H4。
在某些实施方案中，所述抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:11、40或42的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:12、41或46的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含(a)包含SEQ ID NO:11、40或42的氨基酸序列的VH结构域；(b)包含SEQ ID NO:12、41或46的氨基酸序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
在某些实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方案中，所述抗体包含含有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链。
在某些实施方案中，所述抗体-水凝胶缀合物具有相对于未与水凝胶共价附接的参照抗体增加的眼部有效半衰期。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约2倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约5倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约8倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约10倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约12倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约15倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期相对于所述参照抗体增加至少约16倍。
在某些实施方案中，所述眼部有效半衰期是玻璃体半衰期。
在某些实施方案中，所述参照抗体与所述抗体缀合物的抗体相同。
在某些实施方案中，本发明提供了药物组合物，其用作药物、用于制造治疗受试者的与病理性血管生成相关的障碍的药物、用于减少或抑制患有与病理性血管生成相关的障碍的受试者的血管生成、和/或用于治疗受试者的与病理性血管生成相关的障碍。
在某些实施方案中，所述药物组合物包含水凝胶缀合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含第二药剂，其中所述第二药剂选自抗体、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、镇痛剂和与第二生物分子结合的化合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物还包含第二药剂，其中所述第二药剂选自抗体、抗血管生成剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、皮质类固醇、镇痛剂和与第二生物分子结合的化合物。
在某些实施方案中，所述药物组合物的抗血管生成剂是VEGF拮抗剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物的VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体、抗VEGF受体抗体、可溶性VEGF受体融合蛋白、适配体、抗VEGF或VEGFR酪氨酸激酶抑制剂。
在某些实施方案中，所述药物组合物的抗VEGF抗体是兰尼单抗RTH-258或双特异性抗VEGF抗体。
在某些实施方案中，所述双特异性抗VEGF抗体是抗VEGF/抗Ang2抗体。
在某些实施方案中，所述抗VEGF/抗Ang2抗体是RG-7716。
在某些实施方案中，所述可溶性VEGF受体融合蛋白是阿柏西普
在某些实施方案中，所述适配体是哌加他尼
在某些实施方案中，所述抗VEGF是培化阿比西巴(abicipar pegol)。
在某些实施方案中，所述VEGFR酪氨酸激酶抑制剂选自4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟代-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、西玛米尼(semaxaminib)(SU5416)和(舒尼替尼)。
在某些实施方案中，所述第二生物分子选自IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；乙胞素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；和遗传上与AMD风险相关的蛋白质。
在某些实施方案中，所述VEGF受体是VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。
在某些实施方案中，遗传上与AMD风险相关的所述蛋白质选自补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；和TNFRSF10A。
在某些实施方案中，结合第二生物分子的所述化合物是抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方案中，所述抗原结合抗体片段选自Fab、Fab-C、Fab’-SH、Fv、scFv和(Fab’)2片段。
在某些实施方案中，与病理性血管生成相关的所述障碍是眼部障碍。
在某些实施方案中，所述眼部障碍选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病黄斑水肿(DME)(包括病灶性非中心DME和弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其他与局部缺血相关的视网膜病变、早产儿视网膜病变(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病(von Hippel-Lindau disease)、眼睛组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病(Coats’disease)、诺里病(Norrie Disease)、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇(Lebercongenital amaurosis)、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤和舍格伦病(disease)。
在某些实施方案中，所述眼部障碍是AMD、DME、DR或RVO。
在某些实施方案中，所述眼部障碍是AMD。
在某些实施方案中，AMD是湿性AMD。
在某些实施方案中，本发明提供了用于治疗眼部适应症的方法，所述方法包括给予治疗量的本文所述药物组合物的溶液。
在某些实施方案中，所述药物组合物的给予是眼内的。
在某些实施方案中，将所述药物组合物注入受试者的玻璃体内。
在某些实施方案中，所述药物组合物是使用规格为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32的针注射的。
在某些实施方案中，所述眼部适应症选自年龄相关性黄斑变性(AMD)、黄斑变性、黄斑水肿、糖尿病黄斑水肿(DME)(包括病灶性非中心DME和弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其他与局部缺血相关的视网膜病变、早产儿视网膜病变(ROP)、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(包括近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病、诺里病、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(包括传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤和舍格伦病。
在某些实施方案中，本发明提供了用于产生水凝胶药物缀合物的方法，所述方法包括：
(a)提供上面具有至少三个第一反应基团的第一透明质酸、或碱金属盐或其衍生物；
(b)提供上面具有至少两个第二反应基团的第二透明质酸、或碱金属盐或其衍生物，其中所述第一和第二反应基团能够互相反应以形成共价键；
(c)将至少一种药物与所述第一反应基团之一偶联；以及
(d)通过第一反应基团和第二反应基团的反应交联所述第一和第二透明质酸，以形成交联剂并且形成所述水凝胶缀合物。
在某些实施方案中，所述药物通过可逆的前药接头与所述第一透明质酸偶联。
在某些实施方案中，在与所述第一透明质酸偶联之前，将所述药物与所述可逆的前药接头偶联并且纯化，以形成纯化的药物-可逆的前药接头缀合物，其中将所述药物-可逆的前药接头缀合物通过以下方式纯化：
(a)用纯化标签标记所述药物-可逆的前药接头缀合物，以形成标记的药物-可逆的前药接头缀合物混合物；
(b)通过色谱分离从所述混合物中纯化标记的药物-可逆的前药接头单缀合物；以及
(c)从所述标记的药物-可逆的前药接头单缀合物中除去所述纯化标签，以形成所述纯化的药物-可逆的前药接头缀合物。
在某些实施方案中，所述交联剂包含生物可降解的间隔子部分。
在某些实施方案中，所述交联剂包含壬二酸酯部分。
附图说明
图1是根据本发明的交联透明质酸药物缀合物。
图2是用于制备马来酰亚胺官能化的透明质酸(HA)和具有缀合的药物的马来酰亚胺官能化的透明质酸的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图3是用于制备受保护的硫醇官能化的透明质酸、硫醇官能化的透明质酸和交联透明质酸前药组合物的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图4是用于制备马来酰亚胺官能化的透明质酸和受保护的二硫化物官能化的透明质酸的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图5是用于制备硫醇官能化的透明质酸、具有缀合的药物的硫醇官能化的透明质酸和交联透明质酸前药组合物的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图6是用于制备胺官能化的透明质酸并由其制备马来酰亚胺官能化的透明质酸的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图7是示出了马来酰亚胺官能化的透明质酸和具有缀合的药物的马来酰亚胺官能化的透明质酸的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图8是用于制备胺官能化的透明质酸、受保护的二硫化物官能化的透明质酸和硫醇官能化的透明质酸的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图9是用于制备交联透明质酸前药组合物的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图10是用于制备交联透明质酸前药组合物的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图11是用于制备交联透明质酸前药组合物的根据本公开文本的一方面的反应方案。
图12示出了与游离RabFab的PK(蓝色点和线)相比，从NZW兔中的交联HARabFab释放后的RabFab玻璃体PK(红色点和线)。
图13A和图13B是示出了NHP眼中交联HA水凝胶安慰剂的最小碎裂和颗粒运动的说明。
图14说明了交联HA水凝胶Rabfab缀合物在兔眼中的耐受性。
图15说明了交联HAG6.3.1AAR缀合物在食蟹猕猴眼中的耐受性。
具体实施方式
在一些方面，本公开文本总体上涉及用于制备包含交联透明质酸(HA)或其衍生物或盐的水凝胶前药组合物的方法，其中所述交联剂系统包含生物可降解的间隔子，其中所述交联HA包含缀合的药物-接头，并且其中所述接头能够在生理条件下释放药物。在一些此类方面，本公开文本的水凝胶HA前药组合物分别具有如图1、3、5和9所示的式1、10、16和26。在本文的式、结构和反应方案中，碳、氮、氧或硫原子上的任何开放的化合价应理解为代表氢原子。
参考图1，示出了根据本发明的交联HA药物缀合物化合物1。化合物1可以如下文进一步描述的来制备。在化合物1中，药物部分通过接头L2(其是可逆的前药接头部分)和间隔子L4(如本文进一步描述的)连接至HA部分。药物部分可以包括还如本文进一步描述的任何治疗性或生物活性部分。HA部分通过间隔子L4连接或交联在一起，并且L2-药物部分通过间隔子L4连接至HA部分。间隔子L4在每次出现时可以相同或不同，并且在许多实施方案中可以是生物可降解的，如本文进一步描述的。
间隔子L4可以根据用于交联HA部分和将L2-药物部分附接至HA部分的化学类型而变化。在本文的许多实施方案中，本发明的交联HA药物缀合物是基于硫醇-马来酰亚胺化学的，并且因此间隔子L4包含从硫醇和马来酰亚胺的反应产生的硫代丁二酰亚胺基团。然而，应理解，各种类型的化学可以用于根据本发明交联HA部分和将L2-药物部分附接至HA部分，也在本公开文本的范围内。例如，如WO 2003101972、WO 2011136645、WO 2013036748和WO2013171485(将其公开内容通过引用并入本文)中所披露的基于炔烃与叠氮化物的反应的“点击”化学可以用于交联HA部分和将L2-药物部分附接至HA部分。基于丙烯酸的交联化学、胺-环氧化物交联化学和其他成键化学也可以与本发明一起使用。
还参见图2和图3，示出了根据本发明的交联HA药物缀合物水凝胶化合物10(图3)。在化合物10中，化合物1的将HA部分连接在一起的间隔子L4更具体地显示为
并且将L2-药物部分连接至HA部分的间隔子L4更具体地显示为
其中L1和L3是如本文所定义的。通常，可以根据图2和图3中所描绘的方法制备化合物10。在第一步中，将第一HA化合物2(或其衍生物或盐)与马来酰亚胺化合物3缀合，以形成包含通过间隔子L1与HA缀合的马来酰亚胺反应基团的化合物4。
在第二步中，使硫醇-L2-药物缀合物化合物5与化合物4的马来酰亚胺反应基团反应，以形成包含缀合的-S-L2药物缀合物部分的化合物6。在一些方面，L2是能够在生理条件下控制药物的释放的可逆的前药接头部分，如本文其他地方进一步描述的。化合物5中的硫醇基团可以是可逆的前药接头L2的一部分。在一些方面，所述药物是可用于治疗眼睛的疾病的治疗剂，如抗VEGF分子。化合物4上的马来酰亚胺基团的当量超过药物缀合物化合物5的当量，使得化合物6包含游离马来酰亚胺基团。
在第三步中，将第二HA化合物2(或其衍生物或盐)与受保护的(用保护基团PG显示)硫醇化合物7缀合，以形成包含通过间隔子L3与HA缀合的受保护的硫醇基团的化合物8。在一些方面，L3是生物可降解的间隔子部分。
在第四步中，除去化合物8的保护基团以产生具有硫醇基团的化合物9。在某些实施方案中，保护基团可以与硫醇基团形成二硫化物，使得可以用还原剂除去保护基团。
在第五步中，将化合物6和化合物9合并并且反应，以形成交联HA水凝胶前药化合物10。
如图所示的马来酰亚胺和硫醇的官能化程度仅是说明性的，并且应当理解，并非HA化合物2中的所有羧酸酯基团都发生反应，并且在大多数实施方案中，大多数羧酸酯基团是未反应的。图2中的马来酰亚胺官能化的HA化合物4将具有足够程度的官能化，使得化合物4中的一部分马来酰亚胺官能团可用于附接药物(如化合物6中所示)并且剩余的马来酰亚胺基团可用于进行与化合物9的硫醇基团的交联反应以最终提供根据本发明的交联HA水凝胶前药组合物10。例如，化合物4的马来酰亚胺官能化程度的范围可以是从约5％至约15％，然而硫醇化合物9的官能化程度的范围可以是从约1％至约7％。
在某些实施方案中，HA化合物4被马来酰亚胺官能化的程度的范围可以是从约6％至约14％、从约7％至约13％、从约8％至约12％、从约10％至约12％和从约9％至约11％。如图3中所示的HA化合物9被硫醇官能化的程度可以例如从约1％至约7％、从约2％至约6％和从约3％至约5％变化。
在某些实施方案中，如图2所示的HA化合物4上的马来酰亚胺官能化程度可以是约10％，使得第一HA化合物2上约十分之一的羧酸酯基团被马来酰亚胺衍生化。换言之，如果HA化合物2在其上具有x个数目的羧酸酯基团，则化合物4包含0.1x个马来酰亚胺基团。如图3所示的HA化合物9上的硫醇官能化程度可以是约4％，或对于HA化合物2上的x个羧酸酯基团，化合物9上有0.04x个硫醇基团(并且相应地在化合物8上有0.04x个受保护的硫醇基团)。
在化合物6中，平均约77％的马来酰亚胺将经药物取代，而剩余的大约23％用于与化合物9的交联反应以提供交联凝胶10。因此，例如，用马来酰亚胺10％官能化的116kDa HA在其上将存在大约28个马来酰亚胺基团，其中大约22个马来酰亚胺基团将被药物处理。
4.
现在参考图4和图5，示出了化合物16的制备。
在第一步中，将第一HA化合物2(或其衍生物或盐)与马来酰亚胺化合物3缀合，以形成包含通过间隔子L3与HA缀合的马来酰亚胺反应基团的化合物11。
在第二步中，将第二HA化合物2(或其衍生物或盐)与受保护的(PG)二硫化物化合物7缀合，以形成包含通过间隔子L1与HA缀合的受保护的二硫化物基团的化合物12。在一些方面，L1是生物可降解的间隔子部分。
在第三步中，除去化合物12的保护基团以产生具有硫醇基团的化合物13。
在第四步中，使马来酰亚胺-L2-药物缀合物化合物14与化合物13的硫醇反应基团反应，以形成包含缀合的药物部分的化合物15。硫醇基团的当量超过化合物14的当量，使得化合物15包含游离硫醇基团。在一些方面，L2是能够在生理条件下控制药物的释放的可逆的前药接头部分。在一些方面，所述药物是抗VEGF分子。
在步骤5中，将化合物11和化合物15合并，使得其上分别的游离马来酰亚胺和硫醇基团反应，以形成交联HA水凝胶前药化合物16。在化合物16中，如图1所示的将HA部分连接在一起的间隔子L4更具体地表示为
并且将L2-药物部分连接至HA部分的间隔子L4更具体地表示为
其中L1和L3是如本文所定义的。
如上所述，如图所示的HA化合物2上的羧酸酯基团的官能化程度是任意的，并且是出于说明性目的。硫醇官能化的HA化合物13(和受保护的硫醇官能化化合物12)将具有比马来酰亚胺官能化的HA化合物11更高程度的官能化。化合物13中的一部分硫醇官能团将用于附接药物，并且剩余的硫醇基团可用于与化合物11的马来酰亚胺基团进行交联反应以提供交联HA水凝胶前药组合物16。例如，化合物13的硫醇官能化程度的范围可以是从约5％至约15％，然而马来酰亚胺化合物11的官能化程度的范围可以是从约1％至约7％。硫醇和马来酰亚胺官能化程度的变化允许在如上所述的本发明的生物缀合物中不同的交联密度和不同程度的药物负载。
在一些方面，如图6至图9所描绘，交联HA水凝胶前药可以通过以下方式来制备：(1)制备第一胺官能化的HA并由其制备马来酰亚胺基官能化的HA；(2)制备第二胺官能化的HA并由其制备硫醇官能化的HA；(3)将药物-接头缀合物与马来酰亚胺基官能化的HA缀合，其中一部分马来酰亚胺基不与药物-接头缀合物缀合；以及(4)通过第一官能化的HA上的马来酰亚胺基与第二官能化的HA上的硫醇基团反应形成交联HA水凝胶前药。
在图6步骤1中，使第一透明质酸钠化合物2(或其酸形式或衍生物)与H2N-LA-NH2化合物17反应，以形成胺官能化的HA化合物18，其中HA的胺官能化程度是从约5％至约15％、从约6％至约14％、从约7％至约13％、从约8％至约12％、从约9％至约11％，或在一些实施方案中，约10％；约11％；或约12％。在一些方面，LA是如本文所定义的间隔子部分。
如图6步骤2所描绘，使化合物18与N-羟基琥珀酰亚胺-LB-马来酰亚胺化合物19反应，以形成图7所描绘的马来酰亚胺基官能化的HA化合物20。在一些方面，LB是与试剂19的琥珀酰亚胺部分形成活化酯的间隔子部分。
如图7步骤3所描绘，使化合物20与硫醇药物缀合物化合物5反应，以形成前药前体化合物21。L2是如本文所定义的可逆的前药接头。
如图8步骤4所示，使第二透明质酸钠化合物2(或其酸形式或衍生物)与H2H-LA-NH2化合物17反应，以形成胺官能化的HA(化合物22)，其中HA的胺官能化程度可以从约1％至约7％、从约2％至约6％、从约3％至约5％变化并且在某些实施方案中是约4％。
如图8步骤5进一步所描绘，使化合物22与N-羟基琥珀酰亚胺-Lc-S保护基团(保护基团显示为“PG”)化合物23反应，以形成化合物24。然后在步骤6中将化合物24脱保护以除去保护基团并且形成硫醇官能化的HA化合物25。在一些方面，LC是与试剂23的琥珀酰亚胺部分形成活化酯的生物可降解的间隔子部分。如图9所描绘，使前药前体化合物21与硫醇官能化的HA化合物25交联，以形成交联HA水凝胶前药组合物26。在化合物26中，如图1所示的将HA部分连接在一起的间隔子L4更具体地表示为
并且将L2-药物部分连接至HA部分的间隔子L4更具体地表示为
其中LA、LB和LC是如本文所定义的。
如在上述图2-图3的实施方案中，在图6-图9的实施方案中，图7中的马来酰亚胺官能化的HA化合物20将具有比图8中的硫醇官能化的HA化合物25更高程度的官能化。化合物20中的一部分马来酰亚胺官能团将用于附接药物(如化合物21所示)，并且剩余的马来酰亚胺基团可用于与化合物25的硫醇基团进行交联反应以提供根据本发明的交联HA水凝胶前药组合物26。马来酰亚胺和硫醇基团的官能化程度的范围和值、交联密度的范围和值以及本文其他地方相关的药物负载的范围和值也适用于图6-图9的实施方案。
定义
如本文所用，透明质酸(HA)是指HA及其任何衍生物和盐。在某些实施方案中，HA可以具有式：
其中Ra1和Ra2各自独立地代表氢、低级烷基或其他酯形成基团、金属抗衡离子或铵(包括单烷基铵、二烷基铵、三烷基铵和四烷基铵)抗衡离子或其他类型的抗衡离子。在某些实施方案中，Ra1独立地选自H、C1-4烷基和碱金属抗衡离子，并且每个Ra2独立地选自H、C1-4烷基和碱金属抗衡离子。在一些方面，每个Ra1是Na+，并且每个Ra2是H。在如上所示的HA的一些可能的衍生物中，羟基可以各自独立地被C1-4烷基醚(未示出)或C1-4烷基酯(未示出)替代，并且每个酰胺官能团的氮原子可以任选地经C1-4烷基(也未示出)取代(烷基化)。HA数均分子量是约10kDa、约25kDa、约50kDa、约75kDa、约100kDa、约125kDa、约150kDa、约175kDa、约200kDa、约225kDa、约250kDa、约275kDa、约300kDa、约325kDa、约350kDa、约375kDa、约400kDa、约425kDa、约450kDa、约475kDa、约500kDa、约550kDa、约600kDa、约650kDa、约700kDa及其范围、如从约10kDa至约1000kDa、从约25kDa至约750kDa、从约50kDa至约250kDa、从约75kDa至约200kDa、从约75kDa至约175kDa、从约100kDa至约150kDa或从约100kDa至约125kDa。
术语“可逆的前药接头”或简单地“接头”是指在其一端通过可逆键附接至药物(例如，VEGF中和药物)并且在另一端通过永久键附接至载体(如根据本发明的水凝胶)从而将药物与载体连接的部分。可与本发明一起使用的示例性可逆的前药接头披露于WO2009095479，将其公开内容通过引用并入本文。在此类实施方案中，可逆的前药接头是式XIIa的基团
其中
虚线表示通过形成酰胺键与药物化合物(未示出)的氮的附接；
-X-是-C(R4R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4R4a)-C(R5R5a)-；-C(R5R5a)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-O-；-O-C(R4R4a)-；或-C(R7R7a)-；
X1是C；或S(O)；
-X2-是-C(R8R8a)-；或-C(R8R8a)-C(R9R9a)-；
＝X3是＝O；＝S；或＝N-CN；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R4、-R4a、-R5、-R5a、-R6、-R8、-R8a、-R9、-R9a独立地选自-H；和C1-6烷基；
-R3、-R3a独立地选自-H；和C1-6烷基，条件是如果-R3、-R3a中的一个或二者不是-H，则它们通过SP3杂化碳原子和与它们附接的N连接；
-R7是-N(R10R10a)；或-NR10-(C＝O)-R11；
-R7a、-R10、-R10a、-R11各自独立地是-H；或C1-10烷基；
任选地，-R1a/-R4a、-R1a/-R5a、-R1a/-R7a、-R4a/-R5a、-R8a/-R9a中的一对或多对形成化学键；
任选地，-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R4/-R4a、-R5/-R5a、-R8/-R8a、
-R9/-R9a中的一对或多对和与它们附接的原子连接在一起以形成C3-10环烷基；或3元至10元杂环基；
任选地，-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7a、-R4/-R5、-R4/-R6、-R8/-R9、-R2/-R3中的一对或多对和与它们附接的原子连接在一起以形成环A；
任选地，R3/R3a和与它们附接的氮原子连接在一起以形成3元至10元杂环；
A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；3元至10元杂环基；和8元至11元杂双环基；并且
其中式XIIa的基团经-L4取代，条件是式(XIIa)中用星号标记的氢不被-L4或其他取代基替代；
其中-L4-是单化学键或如本文所定义的间隔子部分；并且
其中C1-10烷基可以如本文所定义的任选地经打断和/或任选地经取代。
可用于本发明的其他实施方案的另外的可逆的前药接头描述于WO 05099768A2、WO 06136586A2、WO 2011/012722A1、WO 2011/089214A1、WO 2011/089216A1、WO 2011/089215A1、WO 2013/024053A1、WO 2013/160340A1、WO 2016/020373A1、WO 2016/196124A2、EP 1536334B1、WO 2009/009712A1、WO 2008/034122A1、WO 2009/143412A2、WO2011/082368A2、US 8618124B2、US 8946405B2、US 8754190B2、WO 2013/036857A1、US 7585837B2和WO 2002/089789A1，将其公开内容通过引用并入本文。
在许多实施方案中，间隔子或间隔子部分可以选自-T-、-C1-10亚烷基、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团打断；
其中：
-Ry1和-Ry1a各自独立地选自-H、-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-的基团打断；
每个T独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3元至10元杂环基、8元至11元杂双环基、8元至30元碳多环基和8元至30元杂多环基；其中每个T独立地任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代；
每个-Ry2独立地选自卤素、-CN、氧代(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代；并且
每个-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b独立地选自-H和C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代。
如果间隔子部分包含至少一个生物可降解的键，则这种间隔子是“生物可降解的间隔子”。
在某些实施方案中，间隔子部分可以选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-20烷基、C2-20烯基和C2-20炔基任选地被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团打断；
其中：
-Ry1和-Ry1a各自独立地选自-H、-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基；其中-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基任选地被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry4)-、-S(O)2N(Ry4)-、-S(O)N(Ry4)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry4)S(O)2N(Ry4a)-、-S-、-N(Ry4)-、-OC(ORy4)(Ry4a)-、-N(Ry4)C(O)N(Ry4a)-和-OC(O)N(Ry4)-的基团打断；
每个T独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3元至10元杂环基、8元至11元杂双环基、8元至30元碳多环基和8元至30元杂多环基；其中每个T独立地任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代；
-Ry2选自卤素、-CN、氧代(＝O)、-COORy5、-ORy5、-C(O)Ry5、-C(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2N(Ry5Ry5a)、-S(O)N(Ry5Ry5a)、-S(O)2Ry5、-S(O)Ry5、-N(Ry5)S(O)2N(Ry5aRy5b)、-SRy5、-N(Ry5Ry5a)、-NO2、-OC(O)Ry5、-N(Ry5)C(O)Ry5a、-N(Ry5)S(O)2Ry5a、-N(Ry5)S(O)Ry5a、-N(Ry5)C(O)ORy5a、-N(Ry5)C(O)N(Ry5aRy5b)、-OC(O)N(Ry5Ry5a)和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代；并且
每个-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代。
如果间隔子部分包含至少一个生物可降解的键，则这种间隔子是“生物可降解的间隔子”。
在仍其他实施方案中，间隔子部分可以选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry1)-、-S(O)2N(Ry1)-、-S(O)N(Ry1)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry1)S(O)2N(Ry1a)-、-S-、-N(Ry1)-、-OC(ORy1)(Ry1a)-、-N(Ry1)C(O)N(Ry1a)-、-OC(O)N(Ry1)-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基；其中-T-、C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地经一个或多个相同或不同的-Ry2取代，并且其中C1-50烷基、C2-50烯基和C2-50炔基任选地被一个或多个选自-T-、-C(O)O-、-O-、-C(O)-、-C(O)N(Ry3)-、-S(O)2N(Ry3)-、-S(O)N(Ry3)-、-S(O)2-、-S(O)-、-N(Ry3)S(O)2N(Ry3a)-、-S-、-N(Ry3)-、-OC(ORy3)(Ry3a)-、-N(Ry3)C(O)N(Ry3a)-和-OC(O)N(Ry3)-的基团打断；
其中：
-Ry1和-Ry1a独立地选自-H、-T、C1-10烷基、C2-10烯基和C2-10炔基；
每个T独立地选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3元至10元杂环基、8元至11元杂双环基、8元至30元碳多环基和8元至30元杂多环基；
每个-Ry2独立地选自卤素和C1-6烷基；并且
每个-Ry3、-Ry3a、-Ry4、-Ry4a、-Ry5、-Ry5a和-Ry5b各自独立地选自-H和C1-6烷基；其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代。
如果间隔子部分包含至少一个生物可降解的键，则这种间隔子是“生物可降解的间隔子”。在进一步的实施方案中，间隔子部分可以是C1-20烷基链，其任选地被一个或多个独立地选自-O-、-T-和-C(O)N(Ry1)-的基团打断；并且所述C1-20烷基链任选地经一个或多个独立地选自-OH、-T和-C(O)N(Ry6Ry6a)的基团取代；其中-Ry1、-Ry6、-Ry6a独立地选自H和C1-4烷基，并且其中T选自苯基、萘基、茚基、茚满基、四氢化萘基、C3-10环烷基、3元至10元杂环基、8元至11元杂双环基、8元至30元碳多环基和8元至30元杂多环基。
如果间隔子部分包含至少一个生物可降解的键，则这种间隔子是“生物可降解的间隔子”。
例如，生物可降解的键可以是酯键或碳酸酯键。
如本文所用，“标签”和“纯化标签”是指当与第二部分缀合时赋予(a)一种或多种不存在于不带标签部分的所述第二部分中的物理和/或化学特性并且所述一种或多种不同的物理和/或化学特性允许这种缀合物的纯化的部分。
如本文所用，“保护基团”或“PG”是指在化学反应过程中用于官能团的可逆保护以使这些官能团在所述化学反应过程中基本上不反应的部分。
如本文所用，术语“前药”意指药物与可逆的接头部分共价并且可逆地缀合的缀合物，所述可逆的前药接头部分直接或间接通过间隔子部分附接至载体(如根据本发明的水凝胶)。前药在生理条件下(水性缓冲液，37.4℃，pH 7.4)释放药物。这样释放的药物可以是未经修饰的，这意味着来自可逆的前药接头部分的残基不会仍与释放的药物附接。
如本文所用，术语“药物”是指可以影响生物有机体(包括但不限于病毒、细菌、真菌、植物、动物和人)的任何物理或生物化学特性的任何物质。特别地，如本文所用，所述术语包括旨在诊断、治愈、减轻、治疗或预防有机体(特别是人或动物)的疾病或以其他方式增强有机体(特别是人或动物)的身体或精神健康的任何物质。在一些方面，所述药物是调节选自以下的一种或多种蛋白质的活性的生物活性部分：碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、转化生长因子α(TGFα)、转化生长因子β(TGFβ)、血小板源性生长因子(PDGF)、血管生成素、血小板源性内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-12、血管内皮生长因子(VEGF)、血管生成素-I、Del-I、卵泡抑素、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)、瘦素、中期因子、胎盘生长因子、多效生长因子(PTN)、颗粒蛋白前体、增殖蛋白、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、angioarrestin、血管抑素纤溶酶原片段、抗血管生成抗凝血酶III、软骨源性抑制因子(CDI)、CDS9补体片段、内皮抑素胶原蛋白XVIII片段、纤连蛋白片段、gro-β、肝素酶、肝素六糖片段、人绒毛膜促性腺激素(hCG)、干扰素α/β/γ、干扰素诱导蛋白(IP-IO)、kringle S纤溶酶原片段、金属蛋白酶抑制剂(TIMP)、2-甲氧基雌二醇、胎盘核糖核酸酶抑制因子、纤溶酶原激活剂抑制因子、血小板因子-4(PF4)、催乳素16kD片段、增殖蛋白相关蛋白(PRP)、类维生素A、四氢皮质醇-S、血小板反应蛋白-I(TSP-I)、血管抑制素(vasculostatin)、血管抑制因子钙网蛋白片段、前列腺素受体、生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、鞘氨醇-1-磷酸、D因子、RTP801、补体抑制剂、α2肾上腺素能激动剂、mTOR、睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、晶状体上皮源性生长因子(LEDGF)、视杆细胞源性视锥细胞活性因子(rod-derived cone viability factor，RdCVF)、色素上皮源性因子(PEDF)、嗜中性粒细胞激活蛋白、单核细胞趋化蛋白、巨噬细胞炎症蛋白、小诱导分泌(SIS)蛋白、血小板因子、血小板碱性蛋白、黑素瘤生长刺激活性、表皮生长因子、神经生长因子、骨形态发生蛋白、骨生长软骨诱导因子、白细胞介素、白细胞介素抑制剂、白细胞介素受体、造血因子、粒细胞集落刺激因子、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、抑制素和激活素。在一些方面，所述药物是VEGF拮抗剂。术语“药物”也用于缀合药物，其与游离药物相比缺乏氢。
如本文所用，术语“VEGF拮抗剂”是指能够与VEGF结合、降低VEGF表达水平、或中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性(包括但不限于VEGF与一种或多种VEGF受体结合、VEGF信号传导和VEGF介导的血管生成和内皮细胞存活或增殖)的分子。例如，能够中和、阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性的分子可以通过与一种或多种VEGF受体(VEGFR)(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))结合而发挥其作用。作为可用于本发明方法的VEGF拮抗剂包括特异性地结合VEGF的多肽、抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF从而隔离其与一种或多种受体结合的受体分子和衍生物、融合蛋白(例如，VEGF-Trap(Regeneron))和VEGF121-多花白树毒蛋白(gelonin)(Peregrine)。VEGF拮抗剂还包括VEGF多肽的拮抗剂变体；与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的反义核碱基寡聚物；与编码VEGF多肽的核酸分子的至少一个片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；VEGF的肽体；和VEGF适配体。VEGF拮抗剂还包括结合VEGFR的多肽、抗VEGFR抗体及其抗原结合片段、以及结合VEGFR从而阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性(例如，VEGF信号传导)的衍生物、或融合蛋白。VEGF拮抗剂还包括结合VEGF或VEGFR并且能够阻断、抑制、消除、减少或干扰VEGF生物活性的非肽小分子。因此，术语“VEGF活性”具体包括VEGF介导的VEGF的生物活性。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在一些实施方案中，被VEGF特异性拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
如本文所用，VEGF拮抗剂可以包括但不限于抗VEGFR2抗体和相关分子(例如，雷莫芦单抗、塔尼比单抗(tanibirumab)、阿柏西普)、抗VEGFR1抗体和相关分子(例如，伊克鲁单抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF Trap-Eye；)、和ziv-阿柏西普(VEGF Trap；))、双特异性VEGF抗体(例如，MP-0250、凡努西单抗(vanucizumab)(VEGF-ANG2)和披露于US 2001/0236388的双特异性抗体)、包含抗VEGF、抗VEGFR1和抗VEGFR2臂中两者的组合的双特异性抗体、抗VEGF抗体(例如，贝伐单抗、赛瓦西单抗(sevacizumab)和兰尼单抗)以及非肽小分子VEGF拮抗剂(例如，帕唑帕尼、阿西替尼、凡德他尼、瑞伐非尼、卡博替尼、乐伐替尼、尼达尼布、奥安替尼(orantinib)、替拉替尼、多维替尼(dovitinig)、西地尼布、莫特塞尼、索凡替尼、阿帕替尼、弗雷替尼(foretinib)、法米替尼和替沃尼布(tivozanib))。另外的VEGF拮抗剂描述如下。
“障碍”是将受益于用本文所述的抗体缀合物治疗的任何病症。例如，患有异常血管生成(过度、不适当或不受控制的血管生成)或血管通透性或需要对其进行预防的哺乳动物。这包括慢性和急性障碍或疾病，包括使哺乳动物易患讨论中的障碍的那些病理状态。本文中待治疗的障碍的非限制性例子包括与病理性血管生成相关的障碍(例如，眼部障碍和细胞增生性障碍)和与不良血管通透性相关的障碍。
药剂(例如，药物制剂)的“有效量”是指在必要的剂量下并且持续必要的时间有效实现所需治疗或预防结果的量。
如本文所用，“治疗”(treatment)(及其语法变体，如“治疗”(treat)或“治疗”(treating))是指试图改变所治疗个体的自然过程，并且可以用于预防而进行或在临床病理过程中进行的临床干预。希望的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的减轻、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、降低疾病进展的速度、改善或缓和疾病状态以及缓解或改善预后。在一些实施方案中，本发明的抗体缀合物或包含本发明的抗体缀合物的其他组合物(例如，药物制剂)用于延缓疾病的发展或减缓疾病的进展。
术语“打断(interrupted)”意指部分插入在两个碳原子之间或者-如果插入是在所述部分的一个末端处-插入在碳或杂原子和氢原子之间，优选地插入在碳和氢原子之间。此类原子和部分的非限制性例子包括-O-、-S-、-N(H)-、-N(取代的)-、-NC(O)-和-OC(O)-。
如本文所用，单独或组合的术语“C1-4烷基”意指具有1至4个碳原子的直链或支链烷基部分。如果存在于分子末端，则直链或支链C1-4烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基和叔丁基。当分子的两个部分通过C1-4烷基连接时，则此类C1-4烷基的例子是-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-、-C(CH3)2-。C1-4烷基碳的每个氢可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，C1-4烷基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。
如本文所用，单独或组合的术语“C1-6烷基”意指具有1至6个碳原子的直链或支链烷基部分。如果存在于分子末端，则直链和支链C1-6烷基的例子是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、2-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基和3,3-二甲基丙基。当分子的两个部分通过C1-6烷基连接时，则此类C1-6烷基的例子是-CH2-、-CH2-CH2-、-CH(CH3)-、-CH2-CH2-CH2-、-CH(C2H5)-和-C(CH3)2-。C1-6碳的每个氢原子可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，C1-6烷基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。因此，“C1-10烷基”、“C1-20烷基”或“C1-50烷基”分别意指具有1至10、1至20或1至50个碳原子的烷基链，其中C1-10、C1-20或C1-50碳的每个氢原子可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，C1-10或C1-50烷基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。
如本文所用，术语“亚烷基”是指二价饱和脂族基团，如亚甲基、乙烯、丙烯等。
如本文所用，单独或组合的术语“C2-6烯基”意指包含至少一个碳-碳双键的具有2至6个碳原子的直链或支链烃部分。如果存在于分子末端，则例子是-CH＝CH2、-CH＝CH-CH3、-CH2-CH＝CH2、-CH＝CHCH2-CH3和-CH＝CH-CH＝CH2。当分子的两个部分通过C2-6烯基连接时，则这种C2-6烯基的例子是-CH＝CH-。C2-6烯基部分的每个氢原子可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，C2-6烯基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。因此，单独或组合的术语“C2-10烯基”、“C2-20烯基”或“C2-50烯基”意指包含至少一个碳-碳双键的具有2至10个、2至20个或2至50个碳原子的直链或支链烃部分。C2-10烯基、C2-20烯基或C2-50烯基的每个氢原子可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，C2-10烯基、C2-20烯基或C2-50烯基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。
如本文所用，单独或组合的术语“C2-6炔基”意指包含至少一个碳-碳三键的具有2至6个碳原子的直链或支链烃部分。如果存在于分子末端，则例子是-C≡CH、-CH2-C≡CH、CH2-CH2-C≡CH和CH2-C≡C-CH3。当分子的两个部分通过炔基连接时，则例子是-C≡C-。C2-6炔基的每个氢原子可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，可以出现一个或多个双键。任选地，C2-6炔基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。因此，如本文所用，单独或组合的术语“C2-10炔基”、“C2-20炔基”和“C2-50炔基”分别意指包含至少一个碳-碳三键的具有2至10、2至20或2至50个碳原子的直链或支链烃部分。C2-10炔基、C2-20炔基或C2-50炔基的每个氢原子可以任选地被如上文所定义的取代基替代。任选地，可以出现一个或多个双键。任选地，C2-10炔基、C2-20炔基或C2-50炔基可以被一个或多个如下文所定义的部分打断。
如上所述，C1-4烷基、C1-6烷基、C1-10烷基、C1-20烷基、C1-50烷基、C2-6烯基、C2-10烯基、C2-20烯基、C2-50烯基、C2-6炔基、C2-10炔基、C2-20烯基或C2-50炔基可以任选地被一个或多个优选地选自以下的部分打断：
其中
虚线表示与部分或试剂的其余部分的附接；并且
-R和-Ra各自独立地选自-H、甲基、乙基、丙基、丁基、戊基和己基。
如本文所用，术语“C3-10环烷基”意指具有3至10个碳原子的可以是饱和的或不饱和的环状烷基链，例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环己烯基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基。C3-10环烷基碳的每个氢原子可以被如上文所定义的取代基替代。术语“C3-10环烷基”还包括像降冰片烷或降冰片烯的桥接的双环。
术语“8元至30元碳多环基”或“8元至30元碳多环”意指具有8至30个环原子的两个或更多个环的环状部分，其中两个相邻的环共享至少一个环原子并且可以含有最多最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳族或非芳族环)。优选地，8元至30元碳多环基意指两个、三个、四个或五个环的环状部分，更优选两个、三个或四个环的环状部分。
如本文所用，术语“3元至10元杂环基”或“3元至10元杂环”意指具有3、4、5、6、7、8、9或10个环原子的环，其可以含有最多最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳族或非芳族环)，其中至少一个环原子多至4个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，并且其中所述环通过碳或氮原子连接至分子的剩余部分。3元至10元杂环的例子包括但不限于氮杂环丙烷、环氧乙烷、环硫乙烷、氮杂环丙烯、环氧乙烯、硫杂环丙烯、氮杂环丁烷、氧杂环丁烷、硫杂环丁烷、呋喃、噻吩、吡咯、吡咯啉、咪唑、咪唑啉、吡唑、吡唑啉、噁唑、噁唑啉、异噁唑、异噁唑啉、噻唑、噻唑啉、异噻唑、异噻唑啉、噻二唑、噻二唑啉、四氢呋喃、四氢噻吩、吡咯烷、咪唑烷、吡唑烷、噁唑烷、异噁唑烷、噻唑烷、异噻唑烷、噻二唑烷、环丁砜、吡喃、二氢吡喃、四氢吡喃、咪唑烷、吡啶、哒嗪、吡嗪、嘧啶、哌嗪、哌啶、吗啉、四唑、三唑、三唑烷、四唑烷、二氮杂烷(diazepane)、氮杂卓和高哌嗪。3元至10元杂环基或3元至10元杂环基团的每个氢原子可以被如下文所定义的取代基替代。
如本文所用，术语“8元至11元杂双环基”或“8元至11元杂双环”意指具有8至11个环原子的两个环的杂环部分，其中至少一个环原子由两个环共享并且可以含有最多最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳族或非芳族环)，其中至少一个环原子多至6个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，并且其中所述环通过碳或氮原子连接至分子的剩余部分。8元至11元杂双环的例子是吲哚、二氢吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噁唑、苯并异噁唑、苯并噻唑、苯并异噻唑、苯并咪唑、苯并咪唑啉、喹啉、喹唑啉、二氢喹唑啉、喹啉、二氢喹啉、四氢喹啉、十氢喹啉、异喹啉、十氢异喹啉、四氢异喹啉、二氢异喹啉、苯并氮杂卓、嘌呤和蝶啶。术语8元至11元杂双环还包括像1,4-二氧杂-8-氮杂螺[4.5]癸烷的两个环的螺环结构或像8-氮杂-双环[3.2.1]辛烷的桥接杂环。8元至11元杂双环基或8元至11元杂双环碳的每个氢原子可以被如下文所定义的取代基替代。
类似地，术语“8元至30元杂多环基”或“8元至30元杂多环”意指具有8至30个环原子的多于两个环的杂环部分，优选地三个、四个或五个环的杂环部分，其中两个相邻的环共享至少一个环原子并且可以含有最多最大数目的双键(完全饱和、部分饱和或不饱和的芳族或非芳族环)，其中至少一个环原子多至10个环原子被选自硫(包括-S(O)-、-S(O)2-)、氧和氮(包括＝N(O)-)的杂原子替代，并且其中所述环通过碳或氮原子连接至分子的剩余部分。
如本文所用，“卤素”意指氟、氯、溴或碘。通常优选的是，卤素是氟或氯。
如本文所用，术语“部分不饱和的”是指环部分在环原子之间包含至少一个双键或三键但不是芳族的。术语“部分不饱和的”旨在包括具有多个不饱和位点的环，但不旨在包括如本文所定义的芳基或杂芳基部分。
如本文关于间隔子部分或其他化学种类所用的术语“生物可降解的”意指所述间隔子部分或化学种类能够在生物或生理条件下发生降解或键断裂。生物降解可以通过水解、酶促切割或其他机制发生。本文所述的间隔子部分通常将通过键断裂反应在玻璃体液中发生降解，所述键断裂反应在注入或暴露于玻璃体的不超过12个月的半衰期时发生，在一些实施方案中在不超过6个月的半衰期时发生。间隔子部分的生物降解可以发生于将间隔子与其他基团附接的化学键处，也可以发生于间隔子部分内的化学键处。
如本文所用，除非另有说明，否则术语“任选经取代的”意指基团可以经一个或多个(例如，1、2、3或4个)针对该基团列出的取代基取代，其中所述取代基可以相同或不同。在一些方面，任选经取代的基团具有1个取代基。在另一方面，任选经取代的基团具有2个取代基。在另一方面，任选经取代的基团具有3个取代基。
如本文与烷基、烯基、炔基或亚烷基一起使用的术语“打断”意指一个或多个碳原子被官能团或杂原子替代，使得在烷基、烯基、炔基或亚烷基中的被打断。除非本文另有说明，否则可以打断烷基、烯基、炔基或亚烷基的示例性基团包括T；-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R17)-；-S(O)2N(R17)-；-S(O)N(R17)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R17)S(O)2N(R17a)-；-S-；-N(R17)-；-OC(O)R17；-N(R17)C(O)-；-N(R17)S(O)2-；-N(R17)S(O)-；-N(R17)C(O)O-；-N(R17)C(O)N(R17a)-；和-OC(O)N(R17R17a)，其中R17在每次出现时独立地是H或C1-50烷基。
术语“经取代的”意指分子的一个或多个-H原子被不同的原子或原子团替代，所述原子或原子团被称为一个或多个“取代基”。合适的取代基选自卤素；CN；COOR15；OR15；C(O)R15；C(O)N(R15R15a)；S(O)2N(R15R15a)；S(O)N(R15R15a)；S(O)2R15；S(O)R15；N(R15)S(O)2N(R15aR15b)；SR15；N(R15R15a)；NO2；OC(O)R15；N(R15)C(O)R15a；N(R15)S(O)2R15a；N(R15)S(O)R15a；N(R15)C(O)OR15a；N(R15)C(O)N(R15aR15b)；OC(O)N(R15R15a)；T；C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地经一个或多个相同或不同的R16取代，并且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个选自T；-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R17)-；-S(O)2N(R17)-；-S(O)N(R17)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R17)S(O)2N(R17a)-；-S-；-N(R17)-；-OC(O)R17；-N(R17)C(O)-；-N(R17)S(O)2-；-N(R17)S(O)-；-N(R17)C(O)O-；-N(R17)C(O)N(R17a)-；和-OC(O)N(R17R17a)的基团打断。在一些此类方面，R15、R15a、R15b独立地选自H；T；和C1-50烷基；C2-50烯基；或C2-50炔基，其中T；C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地经一个或多个相同或不同的R16取代，并且其中C1-50烷基；C2-50烯基；和C2-50炔基任选地被一个或多个选自T；-C(O)O-；-O-；-C(O)-；-C(O)N(R17)-；-S(O)2N(R17)-；-S(O)N(R17)-；-S(O)2-；-S(O)-；-N(R17)S(O)2N(R17a)-；-S-；-N(R17)-；-OC(O)R17；-N(R17)C(O)-；-N(R17)S(O)2-；-N(R17)S(O)-；-N(R17)C(O)O-；-N(R17)C(O)N(R17a)-；和-OC(O)N(R17R17a)的基团打断。在一些此类方面，T选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；4至7元杂环基；或8元至11元杂双环基，其中T任选地经一个或多个相同或不同的R16取代。在一些此类方面，R16是卤素；CN；氧代(＝O)；COOR18；OR18；C(O)R18；C(O)N(R18R18a)；S(O)2N(R18R18a)；S(O)N(R18R18a)；S(O)2R18；S(O)R18；N(R18)S(O)2N(R18aR18b)；SR18；N(R18R18a)；NO2；OC(O)R18；N(R18)C(O)R18a；N(R18)S(O)2R18a；N(R18)S(O)R18a；N(R18)C(O)OR18a；N(R18)C(O)N(R18aR18b)；OC(O)N(R18R18a)；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代。在一些此类方面，R17、R17a、R18、R18a、R18b独立地选自H；或C1-6烷基，其中C1-6烷基任选地经一个或多个相同或不同的卤素取代。
如本文所用，“碱金属抗衡离子”是指Na+、K+和Li+。
如本文所用，术语“水凝胶”意指由均聚物或共聚物组成的亲水性或两亲性聚合物网络，其由于共价化学交联的存在而不溶。
如本文所用，术语“数均分子量”意指各聚合物的分子量的普通算术平均值。本领域技术人员理解，由聚合反应得到的聚合产物并非都具有相同的分子量，而是展现出分子量分布。因此，如本文所用的分子量范围、分子量、聚合物中单体数目的范围和聚合物中单体的数目是指数均分子量和单体的数均值。
如本文所用，术语“药物组合物”是指包含一种或多种活性成分和一种或多种惰性成分的组合物；以及由任何两种或更多种成分的组合、复合或聚集，或由一种或多种成分的解离，或由一种或多种成分的其他类型的反应或相互作用直接或间接得到的任何产品。
如本文所用，术语“赋形剂”是指与治疗剂(即VEGF中和前药，如抗VEGF抗体)一起给予的稀释剂、佐剂或媒介物。这种药物赋形剂可以是水；动物、植物或合成来源的油和石油(包括但不限于花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等)；淀粉；葡萄糖；乳糖；蔗糖；甘露醇；海藻糖；明胶；麦芽；米稻米；面粉；白垩；硅胶；硬脂酸钠；单硬脂酸甘油酯；滑石粉；氯化钠；脱脂乳粉；甘油；丙烯；二醇；乙醇；乙酸酯；琥珀酸酯；三羟甲基氨基甲烷(tris)；碳酸酯；磷酸酯；HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)；MES(2-(N-吗啉代)乙磺酸)；泊洛沙姆；泊洛沙胺(poloxamine)；CHAPS；/>像例如甘氨酸、赖氨酸或组氨酸的氨基酸；甘油三酯；甘露醇；乳糖；淀粉；硬脂酸镁；糖精钠；纤维素和碳酸镁。合适的药物赋形剂的例子描述于E.W.Martin的“Remington's Pharmaceutical Sciences”。制剂应该适合给予模式。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指分子或试剂经监管机构(如EMA(欧洲)和/或FDA(美国)和/或任何其他国家监管机构)批准用于动物、优选地用于人类。
出于本文的目的，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的轻链可变结构域(VL)框架或重链可变结构域(VH)框架的氨基酸序列的框架，如下文所定义。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可以包含其相同的氨基酸序列，或者它可以含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中，氨基酸变化的数目是10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少或者2或更少。在一些实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。
“亲和力”是指分子(例如，抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有指示，否则如本文所用，“结合亲和力”是指固有结合亲和力，其反映结合对(例如，抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可以表示为解离常数(Kd)。亲和力可以通过本领域已知的常见方法(包括本文所述的那些)测量。用于测量结合亲和力的具体说明性和示例性实施方案描述如下。
“亲和力成熟的”抗体是指在一个或多个高变区(HVR)和/或框架区(FR)中具有一个或多个改变的抗体，与不具有此类改变的亲本抗体相比，此类改变导致抗体对抗原的亲和力提高。
术语“血管内皮生长因子”或“VEGF”是指血管内皮生长因子蛋白A，如SEQ ID NO:47所例示(还参见Swiss Prot登录号P15692,Gene ID(NCBI):7422)。术语“VEGF”包括具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的蛋白质及其同源物和亚型。术语“VEGF”还包括VEGF的已知亚型(例如，剪接亚型)，例如VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189和VEGF206；以及其天然存在的等位基因和加工形式，包括通过纤溶酶切割VEGF165产生的110个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Ferrara Mol.Biol.Cell.21:687(2010)；Leung等人,Science,246:1306(1989)；和Houck等人,Mol.Endocrin.,5:1806(1991)中所述。术语“VEGF”还指代来自非人物种(如小鼠、大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF由诸如hVEGF(用于人VEGF)、mVEGF(用于鼠VEGF)等术语表示。术语“VEGF”还用于指代包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸8至109或1至109的多肽的截短形式。对任何此类形式的VEGF的指代可以在本申请中例如通过“VEGF109”、“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF165”鉴定。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所指示的编号。例如，截短的天然VEGF中的氨基酸位置17(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的位置17(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。如本文所用的术语“VEGF变体”是指在天然VEGF序列中包含一个或多个氨基酸突变的VEGF多肽。任选地，所述一个或多个氨基酸突变包括一个或多个氨基酸取代。为了速记本文所述的VEGF变体的名称的目的，需要注意的是，编号是指沿假定的天然VEGF的氨基酸序列的氨基酸残基位置(提供于Leung等人,同上和Houck等人,同上)。除非另有说明，否则如本文所用的术语“VEGF”表示VEGF-A。
术语“抗VEGF抗体”、“结合VEGF的抗体”和“特异性地结合VEGF的抗体”是指能够以足够的亲和力结合VEGF的抗体，使得所述抗体可用作靶向VEGF的诊断剂和/或治疗剂。在一个实施方案中，抗VEGF抗体与不相关的非VEGF蛋白结合的程度小于所述抗体与VEGF结合的约10％，如例如通过放射免疫测定(RIA)测量的。在某些实施方案中，结合VEGF的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)。在某些实施方案中，抗VEGF抗体结合VEGF的在来自不同物种的VEGF中保守的表位。
本文的术语“抗体”以最广泛的含义使用，并且包括多种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和只要展现出所需的抗原结合活性的抗体片段。
“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体的结合完整抗体所结合的抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv；Fab；Fab’；Fab-C；Fab’-SH；F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在一些情况下，抗体片段的例子包括但不限于Fv；Fab；Fab’；Fab’-SH；F(ab’)2；双抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv)；和由抗体片段形成的多特异性抗体。
抗体的木瓜蛋白酶消化产生两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段)和残留的“Fc”片段(反映了容易结晶的能力的名称)。Fab片段由整条轻(L)链连同重(H)链的可变区结构域(VH)和一条重链的首个恒定结构域(CH1)组成。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大的F(ab’)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫化物连接的Fab片段，并且仍然能够交联抗原。Fab’片段与Fab片段的不同之处在于在CH1结构域的羧基末端具有另外的一些残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab-C分子是这样表达使得序列在第一铰链半胱氨酸处截短从而在表达后直接产生具有游离半胱氨酸的Fab的Fab分子(参见例如，Shatz等人Mol.Pharmaceutics2016；PubMed识别码(PMID)27244474)。例如，Fab-C分子可以在重链的Cys227位置处具有游离半胱氨酸。在其他情况下，Fab-C分子可以在重链的Cys229位置处具有游离半胱氨酸。Fab’-SH是本文中Fab’的名称，其中恒定结构域的一个或多个半胱氨酸残基带有游离巯基。F(ab’)2抗体片段最初是作为Fab’片段对产生的，它们之间具有铰链半胱氨酸。抗体片段的其他化学偶联也是已知的。
本文的术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的含有恒定区的至少一部分的C末端区。所述术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基末端。然而，Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。除非本文另有说明，否则Fc区或恒定区中氨基酸残基的编号是根据EU编号系统，也称为EU索引，如Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所描述。
“Fv”由紧密非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。从这两个结构域的折叠中发出六个高变环(各自来自H链和L链的3个环)，其贡献氨基酸残基用于抗原结合并向抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或仅包含三个对抗原具有特异性的HVR的一半Fv)也具有识别和结合抗原的能力，尽管其亲和力经常低于整个结合位点。
“单链Fv”(也缩写为“sFv”或“scFv”)是包含连接到单条多肽链中的VH和VL抗体结构域的抗体片段。优选地，sFv多肽还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，其使sFv能够形成用于抗原结合的所需结构。关于sFv的综述，参见Pluckthun的The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag,New York,第269-315页(1994)。
术语“双抗体(diabody)”是指通过构建具有VH和VL结构域之间的短接头(约5-10个残基)的sFv片段(参见前段)制备的小抗体片段，使得获得V结构域的链间而非链内配对，从而产生二价片段，即具有两个抗原结合位点的片段。双特异性双抗体是两个“交叉”sFv片段的异二聚体，其中两种抗体的VH和VL结构域存在于不同的多肽链上。双抗体更全面地描述于例如EP 404,097；WO 93/11161；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。
“阻断”抗体或“拮抗剂”抗体是抑制或降低其结合抗原的生物活性的抗体。某些阻断抗体或拮抗剂抗体基本上或完全抑制抗原的生物活性。
与参照抗体的“结合相同表位的抗体”是指在竞争测定中将参照抗体与其抗原的结合阻断50％或更多的抗体，相反，在竞争测定中参照抗体将所述抗体与其抗原的结合阻断50％或更多。本文提供了示例性竞争测定。
术语“嵌合”抗体是指重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的其余部分衍生自不同来源或物种的抗体。
抗体的“类别”是指其重链所具有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五种主要类别的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且其中一些抗体可以进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称为α、δ、ε、γ和μ。
“亲本抗体”是包含如下氨基酸序列的抗体，来自所述氨基酸序列的一个或多个氨基酸残基被一个或多个残基替代。亲本抗体可以包含天然或野生型序列。相对于其他的天然、野生型或经修饰形式的抗体，亲本抗体可以具有预先存在的氨基酸序列修饰(如添加、缺失和/或取代)。亲本抗体可以针对目标靶抗原(例如，生物学上重要的多肽，如VEGF)。本文所述的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)可以是亲本抗体。
“效应子功能”是指可归因于抗体Fc区的那些生物活性，其随抗体同种型的变化而变化。抗体效应子功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体)的下调；和B细胞激活。
“框架”或“框架区”或“FR”是指除了高变区(HVR)残基之外的可变结构域残基。可变结构域的FR通常由四个FR结构域组成：FR1、FR2、FR3和FR4。
术语“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文中可互换地使用以指代具有与天然抗体结构基本上相似的结构或具有含有如本文所定义的Fc区的重链的抗体。
“人共有框架”是代表在人免疫球蛋白VL或VH框架序列的选择中最常出现的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列的选择是从可变结构域序列的亚组进行。通常，序列的亚组是如在Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991),第1-3卷中所述的亚组。在一个实施方案中，对于VL，所述亚组是如在Kabat等人,同上中所述的亚组κI。在一个实施方案中，对于VH，所述亚组是如在Kabat等人,同上中所述的亚组III。
“人源化”形式的非人(例如，啮齿动物)抗体是含有衍生自非人抗体的最小序列的嵌合抗体。在大多数情况下，人源化抗体是来自接受者的高变区的残基被来自具有所需抗体特异性、亲和力和能力的诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物等的非人物种(供体抗体)的高变区的残基替代的人免疫球蛋白(受体抗体)。在一些情况下，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可以包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含至少一个、通常两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的高变环与非人免疫球蛋白的高变环对应，并且全部或基本上全部的FR是人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体还任选地包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定区的至少一部分。关于进一步的细节，参见Jones等人,Nature 321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；以及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。
术语“可变的”是指可变结构域的某些区段在抗体间的序列上差异很大的事实。可变或“V”结构域介导抗原结合并且定义特定抗体对其特定抗原的特异性。然而，可变性在可变结构域的跨度上不是均匀分布的。相反，V区由通过称为“高变区”的具有极端可变性的较短区域隔开的称为框架区(FR)的15-30个氨基酸的相对不变的延伸组成，所述高变区各自长9-12个氨基酸。术语“高变区”或“HVR”当在本文中使用时是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自例如在VL中的约残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及在VH中的约残基26-35(H1)、49-65(H2)和95-102(H3)(在一个实施方案中，H1是约残基31-35)的氨基酸残基；(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))和/或来自“高变环”的那些残基(例如，在VL中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及在VH中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变区连接的主要采用β-片层构象的四个FR，所述三个高变区形成连接β-片层结构的环，并且在一些情况下形成β-片层结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密结合在一起，并且与来自另一条链的高变区一起有助于抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))。因此，HVR和FR序列通常按以下序列出现在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但是展现出各种效应子功能，如抗体参与抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变体是指同上的Kabat等人中的用于抗体的编译的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用此编号系统，实际线性氨基酸序列可以含有较少或另外的氨基酸，其对应于可变结构域的FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可以包含在H2的残基52之后的单个氨基酸插入(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过在抗体序列同源性区域与“标准”Kabat编号序列比对可以确定给定抗体的残基的Kabat编号。
当提及可变结构域中的残基时(大约是轻链的残基1-107和重链的残基1-113)，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人,Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，在同上的Kabat等人中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体可变结构域中的残基编号意指通过Kabat编号系统的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体恒定结构域中的残基编号意指通过EU编号系统的残基编号(例如，参见美国临时申请号60/640,323，用于EU编号的图)。
除非另有指示，否则可变结构域中的HVR残基和其他残基(例如，FR残基)在本文中根据同上的Kabat等人来编号。
当用于描述本文公开的各种抗体时，术语“分离的抗体”意指已经从表达它的细胞或细胞培养物中鉴定和分离和/或回收的抗体。其自然环境的污染组分是通常会干扰多肽的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质溶质或非蛋白质溶质。在一些实施方案中，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳)或色谱(例如，离子交换或反相HPLC)确定的，将抗体纯化至大于95％或99％的纯度。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见例如，Flatman等人,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)。在优选的实施方案中，抗体将被纯化(1)至通过使用旋转杯测序仪足以获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(2)至使用考马斯蓝或优选地银染在非还原或还原条件下通过SDS-PAGE测得的同质性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为多肽的天然环境的至少一种组分将不存在。然而，通常，将通过至少一个纯化步骤制备分离的多肽。
如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即，构成所述群体的各抗体是相同的和/或结合相同表位，但是例如含有天然存在的突变或在单克隆抗体制剂的产生期间产生的可能变体抗体除外，此类变体通常以少量存在)获得的抗体。与通常包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂相反，单克隆抗体制剂的每种单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。因此，修饰语“单克隆”表示从基本上同质的抗体群体获得的抗体的特征，并且不应解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，根据本发明待使用的单克隆抗体可以通过多种技术制备，所述多种技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文描述了制备单克隆抗体的此类方法和其他示例性方法。
术语“多特异性抗体”以最广泛的含义使用，并且明确涵盖包含重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)的抗体，其中VH-VL单元具有多表位特异性(即，能够结合一个生物分子上的两个不同表位或不同生物分子上的每个表位)。此类多特异性抗体包括但不限于全长抗体、具有两个或更多个VL和VH结构域的抗体、抗体片段(如Fab、Fab’、Fab-C、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体、已经共价或非共价连接的抗体片段)。“多表位特异性”是指特异性地结合一个或多个相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位的能力。“双重特异性”或“双特异性”是指特异性地结合一个或多个相同或不同靶标上的两个不同表位的能力。然而，与双特异性抗体相比，双重特异性抗体具有两个在氨基酸序列上相同的抗原结合臂，并且每个Fab臂能够识别两种抗原。双重特异性允许抗体与作为单个Fab或IgG分子的两种不同抗原以高亲和力相互作用。根据一个实施方案，IgG1形式的多特异性抗体以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位。“单特异性”是指仅结合一个表位的能力。
“天然抗体”是指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由二硫键键合的两条相同的轻链和两条相同的重链组成。从N末端到C末端，每条重链具有可变区(VH)(也称为可变重链结构域或重链可变结构域)，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N末端到C末端，每条轻链具有可变区(VL)(也称为可变轻链结构域或轻链可变结构域)，随后是恒定轻(CL)结构域。基于其恒定域的氨基酸序列，可以将抗体的轻链分配到两种类型(称为卡帕(κ)和拉姆达(λ))之一。
关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”或“特异性地结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或“对其具有特异性”意指可测量地不同于非特异性相互作用的结合。例如，可以通过与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量特异性结合。例如，特异性结合可以通过与类似于靶标的对照分子(例如，过量的未标记的靶标)竞争来确定。在这种情况下，如果标记的靶标与探针的结合被过量的未标记的靶标竞争性地抑制，则指示特异性结合。如本文所用的术语“特异性结合”或“特异性地结合”特定多肽或特定多肽靶标上的表位或“对其具有特异性”可以展现为例如分子对靶标具有10-4M或更低、可替代地10-5M或更低、可替代地10-6M或更低、可替代地10-7M或更低、可替代地10-8M或更低、可替代地10-9M或更低、可替代地10-10M或更低、可替代地10-11M或更低、可替代地10-12M或更低或在10-4M至10-6M或10 6M至10 10M或10 7M至10 9的范围内的Kd的Kd。如熟练的技术人员所理解的，亲和力和Kd值是负相关的。通过低Kd值测量对抗原的高亲和力。在一个实施方案中，术语“特异性结合”是指分子结合特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的结合。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在用以实现最大百分比序列同一性而比对序列和引入缺口(如果需要)并且不将任何保守取代视为序列同一性的一部分后，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的的比对可以按本领域技术内的多种方式来实现，例如使用公众可获得的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在所比较序列的全长中实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性％值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech,Inc.编写，并且源代码已经以用户文档提交在美国版权局(U.S.Copyright Office)，华盛顿，20559中，其中它在美国版权登记号TXU510087下进行了注册。ALIGN-2程序可从加利福尼亚州南旧金山的Genentech,Inc.公开获得，或者可以从源代码编译。应编译ALIGN-2程序以在UNIX操作系统(包括数字UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数均由ALIGN-2程序设置，并且不变。
在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况下，给定的氨基酸序列A与(to、with或against)给定的氨基酸序列B的氨基酸序列同一性％(其可替代地可以用短语表示为与(to、with或against)给定的氨基酸序列B具有或包含一定氨基酸序列同一性％的给定的氨基酸序列A)如下计算：100乘以分数X/Y，其中X是通过序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中作为相同匹配得分的氨基酸残基数，并且其中Y是B中氨基酸残基的总数。应当理解，当氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度时，A与B的氨基酸序列同一性％将不等于B与A的氨基酸序列同一性％。除非另有特别说明，否则本文所用的所有氨基酸序列同一性％值均如前段中所述的使用ALIGN-2计算机程序获得。
如本文所用，“给予”意指向受试者给予一定剂量的化合物(例如，本发明的抗体-水凝胶缀合物)或组合物(例如，药物组合物，例如包含本发明的抗体-水凝胶的药物组合物)的方法。本文所述的方法中利用的组合物可以例如玻璃体内地(例如，经玻璃体内注射)、经滴眼剂、肌内地、局部地、结膜下地、囊内地、眼内地、眶内地、经注射、经植入、经输注、经连续输注、在脂质组合物中给予。
“血管生成”是指新血管从预先存在的血管形成的过程。血管生成不同于血管发生，后者是从中胚层细胞前体从头形成内皮细胞。可以通过本发明的组合物和方法治疗与病理性血管生成相关的障碍。这些障碍包括非肿瘤性障碍和细胞增生性障碍。细胞增生性障碍包括但不限于下文描述的那些。非肿瘤性障碍包括但不限于眼部病症(非限制性眼部病症包括例如视网膜病变，包括增生性糖尿病视网膜病变、脉络膜新血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病和其他局部缺血相关的视网膜病变、糖尿病黄斑水肿(DME)、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(包括中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、早产儿视网膜病变(ROP)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病、诺里病、骨质疏松症-假神经胶质瘤综合征(OPPG)、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼和高血压视网膜病变)、自身免疫性疾病(例如，类风湿性关节炎(RA)、银屑病、强直性脊柱炎和炎性肠病(例如，克罗恩病(Crohn’s disease)和溃疡性结肠炎))、不希望的或异常的肥大、关节炎、银屑病关节炎、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、动脉硬化、血管再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯病(Grave’s disease))、角膜和其他组织移植、肺部炎症、急性肺损伤/ARDS、败血症、原发性肺动脉高压、恶性肺积液、脑水肿(例如，伴有急性卒中/闭合性颅脑损伤/创伤)、滑膜炎症、RA中血管翳形成、骨化性肌炎、肥厚骨形成、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊卵巢病、子宫内膜异位症、第3间隔疾病(3rd spacing of fluid disease)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、慢性哮喘、子宫肌瘤、早产、慢性炎症如IBD(克罗恩病和溃疡性结肠炎)、炎性肾病(包括肾小球肾炎特别是系膜增生性肾小球肾炎、溶血性尿毒症综合征、糖尿病肾病和高血压性肾硬化)、移植后发生的疾病、肾移植排斥、炎性疾病、肾病综合征、不希望的或异常的组织块生长(非癌症)、血友病性关节炎、增生性瘢痕、毛发生长抑制、奥-韦二氏综合征(Osler-Weber syndrome)、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(如与心包炎相关的心包积液)和胸腔积液。另外的眼部疾病描述如下。
可能与病理性血管生成相关的其他障碍包括骨不连骨折(无法愈合的骨折)、脓性肉芽肿、沙眼、血友病性关节、血管粘连和增生性瘢痕、移植排斥、纤维血管组织、酒糟鼻、获得性免疫缺陷综合征、动脉闭塞、特应性角膜炎、细菌性溃疡、白塞病(Bechet’s disease)、颈动脉阻塞性疾病、慢性炎症、慢性视网膜脱落、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃体炎、接触镜过度磨损、角膜移植排斥、角膜移植新血管形成、伊耳斯病(Eales disease)、流行性角结膜炎、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、高粘滞综合征、卡波西肉瘤(Kaposi’ssarcoma)、白血病、脂质变性、莱姆病(Lyme’s disease)、边缘角层分离、蚕蚀性角膜溃疡(Mooren ulcer)、除麻风病以外的分枝杆菌感染、近视、视盘小凹(optic pits)、骨关节炎、佩吉特病(Paget’s disease)、睫状体扁平部炎、类天疱疮、小水泡病(phylectenulosis)、多动脉炎、激光后并发症、原虫感染、弹力纤维性假黄瘤、翼状胬肉干燥性角膜炎、放射状角膜切开术、晶体后纤维增生症(retrolental fibroplasias)、类肉瘤、巩膜炎、镰状细胞性贫血、舍格伦综合征(Sjogren’s syndrome)、Stargart病、斯蒂文·约翰逊病(Steven’sJohnson disease)、上缘角膜炎、梅毒、系统性狼疮、泰里安边缘变性(Terrien’s marginaldegeneration)、弓形虫病、创伤、静脉阻塞、维生素A缺乏和韦格纳结节病(Wegenerssarcoidosis)、与糖尿病相关的不希望的血管生成、寄生虫病、异常伤口愈合、术后肥大、损伤或创伤、毛发生长抑制、排卵和黄体形成抑制、着床抑制和子宫内胚胎发育抑制。
如本文所用，术语“眼部障碍”包括与病理性血管生成相关的任何眼部障碍(在本文中也可互换地称为“眼部病症”)。眼部障碍的特征可以在于改变或不受调节的增生和/或新血管组织侵入诸如视网膜或角膜等眼部组织的结构中。非限制性眼部障碍包括例如AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD和地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，病灶性非中心DME和弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)和高原DR)、其他局部缺血相关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇(也称为利伯先天性黑矇或LCA)、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如，多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤、舍格伦病和其他眼科疾病，其中所述疾病或障碍与眼部新血管形成、血管渗漏和/或视网膜水肿相关。另外的示例性眼部障碍包括与虹膜发红(角的新血管形成)相关的疾病和由纤维血管或纤维组织的异常增生引起的疾病，包括所有形式的增生性玻璃体视网膜病变。
与角膜新血管形成相关的示例性疾病包括但不限于流行性角结膜炎、维生素A缺乏、接触镜过度磨损、特应性角膜炎、上缘角膜炎、翼状胬肉干燥性角膜炎、舍格伦综合征、酒糟鼻、小水泡病、梅毒、分枝杆菌感染、脂质变性、化学灼伤、细菌性溃疡、真菌性溃疡、单纯疱疹感染、带状疱疹感染、原虫感染、卡波西肉瘤、蚕食性角膜溃疡、泰里安边缘变性、边缘角层分离、类风湿性关节炎、系统性狼疮、多动脉炎、创伤、韦格纳结节病、巩膜炎、斯蒂文-约翰逊综合征(Stevens-Johnson syndrome)、类天疱疮、放射状角膜切开术和角膜移植排斥。
与视网膜/脉络膜新血管形成相关的示例性疾病包括但不限于糖尿病视网膜病变、黄斑变性、镰状细胞贫血、类肉瘤、梅毒、弹力纤维性假黄瘤、佩吉特病、静脉阻塞、动脉闭塞、颈动脉阻塞性疾病、慢性葡萄膜炎/玻璃体炎、分枝杆菌感染、莱姆病、系统性红斑狼疮、早产儿视网膜病变、视网膜色素变性、视网膜水肿(包括黄斑水肿)、伊耳斯病、白塞病、引起视网膜炎或脉络膜炎的感染(例如，多灶性脉络膜炎)、假定眼组织胞浆菌病、贝斯特病(Best’s disease)(卵黄状黄斑变性)、近视、视盘小凹、Stargart病、睫状体扁平部炎、视网膜脱落(例如，慢性视网膜脱落)、高粘滞综合征、弓形虫病、创伤和激光后并发症。
如本文所用，“与不良血管通透性相关的障碍”包括例如与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格斯综合征(Meigs’syndrome)、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸膜积液、与心血管疾病相关的通透性(如心肌梗塞和中风后的状况)等。
起始或参照多肽(例如，参照抗体或其一个或多个可变结构域/HVR)的“变体”或“突变体”是(1)具有不同于起始或参照多肽的氨基酸序列的氨基酸序列并且(2)通过天然或人工(人造)诱变从起始或参照多肽衍生的多肽。此类变体包含例如目标多肽的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代，在本文中称为“氨基酸残基改变”。因此，变体HVR是指包含相对于起始或参照多肽序列(如源抗体或抗原结合片段的序列)的变体序列的HVR。在此上下文中，氨基酸残基改变是指与起始或参照多肽序列(如参照抗体或其片段的序列)中的相应位置处的氨基酸不同的氨基酸。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的变体或突变体构建体，条件是最终的构建体具有所需的功能特征。氨基酸变化也可以改变多肽的翻译后过程，如改变糖基化位点的数目或位置。
“野生型(WT)”或“参照”序列或“野生型”或“参照”蛋白质/多肽的序列(如参照抗体的HVR或可变结构域)可以是通过引入突变衍生出变体多肽的参照序列。通常，给定蛋白质的“野生型”序列是自然界中最常见的序列。类似地，“野生型”基因序列是该基因的自然界中最常见的序列。可以通过自然过程或通过人为诱导的手段将突变引入“野生型”基因(以及其所编码的蛋白质)中。此类过程的产物是原始“野生型”蛋白质或基因的“变体”或“突变体”形式。
如本文所用，术语“清除率”是指每单位时间从区室(例如，眼睛(例如，玻璃体))中清除的物质(例如，抗VEGF抗体、抗体缀合物、融合蛋白(例如，Fab融合蛋白)或聚合物制剂)的体积。
术语“半衰期”是指物质(例如，抗VEGF抗体、抗体缀合物、融合蛋白(例如，Fab融合蛋白)或聚合物制剂)的浓度在体内(例如，在眼睛(例如，玻璃体)中)或在体外降低一半所需的时间。
术语“有效半衰期”是指缀合物(例如，水凝胶-接头-抗体缀合物)的浓度在体内(例如，在眼睛中，例如在玻璃体中)或在体外降低一半所需的时间。应当理解，缀合物的每种组分(例如，水凝胶、接头和抗体)可以有助于缀合物的有效半衰期。
HA纯化
根据本公开文本的方法，可以在衍生之前任选地纯化HA。在一些此类方面，形成包含HA和从约0.5mol/L至约1mol/L乙酸钠的水溶液。通过添加乙醇至约80％乙醇v/v使HA从溶液中沉淀出来。将沉淀的HA收集并且用约80％v/v乙醇洗涤，随后用无水乙醇洗涤。必要时可以重复溶解/沉淀/洗涤程序，直至达到所需的纯度。
胺官能化的透明质酸的制备
在一些方面，根据以下反应方案1，通过使包含式I的HA、伯胺(H2N-LA-NH2)和羧基活化偶联试剂的反应混合物反应将透明质酸用胺官能化，以形成式II的胺-HA和式III的部分交联的胺-HA胺。
反应方案1
如反应方案1中所示的HAII和III被胺试剂H2N-LA-NH2官能化的程度如本文其他地方所述。
在反应方案1中，每个Ra1独立地选自H、C1-4烷基、碱金属抗衡离子、铵抗衡离子或碱土金属抗衡离子。每个Ra2独立地选自H、C1-4烷基和碱金属抗衡离子。如下文进一步描述的，式III中的交联酯键可以随后被水解，以提供另外的式II的材料，并且使方案1的反应产物适合于无菌过滤。
在一些此类方面，LA是间隔子。在一些其他方面，LA是任选经取代的和/或任选经打断的C1-10亚烷基。在一些此类方面，LA是直链C2-4亚烷基，或者是正丙烯。在其他方面，LA可以包含氧化烯低聚物或聚合物如聚乙二醇(PEG)。
反应方案1中的酰胺形成利用偶联试剂，其在某些实施方案中可以选自1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二环己基碳二亚胺(DCC)、二异丙基碳二亚胺(DIC)、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓盐酸盐(DMTMM)和2-氯-4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪(CDMT)。在一些具体方面，所述偶联试剂是EDC。
在一些方面，所述反应混合物还可以包含偶联添加剂。在一些此类方面，所述偶联添加剂可以选自1-羟基苯并三唑(HOBt)、1-羟基-7-氮杂-1H-苯并三唑(HOAt)、N-羟基琥珀酰亚胺(HOSu)和2-氰基-2-(羟亚胺基)乙酸乙酯(Oxyma)。在一些具体方面，所述偶联添加剂是HOBt。在其他实施方案中，所述偶联试剂可以是1-氰基-2-乙氧基-2-氧代亚乙基氨基氧基)二甲基氨基-吗啉代-碳鎓六氟磷酸盐(COMU)。具有从约5至约6的pH的浓度为从约50mM至约150mM的缓冲液通常适用于反应混合物形成胺官能化的透明质酸。在一些此类方面，所述缓冲液是2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)。
在一些实施方案中，所述反应混合物还可以包含极性非质子溶剂以改善反应物的溶解度。在此类方面，缓冲液与极性非质子溶剂的合适比率是约1:3v/v、约1:2v/v、约1:1.5v/v、约1:1v/v、约1.5:1v/v、约2:1v/v、约3:1v/v、约5:1v/v或约10:1v/v。在一些此类方面，所述极性非质子溶剂可以选自丙酮、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙腈(ACN)、二甲基亚砜(DMSO)及其组合。在一方面，所述溶剂是乙腈。
胺官能化可以在约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃的温度下进行，持续适用于实现基本上完全的偶联的时间(如约2小时、约4小时、约6小时、约8小时、约10小时、约12小时或更长时间)。
在本公开文本的各方面中的任何方面，如上所述，在所形成的官能化的HA处，羧基的当量超过伯胺的当量，使得并非所有的HA羧基都被官能化，如反应方案I中所描绘。更具体地，引入胺官能团以提供约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％或约15％及其范围或如本文其他地方所述的HA(或其衍生物或其碱金属盐)的官能化程度。透明质酸、伯胺和偶联添加剂的浓度可以保持恒定，并且所述浓度独立于所形成的胺官能化的透明质酸的所需胺负荷。
合适的透明质酸浓度的例子的范围可以例如从2g/L至16g/L。胺试剂和酰胺偶联添加剂相对于HA I上的羧酸酯基团的当量的当量数可以根据需要而变化，以提供所需的官能化程度。在一些实施方案中，在过量胺试剂的存在下，可以基于酰胺偶联试剂的当量控制官能化程度。
如反应方案1中所描绘，HA的一部分可以通过酯键交联以形成部分交联的胺-HA。这样部分交联的HA可溶于水性体系，但是在大多数情况下不是无菌可过滤的。交联的HA可以在碱存在下孵育以水解酯键并且提供线性胺-HA。合适的碱包括碱金属碱，如NaOH、KOH和LiOH。水解可以在诸如约0.1M、约0.5M、约1M、约1.5M或约2M等碱浓度下，在从约12至约14、约13至约14或约14的pH下，在约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃的温度下进行，持续适用于实现基本上完全的水解的时间(如约0.5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时或更长时间)。这样水解的胺-HA具有与天然HA起始材料基本上相同的数均分子量，可溶于水性体系，并且是无菌可过滤的。水解后，可以用无机酸或有机酸将pH调节至从约6至约8.5、从约6.5至约8或至约7.5。在一些方面，所述酸是乙酸。
马来酰亚胺基官能化的HA的制备
在本公开文本的一些方面，使本文其他地方描述的胺官能化的HA与-N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-La-马来酰亚胺或NHS-LC-马来酰亚胺反应，以形成马来酰亚胺官能化的HA。在一些此类方面，根据以下反应方案2，使式II的HA衍生物与NHS-LB-马来酰亚胺或NHS-LC-马来酰亚胺(其中NHS是N-羟基琥珀酰亚胺并且呈与LB或LC的活化酯形式)反应，以形成式IV的马来酰亚胺官能化的HA。
反应方案2
其中Ra1、Ra2和LA是如本文其他地方所述的。在一些具体方面，所述马来酰亚胺间隔子是LB。在其他方面，所述马来酰亚胺间隔子是LC。如反应方案2中所示的HAII和IV分别被胺试剂H2N-LA-NH2和LB-马来酰亚胺或LC-马来酰亚胺官能化的程度是任意的，并且应当理解，官能化程度可以根据本发明的不同实施方案的需要而变化，并且马来酰亚胺官能化程度可以如本文其他地方所述。在许多实施方案中，使HA II上的大部分或全部胺官能团与LB-马来酰亚胺或LC-马来酰亚胺反应，但是在某些实施方案中可能存在残留的胺官能团。
在一些方面，LB是如本文所述的间隔子部分。在一些方面，LB是任选经取代的和/或任选经打断的C1-10亚烷基。在一些方面，LB是-C(O)-C1-5亚烷基。在一些此类方面，LB是直链-(O)-C2-3亚烷基，或者是-C(O)-乙烯。
在一些方面，Lc是如本文所述的生物可降解的间隔子部分。在一些方面，LC可以包含至少一个酯部分、至少一个碳酸酯键或其组合。
在一些方面，LC具有结构：
其中m选自1、2、3、4、5、6、7、8、9和10以及由其构成的范围(如从1至10、从2至8或从5至8)。n选自1、2、3和4以及由其构成的范围(如从1至4或从1至3)。o选自1、2、3和4以及由其构成的范围(如从1至4或从1至3)。在此类实施方案中，Lc-马来酰亚胺试剂具有结构：
在其中m是7的一些方面，LC包含衍生自壬二酸的部分，如壬二酸酯部分。在一个这样的方面，LC具有结构：
在此类实施方案中，Lc-马来酰亚胺试剂具有结构：
反应方案2的事件的反应pH合适地从约6.5至约9、从约7至约8或是约7.4。从约50mM至约150mM的缓冲液浓度通常适用于反应混合物形成马来酰亚胺官能化的透明质酸。在一些此类方面，所述缓冲液选自(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸)(HEPES)、马来酸盐、柠檬酸盐、BIS-Tris、磷酸盐、N-(2-乙酰胺基)亚氨基二乙酸(ADA)、碳酸盐、哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸)(PIPES)、3-吗啉代-2-羟基丙磺酸(MOPSO)、咪唑、BIS-Tris-丙烷、N,N-双(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、(3-(N-吗啉代)丙磺酸)(MOPS)、2-[(2-羟基-1,1-双(羟基甲基)乙基)氨基]乙磺酸(TES)、3-(双(2-羟基乙基)氨基)-2-羟基丙烷-1-磺酸(DIPSO)、2-羟基-3-[三(羟基甲基)甲基氨基]-1-丙磺酸(TAPSO)、4-(2-羟基乙基)哌嗪-1-(2-羟基丙磺酸)(HEPPSO)、哌嗪-1,4-双(2-羟基丙磺酸)脱水物(POPSO)、tricene、双甘氨肽和Tris。在一些具体方面，所述缓冲液是HEPES。所述反应混合物还可以包含极性非质子溶剂以改善反应物的溶解度。在此类方面，缓冲液与极性非质子溶剂的合适比率是约1:3v/v、约1:2v/v、约1:1.5v/v、约1:1v/v、约1.5:1v/v、约2:1v/v、约3:1v/v、约5:1v/v或约10:1v/v。在一些此类方面，所述极性非质子溶剂可以选自丙酮、DMF、ACN、DMSO及其组合。在一方面，所述溶剂是ACN。反应温度是约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃，并且反应时间是约0.5小时、约1小时、约1.5小时、约2小时或更长时间。
在反应方案2的一些方面，根据以下反应方案3，通过使胺官能化的HA的伯胺与NHS-LB-马来酰亚胺试剂反应获得马来酰亚胺官能化的HA。
反应方案3
在一些具体方面，LA是正丙烯，并且LB是-C(O)-(CH2)2-。在一些方面，所述缓冲液是HEPES，反应pH是从约7至约8或是约7.4，所述缓冲液以约2:1的缓冲液与ACN体积比包含ACN，反应温度是从约20℃至约30℃，并且反应时间是从约0.5小时至约2小时。
在反应方案2的一些其他方面，根据以下反应方案4，通过使胺官能化的HA的伯胺与NHS-LC-马来酰亚胺试剂反应获得马来酰亚胺基官能化的HA。
反应方案4
在一些具体方面，LA是正丙烯，并且LC具有结构：
其中m是7，p是2，并且o是2。在一些方面，所述缓冲液是HEPES，反应pH是从约8至约9或是约7.4，所述缓冲液以约2:1的缓冲液与ACN体积比包含ACN，反应温度是从约20℃至约30℃，并且反应时间是从约1小时至约3小时。
马来酰亚胺基官能化的HA的直接制备
在一些方面，如图2所描绘，可以通过使包含HA(或其衍生物或盐)、具有结构的马来酰亚胺化合物2和羧基活化偶联试剂的反应混合物反应将马来酰亚胺基团与HA直接缀合，以形成具有缀合的马来酰亚胺基团的化合物4。。
L1是如本文所述的间隔子部分。在一些方面，L1是C1-12烷基、C2-10烷基或C3-8烷基。如本文其他地方所述，L1可以任选地经取代和/或任选地经打断。例如，L1可以任选地被一个或多个酰胺或胺打断。
硫醇官能化的HA的制备
在本公开文本的一些方面，使本文其他地方描述的胺官能化的HA与NHS-LB-S-保护基团或NHS-LC-S-保护基团反应，随后脱保护，以形成硫醇官能化的HA。在一些此类方面，根据以下反应方案5，使式II或式IIa与NHS-LB-S-保护基团或NHS-LC-S-保护基团反应以形成式V，随后脱保护，以形成式VI的硫醇官能化的HA。
反应方案5
其中Ra1、Ra2、LA、LB和LC是如本文其他地方所述的。在一些具体方面，在方案5中，在化合物V中连接至-S-PG和在化合物VI中连接至-SH的间隔子是LC。
与上述反应方案5一样，反应方案5中所示的HAV和VI被NHS-LB-S-保护基团或NHS-LC-S-保护基团官能化的程度是任意的，并且应当理解，官能化程度可以根据本发明的不同实施方案的需要而变化。受保护的硫醇(以及最终硫醇)的官能化程度是如本文其他地方所述的。在许多实施方案中，使HA II上的大部分或全部胺官能团与NHS-LB-S-保护基团或NHS-LC-S-保护基团反应，但是在某些实施方案中可能存在残留的胺官能团。
反应方案5的缀合反应pH合适地从约7.5至约9.5、或从约8至约9，如约8.5。浓度为从约50mM至约150mM的合适缓冲液在本文的其他地方描述。在一些方面，所述缓冲液是HEPES。所述反应混合物还可以包含如本文其他地方所述的极性非质子溶剂以改善反应物的溶解度。在一些方面，所述溶剂是ACN。缓冲液与极性非质子溶剂的比率合适地是约1:2v/v至约4:1、或从约3:1至约1:1，如约2:1。反应温度是约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃，并且反应时间是约1小时、约2小时、约3小时、约4小时或更长时间。
使式V的HA衍生物与还原剂接触以在二硫键处切割保护基团，从而产生以硫醇封端的LB或LC(式VI)。可切割的保护基团是本领域已知的，并且非限制性例子包括吡啶基-硫醇和苯基-硫醇，其可以任选地经至少一个独立地选自NO2、Cl、F、CN、CO2H和Br的取代基取代。在一个这样的方面，离去基团是2-巯基吡啶基。还原剂是本领域已知的，并且包括(三(2-羧乙基)膦)HCl盐(TCEP)、2-巯基乙醇和二硫苏糖醇。
硫醇官能化的HA的直接制备
在一些方面，如图3所描绘，可以通过使包含HA(或其衍生物或盐)、具有结构H2N-L3-S-PG的受保护的二硫化物化合物6和羧基活化偶联试剂的反应混合物反应将受保护的二硫化物基团与HA直接缀合，以形成具有缀合的受保护的二硫化物基团的化合物8。可以如本文其他地方所述的切割所述保护基团，以产生硫醇官能化的HA。
药物-接头缀合物
将药物-接头缀合物(如图2中的试剂5、图5中的试剂14和图7中的试剂5)用于制备根据本发明的交联HA药物缀合物。在许多实施方案中，所述药物接头缀合物可以利用如上所述的式II的可逆的前药接头L2。在一些其他方面，在此类药物单缀合物中所用的可逆的前药接头部分L2可以由式XIIa表示：
其中：
虚线表示通过形成酰胺键与药物化合物(未示出)的氮的附接；并且
X、X1、X2、X3、R1、R1a、R2、R2a、R3和R3a是如上所定义的。
在许多实施方案中，为了方便合成，所述可逆的前药接头L2可以与间隔子L4或间隔子L4的一部分一起制备。
在一些实施方案中，所述可逆的前药接头部分L2与间隔子L4的一部分一起可以由包含式XIIc的间隔子-接头化合物表示：
其中最右边的波浪线代表通过酰胺键与药物的氮原子的附接点，并且最左边的波浪线代表通过硫键(未示出)与如本说明书所公开的交联HA水凝胶或其前体的附接点。所述接头间隔子部分XIIcd代表可逆的前药接头部分L2与间隔子L4的一部分的特定组合，其可以如下所述的便利地一起合成以用于本发明的具体实施方案中。
在一些方面，所述可逆的前药接头部分L2部分可以选自以下，其中波浪线表示与药物的氮原子的附接位点，并且其中每个L2经一个部分L4取代，条件是用星号标记的氢不被替代：
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药物-间隔子-接头缀合物的制备和纯化
在本公开文本的各方面中的任何方面，使用可逆的前药接头L2的药物-接头缀合物可以如下制备。如上所述，在许多实施方案中，为了方便合成，所述可逆的前药接头L2可以与间隔子L4或间隔子L4的一部分一起制备。式XIIb的部分用于示例性目的，但是本领域技术人员应认识到，以下程序的变体可以用于根据本发明的接头L2和间隔子L4的其他实施方案。
式VIIIa的化合物：
代表包含具有胺保护基团Pg1的可逆的前药接头L2、其上具有硫醇保护基团Pg2的间隔子L4的一部分和活化基团AG的部分。如图2至图9所示，所述硫醇保护基团代表与交联HA缀合物10、16和26或相应的前体HA部分5、14和19的附接点。所述活化基团AG是在与药物基团(如兰尼单抗或其上具有游离氨基的其他肽治疗剂)反应期间被置换以形成酰胺键的基团。通过基团Pg1保护的胺基团是参与连接药物与接头L2的酰胺键的切割的催化基团。
式VIIIa的接头L2和间隔子L4的一部分的组合化合物可以用于制备式VIIIb的化合物：
通过活化基团AG的置换，以与药物形成酰胺键。所述药物可以是例如如本文所述的具有一个或多个可用的游离氨基的治疗蛋白、抗体或抗体片段，所述游离氨基可与所述接头反应以通过酰胺键形成接头药物缀合物。
保护基团(PG)是本领域已知的。例如，在本公开文本的范围内的一些保护基团描述于国际公开号WO 2015/052155，将其内容通过引用以其整体并入本文。本领域技术人员应认识到，各种不同的保护和脱保护方案(如John Wiley&Sons,Inc.在“Greene'sProtective Groups in Organic Synthesis,”第5版,2014中描述的那些,也通过引用并入)可以与本发明一起使用作为本文所示的具体例子的替代方案。
在一些方面，所述胺保护基团Pg1是自杀式(self immolative)保护基团，其可以包含以下部分之一：
其中R18是任选经取代的和/或任选经打断的C1-10烷基。在一些方面，R18是C1-6胺。在其他方面，R18是C1-6二胺。
胺保护基团Pg1基团的一个例子如下：
其中波浪线表示与接头L2上的胺基团的附接点。
硫醇保护基团的一个例子是式-SO2CH3的甲磺酰基，使得形成甲烷硫代磺酸酯MTS。
活化基团也是本领域熟知的。在某些实施方案中，所述活化基团AG可以是呈酯形式的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)。其他此类活化的酯基团包括4-硝基酚和五氟苯酚酯。
在一个具体方面，上述式VIIIa的部分可以是具有结构VIIIc的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯甲烷硫代磺酸酯化合物：
化合物VIIIc代表化合物VIIIb，更具体地具有甲磺酰基作为Pg2、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯作为AG和上述胺保护基团作为Pg1。化合物VIIIc与药物的反应然后提供式VIIId的间隔子-接头-药物缀合物化合物：
药物间隔子接头双缀合物和三缀合物(未示出)也可以在一些实施方案中与单缀合物VIIId一起形成，并且所述单缀合物可以通过如以下实验例子中所述的柱分离与更高的缀合物分离。使单缀合物VIIId的未受保护的硫醇基团与如上所述的HA部分上的马来酰亚胺基团反应，并且所述未受保护的氨基参与药物-酰胺键的催化切割，以提供药物的定时释放。
置换NHS基团的药物(例如，兰尼单抗或其他治疗剂)可以合适地溶解于pH从约6至约9、或从7至约8(如约7.4)的缓冲液中，浓度是从约20mg/mL至约100mg/mL、从约30mg/mL至约50mg/mL或约40mg/mL。在一些方面，所述缓冲液包含约30mM磷酸钠。所述接头N-羟基琥珀酰亚胺酯可以合适地溶解于极性非质子溶剂(如DMSO)中。
将所述接头N-羟基琥珀酰亚胺酯和所述药物的溶液在约5℃下、在pH从约7至约8(如约7.4)下合并，并且反应最多约10分钟(如约5分钟)，以形成接头-药物缀合物的溶液。接头N-羟基琥珀酰亚胺酯与药物的当量比率是约1:1、约5:1、约10:1、约15:1或约20:1，如约5:1、约10:1或约15:1。所述接头-药物缀合物通常包含未缀合的药物、药物单缀合物、药物双缀合物、药物三缀合物和更高的缀合物的混合物。根据需要使用更长的反应时间和更大量的当量以及更高的反应温度。
可以根据需要使用的具体保护基团调节所述药物缀合物的溶液的pH。为了与以上所示的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯甲烷硫代磺酸酯化合物一起使用，可以将pH调节至约4。在一些方面，用具有从约2至约3.5的pH的缓冲液调节pH。在一些此类方面，所述缓冲液是pH3的琥珀酸(例如，约3M的琥珀酸)。在一些方面，pH调节后，所述接头-药物缀合物的溶液的缓冲液更换可以用具有约4的pH的缓冲液来进行。在一些此类方面，缓冲液更换可以用约5mM的pH 4.0的琥珀酸来进行。
可以将纯化标签部分用于制备和纯化根据本发明的药物接头单缀合物。在标签化步骤中，通过置换甲磺酰基引入纯化标签，使得所述纯化标签通过二硫键与所述缀合物连接。在本公开文本的范围内的纯化标签描述于国际公开号WO 2015/052155。在一些方面，所述纯化标签包含下式IX的部分：
其中：
SP是间隔子部分；
虚线表示与所述标签的其余部分的附接或可替代地所述标签与所述药物接头缀合物的附接点(例如，通过形成二硫键，其中4-巯基-3-烟酸是间隔子)；
R21、R21a、R21b、R22、R22a、R22b、R23、R23a、R23b、R24、R24a和R24b各自独立地是H或甲基；
每个s彼此独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个t彼此独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；
每个u彼此独立地是1、2、3、4、5、6、7或8；并且
每个v彼此独立地是1、2、3、4、5、6、7或8。
在一些方面，R21、R21a和R21b各自是甲基。在一些其他方面，R21是H，并且R21a和R21b是甲基。在一些方面，R22、R22a和R22b各自是甲基。在一些其他方面，R22是H，并且R22a和R22b是甲基。在一些方面，R23、R23a和R23b各自是甲基。在一些其他方面，R23是H，并且R23a和R23b是甲基。在一些方面，R24、R24a和R24b各自是甲基。在一些其他方面，R24是H，并且R24a和R24b是甲基。
在一些方面，s是1、2、3、4、5或6；2、3、4或5；3、4或5；或4。在一些方面，t是1、2、3、4、5或6；2、3、4或5；2、3或4；或3。在一些方面，u是1、2、3、4、5或6；1、2、3或4；1、2或3；或1。在一些方面，v是1、2、3、4、5或6；1、2、3或4；1、2或3；或1。
在一些方面，R21、R21a、R21b、R22、R22a、R22b、R23、R23a、R23b、R24、R24a和R24b各自是甲基；s是4，t是3，u是1，并且v是1。在一些其他方面，R21、R22、R23和R24各自是H；R21a、R21b、R22a、R22b、R23a、R23b、R24a和R24b各自是甲基；s是4，t是3，u是1，并且v是1。
在本公开文本的范围内的式IX的抗衡离子包括Cl-、TFA-、HSO4-和SO42-。
应当理解，式IX中的虚线表示与所述标签的剩余部分的附接，如果式IX的化合物是试剂并且优选地是氢的话；并且可替代地表示在缀合至所述药物接头缀合物后与所述药物接头缀合物的附接。
在一些具体方面，所述纯化标签具有式X：
其中虚线表示与式X的硫醇部分的附接。
在一些具体方面，所述纯化标签试剂具有式Xa：
在一些具体方面，所述标签-间隔子-接头-药物脱保护的单缀合物具有式VIIIe：
所述标签-间隔子-接头-药物脱保护的单缀合物VIIIe代表缀合物VIIId连同纯化标签Xa代替甲磺酰基保护基团。标签-间隔子-接头-药物脱保护的单缀合物VIIIe可以与上述更高的缀合物(未示出)一起存在。
应当理解，部分VIIIe和以下部分中提到的其他化合物也包含L4的部分。为了方便和更容易命名，从以下描述的化合物的名称中省略了间隔子部分。
标签化和胺脱保护可以如下进行。所述纯化标签的引入通过将含有相对于与接头-药物缀合物化学计量过量的纯化标签(如约1.5、2、2.5或3或甚至更多当量的纯化标签)的溶液与接头-药物缀合物的溶液合并来进行。其溶液中接头-药物缀合物的浓度合适地是约5mg/mL、约10mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL或约40mg/mL，如约10mg/mL至约20mg/mL或约10mg/mL至约40mg/mL。用于与所述药物接头缀合物反应的溶液中的标签的浓度合适地从约0.1mM至约1mM、从约0.2mM至约0.8mM、从约0.3mM至约0.7mM、从约0.4mM至约0.6mM。在某些实施方案中，标签的浓度是约0.5mM。在一些方面，所述标签溶液是水溶液。所述反应的pH合适地从约3至约5、从约3.5至约4.5或是约4。反应温度合适地从约10℃至约40℃，如约25℃。反应时间合适地是至少5分钟、或至少10分钟、或至少30分钟，如约15分钟或约35分钟。
脱保护可以通过在从约7至约8(如约7.4)的pH下孵育来进行。在一些方面，用含有N,N,N′-三甲基乙烯-1,3-二胺(TriMED)的磷酸盐缓冲液将pH调节至从约7至约8。孵育可以合适地在从约10℃至约40℃(如约25℃)的温度下进行，并且持续至少8小时(如约16小时)的时间。
脱保护后，将所述标签-接头-药物脱保护的缀合物的溶液的pH调节至从约3.5至约4.5或约4.0，用于随后纯化。在一些方面，pH调节可以用具有从约2.5至约3.5的pH的缓冲液(如pH 3.0的琥珀酸缓冲液)来进行。在随后纯化之前，可以任选地用缓冲液稀释pH调节的溶液。在一些方面，稀释可以用pH 4.0的琥珀酸缓冲液(例如，20mM琥珀酸缓冲液)来进行。
脱保护后，分离所述标签-接头-药物脱保护的缀合物的单缀合物种类。在一些方面，所述单缀合物可以通过阳离子交换色谱(CIEC)分离。在一些其他方面，所述单缀合物可以通过尺寸排阻色谱分离。在一些其他方面，所述单缀合物可以通过亲和色谱分离。在CIEC方面，合适的树脂是本领域已知的并且可从例如Bio-Rad Laboratories和GE Healthcare商购获得，并且包括例如但不限于50W、/>MP-50、Bio-Rex 70、/>100、50W、/>系列、UNOsphereTM系列、Source 15S、Source 30S和NuviaTM S。第二步中用于稀释的相同的缓冲液可以用作CIEC缓冲液。例如，缓冲液A可以是20mM琥珀酸(pH 4.0)，并且缓冲液B(用于洗脱)可以是20mM琥珀酸、1M NaCl(pH 4.0)。未缀合的药物首先在CIEC分离中洗脱，随后是所述药物单缀合物，然后是更高的缀合物(双缀合物和三缀合物)等。
在分离所述标签-接头-药物脱保护的单缀合物后，可以通过本领域已知的方法(如通过切向流过滤(TFF)或通过膜离心)浓缩所述单缀合物。可以任选地过滤经浓缩的单缀合物。浓缩后，最终浓度可以合适地从约0.2mg/mL至约20mg/mL、从约0.2mg/mL至约10mg/mL或是约5mg/mL。
接下来，通过在还原剂存在下切割二硫键，从分离且可能浓缩的标签-接头-药物脱保护的单缀合物上切割下所述纯化标签，以形成包含切割的标签和接头-药物单缀合物的混合物。
所述还原剂通常是小分子，并且可以选自例如β-巯基乙醇、谷胱甘肽、二硫苏糖醇(DTT)和TCEP。在一些方面，所述还原剂是DTT。标签切割可以合适地在从约3.5至约5.5(如约4或约4.5)的pH下来进行。在一些方面，在低于约15℃(如从约2℃至约8℃)的温度下，将DTT添加到所述标签-接头-药物脱保护的单缀合物的溶液中，至从约0.1mM至约20mM(如约1mM)的浓度。孵育可以合适地进行至少2小时、至少4小时、至少8小时。
在一些方面，脱保护和除去所述纯化标签后的接头-药物单缀合物具有式VIIIf：
如本文其他地方所述的，所述接头-药物单缀合物可以通过色谱从含有切割标签的混合物中分离。在CIEC方面，合适的树脂在本文的其他地方描述。通常，用于分离所述接头-药物单缀合物的CIEC用具有从约4至约7(如约5.5)的pH的缓冲液体系来进行。例如，缓冲液A可以是10mM组氨酸(pH 5.5)，并且缓冲液B(用于洗脱)可以是10mM组氨酸、500mMNaCl(pH 5.5)。所述接头-药物单缀合物首先在CIEC分离中洗脱，随后是潜在的二硫化物连接的二聚体和切割的标签。
可以任选地添加另外的缓冲液B以调节所述蛋白质溶液的渗透压。可以任选地将经分离的接头-药物单缀合物浓缩至超过50mg/mL或超过60mg/mL的浓度，随后用于制备包含本公开文本的交联HA的前药组合物。浓缩可以通过TFF或通过膜离心来进行。
药物-接头单缀合物与马来酰亚胺基官能化的HA的缀合
再次参考图2和图3以及图6至图9，所述接头-药物单缀合物VIIIf可以用作接头药物缀合物试剂5。如本文其他地方所述的，马来酰亚胺基相对于试剂5当量过量，使得一些比例的马来酰亚胺基不与所述药物-接头单缀合物缀合，并且因此可用于与硫醇官能化的HA交联。在一些方面，马来酰亚胺基官能化的HA与药物-接头单缀合物的当量比率是从1.1:1至约2:1，如约1.2:1、约1.3:1、约1.4:1、约1.5:1、约1.6:1、约1.7:1或约1.8:1。在一些方面，包含药物-接头单缀合物的反应混合物的浓度是从约25mg/mL至约100mg/mL(在蛋白质的基础上)、从约35mg/mL至约55mg/mL或是约55mg/mL。缀合在具有从约4.5至约6.5或从约5至约6(如约5.5)的pH的缓冲液体系中进行。在一些方面，所述缓冲液是10mM组氨酸、150mMNaCl和0.01％ Tween20。反应温度是约0℃、约5℃、10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃，并且将所述反应混合物孵育适用于实现基本上完全的缀合的时间(如从约1小时至约12小时或更长时间，如约2小时、约4小时或约6小时)。
在一些方面，所述药物-接头-马来酰亚胺基官能化的HA具有结构XII：
HA化合物XII的官能化程度可以如上所述变化，并且结构XII中的相对官能化程度仅是说明性的。在一些实施方案中，XII的HA链上的约0.5％至约6％、约1％至约5％、约1.5％至约4％、约2％至3％或约2％至约2.5％的羧酸酯位点被未反应的马来酰亚胺占据(并且因此可用于随后的交联反应)，同时约3％至约10％、约5％至约9％、约6％至约8％或约7％至约8％的羧酸酯位点被接头药物缀合物占据。在某些实施方案中，XII的HA链上的约4％的羧酸酯位点被未反应的马来酰亚胺占据，并且约6％的羧酸酯位点被接头药物缀合物占据。在某些实施方案中，XII的HA链上的约2.3％的羧酸酯位点被未反应的马来酰亚胺占据，并且约7.7％的羧酸酯位点被接头药物缀合物占据。如本文所述，通过所述药物连接物缀合物的硫醇基团与HA链上的马来酰亚胺基团的反应使所述药物接头缀合物与HA链结合。可以改变未反应的马来酰亚胺占据的位点的百分比和接头药物缀合物占据的位点的百分比，以控制最终水凝胶缀合物的交联度和药物负载。
包含交联HA的前药组合物的制备
在一些方面，本公开文本的前药组合物可以通过以下方式来制备：形成反应混合物，所述反应混合物包含如本文其他地方所述的药物-接头-马来酰亚胺基官能化的HA的溶液和如本文其他地方所述的硫醇官能化的HA的溶液；以及在足以实现HA交联的pH、时间和温度下孵育所述反应混合物。所述反应通常根据图9中所描绘的反应方案的步骤7进行，其中LA、LB、LC、L2和药物是如本文其他地方所述的。在一些方面，pH是从约4.5至约6.5或从约5至约6，如约5.5。反应温度是约0℃、约5℃、约10℃、约15℃、约20℃、约25℃、约30℃、约35℃或约40℃。
在一些方面，将所述反应混合物充分混合并且此后立刻填充到注射器中。然后可以将经预填充的注射器在环境温度下孵育从约8小时至约4周，以完成交联并且形成本公开文本的交联HA前药组合物。经预填充的注射器也可以在不在环境温度下进一步储存的情况下直接储存在2℃-8℃下。在一个实施方案中，将药物-接头-马来酰亚胺基官能化的HA和硫醇官能化的HA的单独溶液各自直接引入预填充注射器装置中并在其中混合，并且允许在所述预填充注射器装置中发生交联，并且允许在其中进行交联反应以在所述预填充注射器装置内原位形成交联HA前药组合物。在允许交联反应的合适时间(其可以根据温度和其他条件而变化)后，在不进一步混合或转移的情况下准备将所述交联HA前药组合物注射进患者体内。
在其他实施方案中，可以进行间歇聚合以进行交联反应。然后将所得凝胶使其通过筛网切碎，以使其可注射，并且随后转移到注射器装置中。
在一些方面，本公开文本的前药组合物具有式10：
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其中L1、L2、L3、官能化程度和药物是如本文其他地方所定义的。在一些其他方面，如本文其他地方所述的，所述HA可以经Ra1和/或Ra2取代。
在一些其他方面，本公开文本的前药组合物具有式16：
其中L1、L2、L3、官能化程度和药物是如本文其他地方所定义的。在一些其他方面，如本文其他地方所述的，所述HA可以经Ra1和/或Ra2取代。
在一些其他方面，本公开文本的前药组合物具有式26：
其中LA、LB、LC、L2、官能化程度和药物是如本文其他地方所定义的。在一些其他方面，所述HA可以经Ra1和/或如本文其他地方所述的取代。
用于制备包含交联HA的前药组合物的总体方法
用于制备包含交联HA的前药组合物的总体方法如图10和图11所描绘。
用于制备包含交联HA的前药组合物的一种方法如图10所描绘。在步骤1中，根据如本文其他地方所述的用于制备胺官能化的HA的方法制备胺-HA1。在步骤2中，根据如本文其他地方所述的用于制备马来酰亚胺基官能化的HA的方法从胺-HA 1制备具有永久性间隔子的马来酰亚胺-HA。在步骤3中，根据如本文其他地方所述的用于制备胺官能化的HA的方法制备胺-HA 2。在步骤4中，根据如本文其他地方所述的用于制备硫醇官能化的HA的方法制备包含可降解连接的硫醇基团的硫醇-HA 2。在步骤5中，根据本文其他地方所述的方法制备药物-接头-硫醇单缀合物。在步骤6中，如本文其他地方所述的，将所述药物-接头-硫醇单缀合物与具有间隔子的马来酰亚胺-HA缀合。在步骤7中，如本文其他地方所述的，包含交联HA的前药组合物是由药物-接头-马来酰亚胺-HA和可降解的硫醇-HA制备而来。步骤7可以包括步骤6的药物-马来酰亚胺-HA的无菌过滤和步骤4的可降解的硫醇HA直接进入进行交联的预填充注射器装置。
用于制备包含交联HA的前药组合物的另一种方法如图11所描绘。在步骤1中，根据如本文其他地方所述的用于制备胺官能化的HA的方法制备胺-HA 1。在步骤2中，根据如本文其他地方所述的用于制备马来酰亚胺基官能化的HA的方法从胺-HA1制备具有间隔子的马来酰亚胺-HA。在步骤3中，根据如本文其他地方所述的用于制备胺官能化的HA的方法制备胺-HA2。在步骤4中，根据如本文其他地方所述的用于制备硫醇官能化的HA的方法制备包含可降解连接的硫醇基团的硫醇-HA 2。在步骤5中，根据本文其他地方所述的方法制备药物-接头-硫醇单缀合物。在步骤6中，将所述药物-接头-硫醇单缀合物、具有永久性接头的马来酰亚胺-HA和具有可降解的接头的硫醇-HA合并并且缀合以形成包含交联HA的前药组合物。马来酰亚胺HA、药物接头硫醇单缀合物和硫醇HA可以各自无菌过滤并且转移到预填充注射器装置中，在所述预填充注射器装置中它们进行反应以形成最终的交联HA前药。图11步骤6的反应条件通常与用于制备前药组合物的条件的反应条件一致，如本文其他地方所述的，所述前药组合物包含来自药物-接头-马来酰亚胺-HA和可降解的硫醇-HA的交联HA。
药物组合物
本发明的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，其包括缓冲剂、等渗调节剂、防腐剂/抗微生物剂、稳定剂、抗吸附剂、抗氧化剂、增粘剂/粘度增强剂和/或其他助剂。
缓冲剂可以用于将组合物的pH维持在所需范围内。缓冲剂的非限制性例子包括磷酸钠、碳酸氢盐、琥珀酸盐、组氨酸、柠檬酸盐和乙酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氯化物和丙酮酸盐。
等渗调节剂可以用于将由于注射侧的渗透压差引起的细胞损伤可引起的疼痛最小化。等渗剂的非限制性例子包括甘油和氯化钠。
防腐剂/抗微生物剂可以用于将感染风险最小化。防腐剂的非限制性例子包括间甲酚、苯酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、氯丁醇、苯甲醇、硝酸苯汞、硫柳汞、山梨酸、山梨酸钾、苯甲酸、氯甲酚和苯扎氯铵。
稳定剂可以用于抑制水凝胶和药物的降解。稳定剂的非限制性例子包括：氨基酸，如丙氨酸、精氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、脯氨酸；糖类，如葡萄糖、蔗糖、海藻糖；多元醇，如甘油、甘露醇、山梨醇；盐类，如磷酸钾、硫酸钠；螯合剂，如EDTA、六磷酸盐；配体，如二价金属离子(锌、钙等)；低聚物或聚合物，如环糊精、葡聚糖、树枝状大分子、PEG或PVP或鱼精蛋白或HAS；和/或其他盐类或有机分子，如酚类衍生物。
抗吸附剂可以用于竞争性地涂覆或吸附到例如含有所述药物组合物的容器(如注射器)的表面。抗吸收剂可以是离子或非离子表面活性剂、蛋白质或可溶性聚合物。表面活性剂的非限制性例子包括：烷基硫酸盐，如月桂基硫酸铵和月桂基硫酸钠；烷基醚硫酸盐，如月桂醇醚硫酸钠和肉豆蔻醇醚硫酸钠；磺酸盐，如琥珀酸二辛酯磺酸钠、全氟辛烷磺酸盐、全氟丁烷磺酸盐、烷基苯磺酸盐；磷酸盐，如烷基芳基醚磷酸盐和烷基醚磷酸盐；羧酸盐，如脂肪酸盐(皂)或硬脂酸钠、月桂酰肌氨酸钠、全氟壬酸盐、全氟辛酸盐；奥替尼啶二盐酸盐；季铵阳离子，如十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基氯化铵、氯化十六烷基吡啶、聚乙氧基化牛脂胺、苯扎氯铵、苄索氯铵、5-溴-5-硝基-1,3-二噁烷、二甲基二十八烷基氯化铵、二十八烷基二甲基溴化铵；两性离子，如3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]-1-丙磺酸盐、椰油酰胺丙基羟基磺基甜菜碱、氨基酸、亚氨基酸、椰油酰胺丙基甜菜碱、卵磷脂；脂肪醇，如十六烷基醇、硬酯醇、十六十八醇、油醇；聚乙二醇烷基醚，如八乙二醇单十二烷基醚、五乙二醇单十二烷基醚；聚氧丙烯二醇烷基醚；葡萄糖苷烷基醚，如癸基葡糖苷、月桂基葡糖苷、辛基葡糖苷；聚乙二醇辛基酚醚，如Triton X-100；聚乙二醇烷基酚醚，如壬苯醇醚-9；甘油烷基酯，如月桂酸甘油酯；聚乙二醇脱水山梨醇烷基酯，如聚山梨酯；脱水山梨醇烷基酯；椰油酰胺MEA和椰油酰胺DEA；十二烷基二甲胺氧化物；聚乙二醇和聚丙二醇的嵌段共聚物，如泊洛沙姆(Pluronic F-68)、PEG十二烷基醚(Brij 35)、聚山梨酯20和80；其他抗吸收剂是葡聚糖、聚乙二醇、PEG-聚组氨酸、BSA和HSA以及明胶。
抗氧化剂的非限制性例子包括抗坏血酸、四氢嘧啶、甲硫氨酸、谷胱甘肽、一硫代甘油、桑色素、聚乙烯基亚胺(PEI)、没食子酸丙酯、维生素E、螯合剂如柠檬酸、EDTA、六磷酸盐和巯基乙酸。
所述交联HA水凝胶前药药物组合物可以在包含多剂量的药物组合物的容器中提供。这种多剂量药物组合物可以用于有需要的不同患者，或者可以用于一名患者，其中在第一剂量应用之后储存剩余剂量至需要时。在一些此类方面，所述容器是预填充的注射器。
所述交联HA水凝胶前药药物组合物可以作为单剂量或多剂量药物组合物在预填充的注射器中提供。
本公开文本的交联HA水凝胶前药药物组合物可以在低于约10℃的温度下合适地储存于注射器中。
治疗量的交联HA水凝胶前药药物组合物可以通过眼内注射来给予。例如，可以使用规格为22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32的针将所述组合物注射进有需要的受试者的玻璃体中。
在一些方面，所述交联HA水凝胶前药药物组合物可以在试剂盒中提供。在此类方面，所述试剂盒可以包含预先填充有所述交联HA水凝胶前药药物组合物的注射器、皮下注射针和使用说明书。
本发明提供了抗体缀合物，其包含与如本文所述的交联HA水凝胶组合物共价连接的抗体(例如，抗VEGF抗体)。
用于本发明的交联HA水凝胶缀合物组合物的示例性抗体
可以使用任何合适的抗体(例如，抗VEGF抗体)。例如，所述抗体可以特异性地结合选自以下的抗原：VEGF；白细胞介素-1β(IL-1β)；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-6受体(IL-6R)；白细胞介素-13(IL-13)；IL-13受体(IL-13R)；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；乙胞素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))；ST-2受体；以及遗传上与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险相关的蛋白质(例如，补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。此类抗体可以用于例如减少血管生成和/或用于治疗或延缓与病理性血管生成相关的障碍(例如，眼部障碍或细胞增生性障碍)的进展。可以用于本发明的抗体缀合物中的示例性的非限制性抗VEGF抗体进一步如下所述。
在一些情况下，所述抗VEGF抗体可以包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO:2)的氨基酸序列的HVR-H2，其中X1是Ile或His，X2是Ala或Arg，X3是Tyr或Lys，X4是Thr或Glu，X5是Arg、Tyr、Gln或Glu，X6是Ala或Glu，X7是Lys或Glu，并且X8是Gly或Glu；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列的HVR-L1，其中X1是Asp或Arg；(e)包含X1ASFLYS(SEQ ID NO:5)的氨基酸序列的HVR-L2，其中X1是Ser或Met；以及(f)包含X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO:6)的氨基酸序列的HVR-L3，其中X1是Gln、Asn或Thr，并且X2是Ala、Asn、Gln或Arg；或者一个或多个上述HVR和其一个或多个与SEQ ID NO:1-6中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的变体的组合。
例如，所述抗VEGF抗体可以包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)、GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO:21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)或QQGYGNPFT(SEQ IDNO:23)的氨基酸序列的HVR-L3；或者一个或多个上述HVR和其一个或多个与SEQ ID NO:1、3、7-10或21-23中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的变体的组合。
例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体可以包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3；或者一个或多个上述HVR和其一个或多个与SEQ ID NO:1、3或7-10中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的变体的组合。在一个具体例子中，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下重链可变结构域框架区(FR)：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ IDNO:16)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体可以包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGNPFT(SEQID NO:23)的氨基酸序列的HVR-L3；或者一个或多个上述HVR和其一个或多个与SEQ ID NO:1、3、8、9、22或23中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的变体的组合。在一个具体例子中，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ IDNO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ IDNO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下重链可变结构域框架区(FR)：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGNPFT(SEQ ID NO:23)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体可以包含选自以下的至少一个、两个、三个、四个、五个或六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ IDNO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3；或者一个或多个上述HVR和其一个或多个与SEQ ID NO:1、3、8-10或22中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的变体的组合。在一个具体例子中，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ IDNO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ IDNO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下重链可变结构域框架区(FR)：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQID NO:27)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ IDNO:19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在其他情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在其他情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在又其他情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在仍进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。
在其他情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。
例如，在其他情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ IDNO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ IDNO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
在其他情况下，所述抗VEGF抗体包含以下六个HVR：(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO:22)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个重链可变结构域FR：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:51)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-H4。在进一步的情况下，所述抗VEGF抗体包含以下四个轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:11、40或42中任一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:11、40或42中任一个的序列的重链可变(VH)结构域；(b)包含与SEQ ID NO:12、41或46中任一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:12、41或46中任一个的序列的轻链可变(VL)结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ IDNO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下重链可变结构域框架区(FR)：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)或DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO:45)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO:44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO:54)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO:55)的氨基酸序列的FR-L4。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSA SFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:59)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGT KVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO:60)的氨基酸序列的VL结构域。例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQID NO:11的序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:11具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQID NO:11的序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。在一些情况下，所述抗VEGF抗体可以包含(a)包含DYWIH(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO:7)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含FVFFLPYAMDY(SEQID NO:3)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含RASQDVSTAVA(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含SASFLYS(SEQ ID NO:9)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QQGYGAPFT(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列的HVR-L3。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下重链框架区：(a)包含EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:15)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列的FR-H4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含以下轻链框架区：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ IDNO:20)的氨基酸序列的FR-L4。在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含含有以下的结合结构域：(a)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的VH结构域和(b)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述示例性抗VEGF是N94A.F83A.N82aR.Y58R(也称为G6.31.AARR)。
在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:33或51具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:33或51的序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:12、34、35、36、37或38中任一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:12、34、35、36、37或38中任一个的序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，所述抗VEGF抗体包含(a)包含与SEQ ID NO:33或51具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:33或51的序列的VH结构域；(b)包含与SEQ ID NO:12、34、35、36、37或38中任一个具有至少90％序列同一性(例如，至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性)的氨基酸序列或SEQ ID NO:12、34、35、36、37或38中任一个的序列的VL结构域；或(c)如(a)中的VH结构域和如(b)中的VL结构域。例如，在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQID NO:38的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL结构域。在一些情况下，所述抗体包含含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH结构域和含有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的VL结构域。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下重链可变结构域框架区(FR)：(a)包含EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO:29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列的FR-H1；(b)包含WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO:30)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列的FR-H2；(c)包含RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列的FR-H3；以及(d)包含WGQGELVTVSS(SEQ ID NO:32)的氨基酸序列的FR-H4。
在一些情况下，任何前述抗VEGF抗体可以包含一个、两个、三个或四个以下轻链可变结构域FR：(a)包含DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO:17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO:26)的氨基酸序列的FR-L1；(b)包含WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO:18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQID NO:27)的氨基酸序列的FR-L2；(c)包含GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ IDNO:19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO:24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列的FR-L3；以及(d)包含FGQGTKVEIK(SEQ ID NO:20)的氨基酸序列的FR-L4。
在一些情况下，本发明提供了包含(a)包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列的重链和/或(b)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链的抗体。在某些实施方案中，所述抗体是以Fab形式表达的G6.31 AARR。
在一些情况下，本发明提供了包含(a)包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列的重链和/或(b)包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列的轻链的抗体。在某些实施方案中，所述抗体是缺乏与抗人IgG的反应性的G6.31 AARR的变体形式。
在一个进一步的方面，根据任何上述实施方案的抗体(例如，抗VEGF抗体)可以单独地或组合地掺入任何特征，如以下第1-7节中所述：
第1节：抗体亲和力
在某些实施方案中，本文提供的抗体的解离常数(Kd)≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如，10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M、例如从10-9M至10-13M)。例如，在一些情况下，本文提供的抗体以约10nM或更低的Kd结合抗原(例如，人VEGF(hVEGF))。在一些情况下，本文提供的抗体以约5nM或更低的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，本文提供的抗体以约2nM或更低的Kd结合hVEGF。例如，在一些情况下，所述抗体以在约25pM和约2nM之间(例如，约25pM、约50pM、约75pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约375pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约525pM、约550pM、约575pM、约600pM、约625pM、约650pM、约675pM、约700pM、约725pM、约750pM、约775pM、约800pM、约825pM、约850pM、约875pM、约900pM、约925pM、约950pM、约975pM、约1nM、约1.1nM、约1.2nM、约1.3nM、约1.4nM、约1.5nM、约1.6nM、约1.7nM、约1.8nM、约1.9nM或约2nM)的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和600pM之间(例如，约75pM、约100pM、约125pM、约150pM、约175pM、约200pM、约225pM、约250pM、约275pM、约300pM、约325pM、约350pM、约375pM、约400pM、约425pM、约450pM、约475pM、约500pM、约525pM、约550pM、约575pM、约600pM)的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约500pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约400pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约300pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约200pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约150pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约125pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以在约75pM和约100pM之间的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以约80pM的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以约60pM的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。在一些情况下，所述抗体以约40pM的Kd结合抗原(例如，hVEGF)。
在一个实施方案中，通过放射性标记的抗原结合测定(RIA)测量Kd。在一个实施方案中，使用目标抗体的Fab形式及其抗原进行RIA。例如，Fab对抗原的溶液结合亲和力是通过以下方式来测量：在未标记抗原的滴定系列的存在下用最小浓度的(125I)标记的抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体包被的板捕获结合的抗原(参见例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999))。为了建立测定条件，将多孔板(Thermo Scientific)用在50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml的捕获抗Fab抗体(Cappel Labs)包被过夜，并且随后在室温(大约23℃)下用在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的2％(w/v)牛血清白蛋白(BSA)封闭2至5小时。在非吸附板(Nunc#269620)中，将100pM或26pM的[125I]-抗原与目标Fab的连续稀释液混合(例如，与Presta等人,Cancer Res.57:4593-4599(1997)中的抗VEGF抗体Fab-12的评估一致)。然后将目标Fab孵育过夜；然而，孵育可以持续更长的时间(例如，约65小时)以确保达到平衡。此后，将所述混合物转移到捕获板中，以在室温下孵育(例如，1小时)。然后除去溶液，并且将板用PBS中的0.1％聚山梨醇酯20/> 洗涤8次。当板干燥后，添加150μl/孔的闪烁体(MICROSCINT-20TM；Packard)，并且将板在TOPCOUNTTM伽马计数器(Packard)上计数10分钟。选择给出小于或等于20％最大结合的每种Fab的浓度用于竞争性结合测定。
根据另一个实施方案，使用表面等离子共振测定测量Kd。例如，以约10个响应单位(RU)用固定化抗原CM5芯片在25℃下使用/>或(BIAcore,Inc.，新泽西州皮斯卡塔韦)进行测定。在一个实施方案中，根据供应商的说明，将羧甲基化的葡聚糖生物传感器芯片(CM5，BIAcore,Inc.)用N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化。在以5μl/分钟的流速注射前，将抗原用10mM乙酸钠(pH 4.8)稀释至5μg/ml(约0.2μM)以获得大约10个响应单位(RU)的偶联蛋白。注射抗原后，注射1M乙醇胺以封闭未反应的基团。用于动力学测量，在25℃下，以大约25μl/min的流速，将Fab的两倍连续稀释液(0.78nM至500nM)注射到含有0.05％聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)表面活性剂的PBS(PBST)中。通过同时拟合缔合和解离传感图，使用简单的一对一朗缪尔(Langmuir)结合模型(/>评估软件版本3.2)计算缔合速率(kon)和解离速率(koff)。将平衡解离常数(Kd)计算为比率koff/kon。参见例如，Chen等人,J.Mol.Biol.293:865-881(1999)。如果通过上述表面等离子体共振测定测得的缔合速率超过106M-1s-1，则可以通过使用荧光猝灭技术确定缔合速率，所述荧光淬灭技术在25℃下，在递增浓度的抗原的存在下，测量pH 7.2的PBS中20nM抗抗原抗体(Fab形式)的荧光发射强度的增加或减少(激发＝295nm；发射＝340nm，16nm带通)，如在带搅拌比色皿的光谱仪(如装有停流计(stop-flow)的分光光度计(Aviv Instruments)或8000系列SLM-AMINCOTM分光光度计(ThermoSpectronic))中所测量的。
第2节：抗体稳定性
在一些情况下，本发明的抗体缀合物或其组合物中使用的抗体具有增强的稳定性，例如与抗VEGF抗体(例如，G6.31)相比(参见例如，美国专利号7,758,859和国际申请公开号WO 2005/012359，将其通过引用以其整体并入本文)。抗体的稳定性可以使用本领域已知的任何方法(例如，差示扫描荧光测定(DSF)、圆二色性(CD)、蛋白内源荧光、差示扫描量热法、光谱法、光散射(例如，动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS))、自相互作用色谱(SIC))确定。与抗VEGF抗体(例如，G6.31)相比，所述抗VEGF抗体可以具有例如增强的解链温度(Tm)、聚集温度(Tagg)或其他稳定性指标。
在某些实施方案中，本文提供的抗体的Tm大于或等于约80℃(例如，约81℃、约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃或约93℃)。例如，在一些情况下，所述抗VEGF抗体的Tm大于或等于约83.5℃(例如，约83.5℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃、约92℃或约93℃)。在一些情况下，所述抗VEGF抗体的Tm是约82℃至约92℃(例如，约82℃、约83℃、约84℃、约85℃、约86℃、约87℃、约88℃、约89℃、约90℃、约91℃或约92℃)。在一些情况下，所述抗VEGF抗体的Tm是约82℃。在一些情况下，使用DSF确定抗VEGF抗体的任何前述Tm值。在一些实施方案中，抗VEGF抗体的Tm值如例如国际专利申请号PCT/US2016/053454的实施例1中所述的确定，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
第3节：抗体片段
在某些实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段。抗体片段包括但不限于Fab、Fab’、Fab-C、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv和scFv片段以及下文描述的其他片段。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)。关于scFv片段的综述，参见例如，Pluckthün的The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore编辑,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；以及美国专利号5,571,894和5,587,458。关于包含补救(salvage)受体结合表位残基且具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，其可以是二价的或双特异性的。参见例如，EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。
单结构域抗体是包含抗体的全部或部分重链可变结构域或者全部或部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.，马萨诸塞州沃尔瑟姆；参见例如，美国专利号6,248,516B1)。
抗体片段可以通过各种技术(包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如，大肠杆菌(E.coli)或噬菌体)产生，如本文所述)制备。
第4节：嵌合和人源化抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体描述于例如美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)。在一个例子中，嵌合抗体包含非人可变区(例如，衍生自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类动物(如猴)的可变结构域)和人恒定结构域。在一个进一步的例子中，嵌合抗体是类别或亚类已经从亲本抗体的类别或亚类改变的“类别转换”抗体。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些实施方案中，嵌合抗体是人源化抗体。通常，人源化非人抗体以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含HVR(例如，CDR)(或其部分)衍生自非人抗体，并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基经来自非人抗体(例如，衍生出HVR残基的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体及其制备方法综述于例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)，并且进一步描述于例如Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods36:25-34(2005)(描述了特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述了“表面重修”)；Dall’Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述了“FR改组”)；以及Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述了用于FR改组的“定向选择”方法)。
可以用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最佳拟合”方法选择的框架区(参见例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；衍生自轻链或重链可变区的特定亚组的人抗体的共有序列的框架区(参见例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；以及衍生自筛选FR文库的框架区(参见例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
第5节：文库衍生的抗体
本发明的抗体可以通过针对具有一种或多种所需活性的抗体筛选组合文库来分离。例如，用于产生噬菌体展示文库并且针对具有所需结合特征的抗体筛选此类文库的多种方法是本领域已知的。此类方法综述于例如Hoogenboom等人的Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,2001)中，并且进一步描述于例如McCafferty等人,Nature 348:552-554；Clackson等人,Nature 352:624-628(1991)；Marks等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1992)；Marks和Bradbury的Methods inMolecular Biology 248:161-175(Lo编辑,Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004)；Lee等人,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA101(34):12467-12472(2004)；以及Lee等人,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004)。
在某些噬菌体展示方法中，通过聚合酶链式反应(PCR)分别克隆VH和VL基因的库(repertoire)，并且在噬菌体文库中随机重组，然后可以如Winter等人,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)中所述的针对抗原结合噬菌体筛选所述噬菌体文库。噬菌体通常展示作为单链Fv(scFv)片段或作为Fab片段的抗体片段。来自免疫源的文库在不需要构建杂交瘤的情况下提供针对免疫原的高亲和力抗体。可替代地，可以克隆天然库(例如，从人)以在不进行任何免疫的情况下提供针对多种非自身和自身抗原的单一来源的抗体，如Griffiths等人,EMBO J,12:725-734(1993)所描述。最后，也可以通过从干细胞克隆未重排的V基因区段，并且使用含有随机序列的PCR引物编码高度可变的CDR3区并且完成体外重排合成地制备天然文库，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所描述。描述人抗体噬菌体文库的专利公开案包括例如：美国专利号5,750,373以及美国专利公开号2005/0079574、2005/0119455、2005/0266000、2007/0117126、2007/0160598、2007/0237764、2007/0292936和2009/0002360。
如在国际专利申请号PCT/US2016/053454中所述的，抗体或抗体片段可以衍生自噬菌体文库。
从人抗体文库中分离的抗体或抗体片段在本文中被认为是人抗体或人抗体片段。
第6节：多特异性抗体
在某些实施方案中，本文提供的抗体是多特异性抗体，例如双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点具有结合特异性的单克隆抗体。在某些实施方案中，所述结合特异性之一是针对VEGF，并且其他结合特异性是针对其他抗原(例如，第二生物分子，例如白细胞介素-1β(IL-1β)；白细胞介素-6(IL-6)；白细胞介素-6受体(IL-6R)；白细胞介素-13(IL-13)；IL-13受体(IL-13R)；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；乙胞素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜结合VEGF受体(mbVEGFR)或可溶性VEGF受体(sVEGFR))；ST-2受体；以及遗传上与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险相关的蛋白质(如补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。因此，所述双特异性抗体可以对VEGF和IL-1β；VEGF和IL-6；VEGF和IL-6R；VEGF和IL-13；VEGF和IL-13R；VEGF和PDGF(例如，PDGF-BB)；VEGF和血管生成素；VEGF和Ang2；VEGF和Tie2；VEGF和S1P；VEGF和整合素αvβ3；VEGF和整合素αvβ5；VEGF和整合素α5β1；VEGF和乙胞素；VEGF和apelin/APJ；VEGF和促红细胞生成素；VEGF和补体因子D；VEGF和TNFα；VEGF和HtrA1；VEGF和VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；VEGF和ST-2受体；VEGF和C2；VEGF和因子B；VEGF和因子H；VEGF和CFHR3；VEGF和C3b；VEGF和C5；VEGF和C5a；VEGF和C3a；VEGF和ARMS2；VEGF和TIMP3；VEGF和HLA；VEGF和IL-8；VEGF和CX3CR1；VEGF和TLR3；VEGF和TLR4；VEGF和CETP；VEGF和LIPC；VEGF和COL10A1；或VEGF和TNFRSF10A具有结合特异性。在某些实施方案中，双特异性抗体可以结合VEGF的两个不同表位。双特异性抗体也可以用于将细胞毒性剂定位至表达VEGF的细胞。可以将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段(例如，Fab、Fab'或Fab-C片段)。
在一些情况下，所述双特异性抗体是美国专利申请号US 2014/0017244中披露的双特异性抗VEGF/抗血管生成素2(Ang2)抗体，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。例如，所述抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可以包含结合VEGF的第一结合结构域(如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合Ang2的第二结合结构域，所述双特异性抗体包含(a)包含GYYMH(SEQ ID NO:61)的氨基酸序列的HVR-H1；(b)包含WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO:62)的氨基酸序列的HVR-H2；(c)包含SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列的HVR-H3；(d)包含GGNNIGSKSVH(SEQ ID NO:64)的氨基酸序列的HVR-L1；(e)包含DDSDRPS(SEQ ID NO:65)的氨基酸序列的HVR-L2；以及(f)包含QVWDSSSDHWV(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列的HVR-L3；或者一个或多个上述HVR和其一个或多个与SEQ ID NO:61-66中任一个具有至少约80％序列同一性(例如，81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性)的变体的组合。
在一些情况下，所述抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可以包含结合VEGF的第一结合结构域(如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合Ang2的第二结合结构域。在一些情况下，所述抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体可以包含结合VEGF的第一结合结构域(如本文所述的任何抗VEGF抗体)和特异性地结合Ang2的第二结合结构域，其中所述第二结合结构域是国际专利申请公开号WO 2010/069532中描述的任何抗体结合结构域或其变体，将所述专利申请通过引用以其整体并入本文。
在其他情况下，所述抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体是国际专利申请公开号WO2016/073157中描述的任何抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体。
在一些情况下，所述双特异性抗体是双特异性抗VEGF/抗IL-6抗体。在一些情况下，抗VEGF/抗IL-6双特异性抗体可以包含结合VEGF的第一结合结构域(如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合IL-6的第二结合结构域。所述第二结合结构域可以是本领域已知的任何抗IL-6抗体的结合结构域，所述抗体是例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见例如，WO 2016/073890，将其通过引用以其整体并入本文)、司妥昔单抗(siltuximab)欧罗单抗(olokizumab)、克莱赞珠单抗(clazakizumab)、思鲁库单抗(sirukumab)、艾西莫单抗(elsilimomab)、吉利单抗(gerilimzumab)、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其变体。
在一些情况下，所述双特异性抗体是双特异性抗VEGF/抗IL-6R抗体。在一些情况下，抗VEGF/抗IL-6R双特异性抗体可以包含结合VEGF的第一结合结构域(如本文所述的任何抗VEGF抗体)和结合IL-6R的第二结合结构域。所述第二结合结构域可以是本领域已知的任何抗IL-6R抗体的结合结构域，所述抗体是例如托珠单抗(tocilizumab)(参见例如，WO 1992/019579，将其通过引用以其整体并入本文)、萨瑞鲁单抗(sarilumab)、沃巴利单抗(vobarilizumab)(ALX-0061)、SA-237或其变体。
用于制备多特异性抗体的技术包括但不限于具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对的重组共表达(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983)、WO 93/08829和Traunecker等人,EMBO J.10:3655(1991))以及“杵臼结构(knob-in-hole)”工程化(参见例如，美国专利号5,731,168)。多特异性抗体也可以通过以下方式来制备：工程化静电转向效应以制备抗体Fc-异源二聚体分子(WO 2009/089004A1)；交联两种或更多种抗体或片段(参见例如，美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(参见例如，Kostelny等人,J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992))；使用“双抗体”技术以制备双特异性抗体片段(参见例如，Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(参见例如，Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及如例如在Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述的制备三特异性抗体。
本文还包括具有三个或更多个功能性抗原结合位点的工程化抗体，包括“章鱼抗体”(参见例如，US 2006/0025576A1)。
本文的抗体或片段还包括“双重作用FAb”或“DAF”，其包含结合VEGF以及另一种不同的抗原的抗原结合位点(参见例如，US 2008/0069820)。
第7节：抗体变体
在某些实施方案中，考虑了本文提供的抗体的氨基酸序列变体(例如，包含一个或多个氨基酸残基改变的抗体变体)。例如，可能希望改善所述抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过在编码所述抗体的核苷酸序列中引入适当的修饰或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如所述抗体的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以进行缺失、插入和取代的任何组合以获得最终的构建体，条件是最终的构建体具有所需的特征(例如，抗原结合)。
(a)取代、插入和缺失变体
在某些实施方案中，提供了具有一个或多个氨基酸取代的抗体变体。用于取代诱变的目标位点包括HVR和FR。保守取代示于表1中的“优选取代”标题下。更多实质变化提供于表1中的“示例性取代”标题下，并且如下文参考氨基酸侧链类别进一步描述的。可以将氨基酸取代引入目标抗体中，并且筛选产物的所需活性，例如保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或其他功能特征(例如，稳定性或效应子功能)。
表1
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)碱性：His、Lys、Arg；(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe；非保守取代将需要将这些类别之一的成员交换为另一类别。
一种类型的取代变体涉及取代亲本抗体(例如，人源化抗体)的一个或多个高变区残基和/或FR残基。通常，选择用于进一步研究的一种或多种所得变体相对于亲本抗体将具有某些生物学特性的修饰(例如，改善)(例如，增加的亲和力、增加的稳定性、增加的表达、改变的pI和/或降低的免疫原性)和/或将基本上保留亲本抗体的某些生物学特性。示例性取代变体是亲和力成熟的抗体，其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术(如本文所述的那些)方便地产生。简而言之，突变一个或多个HVR残基并且在噬菌体上展示变体抗体，并且针对特定的生物活性(例如，结合亲和力)进行筛选。
可以在HVR中进行改变(例如，取代)，例如以改善抗体亲和力。此类改变可以在HVR“热点”中进行，所述热点即在体细胞成熟过程中以高频率发生突变的密码子编码的残基(参见例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196(2008))和/或抗原接触的残基，并且测试所得变体VH或VL的结合亲和力。例如在Hoogenboom等人的Methods in MolecularBiology 178:1-37(O’Brien等人编辑,Human Press,Totowa,NJ,(2001))中已经描述了通过构建二级文库和从二级文库中重新选择进行的亲和力成熟。在亲和力成熟的一些实施方案中，通过多种方法中的任何一种(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸指导的诱变)，将多样性引入选择进行成熟的可变基因中。然后建立二级文库。然后筛选所述文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。用于引入多样性的另一种方法涉及HVR指导的方法，其中随机化几个HVR残基(例如，每次4-6个残基)。抗原结合涉及的HVR残基可以使用例如丙氨酸扫描诱变或建模来特异性地鉴定。特别地，通常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个HVR内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在HVR中进行基本上不降低结合亲和力的保守改变(例如，如本文提供的保守取代)。例如，此类改变可以在HVR中的抗原接触残基之外。在上文提供的变体VH和VL序列的某些实施方案中，每个HVR未改变，或者含有不超过一个、两个或三个氨基酸取代。
在某些实施方案中，取代、插入或缺失可以在一个或多个FR内发生，只要此类改变基本上不降低抗体结合抗原的能力。例如，此类改变可以改善抗体亲和力和/或稳定性(例如，如通过提高的解链温度评估的)。
用于鉴定可以靶向进行诱变的抗体残基或区域的有用方法称为“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所描述。在此方法中，鉴定残基或靶残基组(例如，带电残基，如Arg、Asp、His、Lys和Glu)并且用中性或带负电的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替代以确定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在氨基酸位置引入进一步的取代，证明对初始取代的功能敏感性。可替代地或另外地，抗原-抗体复合物的晶体结构用于鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基作为取代候选物。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端融合，长度范围从一个残基到含有一百个或更多个残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰残基的抗体。所述抗体分子的其他插入变体包括将所述抗体的N末端或C末端与酶(例如，用于ADEPT)或增加所述抗体的血清半衰期的多肽融合。
(b)等电点变体
本发明提供了具有改变的等电点的抗体变体。例如，本发明提供了具有降低的等电点(pI)(例如，与抗VEGF抗体(例如，G6.31)相比)的抗体变体。在一些情况下，在生理pH下减少表面电荷。在一些情况下，所述抗VEGF抗体的pI等于或低于约8(例如，约8、约7、约6、约5或约4)。在一些情况下，所述抗体的pI是从约4至约8(例如，约4、约5、约6、约7或约8)。在一些情况下，所述抗VEGF抗体的pI是从约5至约7(例如，约5、约6或约7)。在一些情况下，所述抗VEGF抗体的pI是从约5至约6(例如，约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6、约5.7、约5.8、约5.9或约6)。
可以工程化本发明的抗体以具有降低的pI，例如通过经具有较低pI的氨基酸取代给定位置处的野生型氨基酸残基。氨基酸的pI可以基于本领域已知的胺(-NH2)、羧酸(-COOH)和氨基酸侧链的pKa值来确定。在一些实施方案中，表面暴露的氨基酸残基可以经取代以降低抗体的pI。在一个实施方案中，表面暴露的氨基酸残基可以经谷氨酸(E)取代。在一个实施方案中，表面暴露的氨基酸残基可以经天冬氨酸(D)取代。
重组方法和组合物
本文所述的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)可以使用重组方法和组合物产生，例如如美国专利号4,816,567中所述。在一个实施方案中，提供了编码本文所述的抗VEGF抗体的分离的核酸。这种核酸可以编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和/或包含所述抗体的VH的氨基酸序列(例如，所述抗体的轻链和/或重链)。在一个进一步的实施方案中，提供了包含这种核酸的一种或多种载体(例如，表达载体)。在一个进一步的实施方案中，提供了包含这种核酸的宿主细胞。在一个这样的实施方案中，宿主细胞包含：(1)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列和包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的载体，或(2)包含编码包含所述抗体的VL的氨基酸序列的核酸的第一载体和包含编码包含所述抗体的VH的氨基酸序列的核酸的第二载体(例如，已经被其转化)。在一个实施方案中，所述宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。在一个实施方案中，提供了制备抗VEGF抗体的方法，其中所述方法包括在适用于表达所述抗体的条件下培养包含编码如以上所提供的抗体的核酸的宿主细胞，以及任选地从所述宿主细胞(或宿主细胞培养基)中回收所述抗体。
用于抗体(例如，抗VEGF抗体)的重组产生，分离编码例如如上所述的抗体的核酸，并且将其插入一种或多种载体中，用于在宿主细胞中进一步克隆和/或表达。可以使用常规程序(例如，通过使用能够与编码所述抗体重链和轻链的基因特异性地结合的寡核苷酸探针)容易地分离和测序这种核酸。
用于克隆或表达编码抗体的载体的合适的宿主细胞包括本文所述的原核或真核细胞。例如，可以在细菌中产生抗体，特别是当不需要糖基化和Fc效应子功能时。关于在细菌中表达抗体片段和多肽，参见例如，美国专利号5,648,237、5,789,199和5,840,523。还参见Charlton,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,Humana Press,Totowa,NJ,2003),第245-254页，其描述了在大肠杆菌中表达抗体片段。表达后，能以可溶性级分从细菌细胞糊中分离所述抗体，并且可以将其进一步纯化。
除原核生物之外，真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是编码抗体的载体的合适的克隆或表达宿主，包括其糖基化途径已经“人源化”从而产生具有部分或完全人糖基化模式的抗体的真菌和酵母菌株。参见Gerngross,Nat.Biotech.22:1409-1414(2004)；和Li等人,Nat.Biotech.24:210-215(2006)。
用于表达糖基化抗体的合适的宿主细胞也衍生自多细胞有机体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物细胞和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞结合使用的许多杆状病毒株，特别是用于草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的转染。
植物细胞培养物也可以用作宿主。参见例如，美国专利号5,959,177、6,040,498、6,420,548、7,125,978和6,417,429(描述了用于在转基因植物中产生抗体的PLANTIBODIESTM技术)。
脊椎动物细胞也可以用作宿主。例如，适于悬浮生长的哺乳动物细胞系可以是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其他例子是由SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7)；人胚肾细胞系(293或293细胞，如例如在Graham等人,J.Gen Virol.36:59(1977)中所述)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；小鼠支持细胞(TM4细胞，如例如在Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)中所述)；猴肾细胞(CV1)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；人宫颈癌细胞(HELA)；犬肾细胞(MDCK)；水牛大鼠肝细胞(BRL 3A)；人肺细胞(W138)；人肝细胞(Hep G2)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562)；TRI细胞，如例如在Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)中所述；MRC 5细胞；和FS4细胞。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980))；以及骨髓瘤细胞系，如Y0、NS0和Sp2/0。关于适用于抗体产生的某些哺乳动物宿主细胞系的综述，参见例如，Yazaki和Wu,Methods in Molecular Biology,第248卷(B.K.C.Lo编辑,HumanaPress,Totowa,NJ),第255-268页(2003)。
测定
可以通过本领域已知的各种测定来鉴定、筛选或表征抗体(例如，本文所述的抗VEGF抗体)以及抗体缀合物(例如，包含抗VEGF抗体(例如，本文提供的任何抗VEGF抗体)的抗体缀合物)的物理/化学特性和/或生物活性。
(a)结合测定和其他测定
在一方面，例如通过诸如ELISA、蛋白质印迹等已知方法来测试抗体(例如，抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的抗原结合活性。
在另一方面，竞争测定可以用于鉴定与如本文所述的抗体或其抗体缀合物竞争结合抗原(例如，VEGF)的抗体。在某些实施方案中，这种竞争抗体与如本文所述的抗体结合的表位相同的表位(例如，线性表位或构象表位)结合。用于为抗体所结合的表位作图的详细示例性方法提供于Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols,”在Methods inMolecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。
在示例性竞争测定中，将固定化VEGF在包含结合VEGF的第一标记抗体和第二未标记抗体的溶液中孵育，测试所述第二未标记抗体与第一抗体竞争结合VEGF的能力。所述第二抗体可以存在于杂交瘤上清液中。作为对照，将固定化VEGF在包含第一标记抗体但不包含第二未标记抗体的溶液中孵育。在允许第一抗体与VEGF结合的条件下孵育后，除去过量的未结合的抗体，并且测量与固定化VEGF缔合的标记的量。如果相对于对照样品，在测试样品中与固定化VEGF缔合的标记的量明显减少，则表明第二抗体与第一抗体竞争结合VEGF。可以对其他的抗原进行类似的测定。参见Harlow和Lane(1988)Antibodies:ALaboratoryManual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
(b)活性测定
在一方面，提供了用于鉴定具有生物活性的抗体(例如，抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的测定。生物活性可以包括例如在体内、在体外或离体地与抗原(例如，VEGF(例如，血流中的VEGF))或其肽片段的结合。在某些实施方案中，生物活性可以包括阻断或中和抗原。例如，在某些实施方案中，生物活性可以包括阻断或中和VEGF、或阻止VEGF结合配体(例如，受体如KDR或Flt-1)。还提供了在体内和/或在体外具有这种生物活性的抗体或其抗体缀合物。在某些实施方案中，测试本发明的抗体或其抗体缀合物的这种生物活性。
(c)稳定性测定
在一方面，提供了用于确定抗体(例如，抗VEGF抗体)或其抗体缀合物的稳定性(例如，热稳定性)的测定。例如，抗体或其抗体缀合物的稳定性可以使用本领域已知的任何方法(例如，差示扫描荧光测定(DSF)、圆二色性(CD)、蛋白内源荧光、差示扫描量热法、光谱法、光散射(例如，动态光散射(DLS)和静态光散射(SLS))、自相互作用色谱(SIC))确定。抗体或其抗体缀合物的稳定性可以如本文所述的(例如，使用如例如国际专利申请号PCT/US2016/053454的实施例1和实施例2中所述的DSF)确定。在一些情况下，抗体缀合物的稳定性可以通过与折射率和多角度光散射检测器同轴的尺寸排阻色谱(SEC-RI-MALS)来确定。
治疗方法和组合物
本文提供的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)或其抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以用于治疗方法。
在一方面，提供了用作药物的抗VEGF抗体。在另一方面，提供了用作药物的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在进一步的方面，本发明提供了用于治疗与病理性血管生成相关的障碍的抗VEGF抗体。在另一方面，本发明提供了用于治疗与病理性血管生成相关的障碍的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在一些实施方案中，与病理性血管生成相关的所述障碍是眼部障碍或细胞增生性障碍。在一些情况下，所述眼部障碍是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，病灶性非中心DME或弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如，多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤或舍格伦病。在一些情况下，所述细胞增生性障碍是癌症。在一些情况下，所述癌症是乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤或多发性骨髓瘤。在另一方面，提供了用于治疗与不良血管通透性相关的障碍的抗VEGF抗体。在一些情况下，与不良血管通透性相关的所述障碍是与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格斯综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸膜积液或与心血管疾病相关的通透性。
在另一方面，提供了用于治疗方法的抗VEGF抗体。在另一方面，提供了用于治疗方法的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在某些情况下，本发明提供了用于治疗患有与病理性血管生成相关的障碍的受试者的方法的抗VEGF抗体(例如，抗VEGF抗体)，所述方法包括向所述个体给予有效量的抗VEGF抗体。本发明还提供了用于治疗患有与病理性血管生成相关的障碍的受试者的方法的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)，所述方法包括向所述个体给予有效量的抗体缀合物。在一些情况下，与病理性血管生成相关的所述障碍是眼部障碍。在一些情况下，所述眼部障碍是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，病灶性非中心DME或弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如，多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤或舍格伦病。在一些情况下，所述细胞增生性障碍是癌症。在一些情况下，所述癌症是乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤或多发性骨髓瘤。
在其他情况下，本发明提供了用于治疗患有与不良血管通透性相关的障碍的个体的方法的抗VEGF抗体。在其他情况下，本发明提供了用于治疗患有与不良血管通透性相关的障碍的个体的方法的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在一些情况下，与不良血管通透性相关的所述障碍是与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格斯综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸膜积液或与心血管疾病相关的通透性。任何前述用途还可以包括向所述个体给予有效量的至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。
在一些情况下，本发明提供了用于减少或抑制受试者的血管生成的抗VEGF。在另一方面，提供了用于减少或抑制受试者的血管生成的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在某些实施方案中，本发明提供了用于减少或抑制受试者的血管生成的方法的抗VEGF抗体，所述方法包括向所述个体给予有效量的抗VEGF抗体以减少或抑制血管生成。本发明还提供了用于减少或抑制受试者的血管生成的方法的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)，所述方法包括向所述个体给予有效量的抗体缀合物。在其他情况下，本发明提供了用于降低或抑制受试者的血管通透性的抗VEGF抗体或其抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在某些实施方案中，本发明提供了用于降低或抑制受试者的血管通透性的方法的抗VEGF抗体或其抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)，所述方法包括向所述个体给予有效量的抗VEGF抗体或抗体缀合物以降低或抑制血管通透性。根据任何上述用途的“受试者”可以是人。
本发明提供了抗VEGF抗体在制造或制备药物中的用途。本发明还提供了抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)在制造或制备药物中的用途。例如，在一种情况下，所述药物用于治疗与病理性血管生成相关的障碍。在一种进一步的情况下，所述药物用于治疗与病理性血管生成相关的障碍的方法，所述方法包括向患有与病理性血管生成相关的障碍的受试者给予有效量的药物。在一些情况下，与病理性血管生成相关的所述障碍是眼部障碍。在一些情况下，所述眼部障碍是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，病灶性非中心DME或弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如，多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤或舍格伦病。在一些情况下，所述细胞增生性障碍是癌症。在一些情况下，所述癌症是乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤或多发性骨髓瘤。在一种进一步的情况下，所述药物用于减少或抑制受试者的血管生成。在一种进一步的情况下，所述药物用于减少或抑制受试者的血管生成的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的药物以减少或抑制血管生成。在药物的任何前述用途中，所述方法可以包括向所述个体给予有效量的至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。
在另一种情况下，所述药物用于治疗与不良血管通透性相关的障碍。在一些情况下，与不良血管通透性相关的所述障碍是与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格斯综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸膜积液或与心血管疾病相关的通透性。在一种进一步的情况下，所述药物用于治疗与不良血管通透性相关的障碍的方法，所述方法包括向患有与不良血管通透性相关的障碍的受试者给予有效量的药物。在另一种情况下，所述药物用于降低或抑制受试者的血管通透性。在一种进一步的情况下，所述药物用于降低或抑制受试者的血管通透性的方法，所述方法包括向所述受试者给予有效量的药物以减少或抑制血管生成。在药物的任何前述用途中，所述方法可以包括向所述受试者给予有效量的至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。根据任何上述用途的“受试者”可以是人。
本发明提供了用于治疗与病理性血管生成相关的障碍的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有与病理性血管生成相关的障碍的个体给予有效量的抗VEGF抗体。在另一个例子中，所述方法包括向患有与病理性血管生成相关的障碍的个体给予有效量的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在一些情况下，与病理性血管生成相关的所述障碍是眼部障碍。在一些情况下，所述眼部障碍是AMD(例如，湿性AMD、干性AMD、中度AMD、晚期AMD或地图样萎缩(GA))、黄斑变性、黄斑水肿、DME(例如，病灶性非中心DME或弥漫性中心相关DME)、视网膜病变、糖尿病视网膜病变(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相关的视网膜病变、ROP、视网膜静脉阻塞(RVO)(例如，中央(CRVO)和分支(BRVO)形式)、CNV(例如，近视CNV)、角膜新血管形成、与角膜新血管形成相关的疾病、视网膜新血管形成、与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、FEVR、冠茨病、诺里病、OPPG、结膜下出血、虹膜发红、新生血管性眼病、新生血管性青光眼、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、黄斑毛细血管扩张、虹膜新血管形成、眼内新血管形成、视网膜变性、囊样黄斑水肿(CME)、血管炎、视乳头水肿、视网膜炎、结膜炎(例如，传染性结膜炎和非传染性(例如，过敏性)结膜炎)、利伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括传染性和非传染性葡萄膜炎)、脉络膜炎(例如，多灶性脉络膜炎)、眼组织胞浆菌病、睑缘炎、干眼症、创伤性眼外伤或舍格伦病。在一些情况下，所述细胞增生性障碍是癌症。在一些情况下，所述癌症是乳腺癌、结肠直肠癌、非小细胞肺癌、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、肾癌、前列腺癌、肝癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、间皮瘤或多发性骨髓瘤。在进一步的情况下，所述方法还包括向所述个体给予有效量的至少一种如下所述的另外的治疗剂。根据任何上述方法的“受试者”可以是人。
本发明提供了用于治疗与不良血管通透性相关的障碍的方法。在一个实施方案中，所述方法包括向患有与不良血管通透性相关的障碍的个体给予有效量的抗VEGF抗体。在另一个实施方案中，所述方法包括向患有与不良血管通透性相关的障碍的个体给予有效量的抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在一些情况下，与不良血管通透性相关的所述障碍是与脑肿瘤相关的水肿、与恶性肿瘤相关的腹水、梅格斯综合征、肺部炎症、肾病综合征、心包积液、胸膜积液或与心血管疾病相关的通透性。在进一步的情况下，所述方法还包括向所述个体给予有效量的至少一种如下所述的另外的治疗剂。根据任何上述方法的“受试者”可以是人。
考虑到本发明的抗体或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以用于治疗哺乳动物。在一个实施方案中，例如，为了获得临床前数据的目的，向非人哺乳动物给予所述抗体或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。待治疗的示例性非人哺乳动物包括非人灵长类动物、狗、猫、啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)和进行临床前研究的其他哺乳动物。此类哺乳动物可以是用所述抗体治疗疾病的建立的动物模型，或者可以用于研究目标抗体的毒性或药代动力学。在这些实施方案中的每个实施方案中，可以在所述哺乳动物中进行剂量递增研究。例如，可以向作为实体瘤模型的宿主啮齿动物给予所述抗体或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。可以例如通过玻璃体内给予(例如，玻璃体内注射)向宿主(例如，啮齿动物，例如兔)给予所述抗体或抗体缀合物，以用于眼部药代动力学研究。
在一个进一步的方面，本发明提供了例如用于任何上述治疗方法的药物制剂，其包含本文提供的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)。在一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)和药学上可接受的载体。在另一个实施方案中，药物制剂包含本文提供的任何抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)和至少一种例如如下所述的另外的治疗剂。在某些实施方案中，所述药物制剂包含一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，所述另外的化合物与选自以下的第二生物分子结合：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；乙胞素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；以及遗传上与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险相关的蛋白质(如补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。例如，在一些情况下，所述另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中披露的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或其变体)。在另一个例子中，在一些情况下，所述另外的化合物是抗IL-6抗体，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见例如，WO 2016/073890)、司妥昔单抗欧罗单抗、克莱赞珠单抗、思鲁库单抗、艾西莫单抗、吉利单抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其变体。在一个仍进一步的例子中，在一些情况下，所述另外的化合物是抗IL-6R抗体，例如托珠单抗/>(参见例如，WO 1992/019579)、萨瑞鲁单抗、沃巴利单抗(ALX-0061)、SA-237或其变体。
抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以在疗法中单独使用或与其他药剂组合使用。例如，抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以与至少一种另外的治疗剂共同给予。在某些实施方案中，另外的治疗剂是另一种抗体、化疗剂、细胞毒性剂、抗血管生成剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放射疗法、皮质类固醇、镇吐药、癌症疫苗、镇痛剂、生长抑制剂或其组合。
例如，在某些实施方案中，任何前述方法还包括给予一种或多种另外的化合物。在某些实施方案中，所述抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)与一种或多种所述另外的化合物同时给予。在某些实施方案中，所述抗体或抗体缀合物在一种或多种所述另外的化合物之前或之后给予。在某些实施方案中，所述另外的化合物与选自以下的第二生物分子结合：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；乙胞素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体；ST-2受体；以及遗传上与AMD风险相关的蛋白质(如补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；白细胞介素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。在某些实施方案中，所述另外的化合物是抗体或其抗原结合片段。在根据(或如应用于)任何上述实施方案的某些实施方案中，所述眼部障碍是选自以下的眼内新生血管性疾病：增生性视网膜病变、脉络膜新血管形成(CNV)、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病和其他局部缺血相关的视网膜病变、糖尿病黄斑水肿、病理性近视、希佩尔-林道病、眼睛组织胞浆菌病、视网膜静脉阻塞(RVO)(包括CRVO和BRVO)、角膜新血管形成、视网膜新血管形成和早产儿视网膜病变(ROP)。例如，在一些情况下，所述另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体如RG-7716或WO 2010/069532或WO 2016/073157中披露的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或其变体)。在另一个例子中，在一些情况下，所述另外的化合物是抗IL-6抗体，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；参见例如，WO 2016/073890)、司妥昔单抗欧罗单抗、克莱赞珠单抗、思鲁库单抗、艾西莫单抗、吉利单抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其变体。在一个仍进一步的例子中，在一些情况下，所述另外的化合物是抗IL-6R抗体，例如托珠单抗/>(参见例如，WO 1992/019579)、萨瑞鲁单抗、沃巴利单抗(ALX-0061)、SA-237或其变体。
在一些情况下，本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以与至少一种另外的治疗剂组合给予以治疗眼部障碍，例如本文所述的眼部障碍(例如，AMD(例如，湿性AMD)、DME、DR或RVO)。用于治疗眼部障碍的组合疗法的示例性的另外的治疗剂包括但不限于抗血管生成剂，如VEGF拮抗剂，包括例如抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab LUCENTIS(兰尼单抗))、可溶性受体融合蛋白(例如，重组可溶性受体融合蛋白(阿柏西普，也称为VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis))、适配体(例如，抗VEGF聚乙二醇化适配体/>(哌加他尼钠；NeXstar Pharmaceuticals/OSIPharmaceuticals))和VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟代-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、西玛米尼(SU5416；SUGEN)和/>(舒尼替尼))；色氨酰-tRNA合成酶(TrpRS)；角鲨胺；/>(用于贮库悬浮液的乙酸阿奈可他(anecortave acetate)；Alcon,Inc.)；康普瑞汀(Combretastatin)A4前药(CA4P)；/>(米非司酮-ru486)；筋膜下(subtenon)曲安奈德；玻璃体内结晶曲安奈德；基质金属蛋白酶抑制剂(例如，普马司他(AG3340；Pfizer))；醋酸氟轻松(包括氟轻松眼部植入物；Bausch&Lomb/Control DeliverySystems)；利诺胺(linomide)；整合素β3功能抑制剂；血管抑素及其组合。可以与本发明的抗体缀合物组合给予的这些和其他治疗剂描述于例如美国专利申请号US 2014/0017244，将其通过引用以其整体并入本文。
可以与本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)组合使用以治疗眼部障碍(例如，AMD、DME、DR或RVO)的另外的添加剂的进一步的例子包括但不限于(维替泊芬；通常与用非热激光的光动力疗法结合使用的光敏药物)、PKC412、Endovion(NS 3728；NeuroSearch A/S)、神经营养因子(例如，胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和睫状神经营养因子(CNTF))、地尔硫卓、多佐胺(dorzolamide)、9-顺式-视黄醛、眼药(例如，碘磷灵(phospholine iodide)、乙膦硫胆碱(echothiophate)或碳酸酐酶抑制剂)、维奥司他(veovastat)(AE-941；AEternaLaboratories,Inc.)、Sirna-027(AGF-745；Sima Therapeutics,Inc.)、神经营养素(包括(仅举例而言)NT-4/5，Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(InspirePharmaceuticals)、整合素拮抗剂(包括来自Jerini AG和Abbott Laboratories的那些)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙利度胺(例如，如EntreMed,Inc.所用的)、心肌营养蛋白-1(Genentech)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫钼酸盐(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany、Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪氨酸激酶抑制剂(例如，来自Allergan、SUGEN或Pfizer的那些)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、视网膜细胞神经节神经保护剂(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A&M UniversitySystem)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、环孢菌素A、用于光动力疗法的治疗剂(例如，/>受体靶向的PDT、Bristol-Myers Squibb,Co.；用于与PDT一起注射的卟吩姆钠；维替泊芬，QLT Inc.；与PDT一起使用的罗他泊芬(rostaporfin)，MiraventMedical Technologies；与PDT一起使用的他拉泊芬钠(talaporfin sodium)，NipponPetroleum；和莫特沙芬镥(motexafin lutetium)，Pharmacyclics,Inc.)、反义寡核苷酸(包括(举例而言)由Novagali Pharma SA和ISIS-13650测试的产品，IsisPharmaceuticals)及其组合。
本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以与疗法或手术程序组合给予以治疗眼部障碍(例如，AMD、DME、DR或RVO)，所述疗法或手术程序包括例如激光光凝术(例如，全视网膜光凝术(PRP))、玻璃疣激光术、黄斑裂孔手术、黄斑转位手术、植入式微型望远镜、PHI-运动血管造影术(也称为微型激光疗法和给料容器治疗(feeder vessel treatment))、质子束疗法、微刺激疗法、视网膜脱落和玻璃体手术、巩膜扣带术、黄斑下手术、经瞳孔温热疗法、光系统I疗法、RNA干扰(RNAi)的使用、体外流变术(extracorporeal rheopheresis)(也称为膜差过滤和流变疗法(rheotherapy))、微型芯片植入、干细胞疗法、基因替代疗法、核酶基因疗法(包括用于缺氧反应元件的基因疗法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；和PDEF基因疗法，GenVec)、光感受器/视网膜细胞移植(包括可移植的视网膜上皮细胞，Diacrin,Inc.；视网膜细胞移植，Cell Genesys,Inc.)、针灸及其组合。
在一些情况下，本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以与抗血管生成剂组合给予以治疗眼部障碍(例如，AMD、DME、DR或RVO)。任何合适的抗血管生成剂都可以与本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物组合使用，所述血管生成剂包括但不限于由Carmeliet等人Nature 407:249-257,2000所列出的那些。在一些实施方案中，所述抗血管生成剂是VEGF拮抗剂，包括但不限于抗VEGF抗体(例如，抗VEGF Fab(兰尼单抗)、RTH-258(原名ESBA-1008，一种抗VEGF单链抗体片段；Novartis)、或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体，如RG-7716；Roche))、可溶性重组受体融合蛋白(例如，/>(阿柏西普))、VEGF变体、可溶性VEGFR片段、能够阻断VEGF(例如，哌加他尼)或VEGFR的适配体、中和抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂、抗VEGF/>(例如，培化阿比西巴)、抑制VEGF或VEGFR表达的小干扰RNA、VEGFR酪氨酸激酶抑制剂(例如，4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟代-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯烷-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、西玛米尼(SU5416；SUGEN)和/>(舒尼替尼))及其组合。在一些情况下，所述双特异性抗VEGF抗体结合第二生物分子，所述第二生物分子包括但不限于IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5和α5β1；乙胞素；apelin/APJ；促红细胞生成素；补体因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受体(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；ST-2受体；以及遗传上与年龄相关性黄斑变性(AMD)风险相关的蛋白质(如补体途径组分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a和C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；和TNFRSF10A)。例如，在一些情况下，所述另外的化合物是双特异性抗体(例如，抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体如RG-7716或WO 2010/069532或WO2016/073157中披露的任何双特异性抗VEGF/抗Ang2双特异性抗体或其变体)。
可以与本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)组合给予以治疗眼部障碍(例如，AMD、DME、DR或RVO)的其他合适的抗血管生成剂包括皮质类固醇、血管抑制(angiostatic)类固醇、乙酸阿奈可他、血管抑素、内皮抑素、酪氨酸激酶抑制剂、基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂、胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3)、基质细胞源性因子(SDF-1)拮抗剂(例如，抗SDF-1抗体)、色素上皮源性因子(PEDF)、γ-分泌酶、δ样配体4、整合素拮抗剂、低氧诱导因子(HIF)-1α拮抗剂、蛋白激酶CK2拮抗剂、抑制干细胞(例如，内皮祖细胞)归巢于新血管形成位点的药剂(例如，抗血管内皮钙粘蛋白(CD-144)抗体和/或抗SDF-1抗体)及其组合。
在一个进一步的例子中，在一些情况下，本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以与具有抗新血管形成活性的药剂组合给予以治疗眼部障碍(例如，AMD、DME、DR或RVO)，所述药剂是如抗炎药、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂(例如，雷帕霉素、(依维莫司拮抗剂)和/>(坦罗莫司(temsirolimus)))、环孢菌素、肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂(例如，抗TNFα抗体或其抗原结合片段(例如，英夫利昔、阿达木单抗、赛妥珠单抗(certolizumab pegol)和戈利木单抗(golimumab))或可溶性抗体融合蛋白(例如，依那西普))、抗补体剂、非类固醇抗炎药(NSAID)或其组合。
在一个仍进一步的例子中，在一些情况下，本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)可以与神经保护性的并且可以潜在地减少干性AMD至湿性AMD的进展的药剂组合给予，所述药剂是如称为“神经类固醇”的药物类别，其包括诸如脱氢表雄酮(DHEA)(商品名：PRASTERATM和)、脱氢表雄酮硫酸盐和孕烯醇酮硫酸盐等药物。
任何合适的AMD治疗剂都可以作为另外的治疗剂与本发明的抗体(例如，抗VEGF抗体)或抗体缀合物(例如，交联HA水凝胶缀合物)组合给予以治疗眼部障碍(例如，AMD、DME、DR或RVO)，所述AMD治疗剂包括但不限于VEGF拮抗剂，例如抗VEGF抗体(例如，(兰尼单抗)、RTH-258(原名ESBA-1008，一种抗VEGF单链抗体片段；Novartis)或双特异性抗VEGF抗体(例如，抗VEGF/抗血管生成素2双特异性抗体，如RG-7716；Roche))、可溶性VEGF受体融合蛋白(例如，/>(阿柏西普))、抗VEGF(例如，培化阿比西巴；Molecular Partners AG/Allergan)或抗VEGF适配体(例如，/>(哌加他尼钠))；血小板源性生长因子(PDGF)拮抗剂，例如抗PDGF抗体、抗PDGFR抗体(例如，REGN2176-3)、抗PDGF-BB聚乙二醇化适配体(例如，/>Ophthotech/Novartis)、可溶性PDGFR受体膜融合蛋白、或双PDGF/VEGF拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或双特异性抗PDGF/抗VEGF抗体))；(维替泊芬)与光动力疗法组合；抗氧化剂；补体系统拮抗剂，例如补体因子C5拮抗剂(例如，小分子抑制剂(例如，ARC-1905；Opthotech)或抗C5抗体(例如，LFG-316；Novartis)、备解素拮抗剂(例如，抗备解素抗体，例如CLG-561；Alcon)、或补体因子D拮抗剂(例如，抗补体因子D抗体，例如兰帕珠单抗(lampalizumab)；Roche))；视觉周期调节剂(visual cycle modifier)(例如，依米司他盐酸盐(emixustat hydrochloride))；角鲨胺(例如，OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；维生素和矿物质补充剂(例如，描述于年龄相关性眼部疾病研究1(AREDS1；锌和/或抗氧化剂)和研究2(AREDS2；锌、抗氧化剂、叶黄素、玉米黄质和/或Ω-3脂肪酸)中的那些)；细胞基疗法，例如NT-501(Renexus)；PH-05206388(Pfizer)、huCNS-SC细胞移植(StemCells)、CNTO-2476(Janssen)、OpRegen(Cell CureNeurosciences)、或MA09-hRPE细胞移植(Ocata Therapeutics)；组织因子拮抗剂(例如，hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-肾上腺素能受体激动剂(例如，酒石酸溴莫尼定)；肽疫苗(例如，S-646240；Shionogi)；淀粉样蛋白β拮抗剂(例如，抗β淀粉样蛋白单克隆抗体、例如GSK-933776)；S1P拮抗剂(例如，抗S1P抗体，例如iSONEPTM；Lpath Inc)；ROBO4拮抗剂(例如，抗ROBO4抗体、例如DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表达内皮抑素和血管抑素的慢病毒载体(例如，RetinoStat)；及其组合。在一些情况下，可以共同配制AMD治疗剂(包括任何前述AMD治疗剂)。例如，抗PDGFR抗体REGN2176-3可以与阿柏西普/>共同配制。在一些情况下，这种共制剂可以与本发明的抗体组合给予。在一些情况下，所述眼部障碍是AMD(例如，湿性AMD)。
上述的此类组合疗法包括组合给予(其中在相同或不同的制剂中包含两种或更多种治疗剂)和单独给予，在这种情况下，本发明的抗体或抗体缀合物的给予可以在一种或多种所述另外的治疗剂的给予之前、同时和/或之后发生。在一个实施方案中，所述抗体或抗体缀合物的给予和另外的治疗剂的给予在彼此约一个月、两个月、三个月、四个月或五个月内，或在约一周、两周或三周内，或在约一天、两天、三天、四天、五天或六天之内发生。
实施例
以下缩写可以用于以下实施例和本文其他地方。
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实施例1A自杀式保护基团4-(((全氟代苯氧基)羰基氧基)甲基)苯基2-(二甲基氨 基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a3的合成
方案1A
方案1A中说明了4-(((全氟代苯氧基)羰基氧基)甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a3的合成。
步骤1 4-(羟基甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a2的制备
将4-羟基苯甲醇a1(1.70g；13.69mmol；1.00当量)溶解于THF(20.5ml)中并且在搅拌下添加DIPEA(4.8ml；27.39mmol；2.00当量)。经25min逐滴添加在THF(5ml)中的4-硝基苯基氯甲酸酯(2.90g；14.38mmol；1.05当量)。将反应在室温下再搅拌20分钟。通过LCMS测得的IPC确认了所需中间体的形成。将N,N,N'-三甲基乙二胺(2.21ml；17.12mmol；1.25当量)缓慢添加到溶液中并且将反应混合物再搅拌20min。通过LCMS测得的IPC确认了碳酸酯的完全转化。将反应在冰浴中冷却，用TFA(3.17ml；41.08mmol；3.00当量)淬灭并且用水稀释。如pH试纸所指示，pH应该低于2。将水相用乙酸乙酯(3x 100ml)洗涤，之后使水相的pH升至约pH 4.5。将水相冻干以产出油状残余物。将残余物与乙酸乙酯(3x)共蒸发，溶解于DCM中并且干燥(Na2SO4)。过滤后，将溶剂蒸发并且将油状残余物在高真空下干燥(2h)。通过LCMS测得的QC揭示了93％的纯度。将所得粗4-(羟基甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a2不经纯化而用于下一步骤。
步骤2 4-(((全氟代苯氧基)羰基氧基)甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨 基甲酸酯a3的制备
将来自步骤1的粗4-(羟基甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a2(11.76g；最多13.69mmol；1.00当量；最大纯度40wt％)溶解于乙腈(24ml)中并且将溶液在冰浴总冷却。在搅拌下添加双(五氟代苯基)碳酸酯(10.15g；25.75mmol；1.88当量)、DMAP(315mg；2.58mmol；0.19当量)和DIPEA(9.0ml；51.53mmol；3.76当量)。溶液从橙色变成绿色，然后变成灰色。将反应混合物搅拌15分钟。通过LCMS确认了产物的形成。将反应混合物冷却至-15℃并且用含0.1％ TFA的水(12.38ml)和纯TFA(3.9ml；51.48mmol；3.76当量)的混合物淬灭。通过RP-LPLC在4次运行中纯化黄色溶液。将纯级分合并，冷冻并且冻干以产出呈黄色油状物的4-(((全氟代苯氧基)羰基氧基)甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a3，4.73g TFA盐(经2个步骤8.21mmol，60％)。
实施例1B受保护的接头b5的合成
方案1B
方案1B中示出了接头b5的合成。
步骤1酰胺化合物b3的制备
将Fmoc-N-Me-Asp(tBu)-OH b1(6.96g；16.36mmol；1.00当量)溶解于DMF(139ml)中。添加PyBOP(12.77g；24.54mmol；1.50当量)和DIPEA(14.25ml；81.79mmol；5.00当量)并且搅拌直至完全溶解。添加N-Boc-N-甲基-1,3-二氨基丙烷盐酸盐b2(4.04g；17.99mmol；1.10当量)并且将反应混合物在室温下搅拌15min。通过LCMS观察到完全转化为产物。将反应混合物用400ml二氯甲烷稀释并且用400ml 0.1N HCl洗涤三次。将有机层用400ml饱和NaHCO3溶液洗涤三次并且用200ml盐水洗涤一次。将有机层经MgSO4干燥，过滤并且浓缩。将粗材料溶解于14ml二氯甲烷中并且通过正相快速色谱纯化。合并含有产物的级分并且蒸发溶剂。将最终材料在高真空下干燥以产出呈白色泡沫的酰胺化合物b3。产量：8.81g(14.79mmol，90％)。
步骤2酰胺化合物b4的制备
将酰胺化合物b3(8.81g；14.79mmol；1.00当量)溶解于THF(130ml)中。添加DBU(2.56ml；17.15mmol；1.16当量)并且将混合物在室温下搅拌5分钟。LCMS色谱图显示起始材料的完全转化。另外地，准备TLC(乙酸乙酯/甲醇9:1，KMnO4染色剂)，Rf(Pdt)＝0.48)。蒸发粗反应混合物的溶剂。将残余物溶解于乙酸乙酯中以达到20ml的终体积并且将溶液通过快速色谱纯化。合并含有产物的级分并且蒸发溶剂。将最终材料在高真空下干燥过夜以产出呈浅黄色油状物的酰胺化合物b4。产量：5.13g(13.74mmol，产率87％，在215nm处的纯度为94％)
步骤3接头化合物b5的制备
将DIPEA(7.19ml；41.21mmol；3.00当量)添加到来自实施例1E的羧酸c3(3.42g；15.11mmol；1.10当量)和PyBOP(7.86g；15.11mmol；1.10当量)在二氯甲烷(35ml)中的溶液中，随后将混合物有效地温热，此时从浅黄色变成深黄色。将混合物在室温下搅拌5分钟以预活化酸。向活化的酸溶液中一次性添加新制备的酰胺化合物b4(5.13g；13.74mmol；1.00当量)在二氯甲烷(35ml)中的溶液，此时混合物变成浅棕色。将偶联溶液在室温下搅拌100min。通过LCMS测得的IPC显示起始材料的几乎完全转化。将反应混合物用500ml乙酸乙酯稀释并且用0.2N HCl(4x300ml)、盐水(1x100ml)、饱和NaHCO3(50ml、25ml、160ml)、5％柠檬酸(1x100ml)和盐水(1x100ml)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥，过滤并且浓缩。将残余物在高真空下干燥过周末(13.59g粗材料)。将残余物溶解于乙酸乙酯中以达到约22ml的终体积。将粗材料通过快速色谱纯化。合并含有产物的级分(TLC：乙酸乙酯，KMnO4染色剂，Rf(Pdt)＝0.54)并且蒸发溶剂以产出粘性棕色胶状残余物。将最终材料在高真空下干燥过夜以产出呈泡沫的接头化合物b5。产量：6.61g(11.36mmol，产率83％，纯度96％)。
实施例1C接头(S)-4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基) 苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代 丁酸b7的合成
方案1C
方案1C中说明了(S)-4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸b7的合成。
步骤1(S)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-(3-(甲基氨基)丙基氨 基)-4-氧代丁酸b6的制备
将酰胺化合物b5(3.40g；5.84mmol；1.00当量)溶解于二氯甲烷(19ml)中并且添加TFA(19ml)。在开口烧瓶中，将反应混合物在室温下搅拌75分钟。通过LCMS测得的IPC显示很好地转化为产物。以可控的方式除去挥发物(在25℃和12毫巴下旋转蒸发器，然后在室温下高真空持续60min)。将所得残余物(S)-4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸b6不经进一步纯化而立即用于下一步骤。
步骤2接头(S)-4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基 氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸 b7的制备
将来自实施例1的4-(((全氟代苯氧基)羰基氧基)甲基)苯基2-(二甲基氨基)乙基(甲基)氨基甲酸酯a3(4.38g；7.60mmol；1.30当量)在乙腈(35.00ml)中的溶液在冰浴中冷却至0℃。添加DIPEA(10.19ml；58.44mmol；10.00当量)，并且在于10min之内逐滴添加粗化合物b6在乙腈(35.00ml)中的溶液之前，将混合物在此温度下搅拌1分钟。添加完成后，将混合物在0℃下再搅拌5分钟，然后分析反应混合物。观察到两性离子b6的完全转化。将反应通过在0℃下添加TFA(4.00ml；51.92mmol；8.88当量)淬灭。除去所有挥发物，并且将残余物在旋转蒸发器上在<10毫巴和40℃下干燥10分钟。将粗残余物溶解于6ml H2O/MeCN/TFA1:1:0.002和12ml 0.1％ TFA的混合物中。将浅棕色溶液通过反相快速色谱纯化。将溶液保持在冰上直至注射。将含有产物的级分合并，冷冻并且冻干以给出(S)-4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸b7。产量：3.25g，呈TFA盐(产率68％)。
实施例1D NHS活化的接头(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(3-(((4-((2-(二甲基 氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基- 6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸酯b8的合成
方案1D
方案1D中示出了(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸酯b8的制备。
将来自实施例1C的接头b7(2.02g；2.47mmol；1.00当量)溶解于二氯甲烷(20ml)中。添加HOSu(852.72mg；7.41mmol；3.00当量)和EDC(1.42g；7.41mmol；3.00当量)并且将混合物在氮气氛下在室温下搅拌。在添加的试剂溶解后，混合物变成微黄色。1h后，通过LCMS测得的IPC显示很好地转化为产物。75min后，将反应混合物用DCM(75ml)稀释并且用75ml酸性盐水(250ml盐水与2.5ml 1M HCl混合并且将所得溶液用另外的NaCl饱和)洗涤一次。将水层(pH约6.5)用50ml DCM萃取。将合并的有机相经Na2SO4干燥并且过滤。添加TFA(190μL；2.47mmol；1.00当量)后，蒸发挥发物。将油状残余物在高真空下干燥30分钟以产出呈白色泡沫的粗(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸酯b8(约2.4g)。将粗产物溶解于5ml无水乙腈中(总体积约6ml)并且通过RP-LPLC纯化。将用于色谱的洗脱剂冷却，然后冷冻并且冻干。将冻干的干燥材料与无水乙腈合并(总共约20ml)。将溶剂除去(旋转蒸发器，40℃)并且在高真空下干燥以产出2.05g(产率91％)呈无色泡沫的(S)-2,5-二氧代吡咯烷-1-基4-(3-(((4-((2-(二甲基氨基)乙基)(甲基)氨基甲酰基氧基)苄基氧基)羰基)(甲基)氨基)丙基氨基)-3-(N-甲基-6-(甲基磺酰硫基)己酰胺基)-4-氧代丁酸酯b8。将材料溶解于22.37ml无水DMSO中。将澄清的无色溶液无菌过滤(无菌PTFE注射器过滤器，Millipore Millex-LG，25mm，0.2μm)以产出约23.5ml澄清的无色溶液。将材料在-80℃下在氩气下以等分试样储存。通过LCMS分析确定NHS活性为79％。
实施例1E 6-(甲基磺酰硫基)己酸c3的合成
方案1E
方案1E中示出了6-(甲基磺酰硫基)己酸c3的制备。
将6-溴己酸(5.89g；30.19mmol；1.00当量)和甲硫磺酸钠(4.05g；30.19mmol；1.00当量)溶解于无水N,N-二甲基甲酰胺(47.10ml)中。将反应混合物在80℃下搅拌3小时，然后使其冷却至室温。LCMS分析确认了产物c3的形成。将反应混合物用116ml水稀释并且用233ml乙醚洗涤三次。将有机相用盐水(350ml)洗涤，经MgSO4干燥，过滤并且在减压下浓缩至40ml的体积。将所得溶液在-18℃下在2x1000ml冷正庚烷中沉淀过夜。将上清液滗析并且将沉淀物溶解于80ml乙醚(40℃)中。将所得溶液在-18℃下在2x1000ml冷正庚烷中沉淀3小时。滤出沉淀物并且将白色固体在高真空下干燥过夜以给出6-(甲基磺酰硫基)己酸c3。产量：5.72g；84％。
实施例1F 1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰 胺基)乙氧基)乙基)壬二酸酯d9的合成
方案1F
方案1F中示出了1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙氧基)乙基)壬二酸酯d9的制备。
步骤1 9-(苄基氧基)-9-氧代壬酸d2的合成
将壬二酸d1(103.00g；547.23mmol；1.10当量)、苯甲醇(51.73ml；497.48mmol；1.00当量)和对甲苯磺酸一水合物(1.99g；10.45mmol；0.02当量)在甲苯(561.82ml)中的混合物在Dean-Stark仪器中回流5h。然后将反应混合物冷却至室温并且在此温度下储存1h。然后，将固体滤出并且用50ml甲苯洗涤。将残余物用大约800ml 0.4M NaOH溶液处理并且使用大约30ml 4M NaOH将pH调节至pH＝9。将水相分离，向有机相中添加100ml水和80ml 0.4MNaOH，从而调节pH至9。将合并的有机相用50ml 1M硫酸酸化至pH＝5并且用200ml MTBE萃取两次。将合并的有机相用200ml盐水洗涤，经MgSO4干燥并且在真空中蒸发溶剂。将粗产物(62g)溶解于40ml庚烷和20ml THF中(总体积120ml)并且通过自动快速色谱在两次运行中纯化。蒸发洗脱剂并且获得呈油状物的残余物(55.00g；39.72％)。将残余物溶解于80mlMTBE中并且添加加热至30℃的2000ml庚烷。用于结晶，将溶液在-20℃下储存过夜。将产物通过玻璃过滤器(Por.3)过滤收集并且用500ml庚烷洗涤。将白色晶体在<1毫巴下干燥4h以给出9-(苄基氧基)-9-氧代壬酸d2。产量：48.02g；35％。
步骤2 Boc保护的1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)9-苄基壬二酸酯d4的合成
将DCC(3.32g；16.08mmol；1.10当量)添加到Boc-2-(2-氨基乙氧基)乙醇d3(3.00g；14.62mmol；1.00当量)、化合物d2(4.07g；14.62mmol；1.00当量)和DMAP(446.41mg；3.65mmol；0.25当量)在DCM(50.00ml)中的溶液中。将形成的悬浮液在室温下搅拌过夜。将白色悬浮液通过20ml注射器玻璃料过滤并且将滤饼用约50ml DCM洗涤。通过LCMS检测产物。除去所有的挥发物。并且将残余物溶解于DCM中(总体积20ml)。将所得轻微浑浊的悬浮液通过快速色谱纯化。合并含有产物的级分并且蒸发所有的挥发物以产出呈无色油状物的Boc保护的1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)9-苄基壬二酸酯d4。产量：6.11g；90％。
步骤3 Boc保护的9-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-9-氧代壬酸d5的合成
将10％ Pd/C(348.58mg；0.33mmol；0.03当量)添加到Boc保护的1-(2-(2-氨基乙氧基)乙基)9-苄基壬二酸酯d4(6.10g；13.10mmol；1.00当量)在THF(75.00ml)中的溶液中并且将烧瓶中的空气层进行氮气交换。然后，将烧瓶置于50℃水浴中并且使用球囊和20G套管使氢气流通过黑色悬浮液。5分钟后，停止氢气流并且将混合物在50℃下在氮气氛下剧烈搅拌直至脱保护反应完成。将所得悬浮液通过硅藻土垫过滤。将滤饼用另外的EtOAc(25ml)洗涤。蒸发合并的滤液的挥发物，并且将粗材料溶解于EtOAc(30ml)中。将溶液通过0.22μm-RC注射器过滤器过滤并且除去挥发物以产出呈微黄色油状物的Boc保护的9-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-9-氧代壬酸d5。产量：5.09g，定量的。
步骤4 9-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-9-氧代壬酸d6的合成
将TFA(5.00ml；64.90mmol；4.79当量)添加到Boc保护的9-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-9-氧代壬酸d5(5.09g；13.55mmol；1.00当量)在二氯甲烷(10.00ml)的溶液中。40分钟后，将另外的等分试样的TFA(5.00ml；64.90mmol；4.79当量)添加到混合物中并且使氮气流通过反应混合物。70min后的LCMS揭示了起始材料的完全转化。除去挥发物并且用乙醚(50ml)稀释棕色的油状残余物，此时形成两相系统。将乳液在旋转蒸发仪上再次除去所有的挥发物并且将棕色的油状残余物在高真空下干燥过夜。将甲苯(30ml)添加到残余物中并且将混合物在旋转蒸发仪(60℃水浴)上再次除去所有的挥发物。将材料在<9毫巴和60℃水浴温度下在旋转蒸发仪上干燥以产出呈黄色油状物的9-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-9-氧代壬酸d6。产量：6.04g；97％。
步骤5 9-氧代-9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)壬 酸d8的合成
将DIPEA(951.90μL；5.46mmol；5.00当量)添加到9-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-9-氧代壬酸d6(500.00mg；1.09mmol；1.00当量)和3-[[(2-吡啶基)硫代]硫代]丙酸琥珀酰亚胺酯d7(375.05mg；1.20mmol；1.10当量)在乙腈(5.00ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌45min。将反应通过添加乙酸(1.00ml；17.48mmol；16.02当量)淬灭。将混合物用6.5ml乙腈和14.5ml水稀释并且将所得溶液通过制备型HPLC纯化。将含有产物的级分合并，在液氮中冷冻并且冻干过夜。将产物批料与DCM合并。除去挥发物并且将油状残余物在高真空下干燥以产出呈微黄色油状物的9-氧代-9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)壬酸d8；392.00mg；61％。
步骤6 1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺 基)乙氧基)乙基)壬二酸酯d9的合成
向9-氧代-9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)壬酸d8(392.00mg；0.67mmol；1.00当量)在二氯甲烷(5.00ml)中的溶液中依次添加HOSu(153.81mg；1.34mmol；2.00当量)和EDC*HCl(256.19mg；1.34mmol；2.00当量)。将悬浮液在室温下搅拌，此时固体内容物随时间缓慢溶解并且形成淡黄色澄清溶液。80min后，添加另外的HOSu(50.00mg；0.43mmol；0.65当量)和EDC*HCl(50.00mg；0.26mmol；0.39当量)。120min后，通过LCMS分析揭示了反应的完成。除去挥发物并且将残余物溶解于乙腈(5ml)中。添加水(5ml)和H2O/MeCN/TFA 1:1:0.002(4ml)。将乙腈添加到浑浊的乳液中直至获得澄清溶液。将所得溶液通过制备型HPLC纯化。将含有产物的所有级分保持在冰上直至将它们合并，冷冻并且冻干。将产物批料与二氯甲烷合并并且除去所有的挥发物。将产物在高真空下干燥以产出呈无色油状物的1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)9-(2-(2-(3-(吡啶-2-基二硫烷基)丙酰胺基)乙氧基)乙基)壬二酸酯d9；455.00mg；定量产率。
实施例1G纯化标签N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-16-(4-巯 基烟酰基)-2-甲基-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2- (二甲基氨基)乙酰胺)e8的合成
方案1G
方案1G中示出了纯化标签N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-16-(4-巯基烟酰基)-2-甲基-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2-(二甲基氨基)乙酰胺)e8的制备。
步骤1(9H-芴-9-基)甲基双(3-氨基丙基)氨基甲酸酯e2的合成
将Fmoc-OSu(9.77g；28.96mmol；1.20当量)添加到1,9-双-Boc-1,5,9-三氮杂壬烷e1(8.00g；24.14mmol；1.00当量)在THF(80.00ml)中的溶液中。在室温下经10分钟向此混合物中逐滴添加K2CO3(5.00g；36.20mmol；1.50当量)在水(80.00ml)中的溶液。在添加过程中形成白色乳液。在室温下搅拌50min后，将反应混合物用乙酸乙酯(600ml)稀释。将有机层用盐酸(0.1M，3x 200ml)、饱和NaHCO3溶液(200ml)和盐水(100ml)洗涤。经MgSO4干燥和过滤后，除去所有的挥发物。将粗残余物在高真空下干燥20分钟以给出白色泡沫。将此泡沫溶解于二氯甲烷中并且通过快速色谱纯化。将含有产物的级分合并并且浓缩以产出呈无色玻璃状固体的9H-芴-9-基甲基N,N-双[3-(叔丁氧基羰基氨基)丙基]氨基甲酸酯中间体(方案1G中未示出)；12.81g；96％。
在室温下将此中间体产物(12.78g；23.08mmol；1.00当量)溶解于TFA(30.00ml；389.39mmol；16.87当量)中。完全溶解后，将黄色溶液在室温下搅拌35min。通过将反应混合物逐滴添加到在50ml Falcon管中的乙醚(在40ml乙醚中的2ml反应溶液)中沉淀产物。将Falcon管在7000xG和0°下离心3分钟。弃去醚上清液并且将残余物溶解于甲醇(1ml/管)中。在500ml圆底烧瓶中，将合并的甲醇溶液逐滴添加到乙醚(200ml)中。将所有的管用甲醇(总共约150ml)洗涤并且将洗涤溶液添加到醚/沉淀物混合物中，此时形成无色的澄清溶液。浓缩此溶液并且将油状残余物在高真空下干燥过夜以给出呈白色泡沫的(9H-芴-9-基)甲基双(3-氨基丙基)氨基甲酸酯e2：13.68g；定量产率。
步骤2(9H-芴-9-基)甲基双(3-((S)-2,6-二氨基己酰胺基)丙基)氨基甲酸酯e3的 合成。
将DIPEA(20.44ml；117.20mmol；5.00当量)添加到化合物e2(13.63g；23.44mmol；1.00当量)和Boc-Lys(Boc)-OSu(24.95g；56.25mmol；2.40当量)在DMF(250.00ml)中的溶液中并且将浅黄色混合物在室温下搅拌45min。将反应混合物用乙酸乙酯(1200ml)稀释并且将有机层用盐酸(0.1M，4x 500ml)、饱和NaHCO3溶液(3x 250ml)和盐水(200ml)洗涤。经MgSO4干燥和过滤后，除去所有的挥发物以产出呈白色泡沫的Boc保护的中间体(方案1G中未示出)。将粗残余物溶解于二氯甲烷(30ml)中并且通过快速柱色谱纯化。合并含有产物的级分并且在真空中除去所有的挥发物。将纯产物从冷的乙酸乙酯溶液中沉淀出来。添加甲醇以完全溶解产物。合并的级分的蒸发产生无色油状物，将其在高真空下干燥过夜以给出Boc保护的中间体：18.27g；77％。
将此中间体(18.12g；17.94mmol；1.00当量)溶解于TFA(40.00ml；519.19mmol；28.95当量)中。在溶解过程中，产生大量气体，并且将混合物温热至约45℃并且变成黄色。将澄清的粘稠溶液在室温下搅拌2h。将反应混合物添加到乙醚(在50ml Falcon管中的40ml醚中的2ml反应溶液)中。剧烈振荡后，双相系统转化为在酸性乙醚中的白色粉末状沉淀物的悬浮液。将混合物转移到Falcon管中并且将所有Falcon在0℃和7000xG下离心3min，并且弃去上清液。将所有的沉淀物各自用40ml乙醚洗涤并且重复离心。再次弃去上清液后，将所有的沉淀物在旋转蒸发仪上预干燥以形成干粉。将所有的等分试样合并并且在高真空下干燥过夜以给出(9H-芴-9-基)甲基双(3-((S)-2,6-二氨基己酰胺基)丙基)氨基甲酸酯e3：19.52g；定量产率。
步骤3化合物e5的合成
将DIPEA(18.02ml；103.29mmol；6.00当量)添加到N,N-二甲基甘氨酸e4(8.88g；86.08mmol；5.00当量)和PyBOP(44.79g；86.08mmol；5.00当量)在DMF(180.00ml)中的悬浮液中。将混合物在室温下搅拌15分钟，此时形成澄清溶液。将此溶液一次性添加到(9H-芴-9-基)甲基双(3-((S)-2,6-二氨基己酰胺基)丙基)氨基甲酸酯e3(18.35g；17.22mmol；1.00当量)和DIPEA(15.01ml；86.08mmol；5.00当量)在DMF(180.00ml)中的溶液中。将黄色反应混合物在室温下搅拌。35min后，将反应混合物通过添加TFA(22.02ml；285.82mmol；16.60当量)淬灭。将溶液浓缩以产出黄色油状物，将其随后溶解于甲醇(450ml)中以产出600ml深黄色溶液。将此中间体产物(方案1G中未示出)从乙醚中沉淀出来两次。将沉淀物用乙醚洗涤后，浓缩产物浆料并且将产物在真空中干燥72小时：23.17g；96％。将哌啶(17.50ml；0.18mol；10.83当量)一次性添加到中间体产物(23.00g；0.02mol；1.00当量)在DMF(69.00ml)中的溶液中并且将橙色溶液在室温下搅拌35min。浓缩反应混合物，并且将TFA(200ml)添加到残余物中。将浆料通过PE玻璃料过滤。将产物从乙醚中沉淀出来并且将产物用乙醚洗涤后，将其在真空中干燥以产出呈灰白色粉末的化合物e5：19.82g；93％。
步骤4 N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-2-甲基-16-(4-(甲基 二硫烷基)烟酰基)-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2- (二甲基氨基)乙酰胺)e7的合成
将PyBOP(528.17mg；1.01mmol；1.00当量)和4-(甲基二硫烷基)烟酸e6(320.00mg；1.01mmol；1.00当量，通过使4-巯基烟酸与S-甲基甲硫醇磺酸酯反应制备)悬浮于乙腈(10.00ml)中。添加DIPEA(1.59ml；9.13mmol；9.00当量)，此时形成澄清的深黄色溶液。在室温下2min后，将混合物添加到化合物e5(1 317.49mg；1.01l mmol；1.00当量)在乙腈(10.00ml)中的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1h。添加TFA(1.59ml；20.64mmol；20.33当量)并且将产物从乙醚(140ml)中沉淀出来。将沉淀物用乙醚(100ml)洗涤。将沉淀物溶解于甲醇(8ml)中并且从乙醚(140ml)中沉淀第二次。将产物在高真空下干燥过夜以产出呈粉末的N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-2-甲基-16-(4-(甲基二硫烷基)烟酰基)-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2-(二甲基氨基)乙酰胺)e7：1.231g；82％。
步骤5 N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-16-(4-巯基烟酰基)- 2-甲基-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2-(二甲基氨 基)乙酰胺)e8的合成
将NaBH4(220.07mg；5.82mmol；7.00当量)分四部分添加到N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-2-甲基-16-(4-(甲基二硫烷基)烟酰基)-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2-(二甲基氨基)乙酰胺)e7(1.231g；0.83mmol；1.00当量)在水(15.00ml)中的溶液中。最后一次添加后，将混合物在室温下搅拌60分钟。将TFA(1.00ml；12.98mmol；15.62当量)添加到反应混合物中。将反应混合物用水稀释至25ml的终体积。将溶液通过制备型HPLC纯化。将含有产物的级分合并，冷冻并且冻干以给出N,N'-((10S,22S)-10-(2-(二甲基氨基)乙酰胺基)-16-(4-巯基烟酰基)-2-甲基-4,11,21-三氧代-2,5,12,16,20-五氮杂二十六烷-22,26-二基)双(2-(二甲基氨基)乙酰胺)e8的TFA盐；942.00mg；79％。
实施例2A：胺官能化透明质酸(HA)的制备
将胺官能团引入HA上。在一些方面，对于随后马来酰亚胺官能化的HA和药物与马来酰亚胺的附接引入达到约11％的官能化程度，并且对于随后硫醇官能化的HA引入达到约5％的官能化程度。
方案2A
根据反应方案2A进行HA的胺官能化：
在剧烈搅拌下，将200mg 116kDa透明质酸钠盐f1溶解于25mL缓冲溶液(100mMMES、0.4M 1,3-二氨基丙烷，pH 5.5)中。添加相对于在HA处的羧酸官能团的3.00当量(229.14mg；1.50mmol)HOBt。添加0.93当量(88.92mg；0.46mmol)EDC·HCl，之后悬浮液缓慢变成溶液。将溶液在环境温度下搅拌过夜并且随后形成悬浮液。向悬浮液中添加50.00当量(3.39g；24.94mmol)乙酸钠以形成溶液。将经修饰的HA f2通过添加无水乙醇沉淀，用乙醇洗涤并且在高真空下干燥过夜。将颗粒物溶解于16mL水中以形成澄清溶液。添加5.40mL 4MNaOH并且将溶液在环境温度下搅拌2小时。添加1.24mL乙酸。将氨基官能化的HA f3通过添加无水乙醇沉淀，用80v/v％乙醇和无水乙醇洗涤并且在高真空下干燥以给出白色颗粒物。0.93当量的EDC导致HA上的大约11％的羧酸酯基团的胺官能化。为了制备具有大约5％胺官能化的胺官能化的HA，使用0.40当量(38.63mg；0.20mmol)的EDC·HCl。
实施例2B马来酰亚胺官能化的HA的制备
根据以下反应方案，通过使胺官能化的HA f3与马来酰亚胺基丙酸NHS酯f4反应获得马来酰亚胺官能化的HA：
/>
方案2B
将176.1mg胺官能化的HA f3(0.252mmol/g胺)溶解于17.6mL 100mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中。添加在9.50mL乙腈中的150.48mg(0.57mmol；10.00当量)的3-马来酰亚胺基丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯f4。将反应混合物在环境温度下恰好搅拌60分钟。在搅拌下，将27.1mL 1M乙酸钠溶液(pH 5.5)添加到溶液中。添加无水乙醇以沉淀HA。将获得的颗粒物依次用80v/v％乙醇和无水乙醇洗涤。合并颗粒物并且将材料在高真空下干燥3小时，随后在-20℃下储存。将获得的颗粒物溶解于17.6mL 1％乙酸中。将17.6mL 1M乙酸钠溶液(pH 5.5)添加到溶液中。将所得混合物通过33mm直径的0.22μm PES注射器过滤器过滤并且通过添加无水EtOH沉淀马来酰亚胺官能化的HA f5。将颗粒物依次用80％v/v乙醇和无水乙醇洗涤。将颗粒物合并并且在高真空下干燥3小时以给出159.50mg白色颗粒物。通过添加2-巯基乙醇并检测未反应的残留2-巯基乙醇，通过反向Ellman测定进行马来酰亚胺含量确定。检测到相对于在天然HA中的最初可用的羧酸酯基团的大约10％的马来酰亚胺官能化程度。
实施例2C：硫醇官能化的HA的制备
设计硫醇官能化的HA以使得在生理条件下孵育交联HA凝胶后，HA凝胶能够降解。在此实施例中，引入了使用壬二酸的酯键。
方案2C
将166.90mg胺官能化的HA f3(0.104mmol/g胺官能团)溶解于13.9mL100mM HEPES缓冲液(pH 8.40)中。将新制备的在7.5mL乙腈中的75.3mg(0.11mmol；5.00当量)的NHS酯d9的溶液(参见方案1F)添加到混合物中。将混合物在环境温度下搅拌120分钟以制备二硫化物官能化的HA(未示出)。将新制备的在2.1mL水中的63.2mg三(2-羧乙基)膦HCl盐(TCEP)(0.22mmol；10.00当量)的溶液添加到反应混合物中。将溶液在环境温度下搅拌1小时。将22.9mL 1M乙酸钠溶液(pH 5.5)添加到反应混合物中。将所得溶液在Falcon管之间分配。为了沉淀HA内容物，添加无水乙醇。将管封闭，振荡并且离心。将获得的颗粒物依次用80v/v％乙醇和无水乙醇洗涤。将颗粒物合并并且在高真空下干燥3小时，随后在氩气氛下在-20℃下储存直至进一步使用。通过在氩气氛下剧烈搅拌将颗粒物溶解于16.7mL 1％乙酸中。将16.7mL 1M乙酸钠溶液(pH 5.5)添加到溶液中。将所得混合物通过33mm直径的0.22μm PES注射器过滤器过滤到Falcon管中并且通过添加无水乙醇沉淀。将管封闭，振荡并且离心。将颗粒物依次用80％v/v乙醇和无水乙醇洗涤。将颗粒物合并并且在高真空下干燥3小时以给出150.10mg呈白色颗粒物的硫醇官能化的HA f6。通过Ellman测定进行硫醇含量测定。检测到相对于在天然HA中的最初可用的羧酸酯基团的大约4％的硫醇官能化程度。
实施例3A：接头-兰尼单抗缀合物的制备
方案3A
根据方案3A进行Rbz与来自实施例1D的接头b8的缀合。
可以用HiPrep柱随后通过离心过滤器浓缩(小规模)或通过使用切向流过滤(TFF)系统(大规模)进行缓冲液更换和浓缩。
在此实施例中使用在10mM组氨酸、10wt％α,α-D-海藻糖、0.01％ Tween20(pH5.5)中以40mg/mL配制的62mL Rbz。在缓冲液更换为30mM磷酸盐(pH 7.4)并且浓缩后，将Rbz溶液使用孔径为0.22μm的Millex GV 33mm过滤器过滤。回收约50g的蛋白质溶液。浓度确定后，通过添加磷酸盐缓冲液将样品稀释至40mg/mL以给出53.1493g的终体积。以39.8mg/mL的浓度和约53mL体积的总体积回收2118.5mg(85％)的Rbz。
将在30mM磷酸钠盐(pH 7.4)中的1990mg Rbz(50mL，39.8mg/mL)在冰上冷却。添加15当量(8.0mL)的化合物b8(实施例1D)(相对于NHS内容物修正，DMSO中的100mM储备溶液)，并且小心地振荡溶液(不使用搅拌器)。
将溶液在冰上孵育5min，随后立即发生pH改变，并且进行缓冲液更换以从Rbz接头缀合物溶液中除去过量的接头种类。通过添加0.12体积当量(6mL)的0.5M琥珀酸(pH 3.0)进行缓冲液变换，并且小心地振荡溶液。溶液的pH移向约pH 4.0。使用配备有GE HiPrep柱的P-900进行缓冲液更换。缓冲液是5mM琥珀酸(pH 4.0)，以8.0mL/min的流速每次运行5mL的注射体积进行13次运行而引入。收集浓度为14.5mg/mL的134mL产物溶液(基于天然药物的消光系数计算)。
通过质谱法分析缀合之前和之后的样品。缀合前的解卷积MS谱指示了在48381处的Rbz单峰。缀合后的谱指示了在48382处的Rbz峰、在49066处的单缀合物g1峰、在497543处的双缀合物和在50437处的三缀合物。为清楚起见，方案3A中只示出了主要产物单缀合物g1，并且将单缀合物如下所述的与更高的缀合物分离。
实施例3B：将纯化标签引入Rbz接头缀合物中
方案3B
根据方案3B将纯化标签e8引入Rbz接头缀合物g1中。
在环境温度下向包含单缀合物g1(和未示出的更高的缀合物)(14.53mg/mL，1824mg蛋白质，37.7μmol)的125mL接头缀合物混合物的溶液中添加相对于蛋白质含量的2.5摩尔当量的纯化标签e8(方案1G)(1886μL 50mM e8，94.3μmol，在水中)，并且小心地振荡溶液以得到标签化的Rbz接头单缀合物g2和更高的缀合物(未示出)。35min后，pH移向pH7.4，并且通过添加0.170体积当量(21.4mL)的0.5M磷酸盐、200mM TriMED(pH 7.8)(不考虑标签化溶液的体积)进行胺脱保护，在此期间保护基团被切割掉以得到标签化Rbz接头单缀合物g3和更高的缀合物(未示出)。将溶液在培养箱中在25℃的控制温度下储存过夜。
从25℃培养箱中取出约148mL蛋白质溶液并且将0.419体积当量(52.4mL，基于初始125mL蛋白质体积，实际添加52.7mL)的0.5M琥珀酸(pH3.0)添加到g3和更高的缀合物的溶液中以获得大约pH 4.0的pH。
实施例3C：Rbz接头单缀合物的分离
用于CIEC纯化，将含有未缀合的Rbz的混合物和标签化的Rbz-接头单缀合物g3和更高的缀合物的混合物的蛋白质溶液用20mM琥珀酸(pH 4.0)稀释3.3倍至约660mL的终体积。与以下缓冲液一起使用GE Healthcare Source柱15S(柱XK26，高度5.2cm)：20mM琥珀酸(pH 4.0)(缓冲液A)；和20mM琥珀酸、1M NaCl(pH 4.0)(缓冲液B)。梯度是线性的，10％-50％ B，32CV(20mL/min流速)。负载是大约300mg。在CIEC之前通过MS分析缀合物混合物并且在解卷积MS谱中，指示了48380m/z峰(天然Rbz)、49573峰(单缀合物g3)、50766峰(双缀合物)和51958峰(三缀合物)。CIEC级分1主要含有天然Rbz(48380的m/z峰)，CIEC级分2主要含有单缀合物g3(49573的m/z峰)，并且CIEC级分3主要含有双缀合物(50766的m/z峰)。
在分离Rbz-接头单缀合物g3后，使用切向流过滤将蛋白质溶液浓缩至约5mg/mL。起始材料含有在琥珀酸盐缓冲液(pH 4.0)中以约0.85mg/mL配制的约450mL Rbz-接头单缀合物g3。将样品使用孔径为0.22μm的一个Millex GV 33mm过滤器过滤。获得浓度为4.82mg/mL的68mL的Rbz-接头单缀合物溶液。
实施例3D：纯化标签切割
方案3D
通过方案3C中显示的程序除去纯化标签e8。
通过在2℃-8℃下将Rbz-接头单缀合物g3(68ml，4.82mg/ml)与DTT一起孵育过夜来切割纯化标签e8(去标签化)，其中DTT的浓度为1mM。通过将0.0161g DTT溶解于4.175mL琥珀酸盐缓冲液中制备在20mM琥珀酸(pH4.0)中的25mM DTT储备溶液。通过Millex-GV13mm过滤器(孔径0.22μm)过滤溶液。将Rbz-接头单缀合物溶液和25mM DTT储备溶液在冰上冷却至4℃。将2.838mL 25mM DTT溶液添加到蛋白质溶液中以给出1mM的最终DTT浓度。在2℃-8℃下进行过夜孵育。通过MS监测纯化标签的去除。切割前的Rbz-间隔子-接头-纯化标签具有指示纯化标签单缀合物g3的在49573处的峰。切割后的Rbz-接头缀合物g4具有指示切割纯化标签后的Rbz-接头单缀合物的在48709处的峰。
通过CIEC纯化Rbz-接头缀合物g4。将DTT介导的脱保护后的70.9mL Rbz-接头单缀合物用10mM组氨酸(pH 5.5)稀释12倍至约850mL的终体积。柱是GE Healthcare Source15S XK26柱(高度5.2cm)。缓冲液体系是：10mM组氨酸(pH 5.5)(缓冲液A)；和10mM组氨酸、500mM NaCl(pH 5.5)(缓冲液B)。梯度是线性的，0％-50％ B，25CV(17.5mL/min流速)。负载是约300mg。
在CIEC步骤后，通过使用缓冲液B(10mM组氨酸、500mM NaCl，pH5.5)进一步稀释来调节蛋白质溶液的渗透压以给出约150mM的NaCl浓度。在CIEC运行期间，收集63mL Rbz-接头单缀合物。将15.6mL 10mM组氨酸、500mM NaCl(pH 5.5)添加到样品中以给出Rbz-间隔子-接头单缀合物g4的78.6mL的总体积。
实施例3E：Rbz-接头浓度
为了制备蛋白质负载为40mg/mL的HA-接头-Rbz h1，将Rbz-接头单缀合物g4浓缩至60mg/mL以上。使用两个Amicon Ultra 15PLCG Ultracel Membranes MWCO 10kDa通过在3000g下离心浓缩蛋白质溶液。获得蛋白质含量为64.6mg/mL(293.8mg)的Rbz-接头单缀合物g4的约4.5g溶液。通过MS分析Rbz-接头单缀合物g4，并且发现了指示Rbz-接头单缀合物的在48710处的峰。
实施例4A：-接头-Rbz缀合物与马来酰亚胺官能化的HA的缀合
方案4A
如方案4A中所示的进行Rbz接头单缀合物g4与马来酰亚胺官能化的HA f5的缀合。
通过将Rbz接头单缀合物g4的浓缩溶液添加到相对于硫醇含量的1.3当量的马来酰亚胺官能化的HA f5中进行Rbz-接头单缀合物g4与马来酰亚胺官能化的HA f5的缀合，得到44mg/mL(基于硫醇含量)的蛋白质(Rbz)浓度和约0.49％的HA含量。允许将根据实施例3C制备的Rbz-接头单缀合物样品(在10mM组氨酸、150mM NaCl(pH 5.5)中配制的64.6mg/mL的蛋白质溶液)温热至环境温度。将样品通过孔径为0.22μm的GV Millex过滤器33mm过滤。Rbz接头单缀合物g4溶液的硫醇含量确定为69.0mg/mL。将1300μL Rbz接头单缀合物g4溶液转移到5mL Eppendorf管中。添加336μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.01％ Tween 20(pH 5.5)缓冲液。添加68μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.2％ Tween 20(pH 5.5)。添加335μL HA-马来酰亚胺f5溶液(116kDa HA的含量为30mg/mL，并且马来酰亚胺的含量为0.24mmol/g)。将所得溶液充分混合并且允许在环境温度下孵育4小时。4小时反应时间后，取出25μL样品并且通过SEC分析。92％的Rbz接头单缀合物已经结合至马来酰亚胺官能化的HA。
实施例4B：硫醇-马来酰亚胺交联以形成接头-药物交联HA凝胶
根据方案4B进行交联：
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方案4B
将2014μL接头-Rbz HA-缀合物h1孵育4小时后，添加201μL HA-硫醇l f6溶液(116kDa HA的含量为27.8mg/mL，并且硫醇的含量为0.098mmol/g)，在所得溶液中得到40mg/mL(基于硫醇含量)的最终蛋白质含量和7.01mg/mL的最终HA含量。将溶液充分混合并且吸入配备有18G钝头插管的2mL注射器中。使用注射器尖端进行填充，将溶液快速填充到8个1mL Luer Lock注射器中。将螺旋盖安装在注射器上，并且允许它们在环境温度下以直立位置孵育约24h。随后将注射器在5℃下孵育3周。在注射器中完成交联反应以产出交联HA凝胶Rbz缀合物h2。
实施例4C Rbz从交联HA Rbz凝胶中的释放
使用根据实施例4B进行小的调整所制备的材料在体外分析Rbz从交联HARbz凝胶中的释放。将13mg-17mg Rbz HA凝胶h2转移到无菌无热原的管中。根据975μL缓冲液与25mgHA的比率，添加释放缓冲液(60mM磷酸钠、3mM EDTA、0.01％ Tween，pH 7.4)。没有倒置或振荡管。将所有的管在培养箱中在37℃的控制温度下储存。在不同的时间点，从培养箱中取出管并且离心(9300rcf，3min)。将上清液转移到新的Eppendorf管中，并且通过使用1.9mL/cm.mg的Rbz的消光系数，以338nm的参考波长在280nm处通过吸光度测量来确定上清液的蛋白质浓度。对于每个样品，使用转移的质量和凝胶的蛋白质含量计算释放(以％计)(表4c)。
表4C兰尼单抗的释放
实施例5A：接头-G6.31 AARR缀合物的制备
方案5A
根据方案5A进行G6.31 AARR与来自实施例1D的接头b8的缀合。
可以用HiPrep柱随后通过离心过滤器浓缩(小规模)或通过使用切向流过滤(TFF)系统(大规模)进行缓冲液更换和浓缩。
在此实施例中使用在20mM组氨酸、240mM蔗糖、0.01％ Tween 20(pH5.5)中以40mg/mL配制的31mL G6.31 AARR(在方案5A和以下反应方案中以“G6.31”示出)。在缓冲液更换为30mM磷酸盐(pH 7.4)并且浓缩后，回收约23g蛋白质溶液并且确定浓度。通过添加磷酸盐缓冲液将样品稀释至40mg/mL。获得含有浓度为39.9mg/mL的1277mg G6.31的总体积为32.0g的蛋白质溶液。
将在30mM磷酸钠(pH 7.4)中的1277mg G6.31 AARR(32.0mL，39.9mg/mL)在冰上冷却。添加15当量(4.6mL)的化合物b8(实施例1D)(相对于NHS内容物修正，DMSO中的100mM储备溶液)，并且将溶液倒置数次。
将溶液立即在冰上孵育。5min后，通过将pH移向约pH 4.0终止缀合反应。因此，添加0.12体积当量(3.8mL)的0.5M琥珀酸(pH 3.0)，并且将溶液倒置数次。使用配备有GEHiPrep柱的Basic 10以8mL/min的流速在10次运行中将缓冲液更换为5mM琥珀酸(pH4.0)。每次运行注射4mL溶液。总共收集到浓度为12.9mg/mL的93.1g产物溶液。
通过质谱法分析缀合之前和之后的样品。缀合前的解卷积MS谱指示了在47390处的G6.31单峰。缀合后的谱指示了在47392处的G6.31 AARR峰、在48077处的单缀合物j1峰、在48766处的双缀合物、在49452处的三缀合物和在50147处的四缀合物。为清楚起见，方案3A中只示出了主产物单缀合物j1，并且将单缀合物如下所述的与更高的缀合物分离。
实施例5B：将纯化标签引入G6.31 AARR接头缀合物中
方案5B
根据方案5B将纯化标签e8引入G6.31 AARR接头缀合物j1中。
在环境温度下向包含单缀合物j1(天然G6.31 AARR和未示出的更高的缀合物)(12.9mg/mL，1203mg蛋白质，25.4μmol(为了简单起见，使用G6.31AARR的消光系数和分子量))的93.1mL接头缀合物混合物的溶液中添加相对于蛋白质含量的2.5mol当量的纯化标签e8(方案1G)(1270μL 50mM e8，在20mM琥珀酸(pH 4.0)中，63.5μmol)，并且小心地振荡溶液以得到标签化的G6.31接头单缀合物j2和更高的缀合物(未示出)。50min后，pH移向pH7.4，并且通过添加0.170体积当量(15.8mL)0.5M磷酸盐、200mM TriMED(pH 7.8)(不考虑添加的纯化标签溶液的体积)进行胺脱保护。由于在pH改变后的混合物中仍检测到单标签化的双缀合物，将另外的相对于蛋白质含量的0.2当量(100μL 50mM e8，在20mM琥珀酸(pH4.0)中，5μmol)的纯化标签e8(方案1G)添加到混合物中。将溶液在培养箱中在25℃的控制温度下储存过夜，在此期间，标签化的接头单缀合物j2(和更高的缀合物)的接头的保护基团被切割掉，从而产生j3。
从25℃培养箱中取出约110mL蛋白质溶液并且将0.419体积当量(39.0mL，基于初始93.1mL蛋白质体积)的0.5M琥珀酸(pH 3.0)添加到j3和更高的缀合物的溶液中以获得大约pH 4.0的pH。
实施例5C：G6.31 AARR接头单缀合物的分离
用于CIEC(阳离子交换色谱)纯化，将含有未缀合的G6.31的混合物和标签化的G6.31 AARR-接头单缀合物j3和更高的缀合物的混合物的蛋白质溶液用20mM琥珀酸(pH4.0)稀释3.3倍至约500mL的终体积。与以下缓冲液一起使用GE Healthcare Source 15S柱(柱HiScale26，高度9.8cm)：20mM琥珀酸(pH 4.0)(缓冲液A)；和20mM琥珀酸、1M NaCl(pH4.0)(缓冲液B)。梯度是线性的，0％-50％ B，40CV或10％-50％ B，32CV，流速为20mL/min。每次运行的负载是大约600mg。在CIEC之前通过MS分析缀合物混合物并且在解卷积MS谱中，观察到在47395处的峰(天然G6.31 AARR)、在48584处的峰(单缀合物j3)、在49782处的峰(双缀合物)、在50986处的峰(三缀合物)和在52174处的峰(四缀合物)。收集所有的CIEC峰。将主要含有单缀合物j3的级分(534.2mL；0.67mg/mL)合并并且用于下一步骤。
实施例5D：纯化标签切割
方案5D
通过方案5D中显示的程序除去纯化标签e8。
通过在DTT的存在下孵育分离的标签化的G6.31AARR-接头单缀合物j3(534.2ml，0.67mg/mL)切割纯化标签e8(去标签化)。通过在35.4mL 20mM琥珀酸(pH 4.0)中溶解0.1364g DTT制备25mM DTT储备溶液。将G6.31-接头单缀合物溶液和25mM DTT储备溶液冷却至4℃。将22.3mL 25mM DTT储备溶液添加到蛋白质溶液中以给出1mM的最终DTT浓度。将所得溶液在培养箱中在5℃的控制温度下储存过夜。通过MS监测纯化标签的去除。切割前，检测到指示标签化的单缀合物j3的在48585处的峰。切割后，检测到确认去标签化和G6.31AARR-接头单缀合物j4的产生的在47720处的峰。
通过CIEC纯化G6.31 AARR-接头单缀合物j4。将DTT介导的脱保护后的556.5mLG6.31-接头单缀合物用20mM琥珀酸(pH 4.0)稀释3倍至约1660mL的终体积。使用GEHealthcare Source 15S HiScale26柱(高度9.8cm)。缓冲液体系是：10mM组氨酸(pH 5.5)(缓冲液A)；20mM琥珀酸(pH 4.0)(A2)；和10mM组氨酸、500mM NaCl(pH 5.5)(缓冲液B)。在柱装载后，用2CV的缓冲液A2洗涤柱，随后用2CV A1洗涤柱。随后，应用线性梯度：0％-50％B，25CV(20mL/min流速)。负载是约300mg。
在CIEC步骤后，通过使用缓冲液B(10mM组氨酸、500mM NaCl，pH5.5)进一步稀释来调节蛋白质溶液的渗透压以给出约150mM的NaCl浓度。在CIEC运行期间，收集130mL G6.31-接头单缀合物。将28mL 10mM组氨酸、500mM NaCl(pH 5.5)添加到样品中以给出G6.31AARR-接头单缀合物j4的158mL的总体积。
实施例5E：G6.31 AARR-接头浓缩
为了制备蛋白质负载为40mg/mL的HA-接头-G6.31 AARR k1(以下实施例6A)，将G6.31 AARR-接头单缀合物j4浓缩至60mg/mL以上。使用四个Amicon Ultra 15PLCGUltracel Membranes MWCO 10kDa通过在3000g下离心浓缩蛋白质溶液。获得蛋白质含量为76.5mg/mL(298mg)的G6.31 AARR-接头单缀合物j4的约3.9g溶液。通过MS分析浓缩溶液，并且检测到对应于G6.31-接头单缀合物j4的在47723处的峰。通过添加689μL 10mM组氨酸、150mM NaCl(pH 5.5.H 5.5)将样品稀释至65mg/mL。实施例6A：G6.31AARR-接头单缀合物j4 与马来酰亚胺官能化的HA的缀合
/>
方案6A
如方案6A中所示的进行G6.31接头单缀合物j4与马来酰亚胺官能化的HAf5的缀合以制备接头-G6.31 AARR-HA缀合物k1。
通过将G6.31接头单缀合物j4的浓缩溶液添加到相对于硫醇含量的1.3当量的马来酰亚胺官能化的HAf5中进行G6.31-接头单缀合物j4与马来酰亚胺官能化的HAf5(实施例2B)的缀合，得到44mg/mL(基于硫醇含量)的蛋白质(G6.31 AARR)浓度和约0.49％的HA含量。允许将根据实施例5D制备的G6.31 AARR-接头单缀合物j4样品(在10mM组氨酸、150mMNaCl(pH5.5)中配制的64.7mg/mL的蛋白质溶液)温热至环境温度。将样品通过孔径为0.22μm的GV Millex过滤器33mm过滤。G6.31接头单缀合物j4溶液的硫醇含量确定为73.4mg/mL。将2190μL G6.31接头单缀合物j4溶液转移到50mL Falcon管中。添加735.5μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.01％ Tween 20(pH5.5)缓冲液。添加115.3μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.2％ Tween 20(pH5.5)。添加612.5μL无菌过滤(Millex GP，25mm直径，0.22μm)的HA-马来酰亚胺f5溶液(116kDa HA的含量为30mg/mL，并且马来酰亚胺的含量为0.24mmol/g)。将所得溶液充分混合并且允许在环境温度下孵育4小时。4小时反应时间后，取出25μL样品并且通过SEC分析。将95％的G6.31 AARR-接头单缀合物j4与马来酰亚胺官能化的HAf5缀合以提供接头-G6.31 AARR-HA缀合物k1。
实施例6B：硫醇-马来酰亚胺交联以形成接头-G6.31 AARR交联HA凝胶
根据方案6B进行硫醇HA f6和接头-G6.31 AARR-HA缀合物k1的交联以给出接头-G6.31 AARR交联HA水凝胶k2。
/>
方案6B
将3628μL接头-G6.31 HA-缀合物k1孵育4小时后，添加363μL无菌过滤(MillexGP，25mm直径，0.22μm)的HA-硫醇f6(实施例2C)溶液(116kDa HA的含量为28.4mg/mL，并且硫醇的含量为0.098mmol/g)，在所得溶液中得到40mg/mL(基于硫醇含量)的最终蛋白质含量和7.16mg/mL的最终HA含量。将溶液充分混合并且吸入配备有18G钝头插管的5mL注射器中。使用注射器尖端进行填充，将溶液快速填充到18个1mL Luer Lock注射器中。将螺旋盖安装在注射器上，并且允许它们在环境温度下以直立位置孵育约24h。随后将注射器在5℃下孵育3周。在注射器中完成交联反应以产出交联HA凝胶G6.31缀合物k2。
实施例6C G6.31 AARR从交联HA G6.31凝胶中的释放
使用来自实施例6B的材料在体外分析G6.31 AARR从交联HA G6.31AARR凝胶k2中的释放。将11mg-16mg G6.31 HA凝胶转移到无菌无热原的管中。根据975μL缓冲液与25mgHA的比率，添加释放缓冲液(60mM磷酸钠、3mM EDTA、0.01％ Tween，pH 7.4)。没有倒置或振荡管。将所有的管在培养箱中在37℃的控制温度下储存。在不同的时间点，从培养箱中取出管并且离心(9300rcf，3min)。将上清液转移到新的Eppendorf管中，并且通过使用1.38mL/cm.mg的G6.31的消光系数，以338nm的参考波长在280nm处通过吸光度测量来确定上清液的蛋白质浓度。对于每个样品，使用转移的质量和凝胶的蛋白质含量计算释放(以％计)(表6C)。
表6C G6.31的释放
时间/d 释放/％
7 14.67
14 21.08
21 27.58
33 35.79
62 53.98
70 58.42
125 75.87
186 93.18
实施例7A交联HA RabFab凝胶的制备。
根据实施例3A、3B、3C和3D中描述的程序进行RabFab-接头缀合物的制备。根据实施例3E中描述的程序进行RabFab-接头单缀合物的浓缩，不同之处在于将缀合物浓缩至46mg/mL的浓度，由此最终凝胶中的蛋白质含量是大约30mg/mL。
根据实施例4A中描述的程序进行RabFab-接头缀合物与马来酰亚胺官能化的HA的缀合。将5502μL RabFab-接头缀合物与1804μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.01％ Tween 20(pH 5.5)缓冲液混合。添加289μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.2％ Tween 20(pH 5.5)。添加1124μL HA-马来酰亚胺f5溶液(116kDa HA的含量为30mg/mL，并且马来酰亚胺的含量为0.24mmol/g)。将所得溶液充分混合并且允许在环境温度下孵育4小时。
根据实施例4B中描述的程序获得交联HA RabFab凝胶的制备。向8691μL RabFab-接头-HA缀合物中添加869μL HA-硫醇f6溶液(116kDa HA的含量为22.6mg/mL，并且硫醇的含量为0.096mmol/g)。将溶液充分混合并且吸入配备有18G钝头插管的10mL注射器中。使用注射器尖端进行填充，将溶液快速填充到48个1mL Luer Lock注射器中。将螺旋盖安装在注射器上，并且允许它们在环境温度下以直立位置孵育约24h。随后将注射器在5℃下孵育3周。在注射器中完成交联反应以产出交联HA凝胶RabFab缀合物m1。
实施例7B羧基荧光素标记的HA安慰剂凝胶的制备
根据实施例2A中描述的程序获得胺官能化的HA的制备。为了获得具有更高胺官能化程度的HA变体，将1.00g 116kDa HA溶解于125mL 100MES、0.4M 1,3-二氨基丙烷缓冲液(pH 5.5)中，并且使用1.15g(7.48mmol)的HOBt和444.6mg(2.32mmol)的EDC。随后通过将463mg上述胺官能化的HA溶解于46mL 100mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中，随后添加1.5mL 5(6)-羧基荧光素N-琥珀酰亚胺酯溶液(在乙腈中5.28mg/mL)，获得羧基荧光素和马来酰亚胺标记。在环境温度下在搅拌下孵育1小时后，将新制备的396mg3-马来酰亚胺基丙酸NHS酯在24mL乙腈中的溶液添加到溶液中。在环境温度在搅拌下再孵育1小时后，根据实施例2B中描述的程序进行反应混合物的后处理。
根据以下程序获得羧基荧光素标记的HA凝胶的制备：将140.6mg羧基荧光素标记的马来酰亚胺官能化的HA溶解于6580μL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.01％ Tween 20(pH5.5)缓冲液中。将82.8mg硫醇官能化的HA溶解于2946μL10mM组氨酸、150mM NaCl、0.01％Tween 20(pH 5.5)缓冲液中。将57.6mg 2-巯基乙醇溶解于6216μL 10mM组氨酸、150mMNaCl、0.01％ Tween 20(pH 5.5)缓冲液中。将500μL此2-巯基乙醇溶液转移到新的小瓶中并且用49.5mL 10mM组氨酸、150mM NaCl、0.01％ Tween 20(pH5.5)缓冲液稀释。将121.5mg天然116kDa HA溶解于8433μL稀释的2-巯基乙醇溶液中。将8433μL此溶液转移到新的小瓶中并且添加2568μL马来酰亚胺HA溶液。将所得溶液稍加振荡，离心并且允许在环境温度下孵育2小时。将10mL此溶液转移到新的小瓶中并且添加1mL硫醇HA溶液。将溶液充分混合并且吸入配备有18G钝头插管的10mL注射器中。使用注射器尖端进行填充并且应用每个注射器大约300μL的填充体积，将溶液快速填充到34个1mL Luer Lock注射器中。将螺旋盖安装在注射器上，并且允许它们在环境温度下以直立位置孵育约24h。随后将注射器在5℃下孵育3周。在注射器中完成交联反应以产出交联羧基荧光素标记的HA安慰剂凝胶m2。
实施例7C：交联HA RabFab凝胶的体内释放动力学
通过单次双侧玻璃体内注射向幼稚新西兰白(NZW)兔给予交联HA RabFab凝胶，随后进行长达60天的观察。在治疗前一天，注射后立即将局部抗生素(妥布霉素(tobramicin)眼用软膏)应用于双眼两次，并且注射后一天应用两次，除了在第1天和第2天送至尸检的动物。在给药之前，将散瞳滴剂(1％托品酰胺)应用于每只眼以使瞳孔完全扩张。在所述程序之前和期间，用异氟烷/氧气使动物镇静。在注射之前还将爱尔卡因(0.5％)应用于每只眼。用在无菌水(U.S.P.)中稀释到1:10,000(v/v)的苯扎氯铵(ZephiranTM)冲洗结膜。
通过单次30μL玻璃体内注射(0.3mg剂量)向所有动物的双眼给予交联HARabFab凝胶。剂量由经过委员会认证的兽医眼科医生使用具有25规格x1/2”针头的1mL Luer Lock注射器给予。为了模拟临床给药，在颞下象限中(即分别在左眼和右眼的5点钟和7点钟位置(当面向动物时))向眼睛给药。治疗后立即通过裂隙灯活组织显微镜检查和/或间接检眼镜检查来检查眼睛。
将所有动物通过切开腋动脉或股动脉进行放血，然后通过静脉注射戊巴比妥钠进行麻醉。将房水、玻璃体液和视网膜组织收集，在液氮中快速冷冻并且在-80℃下储存。通过抗原结合ELISA确定测试物品的玻璃体浓度。低于LLOQ的值不用于药代动力学分析或用于图形或概要目的。
使用靶标涂布法进行ELISA分析。在此测定中，靶标涂布是缀合至KLH的磷酸化cMet肽(P-cMet肽，来自加利福尼亚州南旧金山的Yenzym)。为了制备测定板，用300μl缓冲液重构冻干的P-cMet肽，并且在0.05M碳酸氢钠缓冲液中进一步稀释至1:200。将稀释的P-cMet肽(100μL/孔)添加到96孔微量滴定板(Nunc，Thermo Scientific，伊利诺伊州罗克福德)中并且在2℃-8℃下孵育过夜。孵育后，将板用400μl洗涤缓冲液(BA029)洗涤三次，随后用测定稀释剂(含有0.5％牛血清白蛋白和0.05％ Proclin的洗涤缓冲液)封闭。通过将兔Fab(Genentech，加利福尼亚州南旧金山)稀释至200ng/ml，然后在测定稀释剂中以1:2连续稀释来制备标准曲线。将对照在测定稀释剂中以1:100稀释。使用测定稀释剂将每个样品稀释至测定的定量范围。将所有样品、对照和标准品以100μl添加到板中并且在室温下温和地搅动孵育2小时。孵育和洗涤后，在测定稀释剂中1/4,000稀释后，每孔加入100μl检测抗体(鼠抗兔轻链-HRP，SouthernBiotech，亚拉巴马州伯明翰)。然后将板在室温下温和地搅动孵育1小时。在另外洗涤后，将100μl HRP底物(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，TMB，来自马里兰州盖瑟斯堡的Kirkegard&Perry Laboratory)添加到每个孔中，随后在室温下温和地搅动孵育15min。用100μl 1M磷酸终止反应。在450nm检测波长和630nm参考波长处对板进行读数(SpectraMax 384-plus；Molecular Devices，加利福尼亚州森尼维尔)。使用四参数逻辑斯蒂曲线拟合软件(Softmax，Molecular Devices)绘制标准品的光密度值，通过外推法从中导出对照和测试样品的浓度值。
如上所述通过抗原结合ELISA确定玻璃体中的浓度，并且随时间变化进行绘图。图12示出了总结随注射后时间变化的玻璃体浓度的图。IVT给予后的游离RabFab呈现为蓝色，而交联HA中释放的游离RabFab呈现为红色。点是个别观察数据，而线是基于玻璃体中游离Fab的已知PK参数、可逆的前药接头的体外释放以及兔玻璃体的pH和温度的预期玻璃体浓度的模型预测值。使这些数据经受非房室分析以获得药代动力学(PK)参数。
通过标称时间和剂量的非房室分析(Phoenix WinNonlin，Pharsight Corp，加利福尼亚山景城)确定药代动力学参数。使用非房室分析计算的PK参数总结于表2中。
表1：NZW兔PK研究中的PK参数估值
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从NZW兔的交联HARabFab释放后的RabFab玻璃体PK与基于体外释放的预测一致。最初较高的浓度是由于含有约3.6％游离Fab和约4.9％游离Fab-HA种类的剂量溶液。兔玻璃体液中的释放半衰期估计是53天。
玻璃体中游离Fab的终末半衰期等于可逆的前药接头的半衰期。这意味着一旦HA释放药物的动力学与随后从玻璃体中的消除达到平衡，在玻璃体中的活性药物的有效消除半衰期将比在IVT注射游离Fab后通常观察到的有效消除半衰期长53/3.2＝16.5倍。
实施例5E NHP眼中没有显著碎裂或颗粒运动。
在颞下象限中向两只食蟹猴双侧给予单次ITV给予的安慰剂交联HA凝胶-荧光素(50uL/眼)。观察30天动物的临床观察、体重变化、食物消耗和眼部观察(IOP、生物显微镜(裂隙灯)和眼底检查)。另外，在使用前房角镜检查、角膜成像(gonioimaging)、使用共聚焦扫描激光检眼镜的眼底成像和使用Fluoroton的荧光测定的同时，监测材料的位置和粘结性。
图13A是在第15天拍摄的代表性cSLO图像。TA(箭头)保留在下玻璃体中，并且不会遮挡中央凹(F)或视盘(ON)。图13B是在去除前段和晶状体后在尸检时用钴蓝光拍摄的图像。注意TA(箭头)仍然具有粘结性。可以看出，安慰剂交联HA凝胶m2在30天后显示出最小的碎裂和移动。
实施例7F兔中交联HA RabFab凝胶耐受性研究
在颞下象限中向三只新西兰白兔双侧给予单次ITV给予的交联HA-RabFab凝胶(50μL/眼)。观察60天动物的临床观察、体重变化、食物消耗和眼部观察(IOP、生物显微镜(裂隙灯)和眼底检查)。采集血清样品用于ADA和TK。在尸检时，取出眼睛并且加工用于组织病理学。图14示出了组织学切片。可以看出，在2个月的研究中，交联HA-RabFab凝胶良好耐受。没有观察到细胞浸润、炎症反应和异物反应(6只眼睛)。
实施例7G食蟹猴中交联HA G6.31 AARR凝胶耐受性研究
在颞下象限中向两只食蟹猴双侧给予单次ITV注射的缀合至抗VEGF Fab G6.31AARR的交联HA凝胶(50μL/眼；1.92mg Fab/眼)。观察3个月(92天)动物的临床观察、体重变化、食物消耗和眼部观察(IOP、生物显微镜(裂隙灯)和眼底检查)。在使用前房角镜检查和角膜成像的同时，监测材料的位置和粘结性。采集血清样品进行ADA和TK评估，并且在3个月时通过组织病理学评估眼睛。
在整个评估期间，水凝胶保持粘结性并且在下玻璃体中。尽管截至第28天诱导了两只动物的ADA，但是没有发现显著的生命炎症。在临床观察、定性食物消耗和体重方面没有测试物品相关的变化。图15示出了含有测试物品的眼睛下半球的上下组织学切片。可以看出，在3个月的研究中，交联HA-G6.31 AARR凝胶良好耐受。没有观察到细胞浸润、炎症反应和异物反应(4只眼睛)。
与缀合至兰尼单抗的PEG基颗粒水凝胶相比，交联HA-G6.31 AARR凝胶展示出优异的安全特性。当注入下玻璃体腔中时，交联HA-G6.31 AARR凝胶不移动并且保持在视轴下方，并且因此预期不会干扰患者视力。相反，PEG基颗粒水凝胶在玻璃体腔内自由移动。
交联HA-G6.31 AARR凝胶保持粘结性并且不形成大量游离颗粒状碎片，因此限制了流出物堵塞的风险。在食蟹猴眼的前房中观察到一部分PEG基颗粒水凝胶。
实施例8：用于本发明的抗体缀合物的示例性的优化的抗VEGF抗体
在此实施例中描述的任何优化的抗VEGF抗体都可以用于制备如上文实施例3A至4D中所述的抗体缀合物。例如，可以使用国际专利申请号PCT/US2016/053454中描述的任何优化的抗VEGF抗体。表3描述了可以使用的示例性的优化的抗VEGF抗体以及每种抗体的VH和VL结构域的氨基酸序列。表4描述了表3中描述的抗VEGF抗体的VL HVR氨基酸序列。表5描述了表3中描述的抗VEGF抗体的VH HVR氨基酸序列。在具体实施方案中，使用抗VEGF抗体G6.31 AARR(在本文中也称为“G6.31.AARR”)。
表3：示例性抗VEGF抗体的VH和VL氨基酸序列
/>
表4：来自表3的抗体的VL HVR序列
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表5：来自表3的抗体的VH HVR序列
/>
可以突变上文列出的任何抗体(例如，G6.31 AARR)的Fab重链的上铰链区，以除去文献中报道的抗IgG1铰链自身抗体的反应性。参见例如，Brezski等人,J.Immunol.181:3183-3192,2008和Brezski等人,mAbs 2:3,212-220,2010。因此，G6.31 AARR重链的C末端氨基酸可以是T(野生型(WT)形式)或L(缺乏与抗人IgG Fab的反应性的变体形式)。野生型G6.31 AARR的全长重链氨基酸序列是SEQ ID NO:48。缺乏与抗人IgG Fab的反应性的变体形式的全长重链氨基酸序列是SEQ ID NO:49。G6.31 AARR和缺乏与抗人IgG Fab的反应性的变体形式的全长轻链氨基酸序列均是SEQ ID NO:50。
此书面说明书使用例子来公开本发明(包括最佳模式)，并且还使任何本领域技术人员能够实践本发明(包括制造和使用任何装置或系统以及执行任何并入的方法)。本发明的可取得专利权的范围由权利要求限定，并且可以包括本领域技术人员想到的其他例子。如果此类其他例子具有与权利要求的字面语言没有不同的结构元素，或者如果它们包括与权利要求的字面语言无实质差别的等效结构元素，则此类其他例子意图在权利要求的范围内。
序列表
<110> 基因泰克公司
阿森迪斯制药公司
<120> 水凝胶交联透明质酸前药组合物和方法
<130> P34128-WO
<140> PCT/US2018/023857
<141> 2018-03-22
<150> 62/475,094
<151> 2017-03-22
<160> 66
<170> PatentIn version 3.5
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Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
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Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
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Lys Thr His Leu
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Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Gly Ala Pro Phe
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
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Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
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Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Glu Ile Ser Asp Tyr
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Trp Ile His Trp Val Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Val
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Ala Gly Ile Thr Pro Ala Gly Gly Tyr Glu Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
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Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Glu Asn Thr Ala Tyr
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Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Trp Val
1 5 10

Claims (30)

1.一种交联HA药物水凝胶缀合物，其包含多个透明质酸聚合物2A和多个透明质酸聚合物2B，其中：
每个2A包含多个线性连接单元，所述单元包含：
每个2B包含多个线性连接单元，所述单元包含：
其中
未标记的虚线表示与用#标记的虚线处的相邻单元或与氢的附接点，
用#标记的虚线表示与未标记的虚线处的相邻单元或与羟基的附接点；并且
用*标记的虚线表示在2A的单元Z3和2B的单元Z4之间的交联附接点，使得至少一个2A与至少一个2B交联；
药物是抗VEGF抗体片段，其中交联HA药物缀合物的眼部有效半衰期相对于未修饰的药物高至少16倍；
Ra1和Ra2各自独立地是氢；C1-4烷基；碱金属离子、铵离子或碱土金属离子；
L2是可逆的前药接头；
连接透明质酸聚合物2A至透明质酸聚合物2B的L4'是生物可降解的间隔子；
连接所述可逆的前药接头L2至透明质酸聚合物2B的L4是任选生物可降解的间隔子；
2A总共包含s个单元，其中s是从25至2500，其中；
2A中Z1单元的数目是从0.8s至0.99s，并且
Z3单元的数目是从0.1s至0.01s；
2B总共包含t个单元，其中t是从25至2500，其中；
2B中Z1单元的数目是从0.75t至0.94t；
Z2和Z4单元的组合数目是从0.14t至0.06t；
Z2单元的数目是至少0.01t；
Z4单元的数目是至少0.01t，并且
其中药物仅与聚合物2B偶联。
2.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中将所述药物与间隔子L4偶联的可逆的前药接头L2具有式XIIa：
其中：
虚线表示通过形成酰胺键与所述药物的氮的附接；
-X-是-C(R4R4a)-；-N(R4)-；-O-；-C(R4R4a)-C(R5R5a)-；-C(R5R5a)-C(R4R4a)-；
-C(R4R4a)-N(R6)-；-N(R6)-C(R4R4a)-；-C(R4R4a)-O-；-O-C(R4R4a)-；或
-C(R7R7a)-；
X1是C；或S(O)；
-X2-是-C(R8R8a)-；或-C(R8R8a)-C(R9R9a)-；
＝X3是＝O；＝S；或＝N-CN；
-R1、-R1a、-R2、-R2a、-R4、-R4a、-R5、-R5a、-R6、-R8、-R8a、-R9、-R9a独立地选自-H；和C1-6烷基；
-R3、-R3a独立地选自-H；和C1-6烷基，条件是如果-R3、-R3a中的一个或二者不是-H，则它们通过sp3杂化碳原子和与它们附接的N连接；
-R7是-N(R10R10a)；或-NR10-(C＝O)-R11；
-R7a、-R10、-R10a、-R11各自独立地是-H；或C1-10烷基；
任选地，-R1a/-R4a、-R1a/-R5a、-R1a/-R7a、-R4a/-R5a、-R8a/-R9a中的一对或多对形成化学键；
任选地，-R1/-R1a、-R2/-R2a、-R4/-R4a、-R5/-R5a、-R8/-R8a、
-R9/-R9a中的一对或多对和与它们附接的原子连接在一起以形成C3-10环烷基；或3元至10元杂环基；
任选地，-R1/-R4、-R1/-R5、-R1/-R6、-R1/-R7a、-R4/-R5、-R4/-R6、-R8/-R9、-R2/-R3中的一对或多对和与它们附接的原子连接在一起以形成环A；
任选地，-R3/-R3a和与它们附接的氮原子连接在一起以形成3元至10元杂环；
环A选自苯基；萘基；茚基；茚满基；四氢化萘基；C3-10环烷基；3元至10元杂环基；和8元至11元杂双环基；并且
其中式XIIa的基团经-L4取代，条件是式XIIa中用星号标记的氢不被-L4或其他取代基替代；
其中L4是任选生物可降解的间隔子。
3.根据权利要求2所述的水凝胶缀合物，其中：
＝X3是＝O；
-R1和-R1a是氢；
-R3是甲基并且R3a是氢；并且
X是-C(R7R7a)-；其中R7是NR10-(C＝O)-R11。
4.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中所述可逆的前药接头L2与间隔子L4一起具有式VIIc：
其中：
最右边的波浪线代表与药物的氮原子的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸2B的单元Z2的附接点。
5.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中：
连接透明质酸聚合物2A与透明质酸聚合物2B的所述间隔子L4'具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z3的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z4的附接点；
其中：
L1是间隔子；并且
L3是生物可降解的间隔子；
连接所述可逆的前药接头L2与透明质酸聚合物2B的所述间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与L2的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z2的附接点；
其中：
L1是间隔子。
6.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中：
所述单元Z4是并且
所述单元Z2是
其中：
L1是间隔子；
L3是生物可降解的间隔子；并且
药物、Ra2、L2是如权利要求1中所述。
7.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中连接透明质酸聚合物2A与透明质酸聚合物2B的所述间隔子L4'具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z4的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2A上的单元Z3的附接点；
并且连接可逆的前药接头L2与透明质酸聚合物2A的所述间隔子L4具有式：
其中：
最右边的波浪线代表与L2的附接点；并且
最左边的波浪线代表与透明质酸聚合物2B上的单元Z2的附接点；
其中：
LA是间隔子；
LB是间隔子；并且
LC是生物可降解的间隔子。
8.根据权利要求7所述的水凝胶缀合物，其中LA是任选经取代的和/或任选经打断的C1-10亚烷基。
9.根据权利要求7所述的水凝胶缀合物，其中LA是直链C2-4亚烷基。
10.根据权利要求7所述的水凝胶缀合物，其中LB是直链-C(O)-C1-5亚烷基。
11.根据权利要求7所述的水凝胶缀合物，其中LC是：
其中m是从0至10，n是从1至4，并且o是从1至4。
12.根据权利要求7所述的水凝胶缀合物，其中LC是：
13.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中所述抗体片段是Fab抗体片段。
14.根据权利要求13所述的水凝胶缀合物，其中所述Fab抗体片段是兰尼单抗。
15.根据权利要求1所述的水凝胶缀合物，其中所述眼部有效半衰期是玻璃体有效半衰期。
16.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的水凝胶缀合物和药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
17.根据权利要求16所述的组合物在制备用于治疗眼部适应症的药物中的用途。
18.根据权利要求17所述的用途，其中所述给予是眼内的。
19.根据权利要求17所述的用途，其中将所述组合物注入所述受试者的玻璃体内。
20.根据权利要求17所述的用途，其中所述组合物是使用规格为20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31或32的针注射的。
21.根据权利要求17所述的用途，其中所述眼部适应症选自下组：黄斑变性、黄斑水肿、视网膜病变、希佩尔-林道病、新生血管性眼病、黄斑毛细血管扩张和血管炎。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述眼部适应症选自视网膜变性和眼内新生血管形成。
23.根据权利要求21所述的用途，其中所述眼部适应症选自下组：年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病黄斑水肿(DME)、囊样黄斑水肿(CME)、糖尿病视网膜病变(DR)、其他与局部缺血相关的视网膜病变、早产儿视网膜病变(ROP)、家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)、冠茨病、视网膜静脉阻塞(RVO)、CNV、视网膜色素变性(RP)、高血压视网膜病变、视网膜血管瘤增生、角膜新血管形成、视网膜新血管形成、新生血管性青光眼、虹膜新血管形成。
24.根据权利要求21所述的用途，其中所述眼部适应症选自与角膜新血管形成相关的疾病和与视网膜/脉络膜新血管形成相关的疾病。
25.根据权利要求23所述的用途，其中所述眼部适应症是AMD、DME、DR或RVO。
26.根据权利要求25所述的用途，其中所述眼部适应症是AMD。
27.根据权利要求26所述的用途，其中所述AMD是湿性AMD。
28.一种用于产生根据权利要求1所述的交联HA药物水凝胶缀合物的方法，所述方法包括：
(a)提供上面具有至少三个第一反应基团的第一透明质酸或其衍生物；
(b)提供上面具有至少两个第二反应基团的第二透明质酸或其衍生物，其中所述第一和第二反应基团能够互相反应以形成共价键；
(c)将至少一种药物与所述第一反应基团之一偶联；以及
(d)通过第一反应基团和第二反应基团的反应交联所述第一和第二透明质酸，以形成交联剂并且形成所述交联HA药物水凝胶缀合物；
其中所述药物仅与所述第一透明质酸偶联。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述药物通过可逆的前药接头与所述第一透明质酸偶联。
30.根据权利要求29所述的方法，其中在与所述第一透明质酸偶联之前，将所述药物与所述可逆的前药接头偶联并且纯化，以形成纯化的药物-可逆的前药接头缀合物，其中将所述药物-可逆的前药接头缀合物通过以下方式纯化：
(a)用纯化标签标记所述药物-可逆的前药接头缀合物，以形成标记的药物-可逆的前药接头缀合物混合物；
(b)通过色谱分离从所述混合物中纯化标记的药物-可逆的前药接头单缀合物；以及
(c)从所述标记的药物-可逆的前药接头单缀合物中除去所述纯化标签，以形成所述纯化的药物-可逆的前药接头缀合物。
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