KR102049568B1 - 히알루론산을 포함하는 핵산전달용 조성물 - Google Patents

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Abstract

히알루론산, 황을 포함하는 가교제, 및 양이온성 및 양친성 고분자를 포함하는 히알루론산 접합체, 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체, 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체가 서로 가교된 자가조립체(self-assembly), 및 상기 히알루론산-핵산 복합체를 포함하는 핵산 전달용 조성물이 제공된다.

Description

히알루론산을 포함하는 핵산전달용 조성물{Composition for nucleic acid delivery containing hyaluronic acid}
히알루론산, 황을 포함하는 가교제, 및 양이온성 및 양친성 고분자를 포함하는 히알루론산 접합체, 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체, 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체가 서로 가교된 자가조립체(self-assembly), 및 상기 히알루론산-핵산 복합체를 포함하는 핵산 전달용 조성물이 제공된다.
전 세계적으로 siRNA에 기반을 둔 치료제의 개발이 활발하게 진행되고 있으며, 특히 알츠하이머, 당뇨병, 비만, 류마티스 관절염, 파킨스병, B형 간염, C형 간염, 에이즈, 암과 같은 난치성 질병을 치료하기 위한 siRNA 치료제가 집중적으로 개발되고 있다.
siRNA 치료제는 특정 유전자의 발현 메커니즘을 조절하기 위해 mRNA를 특이적으로 분해하여 표적 유전자의 전사와 단백질 합성을 중단시켜 질병을 치료한다. 그러나 siRNA는 생체 내에 혈장에 대량으로 존재하는 다양한 분해 효소에 의하여 단시간 내 용이하게 분해되기 때문에, 정맥투여 시 생화학적으로 보호되지 않으면 효능을 발휘하기 전에 대부분 분해되는 단점이 있다. 또한, 생체 내에서 siRNA를 항원 또는 외부 물질로 인식하여 활성화되는 면역체계에 의한 부작용이 발생할 수 있으며, siRNA가 원래 계획한 유전자 부위가 아닌 다른 부위의 유전자에 영향을 주어 유전자 염기서열에 교차혼성화(cross-hybridization)를 일으킬 수 있는 단점이 있다. 따라서, 최근에 치료에 사용되는 siRNA 기반 치료제의 안정성과 부작용을 최소화 하기 위해 새로운 siRNA 제형 개발이 활발히 이루어지고 있다. 특히, siRNA의 생체 내 안정성을 향상시키고 siRNA약물의 부작용을 최소화 할 수 있는 나노입자, 마이셀, 리포좀, 고분자복합체 등의 다양한 약물전달체가 개발되고 있다.
현재까지 주로 개발된 비바이러스성 siRNA 약물전달 시스템은 다음과 같다.
첫 번째는 양성 전위를 띄는 리포좀 표면에 siRNA를 결합시켜, siRNA의 안정성을 증가시키는 시스템이다. 이는 siRNA 단독 투여 시 다량의 siRNA가 짧은 시간에 파괴됨으로써 일어나는 부작용을 억제하기 위한 시도로서, 리포좀을 이용해 siRNA의 안정성을 높이는 것이 주요 목표이다.
두 번째는 양전하를 띠는 양친성 고분자에 정전기적 상호작용을 통해siRNA를 결합시켜 전기적으로 중성인 나노입자를 만드는 방법이다. 이는 나노크기의 입자에 의한 표적지향성 개선이 가능하여 siRNA가 표적 부위에 효과적으로 전달되어, 면역체계와 정상 조직에서의 부작용을 최소화 할 수 있는 장점이 있다. siRNA 치료가 적용되는 대표적인 질환인 암은 세포의 빠른 분열에 의해 정상 조직에 비하여 많은 영양분 및 산소를 필요로 한다. 이러한 산소와 영양분을 공급받기 위해 암 조직 주변으로 새로운 혈관이 빠르게 형성되며, 이에 따라 혈관 벽의 구조가 불규칙적이며 엉성한 특징을 가지고 있다. 또한 암 조직에서의 림프관을 통한 배출은 정상 조직에 비하여 현저하게 낮아서 고분자의 경우 다른 조직이나 기관보다 암 조직에 좀 더 머물러 있게 되는데, 이러한 암의 특징적인 현상을 EPR(enhanced permeability and retention) 효과라 한다. 최근에는 이와 같은 EPR효과를 통해 siRNA을 효율적으로 전달하고자 양친성 미립구-siRNA 결합체가 개발된 바 있다.
그러나, 보다 획기적인 핵산 안전성 및 핵산 전달 효율이 달성될 수 있는 전달체의 개발이 요구되고 있다.
본 발명의 일 예는 히알루론산, 황을 포함하는 가교제, 및 양이온성 및 양친성 고분자를 포함하는 히알루론산 접합체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체가 서로 가교된 자가조립체(self-assembly)를 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-핵산 복합체 또는 자가조립체를 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
최근 이황결합(S-S)을 이용한 유전자 전달체 또는 약물전달체의 개발이 보고되고 있다. 이황결합은 생체내 환원반응이 가능한 특성을 가지고 있으며 더 상세하게는 세포내 존재하는 글루타치온 (glutathione, ~10mM)에 의해 쉽게 환원되어 티올 (thiol)을 형성하는 특성이 있다.　
본 발명자들은 히알루론산을 PDMAEMA (Poly(Dimethylaminoethyl methacrylate) 등의 양전하를 갖는 양친성 고분자와 PDA (pyridyldithioethylamine) 등의 이황결합을 갖는 화합물로 개질하여, siRNA 등의 핵산이 결합되어 보다 안정적이고 효율적으로 표적 세포에 전달될 수 있도록 하는 핵산 전달체를 제조하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일례는 히알루론산, 이황결합을 포함하는 가교제, 및 양이온성 및 양친성 고분자를 포함하는 히알루론산 접합체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체가 서로 가교된 자가조립체를 제공한다.
또 다른 예는 상기 히알루론산-핵산 복합체 또는 자가조립체를 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상기 히알루론산(Hyaluronic acid, HA)은 음이온성 뮤코다당류로서, 동물 유래의 유리체, 관절액, 연골, 피부 등에 존재하는 생체 유래 물질이다. 사용 가능한 히알루론산의 분자량에는 제한이 없으나, 중량평균분자량 범위가 약 1,000 내지 1,000,000 Da인 것일 수 있다.
상기 이황결합을 포함하는 가교제는 황을 포함하여 화합물 내에 이황결합(S-S)이 형성된 모든 화합물일 수 있다. 예컨대, 상기 이황결합을 포함하는 가교제는 피리딜다이사이오에틸아민 (pyridyldithioethylamine, PDA), 피리딜다이설파이드 메타크릴레이트(pyridyl disulfide methacrylate, PDSMA), 숙신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridylthio)propionate; SPDP), 숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)엑사노에이트(Succinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate; LC-SPDP), 설포숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate; Sulfo-LC-SPDP), 3,3'-디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트 (3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate); DTSSP) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 가교제 내의 이황결합에 의하여 환원 조건(예컨대 환원제 처리 등)에서 히알루론산 접합체 또는 히알루론산-핵산 복합체 간 가교결합이 형성되어 자가조립체를 형성하여 나노젤 형태의 제형을 얻을 수 있다.
상기 가교제는 통상적인 방법 (예컨대, 촉매 사용)으로 히알루론산과 화학적으로 결합할 수 있다. 예컨대, 상기 가교제가 피리딜다이사이오에틸아민 인 경우, pH 6 내지 7 하에서 통상적으로 사용되는 촉매에 의하여, 상기 피리딜다이사이오에틸아민의 아민기와 히알루론산의 카르복시기 간 결합이 형성될 수 있다.
상기 가교제의 함량에 따라서 히알루론산 접합체의 가교결합 형성 및 가교결합 후 나노젤의 크기가 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 가교제의 함량은 히알루론산에 포함된 카르복시기 100 개 중 1 내지 30개가 가교제로 치환될 수 있도록 하는 양, 즉 가교제 치환률이 히알루론산 내의 카르복시기 100개 기준으로 1 내지 30%가 되도록 하는 양일 수 있다.
상기 양이온성 및 양친성 고분자는 소수성 부분이 양이온을 띰으로써 핵산과의 결합을 용이하게 하는 한편, 양친성을 띰으로써 수계에서 핵산과 정전기적 인력에 의한 자기 접합체 (self-assembly 또는 self-aggregate)의 형성을 용이하게 하는 역할을 한다 (예컨대 P(DMAEMA) 등).
상기 양이온성 및 양친성 고분자는 양전하 및 양친성을 갖는 중량평균분자량이 1x102 Da 내지 1x105 Da인 모든 고분자일 수 있다. 예컨대, 상기 양이온성 및 양친성 고분자는 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)[Poly(Dimethylaminoethyl methacrylate), P(DMAEMA)], 키토산(chitosan), 글라이콜키토산 (glycol chitosan), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리에틸렌이민(Polyethylene imine, PEI), 폴리아미드아민 덴드리머 (polyamidoamine dendrimer) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 양이온성 및 양친성 고분자는 중량평균분자량이 1x102 Da 내지 1x105 Da 범위의 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)일 수 있다.
상기 양이온성 및 양친성 고분자는 통상적인 방법 (예컨대, 촉매 사용)으로 히알루론산과 화학적으로 결합할 수 있다. 예컨대, 상기 양이온성 및 양친성 고분자가 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)인 경우, pH 6 내지 7 하에서 통상적으로 사용되는 촉매에 의하여, 상기 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)의 아민기와 히알루론산의 카르복시기 간 결합이 형성될 수 있다.
상기 양이온성 및 친수성 고분자 함량에 따라서 히알루론산 접합체의 양전하 크기가 조절될 수 있다. 예컨대, 상기 양이온성 및 친수성 고분자의 함량은 히알루론산에 포함된 카르복시기 100 개 중 1 내지 30개가 양이온성 및 친수성 고분자로 치환되도록 하는 양, 즉 양이온성 및 친수성 고분자 치환률이 히알루론산 내의 카르복시기 100개 기준으로 1 내지 30%가 되도록 하는 양일 수 있다.
일 구체예에서, 상기 히알루론산 접합체는 다음의 화학식 1의 구조를 갖는 것일 수 있다:
[화학식 1]
Figure 112013028251433-pat00001
(상기 식 중 l, m, 및 n은 히알루론산 단위체 (하나의 카르복시기 포함)의 반복 수로서, 이 중에서 n은 가교제가 결합된 단위체의 반복 수로서 l+m+n의 1 내지 30%일 수 있고, m은 양이온성 및 양친성 고분자가 결합된 단위체의 반복 수로서 l+m+n의 1 내지 30%일 수 있으며, n과 m과 l의 단위체의 위치는 서로 바뀌어도 무방하며, l+m+n은 2 내지 20,000의 정수, 구체적으로 2 내지 10,000의 정수, 보다 구체적으로 2 내지 5,000의 정수, 예컨대 2,000 내지 2,500의 정수 (분자량: 약 1,000 Da 내지 약 10,000,000 Da, 구체적으로 약 1,000 Da 내지 약 5,000,000 Da, 보다 구체적으로 약 1,000 Da 내지 약 2,500,000 Da, 예컨대, 약 800,000 Da 내지 약 1,200,000 Da)일 수 있다.)
예컨대, 상기 히알루론산 접합체가 이황결합을 포함하는 가교제로서 피리딜디티오에틸아민을, 상기 양이온성 및 양친성 고분자로서 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)를 포함하는 경우, 다음의 화학식 2(도면 2 참조)의 구조를 가질 수 있다:
[화학식 2]
Figure 112013028251433-pat00002
(상기 식 중 l, m, 및 n의 범위는 상기한 바와 같다)
상기 히알루론산 접합체는 포함된 양이온성 및 양친성 고분자에 정전기적으로 결합된 핵산을 추가로 포함하여 히알루론산-핵산 복합체를 형성할 수 있다.
상기 핵산은 디옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA), 또는 백본(backbone), 당 또는 염기가 화학적으로 변형되거나 말단이 수식된 폴리뉴클레오타이드 유도체 등의 모든 종류의 단일가닥 또는 이중가닥 형태의 핵산일 수 있으며, 구체적으로는 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 디엔에이자임(DNAzyme) 등으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 예컨대 상기 핵산은 유전자 치료에 주로 사용되는 siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA) 등일 수 있으며, 구체적으로 siRNA일 수 있다.
상기 히알루론산-핵산 복합체에 포함된 핵산의 양은 양이온성 및 양친성 고분자의 양에 의하여 조절 가능하며, 상기 복합체에 포함된 히알루론산 접합체와 핵산 함량비는 중량기준으로 99:1 내지 5:95 (히알루론산 접합체 중량:핵산 중량), 구체적으로 2:1 내지 30:1, 보다 구체적으로 5:1 내지 25:1일 수 있다.
상기 히알루론산 접합체 또는 히알루론산-핵산 복합체는 가교제에 의하여 다수의 접합체 간 또는 복합체 간 가교 결합이 일어나 핵산이 결합되거나 결합되지 않은 소수성 부분이 내부를 형성하고, 친수성 부분이 외부를 형성하는 자가조립체 형태를 형성할 수 있다 (예컨대, 도 10 참조). 이와 같이 형성된 히알루론산 접합체 또는 히알루론산-핵산 복합체의 자가조립체의 평균 지름은 1nm 내지 2,000nm, 예컨대 10nm 내지 800nm 정도일 수 있다.
상기 가교 결합은 환원제 처리에 의하여 생성될 수 있다. 상기 환원제는 이 때 사용 가능한 환원제는 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), 글루타치온 (Glutathione), 2-티아졸린-2-티올 (2-Thiazoline-2-thiol), 2-프로펜-1-티올 (2-propen-1-tiol) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
이와 같이 히알루론산 접합체간 또는 히알루론산-핵산 복합체간 가교결합이 형성됨으로써, 히알루론산 접합체 또는 히알루론산-핵산 복합체의 표적화 정도 및 표적에의 축적성이 증진될 수 있다 (도 11 및 도 12 참조).
다른 예는 상기 히알루론산 접합체와 핵산이 결합된 히알루론산-핵산 복합체가 서로 가교된 자가조립체를 제공한다.
상기 핵산이 유전자 치료용 핵산인 경우, 상기 핵산은 폐질환 (예컨대, RSV, Flu, SARS, Influenza 등), 안질환 (예컨대, AMD 등), 신경계통 질환 (예컨대, Depression, Alzheimer, Huntington disease, Spincoerebral ataxia, ALS, Neuropathic pain, Encephalitis 등), 암 (예컨대, Glioblastoma, Human paillomavirus, Prostate, Adenocarcinoma 등), 소화계통 질환 (예컨대, Irritable bowel disease 등), 간질환 (예컨대, HBV, Hypercholesterolemia 등), 자가면역질환(예컨대, Rheumatoid arthritis 등), 관절 질환 (예컨대, Rheumatoid arthritis 등), 생식계통 질환 (예컨대, HSV) 등의 질병 치료에 사용 가능한 핵산, 예컨대 siRNA일 수 있다.
따라서, 상기 히알루론산-핵산 복합체는 상술한 질병의 예방 및/또는 치료 용도로 사용 가능하다.
본 발명에 따른 히알루론산-핵산 복합체는 양전하와 음전하의 균형을 통해 복합체를 형성한 뒤 이황결합에 의한 복합체간 가교결합을 통하여 나노크기의 자가조립체 (self-assemblｙ 또는 self-aggregate)를 형성 하며 특정 질병에 선택적으로 축적되는 것을 특징으로 한다. 상기 히알루론산-핵산 복합체에 함유된 히알루론산은 암 세포 표면에 과발현되는 CD44 수용체에 특이적으로 결합 할 수 있어 효과적인 질병 표적화가 가능하다.
본 발명의 또 다른 예는 상기 히알루론산 접합체 및 히알루론산-핵산 복합체의 제조 방법을 제공한다.
상기 히알루론산 접합체의 제조 방법은
(1) 히알루론산과 이황결합을 포함하는 양이온성 및 양친성 고분자를 반응시키는 단계; 및
(2) 상기 양이온성 및 양친성 고분자가 결합된 히알루론산에 가교제를 반응시키는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (1)과 (2)는 서로 순서가 바뀌어도 무방하다.
상기 히알루론산-핵산 복합체의 제조 방법은
(1') 히알루론산과 이황결합을 포함하는 양이온성 및 양친성 고분자를 반응시키는 단계;
(2') 상기 양이온성 및 양친성 고분자가 결합된 히알루론산에 가교제를 반응시키는 단계; 및
(3) 상기 얻어진 반응물에 핵산을 반응시키는 단계
를 포함할 수 있다.
상기 단계 (1')과 (2')는 서로 순서가 바뀌어도 무방하며, 상기 단계 (3)은 단계 (1')과 (2') 이후에 수행할 수 있다.
상기 히알루론산-핵산 복합체의 제조 방법은 상기 단계 (3) 이후에 환원제를 처리하는 단계 (4)를 추가로 포함할 수 있다. 이와 같이 환원제가 처리되면 이황결합에 의하여 히알루론산-핵산 복합체 간 가교결합이 형성될 수 있다. 이 때 사용 가능한 환원제는 디티오트레이톨(Dithiothreitol, DTT), 글루타치온 (Glutathione), 2-티아졸린-2-티올 (2-Thiazoline-2-thiol), 2-프로펜-1-티올 (2-propen-1-tiol) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 방법에서 각 성분에 대한 설명은 앞서 기재한 바와 같다.
본 발명에서 제안하는 히알루론산 접합체 및 히알루론산-핵산 복합체는 이황결합에 의하여 생체내 안정성이 현저하게 증가되었을 뿐 아니라, 히알루론산에 의한 질병세포 표적능력에 의해 다양한 질병부위에 핵산을 효과적으로 전달하는 한편 정상 세포에는 아무런 독성도 보이지 않으며 (도 4 참조), 핵산 전달 효율이 우수하여 (도 6 및 7 참조), 핵산을 이용한 유전자 치료 효과를 극대화(도 8 참조)하여 질병의 치료 효능을 높이며 부작용을 최소화 할 수 있다. 따라서, 이들이 다양한 질병 모델에 적용하여 각각의 질병에 대한 치료효능을 보여 줌으로써, 향후 광범위하게 다양한 질병 치료를 위한 치료제로 사용될 수 있도록 한다.
본 발명의 siRNA를 함유하는 HA-PDA-P(DMAMEA) siRNA 복합체 형태의 신제형 siRNA 전달체는 기존의 양친성 siRNA 전달체가 갖는 비특이적 세포독성을 감소시키고 나노크기의 복합체를 형성 함으로써 EPR 효과 및 HA가 갖는 수용체와의 특이적 결합능력에 의하여 질병 (예 암)조직에 대한 선택성이 높아 더 많은 siRNA가 암 조직에 축적되어, 획기적인 치료 작용을 발휘할 수 있는 장점이 있으며, 이황결합을 이용하여 가교를 시킴으로써 생체내 안정성이 증가하며 표적세포에 대한 선택성을 충분히 나타내면서 정상세포에의 독성을 현저히 줄이고, 장기간 약물이 지속적으로 방출되도록 하는 신제형의 siRNA 전달체로서 암과 같은 난치성 질환을 치료하는 새로운 siRNA 치료제의 연구에 사용될 수 있다.
도 1은 동물 모델에서 일 실시예에 따른 siRNA/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체가 체내 정맥투여 후 질병부위에 특이적으로 축적되고, siRNA에 의한 유전자 치료(gene therapy)가 일어나는 과정을 보여주는 모식도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 구조를 보여준다.
도 3은 P(DMAEMA) (상단) 및 이 실시예에 따른 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체 (하단)를 1H-NMR로 관찰한 구조 특성 스펙트럼을 보여준다.
도 4는 일 실시예에 따른 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 처리 농도에 따른 B16F10 (흑색종 종양세포) 및 NIH3T3 (섬유아세포)의 생존률을 보여주는 그래프로서, HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 세포독성 정도를 보여준다 (검은색 (좌측): B16F10 세포; 붉은색 (우측): NIH3T3 세포).
도 5는 siRFP의 무게비율에 따른 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체 형성거동 및 DTT처리 후 가교결합 형성거동을 전기영동법으로 관찰한 결과를 보여준다.
도 6은 일 실시예에 따른 FITC 형광체로 표지된 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체의 B16F10 세포 내 침투 거동을 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여준다(scale bar: 25um).
도 7은 일 실시예에 따른 FITC 형광체로 표지된 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체의 NIH3T3 세포내 침투 거동을 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여준다 (scale bar: 25um).
도 8은 일 실시예에 따른 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체 처리 후 RFP 유전자 신호화(gene silencing)에 의한 세포내 RFP 형광량의 변화를 형광현미경으로 관찰한 결과를 보여준다.
도 9는 일 실시예에 따른 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체와 free siRNA에 헤파린을 처리한 후 아크릴아마이드 젤을 통하여 얻은 밴드를 보여주는 것으로, 상기 복합체 내의 siRNA(siRFP)의 안정성을 free siRNA와 비교한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 히알루론산-핵산 복합체의 자가조립 과정을 예시적으로 보여주는 모식도이다.
도 11은 일 실시예에 따른 형광표지된 siRFP-HPD 및 c-siRFP-HPD의 종양 동물 모델 내에서의 근적외선 형광 이미지로서, siRFP-HPD 및 c-siRFP-HPD의 종양 동물 모델 내에서의 분포를 보여준다.
도 12는 도 11의 형광 이미지의 형광량을 정량하여 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 폴리 ( 디메틸아미노에틸 메타크릴레이트 ) [Poly(Dimethylaminoethyl methacrylate ); P( DMAEMA )]의 제조
DMAEMA 3.22 ml, AESH-HCl(2-Aminoethanethiol hydrochloride) 72.28 mg 및 AIBN (Azobisisobutyronitrile) 31.4 mg을 10 ml의 메탄올에 녹인 뒤, 3번의 freeze-thaw 과정을 반복하여 반응기 내부의 산소를 제거해 주고, 70℃에서 6시간동안 교반하여 반응시켰다. 반응이 종료된 후, MWCO (Molecular Weight Cut Off) 1000 Da의 반투과성 막을 사용한 투석법을 이용하여 물/메탄올 (1:1 부피비)에서 촉매 및 미반응물질을 제거하고 동결건조하여 흰색 분말의 P(DMAEMA)을 얻었다. 상기 얻어진 P(DMAEMA)의 NMR 스펙트럼을 도 3 (상단)에 표시하였다. 도 3의 NMR 스펙트럼을 기반으로 2.2 - 2.4 ppm, 2.5 ppm, 3.6 ppm, 4 ppm의 특성 피크를 이용하여 생성된 고분자의 구조를 확인하였고, 특성 피크의 면적비를 이용하여 분자량이 8000 Da임을 확인하였다. 반응 생성물의 수율은 85% 이상 이었다.
상기 반응을 아래의 [반응식 1]에 나타내었다.
[반응식 1]
Figure 112013028251433-pat00003
　
실시예 2: 히알루론산( HA )- 피리딜디티오에틸아민 ( PDA ) 접합체 제조
히알루론산(HA)에 이황결합이 가능한 관능기를 도입하기 위하여, 피리딜디티오에틸아민(pyridyldithioethylamine; PDA)을 EDC[1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide]와 HOBt(Hydroxybenzotriazole) 촉매하에서 반응시켰다.
구체적으로, 분자량 67 KDa의 HA 100 mg와 EDC 60.58 mg를 25 ml의 3차 증류수에 녹여 HA 용액을 제조하였다. PDA-HCl 17.54 mg과 HOBt 42.7 mg를 25 ml의 메탄올에 녹인 후, 상기 준비된 HA 용액에 천천히 적가하여 반응 혼합 용액을 준비하였다. 상기 반응 혼합용액의 pH를 6.6 내지 6.8로 조절하고 상온에서 24시간동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후, MWCO 12 내지 14 KDa의 반투과성 막을 사용한 투석법을 이용하여 물/에탄올 (1:1 부피비)에서 미반응물질 및 촉매를 제거하였다. 정제가 완료된 HA-PDA 접합체 용액을 동결건조하여 흰색의 분말형 HA-PDA 접합체를 얻었다. 상기 HA-PDA 접합체의 수율은 87% 이상이며, PDA는 UV-Vis 스펙트럼을 이용하여 DTT 처리 후 PDA에서 분리되는 pyridine-2-thion (UV-Vis 흡수 파장 343nm)의 양을 측정하여 분석한 결과, HA 단위유닛 100 개당 6.7개 의 PDA가 결합된 것으로 분석되었다 (치환률: 6.7%). 상기 결과로부터 얻어진 HA-PDA 접합체의 평균분자량은 68.9 KDa이다.
상기 반응을 아래의 [반응식 2]에 나타내었다.
　[반응식 2]
Figure 112013028251433-pat00004
　
실시예 3: HA - PDA 에 P( DMAEMA )가 접합된 접합체 제조
HA-PDA 접합체에 양전하를 갖는 관능기를 도입하기 위하여, EDC와HOBt 촉매하에서 P(DMAEMA)를 반응시켰다.
구체적으로, 상기 실시예 2에서 제조된　HA-PDA 접합체 100 mg과 EDC20.16 mg을 25 ml의 3차 증류수에 녹여서 HA-PDA 용액을 제조하였다. 상기 실시예 1에서 제조된 P(DMAEMA) 213.54 mg HOBt 14.25 mg를 25 ml의 메탄올에 녹인 뒤, 상기 제조된 HA-PDA 용액에 천천히 적가하여 반응 혼합 용액을 준비하였다. 상기 반응 혼합 용액의 pH를 6.6 내지 6.8로 조절하고 상온에서 24시간동안 교반하면서 반응시켰다. 반응이 종료된 후, MWCO 12 내지 14 KDa의 반투과성 막을 사용한 투석법을 이용하여 물/에탄올 (1:1 부피비)에서 미반응물질 및 촉매를 제거하였다. 정제가 완료된 HA-PDA-P(DMAEMA) 용액을 동결건조하여 흰색의 분말형 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체를 얻었다. 상기 HA-PDA-P(DMAEMA)의 수율은 90% 이상이며, PDA의 치환률은 HA단위유닛 100 개당 6.7개 (6.7%), P(DMAEMA)의 치환률은 HA단위유닛 100 개당 2개 (2.0%)인 것으로 확인되었다. 상기 접합체의 분자량은 97.4 kDa으로 확인되었다.
상기 반응식을 [반응식 3]에 나타내었다.
　[반응식 3]
Figure 112013028251433-pat00005
　
실시예 4: HA - PDA -P( DMAEMA ) 접합체의 화학적 특성 분석
상기 실시예 1에서 제조된 P(DMAEMA)의 분자량과, 상기 실시예 1에서 제조된 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체에서의 PDA와 P(DMAEMA)의 치환도 (degree of substitution, DS)를 분석하기 위하여, 각각의 물질을 5mg/ml의 농도로 CD3OD/D2O (1:1 부피비)에 녹인 뒤, 500MHz 1H-NMR을 이용하여 P(DMAEMA) (도 3 상단)와 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체(도 3 하단)의 구조적 특성을 분석하였다. 상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3 하단에서 확인되는 바와 같이, HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 PDA의 치환도는 6.7%, P(DMAEMA) 치환도는 4.5%이다.
　
실시예 5: HA - PDA -P( DMAEMA ) 접합체 세포독성 평가
상기 실시예 3에서 제조된 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 세포독성을 흑색종 세포인B16F10와 섬유아세포인 NIH3T3에서 각각 평가하였다.
구체적으로, B16F10 세포(American Type Culture Collection (ATCC), USA)와 NIH3T3 세포(American Type Culture Collection (ATCC), USA)를 각각 96well plate에 5x103　cell의 밀도로 접종한 후, RPMI1640 배지 (FBS 10%(v/v), AA 1%(v/v) 포함; Welgene, Korea)를 사용하여 37℃에서 24시간 동안 배양하여 안정화시켰다. 그리고 난 후, 상기 준비된 세포에 상기 실시예 3에서 제조된 HA-PDA-P(DMAEMA)를 10, 100 ug/ml의 농도로 처리하고, Opti-MEM 배지 (Gibco, USA)를 이용하여 12시간 동안 37℃ 및 5% 이산화탄소가 유지되는 인큐베이터에서 배양하였다. 12시간 동안 배양 후, RPMI1640 배지의 10부피%에 해당하는 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 용액 (5mg/ml, DPBS에 용해)을 섞어서 상기 세포에 처리하고 37℃에서 1시간 동안 더 배양하였다. DMSO(dimethyl sulfoxide)로 생성된 formazan 결정을 용해시키고, microplate reader를 이용하여 570nm의 흡광도를 측정하여, 세포 생존률을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체는 정상세포인 NIH3T3 세포에는 거의 독성을 보이지 않는 반면, 암 세포인 B16F10 세포에 대해서는 높은 세포독성을 나타내는 것으로 확인되었다. 이는 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체가 암세포에 존재하는 CD44 수용체에 의한 높은 세포 침투 효과를 가짐에서 기인한다고 여겨진다.
　
실시예 6: siRNA / HA - PDA -P( DMAEMA ) 복합체 형성 거동 평가
상기 실시예 3에서 제조된 HA-PDA-P(DMAEMA)의 siRNA와의 복합체 형성 거동을 평가하기 위하여, 8%(w/v) 아크릴아마이드 젤을 이용한 전기영동을 실시하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3에서 제조된 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체 5mg 를 DEPC(diethyl pyrocarbonate)가 처리된 PBS (pH 5.0, 150mM NaCl) 1ml에 녹여 보관용액을 제조한다. siRNA로서, 5'-UGU AGA UGG ACU UGA ACU CdTdT-3'(서열번호 1-dTdT)의 서열을 갖는 센스가닥과 5'-GAG UUC AAG UCC AUC UAC AdTdT-3'(서열번호 2-dTdT)의 서열을 갖는 안티센스 가닥의 siRFP를 사용하였으며, 상기 siRFP 1mg/ml를 DEPC가 처리된 PBS (pH7.4, 150mM NaCl) 1ml에 녹여서 보관용액을 제조하였다. 이하 실시예에 기재된 siRNA는 상기 siRFP를 의미한다.
HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 양에 따른 복합체 형성 거동을 평가하기 위하여, 1ug(microgram), 5ug, 10ug 및 20ug의 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체를 각각 siRFP 1ug와 혼합 한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 복합체를 형성시켰다. 복합체가 충분히 형성된 후, 15uM DTT 1ul(microliter)를 처리한 후, 37℃에서 20분간 충분히 섞어주어 가교결합이 충분히 생성되도록 하였다.
복합체 형성을 확인하기 위하여, 8%(w/v) 아크릴아마이드 젤을 이용하여 상기 얻어진 반응 산물을 전기영동하여, 복합체와 siRFP의 밴드를 확인하였다. 상기 얻어진 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인되는 바와 같이, HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체와 siRNA 의 중량비를 1:1에서 20:1까지 다양하게 조절하여 복합체를 생성하였을 때, 환원제(DTT)를 처리하지 않은 경우 5:1의 비율부터는(5:1, 10:1, 20:1) 복합체가 형성되어 Free siRNA보다 더 윗쪽에 밴드가 형성되나, 컴팩트한 복합체 형성이 다소 어려워서 밴드가 약간 아래로 끌리는 현상이 나타나는 반면, 환원제를 처리하여 복합체간 가교결합을 실시한 경우 5:1의 비율부터는(5:1, 10:1, 20:1) 아래로 끌리는 현상없이 컴팩트한 복합체 생성이 이루어짐을 알 수 있다. 위 결과로부터, siRNA에 대한 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체의 중량비가 5:1 (HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체:siRNA)이상인 경우에 복합체 형성에 보다 유리한 것을 알 수 있다.
　
실시예 7: siRNA / HA - PDA -P( DMAEMA ) 복합체 형성에 의한 siRNA 안전성 평가
상기 실시예 6에서 제조된 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체(HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체 중량:siRNA(siRFP) 중량 = 20:1)를 사용하는 경우의 50%(v/v)의 쥐 혈장에서의 시간에 따른 siRFP 안전성을 관찰하였다. 시간에 따른 siRFP의 안전성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 6을 참조하여 20ug의 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체를 각각 siRFP 1ug와 혼합 한 후 37℃에서 1시간 동안 반응시켜서 얻어진 복합체에 1M DTT 1ul 및 헤파린 40ug을 처리하여 복합체가 풀어지도록 하고, 8%(v/v) 아크릴아마이드 젤을 이용하여 0, 1, 3, 6, 9, 24시간에서 siRFP 밴드의 유/무를 확인하였다.
상기 얻어진 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 siRNA-HPD는 환원제(DTT) 처리 없이 형성된 (가교되지 않은) HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체와 siRNA(siRFP)와의 복합체, c-siRNA-HPD 는 환원제를 처리하여 이황화결합을 통하여 가교결합시킨 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체와 siRNA(siRFP)와의 복합체를 나타낸다. 도 9에서 확인되는 바와 같이, free siRNA의 경우 시간이 지남에 따라서 siRFP밴드가 소실되는 반면, 복합체를 형성한 경우에는 시간이 지나도 siRFP밴드가 잘 유지됨을 알 수 있으며, 가교결합이 형성된 경우 siRFP밴드가 보다 잘 유지됨을 알 수 있다. 이러한 결과는 상기 복합체 형성에 의하여 siRNA의 안정성이 증진됨을 보여주는 것이다.
　
실시예 8: siRNA / HA - PDA -P( DMAEMA ) 복합체의 세포내 침투 거동 평가
siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체의 세포내 침투 거동을 평가하기 위하여 FITC(Fluorescein isothiocyanate) 형광체로 표지된 siRFP를 사용한 것을 제외하고 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체를 제조하였다(HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체 중량:siRNA(siRFP) 중량 = 20:1). B16F10 세포(ATCC) 및 NIH3T3 세포(ATCC)를 8well chamber slide에 각각 5x103개 밀도로 접종한 뒤 24시간동안 안정화시켰다. 상기 준비된 세포에 상기 제조된 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체를 siRFP 농도가 50nM가 되는 양으로 30분간 처리 하였다. siRNA 전달 효율의 비교를 위하여, 아무 것도 처리하지 않은 세포(control)와 free siRFP만 50nM의 농도로 처리한 세포를 사용하였다.
각각의 세포를 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)로 2번 세척한 뒤, 고정액(DPBS에 부피비로 4 부피% 파라포름알데히드 (Formaldehyde)가 첨가된 용액)을 이용하여 세포를 고정하였다. 고정이 완료된 세포에 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole) 형광체가 포함된 마운팅 용액(DAPI Fluoromount G용액; SouthernBiotech, USA))을 처리하여 세포핵을 염색한 뒤, 형광현미경을 이용하여 세포내 형광을 관찰하였다.
상기 얻어진 결과를 도 6(B16F10 세포) 및 도 7(NIH3T3 세포)에 각각 나타내었다. 도 6 및 7에서 siRNA-HPD는 환원제(DTT) 처리 없이 형성된 (가교되지 않은) HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체와 siRNA(siRFP)와의 복합체, c-siRNA-HPD 는 환원제를 처리하여 이황화결합을 통하여 가교결합시킨 HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체와 siRNA(siRFP)와의 복합체를 나타낸다.
도 6에서 알 수 있는 바와 같이, 암세포에서는 free siRFP 의 경우에는 세포질에서 관찰되는 형광 세기가 미미한데 반하여, siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체의 경우에는 세포질에서 강한 형광 세기가 관찰되었다. 이는 FITC로 표지된 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체가 암세포 세포질 내부에 침투하였음을 보여주는 것이다. 반면, 도 7에서와 같이, 정상세포에서는 free siRFP와 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체의 세포질 침투효과가 거의 관찰 되지 않았다. 상기 도 6 및 7의 결과는 본 발명에 따른 siRFP(siRNA)/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체는 암세포 표면에 과발현되는 CD44 수용체와 복합체에 포함된 HA와의 특이적인 결합에 의하여 빠른 시간내에 siRNA를 세포 내부로 전달 할 수 있고, NIH3T3 세포와 같은 정상세포에 대한 비특이적 세포 침투에 의한 부작용을 감소시킬 수 있음을 보여준다.
　
실시예 9: siRNA / HA - PDA -P( DMAEMA ) 복합체의 세포내 유전자 치료 효능 평가　
siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체의 세포내 유전자 치료 효능을 평가하기 위하여, RFP (red fluorescence protein)를 발현하는 RFP-B16F10 세포에 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체를 처리한 후 형광현미경을 이용하여 siRNA전달 효능을 평가하였다.
구체적으로, 5x103개의 RFP-B16F10 세포를 8well chamber slide에 접종하고 24 시간동안 안정화시켰다. 상기 RFP-B16F10 세포(Red fluorescence protein(RFP)을 발현하는 B10F10 세포)는 다음과 같이 준비하였다 (Clin Cancer Res 2008;14:2841-2849 참조). pDSRed2 (1ug)과 리포펙타민 (1ug, Invitrogen)을 100ul의 Opti-MEM (Gibco, USA)에 녹이고 상온에서 10분간 섞어준 뒤, 37℃도에서 20분간 더 섞어주었다. 만들어진 pDSRed2/리포펙타민 혼합물 100ul(microliter)를 B16F10 세포(ATCC, USA; 1x106개)에 처리한 뒤, 4 시간 동안 37℃ 및 5% 이산화탄소의 조건에서 배양하였다. 4시간의 배양이 끝난 후, 상기 배양물의 배지를 RPMI1640으로 바꿔주고 37℃ 및 5%이산화탄소 조건하에서 2일간 배양을 실시하였다 (transfection efficiency: 30~40%). RFP발현하는 세포를 분리하기 위하여 G418 (1mg/ml, Life Technologies, USA)가 포함된 RPMI1640 배지로 2-15번 계대하였다.
상기 실시예 6에서 제조된 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체(HA-PDA-P(DMAEMA) 접합체 중량:siRFP 중량 = 20:1)를siRFP 농도가 50nM가 되는 양으로 30분간 처리한 뒤, 배양액을 제거한 후 DPBS로 두 번 세척하여 세포에 흡수되지 않은 잔여 물질을 제거하고 24시간동안 배양하였다.
이때, siRNA의 치료 효능의 비교를 위하여, 아무것도 처리하지 않은 세포(control), free siRFP만 50nM의 농도로 처리한 세포, 리포펙타민(Lipofectamine; Invitrogen, USA)/siRFP 복합체를 siRFP 농도가 50nM가 되는 양으로 처리한 세포를 사용하였다.
24시간 후 고정액을 이용하여 세포를 고정한 뒤, DAPI 마운팅 용액을 이용하여 세포핵을 염색한 후, 형광현미경을 이용하여 각각의 RFP 형광량을 비교 분석하여 siRNA의 치료 효능을 평가하였다.
상기 얻어진 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 c-HPD-siRNA는 환원제(DTT)를 처리하여 가교결합한 HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체를 의미한다. 도 8에서와 같이, 아무것도 처리하지 않은 세포, free siRFP 처리 세포 및 리포펙타민(Lipofectamine)/siRFP 복합체 처리 세포와 비교하여, siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체를 처리한 세포에서의 형광세기가 현저하게 감소한 것을 확인할 수 있다. 이는 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체에 포함된 siRFP가 타겟 단백질인 RFP의 발현을 효과적으로 억제함을 의미하는 것이다.
또한, 상기 siRFP/HA-PDA-P(DMAEMA) 복합체는 암세포 표면에 과발현하는 CD44 수용체와 히알루론산 간의 특이적이고 빠른 결합 특성에 의해 암세포 특이적으로 탐식되는 특성을 가지며, 이러한 탐식과정을 통하여 복합체에 포함된 siRNA가 기존의 다른 전달체와 비교하여 보다 더 효과적으로 세포내에 전달되어 타겟 단백질의 발현을 효과적으로 억제한다.
실시예 10: 종양 동물모델에서의 siRFP - HPD 및 c- siRFP - HPD 의 생체내 분포거동 평가
상기 제조된 siRFP-HPD 및 c-siRFP-HPD의 생체내 분포거동을 평가하기 위하여 근적외선 형광체를 표지한 HPD를 제조한 뒤, siRFP와 복합체를 제조하여 종양 동물모델에 정맥투여 하고 시간에 따른 분포거동을 근적외선 형광영상화 장치를 이용하여 관찰하였다.
근적외선 형광체를 표지한 HPD를 제조하기 위하여, 0.1mg의 FlammaTM(FPR-675) 형광체 (λex=675, λem=720, Bioacts, Incheon, Korea)를 10mg의 HPD와 10mM phosphate buffer (pH8.0)에서 24시간동안 반응시킴. 반응이 완료된 용액을 centrifugal filter (Ultracel
Figure 112013028251433-pat00006
-3K, Millipore Irenand Ltd, Ireland)로 14000 rpm에서 농축 시킨 뒤 증류수를 첨가하여 상기 과정을 3회 반복 하고 동결건조하여 하늘색 분말형태의 형광체를 표지한 HPD(F-HPD)를 제조하였다.
한편, 1x106 개의 편평상피세포암 (SCC7 cells, ATCC, USA)을 5주령 수컷 누드마우스 (Balb/C nude, 나라바이오텍, Korea)의 왼쪽 옆구리에 피하 주사하여, 종양 동물 모델을 준비하였다.
상기 종양 동물 모델의 종양의 크기가 80-150 mm3가 되었을 때, siRFP-F-HPD 복합체와 c-siRFP-F-HPD (1mg/ml F-HPD) 복합체를 각각 200ul의 양으로 상기 종양 동물 모델의 꼬리 정맥에 투여하였다. 각각의 동물 모델은 근적외선 형광영상화 장치인 eXplore Optix system (ART Advanced Research Technologies, Inc., Montreal, Canada)을 이용하여 1, 3, 6, 9, 24, 또는 48 시간에 영상화를 실시하였다.
상기 얻어진 근적외선 형광 이미지를 도 11에 나타내었다. 상기 얻어진 형광 이미지에서 Analysis Workstation software (ART Advanced Research Technologies, Inc., Montreal, Canada )를 이용하여 암 부근의 형광량을 정량하여 얻어진 형광량 축적 거동을 도 12에 나타내었다. 도 11 및 도 12에 나타난 바와 같이, 본 실시예에서 제작한 siRFP-HPD 및 c-siRFP-HPD 복합체는 모두 종양 동물모델에서 뛰어난 암 표적성을 갖는 것을 확인할 수 있다. 또한, 도 11 및 도 12에서, 가교결합을 형성시킨 c-siRFP-HPD 복합체에서 보다 뛰어난 암 표적화 및 축적성을 보임을 확인하여, 가교결합을 통하여 복합체의 형태 안정성이 증가됨을 확인하였다.
본 실시예를 통하여 siRNA-HPD 및 c-siRNA-HPD 복합체가 생체내 암 조직에 효과적인 표적화 및 축적성을 갖는 것이 확인됨으로써, 이를 이용하여 암 조직으로의 효과적인 핵산 전달이 가능함을 확인하였으며, 특히 가교결합을 도입한 c-siRNA-HPD 복합체는 보다 우수한 암 특이적 핵산 전달이 가능할 것으로 예상된다.
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Composition for nucleic acid delivery containing hyaluronic acid <130> DPP20126853KR <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sense strand of siRNA against RFP (siRFP) <400> 1 uguagaugga cuugaacuc 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> antisense strand of siRNA against RFP (siRFP) <400> 2 gaguucaagu ccaucuaca 19

Claims (13)

  1. 히알루론산(HA), 이황결합을 포함하는 가교제, 및 양이온성 및 양친성 고분자를 포함하고,
    히알루론산 내 카르복시기 100개 기준으로, 가교제 치환률이 1 내지 30%이고, 양이온성 및 양친성 고분자 치환률이 1 내지 30%이고,
    상기 이황결합을 포함하는 가교제는 피리딜디티오에틸아민 (pyridyldithioethylamine, PDA), 피리딜디설파이드 메타크릴레이트(pyridyl disulfide methacrylate, PDSMA), 숙신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridylthio)propionate; SPDP), 숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)엑사노에이트(Succinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate; LC-SPDP), 설포숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate; Sulfo-LC-SPDP), 및 3,3'-디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트 (3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate); DTSSP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    히알루론산 접합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이황결합을 포함하는 가교제는 피리딜디티오에틸아민 (pyridyldithioethylamine, PDA)인,
    히알루론산 접합체.
  3. 제1항에 있어서, 상기 양이온성 및 양친성 고분자는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트(Dimethylaminoethyl methacrylate; DMAEMA), 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)[Poly(Dimethylaminoethyl methacrylate); P(DMAEMA)], 키토산(chitosan), 글라이콜키토산(glycol chitosan), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리에틸렌이민(Polyethylene imine; PEI), 및 폴리아미드아민 덴드리머 (polyamidoamine dendrimer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    히알루론산 접합체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 히알루론산 접합체를 포함하고,
    상기 접합체 내의 이황결합에 의하여 접합체 간 가교결합이 형성된, 자가조립체.
  5. 히알루론산(HA), 이황결합을 포함하는 가교제, 및 양이온성 및 양친성 고분자를 포함하는 히알루론산 접합체, 및
    핵산
    을 포함하고,
    상기 히알루론산 접합체는 히알루론산 내 카르복시기 100개 기준으로, 가교제 치환률이 1 내지 30%이고, 양이온성 및 양친성 고분자 치환률이 1 내지 30%인 것이고,
    상기 이황결합을 포함하는 가교제는 피리딜디티오에틸아민 (pyridyldithioethylamine, PDA), 피리딜디설파이드 메타크릴레이트(pyridyl disulfide methacrylate, PDSMA), 숙신이미딜 3-(2-피리딜티오)프로피오네이트(Succinimidyl 3-(2-pyridylthio)propionate; SPDP), 숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)엑사노에이트(Succinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate; LC-SPDP), 설포숙신이미딜 6-(3'-[2-피리딜디티오]-프로피온아미도)헥사노에이트(Sulfosuccinimidyl 6-(3'-[2-pyridyldithio]-propionamido)hexanoate; Sulfo-LC-SPDP), 및 3,3'-디티오비스(설포숙신이미딜프로피오네이트 (3,3'-dithiobis(sulfosuccinimidylpropionate); DTSSP)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이고,
    상기 핵산은 상기 히알루론산 접합체 내의 양이온성 및 양친성 고분자에 결합된,
    히알루론산-핵산 복합체.
  6. 제5항에 있어서, 상기 이황결합을 포함하는 가교제는 피리딜디티오에틸아민 (pyridyldithioethylamine, PDA)인,
    히알루론산-핵산 복합체.
  7. 제5항에 있어서, 상기 양이온성 및 양친성 고분자는 디메틸아미노에틸메타크릴레이트(Dimethylaminoethyl methacrylate; DMAEMA), 폴리(디메틸아미노에틸메타크릴레이트)[Poly(Dimethylaminoethyl methacrylate); P(DMAEMA)], 키토산(chitosan), 글라이콜키토산(glycol chitosan), 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 폴리에틸렌이민(Polyethylene imine; PEI), 및 폴리아미드아민 덴드리머 (polyamidoamine dendrimer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    히알루론산-핵산 복합체.
  8. 제5항에 있어서, 상기 핵산은 RNA, DNA, siRNA(short interfering RNA), 압타머(aptamer), 안티센스 ODN(antisense oligodeoxynucleotide), 안티센스 RNA(antisense RNA), 리보자임(ribozyme), 및 디엔에이자임(DNAzyme)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인,
    히알루론산-핵산 복합체.
  9. 제5항에 있어서, 상기 히알루론산-핵산 복합체에 포함된 히알루론산 접합체와 핵산 함량비는 중량기준으로 99:1 내지 5:95 (히알루론산 접합체 중량:핵산 중량)인,
    히알루론산-핵산 복합체.
  10. 제9항에 있어서, 상기 히알루론산-핵산 복합체에 포함된 히알루론산 접합체와 핵산 함량비는 중량기준으로 5:1 내지 25:1 (히알루론산 접합체 중량:핵산 중량)인,
    히알루론산-핵산 복합체.
  11. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 히알루론산-핵산 복합체를 포함하는 핵산 전달용 조성물.
  12. 제5항 내지 제10항 중 어느 한 항의 히알루론산-핵산 복합체를 포함하고,
    상기 복합체의 이황결합에 의하여 복합체 간 가교결합이 형성된, 자가조립체.
  13. 제12항의 자가조립체를 포함하는 핵산 전달용 조성물.
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