CN106727323A - 一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用 - Google Patents

一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用，可有效解决透明质酸纳米囊泡的制备及实现在肿瘤基因治疗药物中的应用问题，技术方案是，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，本发明原料来源广泛，制备方法简单，成本低廉，制得的透明质酸纳米囊泡形态规则，粒径范围100‑300nm，结构稳定，分布均匀，生物相容性好，毒性低，能够负载高分子质量核酸类抗肿瘤药物，高摄取并转染至肿瘤细胞，从而实现在肿瘤治疗药物中的应用。

Description

一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，特别是一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用。
背景技术
研究证明，人类很多种疾病都与基因的功能或结构改变密切相关，基因治疗已成为改善人类健康的新兴医学治疗手段。基因治疗的关键在于选择合适的基因载体，使治疗基因高效、快速的运送至目的细胞，并实现其生物学功能。基因载体主要分为病毒基因载体和非病毒基因载体（Current Drug Delivery,2004,1:165）。与病毒基因载体相比，非病毒基因载体具有低毒性、无免疫性、容易制备、以及适用于体内研究等优点，而被广泛应用。
由于磷酸基团的存在，DNA、RNA等核酸分子通常带有负电荷，因此以核酸为主体的基因传递载体通常带有一定的正电荷。研究表明，适量的正电荷不仅有利于核酸的压缩和包载，而且能够与负电荷的细胞膜发生相互作用，提高细胞摄取率。比如，我们曾以高度正电荷的聚乙烯亚胺修饰昆布多糖，构建得到一种阳离子化基因传递载体，它可以负载治疗性核酸片段高效转染至乳腺癌细胞，并有效抑制肿瘤生长（Bioconjugate Chemistry,2016,27:66）。但是，阳离子化的基因传递载体也存在其难以克服的缺点：由于正电荷的作用与血浆蛋白快速结合，并很快被体内的网状内皮系统清除，因而在体内的半衰期很短，不利于治疗基因的递送（Cell Research,2015,25:237）。
透明质酸（Hyaluronic acid, HA）是糖胺聚糖中的一种，属于酸性粘多糖，广泛分布于人体各部位，是构成细胞外基质和胞间质的主要成分，在维持细胞外基质结构及调节细胞内活动方面都起着重要的作用（Carbohydrate Polymers,2007,10:1）。研究发现，HA不但具有良好的生物相容性、可降解性、高黏弹性及非免疫原性等物理化学和生物学性质，而且可以与肿瘤细胞表面过量表达的CD44受体结合，增强了肿瘤细胞结合和内化透明质酸的能力，对肿瘤血管的生成、肿瘤转移性及侵袭性等具有重要的调节作用。不仅如此，HA 结构中存在多种活性基团，有利于作为抗肿瘤药物载体材料的修饰。因此，HA 在肿瘤靶向给药系统中的应用受到越来越多的关注（Controlled Release,2011,156:231），具有极大的发展潜力和独特优势。但是至今未见到有关透明质酸纳米囊泡及其作为基因传递载体的公开报道。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种透明质酸纳米囊泡及其制备方法和应用，可有效解决透明质酸纳米囊泡的制备及实现在肿瘤基因治疗药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种透明质酸纳米囊泡，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，所述透明质酸的分子量为50-5000 kD，聚乙烯亚胺的分子量为600-2000 D，透明质酸与、功能长链和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：3-10：3-10；所述功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸。
其制备方法包括以下步骤：
（1）将120-170mg透明质酸加入到12-17mL的N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，加入50-250mg活化试剂，避光，氮气保护下室温搅拌反应3-5h，再加入220-270mg功能长链，室温搅拌反应40-55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；所述的活化试剂为 N-羟基丁二酰亚胺、羰基二咪唑、马来酸酐、乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和三乙胺中的一种或两种；所述的功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸
（2）将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加1-5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡；
或将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入50-250mg活化试剂活化4h后，再与400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
所述方法制备的透明质酸纳米囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用。
本发明原料来源广泛，制备方法简单，成本低廉，制得的透明质酸纳米囊泡形态规则，粒径范围100-300nm，结构稳定，分布均匀，生物相容性好，毒性低，能够负载高分子质量核酸类抗肿瘤药物，高摄取并转染至肿瘤细胞，从而实现在肿瘤治疗药物中的应用。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将150mg透明质酸加入到15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂138mg乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg N-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加1ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例2
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将120mg透明质酸加入到12mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂30mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应3h，再加入220mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应40h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂30mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐活化4h后，加入400mg的聚乙烯亚胺反应36h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例3
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将170mg透明质酸加入到17mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂150mg的乙基-(3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mg N-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应5h，再加入270mg氨基末端长链酸，室温搅拌反应55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL的超纯水中加入活化试剂150mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mg N-羟基丁二酰亚胺活化4h后，再与600mg的聚乙烯亚胺反应72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例4
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将140mg透明质酸加入到14mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和50mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入240mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入550mg的聚乙烯亚胺反应55h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例5
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将160mg透明质酸加入到16mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和100mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入260mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂138mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg N-羟基丁二酰亚胺活化4h后，再与550mg的聚乙烯亚胺反应50h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例6
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将170mg透明质酸加入到17mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和150mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入270mg氨基末端长链酸，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂120mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和80mg马来酸酐活化4h后，再与580mg的聚乙烯亚胺反应65h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例7
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将150mg透明质酸加入到15mL二甲基亚砜中，加入活化试剂138mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg 马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加4ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
实施例8
本发明在具体实施中可由以下方法制得：
将150mg透明质酸加入到15mL二甲基亚砜中，加入活化试剂138mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg 马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂100mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和80mg马来酸酐活化4h后，与500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
本发明制备的透明质酸纳米囊泡经多次反复实验，其效果非常好，取得了满意的有益技术效果，有关试验资料如下：
实验一：将不同质量的透明质酸纳米囊泡加入到去离子水中，加入1μg质粒DNA，室温放置，进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果显示，当加入0.3μg以上透明质酸纳米囊泡时，DNA条带完全消失，这说明当透明质酸纳米囊泡的质量高于或等于质粒DNA的0.3倍时，可以完全负载，实验结果表明透明质酸纳米囊泡具有良好的核酸负载能力。
实验二：人乳腺癌细胞MCF-7在含有10%胎牛血清的培养基和37℃的条件下常规培养，按照5×103个/孔接种于96孔板，将不同质量的透明质酸纳米囊泡加入到培养基中，48h后，四甲基偶氮唑盐比色法测定细胞增殖，实验结果显示，随着透明质酸含量的增加，细胞存活率稍有下降，但在0-200μg/ml的范围内，透明质酸纳米囊泡对细胞生长没有抑制作用，试验结果表明透明质酸纳米囊泡具有良好的生物相容性。
实验三：人肝癌细胞HepG2在含有10%胎牛血清的培养基和37℃的条件下常规培养，按照2.0×105个/孔接种于6孔板，将含有1.5μg/ml pEGFP-C1的HA-PEI/pEGFP-C1加入到培养基中，72h后，流式细胞仪测定绿色荧光蛋白的表达量，实验结果显示绿色荧光蛋白的表达量为55.8%，实验结果表明透明质酸纳米囊泡能够将质粒pEGFP-C1转染进细胞，并高效表达出绿色荧光蛋白。
在上述实验中，所用到的细胞株，质粒，核酸序列为：
1、细胞株：人乳腺癌MCF-7细胞、人肝癌细胞HepG2购自中国科学院细胞库。
2、质粒：绿色荧光蛋白表达质粒pEGFP-C1（GenBank登录号U55763）购自BDBiosciences Clontech公司。
在实验中，所述透明质酸纳米囊泡作为基因传递载体在肿瘤治疗中的应用，还包括将抗肿瘤基因治疗药物与透明质酸纳米囊泡混合，然后进行体外抗肿瘤的生物学评价。
所述抗肿瘤基因治疗药物为装载有治疗基因的质粒、装载有治疗基因的病毒载体中的一种或几种。
所述的肿瘤细胞为人器官表面或内部出现的各种实体瘤细胞，包括乳腺癌细胞、肝癌细胞、肺癌细胞、食管癌细胞、鼻咽癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、肾癌细胞、胃癌细胞、阴茎癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、胰腺癌细胞、舌癌细胞、恶性黑色素瘤细胞中的一种。
所述的肿瘤为人器官表面或内部出现的各种实体瘤，包括乳腺癌、肺癌、卵巢癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、前列腺癌、肾癌、阴茎癌、皮肤癌、白血病、胰腺癌、舌癌、胃癌、恶性黑色素瘤中的一种。
由上述表明，本发明透明质酸纳米囊泡经反复多次试验，均取得了满意的有益的技术效果，充分证明，本发明通过功能长链将聚乙烯亚胺连接到透明质酸上形成囊泡结构，克服了透明质酸及阳性聚乙烯亚胺已知的缺点，本发明中的透明质酸纳米囊泡，具有广泛的原料来源，简便的制备方法，低廉的成本，稳定的结构，良好的生物相容性，低毒性，核酸负载能力强，透明质酸纳米囊泡作为一种良好的抗肿瘤基因治疗载体，并将其用于基因治疗领域，有效实现了透明质酸纳米囊泡作为基因传递载体在肿瘤治疗药物中的应用，制备方法简单，开辟了肿瘤治疗的药物新途径，具有巨大的经济和社会效益。

Claims (10)

1.一种透明质酸纳米囊泡，其特征在于，该透明质酸是经化学键接枝功能长链，并且在功能长链的末端接枝聚乙烯亚胺，当与核酸发生相互作用时，聚乙烯亚胺通过静电相互作用对核酸进行压缩，透明质酸完全包裹在聚乙烯亚胺/核酸的周围形成囊泡结构，所述透明质酸的分子量为50-5000 kD，聚乙烯亚胺的分子量为600-2000 D，透明质酸与、功能长链和聚乙烯亚胺的摩尔比为1：3-10：3-10；所述功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸。
2.权利要求1所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将120-170mg透明质酸加入到12-17mL的N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜中，加入50-250mg活化试剂，避光，氮气保护下室温搅拌反应3-5h，再加入220-270mg功能长链，室温搅拌反应40-55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；所述的活化试剂为 N-羟基丁二酰亚胺、羰基二咪唑、马来酸酐、乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和三乙胺中的一种或两种；所述的功能长链为长链二胺、氨基末端长链醇和氨基末端长链酸；
（2）将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加1-5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡；
或将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入50-250mg活化试剂活化4h后，再与400-600mg的聚乙烯亚胺反应36-72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
3.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将150mg透明质酸加入到15mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂138mg乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg N-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加1ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
4.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将120mg透明质酸加入到12mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂30mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应3h，再加入220mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应40h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂30mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和20mg马来酸酐活化4h后，加入400mg的聚乙烯亚胺反应36h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
5.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将170mg透明质酸加入到17mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂150mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mg N-羟基丁二酰亚胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应5h，再加入270mg氨基末端长链酸，室温搅拌反应55h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂150mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和100mg N-羟基丁二酰亚胺活化4h后，再与600mg的聚乙烯亚胺反应72h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
6.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将140mg透明质酸加入到14mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和50mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入240mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水后滴加5ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入550mg的聚乙烯亚胺反应55h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
7.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将160mg透明质酸加入到16mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和100mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入260mg氨基末端长链醇，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂138mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg N-羟基丁二酰亚胺活化4h后，再与550mg的聚乙烯亚胺反应50h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
8.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将170mg透明质酸加入到17mL的N,N-二甲基甲酰胺中，加入活化试剂60mg的羰基二咪唑和150mg的三乙胺，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入270mg氨基末端长链酸，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15 mL 的超纯水中加入活化试剂120mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和80mg马来酸酐活化4h后，再与580mg的聚乙烯亚胺反应65h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
9.根据权利要求2所述的透明质酸纳米囊泡的制备方法，其特征在于，将150mg透明质酸加入到15mL二甲基亚砜中，加入活化试剂138mg的乙基-( 3-二甲基丙基)碳化二亚胺盐酸盐和84mg 马来酸酐，避光，氮气保护下室温搅拌反应4h，再加入250mg长链二胺，室温搅拌反应48h，加入体积浓度95%的乙醇透析24h，再用超纯水透析48h，冷冻干燥，得功能长链修饰的透明质酸；将上述产物溶于15mL 的超纯水后滴加4ml质量浓度3.7%的盐酸，再加入500mg的聚乙烯亚胺反应48h，产物用超纯水透析3d，冷冻干燥，即得透明质酸纳米囊泡。
10.权利要求2-9任一项所述方法制备的透明质酸纳米囊泡在制备治疗肿瘤药物中的应用。
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