CN102408498A - 一种透明质酸键合聚乙烯亚胺共聚物、其制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸键合聚乙烯亚胺的聚合载体材料、制备方法及其应用,该聚合载体材料以透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)作为骨架,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)作为交联剂,嫁接到聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)上,形成的HA-PEI聚合载体材料,本聚合载体材料能够提高基因/阴离子蛋白质在细胞内的靶向性,降低对细胞的毒性、以及提高靶向基因的转化效率,具有广泛的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种聚合载体材料,属于生物医学材料领域,具体涉及一种透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物、其制备方法及应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象的发现与研究,为基因治疗带来新的契机,它正以飞快地速度发展成为基因治疗主要手段。由21-23个碱基对构成的双链小干扰核糖核酸(small interference RNA,siRNA)[1,2],可在动物细胞质中特异性降解与其碱基对互补的信使RNA(mRNA),从而阻断mRNA编码蛋白质的表达,实现基因沉默[3,4],即RNA干扰。但是,siRNA在机体内会被快速酶解,而且细胞对siRNA的摄取量很少,所以体内siRNA的基因沉默效率很低[5-7]。为了解决这些问题,人们探究了许多种能以静电形式与siRNA结合形成缩聚毫微粒的阳离子高分子材料,在促进细胞内传递的同时也增加了酶攻击的稳定性[8,9]。
阳离子高分子材料中的聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)被广泛用于凝聚DNA质粒、siRNA和反义链脱氧核苷酸(ODN)[10-12]。带有正电荷PEI与siRNA形成了带有正电荷的复合物体,经内吞等方式进入细胞后先形成内涵体,通过PEI质子海绵吸附作用(proton sponge effect),导致复合物从内涵体逃逸后直接进入细胞质,来实现靶向基因沉默。但是该过程中,由于正电荷表面特征siRNA/PEI复合物能引起补体活化[13]、血细胞凝固[14]以及血清蛋白的自我聚集[15]。此外,PEI固有的细胞毒性限制了它在活体基因治疗中的应用[16]。为了缓解这些问题,常采用各种多聚阴离子在不破裂siRNA/PEI复合物结构的同时将其外包[15,16],增加siRNA/PEI复合物转移率。我们选择了具有无毒无免疫原性、靶向细胞表面CD44(Cluster determinant 44)[10]、LYVE-1(lymphatic vesselendothelial hyaluronan receptor-1)[17]受体的透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)作为PEI聚合物的轭合物能够减少PEI对细胞毒性、增加血清稳定性以及通过HA受体介导的细胞内吞作用维持内涵体脱离的能力,促进siRNA/PEI-HA复合物被细胞摄取,进而提高对靶向基因沉默效率。
发明内容
本发明涉及一种透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)键合聚乙烯亚胺(Polyethyleneimine,PEI)的聚合载体材料、制备方法及其应用,该聚合载体材料以HA作为骨架,利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC·HCl]作为交联剂,嫁接到PEI上,形成HA-PEI聚合载体材料,所述HA-PEI化合物的制备过程用结构式表示如下:
有研究表明:HA对各种癌细胞的CD44(Cluster determinant 44)[10]和LYVE-1(lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor-1)[17]受体具有靶向作用,目前已被当做抗癌药物靶向分子而受到广泛的重视。以HA作为骨架,经过表面修饰与PEI联接,制成分子量高、电荷密度大及缓冲能力强的基因载体[5],该复合型转基因载体结构中多糖的羟基可以增强载体和细胞膜的粘附作用,其柔软的结构可以协同PEI顺利穿透细胞膜屏障[19]。进入细胞膜后,连接的PEI仍保持原来的基本结构,具有足够的表面电荷和缓冲能力,使载体siRNA复合物在穿越细胞膜屏障并进入溶酶体后,能有效地抵抗溶酶体内酶的降解作用,延长载体在细胞内的作用时间[9-10],并有可能协同siRNA有效沉默疾病基因。因此,认为PEI-HA作为特异性siRNA的载体,能达到理想的作用效果。这对HA受体组织的疾病(例如肝癌和肾癌)的靶向治疗有深远而积极的影响。
通过本方法制备的聚合载体材料能够提高基因/阴离子蛋白质在细胞内的靶向性,降低对细胞的毒性、以及提高靶向基因的转化效率,具有广泛的应用前景。本发明具体通过如下步骤实现:
a.将浓度为0.5~4mg/mL的透明质酸溶液溶解于同体积的聚乙烯亚胺溶液中,用HCl调pH值到6.5,其中,所述聚乙烯亚胺溶液浓度是透明质酸溶液浓度的20倍;
b.向体积百分比为50%的二甲基亚砜溶液中按1ml∶68.9mg的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-苯并-三氮唑的混合物,所述混合物中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基-苯并-三氮唑的质量比为40.4∶28.5;
c.将步骤b所得溶液按1∶20的体积比加入到步骤a所得溶液中,在常温下搅拌混合24小时之后,用NaOH调pH到7.0;
d.将步骤c所得溶液经过分离纯化和浓缩后制得聚合载体材料。
在上述制备HA-PEI聚合载体材料的方法中:
当上述透明质酸的平均分子量为200道尔顿~300万道尔顿,所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为200道尔顿~25,000道尔顿时,效果更佳。
当上述透明质酸的平均分子量为132,300道尔顿,所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为25,000道尔顿时,效果更佳。
当步骤d所述的分离纯化方法为:在100mmol/L NaCl溶液中透析2天,在25wt%的乙醇中透析1天,纯化水中透析1天;步骤d所述的浓缩方法为冷冻干燥法时,效果更佳。
本发明的另外一方面是:利用上述方法所制备的透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物载体材料。
本发明的另外一方面是:制备的透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物载体材料作为基因载体、制备生物医药中的应用。
上述共聚物载体材料作为基因载体的应用:共聚物载体材料与能在真核细胞内沉默血管生成因子的基因、癌基因和报告基因的siRNA形成复合物,并转染动物来源的内皮细胞、上皮细胞及癌细胞。
上述共聚物载体材料作为基因载体的应用,其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成的复合物的平均粒径小于100nm。
上述共聚物载体材料作为基因载体的应用,其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成的复合物的平均粒径为20nm。
上述共聚物载体材料在制备医药中的应用,其特征在于:共聚物载体材料与siRNA形成复合物,通过局部给药、口腔吸附给药的途径,应用于肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。
通过本发明所述的方法制备的HA键合分枝状聚乙烯亚胺(BranchedPolyethyleneimine,bPEI)的共聚物载体材料,对其进行下述几方面的检测:
a)利用核磁共振氢谱(1H-NMR)对其进行化学表征以确定其结构,结果显示,有24%的bPEI偶联HA上。
b)用凝胶电泳阻滞实验观察HA-bPEI对小干扰siRNA的结合能力,结果显示,HA在偶合了bPEI后,HA-bPEI与siRNA增加时,其与siRNA的结合能力也增强。
c)通过MTT法检测siRNA/bPEI-HA复合物对细胞的毒性,结果显示,在相同浓度下HA-bPEI的毒性低于bPEI。
d)用原子力显微镜观察siRNA/bPEI-HA复合物,结果显示,siRNA/bPEI-HA复合物带有负电荷表面特征,平均粒径为20nm。
e)通过体外转染实验,即在B16F细胞株上进行基因沉默效率实验,结果显示在含高血清条件下,siRNA/bPEI-HA对B16F1细胞的基因沉默效率比bPEI高。
上述结果证明,通过本发明所述方法,以HA为骨架材料键合PEI形成的共聚物载体材料,是一种具有潜在研究价值的新型靶向非病毒载体。
有益效果:
本发明的共聚物具有靶向性和亲水性,结构中多糖的羟基可以增强载体和细胞膜的粘附作用,其柔软的结构可以协同聚乙烯亚胺顺利穿透细胞膜屏障而且能够降低普通聚乙烯亚胺对细胞的毒性,能大大提高药物传输系统的安全性。进入细胞膜后,连接的聚乙烯亚胺仍保持原来的基本结构,具有足够的表面电荷和缓冲能力,使载体siRNA复合物在穿越细胞膜屏障并进入溶酶体后,能有效地抵抗溶酶体内酶的降解作用,延长载体在细胞内的作用时间,能够提高siRNA沉默疾病基因有效。该共聚物具有广泛的siRNA适应性,有效荷载外源siRNA的5bp到200bp大小,可由于制备多沉默基因的siRNA的联合转移的新型siRNA传输载体,同时也可作为平台技术用于制备治疗其它疾病的siRNA传输系统。
附图说明
图1:核磁共振氢谱(1H-NMR)分析结果图,其中:(a)是HA的1H-NMR分析结果图;(b)是bPEI的1H-NMR分析结果图;(c)是HA和bPEI混合物的的1H-NMR分析结果图;(d)是HA与bPEI共聚物的1H-NMR分析结果图;
图2:siRNA,siRNA/PEI复合物和siRNA/PEI-HA复合物的琼脂糖凝胶电泳图,其中:从左至右共五条泳道,第一道为siRNA(浓度为0.75μg/μL),第二道为siRNA/bPEI的体积比为1∶3的复合物,第三道至第五道为siRNA/bPEI-HA的体积比分别为(1∶1)、(1∶3)和(1∶5)时的电泳图;
图3:siRNA/PEI-HA复合物原子显微镜粒度分析图;
图4:siRNA/PEI-HA复合物体外的基因沉默效率图。
具体实施方式
下面结合几个实施例,对本发明做进一步描述。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明,但不以任何方式限制本发明。
下述实施例中所述试验方法,如无特殊说明,均为常规方法;所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得,或可以常规方法制备。
透明质酸(Hyaluronic Acid,HA),购自Lifecore有限公司,Chaska,MN,平均分子量为132,300Da。
分枝状聚乙烯亚胺(Branched Polyethyleneimine,bPEI),分子量为25,000道尔顿、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐[N-(3-dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimide hydrochloride,EDC·HCl]、1-羟基-苯并-三氮唑(N-hydroxybenzotrizole,HOBt)、琼脂糖凝胶、硼酸钠、硼酸、磷酸盐缓冲液、甲醇和蛋白抑制剂,均购自Sigma-Aldrich公司;
盐酸(HCl)和氢氧化钠(NaOH)均购自日本Wako纯化学工业;
二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)购自日本东京Junsei化工有限公司;
抗-PGL3-Luc siRNA购自大连宝生物有限公司;
B16F1是小鼠黑色素瘤细胞,是广泛用于肿瘤研究的细胞株,获赠于韩国浦项大学的医药用新材料研究室,浦项,韩国;
96孔的细胞培养皿购自科宁公司,科宁,纽约;
RPMI1640和MEM细胞培养基为Cell Culture,购自Invitorgen有限公司,优级胎牛血清(FBS)购自生工生物公司,上海,中国。
PGL3-Luc质粒和细胞裂解液和荧光素酶报告系统购自Promega有限公司,麦迪逊,美国威斯康辛州WI;
粒度分析仪为Zetasizer Nano,Malvern仪器公司,英国;
原子量显微镜为AFM,Multimode 3100,VEECO器械公司,纽约,NJ;
紫外分光光度计为Biotrak II plate reader,Biochrom,剑桥,美国;
分光光度计为Luminoskan Ascent实验室系统,德国;
透析袋:10万道尔顿,Millipore,Bedford,MA;
荧光光度计为CARY Eclipse,Varian,Palo Alto,CA。
实施例1bPEI-HA复合物的合成
a.将10mL浓度为2mg/mL的HA溶解于10mL浓度为40mg/mL的bPEI中,1.0mol/L的HCl溶液调节反应物的pH值到6.5。
b.取40.4mg EDC·HCl、28.5mg HOBt溶解在1ml的体积百分数为50%的DMSO溶液中。
c.将步骤b获得的溶液加入到步骤a所得溶液中,在常温下搅拌混合24h之后,用浓度为1.0mol/L的NaOH调节pH到7.0。
d.将步骤c所得溶液倒至清洗过的10kDa透析袋中,在100mmol/L NaCl溶液中透析2天,25wt%的乙醇中透析一天,纯化水中透析一天,得到1μg/μL的bPEI-HA复合物溶液,进行冷冻干燥,得到白色粉末状固体。再用1H-NMR分析检测HA的bPEI修饰程度。
用1H-NMR分析检测HA的bPEI修饰程度,结果见附图1,其中:(a)是HA的1H-NMR分析结果图;(b)是bPEI的1H-NMR分析结果图;(c)是HA和bPEI混合物的的1H-NMR分析结果图;(d)是HA与bPEI共聚物的1H-NMR分析结果图;如图所示HA的乙酰胺基在1.9ppm处的一个甲基峰、在2.5~3.2ppm处有一个bPEI峰[18]。由此确定合成的bPEI-HA复合物bPEI摩尔含量为24%。
实施例2bPEI-HA复合物的效果检测实验
(一)siRNA/bPEI-HA复合物的制备
取浓度为0.75μg/μL的抗-PGL3-Luc的siRNA与浓度为0.75μg/μL的bPEI-HA复合物分别按体积比为1∶1、1∶3和1∶5的比例混合,混合方式如表1,室温孵育15分钟,制成siRNA/bPEI-HA复合物。最后,加入3μL 5mol/L的NaCl溶液使siRNA/bPEI-HA复合物的终浓度达到150mmol/L。
取0.75μg/μL的抗-PGL3-Luc的siRNA与浓度为0.75μg/μL的bPEI分别按体积比为1∶1、1∶3和1∶5的比例混合,混合方式如表2,室温孵育15分钟,制成siRNA/bPEI复合物。最后,加入3μL 5mol/L的NaCl溶液使siRNA/bPEI复合物的终浓度达到150mmol/L。
表1.siRNA与bPEI-HA复合物的混合比例
表2.siRNA与bPEI复合物的混合比例
(二)凝胶阻留法分析siRNA/bPEI-HA复合物
siRNA,由上述表2中e的比例制备的siRNA/bPEI复合物,以及由上述表1中a、b、c的比例制备的siRNA/bPEI-HA复合物,依次加到1.0wt%的琼脂糖样品小槽中,50V电压下电泳40分钟。siRNA在溴化物染色后是可见的,凝胶图像在紫外线下采集。通过凝胶图像可以检测载体材料结合siRNA的能力,附图2为siRNA、siRNA/bPEI和siRNA/bPEI-HA的凝胶电泳实验结果,其中:从左至右共五条泳道,第一道为siRNA(浓度为0.75μg/μL),第二道为siRNA/bPEI的体积比1∶3复合物,第三道至第五道为siRNA/bPEI-HA的体积比分别为(1∶1)、(1∶3)和(1∶5)时的电泳图;由实验结果表明,HA在偶合了bPEI后,HA-bPEI与siRNA增加时,其与siRNA的结合能力也增强,其体积比在1∶3、1∶5都可以完全结合siRNA。
(三)siRNA/bPEI-HA复合物的粒度分析
将由上述表2中b的比例制备的siRNA/bPEI-HA复合物,取50μL用750μL水稀释,取10μL稀释液放到硅片上室温内干燥3天,将带有样品的硅片置于原子力显微镜下,选择“tapping′’模式,扫描面积为8×8μm。
siRNA/bPEI-HA复合物的粒度分析结果见附图3,其中:siRNA/bPEI-HA复合物的体积比为1∶3,原子力显微镜技术(AFM)分析显示:siRNA/bPEI-HA复合物带有负电荷表面特征,平均粒径为20nm。所有这些结果反应了siRNA/bPEI-HA复合物是由siRNA和bPEI-HA复合物的bPEI部分通过静电反应形成的。
(四)siRNA/bPEI-HA复合物的细胞毒性检测
在96孔板上以5×103细胞/孔接种B16F1细胞,在37℃、5%的CO2的细胞培养室培养24小时左右,再分别加入20μL的由上述表2中e的比例制备的siRNA/bPEI复合物,以及由上述表1中b的比例制备的siRNA/bPEI-HA复合物,和空白对照无siRNA的生理盐水,共孵育24h后,加入20μL浓度为2mg/mL的MTT溶液,37℃下培养4h,除去含有MTT的培养基,加入300μL的DMSO溶解活细胞形成的甲瓒结晶。用紫外分光光度计在540nm下检测吸光度。细胞成活率(%)用以下公式计算:
细胞成活率(%)=[OD540(样品)/OD540(对照品)]×100,
其中OD540(样品)表示用siRNA/bPEI复合物或siRNA/bPEI-HA复合物处理的细胞吸光度,OD540(对照品)表示PBS处理后的细胞吸光度。
siRNA/bPEI-HA复合物的细胞毒性结果分析
MTT细胞毒性试验结果显示:与空白对照生理盐水组相比较,体积比为1/3的siRNA/bPEI-HA复合物细胞存活率占到92.3%,而siRNA/bPEI复合物的仅仅为61.2%。这可能由于HA上的负电荷中和了bPEI上的正电荷对细胞毒性作用,因此与siRNA/bPEI复合物相比,siRNA/bPEI-HA复合物相对较小的细胞毒性。
(五)siRNA/bPEI-HA复合物的体外基因沉默实验
PGL3-Luc的载体基因沉默实验:B16F1细胞以5×105细胞/孔接种到24孔板上,用有血清(FBS)的培养液1640在CO2培养箱中培养24h,孔板上细胞密度达到70~80%时,去除培养液后,加入500μL无FBS的DMEM培养基(含1μgPGL3-Luc/25μL Lipofectamine复合物)培养3h后,吸取培养基并冲洗,然后加入400μL含有10%、20%、30%、40%和50%浓度FBS的DMEM培养基,各加入已制备最终混合体积为100μL的空白对照生理盐水、阴性对照(体积比为1∶3的抗-PGL3-Luc siRNA/bPEI复合物)和阳性对照(体积比为1∶3的抗-PGL3-LucsiRNA/bPEI-HA复合物)到24孔板中,3复孔,培养24h之后,吸去培养液,PBS洗涤细胞1次,然后每孔加入100μL含1%的Triton X-100的裂解液,-80℃冻存至少1h,然后37℃融化,反复冻融2次,使细胞裂解,离心后用Promega公司的荧光素酶检测试剂盒检测蛋白中荧光素酶浓度。
siRNA/bPEI-HA复合物体外基因沉默结果分析
PGL3-Luc基因沉默实验结果分析:脂质体转染B16F1细胞后,转录后的基因沉默效率分析见图4,其中:siRNA/bPEI-HA复合物的体积比为1∶3,在有HA受体的B16F1细胞中,siRNA/bPEI-HA(体积比,1∶3)复合物基因沉默率达到84%,而siRNA/bPEI(体积比,1∶3)复合物的基因沉默率仅为64%。说明HA配体的偶合可以增加载体材料对肿瘤细胞表面HA受体的结合。外层有HA包裹的抗-PGL3-Luc siRNA/bPEI-HA复合物比没有HA包裹的能更能有效地传到B16F1细胞中,这可能是由于通过HA受体介导的细胞内吞作用增加了抗-PGL3-LucsiRNA/bPEI-HA复合物的细胞内吞作用。
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Claims (10)
1.一种透明质酸键合聚乙烯亚胺的聚合载体材料的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
a.将浓度为0.5~4mg/mL的透明质酸溶液溶解于同体积的聚乙烯亚胺溶液中,用HCl调pH值到6.5,其中,所述聚乙烯亚胺溶液浓度是透明质酸溶液浓度的20倍;
b.向体积百分比为50%的二甲基亚砜溶液中按1ml∶68.9mg的比例加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和1-羟基-苯并-三氮唑的混合物,所述混合物中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与1-羟基-苯并-三氮唑的质量比为40.4∶28.5;
c.将步骤b所得溶液按1∶20的体积比加入到步骤a所得溶液中,在常温下搅拌混合24小时之后,用NaOH调pH到7.0;
d.将步骤c所得溶液经过分离纯化和浓缩后制得聚合载体材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于:所述的透明质酸的平均分子量为200道尔顿~300万道尔顿,所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为200道尔顿~25,000道尔顿。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法,其特征在于:所述的透明质酸的平均分子量为132,300道尔顿,所述的聚乙烯亚胺的平均分子量为25,000道尔顿。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于:步骤d所述的分离纯化方法为:在100mmol/L NaCl溶液中透析2天,在25wt%的乙醇中透析1天,纯化水中透析1天;步骤d所述的浓缩方法为冷冻干燥法。
5.如权利要求1或4所述的制备方法制备的透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物载体材料。
6.如权利要求1所述的制备方法制备的透明质酸键合聚乙烯亚胺的共聚物载体材料作为基因载体、制备生物医药中的应用。
7.根据权利要求6所述的共聚物载体材料作为基因载体的应用,其特征在于:共聚物载体材料与能在真核细胞内沉默血管生成因子的基因、癌基因和报告基因的siRNA形成复合物,并转染动物来源的内皮细胞、上皮细胞及癌细胞。
8.根据权利要求7所述的共聚物载体材料作为基因载体的应用,其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成的复合物的平均粒径小于100nm。
9.根据权利要求8所述的共聚物载体材料作为基因载体的应用,其特征在于共聚物载体材料与siRNA形成的复合物的平均粒径为20nm。
10.根据权利要求6所述的共聚物载体材料在制备医药中的应用,其特征在于:共聚物载体材料与siRNA形成复合物,通过局部给药、口腔吸附给药的途径,应用于肿瘤、哮喘和心血管疾病的基因治疗。
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