CN115337268A - 一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途，属于医药领域。该纳米系统由如下重量配比的原料制备而成：HA‑AEM1～5份，PEI‑PLG10～50份；所述HA‑AEM由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸盐1～4份，N‑(2‑氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐1～2份；所述PEI‑PLG由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺10～40份，寡肽GPLGLAGC1～2份。该纳米递送系统可以有效包裹siRNA并形成稳定的纳米络合物，并能够有效被肿瘤细胞摄取。更重要的是该递送系统克服了现有技术中siRNA药物对实体瘤渗透作用差的问题。该纳米系统载PD‑L1‑siRNA后可有效下调PD‑L1在肿瘤细胞中的表达。本发明为siRNA的递送和提高肿瘤渗透提供了一种新的方法，为其未来在癌症治疗中的临床应用提供了新的途径。

Description

一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途。
背景技术
人类程序性死亡配体1(PD-L1)在肿瘤细胞中的过度表达不仅降低了T细胞的识别能力，还促进了肿瘤的病变和扩散。PD-L1通过与T细胞中的PD-1结合发挥免疫抑制作用。阻断PD-1和PD-L1之间的相互作用可以有效逆转T细胞的抑制，并且避免肿瘤细胞微环境中的免疫抑制，对疾病，特别是癌症的治疗十分重要。美国食品和药物管理局已经批准了诸如Altizolumab、Avilumab和Duvarumab6等几种PD-L1抗体药物用于帕金森病的临床治疗。对于肺癌患者，阻断PD-1/PD-L1的免疫治疗也已被归为第一治疗方案。
随着近年来纳米技术的发展，小干扰RNA(siRNA)技术已成为一个成熟的研究课题。2004年，一项基于siRNA的治疗被应用于一种眼病的一期临床研究。此外，第一个被用于治疗实体肿瘤患者的靶向纳米颗粒投递系统已经进入临床试验阶段。这标志着siRNA在实体肿瘤全面治疗上的开始。而siRNA-PD-L1在临床前研究中的应用也取得了积极进展。PD-L1 siRNA脂质纳米颗粒治疗可提高自然杀伤细胞和对抗CD8+抗原具有特异性的T细胞的增殖，并增强其致死能力和记忆功能。然而，现阶段纳米颗粒存在对实体瘤穿透能力较差的问题，导致药效无法完全发挥，治疗效果较差。
聚乙烯亚胺(PEI)是一种被广泛用于基因治疗的亲水性且带正电荷的聚合物材料。此聚合物的主链可以通过静电作用与siRNA中磷酸阴离子相互作用形成尺寸为100至1000nm15的纳米络合物。络合的形成后可防止siRNA的酶降解以及促进经由内吞作用所引起的细胞物质吸收。但，PEI具有细胞毒性大和在高效转染前提下的不可生物降解性等问题。现有技术通过使用透明质酸、壳聚糖、琼脂糖等对PEI进行改性，降低其细胞毒性和可降解性，促进对肿瘤细胞的靶向性。但是，由于实体瘤内部的高压环境，药物仍然很难穿透实体瘤进行治疗。
研究一种对实体瘤穿透能力强的载药系统，对于肿瘤治疗有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途。
本发明提供了一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统，它由如下重量配比的原料制备而成：HA-AEM 1～5份，PEI-PLG 10～50份；
所述HA-AEM由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸盐1～4份，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐1～2份；
所述PEI-PLG由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺10～40份，寡肽GPLGLAGC 1～2份。
进一步地，前述的纳米系统由如下重量配比的原料制备而成：HA-AEM 1份，PEI-PLG 20份；
所述HA-AEM由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸盐2份，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐1份；
所述PEI-PLG由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺20份，寡肽GPLGLAGC 1份。
进一步地，所述聚乙烯亚胺为具有支链结构的聚乙烯亚胺；
和/或，所述透明质酸盐为透明质酸钠。
进一步地，所述HA-AEM的制备方法为：在催化剂作用下，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐的氨基与透明质酸盐的羧基反应而得；
和/或，所述PEI-PLG的制备方法为：在催化剂作用下，寡肽GPLGLAGC的羧基与聚乙烯亚胺的氨基反应而得。
进一步地，所述HA-AEM的制备方法包括如下步骤：
(1)将透明质酸盐溶于水中，得到HA溶液；
(2)将N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐溶于水中，得到AEM溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的溶液混合后加入催化剂量的催化剂，调节pH至6.5，常温反应，得反应液；
(4)将反应液透析后冷冻干燥，即得；
优选地，步骤(3)中，所述催化剂为EDC和HOBt，质量比为(1～2)：1；和/或，步骤(4)中，所述透析为将反应液置于分子量为30KD的透析袋中透析。
进一步地，所述PEI-PLG的制备方法包括如下步骤：
(a)将寡肽GPLGLAGC溶于水中，得PLG溶液；
(b)将聚乙烯亚胺溶于水中，得PEI溶液；
(c)将催化量的催化剂加入PLG溶液中，再将PEI溶液加入PLG溶液中，调节pH至6.0，常温反应，得反应液；
(d)将反应液透析后冷冻干燥，即得；
优选地，步骤(c)中，所述催化剂为EDC和NHS，质量比为(1～2)：1；
和/或，步骤(d)中，所述透析为将反应液置于分子量为35KD的透析袋中透析。
本发明还提供了一种制备前述的纳米系统的方法，它包括如下步骤：
(A)将HA-AEM和PEI-PLG溶于溶剂中反应，得反应液；
(B)将反应液透析后冷冻干燥，即得；
优选地，步骤(A)中，所述溶剂为PBS溶液；和/或，步骤(A)中，所述反应为室温下反应；和/或，步骤(B)中，所述透析为将反应液置于分子量为35KD的透析袋中透析。
本发明还提供了前述的纳米系统作为药物载体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明还提供了一种药物，它是由前述的纳米系统为药物载体，载siRNA的药物；优选地，所述siRNA为PD-L1 siRNA。
进一步地，所述药物是经过MMP-2处理的药物，所述经过MMP-2处理的处理方法为将药物与MMP-2溶液孵育后而得。
本发明中常温即为室温，是25±5℃。
本发明提供了一种具有MMP-2敏感的siRNA纳米递送系统HA-P-PEI，该纳米递送系统可以有效包裹siRNA并形成稳定的纳米络合物，有利于siRNA在体内递送。同时，该递送系统能够有效被肿瘤细胞摄取。更重要的是该递送系统对实体瘤有良好的渗透能力，特别是经过MMP-2处理的该递送系统对实体瘤的渗透能力有显著提高，克服了现有技术中siRNA药物对实体瘤渗透作用差的问题。该纳米系统载PD-L1-siRNA后可有效下调PD-L1在肿瘤细胞中的表达。本发明纳米递送系统作为药物载体，为siRNA的递送和提高肿瘤渗透提供了一种新的方法，为其未来在癌症治疗中的临床应用提供了新的途径。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为HA-P-PEI和HA-PEI的合成路线图：A为HA-PEI的合成路线图；B为HA-P-PEI的合成路线图，其中，(a)为HA-AEM合成路线图，(b)为PEI-PLG合成路线图，(c)为HA-P-PEI合成路线图。
图2为不同材料核磁共振和红外图谱：A为HA的核磁共振图谱；B为HA-AEM的核磁共振图谱；C为PEI的核磁共振图谱；D为PEI-PLG的核磁共振图谱；E为HA-P-PEI的核磁共振图谱；F为HA-PEI的核磁共振图谱；G为红外图谱。
图3为纳米系统载药胶束表征结果：A为PEI/siRNA的凝胶电泳结果；B为HA-PEI/siRNA的凝胶电泳结果；C为HA-P-PEI/siRNA的凝胶电泳结果；D为HA-PEI/siRNA络合物的透射电子显微镜图片；E为HA-P-PEI/siRNA络合物的透射电子显微镜图片；F为将HA-P-PEI/siRNA暴露于MMP-26h后的透射电子显微镜图片；G为HA-PEI/siRNA络合物的粒径分布；H为HA-P-PEI/siRNA络合物的粒径分布；I为将HA-P-PEI/siRNA暴露于MMP-26h后的粒径分布；J为游离的siRNA以及PEI/siRNA，HA-PEI/siRNA和HA-P-PEI/siRNA络合物与FBS在37℃下孵育不同时间后的凝胶电泳实验结果。
图4为PEI、HA-PEI、HA-P-PEI的细胞毒性测试结果。
图5为体外细胞摄取试验结果：A为荧光显微镜观察各组Cy3标记的siRNA络合物细胞摄取试验结果；B为流式细胞仪测定各组FAM标记的siRNA络合物细胞摄取试验结果。
图6为肿瘤球穿透实验结果：A为各组载siRNA络合物在实体肿瘤球深层区域的渗透荧光图，其中a为游离CY3-siRNA，b为PEI/CY3-siRNA纳米粒，c为HA-PEI/CY3-siRNA纳米粒，d为HA-p-PEI/CY3-siRNA纳米粒，e为同时采用MMP2孵育的HA-p-PEI/CY3-siRNA纳米粒；B为各组载siRNA络合物在实体肿瘤深层区域的荧光强度结果。
图7为各组络合物对PD-L1基因表达的影响结果：A为对PD-L1基因表达的影响结果；B为对PD-L1蛋白表达的影响结果。
具体实施方式
本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
部分主要材料如下：透明质酸钠(20kDa)购自Lifecore Biomedical Inc.(美国)。具有支链的聚乙烯亚胺(25kDa)购自Sigma-Aldrich(美国)。寡肽GPLGLAGC由上海生物工程股份有限公司(中国)合成。siRNA(NC siRNA)阴性对照，Cy3-siRNA(在5'末端修饰有Cy3染料的siRNA阴性对照)，荧光素酰胺(FAM)-siRNA(在5'末端装饰有FAM的siRNA阴性对照)和PD-L1 siRNA(正义链：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT和反义链：ACGUGACACGUUCGGAGAATT)由上海基因制药有限公司合成(中国)。1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和1-羟基苯并三唑(HOBt)购自于四川蜀研生物技术有限公司(中国)。胰蛋白酶购自Hyclone(美国犹他州)。MMP-2购自Sigma-Aldrich(美国)。
SEQ ID NO.1：GPLGLAGC
SEQ ID NO.2：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT
SEQ ID NO.3：ACGUGACACGUUCGGAGAATT
实施例1、本发明基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统的合成
本发明基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统(HA-P-PEI)的合成路线如图1B所示。如图1B所示，HA-P-PEI通过3步反应合成。首先，在EDC/HOBt的催化下，通过将AEM的氨基连接到HA的羧基上合成HA-AEM。然后，PEI-PLG通过将多肽的羧基连接至PEI的氨基来合成。最后，HA-P-PEI通过PEI-PLG上的硫醇基和HA-AEM上的双键的加成反应获得。
(1)HA-AEM的合成
称取透明质酸钠(HA)20mg，溶于10mL纯水中，另称取N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐(AEM)10mg，溶于10mL纯水中，将上述溶液混合得反应液。分别称取EDC 40mg和HOBt28.5mg溶于500μL纯水和500μLDMSO组成的混合溶剂中，加入上述反应液中，用1.0M HCl调节pH至6.5，常温反应24h后，于分子量为30KD的透析袋透析在100mM NaCl溶液中透析2天，于25％乙醇溶液中透析2天，纯水中透析1天，冷冻干燥，即得HA-AEM。
(2)PEI-PLG的合成
称取20mg寡肽GPLGLAGC于50ml烧瓶中，加纯水10mL使其溶解，得PLG溶液；另称取400mg聚乙烯亚胺(PEI)，溶于20mL纯水中，得PEI溶液；将40mg EDC和20mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)添加至PLG溶液中室温搅拌2h，再加入PEI溶液，用1.0M HCl调节pH至6.0，室温反应4h。得到的产物在4℃纯水中透析(35kDa)1天，冷冻干燥，即得PEI-PLG。
(3)HA-P-PEI的合成
将HA-AEM(20mg)和PEI-PLG(400mg)溶解于20mL PBS(pH＝7.4)中，并在室温下反应4h，然后在纯水中透析(35KDa)24h，冷冻干燥，即得本发明基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统(HA-P-PEI)。
对比例1、透明质酸-聚乙烯亚胺纳米系统的合成
透明质酸-聚乙烯亚胺纳米系统的合成路线如图1A所示。如图1A所示，HA-PEI聚合物是通过EDC/HOBt的催化作用把PEI的氨基连接到HA的羧基上来合成的。
分别将20mg的透明质酸钠(HA)和402mg的聚乙烯亚胺(PEI)溶解在10mL纯水中，然后将溶液混合得混合溶液；将40mg EDC和28mg HOBT溶于纯水/DMSO混合溶液中(500μL/500μL)，加入上述混合溶液，并用1M HCl调节混合溶液的pH至6.5，室温反应24h，将反应后的液体先用100mM NaCl溶液透析(30kDa)2天，再用25％乙醇溶液透析(30kDa)1天，最后用纯水透析(30kDa)1天，冷冻干燥，即得透明质酸-聚乙烯亚胺纳米系统(HA-PEI)。
以下通过具体试验例证明本发明的有益效果。
统计分析
使用Prism GraphPad v6(GraphPad,美国)软件对数据进行统计分析和学生t检验分析。
试验例1、HA-P-PEI和HA-PEI的表征
原料HA、PEI、实施例1合成的HA-AEM、PEI-PLG、HA-P-PEI和对比例1合成的HA-PEI分别用傅里叶变换红外光谱(FT-IR)和核磁共振(1HNMR)进行表征。结果如图2所示。
1HNMR(图2F)结果中δ1.9的HA甲基峰以及δ2.5至δ3.2的PEI的特征峰证明了HA-PEI的成功合成。HA与PEI的重量比为1:20。此外，HA-P-PEI络合物由25kDa的PEI骨架，Gly-PLGLAG-Cys和HA-AEM组成。图2B中δ2.6和δ3.2之间显示了AEM的信号峰。如图2D所示，PLG的信号峰分别在δ0.6至δ2.2之间以及δ3.2至δ4.4之间。1HNMR的结果(图2E)显示了HA(δ1.9)，PLG(δ0.6-2.2、δ3.2-4.4)和PEI(δ2.4-3.2)的特征信号，从而证明了HA-PLG-PEI的成功合成。HA与PEI的计算重量比为1:11。
此外，红外光谱(图2G)表明了HA-PEI和HA-P-PEI中的HA的羟基特征吸收峰在3380nm处，PEI中NH的伸缩振动峰在3100nm和3300nm之间，该信号峰在HA与PEI络合后变弱。
试验例2、纳米系统载药胶束的制备和表征
1、试验方法
本试验例中，聚合物分别为实施例1制备的HA-P-PEI、对比例1制备的HA-PEI以及原料PEI。
载siRNA的胶束络合物的制备：将10μL siRNA溶液(在浓度为0.1％的焦碳酸二乙酯水溶液中，siRNA的浓度为20μM)与90μL聚合物溶液(在浓度为0.1％的焦碳酸二乙酯水溶液中，聚合物的浓度为0.1μg/μL)缓慢混合，并在25℃下静置30分钟，即得载siRNA的胶束络合物(聚合物/siRNA络合物)。
将聚合物/siRNA络合物样品加入提前配制的含有溴化乙锭(EtBr，1μg/mL)琼脂糖凝胶(1.0％)上样孔中，并在Tris-borate-EDTA(TBE)缓冲溶液中120V电压下电泳15分钟。此外，用蒸馏水稀释胶束络合物之后，用动态光散射(Nano-ZS90，Malvern Instruments，UK)在25℃下测量siRNA胶束络合物的粒度和电位。此外，使用透射电子显微镜(JEM-2100Plus，JEOL，日本)观察被磷钨酸钠进行负染色的siRNA胶束络合物(纳米颗粒)的尺寸和形态。为了研究HA-P-PEI/siRNA纳米颗粒的MMP-2敏感性，将0.1mL的纳米颗粒(0.1μg/mL)和0.1mL溶于HEPES缓冲液(0.6μg/mL，pH 7.4)中的MMP-2溶液混合并在37℃下孵育。分别在0、2、6、16、24和48h后进行动态光散射测试。在孵育6h后进行透射电子显微镜测试。
2、试验结果
聚合物对siRNA的包载能力通过琼脂糖凝胶电泳评价，结果如图3A-C所示。结果表明，本发明纳米系统可以成功地包裹siRNA并形成稳定的HA-P-PEI/siRNA纳米络合物。
HA-PEI/siRNA和HA-P-PEI/siRNA络合物的分散和形态通过透射电子显微镜进行成像(图3D和E)。几乎都是球形的。这表明HA-PEI和HA-PEI聚合物可以通过静电吸引作用与siRNA相互作用，从而凝聚siRNA形成纳米复合物。络合物的粒径大小和Zeta电位用动态光散射进行测量(图3G和H)。测量结果表明HA-PEI/siRNA和HA-P-PEI/siRNA纳米颗粒的大小约为200nm。当将HA-P-PEI/siRNA暴露于MMP-26h后，透射电镜分析(图3F)结果显示颗粒的原始形状破裂为大小不一的颗粒。动态光散射结果(图3I)还表明，一些纳米颗粒变成了粒径小于10nm的非常小的颗粒。此外，Zeta电位测量表明HA-PEI/siRNA和HA-P-PEI/siRNA的表面电荷分别从37.6mV降至16.4mV和6.89mV。
试验结果说明：本发明纳米系统可以成功地包裹siRNA并形成稳定的纳米络合物。
试验例3、负载siRNA的纳米系统在血清中的稳定性测定
1、试验方法
络合物在血清中的稳定性通过将其与血清溶液一起孵育来测定。简而言之，按试验例2所述方法制备PEI/siRNA，HA-PEI/siRNA和HA-P-PEI/siRNA络合物后将其与胎牛血清(FBS)按1：1(v/v)的比例在37℃下孵育。在孵育0、1、3、6、8和24小时后，将1μL肝素溶液(12kDa，12500IU；天津生化制药有限公司，中国)加入到络合物溶液中使siRNA和聚合物的络合物解离。如试验例2所述方法，通过凝胶电泳方法测试。
2、试验结果
游离的siRNA以及PEI/siRNA，HA-PEI/siRNA和HA-P-PEI/siRNA络合物的稳定性通过将其与FBS在37℃下孵育进行测定。在不同时间间隔通过凝胶阻滞实验对siRNA的降解进行研究。如图3J所示，聚合物/siRNA络合物可以保存siRNA长达24小时，而游离的siRNA的条带在3h后则无法观测了。
试验结果说明：本发明纳米系统与siRNA形成络合物后可以保护siRNA在血清中具有良好的稳定性。
试验例4、本发明纳米系统的细胞毒性测试
1、试验方法
采用MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四唑溴化物)测试聚合物的细胞毒性。将NCI-H1975细胞接种到96孔板中(每孔4000个细胞)。在其贴壁生长24小时后，将细胞与不同浓度的PEI，HA-PEI和HA-P-PEI溶液共同孵育培养48小时。然后，将20μLMTT(5mg/mL)溶液添加到每个孔中，并孵育3小时。此后，将沉淀物溶解在100μLDMSO中，并使用酶标仪(ReadMax 1200，上海，中国)在570nm处测量吸光度。
2、试验结果
细胞毒性测试结果如图4所示：在孵育48小时后，经10μg/mLPEI处理的NCI-H1975细胞的细胞活力明显低于使用相同浓度HA-PEI和HA-P-PEI处理的细胞的细胞活力。此时，PEI的抑制率为58.62％。HA-PEI的抑制率为28.57％(P<0.01vs PEI)。HA-P-PEI的抑制率为12.37％(P<0.001vs PEI)。当聚合物的浓度为20μg/mL时，PEI的抑制率达到81.86％，而HA-PEI的抑制率为77.24％，HA-P-PEI的抑制率为53.76％。HA-PEI和HA-P-PEI的抑制率明显低于PEI的抑制率(P<0.01)。结果表明将HA-AEM与PEI-PLG的偶联得到的本发明HA-P-PEI显著降低了PEI的细胞毒性。
试验例5、体外细胞摄取试验
1、试验方法
分别用流式细胞仪(美国Invitrogen公司)和荧光显微镜(Nikon Eclipse Ts2R公司，日本)评价聚合物/siRNA络合物的细胞摄取效率。
按照试验例2所述方法，将FAM标记的siRNA制备成胶束络合物，并将NCI-H1975细胞接种到12孔板中，每个孔中细胞为12×104个。将其在含有10％的FBS的RPIM培养基中孵育至70％-80％汇合度。此后，更换培养液，将FAM-siRNA、PEI/FAM-siRNA、HA-PEI/FAM-siRNA和HA-P-PEI/FAM-siRNA络合物(100nM)加入到细胞中并在37℃下培养4小时。将未经处理的细胞用作阴性对照。此后，在胰蛋白酶消化后收集细胞，并用冷的PBS溶液洗涤3次之后测量其荧光强度。最后，将细胞重新悬浮于500μLPBS溶液中，并使用流式细胞仪(Invitrogen，美国)进行分析。
此外，将CY3标记的siRNA采用相同方法制备成胶束。按照上述方法，将游离的Cy3-siRNA、PEI/Cy3-siRNA，HA-PEI/Cy3-siRNA和HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物(100nM)加入到细胞中，在37℃下共同孵育4小时后，将细胞用冷的PBS洗涤3次后用Hoechst 33342染色(Abcam，USA)20分钟并洗涤。使用荧光显微镜(Nikon Eclipse Ts2R，日本)拍摄照片。
2、试验结果
细胞对纳米络合物的摄取通过荧光显微镜和流式细胞术进行检测。将具有红色荧光的Cy3标记的siRNA加载到不同的聚合物中，并将其与NCI-H1975细胞在37℃下孵育4h。细胞核被Hoechst 33342染色(蓝色荧光)。如图5A所示，游离的Cy3标记的siRNA基本没有被细胞摄取，只有少量的游离的Cy3标记的siRNA穿透进入了细胞；而经PEI/Cy3-siRNA，HA-PEI/Cy3-siRNA和HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物处理的细胞中可以观测到显著的Cy3-siRNA的荧光信号(红色)，此时红色的荧光信号主要分布在细胞核中，说明PEI/Cy3-siRNA，HA-PEI/Cy3-siRNA和HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物能够很好被细胞摄取。
为了定量评估其在细胞中的摄取效率，本研究进行了流式细胞测定，结果如图5B所示：游离的FAM-siRNA几乎没有被细胞摄取；而PEI/Cy3-siRNA，HA-PEI/Cy3-siRNA和HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物能够很好的被细胞摄取。
试验例6、肿瘤球穿透实验
1、试验方法
肿瘤细胞球具有可以模拟体内肿瘤微环境，直观且可控的优点。H1975球体使用悬滴法制备。将NCI-H1975细胞制备成1×105个/mL的单细胞悬液，分散在2mL的RPMI 1640培养基中后与1mL的1.2％甲基纤维素溶液混合。将此悬浮液滴在培养皿的盖上。在孵育72小时后肿瘤细胞球体长到直径为200μm左右时，将其转移到由2％琼脂糖预处理过的48孔板中。为了评估纳米系统的穿透效果，将游离Cy3-siRNA、PEI/Cy3-siRNA、HA-PEI/Cy3-siRNA、HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物和HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物与MMP-2(将MMP-2溶于HEPES缓冲液中，浓度为1μg/mL)加入其中。培养4小时后，将含有肿瘤细胞球的培养液收集并离心(300rpm)。将沉淀物用冷的PBS溶液洗涤3次，并转移到共聚焦培养皿中(无锡市耐斯特生物技术有限公司，中国)。使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM880，卡尔·蔡司，德国)拍摄不同深度的照片。与此同时，使用ImageJ软件分析荧光强度。
2、试验结果
肿瘤细胞球模型可以准确的反映纳米系统在实体肿瘤深层区域的穿透能力。可以更好的模拟体内。不同纳米系统在H1975肿瘤球体不同深度的影响如图6A和6B所示。游离的siRNA和PEI/siRNA在30和60μm的深度的穿透力增加，这是因为游离的siRNA具有的小粒径，PEI具有的正电位。但是随着深度增加，游离的siRNA和PEI/siRNA基本丧失穿透能力。而HA-PEI/siRNA络合物的穿透能力优于PEI/siRNA，但随着深度增加穿透能力也逐渐减弱；HA-P-PEI/siRNA络合物的穿透能力优于HA-PEI/siRNA；而经过MMP-2孵育的HA-P-PEI/siRNA纳米系统(同时加入HA-P-PEI/Cy3-siRNA络合物与MMP-2组)在实体肿瘤球中的穿透性最好。
试验例7、PD-L1 siRNA纳米复合物的基因沉默效应
1、试验方法
PD-L1 siRNA在NCI-H1975细胞中的基因沉默效率由实时定量PCR(qRT-PCR)进行测定。将NCI-H1975细胞接种到6孔板中(24×104个/孔)，并在37℃的条件下孵育24h。然后，用1.8mL新鲜的完全培养基替换先前的培养基，并将HA-PEI/PD-L1-siRNA和HA-P-PEI/PD-L1-siRNA络合物(100nM)加入其中。将PBS和阴性对照(NC)siRNA用作阴性对照，而LipofectamineTM 3000用作阳性对照。在孵育6小时后，再次用完全培养基替换之前的培养基。在转染24小时后，提取总的mRNA，并使用Evo M-MLV RT试剂盒(中国北京AccurateBiotechnology Co.，Ltd.)进行逆转录。RT-PCR的测定使用RT-PCR系统(Q2000A，中国杭州龙基因科学仪器有限公司)和SYBR qPCRMaster Mix(中国，南京，Vazyme)共同完成。GAPDH和PD-L1的引物如下：GAPDH-上游引物：GGAGCGAGATCTCTCTCCAAAAT，GAPDH-下游引物：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG，PD-L1-上游引物：GCCGAAGTCATCTGGACAAGC，以及PD-L1-下游引物：GTGTTGATTCTCAGTGTGCTGGTCA。扩增为40个循环，每个循环为95℃下进行10s，60℃下进行30s，在95℃下进行300s。将人类的GAPDH用作内参。将获得的数据在统计分析之前进行标准化。
SEQ ID NO.4：GGAGCGAGATCTCTCTCCAAAAT
SEQ ID NO.5：GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG
SEQ ID NO.6：GCCGAAGTCATCTGGACAAGC
SEQ ID NO.7：GTGTTGATTCTCAGTGTGCTGGTCA
在PD-L1 siRNA被如前所述的处理48小时之后，用蛋白质印迹分析法测量蛋白质水平的转染效率。用RIPA裂解缓冲液(中国，Beyotime)裂解细胞。使用10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳在电泳系统(Bio-Rad，里士满，加利福尼亚，美国)上分离蛋白质。将蛋白质转移到NC膜上，并在5％脱脂牛奶中孵育1h。接下来，将膜与抗PD-L1抗体(1：1000，美国Abcam，美国)和抗钙粘蛋白抗体(1：1000，美国Abcam，美国)一起在4℃下过夜孵育。最后，用吐温洗涤剂和磷酸盐缓冲溶液将膜清洗3次，并按1：5000的比例与抗兔免疫球蛋白G的二抗共同孵育1小时。
2、试验效果
本研究利用PD-L1 siRNA对NCI-H1975细胞中mRNA和蛋白质水平进行分析。就RT-PCR分析而言，分别用PEI/PD-L1 siRNA，HA-PEI/PD-L1 siRNA和HA-P-PEI/PD-L1 siRNA对NCI-H1975细胞进行转染，24h后测定。此实验中，Lipo3000/NC siRNA和Lipo3000/PD-L1siRNA分别被用作阴性和阳性对照。如图7A所示，经由Lipo3000/PD-L1 siRNA、PEI/PD-L1siRNA，HA-PEI/PD-L1 siRNA和HA-P-PEI/PD-siRNA处理过的细胞中，PD-L1 mRNA的表达均出现了降低。而Lipo3000/NC siRNA对细胞中PD-L1沉默效应可忽略不计。
就蛋白质印迹分析而言，用聚合物/PD-L1 siRNA对NCI-H1975细胞进行转染，48h后测定。其结果与RT-PCR结果一致。图7B中的结果表明，与对照相比，HA-P-PEI/PD-L1siRNA处理后PD-L1蛋白表达水平显著下调。
综上，本发明提供了一种具有MMP-2敏感的siRNA纳米递送系统HA-P-PEI，该纳米递送系统可以有效包裹siRNA并形成稳定的纳米络合物，有利于siRNA在体内递送。同时，该递送系统能够有效被肿瘤细胞摄取。更重要的是该递送系统对实体瘤有良好的渗透能力，特别是经过MMP-2处理的该递送系统对实体瘤的渗透能力有显著提高，克服了现有技术中siRNA药物对实体瘤渗透作用差的问题。该纳米系统载PD-L1-siRNA后可有效下调PD-L1在肿瘤细胞中的表达。本发明纳米递送系统作为药物载体，为siRNA的递送和提高肿瘤渗透提供了一种新的方法，为其未来在癌症治疗中的临床应用提供了新的途径。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川大学华西医院
<120> 一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统及其制备方法和用途
<130> GYKH1094-2021P0113145CC21JS017
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<170> PatentIn version 3.5
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<212> PRT
<213> 人工序列
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1 5
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<213> 人工序列
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uucuccgaac gugucacgut t 21
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<212> DNA
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acgugacacg uucggagaat t 21
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ggagcgagat ctctctccaa aat 23
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<212> DNA
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gtgttgattc tcagtgtgct ggtca 25

Claims (10)

1.一种基质金属蛋白酶2敏感的纳米系统，其特征在于：它由如下重量配比的原料制备而成：HA-AEM 1～5份，PEI-PLG 10～50份；
所述HA-AEM由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸盐1～4份，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐1～2份；
所述PEI-PLG由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺10～40份，寡肽GPLGLAGC 1～2份。
2.根据权利要求1所述的纳米系统，其特征在于：它由如下重量配比的原料制备而成：HA-AEM 1份，PEI-PLG 20份；
所述HA-AEM由如下重量配比的原料制备而成：透明质酸盐2份，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐1份；
所述PEI-PLG由如下重量配比的原料制备而成：聚乙烯亚胺20份，寡肽GPLGLAGC 1份。
3.根据权利要求1或2所述的纳米系统，其特征在于：所述聚乙烯亚胺为具有支链结构的聚乙烯亚胺；
和/或，所述透明质酸盐为透明质酸钠。
4.根据权利要求1或2所述的纳米系统，其特征在于：所述HA-AEM的制备方法为：在催化剂作用下，N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐的氨基与透明质酸盐的羧基反应而得；
和/或，所述PEI-PLG的制备方法为：在催化剂作用下，寡肽GPLGLAGC的羧基与聚乙烯亚胺的氨基反应而得。
5.根据权利要求4所述的纳米系统，其特征在于：所述HA-AEM的制备方法包括如下步骤：
(1)将透明质酸盐溶于水中，得到HA溶液；
(2)将N-(2-氨乙基)马来酰亚胺盐酸盐溶于水中，得到AEM溶液；
(3)将步骤(1)和步骤(2)得到的溶液混合后加入催化剂量的催化剂，调节pH至6.5，常温反应，得反应液；
(4)将反应液透析后冷冻干燥，即得；
优选地，步骤(3)中，所述催化剂为EDC和HOBt，质量比为(1～2)：1；和/或，步骤(4)中，所述透析为将反应液置于分子量为30KD的透析袋中透析。
6.根据权利要求4所述的纳米系统，其特征在于：所述PEI-PLG的制备方法包括如下步骤：
(a)将寡肽GPLGLAGC溶于水中，得PLG溶液；
(b)将聚乙烯亚胺溶于水中，得PEI溶液；
(c)将催化量的催化剂加入PLG溶液中，再将PEI溶液加入PLG溶液中，调节pH至6.0，常温反应，得反应液；
(d)将反应液透析后冷冻干燥，即得；
优选地，步骤(c)中，所述催化剂为EDC和NHS，质量比为(1～2)：1；
和/或，步骤(d)中，所述透析为将反应液置于分子量为35KD的透析袋中透析。
7.一种制备权利要求1～6任一项所述的纳米系统的方法，其特征在于：它包括如下步骤：
(A)将HA-AEM和PEI-PLG溶于溶剂中反应，得反应液；
(B)将反应液透析后冷冻干燥，即得；
优选地，步骤(A)中，所述溶剂为PBS溶液；和/或，步骤(A)中，所述反应为室温下反应；和/或，步骤(B)中，所述透析为将反应液置于分子量为35KD的透析袋中透析。
8.权利要求1～6任一项所述的纳米系统作为药物载体在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
9.一种药物，其特征在于：它是由权利要求1～6任一项所述的纳米系统为药物载体，载siRNA的药物；优选地，所述siRNA为PD-L1 siRNA。
10.根据权利要求9所述的药物，其特征在于：所述药物是经过MMP-2处理的药物，所述经过MMP-2处理的处理方法为将药物与MMP-2溶液孵育后而得。
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