KR101041985B1 - 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 핵산을 세포 내로 효과적으로 전달하고 독성이 거의 없는 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물은 핵산을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있고 독성이 거의 없어, 핵산의 효과적인 전달 시스템으로 활용할 수 있으며, 특히 저 분자량으로 분해되는 폴리에틸렌이민과 생체적합성이 우수한 히알루론산이 함유되어 주사 제형 및 비강 등을 통해 효과적으로 핵산을 전달할 수 있다.
핵산, 전달, 히알루론산, 폴리에틸렌이민, 스퍼민

Description

핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물{Method of manufacturing polymer for delivering nucleic acids and compositions for delivering nucleic acids comprising the polymer}
본 발명은 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 핵산을 세포 내로 효과적으로 전달하고 독성이 거의 없는 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물에 관한 것이다.
작은 간섭 리보핵산 (siRNA), 안티센스 올리고 핵산 (antisense oligonucleic acids), 플라스미드 데옥시리보 핵산 등은 최근 핵산 소재 의약으로서 산업적 중요성이 부각되고 있다. 핵산 물질의 경우 의약품으로 개발되기 위해서는 세포 또는 조직으로의 효율적인 전달(delivery)이 가장 먼저 해결되어야 할 과제이다.
핵산 물질의 세포내 전달을 위해서는 바이러스성 벡터 또는 고분자나 나노입자를 이용한 비바이러스성 벡터가 연구되고 있다. 이 중 바이러스성 벡터는 비바이러스성 벡터보다 높은 유전자 전달효율을 가지는 장점이 있으나 바이러스 사용시의 안전성 문제로 사람에의 적용은 매우 제한되어 있다. 따라서 바이러스성 벡터보다 안전한 대안으로 비 바이러스성 벡터에 대한 개발이 진행 중이다.
현재 핵산 물질, 특히 siRNA 전달체로 cationic liposome, TAT peptide, 또는 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)과 같은 양이온성 고분자가 많이 사용되고 있다. 특히 이들 가운데 양이온성 고분자인 폴리에틸렌이민(polyethylenimine, PEI)은 음전하를 가지는 특징이 있는 핵산 물질을 압축하여 콜로이드 입자로 만들며, 세포내의 라이소좀 내에서도 pH 완충능력을 보유하여 플라스미드 데옥시리보 핵산을 다양한 세포에 전달하는 것이 보고된 바 있다(Boussif et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 7297-7301; Godbey et al., J. Controlled Release 60 (1999) 149-160).
그러나 상기 양이온성 고분자는 체내 세포응집을 야기하고 혈액단백질과 정전기적으로 결합하여 siRNA의 활성을 저하시키게 되며, 간과 폐 등의 신체 장기에 치명적인 독성을 야기하는 것으로 밝혀져 양이온성 고분자를 단독으로 siRNA 전달체로 활용하기는 어려운 것으로 알려져 있다. 특히 폴리에틸렌이민을 사용함에 있어서는 세포내 유전자 전달 효율 및 세포독성 관련 문제점들이 아직 남아있어서, 이를 해결하기 위한 많은 연구들이 진행되고 있다. 예를 들어 폴리에틸렌이민(PEI)의 세포독성을 줄이기 위하여 텍스트란 설페이트(dextran sulfate), 인간 혈청 알부민(human serum albumin), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol) 등으로 개질하는 방법이 많이 시도되었으나 개질된 PEI는 공통적으로 PEI 자체 보다 낮은 유전자 전달 효율을 보였다.
따라서, 세포 독성이 작으면서도 작은 간섭 리보핵산, 안티센스 올리고 핵산 등의 올리고 핵산을 효율적으로 세포 내로 전달하는 기술은 당 분야에서 필요한 기술이다. 한편 히알루론산은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 번갈아 결합한 직쇄상의 고분자 다당으로, 종(種) 및 장기 특이성을 가지지 않으며, 생체에 이식 또는 주입한 경우에도 우수한 생체적합성을 나타내는 것으로 알려져 있다.
본 발명자들은 세포 독성이 거의 없으면서 핵산을 효율적으로 세포 내로 전달하는 기술에 관하여 연구하던 중, 본 발명에 의해 제조된 핵산 전달용 고분자가 세포 독성이 거의 없고 핵산의 세포 내 전달 효율이 우수함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 히알루론산(hyaluronic acid)을 결합시키는 단계를 포함하는 핵산 전달용 고분자의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자를 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
Figure 112009056039084-pat00001
Figure 112009056039084-pat00002
또한 본 발명은 (a) 히알루론산 및 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)의 혼합물에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하여 히알루론산에 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기를 도입하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입된 히알루론산과 티올기(thiol group)가 도입된 핵산을 결합시키는 단계 및
(c) 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 첨가하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 핵산 전달용 복합체의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 함유하는 핵산 전달용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
Figure 112009056039084-pat00003
본 발명은 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 히알루론산(hyaluronic acid)을 결합시키는 단계를 포함하는 핵산 전달용 고분자의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자를 포함하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
<화학식 1>
Figure 112009056039084-pat00004
상기 화학식 1에서
n 및 m은 각각 독립적으로 8 내지 20에서 선택된 정수이며;
p 및 q는 각각 독립적으로 16 내지 2500에서 선택된 정수이고;
<화학식 2>
Figure 112009056039084-pat00005
상기 화학식 2에서
n와 m는 각각 독립적으로 8 내지 20에서 선택된 정수이며;
r은 26 내지 2500에서 선택된 정수이다.
또한 본 발명은 (a) 히알루론산 및 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)의 혼합물에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하여 히알루론산에 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기를 도입하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입된 히알루론산과 티올기(thiol group)가 도입된 핵산을 결합시키는 단계 및
(c) 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 첨가하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 핵산 전달용 복합체의 제조방법을 제공한다.
또한 본 발명은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물을 함유하는 핵산 전달용 조성물을 제공한다.
<화학식 3>
Figure 112009056039084-pat00006
상기 화학식 3에서
p는 16 내지 2500에서 선택된 정수이며;
R은 피리딜기(pyridyl group)이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에서 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI)은 에틸렌이민을 중합한 중합체로써, 상기 폴리에틸렌이민의 분자량은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 100Da 내지 20kDa일 수 있으며, 더 바람직하게는 800Da 내지 10kDa일 수 있다.
본 발명에서 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)은 이에 한정되지 않지만 상기 폴리에틸렌이민을 하기 화학식 4로 표시되는 시스타민 비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide)와 반응시켜 제조될 수 있다.
<화학식 4>
Figure 112009056039084-pat00007
구체적으로 상기 폴리에틸렌이민을 시스타민 비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide, CBA)와 함께 메탄올에 넣고 반응시켜 제조될 수 있다 (<실시예 1-1> 참조).
본 발명에서 히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 천연 또는 합성 히알루론산, 또는 이들의 개질물일 수 있으며, β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 번갈아 결합한 직쇄상의 고분자 다당류를 말한다. 상기 히알루론산의 분자량에는 제한이 없으나, 바람직하게는 0.5 내지 1,000 kDa인 것을 사용할 수 있으나, 더 바람직하게는 분자량 5 kD 내지 200 kD인 것을 사용할 수 있다.
본 발명에서 핵산은 세포 내로의 전달을 목적으로 하는 핵산이라면 이에 한 정되지 않으나, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 단일 또는 이중 가닥 형태의 이들의 중합체를 포함하고, 바람직하게는 상기 핵산은 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 안티센스 핵산, 핵산 앱타머(aptamer) 일 수 있고, 보다 바람직하게는 5 내지 200개의 염기(base pair)로 구성된 작은 간섭 리보핵산(siRNA), 안티센스 핵산 또는 핵산 앱타머(aptamer)일 수 있으며, 가장 바람직하게는 siRNA일 수 있다.
본 발명에서 유전자 침묵은 표적 핵산 서열, 즉 RNAi에 의해 표적화된 유전자의 전사 정도가 감소하거나 또는 표적 서열 또는 단백질의 양 또는 활성이 감소하는 것을 말한다.
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 핵산 전달용 고분자의 제조방법은 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 히알루론산(hyaluronic acid)을 결합시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)과 히알루론산(HA)의 결합은 바람직하게는 하기와 같이 2가지 종류의 단계를 걸쳐 진행될 수 있다.
먼저, (a) 히알루론산에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)-프로필]카르보디이민(1-ethyl-3- [3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 및 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt), N-히드록시설포숙신이미드(N- hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하는 단계 및
(b) 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민과 결합시키는 단계를 포함하여 핵산 전달용 고분자를 제조할 수 있다. 즉 상기 단계를 통하여, PEI-SS의 아민기와 HA의 카르복실기 사이에 아마이드 결합을 형성함으로써 핵산 전달용 고분자를 제조할 수 있다(<실시예 1-2> 참조). 상기와 같은 과정을 통하여 상기 화학식 1로 표시되는 핵산 전달용 고분자가 제조될 수 있다.
또한 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 히알루론산(hyaluronic acid)에 NaBH3CN을 첨가하여 결합시킴으로써 핵산 전달용 고분자를제조할 수 있다.
보다 바람직하게는 보레이트 버퍼에 NaBH3CN과 NaCl를 용해시키고 HA 와 PEI-SS를 넣어 반응시킴으로써 제조될 수 있다. 즉 상기 단계를 통하여, HA 말단과 PEI-SS의 아민기가 환원성 아민화 반응(reductive amination)를 통해 공유 결합된다(<실시예 1-3> 참조). 상기와 같은 과정을 통하여 상기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자가 제조될 수 있다.
한편, 본 발명의 핵산 전달용 조성물은 상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 핵산 전달용 조성물에는 핵산을 추가적으로 포함하여 상기 핵산 전달용 고분자와 핵산이 정전기적으로 결합된 복합체가 형성되며, 이를 통하여 세포 내로 핵산을 전달할 수 있다. 또한 상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자에 포함된 이황화 결합은 세포 내에서 쉽게 분해되기 때문에 PEI가 저 분자량의 PEI로 분해될 수 있어 세포 내 독성이 감소되며, HA를 함유함으로써 생체 적합성이 매우 우수하다.
본 발명의 일실험예에서는 상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자의 세포 독성을 실험한 결과, 고 분자량의 PEI(25kDa)에 비하여 세포 독성이 거의 없음을 알 수 있다(<실험예 2> 참조).
본 발명의 일실험예에서는 상기 화학식 1 또는 상기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자의 유전자 침묵 활성을 동시 전이(co-transfection)시켜 평가 한 결과, 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다(<실험예 3> 참조).
본 발명의 일 측면에서, 본 발명의 핵산 전달용 고분자의 제조방법은 (a) 히알루론산 및 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)의 혼합물에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하여 히알루론산에 피리딜 다이설 파이드(pyridyldisulfide)기를 도입하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입된 히알루론산과 티올기(thiol group)가 도입된 핵산을 결합시키는 단계 및
(c) 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 첨가하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 (a) 단계를 통하여 HA에 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입되고, 상기 (b) 단계를 통하여 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입된 HA가 티올기(thiol group)가 도입된 핵산과 이황화 결합을 할 수 있다. 마지막으로 상기 (c) 단계를 통하여 HA와 핵산이 이황화 결합된 복합체가, PEI-SS와 정전기적으로 복합체를 형성하게 된다. 상기 단계를 통하여 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물과 핵산이 이황화 결합된 복합체가 형성된다.
한편, 본 발명의 핵산 전달용 조성물은 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 티올기(thiol group)가 도입된 핵산을 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물은 이에 한정되지 않지만 바람직하게는 히알루론산 및 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)의 혼합물에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하여 히알루론산에 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기를 도입함으로써 제조될 수 있다.
또한 상기 조성물에는 당업자에게 알려진 방법에 따라 제조된 티올기(thiol group)가 도입된 핵산이 함유되어 있어, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물과 이황화 결합이 되어 핵산이 포함된 핵산 전달용 복합체가 형성될 수 있다.
상기 조성물에는 PEI-SS를 추가적으로 함유하여, 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 티올기(thiol group)기가 도입된 핵산이 결합된 복합체와 정전기적으로 결합할 수 있다.
상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 티올기(thiol group)기가 도입된 핵산이 결합된 복합체는 이황화 결합이 포함되어 효과적으로 핵산을 세포 내로 전달할 수 있고, PEI-SS 내에도 이황화 결합이 포함되어 세포 내에서 쉽게 분해되기 때문에 PEI가 독성이 낮은 저 분자량의 PEI로 분해될 수 있다. 또한 HA를 함유함으로써 생체 적합성이 매우 우수하다.
본 발명의 일실험예에서는 상기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 티올기(thiol group)가 도입된 핵산이 결합된 것과 PEI-SS의 복합체의 유전자 침묵 활성을 동시 전이(co-transfection)시켜 평가 한 결과, 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다(<실험예 4> 참조).
본 발명의 핵산 전달용 고분자의 제조방법 및 상기 고분자를 함유하는 핵산 전달용 조성물은 핵산을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있고 독성이 거의 없어, 핵산의 효과적인 전달 시스템으로 활용할 수 있으며, 특히 저 분자량으로 분해되는 폴리에틸렌이민과 생체적합성이 우수한 히알루론산이 함유되어 주사 제형 및 비강 등을 통해 효과적으로 핵산을 전달할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민( PEI - SS )과 히알루론산( hyaluronic acid, HA )이 결합된 핵산 전달용 고분자의 제조
<1-1> 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민( PEI - SS )의 합성
본 발명에서 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 합성하는 방법은 도 1에 간략히 기재되어 있다.
상기 도 1에 기재된 바와 같이, 2000Da의 저 분자량을 가진 폴리에틸렌이민을 시스타민 비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide, CBA)와 함께 90% 메탄올에 용해시키고 60℃에서 24시간 동안 반응시켜 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 합성하였다. 이때 폴리에틸렌이민과 시스타민 비스아크릴아마이드의 몰 비를 10:1, 4:1, 2:1로 다양하게 하여 서로 다른 치환율을 가진 합성물을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 합성물을 여과 튜브(cutoff 3000Da)를 이용하여 여과하고 정제하여 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)을 제조하였다.
상기와 같이 PEI-SS가 합성되었는지 여부를 1H NMR과 GPC(gel permeation chromatography)를 이용하여 확인하고 그 중 상기 1H NMR 결과를 도 2에 기재하였다.
상기 도 2에 기재된 바와 같이, 1H NMR 결과에서 합성 전과 후의 데이터를 비교해 보면 폴리에틸렌이민이 합성됨을 알 수 있으며 시스타민 비스아크릴아마이드의 피크(3.4ppm)와 폴리에틸렌이민의 피크(2.5 ~2.9ppm)의 적분값을 이용하여 치환율을 알 수 있다.
<1-2> PEI - SS 의 아민기와 HA 의 카르복실기가 결합된 HA -g-( PEI - SS )의 합성
도 3에 기재된 바와 같은 과정을 통하여, 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)과 히알루론산(hyaluronic acid, HA)을 결합시킴으로써 HA-g-(PEI-SS)를 합성하였다. 즉 PEI-SS의 아민기와 HA의 카르복실기 사이에 아마이드 결합을 형성함으로써 HA-g-(PEI-SS)를 합성하였다.
구체적으로 분자량 130kDa인 HA의 카르복실기(carboxyl group)를 pH 6.5, 1M NaCl 용액에서 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)-프로필]카르보디이민(1-ethyl-3- [3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide, EDC) 및 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt)로 활성화 시킨 다음, 상기 <실 시예 1-1>에서 제조된 PEI-SS와 결합시켰다. 이 때 HA 와 PEI-SS의 무게 비율을 각각 1:2, 1:5, 1:20으로 다양하게 하여 서로 다른 치환율을 가진 합성물을 수득하였다. 상기와 같이 수득된 합성물을 여과 튜브(cutoff 10kDa)를 이용하여 여과하고 정제하여 HA-g-(PEI-SS)를 제조하였다.
상기와 같이 HA-g-(PEI-SS)가 합성되었는지 여부를 1H NMR를 이용하여 확인하고 그 결과를 도 4에 기재하였다.
상기 도 4에 기재된 바와 같이, 1H NMR 결과에서 HA-g-(PEI-SS)가 합성되면서 PEI 특성 피크가 왼쪽으로 옮겨지는 현상을 관찰할 수 있으며, 치환율은 HA 특성 피크 영역(1.9ppm)과 PEI-SS 특성 peak 영역(2.5~3.4ppm)을 비교함으로써 수득할 수 있다.
<1-3> PEI - SS 의 아민기와 HA 의 말단이 결합된 HA -b-( PEI - SS )의 합성
도 5에 기재된 바와 같이, HA 말단과 PEI-SS의 아민기를 환원성 아민화 반응(reductive amination)를 통해 공유 결합시켰다.
구체적으로 pH 8.5의 0.1M 보레이트 버퍼(sodium borate buffer)에 NaBH3CN과 NaCl를 각각 0.3M, 1M 농도로 녹이고, HA와 PEI-SS를 3일간 반응시킴으로써 합성하였다. 상기 합성 후 불순물은 여과 튜브(cutoff 10kDa)를 이용해 제거하여 HA-b-(PEI-SS)를 합성하였다.
상기와 같이 HA-b-(PEI-SS)가 합성되었는지 여부를 1H NMR를 이용하여 확인하고 그 결과를 도 6에 기재하였다.
상기 도 6에 기재된 바와 같이, 1H NMR 결과에서 HA-b-(PEI-SS)가 합성되면서 PEI 특성 피크가 왼쪽으로 옮겨지는 현상을 관찰할 수 있으며, 치환율은 HA 특성 피크 영역(1.9ppm)과 PEI-SS 특성 peak 영역(2.5~3.4ppm)을 비교함으로써 수득할 수 있다.
< 실험예 1>
PEI - SS 와 HA 가 결합된 고분자와 siRNA 의 복합체 형성 여부 확인
150mM의 염화나트륨 수용액에 siRNA(small interfering RNA)(바이오니아, 서열번호 1: UUGUUUUGGAGCACGGAAA(dTdT))와 상기 <실시예 1-2>에서 제조된 HA-g-(PEI-SS) 또는 상기 <실시예 1-3>에서 제조된 HA-b-(PEI-SS) 접합체를 15분 동안 상온에서 반응시킴으로써 복합체(complex)를 형성시켰다. 이때 siRNA와 HA-g-(PEI-SS) 또는 HA-b-(PEI-SS)의 농도를 변화시켜 가장 효과적인 반응비를 살펴보았으며 상기 결과를 도 7에 기재하였다.
상기 도 7에 기재한 바와 같이, siRNA와 HA-g-(PEI-SS) 또는 HA-b-(PEI-SS)가 효과적으로 복합체를 형성할 수 있음을 알 수 있다. 특히 siRNA와 HA-g-(PEI-SS)의 경우 질량비가 1:4 이상부터 복합체가 형성되며, 특히 질량비가 1:15인 경우 가장 효과적으로 복합체가 형성됨을 알 수 있다. 또한 siRNA와 HA-b-(PEI-SS)의 경 우 질량비가 1:2나 1:4이상 부터 복합체가 형성됨을 알 수 있었다.
< 실험예 2>
PEI - SS 와 HA 가 결합된 고분자의 독성 평가
상기 <실시예 1>에서 제조된 HA-g-(PEI-SS) 및 HA-b-(PEI-SS)의 독성을 알아보기 위하여, 고 분자량의 PEI(25kDa), 저 분자량의 PEI(2kDa) 및 PEI-SS와 비교하여 MTT assay를 실시하였다.
구체적으로 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)과 100U/mL 페니실린-스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지(GIBCO-BRL, NY, 미국)에서 배양한 B16F1 세포를 96-웰 플레이트에 분주하여, 플레이트의 약 70% 정도로 세포가 자랄 때까지 37˚C 및 5% CO2 조건하에서 배양한 다음, 각 웰에 다양한 농도의 HA-g-(PEI-SS)를 주입하여 24시간 동안 배양한 후 MTT assay로 세포 독성을 평가하고 그 결과를 도 8에 기재하였다.
상기 도 8에 기재된 바와 같이, HA-g-(PEI-SS) 및 HA-b-(PEI-SS)의 경우 고 분자량의 PEI(25kDa)에 비하여 세포 독성이 거의 없음을 알 수 있다.
< 실험예 3>
PEI - SS 와 HA 가 결합된 고분자와 siRNA 의 복합체의 유전자 침묵( gene silencing ) 활성
상기 <실시예 1>에서 제조된 HA-g-(PEI-SS)와 siRNA 복합체 또는 HA-b-(PEI-SS)와 siRNA 복합체의 유전자 침묵 활성을 동시 전이(co-transfection)시켜 평가하였다.
구체적으로 24-웰 플레이트에 있는 B16f1 세포(한국세포주은행)에 먼저 Lipofectamine/PGL3-Luc complex(Jiang, G.; Park, K. T.; Kim, J. S.; Kim, K. S.; Oh, E. J.; Kang, H. G.; Han, S. E.; Oh, Y. K.; Park, T. G.; Hahn, S. K. Hyaluronic acid-polyethyleneimine conjugate for target specific intracellular delivery of siRNA. Biopolymers 2008, 89, 635-642.)를 주입하여 3시간 동안 배양한 후 수세하였다. 이후, HA-g-(PEI-SS)와 siRNA 복합체 및 HA-b-(PEI-SS)와 siRNA 복합체를 상기 세포에 처리하여 24시간 동안 추가 배양한 후, 형광 루미노메타(Luminometer)를 사용하여 30 초간 루시페라제(luciferase) 활성을 측정하여 그 결과를 도 9 및 도 10에 기재하였다.
상기 도 9 및 도 10에 기재한 바와 같이, HA-g-(PEI-SS)와 siRNA 복합체 또는 HA-b-(PEI-SS)와 siRNA 복합체는 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
< 실시예 2>
HA 와 siRNA 의 이황화 결합에 의한 HA - ss - siRNA 의 합성
<2-1> HA 와 siRNA 의 이황화 결합에 의한 HA - ss - siRNA 의 합성
도 11에 기재된 바와 같은 과정을 통하여, 히알루론산(HA)과 siRNA의 이황화 결합을 통하여 HA-ss-siRNA를 합성하였다. 즉 히알루론산의 카르복실기와 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-Pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)의 디히드라지드(dihydrazide)기를 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC)를 이용하여 결합시킴으로써, 히알루론산에 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide) 그룹을 도입시켰다. 이후 센스 가닥(sense strand)의 3'에 티올기(thiol group)가 도입된 siRNA를 상기 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입된 히알루론산과 결합시켜 HA-ss-siRNA를 합성하였다. 상기 HA-ss-siRNA가 합성되었는지 여부를 GPC를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 12에 기재하였다.
< 실험예 4>
HA - ss - siRNA 와 PEI - SS 복합체의 유전자 침묵( gene silencing ) 활성
상기 <실시예 2>에서 제조된 HA-ss-siRNA와 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)의 복합체의 유전자 침묵 활성을 상기 <실험예 3>과 동일한 방법으로 측정하고 그 결과를 도 13에 기재하였다.
상기 도 13에 기재한 바와 같이, HA-ss-siRNA와 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)의 복합체는 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있다.
도 1은 저 분자량의 폴리에틸렌이민을 시스타민 비스아크릴아마이드과 결합함으로써 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)가 형성되었는지 여부를 1H-NMR를 이용하여 분석한 결과이다. (CBA: 시스타민 비스아크릴아마이드, PEI: polyethyleneimine, PssP: 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS))
도 3은 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(PEI-SS)의 아민기와 히알루론산(hyaluronic acid, HA)의 카르복실기가 결합된 HA-g-(PEI-SS)의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 HA-g-(PEI-SS)가 합성되었는지 여부를 1H NMR를 이용하여 분석한 결과이다.
도 5는 PEI-SS의 아민기와 HA의 말단이 결합된 HA-b-(PEI-SS)의 합성 과정을 나타낸 것이다.
도 6은 HA-b-(PEI-SS)가 합성되었는지 여부를 1H NMR를 이용하여 분석한 결과이다.
도 7은 PEI-SS와 HA가 결합된 고분자와 siRNA의 복합체 형성 여부를 전기영동을 통해 확인한 사진이다.
도 8은 PEI-SS와 HA가 결합된 고분자의 세포 독성을 MTT-assay를 이용하여 측정한 결과이다. (PEI 25k: 고 분자량의 PEI(25kDa), PEI 2k: 저 분자량의 PEI(2kDa), PssP: PEI-SS)
도 9는 HA-g-(PEI-SS)와 siRNA 복합체가 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제함을 보여주는 그래프이다.
도 10은 HA-b-(PEI-SS)와 siRNA 복합체가 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제함을 보여주는 그래프이다.
도 11은 HA와 siRNA가 이황화 결합된 HA-ss-siRNA 의 합성 과정을 나타낸 것이다
도 12는 HA-ss-siRNA의 합성 전후의 GPC분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 13은 HA-ss-siRNA와 PEI-SS의 복합체가 농도 의존적으로 루시페라제(luciferase) 활성을 효과적으로 억제함을 보여주는 그래프이다.
<110> POSTECH ACADEMY-INDUSTRY FOUNDATION <120> Method of manufacturing polymer for delivering nucleic acids and compositions for delivering nucleic acids comprising the polymer <130> DPP20093468KR <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA <400> 1 uuguuuugga gcacggaaa 19

Claims (12)

  1. 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)과 히알루론산(hyaluronic acid)을 결합시키는 단계를 포함하는 핵산 전달용 고분자의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, (a) 히알루론산에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)-프로필]카르보디이민(1-ethyl-3- [3-(dimethylamino)-propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물 및 1-히드록시 벤트리아졸 모노하이드레이트(1-hydroxy bentriazole monohydrate, HOBt), N-히드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide, sulfo-NHS) 및 N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide, NHS)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하는 단계 및
    (b) 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민과 결합시키는 단계를 포함하는 핵산 전달용 고분자의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine) 및 히알루론산(hyaluronic acid)에 NaBH3CN을 첨가하여 결합시키는 것인 핵산 전달 용 고분자의 제조방법.
  4. 하기 화학식 1 또는 하기 화학식 2로 표시되는 핵산 전달용 고분자를 포함하는 핵산 전달용 조성물;
    <화학식 1>
    Figure 112009056039084-pat00008
    상기 화학식 1에서
    n 및 m은 각각 독립적으로 8 내지 20에서 선택된 정수이며;
    p 및 q는 각각 독립적으로 16 내지 2500에서 선택된 정수이고;
    <화학식 2>
    Figure 112009056039084-pat00009
    상기 화학식 2에서
    n와 m는 각각 독립적으로 8 내지 20에서 선택된 정수이며;
    r은 26 내지 2500에서 선택된 정수이다.
  5. 제4항에 있어서, 핵산을 추가적으로 포함하는 핵산 전달용 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 핵산은 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA, siRNA)인 핵산 전달용 조성물.
  7. (a) 히알루론산 및 3-(2-피리딜디티오)프로피오닐 히드라지드(3-(2-pyridyldithio)propionyl hydrazide, PDPH)의 혼합물에 1-에틸-3-[3-(디메틸아미노)프로필]카르보디이미드(1-ethyl-3-[3-(dimethylamino)propyl]carbodiimide, EDC) 및 N, N'-디사이클로헥실카보디이미드 (dicyclohexylcarbodiimide; DCC)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 첨가하여 히알루론산에 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기를 도입하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 피리딜 다이설파이드(pyridyldisulfide)기가 도입된 히알루론산과 티올기(thiol group)가 도입된 핵산을 결합시키는 단계 및
    (c) 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 첨가하여 복합체를 형성하는 단계를 포함하는 핵산 전달용 복합체의 제조방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 핵산은 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA, siRNA)인 핵산 전달용 복합체의 제조방법.
  9. 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물 및 티올기(thiol group)가 도입된 핵산을 함유하는 핵산 전달용 조성물.
    <화학식 3>
    Figure 112009056039084-pat00010
    상기 화학식 3에서
    p는 16 내지 2500에서 선택된 정수이며;
    R은 피리딜기(pyridyl group)이다.
  10. 제9항에 있어서, 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine)을 추가적으로 포함하는 핵산 전달용 조성물.
  11. 제9항에 있어서, 상기 핵산은 작은 간섭 리보핵산(small interfering RNA, siRNA)인 핵산 전달용 조성물.
  12. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 이황화 결합이 도입된 폴리에틸렌이민은 폴리에틸렌이민을 시스타민 비스아크릴아마이드(cystamine bisacrylamide)와 반응시켜 제조된 것인 방법.
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