TWI601536B - 循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體及其製備方法 - Google Patents

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Description

循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體及其製備方法
本發明係關於一種用於遞送藥物的奈米載體，特別係關於一種循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體、包含該循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體之醫藥組成物、及其製備方法。
近年來，許多奈米技術領域的研究係聚焦於開發奈米載體作為疾病治療或診斷的活體內藥物遞送平台，特別是用於遞送抗癌藥物。奈米載體的研發目標包含增進其安全性與生物相容性、藥物遞送的高專一性、高藥物包覆率與釋放率、奈米載體的高穩定性等，使藥物在運送過程中被穩定包覆於奈米載體，並於送達目標細胞後被徹底釋放，以提升藥物作用於目標細胞的濃度及減少對其他正常組織造成的毒副作用。然而，目前已知的奈米載體往往受限於材料或設計，難以兼具前列所有優點。
舉例而言，由脂質構成的微脂體(liposome)雖具有良好的生物相容性與生物可降解性而成為目前市面上主要的抗癌藥物載體，然而其血液中穩定性不佳，在藥物傳輸過程中會因為藥物自微脂體流失，導致噁心、嘔吐、食慾不振、掉髮等副作用。雖有研究顯示在奈米載體表面添加聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)修飾能減少單核吞噬細胞系統(mononuclear phagocytic system)將其自血液中清除，延長其血中循環半生期及提高其穩定性，但經聚乙二醇修飾的微脂體表現出較低細胞吞噬率，即使被目標細胞吞噬，由於缺少促進藥物自微脂體釋放的機制，亦會導致藥物釋放不完全，因此降低藥物作用濃度。
再者，為提升奈米載體對目標細胞的專一性，現行策略之一係將主動標靶分子(active targeting molecule)連接至奈米載體表面，例如單株抗體、適合體(aptamer)、胜肽、及小分子等，使主動標靶分子與目標細胞表面的特定受體(receptor)結合。然而，暴露的主動標靶分子亦會與非目標細胞的表面分子結合，導致藥物被遞送至錯誤細胞，因而造成毒副作用。
緣此，本發明之一目的在提供一種循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體，係具有一親水性聚合物外壁及一多胜肽核心的構造，該多胜肽核心由外向內包含一保護殼層及一加速崩解層，該構造包含依長軸對齊且交錯分布的複數個長鏈多胜肽共聚物及複數個短鏈多胜肽共聚物，其中該長鏈多胜肽共聚物由該親水性聚合物外壁向該多胜肽核心依序包含一長鏈親水性聚合物及一第一多胜肽，且該短鏈多胜肽共聚物由該親水性聚合物外壁向該多胜肽核心依序包含一短鏈親水性聚合物及一第二多胜肽，其中該長鏈親水性聚合物與該第一多胜肽以一酸不穩定鍵結連接，且該短鏈親水性聚合物在靠近該親水性聚合物外壁一端連接一主動標靶分子，其中該第一與第二多胜肽由外向內依序包含一酸性胺基酸鏈段、一酸敏感性胺基酸鏈段、及一疏水性胺基酸鏈段，且該第一與第二多胜肽之胺基酸序列相同，該多胜肽核心的保護殼層係為一酸可溶性礦化保護殼層，由沉積於該酸性胺基酸鏈段的一酸可溶性礦物構成，該加速崩解層由該酸敏感性胺基酸鏈段構成。
本發明亦提供另一種循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體，係具有一親水性聚合物外壁及一多胜肽核心的構造，該多胜肽核心由外向內包含一保護殼層及一加速崩解層，該構造包含依長軸對齊且交錯分布的複數個長鏈多胜肽共聚物及複數個短鏈多胜肽共聚物，其中該長鏈多胜肽共聚物由該親水性聚合物外壁向該多胜肽核心依序包含一長鏈親水性聚合物及一第一多胜肽，且該短鏈多胜肽共聚物由該親水性聚合物外壁向該多胜肽核心依序包含一短鏈親水性聚合物及一第二多胜肽，其中該長鏈親水性聚合物與該第一多胜肽以一酸不穩定鍵結連接，且該短鏈親水性聚合物在靠近該親水性聚合物外壁一端連接一主動標靶分子，其中該第一與第二多胜肽由外向內依序包含一半胱胺酸(cysteine)鏈段、一酸敏感性胺基酸鏈段、及一疏水性胺基酸鏈段，且該第一與第二多胜 肽之胺基酸序列相同，該多胜肽核心的保護殼層係為一氧化還原敏感性保護殼層，包含相鄰長、短鏈多胜肽共聚物的半胱胺酸鏈段間之複數個雙硫鏈，該加速崩解層由該酸敏感性胺基酸鏈段構成。
在本發明之一實施例中，該循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體的粒徑係為100-200nm，且該長鏈多胜肽共聚物及該短鏈多胜肽共聚物之分布莫耳比約為1：2至2：1。
在本發明之一實施例中，該酸敏感性胺基酸鏈段係由一側鏈(side chain)之酸解離平衡常數(pKa)約為6的胺基酸組成，如組胺酸(histidine)。在一較佳實施例中，該酸性胺基酸鏈段由10-20個穀胺酸(glutamic acid)組成，該酸敏感性胺基酸鏈段由5-15個組胺酸組成，及該疏水性胺基酸鏈段由5-15個亮胺酸(leucine)組成。
在本發明之一實施例中，該酸不穩定鍵結係為一在pH 6.5~7下發生水解的鍵結，例如由烏頭酸酐(aconitic anhydride)提供。
在本發明之一實施例中，該酸可溶性礦物為磷酸鈣(calcium phosphate)或碳酸鈣(calcium carbonate)。
本發明之另一目的在提供一種前述循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體的製備方法，包含：(a)以化學接枝法分別製備一長鏈多胜肽共聚物及一短鏈多胜肽共聚物，其中該長鏈多胜肽共聚物包含一長鏈親水性聚合物及一第一多胜肽，該短鏈多胜肽共聚物包含一短鏈親水性聚合物及一第二多胜肽，其中該長鏈親水性聚合物與該第一多胜肽以一酸不穩定鍵結連接，且該短鏈親水性聚合物的末端連接一主動標靶分子，其中該第一與第二多胜肽依序包含一酸性胺基酸鏈段、一酸敏感性胺基酸鏈段、及一疏水性胺基酸鏈段，且該第一與第二多胜肽之胺基酸序列相同；(b)在一極性溶液中混合該長鏈多胜肽共聚物及該短鏈多胜肽共聚物以自我聚合形成一多胜肽奈米載體；(c)在含有該多胜肽奈米載體的極性溶液中加入一陽離子水溶液及一陰離子水溶液以形成一第一層酸可溶性礦化保護殼層後，再以複數次數加入該陽離子水溶液及該陰離子水溶液，以形成多層的酸可溶性礦化保護殼層，使該酸可溶性礦化保護殼層逐層沉積於該多胜肽奈米載體的酸性胺基酸鏈段，以獲得該帶殼多胜肽奈米載體。
在本發明之一實施例中，步驟(a)之該第一與第二多胜肽之酸性胺基酸鏈段由10-20個酸性胺基酸組成，該酸敏感性胺基酸鏈段由5-15個酸敏感性 胺基酸組成，及該疏水性胺基酸鏈段由5-15個疏水性胺基酸組成，且該酸敏感性胺基酸鏈段係由一側鏈之酸解離平衡常數(pKa)約為6的胺基酸組成，該酸性胺基酸鏈段係為穀胺酸、天冬胺酸或其組合，同時，該酸不穩定鍵結係為一在pH 6.5~7下發生水解的鍵結；步驟(b)之該長鏈多胜肽共聚物及該短鏈多胜肽共聚物以莫耳比約1：2至2：1混合；步驟(c)之該陽離子水溶液為鈣離子水溶液，該陰離子水溶液為磷酸根水溶液或碳酸根水溶液，且該複數次數為約至少5次。
本發明之又一目的在提供一種醫藥組成物，包含前述循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體及位於該帶殼多胜肽奈米載體之一多胜肽核心的一疏水性藥物，例如用於抗腫瘤之可嵌入DNA之艾黴素(doxorubicin)、血管新生抑制劑、腫瘤轉移抑制劑等，又例如用於追蹤腫瘤分布的顯影劑。
本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體因為利用具生物相容性且生物可降解之材料設計而成，將其施用於細胞或活體時具有低細胞毒性、可安全使用之優點。
本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體之構造因環境而異，在pH 7.4之生理條件下，能以完整而緊密的構造穩定存在，例如穩定存在血液中，然在pH值小於7的酸性環境中，例如腫瘤組織或細胞內的內體(endosome)及溶酶體(lysosome)系統，其構造會隨pH值的降低而逐漸崩解。因此，本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體具有pH敏感性，其藉由如下設計：(1)位於長鏈多胜肽共聚物中長鏈親水性聚合物與第一多胜肽間的酸不穩定鍵結，(2)形成於長、短鏈多胜肽共聚物中酸性胺基酸鏈段的酸可溶性礦化保護殼層，以及(3)長、短鏈多胜肽共聚物中的酸敏感性胺基酸鏈段，達到順應pH值改變而循序崩解的目標。此外，當本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體的保護殼層為氧化還原敏感性保護殼層，其可同時順應環境中pH值及氧化還原狀態的變化，例如細胞內體的酸性環境及細胞內較高還原性環境，而達到循序崩解的目標。
本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體用於包覆藥物的優點之一在於提升了奈米載體的結構穩定性，特別是為了避免其於注射至活體的瞬間崩解、延長其完整存在於血液循環中的時間、防止藥物未達目標即自奈米載體過早釋放等目的，本發明帶殼多胜肽奈米載體具有一保護殼層，係藉由長、短鏈多胜肽共聚物中多胜肽的酸性胺基酸鏈段帶負電的特性，使酸可溶性礦物沉積其上而形成一酸可溶性礦化保護殼層，或者藉由相鄰長、短鏈多胜肽共聚物 的半胱胺酸鏈段間所形成雙硫鏈，而構成一氧化還原敏感性保護殼層。同時，為確保所包覆藥物能在腫瘤組織的目標細胞內完全釋放，本發明帶殼多胜肽奈米載體藉由前述之多重pH敏感性或氧化還原敏感性設計，達到循序崩解、加速藥物於目標細胞內釋放之目的。
再者，本發明帶殼多胜肽奈米載體在短鏈多胜肽共聚物的短鏈親水性聚合物末端連接一主動標靶分子，能增加腫瘤組織中目標細胞對奈米載體的攝取。為避免該主動標靶分子在遞送過程中與非目標細胞結合，本發明帶殼多胜肽奈米載體之設計將該主動標靶分子包埋在長鏈多胜肽共聚物的長鏈親水性聚合物中，只有在帶殼多胜肽奈米載體到達弱酸性的腫瘤組織，使長鏈多胜肽共聚物因酸不穩定鍵結斷裂而脫去其長鏈親水性聚合物，短鏈多胜肽共聚物末端的主動標靶分子才會暴露並且被目標細胞辨識。依此方式，將可有效預防主動標靶分子過早與非目標細胞結合，因此避免藥物被遞送至錯誤細胞而造成的毒副作用。同時，本發明帶殼多胜肽奈米載體因為上述長鏈多胜肽共聚物在腫瘤組織脫去長鏈親水性聚合物，可提高目標細胞對其吞噬率。
以下將配合圖式進一步說明本發明的實施方式，下述所列舉的實施例係用以闡明本發明之發明特點及應用，而非以限定本發明之範圍，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可做些許更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。
圖1係為本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體的長、短鏈多胜肽共聚物與疏水性藥物自我聚合形成包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的示意圖。
圖2係為本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體在腫瘤組織順應環境pH值變化而循序崩解的示意圖。
圖3A係比較長鏈多胜肽共聚物各階段合成產物的1H NMR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG3400、PEG3400-烏頭酸、及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜。
圖3B係比較短鏈多胜肽共聚物各階段合成產物的1H NMR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG1100、PEG1100-DSS、PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10、及LyP-1胜肽-PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜。
圖4A係比較長鏈多胜肽共聚物及其構成單元的FT-IR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG3400、多胜肽E15-H10-L10、及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜。
圖4B係比較無LyP-1胜肽之短鏈多胜肽共聚物及其構成單元的FT-IR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG1100、DSS、多胜肽E15-H10-L10、及PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜。
圖5係為長鏈多胜肽共聚物中酸不穩定烏頭酸鍵結在不同pH的水解曲線。
圖6A-6F係為本發明包覆艾黴素(DOX)且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體的穿透式電子顯微鏡影像，其中，圖6A-6B為該奈米載體在pH 7.4之影像，圖6C-6F分別為該奈米載體在pH 5下經過20分鐘、40分鐘、1小時、及約4小時之影像；圖6A、6C、6D之比例尺表示0.5μm，圖6B之比例尺表示100nm，圖6E-6F之比例尺表示1μm。
圖7係為不具有保護殼層之包覆DOX之多胜肽奈米載體(DOX NP)與本發明包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP)在不同pH的DOX累積釋放曲線。
圖8A係為人類乳腺癌細胞MDA-MB-231經不含LyP-1胜肽(M-DOX NP w/o LyP-1)或本發明包含LyP-1胜肽(M-DOX NP w/ LyP-1)之包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體處理4小時後之螢光顯微鏡影像；圖中比例尺表示50μm。
圖8B係為活化的人類臍靜脈內皮細胞經不含LyP-1胜肽(M-DOX NP w/o LyP-1)或本發明包含LyP-1胜肽(M-DOX NP w/ LyP-1)之包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體處理4小時後之螢光顯微鏡影像；圖中比例尺表示50μm。
圖9係為人類乳腺癌細胞MDA-MB-231經不含LyP-1胜肽(M-DOX NP w/o LyP-1)或本發明包含LyP-1胜肽(M-DOX NP w/ LyP-1)之包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體或鹽酸艾黴素(DOX．HCl)處理24小時後之細胞存活率。
圖10係為本發明包覆拉春庫林B(latrunculin B)與GM6001且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體抑制人類乳腺癌細胞MDA-MB-231入侵的螢光顯微鏡影像；圖中虛線標示出乳腺癌細胞的初始分布區域與其入侵區域之界線，比例尺表示200μm。
本發明提供一種循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體及其製備方法。在以下實施例中，首先以化學接枝(chemical grafting)分別製備具有雙親性(amphiphilic)的長鏈及短鏈多胜肽共聚物。該長鏈多胜肽共聚物包含一長鏈親水性聚合物及一第一多胜肽，該短鏈多胜肽共聚物包含一短鏈親水性聚合物及一第二多胜肽，該第一與第二多胜肽依序包含一酸性胺基酸鏈段、一酸敏感性胺基酸鏈段、及一疏水性胺基酸鏈段且第一與第二多胜肽之胺基酸序列相同。同時，長鏈多胜肽共聚物包含一連接長鏈親水性聚合物與第一多胜肽的酸不穩定鍵結，如在pH 6.5~7下發生水解的烏頭酸鍵結(aconityl linkage)，短鏈多胜肽共聚物之短鏈親水性共聚物末端包含一主動標靶分子，如LyP-1胜肽。
接著，在極性溶液中混合該長鏈及短鏈多胜肽共聚物與疏水性藥物，該長鏈及短鏈多胜肽共聚物會自我聚合為包覆藥物之多胜肽奈米載體，其具有一親水性聚合物外壁及一多胜肽核心。其後，先使包覆藥物之多胜肽奈米載體溶於水，再分次加入一陽離子水溶液及一陰離子水溶液，使酸可溶性礦物(如磷酸鈣)經由礦化反應逐層沉積於該包覆藥物之多胜肽奈米載體的酸性胺基酸鏈段，即形成帶有酸可溶性礦化保護殼層的包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體，此即本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體包覆藥物之一實例。經實驗分析該包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體，證實其具有水溶液中的高穩定性、高藥物包覆率、多重pH敏感性，其能順應環境中pH值的變化逐步崩解，有效被細胞攝取且具有細胞內之高藥物釋放率，並且在細胞實驗中表現出顯著的腫瘤抑制效果及腫瘤轉移抑制效果。故，本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體可包覆一疏水性藥物以製備一醫藥組成物。
本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體以其多胜肽核心包覆疏水性藥物，例如抗癌藥物或顯影劑，參見圖1之示意圖。在生理條件之pH 7.4下，本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的酸敏感性胺基酸鏈段不帶電，因此酸 敏感性胺基酸鏈段會與疏水性胺基鏈段一同提供包覆疏水性藥物所需的疏水性。當施用粒徑約為100-200nm的本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體於活體，如圖2所示，推測其可經由血液循環、透過高滲透長滯留效應(enhanced permeability and retention effect，EPR)穿過腫瘤血管孔隙(約一百至數百奈米)而專一性地累積在腫瘤組織。由於腫瘤組織為pH 6.5-7.0之弱酸性環境，該包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體中連接長鏈親水性聚合物與第一多胜肽的酸不穩定鍵結會於此時水解斷裂，導致包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體脫去長鏈多胜肽共聚物中的長鏈親水性聚合物，大幅暴露出鄰近短鏈多胜肽共聚物中短鏈親水性聚合物末端的主動標靶分子。同時，位於長、短鏈多胜肽共聚物中酸性胺基酸鏈段的酸可溶性礦化保護殼層亦會開始略為溶解。當該暴露的主動標靶分子與腫瘤組織的目標細胞表面受體結合，使該包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體經由受體介導細胞內吞(receptor-mediated endocytosis)進入目標細胞之內體後，早期內體(early endosome)之pH 6.0-6.5的酸性環境會促使酸可溶性礦化保護殼層進一步溶解，並且使長、短鏈多胜肽共聚物中的酸敏感性胺基酸鏈段發生質子化(protonation)，由此產生的密集正電荷會彼此排斥而造成包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的體積膨脹與結構鬆散，故促進所包覆藥物之釋放。當該結構鬆散的包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體繼續進入晚期內體(late endosome)而遭遇pH 5.0-5.5的環境，甚至因為晚期內體與溶酶體結合而使環境pH值降至4.5-5.0時，包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的酸可溶性礦化保護殼層將完全溶解，且多胜肽奈米載體本身亦徹底崩解為構成分子，使藥物能被完全釋出。
定義
本文中所使用數值為近似值，所有實驗數據皆表示在20%的範圍內，較佳為在10%的範圍內，最佳為在5%的範圍內。
本文中所謂「疏水性藥物」包含用於治療諸如癌症之病症的疏水性藥物，例如抗癌化療藥物之艾黴素(doxorubicin)、紫杉醇(paclitaxel)、順鉑(cisplatin)等，抗腫瘤轉移藥物或因子之基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制劑、血管新生抑制劑、拉春庫林B(latrunculin B)等，基因治療之質體DNA、微型核糖核酸(microRNA，miRNA)、小干擾核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)等，以及用於診斷諸如癌症之病症的疏水性顯 像因子，例如氧化鐵(iron oxide)、螢光基團(fluorophore)、量子點(quantum dot)、碳點(carbon dot)等有機或無機材料或有機-無機混成材料。
材料及方法 材料
由Sigma-Aldrich公司(St.Louis，密蘇里州，美國)購得胺基-(聚乙二醇)-1100-羧基(amine-(polyethylene glycol)-carboxylaic acid，M.W.1100Da，以下簡稱PEG1100)、鹽酸艾黴素(doxorubicin hydrochloride，以下簡稱DOX．HCl，其為艾黴素的水溶性鹽類)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳醯二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)m-carbodiimide，以下簡稱EDC)、N-羥基琥珀醯亞胺(N-Hydroxysuccinimide，以下簡稱NHS)。由NOF公司(東京，日本)購得甲氧基-(聚乙二醇)-胺基(methoxypolyethylene glycol-amine，M.W.3400Da，以下簡稱PEG3400)。由Alfa Aesar公司(Ward Hill，麻薩諸塞州，美國)購得順式烏頭酸酐(cis-aconitic anhydride)、辛二酸二琥珀醯亞胺(Dissucinyl suberate，以下簡稱DSS)。由Pierce Chemical公司(Dallas，德州，美國)購得5% w/v三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid，以下簡稱TNBS)溶液。由Lonza公司(Basel，瑞士)購得螢光染劑DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole)。由Progma公司(Fitchburg，威斯康辛州，美國)購得細胞存活率試驗(MTS assay)之套組CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay 1000 assays。由Abcam公司(Cambridge，英國)購得拉春庫林B(latrunculin B)、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)抑制劑GM6001。由Corning公司(Corning，紐約州，美國)購得基質膠(Matrigel®，Growth Factor Reduced(GFR)Basement Membrane Matrix)。由Cell Biolabs公司(San Diego，加州，美國)購得人類重組基質細胞衍生因子SDF-1α(stromal cell-derived factor 1α，別名CXCL12)。由R&D systems公司(Minneapolis，明尼蘇達州，美國)購得人類重組表皮生長因子EGF(epidermal growth factor)。由Molecular Probes公司(Eugene，奧瑞岡州，美國)購得螢光染劑CellTrackerTM Green CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)。
細胞培養
本發明使用人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231(BCRC H-UV001)及人類臍靜脈內皮細胞株(human umbilical vein endothelial cells，HUVEC，BCRC 60425)於細胞實驗。在37℃、5%CO2下使用培養箱將MDA-MB-231細胞培養於Leibovitz’s L-15培養基(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Waltham，麻薩諸塞州，美國)，該培養基添加10% FBS及1%青黴素與鏈黴素。HUVEC細胞係於相同條件下培養於M199培養基(Gibco，Thermo Fisher Scientific)，該培養基添加10%胎牛血清(fetal bovine serum，以下簡稱FBS，Biological Industrie，Cromwell，康乃狄克州，美國)、1%青黴素與鏈黴素(Gibco，Thermo Fisher Scientific)、30μg/ml內皮細胞生長添加劑(endothelial cell growth supplement，ECGS，Sigma-Aldrich)、及25U/ml肝素(heparin，Sigma-Aldrich)。
統計分析
實驗數據均以平均值±標準偏差(S.D.)表示。統計上顯著差異係以學生T檢定(student’s test)進行分析。*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，N.S.表示無顯著差異。
實施例1 雙親性的長、短鏈多胜肽共聚物之製備
本實施例係舉例說明本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體的主要構成分子，即雙親性的長、短鏈多胜肽共聚物的製備方法。在本發明之一較佳實施例中，長鏈多胜肽共聚物之第一多胜肽與短鏈多胜肽共聚物之第二多胜肽，其共同胺基酸序列由N端至C端為15個穀胺酸、10個組胺酸、及10個亮胺酸，即EEEEEEEEEEEEEEEHHHHHHHHHHLLLLLLLLLL(SEQ ID NO：1)，以下簡稱為多胜肽E15-H10-L10，係購自Genscript公司(Piscataway，紐澤西州，美國)。然，該第一及第二多胜肽的穀胺酸、組胺酸、及亮胺酸的個數係為可變動，其較佳範圍為10-20個穀胺酸、5-15個組胺酸、及5-15個亮胺酸。同時，長鏈多胜肽共聚物之長鏈親水性聚合物與短鏈多胜肽共聚物之短鏈親水性聚合物分別為分子量為3400Da及1100Da的聚乙二醇，以下分別簡稱PEG3400及PEG1100。長鏈多胜肽共聚物中以一酸不穩定的烏頭酸鍵結連接PEG3400與多胜肽E15-H10-L10。短鏈多胜肽共聚物以一穩定而不斷裂的DSS交聯分子(crosslinker)連接PEG1100與多胜肽E15-H10-L10，並於PEG1100末端連接一主動標靶分子LyP-1胜肽。
以下實施例之長鏈多胜肽共聚物為PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10，其合成係分段完成。首先，60μg PEG3400及13.76μg順式烏頭酸酐分別溶於去離子水及1,4-二氧陸圜，將該二溶液混合，經攪拌隔夜，再加入氯仿 (chloroform)與5%碳酸氫鈉的混合物。待移除上述混合溶液之氯仿層，餘下溶液以乙酸乙脂萃取。該萃取液(約5ml)置於截留分子量1000Da的透析膜以1500ml去離子水在攪拌轉速400rpm下進行透析4.5小時，再將透析液冷凍乾燥以獲得PEG3400-烏頭酸的粉末。接著，將PEG3400-烏頭酸、多胜肽E15-H10-L10及用於活化羧酸基之EDC、NHS依莫耳比1：1：10：4溶於去離子水，經攪拌隔夜，該溶液以截留分子量3000Da的纖維膜套管過濾，收集無法通過纖維膜套管的部分再經冷凍乾燥即得PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的粉末。
以下實施例之短鏈多胜肽共聚物為LyP-1胜肽-PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10，其合成係分段完成。先將PEG1100與過量10倍的DSS溶於2ml二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide，以下簡稱DMSO)，在pH 8下攪拌隔夜；再將該溶液逐滴加入20ml的冷乙醚(diethyl ether)，使DMSO與乙醚的體積比為1：10以沉澱出PEG1100-DSS。藉由在5200rpm下離心15分鐘可收集該沉澱，並移除上清液。此沉澱步驟需重複3次以移除未反應的DSS，其終產物以離心濃縮機(miVac Duo，日本)收集。接著，將PEG1100-DSS及多胜肽E15-H10-L10溶於DMSO，在pH 8下以轉速250rpm攪拌隔夜。該溶液移入截留分子量1000Da的透析膜以1500ml去離子水在攪拌轉速400rpm下進行透析4.5小時，再將透析液冷凍乾燥即獲得PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的粉末，儲存於-20℃。
為使本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體具有主動標靶癌組織的能力，將一主動標靶乳癌組織中癌細胞、內皮細胞、及淋巴細胞的胜肽LyP-1以化學接枝方式連接至PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10中PEG1100的末端。該環形胜肽LyP-1係購自Genscript公司(Piscataway，紐澤西州，美國)，其序列為CGNKRTRGC(SEQ ID NO：2)。將PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10、環形胜肽LyP-1及用於活化羧酸基之EDC、NHS依莫耳比1：1：10：4溶於去離子水，以轉速250rpm攪拌隔夜，再將該溶液以截留分子量1000Da的纖維膜套管過濾，收集無法通過纖維膜套管的部分再經冷凍乾燥即得LyP-1胜肽-PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的粉末，儲存於-20℃。
為驗證上述長鏈多胜肽共聚物及短鏈多胜肽共聚物的成功合成，透過分析核磁共振光譜(nuclear magnetic resonance spectrum，以下簡稱NMR光譜)與傅立葉轉換紅外線光譜(Fourier transform infrared spectrum，以下簡稱FT-IR光譜)確認其化學結構。NMR光譜係利用Virian Unity Inova 500 NMR光譜 儀於500MHz測量，待測樣品之配製係將長鏈多胜肽共聚物的各階段合成產物各別溶於重水(D2O)，濃度皆為1mg/ml；短鏈多胜肽共聚物的各階段合成產物中，PEG1100及PEG1100-DSS各別溶於氘代氯仿(CDCl3)，PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10及LyP-1胜肽-PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10各別溶於氘代二甲基亞碸(DMSO-d6)，濃度皆為1mg/ml。FT-IR光譜係利用FT-IR光譜儀Vertex 80v(Bruker，Billerica，麻薩諸塞州，美國)測量，待測樣品之前處理係將上述長、短鏈多胜肽共聚物及其構成單元的粉末壓製成錠。
圖3A係比較長鏈多胜肽共聚物各階段合成產物的1H NMR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG3400、PEG3400-烏頭酸、及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜。在PEG3400、PEG3400-烏頭酸、及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜皆可觀察到聚乙二醇的特徵訊號，即圖3A之a峰；在PEG3400-烏頭酸及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜可觀察到聚乙二醇與烏頭酸酐所形成醯胺鍵(amide)的訊號，即圖3A之b峰；在PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜可觀察到多胜肽的訊號，即圖3A之c-e峰。圖3A中出現在4.8ppm的主峰是重水的訊號。
圖3B係比較短鏈多胜肽共聚物各階段合成產物的1H NMR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG1100、PEG1100-DSS、PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10、及LyP-1胜肽-PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜。在PEG1100、PEG1100-DSS、PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10、及LyP-1胜肽-PEG3400-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜皆可觀察到聚乙二醇的特徵訊號，即圖3B之a峰與b峰；在PEG1100-DSS的光譜可觀察到PEG1100-DSS中NHS的酯類(ester)訊號，即圖3B之c峰，此訊號因PEG1100-DSS與多胜肽結合而在PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜上消失；在PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10及LyP-1胜肽-PEG3400-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜可觀察到多胜肽的訊號；在LyP-1胜肽-PEG3400-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜可觀察到LyP-1胜肽所含胺基酸，如天冬醯胺酸(asparagine)和離胺酸(lysine)的訊號，分別出現在2.6ppm和2.8ppm。圖3B中出現在7.24ppm及2.5ppm的主峰分別是氘代氯仿及氘代二甲基亞碸的訊號。
圖4A係比較長鏈多胜肽共聚物及其構成單元的FT-IR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG3400、多胜肽E15-H10-L10、及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜，箭頭標示出特定吸收峰。在PEG3400及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜 肽E15-H10-L10的光譜可觀察到聚乙二醇於2884cm-1的烷類(alkane)吸收峰以及於1060cm-1的烷基醚(alkyl ether)吸收峰；在多胜肽E15-H10-L10及PEG3400-烏頭酸鍵-多胜肽E15-H10-L10的光譜可觀察到多胜肽於3282.5cm-1的醯胺鍵吸收峰以及其於1626.5cm-1與1656.5cm-1的酯類吸收峰。
圖4B係比較無LyP-1胜肽之短鏈多胜肽共聚物及其構成單元的FT-IR光譜，圖中由上至下依序顯示PEG1100、DSS、多胜肽E15-H10-L10、及PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜，箭頭標示出特定吸收峰。在PEG1100的光譜可觀察到PEG1100於2880cm-1的烷類吸收峰以及其於1102cm-1的烷基醚吸收峰；在多胜肽E15-H10-L10及PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜可觀察到多胜肽於3255cm-1的醯胺鍵吸收峰以及其於1625cm-1與1651cm-1的酯類吸收峰。此外，DSS在1722cm-1、1778cm-1、及1821cm-1的吸收峰消失於PEG1100-DSS-多胜肽E15-H10-L10的光譜。
上述結果顯示，依本實施例之化學接枝方法成功製備得長鏈多胜肽共聚物與短鏈多胜肽共聚物。
實施例2 包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體之製備
本實施例說明由前述長、短鏈多胜肽共聚物及一疏水性藥物，例如抗癌藥物艾黴素(DOX)，製備包覆藥物之多胜肽奈米載體，再藉由礦化反應於該多胜肽奈米載體之多胜肽的帶負電酸性胺基酸鏈段沉積磷酸鈣，以形成包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體。首先，將鹽酸艾黴素(DOX．HCl)與三乙胺(triethylamine)依莫耳比1：3於DMSO中混合，使DOX．HCl之濃度為3.4mM，經攪拌隔夜，再將該溶液加入莫耳比約1：1之長鏈多胜肽共聚物與短鏈多胜肽共聚物的DMSO溶液(長、短鏈多胜肽共聚物濃度皆約為1.34mM)。本發明之一較佳實施例，長、短鏈多胜肽共聚物的莫耳比亦可調整為約1：2或2：1，但不在此限。該混和溶液置於暗處在常溫下攪拌，則長、短鏈多胜肽共聚物會包覆DOX並自我聚合而形成分散於混和溶液中的包覆藥物之多胜肽奈米載體。該混合溶液以截留分子量1000Da的纖維膜套管過濾可移除未被包覆之藥物(如DOX)，再經過冷凍乾燥可獲得包覆藥物(如DOX)之多胜肽奈米載體的粉末，儲存於-20℃。
為提升前述包覆藥物之多胜肽奈米載體的穩定性及減少藥物到達目標組織前之流失，本發明利用該多胜肽奈米載體之多胜肽的酸性胺基酸鏈段帶負電的特性，使酸可溶性礦物逐層沉積其上，例如磷酸鈣、碳酸鈣等。本發明之一較佳實施例係在多胜肽E15-H10-L10的穀胺酸鏈段，逐層形成磷酸鈣的礦化保護殼層。製備方法為緩慢地將0.02M氯化鈣水溶液及0.02M磷酸氫二鈉先後加入前述分散於混和溶液中的包覆藥物之多胜肽奈米載體，過程中持續攪拌。該添加鈣離子水溶液及磷酸根水溶液的步驟重複約至少5次，較佳為至少10次。當重複10次或以上時，前3次以400rpm低速攪拌，其後7次以1000rpm高速攪拌。須注意多胜肽奈米載體中的穀胺酸相對於鈣離子的莫耳濃度比為約1：0.5。該混合溶液以截留分子量1000Da的透析膜對去離子水透析以移除未反應之離子，該透析液經冷凍乾燥即得包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的粉末，儲存於-20℃。若欲形成碳酸鈣之酸可溶性礦化保護殼層，則前述步驟中所使用陰離子水溶液為碳酸根水溶液。
本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體基於第一與第二多胜肽中胺基酸序列的變化，尚可配備其他刺激敏感性的保護殼層。例如當長、短鏈多胜肽共聚物之第一與第二多胜肽之酸性胺基酸鏈段更換為可形成雙硫鍵的半胱胺酸鏈段，則所聚合成的帶殼多胜肽奈米載體會帶有一氧化還原敏感性保護殼層，因為該帶殼多胜肽奈米載體中相鄰長、短鏈多胜肽共聚物的半胱胺酸鏈段間會因氧化而形成雙硫鏈，使長、短鏈多胜肽共聚物彼此交聯。在細胞外的氧化環境中，此類帶殼多胜肽奈米載體具有完整的氧化還原敏感性保護殼層以穩定包覆藥物，然在被攝入細胞後，會因為細胞內榖胱甘肽轉移酶(glutathione S-transferase，GST)還原雙硫鍵的作用，使帶殼多胜肽奈米載體的氧化還原敏感性保護殼層因雙硫鍵斷裂而逐漸崩解，因此達到促進藥物釋放的目的。
實施例3 長鏈多胜肽共聚物之酸不穩定烏頭酸鍵結之水解特性
本實施例藉由三硝基苯磺酸法(TNBS assay)分析本發明帶殼多胜肽奈米載體中長鏈多胜肽共聚物的烏頭酸鍵結，在不同pH值環境下的酸水解特性。因為PEG3400-烏頭酸水解後所釋放的PEG3400帶有裸露的胺基，而TNBS能與一級胺反應生成可溶性橙色產物，故可藉由該橙色產物之生成量測定PEG3400-烏 頭酸在不同pH值下的水解程度。首先，將PEG3400-烏頭酸溶於pH 5.0、6.5、或7.4的去離子水(2mg/ml)進行水解，於反應後3小時、6小時、12小時、及24小時，藉由調整PEG3400-烏頭酸水解液的pH值至8.2及冷凍終止水解反應。其後，在上述水解液中加入碳酸氫鈉至碳酸氫鈉濃度為0.1M(pH 8.2)，再加入5% w/v TNBS溶液於37℃反應1小時，最後以1.0N鹽酸(HCl)終止反應，其中，PEG3400-烏頭酸水解液、TNBS溶液、及鹽酸之體積比為4：2：1。以酵素連結免疫吸附分析儀(Victor X3 2030 Multilabel Reader，PerkinElmer，Waltham，麻薩諸塞州，美國)測定該反應終止溶液在335nm的吸光值。依據已知濃度胺類樣品所得標準曲線，可定量PEG3400的裸露胺基及計算得PEG3400-烏頭酸在各pH值的水解程度。
如圖5所示，在12小時內，約1.97%的烏頭酸鍵結於pH 7.4斷裂，約13.28%及約43.33%的烏頭酸鍵結分別於pH 6.5及pH 5斷裂。在pH 5的情況下，水解於12小時後即達到平衡，然在pH 6.5的情況下，水解會持續24小時至約21%的烏頭酸鍵結斷裂。此結果顯示本發明帶殼多胜肽奈米載體的長鏈多胜肽共聚物的烏頭酸鍵結確實會隨環境pH值的降低，如由pH 7.4降至pH 6.5而增加水解量。
實施例4 包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體之特性
為評估本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體，以及不具有保護殼層的包覆藥物之多胜肽奈米載體在不同pH值的粒子大小及穩定性的差異，本實施例以動態光散射(dynamic light scattering，DLS)分析及界面電位(zeta potential)分析比較本發明包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體，以及不具有保護殼層之包覆DOX之多胜肽奈米載體的粒徑分布及表面電位狀況，並進一步使用穿透式電子顯微鏡(transmission electron microscopy，TEM)觀察本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的外部形態。同時，藉由紫外光-可見光光譜測定該二種多胜肽奈米載體之藥物承載率(drug loading content；其值為被包覆藥物的重量/包覆藥物之奈米載體的重量×100%)及藥物包覆率(drug loading efficiency；其值為被包覆藥物的量/製備包覆藥物之奈米載體時的施藥量×100%)。
動態光散射及界面電位分析係使用Malvern Zetasizer Nano ZS ZEN3600(Malvern Instruments Ltd.,Worcestershire，英國)測量pH 5.0或pH 7.4下前述二種多胜肽奈米載體(1mg/ml)在去離子水中的平均粒徑、多分散係數(polydispersity index，PDI)、及界面電位。如表1所示，包覆藥物之多胜肽奈米載體(DOX NP)的平均粒徑為約77.5±3.8nm，其界面電位為約-45.5±1.0mV，其藥物承載率及藥物包覆率分別為10.22%及51.17%；相對而言，包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP)具有較大的粒徑179.4±33.9nm與負值較小的表面電位-21.9±1.6mV，以及較低的藥物承載率8.16%與相近的藥物包覆率56.33%。在酸性環境下，如pH 5.0時，該二種多胜肽奈米載體的體積皆會膨脹約2倍，且其界面電位皆由負值轉變為正值，此結果顯示該二種多胜肽奈米載體於pH 7.4時穩定分散於溶液中，於pH 5.0時因組胺酸鏈段質子化而在溶液中較不穩定且結構較為鬆散。
包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的穿透式電子顯微鏡影像係由穿透式電子顯微鏡Hitachi H-7650(120kV，東京，日本)取得。製備樣本時，將即時配製的5μl包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的水溶液(3mg/ml)滴加至覆有聚乙烯醇縮甲醛樹脂(Formvar)層的銅網格，經30秒沉降，以濾紙吸取多餘液滴。該步驟重複3次後，將樣本於室溫下乾燥隔夜。
如圖6A所示，包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體在pH 7.4時呈球形並表現出極佳的分散狀態，此結果與動態光散射分析之結論相符。同時，由圖6B可清楚觀察到包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的多胜肽核心與親水性聚合物外壁的結構，該多胜肽核心因外緣包含磷酸鈣礦化保護殼層而呈現深灰色，該親水性聚合物外壁為周邊淺灰色區域。當包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體經過一段時間的酸處理，如圖6C-6F所示之pH值降低至5後的20分鐘、40分鐘、1小時、 及約4小時等時點，該帶殼多胜肽奈米載體會逐漸崩解。其中，圖6C-6D顯示在短時間的酸處理後，該包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的磷酸鈣礦化保護殼層(深灰色)開始溶解，但仍維持其長、短鏈多胜肽共聚物(淺灰色)所形成的球形構造。當經過1小時，如圖6E所示，該包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體膨脹至粒徑超過4μm，顯示其組胺酸鏈段在低pH值下發生質子化，使帶殼多胜肽奈米載體因多胜肽核心的密集正電荷互斥而膨脹崩解。在4小時後，包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體完全溶解，且有部分磷酸鈣重新礦化為圖6F中的卵形構造。此結果顯示本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體在生理條件下具有完整的球形構造，有助於穩定包覆藥物，其在pH 5下會隨時間逐漸崩解，有利藥物有效釋放。
實施例5 包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體之pH敏感性藥物釋放
為證明本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體能順應環境之pH值下降而釋放藥物，本實施例藉由可見光-紫外光光譜測定本發明包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體，以及不具有保護殼層之包覆DOX之多胜肽奈米載體於不同pH值溶液中的藥物釋放情形。將濃度1mg/ml的上述二種多胜肽奈米載體的pH 5.0或pH 7.4磷酸緩衝鹽溶液(phosphate buffered saline，氯化鈉136.9mM、氯化鉀2.68mM、磷酸氫二鈉8.06mM、及磷酸二氫鉀1.47mM，以下簡稱PBS溶液)封入截留分子量1000Da的透析膜，並分別浸入pH 5.0或pH 7.4的20ml PBS溶液，再將該裝置於室溫下以150rpm的速度振動。該PBS溶液於特定時點以新的PBS溶液置換以測定其中藥物的釋放量。進行DOX之光譜測定時，激發波長為490nm，放射波長為535nm。
如圖7所示，不具有保護殼層之包覆藥物之多胜肽奈米載體(DOX NP)表現出藥物的初期快速釋放，其於最初4小時內在pH 5.0及pH 7.4的藥物(如DOX)累積釋放分別為約27.1%及約13.3%。相較之下，本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP)所載藥物不會在初期即快速釋放，其於最初4小時內在pH 5.0及pH 7.4的DOX累積釋放分別為約0%及約5.0%，顯示其所具備之磷酸鈣礦化保護殼層確實發揮保護作用，能避免藥物過早釋出。當經過24小時，不具有保護殼層之包覆藥物之多胜肽奈米載體在pH 7.4之生理條件下，表現出藥物的快速釋放，其藥物的累積釋放為約39.8%；然而，本發明包覆藥物之帶殼多胜 肽奈米載體能有效抑制藥物在pH 7.4下之滲漏，其藥物累積釋放僅約5%。當環境的pH值轉為酸性，如pH 5.0，無論不具有保護殼層之包覆藥物的多胜肽奈米載體、或本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體皆於24小時內大量釋放所載藥物，其藥物累積釋放分別為約60.6%及54.9%；在50小時後，該二種多胜肽奈米載體的藥物累積釋放均為約70%。此結果說明本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體既具備高穩定性，能有效避免藥物在生理條件下過早釋放，又具備對環境刺激之敏感性，能在pH值降低時大量釋放所載藥物。
實施例6 包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體之細胞攝取及細胞內藥物釋放
本實施例利用人類乳腺癌細胞MDA-MB-231及人類臍靜脈內皮細胞之二種細胞模擬腫瘤組織，探討本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體在有無連接主動標靶分子LyP-1胜肽的情況下，其細胞攝取及細胞內藥物釋放情形。首先，將105個乳腺癌細胞MDA-MB-231或人類臍靜脈內皮細胞連同2ml含血清培養基接種於一2孔細胞培養玻片的每一孔，再加入濃度為10μg/ml且溶於培養基之包含或不含LyP-1胜肽之包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體，使其與細胞於37℃下共培養4小時。其後，移除培養基並以PBS溶液潤洗細胞3次，再將細胞以4%甲醛固定，細胞核以藍色螢光之DNA染劑DAPI染色。細胞之螢光顯微鏡影像係由直立式螢光顯微鏡ZEISS Axio Scope.A1(Oerkochen，德國)取得。
如圖8A所示，當乳腺癌細胞MDA-MB-231與本發明包含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP w/ LyP-1)共培養4小時，可觀察到被釋放之藥物(如DOX)快速累積於乳腺癌細胞的細胞核，此結果可由DAPI及藥物之螢光訊號重疊確認。然而，當乳腺癌細胞與不含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP w/o LyP-1)共培養時，被釋放之藥物的微弱螢光訊號主要出現在細胞核周圍。此結果說明主動標靶分子LyP-1胜肽能有效促使乳腺癌細胞MDA-MB-231透過受體介導細胞內吞攝入本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體，因此造成藥物於目標細胞內釋放及藥物進入細胞核。
進一步如圖8B所示，當活化的人類臍靜脈內皮細胞與包含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP w/ LyP-1)共培養4小時，可 觀察到被釋放之藥物累積於內皮細胞的細胞核，儘管此累積量略低於前述乳腺癌細胞的情況。相較於以不含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP w/o LyP-1)處理細胞，本發明包含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體會促使明顯較多的藥物在內皮細胞的細胞核累積。此結果再次證明主動標靶分子LyP-1胜肽能有效引導本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體進入目標細胞以釋放藥物。此結果亦說明與血管新生有關的內皮細胞，會在細胞表面表現LyP-1胜肽的受體蛋白p32，因此，本發明以LyP-1胜肽為主動標靶分子的帶殼多胜肽奈米載體有潛力藉由標靶新生血管以抑制乳腺癌細胞MDA-MB-231的癌細胞轉移。
實施例7 包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體之腫瘤抑制效果
本實施例利用人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231之細胞存活率試驗(MTS assay)，評估本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的腫瘤抑制效果。將細胞接種於96孔盤(5×103個細胞/孔)，並添加10% FBS及1%青黴素與鏈黴素的L-15培養基於37℃下培養1天。其後，移除該培養基並以濃度為10μg/ml且溶於L-15培養基之DOX．HCl、包含LyP-1胜肽之包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP w/ LyP-1)、或不含LyP-1胜肽之包覆DOX且帶有磷酸鈣礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體(M-DOX NP w/o LyP-1)各100ul處理細胞24小時。經PBS溶液潤洗細胞2次，再於37℃下以添加10% FBS及1%青黴素與鏈黴素的L-15培養基培養細胞24、48、或72小時。進行細胞存活率試驗時，先移除96孔盤中培養基，加入10ul MTS溶液及90ul L-15培養基於37℃培養2.5小時，再將溶液移至新的96孔盤以測量其於490nm的吸光值。本試驗重複3次。
如圖9所示，乳腺癌細胞經不含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體處理24小時後，其存活率下降至52.3%，顯示乳腺癌細胞可經由吞噬作用(phagocytosis)攝入該奈米載體。相對地，當乳腺癌細胞以本發明包含LyP-1胜肽之包覆藥物(如DOX)之帶殼多胜肽奈米載體處理，其存活率大幅降低至18.8%，近似於直接以藥物(如DOX．HCl)處理乳腺癌細胞之存活率14.3%。當持續培養細胞72小時，本發明包含LyP-1胜肽之包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體能 維持其腫瘤抑制效果，使乳腺癌細胞存活率隨時間下降至5.7%，近似於直接使用藥物而使乳腺癌細胞存活率隨時間下降至5.4%之腫瘤抑制趨勢。此結果說明主動標靶分子LyP-1胜肽能有效促使乳腺癌細胞MDA-MB-231透過受體介導細胞內吞攝入本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體，因此顯著抑制腫瘤細胞的存活。圖9中，*表示p<0.05，**表示p<0.01，***表示p<0.001，N.S.表示無顯著差異。
實施例8 包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體之腫瘤轉移抑制效果
本實施例以具有轉移能力之人類乳腺癌細胞株MDA-MB-231作為腫瘤轉移之體外試驗模型，評估本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體的腫瘤轉移抑制效果。本實施例之帶殼多胜肽奈米載體帶有磷酸鈣礦化保護殼層並包覆二種可抑制癌細胞轉移的藥物，一為可抑制肌動蛋白絲(actin filament)組裝的拉春庫林B(latrunculin B)，另一為可抑制基質金屬蛋白酶之蛋白質表現量的抑制劑GM6001。實驗時，先將乳腺癌細胞依每孔105個細胞培養於一8孔細胞培養玻片中的含L15培養基基質膠(Matrigel；L15培養基與基質膠混合比例為2：3)，控制組細胞不經處理，實驗組細胞以1mg/ml的本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體處理。經過10分鐘的凝膠作用，於該基質膠上形成直徑5mm的孔洞，以PBS溶液沖洗該圓形孔洞2次，並在該圓形孔洞填入混合了表皮生長因子(epidermal growth factor，以下簡稱EGF)與CXC趨化因子配體12(C-X-C motif chemokine 12，以下簡稱CXCL12)的基質膠，形成中央圓形基質膠。此處添加EGF與CXCL12係因為此二者皆為促進腫瘤轉移的旁分泌(paracrine)因子。利用雷射掃描共軛焦顯微鏡ZEISS LSM 700(Oerkochen，德國)於細胞培養的第1、3、6天觀察經綠色螢光染劑CMFDA染色的乳腺癌細胞入侵中央圓形基質膠的狀況。
圖10係紀錄乳腺癌細胞入侵的螢光顯微鏡影像，圖中虛線標示乳腺癌細胞的初始分布區域與其入侵中央圓形基質膠之界線。控制組的乳腺癌細胞向著包含EGF與CXCL12的中央圓形基質膠表現出強烈移動傾向，特別是在培養6天後乳腺癌細胞的移動距離達到數百微米(μm)，顯示乳腺癌細胞的化學趨向性(chemotaxis)。相對地，實驗組乳腺癌細胞的入侵能力，因為包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體而被明顯限制，導致細胞的移動主要侷限於其最初所在的基質 膠及包含EGF與CXCL12的中央圓形基質膠之交界處，且乳腺癌細胞的移動距離不超過100μm。此結果說明本發明包覆藥物之帶殼多胜肽奈米載體能被乳腺癌細胞MDA-MB-231攝入並釋放藥物，因此有效抑制腫瘤細胞的轉移。
綜上所述，本發明循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體係利用具生物相容性、且生物可降解之材料製備而成，如聚乙二醇、多胜肽、磷酸鈣、LyP-1胜肽等，故將其施用於活體時具有良好安全性。由本發明帶殼多胜肽奈米載體所形成包覆藥物的帶殼多胜肽奈米載體表現出水溶液中的高穩定性、高藥物包覆率、多重pH敏感性或氧化還原敏感性、及良好的細胞攝取與細胞內藥物釋放率，能順應環境中pH值或氧化還原狀態的變化逐步崩解，且進一步在癌細胞實驗中表現出顯著的腫瘤抑制效果及腫瘤轉移抑制效果。因此，本發明具刺激敏感性之多胜肽奈米載體可作為疏水性藥物的遞送平台，例如藉由包覆抗癌藥物以製備抑制腫瘤及其轉移之醫藥組成物，或者藉由包覆如含碘顯影劑以追蹤腫瘤在活體內的分布。該醫藥組成物施用於活體時能基於前述特性，在血液循環中穩定包覆藥物，避免藥物滲漏或未達目標組織而過早釋放，並於抵達目標組織，如腫瘤組織後，因環境中pH值降低而逐步崩解，直至徹底釋放藥物於目標細胞內。
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Claims (14)

  1. 一種循序崩解之帶殼多胜肽奈米載體，係具有一親水性聚合物外壁及一多胜肽核心的構造，該多胜肽核心由外向內包含一保護殼層及一加速崩解層，該構造包含依長軸對齊且交錯分布的複數個長鏈多胜肽共聚物及複數個短鏈多胜肽共聚物，其中該長鏈多胜肽共聚物由該親水性聚合物外壁向該多胜肽核心依序包含一長鏈親水性聚合物及一第一多胜肽，且該短鏈多胜肽共聚物由該親水性聚合物外壁向該多胜肽核心依序包含一短鏈親水性聚合物及一第二多胜肽，其中該長鏈親水性聚合物與該第一多胜肽以一酸不穩定鍵結連接，且該短鏈親水性聚合物在靠近該親水性聚合物外壁一端包含一主動標靶分子，其中該第一與第二多胜肽由外向內依序包含一用於形成保護殼層之胺基酸鏈段、一側鏈之酸解離平衡常數(pKa)約為6的酸敏感性胺基酸鏈段、及一疏水性胺基酸鏈段，該用於形成保護殼層之胺基酸鏈段為一酸性胺基酸鏈段或一半胱胺酸鏈段，且該第一與第二多胜肽之胺基酸序列相同，當該用於形成保護殼層之胺基酸鏈段為該酸性胺基酸鏈段，該多胜肽核心的保護殼層係為一酸可溶性礦化保護殼層，由沉積於該酸性胺基酸鏈段的一酸可溶性礦物構成，該加速崩解層由該酸敏感性胺基酸鏈段構成。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之帶殼多胜肽奈米載體，其中當該用於形成保護殼層之胺基酸鏈段為該半胱胺酸鏈段，該多胜肽核心的保護殼層係為一氧化還原敏感性保護殼層，包含相鄰長、短鏈多胜肽共聚物的半胱胺酸鏈段間之複數個雙硫鏈。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之帶殼多胜肽奈米載體，其粒徑係為100-200nm，且該長鏈多胜肽共聚物及該短鏈多胜肽共聚物之分布莫耳比約為1：2至2：1。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之帶殼多胜肽奈米載體，其中該酸性胺基酸鏈段由10-20個穀胺酸組成，該酸敏感性胺基酸鏈段由5-15個組胺酸組成，及該疏水性胺基酸鏈段由5-15個亮胺酸組成。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之帶殼多胜肽奈米載體，其中該酸不穩定鍵結係為一在pH 6.5~7下發生水解的鍵結。
  6. 如申請專利範圍第1項所述之帶殼多胜肽奈米載體，其中該酸可溶性礦物為磷酸鈣或碳酸鈣。
  7. 一種如申請專利範圍第1項所述之具有一酸可溶性礦化保護殼層之帶殼多胜肽奈米載體的製備方法，包含：(a)以化學接枝法分別製備一長鏈多胜肽共聚物及一短鏈多胜肽共聚物，其中該長鏈多胜肽共聚物包含一長鏈親水性聚合物及一第一多胜肽，該短鏈多胜肽共聚物包含一短鏈親水性聚合物及一第二多胜肽，其中該長鏈親水性聚合物與該第一多胜肽以一酸不穩定鍵結連接，且該短鏈親水性聚合物的末端連接一主動標靶分子，其中該第一與第二多胜肽依序包含一酸性胺基酸鏈段、一側鏈之酸解離平衡常數(pKa)約為6的酸敏感性胺基酸鏈段、及一疏水性胺基酸鏈段，且該第一與第二多胜肽之胺基酸序列相同；(b)在一極性溶液中混合該長鏈多胜肽共聚物及該短鏈多胜肽共聚物以自我聚合形成一多胜肽奈米載體；(c)在含有該多胜肽奈米載體的極性溶液中加入一陽離子水溶液及一陰離子水溶液以形成一第一層酸可溶性礦化保護殼層後，再以複數次數加入該陽離子水溶液及該陰離子水溶液，以形成多層的酸可溶性礦化保護殼層，使該酸可溶性礦化保護殼層逐層沉積於該多胜肽奈米載體的酸性胺基酸鏈段’以獲得該帶殼多胜肽奈米載體。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中步驟(c)之該陽離子水溶液為鈣離子水溶液，該陰離子水溶液為磷酸根水溶液或碳酸根水溶液，且該複數次數為約至少5次。
  9. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中步驟(b)之該長鏈多胜肽共聚物及該短鏈多胜肽共聚物以莫耳比約1：2至2：1混合。
  10. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中步驟(a)之該第一與第二多胜肽之酸性胺基酸鏈段由10-20個酸性胺基酸組成，該酸敏感性胺基酸鏈 段由5-15個酸敏感性胺基酸組成，及該疏水性胺基酸鏈段由5-15個疏水性胺基酸組成。
  11. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中步驟(a)之該酸性胺基酸鏈段係為穀胺酸、天冬胺酸或其組合。
  12. 如申請專利範圍第7項所述之製備方法，其中步驟(a)之該酸不穩定鍵結係為一在pH 6.5~7下發生水解的鍵結。
  13. 一種醫藥組成物，包含如申請專利範圍第1項或第2項所述之帶殼多胜肽奈米載體及位於該帶殼多胜肽奈米載體之一多胜肽核心的一疏水性藥物。
  14. 如申請專利範圍第13項所述之醫藥組成物，其中該疏水性藥物為一疏水性抗癌藥物。
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