JP2022515567A - 人工エクソソーム複合体の製造方法及び使用 - Google Patents

Abstract

【要約】【課題】人工エクソソーム複合体の製造方法及び使用を提供する。【解決手段】本発明の複合体の製造原料は、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）である。ＨＡ－ＰＥＩの製造プロセスにより、直鎖のポリエチレンイミンを得ることができ、従来のポリエチレンイミンのほとんどが分岐化されたものである。ＨＡ－ＰＥＩの製造スキームにより、特定の分子量のＨＡ－ＰＥＩを定量で製造することができ、操作ステップを制御することができ、大規模の工業生産が可能である。ＨＡ－ＰＥＩは、ヒアルロン酸のリガンド活性及び直鎖状ポリエチレンイミンの膜透過性により、深部皮膚細胞の、包埋された活性物質に対する吸収を促進することができる。【選択図】図１

Description

本発明は、生化学技術分野に属し、具体的に、人工エクソソーム複合体の製造方法及び使用に関する。

スキンケア製品の有効性は、主に活性物質の吸収効率にあり、従来、市販の有効な活性物質送達媒体は非常に少ない。直鎖状ポリエチレンイミンは、親水性残基と親油性残基とを同時に有するため、親水性残基を内側に、親油性残基を外側に有する形で二分子層を形成し、物質を包埋してマイクロカプセルを形成することができ、マイクロカプセルは、自己の膜融合性により細胞膜と融合して包埋物を細胞内に送達することができる。しかし、当該マイクロカプセルは膜融合性の特徴を利用するものであるので、細胞選択性を有さない。ヒアルロン酸（Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ）は、天然の保湿潤滑剤であり、ヒアルロン酸は分子量が大きいので、深部皮膚細胞により有効に吸収されず、スキンケアの持続性が限られている。

従来、直鎖状ポリエチレンイミンとヒアルロン酸の両者を組み合わせたものが市販されておらず、その技術的難題は、直鎖状ポリエチレンイミンとヒアルロン酸とは単純に混合するものではなく、アミド化反応により互いに連結してエクソソームに類似するマイクロカプセルを形成することにある。しかし、直鎖状ポリエチレンイミン及びヒアルロン酸の両方とも小分子化合物ではなく、高分子ポリマーであり、このような反応及び品質の制御は、技術上的に、極めて難しい。

本発明が少なくとも解決する１つの技術課題は、新規な人工エクソソーム複合体の製造方法及び使用を提供することであり、その目的は、直鎖状ポリエチレンイミンとヒアルロン酸とを融合し、ヒアルロン酸のリガンド活性とポリエチレンイミンの膜透過活性とを利用して両者を相乗作用させてスキンケア製品に用い、活性物質が深部皮膚によって有効に吸収されるのを促進することになる。

上記の目的を実現するために、本発明は、以下の技術的解決手段を採用する。
製造原料は、直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）である、ことを特徴とする人工エクソソーム複合体、を提供する。

さらに、前記ヒアルロン酸は、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとからなる二糖単位であり、分子量が４００～１８０００００間であり、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウムの形で存在する。

さらに、前記直鎖状ポリエチレンイミンは、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を硫酸水溶液で加熱、加水分解して得られ、分子量が１０００～１０００００間である。

さらに、アミド結合をさらに含むか、あるいはエチル基、イミン、第３級アミン及びアミドなどをさらに含む。

さらに、人工エクソソーム複合体は、水溶液の形で、濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１ｇ／ｍＬ間となるように調製される。

下記の工程ａ～工程ｇを含む、人工エクソソーム複合体の製造方法、を提供する。

工程ａ
４５ｇのポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を２００ｍＬの３０％硫酸水溶液に溶解し、同時に、加熱還流装置を組み立てる。

工程ｂ
反応液を還流状態となるまで加熱し、同時に、蒸留された溶液のｐＨを検出し、主に、反応副生物としてのプロピオン酸を判断し、プロピオン酸は水と共沸することができ、蒸留された溶媒にプロピオン酸が存在しなくなり、即ち、蒸留された溶液のｐＨが６．０～７．０間であると検出した場合、反応を停止することができ、この反応は約７日間が必要とされる。

工程ｃ
反応中止後、反応系の温度が０℃に低下したとき、機械式撹拌を開始して時計回り一方向撹拌を行い、撹拌回転数を３００ｒ／ｍｉｎとし、その後、濃度が１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨを中性、即ち７．０に調節し、さらに、少量の水酸化ナトリウム溶液を滴下し、ｐＨが塩基性に偏っている時、即ち、１０～１１となる時、滴下を停止する。

工程ｄ
ｐＨ調節過程において、固体が徐々に析出し、固体がポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。

工程ｅ
固体が全部析出した後、ろ過を行い、大量の蒸留水を用いて洗浄を行い、ろ過液のｐＨが塩基性から中性となると、洗浄を中止することができる。

工程ｆ
室温条件下、ろ過した固体を全く水分が残存しなくなるまで真空乾燥し、この過程は約７日間が必要とされる。

工程ｇ
６００ｍｇのＨＡをビーカー１に入れて３００ｍＬの蒸留水を添加して溶液Ａに調製し、さらに、１２ｇのＰＥＩをビーカー２に入れて３００ｍｌの蒸留水を添加して溶液Ｂに調製し、溶液Ａを溶液Ｂに入れて、１Ｍ Ｈｃｌ溶液を添加して溶液のｐＨを６．５に調節して溶液Ｃを得、６．３ｍｍｏｌのＥＤＣ（水溶性カルボジイミド、即ち、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）及び６．３ｍｍｏｌのＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）を、１５ｍＬの蒸留水と１５ｍＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とで形成された混合溶媒に溶解して溶液Ｄを形成し、溶液Ｃと溶液Ｄとを１．５Ｌの丸底フラスコに添加し、常温で２４ｈ撹拌し、１ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７に調節して反応液を得る。

工程ｈ
反応液を、活性化した袋状透析膜（分画分子量=８０００～１４０００ＫＤ）に添加し、１００ｍＭのＮａｃｌ溶液中で２日間透析し、体積百分率２５vol％のエタノール中で１日間透析し、最後に、純水中で１日間透析してＨＡ－ＰＥＩ液を得、２日間凍結乾燥して白色スポンジ状物質ＨＡ－ＰＥＩを得る。

工程ｉ
乾燥したＨＡ－ＰＥＩを１０ｇ取って５０ｍＬの蒸留水に分散し、希塩酸溶液をｐＨ７．１となるまで添加し、その後、蒸留水を添加して１００ｍＬに定容する。

工程ｊ
０．２μｍのろ過膜を用いて当該溶液を滅菌処理し、濃度が１００ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＰＥＩ母液を得る。

人工エクソソーム複合体を、ヒアルロン酸受容体により深部皮膚の活性物質に対する吸収を顕著に促進できる製剤に調製する、人工エクソソーム複合体の使用。

さらに、前記剤型は、臨床上許容されるいずれかの剤型である。

さらに、人工エクソソーム複合体は、前記の深部皮膚の活性物質の唯一の活性成分に対する吸収を促進する製剤であるか、あるいは、当該複合体は、他の物質とともに前記の皮膚の活性物質に対する吸収を促進する製剤の製造に用いられる。

本発明は、従来技術と比べて、下記１）～４）のメリットを有する。

１）本発明のＨＡ－ＰＥＩ製造プロセスにより、直鎖状ポリエチレンイミンを得ることができる。従来のポリエチレンイミンのほとんどが分岐化したものであり、分岐化したポリエチレンイミンは、イミン基が非常に少なく、マイクロカプセル構造を非常に形成しにくいので、直鎖状ポリエチレンイミンは、人工エクソソームを形成する非常に有利なポイントである。

２）本発明のＨＡ－ＰＥＩ製造スキームにより、特定の分子量を有するＨＡ－ＰＥＩを定量で製造することができる。ＨＡ－ＰＥＩの分子量がヒアルロン酸の分子量とポリエチレンイミンの分子量とにより決められ、ポリエチレンイミンの分子量がポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）の分子量により決められるので、特定の分子量を有するＨＡ－ＰＥＩを定量で製造することができ、つまり、人工エクソソームの大きさを定量で制御することができる。

３）本発明の操作ステップは制御可能であり、大規模の工業生産が可能である。本発明の製造プロセスは、安全で、環境に優しく、増幅効果がないので、工業化生産条件を具備する。

４）本発明のＨＡ－ＰＥＩは、ヒアルロン酸のリガンド活性及び直鎖状ポリエチレンイミンの膜透過性により、包埋された活性物質を深部皮膚細胞に吸収させるのを促進することができる。

図１は、本発明の一態様に係る人工エクソソームの皮膚に対する刺激性測定である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：対照群、Ｅｘｏｃｒｉｎｅｔｒａｔｅｒ：人工エクソソーム群）。 図２は、本発明の一態様に係る人工エクソソームのＨａｃａｔ細胞形態に対する影響である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：対照群、Ｅｘｏｃｒｉｎｅｔｒａｔｅｒ：人工エクソソーム群）。 図３は、本発明の一態様に係る人工エクソソームのＨａｃａｔ細胞増殖に対する影響である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：対照群、Ｅｘｏｃｒｉｎｅｔｒａｔｅｒ：人工エクソソーム群）。 図４は、本発明の一態様に係る人工エクソソームのｐＣＤＮＡ３．１－ｅＧＦＰに対する送達効率の測定結果である。 図５は、本発明の一態様に係る人工エクソソームの、送達経路に対する測定結果である（ＤＡＰＩ：細胞核染色、Ｅｘｏｃｒｉｎｅｔｒａｔｅｒ：人工エクソソーム、Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ：ミトコンドリア）。 図６は、本発明の一態様に係る人工エクソソームのラット皮膚活性に対する影響である（Ｃｏｎｔｒｏｌ：対照群、Ｅｘｏｃｒｉｎｅｔｒａｔｅｒ：人工エクソソーム群）。

以下、具体的な実施スキームを組み合わせて本発明をさらに説明するが、本発明を制限するためではない。

以下の実施例において、特に説明がない限り、用いる方法は通常の方法であり、用いる試薬はいずれも市販されるものである。

実施例１．人工エクソソーム複合体の皮膚に対する刺激性測定
測定方法：
１０人のボランティアを募集し、新たに調製した濃度１ｍｇ／ｍＬの人工エクソソームを用いて、左手手首の内側に均一に塗り付け、右手手首の内側に再蒸留水を塗り付けて対照群とし、塗り付けた後、２０分間静置し、その間、手首内側の変化を観察し、ボランティアが痛み、痒みなどの刺激的な感覚があるか否かを記録した。

実験結果を図１に示す。

表１．人工エクソソームの皮膚テスト統計結果

実験結論：
１０人のボランティアは、人工エクソソームを塗り付けてから２０分間内に、皮膚が刺激を受けた後の赤い腫れ現象が観察されておらず、かつ、１０人のボランティアがいずれも刺激的な痛み、痒みなどがなかった。

実施例２．人工エクソソームの細胞毒性測定
測定方法：
ヒト不死化表皮細胞ＨａＣａＴを培養して、細胞を消化して９６ウエルプレート内に播種し、５０００ｃｅｌｌｓ／ウエルとした。人工エクソソーム濃度勾配を設置してＨａｃａｔ細胞を培養し、４８時間培養し続け、その間、細胞の形態を観察して、最後に、ＭＴＴ方法を用いて細胞増殖に対する影響を測定した。

実験結果を図２、３に示す。

実験結論：
人工エクソソームは、細胞レベルでは明らかな細胞毒性を見られず、かつ、細胞の増殖に対して影響がなかった。

実施例３．人工エクソソームの活性物質に対する送達効率の測定
測定方法：

人工エクソソームを担体として、Ｈａｃａｔ細胞において緑色蛍光プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ｅＧＦＰを細胞内へ送達する活性を測定した。

実験結果を図４に示す。

実験結論：
人工エクソソームは、良好な活性物質包埋効果を有し、かつ、活性物質を細胞内に有効に送達することができる。

実施例４．人工エクソソームの活性物質に対する送達経路の測定
測定方法：
人工エクソソームの活性物質に対する送達経路をさらに測定するために、染色細胞内のミトコンドリア、リソソームなどの細胞小器官を利用し、同時に、人工エクソソームを利用して緑色蛍光プラスミドｐＣＤＮＡ３．１－ｅＧＦＰを送達し、蛍光の局在情報により活性物質の送達領域を分析した。

実験結果を図５に示す。

実験結論：
人工エクソソームは、活性物質をミトコンドリア部位に直接に送達できることが明らかにされ、当該送達経路により、ミトコンドリア機能を調節し、ミトコンドリア機能の安定性を促進し、最後に抗炎症、修復の役割を果たせることが推定される。

実施例５．人工エクソソームのラット皮膚活性に対する影響の測定
測定方法：
実験動物は、Ｖｉｓｔａラットであり、カルボキシメチルセルロースナトリウムと、活性物質を包埋した人工エクソソームとを使用し、人工エクソソームの濃度を１ｍｇ／ｍＬとした。１週間継続して、ラット背部に人工エクソソームを塗り付け、活性物質を溶解したカルボキシメチルセルロースナトリウムゲルを対照群に塗り付けた。１週間後、ラット背部の皮膚組織を取り、表皮細胞の活性タンパク質Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎの発現状況について免疫蛍光アッセイを行い、蛍光の強弱により人工エクソソームの機能的浸透作用をフィードバックした。

実験結果を図６に示す。

実験結論：
上皮細胞が活性状態にあるときに、膜蛋白質を発現し、免疫蛍光アッセイは緑色蛍光の強弱によりＣｙｔｏｋｅｒａｔｉｎの発現量を反映してさらに表皮細胞の活性をフィードバックすることができる。結果から見れば、人工エクソソームを含まない活性物質は、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎの発現を有効に刺激することができず、即ち、細胞活性を有効に活性化させることができない。しかしながら、人工エクソソームを添加した後、皮膚組織細胞は、Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎを高度に発現し、人工エクソソームは、表皮細胞の活性を活性化させ、細胞の活性物質に対する吸収に有利である。また、実験結果から、人工エクソソームは、深部皮膚細胞の活性を有効に活性化させることができることを明らかにした。人工エクソソームはヒアルロン酸成分を含有するので、表面皮膚の角化層、透明細胞層などの細胞は、ヒアルロン酸受容体を有効に発現できないので、人工エクソソームを有効に吸着できないので、活性成分を、ヒアルロン酸受容体を含有する有棘細胞層及び基底細胞層に深く送達して、スキンケア効果をより有効にすることができると推定する。

本発明の実施例を示して説明したが、当業者にとって、本発明の原理及び趣旨を逸脱しない限り、これらの実施例に対して様々な変化、変更、置き換え及び変形を行うことができ、本発明の範囲は、添付の請求項およびその等価物により限定される。

Claims (9)

1. 直鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）及びヒアルロン酸（ＨＡ）を製造原料とすることを特徴とする人工エクソソーム複合体。
2. 前記ヒアルロン酸は、Ｄ－グルクロン酸とＮ－アセチルグルコサミンとからなる二糖単位であり、分子量が４００～１８０００００間であり、ヒアルロン酸又はヒアルロン酸ナトリウムの形で存在することを特徴とする請求項１に記載の人工エクソソーム複合体。
3. 前記直鎖状ポリエチレンイミンは、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を硫酸水溶液で加熱、加水分解して得られ、分子量が１０００～１０００００間であることを特徴とする請求項１に記載の人工エクソソーム複合体。
4. 請求項１に記載の人工エクソソーム複合体の製造方法であって、
   工程ａ
   ４５ｇのポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）を２００ｍＬの３０％硫酸水溶液に溶解し、同時に、加熱還流装置を組み立てる、
   工程ｂ
   反応液を還流状態となるまで加熱し、同時に、反応副生物としてのプロピオン酸を判断するため蒸留された溶液のｐＨを測定し、蒸留された溶媒にプロピオン酸が存在しなくなるまでにプロピオン酸と水とを共沸させ、即ち、蒸留された溶液のｐＨが６．０～７．０間であると検出した場合、反応を停止させる、
   工程ｃ
   上記反応を中止してから、反応系の温度が０℃に低下させ、機械式撹拌を開始して時計回り一方向撹拌を行い、撹拌回転数を３００ｒ／ｍｉｎとし、その後、濃度が１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム溶液を滴下してｐＨを中性、即ち７．０に調節し、さらに、水酸化ナトリウム溶液を滴下し、ｐＨが１０～１１となるまでに、滴下を停止させる、
   工程ｄ
   ｐＨ調節過程において、固体であるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を析出させる、
   工程ｅ
   固体が全部析出した後、ろ過を行い、大量の蒸留水を用いて洗浄を行い、ろ過液のｐＨが塩基性から中性となるまでに、洗浄を中止させる、
   工程ｆ
   室温条件下、ろ過した固体を水分が残存しなくなるまで真空乾燥させる、
   工程ｇ
   ６００ｍｇのＨＡをビーカー１に入れて、３００ｍＬの蒸留水を添加して溶液Ａに調製し、さらに、１２ｇのＰＥＩをビーカー２に入れて、３００ｍｌの蒸留水を添加して溶液Ｂに調製し、
   前記溶液Ａを前記溶液Ｂに入れて、１Ｍ Ｈｃｌ溶液を添加してから、溶液のｐＨを６．５に調節し、溶液Ｃを得る、
   ６．３ｍｍｏｌのＥＤＣ（水溶性カルボジイミド、即ち、１－（３－ジメチルアミノプロピル）－３－エチルカルボジイミド塩酸塩）及び６．３ｍｍｏｌのＨＯＢｔ（１－ヒドロキシベンゾトリアゾール）を、１５ｍＬの蒸留水と１５ｍＬのＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）とで形成された混合溶媒に溶解して、溶液Ｄを得る、
   前記溶液Ｃと前記溶液Ｄとを１．５Ｌの丸底フラスコに添加し、常温で２４ｈ撹拌し、１ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを７に調節して反応液を得る、
   工程ｈ
   反応液を、活性化した袋状透析膜（分画分子量=８０００～１４０００ＫＤ）に添加し、１００ｍＭのＮａｃｌ溶液中で２日間透析し、体積百分率２５vol％のエタノール中で１日間透析し、最後に、純水中で１日間透析してＨＡ－ＰＥＩ液を得て、２日間凍結乾燥して白色スポンジ状物質ＨＡ－ＰＥＩを得る、
   工程ｉ
   乾燥したＨＡ－ＰＥＩを１０ｇ取って５０ｍＬの蒸留水に分散し、希塩酸溶液をｐＨ７．１となるまで添加し、その後、蒸留水を添加して１００ｍＬに定容し、ＨＡ－ＰＥＩ溶液を得る、
   工程ｊ
   ０．２μｍのろ過膜を用いて工程ｉで得たＨＡ－ＰＥＩ溶液を滅菌処理し、濃度が１００ｍｇ／ｍＬのＨＡ－ＰＥＩ母液を得る。
   上記の工程ａ～工程ｊを含むことを特徴とする人工エクソソーム複合体の製造方法。
5. アミド結合、あるいはエチル基、イミン、第３級アミン及びアミドなどをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の人工エクソソーム複合体。
6. 人工エクソソーム複合体は、水溶液の形で、濃度が１ｍｇ／ｍＬ～１ｇ／ｍＬ間となるように調製されることを特徴とする請求項１に記載の人工エクソソーム複合体。
7. 人工エクソソーム複合体を、ヒアルロン酸受容体により深部皮膚の活性物質に対する吸収を顕著に促進できる製剤に調製することを特徴とする人工エクソソーム複合体の使用。
8. 前記剤型は、臨床上許容されるいずれかの剤型であることを特徴とする請求項７に記載の使用。
9. 人工エクソソーム複合体は、前記の深部皮膚の活性物質の唯一の活性成分に対する吸収を促進する製剤であるか、あるいは、当該複合体は、他の物質とともに前記の皮膚の活性物質に対する吸収を促進する製剤の製造に用いられる、ことを特徴とする請求項７に記載の使用。
   

Images