CN105063090A - 仿组蛋白基因载体及其制备方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种仿组蛋白基因载体及其制备方法和用途；具体涉及一种可递送基因的仿组蛋白基因载体PCAH，还提供一种基因载体系统由精氨酸，组氨酸等碱性氨基酸脱羧基产物胍丁胺、组胺和二丙烯酰胱胺而合成的聚合物，通过与核酸之间静电吸附自组装而成。本发明还公开了仿组蛋白基因载体的制备方法及其在基因治疗中的作用。本发明的仿组蛋白基因载体具有很好的细胞穿透功能，仿组蛋白基因载体转染细胞效率高且细胞毒性低，为疾病的基因治疗提供了一种有效的手段。
Description
技术领域
本发明涉及一种仿组蛋白基因载体及其制备方法和应用，属于基因载体技术领域。
背景技术
基因治疗为癌症等疑难疾病的治疗提供了一种新的可能。成功的基因治疗可将目的基因顺利送达病变细胞，并使目的基因得以表达，这一过程需借助一定的基因传递载体。基因传递载体包括病毒类载体和非病毒类载体。虽然病毒类载体的基因转染效率高，但是非病毒类载体具有免疫原性小，靶向特异性，造价低廉，使用方便等特点，从而在众多方面优于病毒类载体。本课题所研究的——仿组蛋白基因载体系统除了生物载体基因输送系统所具有的优势外，转染效率也有显著的提高。
组蛋白作为天然的染色体组成成分具备优异的核酸压缩性能。研究发现将组蛋白作为基因载体进行基因治疗可以有效的介导基因转运。首先组蛋白表面存在大量的精氨酸、赖氨酸等碱性氨基酸，其可通过静电作用与DNA形成稳定的复合物，继而通过内吞作用将基因载体转运至肿瘤细胞内。
然而，天然的组蛋白提纯分离困难，价格昂贵。故，在体外合成一种既能模仿组蛋白的高效压缩核酸性能，又可以继续保持其低毒性的高分子材料，这在基因递送方面显示出一定的优势。本课题设想借助精氨酸与组氨酸的脱羧基产物胍丁胺与组胺和含有二硫键的二丙烯胱酰胺(CBA)通过迈克尔加成反应制备仿组蛋白基因载体，其可高效压缩DNA，且具有天然组蛋白具有的生物相容性好，转染能力优良的特点。
谷胱甘肽(GSH)是一种天然生理成分，它具有解毒、延缓衰老、增强机体免疫性能、抗癌等作用。病理条件下，肿瘤的存在会使人体会产生有害的氧自由基，而人体自身产生的GSH可以降低此自由基对细胞的损害。故，利用肿瘤细胞内的缺氧还原性环境，使得具有二硫键的仿组蛋白基因载体PCAH基因载体系统在癌细胞的还原断裂，基因载体分解，从而实现基因的的可控释放。
综上，本发明拟利用精氨酸，组氨酸等碱性氨基酸的脱羧基产物与二丙烯酰胱胺的迈克尔加成反应来制备具有仿组蛋白性质的生物可降解高分子基因载体，并探讨反应条件、胍丁胺与组胺的投料比等的变化对产物分子量和DNA压缩能力的影响，期待借助该高分子上与穿膜肽类似的大量胍基的存在，使其具有对肿瘤细胞的高效穿透能力。
发明内容
目的：为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供一种仿组蛋白基因载体，。
技术方案：为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一种仿组蛋白基因载体，以精氨酸，组氨酸等碱性氨基酸脱羧基产物胍丁胺，组胺和二丙烯胱酰胺(CBA)为原料，通过迈克尔加成反应合成仿组蛋白基因载体PCAH；仿组蛋白基因载体PCAH的化学结构式如下：其中，x为正整数，y为自然数，
上述的仿组蛋白基因载体，制备方法如下：将一定比例的胍丁胺和/或组胺，二丙烯胱酰胺在搅拌下加入甲醇共混；通入Ar保护，油浴80-100℃，搅拌下反应12-150h，即得仿组蛋白基因载体PCAH。
具体包括以下步骤：
(1)二丙烯胱酰胺的合成：将氢氧化钠，溶解于的二氯甲烷中的丙烯酰氯逐滴加入到胱胺二盐酸盐的水溶液中，冰浴，室温搅拌反应，得到CBA粗品；使用二氯甲烷多次萃取CBA，合并有机相，加入无水硫酸钠除水分；将溶液抽滤，滤液旋蒸，加入300mL乙酸乙酯，70℃水浴溶解，室温滴加正庚烷，静置沉淀；将沉淀烘箱干燥，称重，得到白色固体，即二丙烯胱酰胺；
(2)将二丙烯胱酰胺、胍丁胺和组胺在搅拌下加入甲醇共混；通入Ar保护，油浴90℃，搅拌反应24h，透析纯化即得仿组蛋白基因载体PCAH。
作为优选方案，反应中加入的二丙烯胱酰胺：胍丁胺：组胺的摩尔比为1:0.01-1:0-1，且反应中加入的胍丁胺和组胺的摩尔数之和等于二丙烯胱酰胺的摩尔数。可以选用胍丁胺和组胺的混合物或者只有胍丁胺。
所述仿组蛋白基因载体的分子量为1000-100000。
本发明还提供上述的仿组蛋白基因载体在制备用于肿瘤、代谢性疾病、纤维化、神经退行性疾病基因治疗中的用途。
本发明的另一目的是，提供一种可还原响应释放基因的基因载体系统，即上述的仿组蛋白基因载体与核酸形成的复合物。
所述核酸为小干扰RNA或者质粒DNA。
所述复合物的粒径范围为50-100nm，表面电荷为+20-+50mV。
有益效果：本发明提供的仿组蛋白基因载体与现有技术相比，具有以下优点：
(1)借助精氨酸与组氨酸的脱羧基产物胍丁胺与组胺和含有二硫键的二丙烯胱酰胺(CBA)通过迈克尔加成反应制备仿组蛋白基因载体，其可高效压缩核酸，且具有天然组蛋白具有的生物相容性好，转染能力优良的特点。
(2)借助该高分子上穿膜肽的大量胍基，使其具有对肿瘤细胞的高效穿透能力。
(3)具有二硫键的PCAH基因载体系统在癌细胞内高GSH浓度的还原响应下断裂，基因载体分解，从而实现核酸的高效释放。
附图说明
图1是仿组蛋白基因载体PCAH的核磁氢谱图(1A)和分子量表征(1B)；
图2是PCAH与DNA结合能力的凝胶电泳图；
图3是PCAH基因载体系统的还原响应凝胶电泳图；
图4是PCAH基因载体系统在HepG2细胞上转染效果图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作更进一步的说明。
实施例1：PCAH基因载体的制备
称取0.2g胍丁胺(1mmol)和0.52g二丙烯胱酰胺(2mmol)和0.18g组胺(1mmol)于烧瓶中，加入3mL甲醇搅拌下共混。通Ar保护，油浴升温至90℃，搅拌反应24h，透析纯化。仿组蛋白基因载体PCAH的核磁氢谱图如图1A所示，其分子量经GPC表征如图1B所示。
实施例2：PCAH基因载体与DNA结合的基因载体系统(PCAH-DNA)的制备
将PCAH基因载体与DNA以不同质量比混合，共孵育30min即PCAH-DNA复合物。凝胶电泳实验所得PCAH-DNA复合物的最佳结合质量比例为2：1，实验结果如图2。所得PCAH-DNA复合物的粒径与表面电荷如下：
| PCAH：DNA(w/w) | 粒径(nm) | 表面电荷(mV) |
| 1:1 | 46.9±1.6 | 24.84±1.62 |
| 2:1 | 33.4±0.9 | 20.27±2.41 |
| 5:1 | 39.6±2.7 | 29.44±2.28 |
| 10:1 | 53.8±4.3 | 50.42±3.66 |
| 20:1 | 94.2±7.8 | 29.9±0.66 |
实施例3：PCAH-DNA基因载体系统的还原响应实验
利用二硫代苏糖醇(DTT)模拟细胞内高浓度的GSH环境，用凝胶电泳实验，考察PCAH-DNA基因载体系统的还原响应能力，实验进行各组分比例如下：
| Polymer/DNA | DNA(μL) | Polymer(μg/mL,μL) | DTT&H2O | 染料(μL) |
| Blank | 2 | 0 | 16μL H2O | 2 |
| PCAH-2 | 2 | 0.1μg/μL,4μL | 12μL H2O | 2 |
| PCAH-2 | 2 | 0.1μg/μL,4μL | 9μL DTT+3μL H2O | 2 |
| PCAH-5 | 2 | 1μg/μL,1μL | 15μL H2O | 2 |
| PCAH-5 | 2 | 1μg/μL,1μL | 9μL DTT+6μL H2O | 2 |
所得实验结果如图3所示。
实施例4：PCAH-DNA基因载体系统的细胞转染试验
将HepG2细胞接种于两块24孔板上，每孔10000个细胞，DMEM培养液，37℃培养24h。根据样品(1mg/mL)凝胶电泳实验确定的最佳结合比例在HepG2细胞进行转染实验。加入24孔板前先将pGL-3质粒DNA滴加入配好的载体聚合物溶液中，制成纳米粒，从培养箱中取出24孔板，吸走上清。处理好后，培养箱培养4h后，吸走上清，各孔加入1mL的完全培养基，在培养箱中培养24h，按照荧光素酶转染试剂盒说明操作，进行荧光素定量实验。实验结果见图4。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种仿组蛋白基因载体，其特征在于，仿组蛋白基因载体PCAH的化学结构式如下：
其中，x为正整数，y为自然数。
2.根据权利要求1所述的仿组蛋白基因载体，制备方法如下：将一定比例的胍丁胺和/或组胺，二丙烯胱酰胺在搅拌下加入甲醇共混；通入Ar保护，油浴80-100℃，搅拌下反应12-150h，即得仿组蛋白基因载体PCAH。
3.根据权利要求2所述的仿组蛋白基因载体，其特征在于：反应中加入的二丙烯胱酰胺：胍丁胺：组胺的摩尔比为1:0.01-1:0-1，且胍丁胺和组胺的摩尔数之和等于二丙烯胱酰胺的摩尔数。
4.根据权利要求1所述的仿组蛋白基因载体，其特征在于：所述仿组蛋白基因载体的分子量为1000-100000。
5.根据权利要求1-4任一项所述的仿组蛋白基因载体在制备用于肿瘤、代谢性疾病、纤维化、神经退行性疾病基因治疗中的用途。
6.一种如权利要求1-5任一项所述的仿组蛋白基因载体与核酸形成的复合物。
7.根据权利要求6所述的复合物，其特征在于：所述核酸为小干扰RNA或者质粒DNA。
8.根据权利要求6所述的复合物，其特征在于：所述复合物的粒径范围为50-100nm，表面电荷为+20-+50mV。
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