CN112778520A - 一种阳离子聚合物、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种阳离子聚合物，该阳离子聚合物可作为谷胱甘肽响应型基因载体，该阳离子聚合物是由N,N'‑双(丙稀酰)胱胺(CBA)、氨乙基哌嗪(AEP)以及组胺(His)形成的含有双硫键阳离子聚合物(表示为CBA‑AEP‑His)。本发明的基因载体在细胞内可以被还原有效释放基因，在细胞外稳定。具有的高缓冲容量可以有效保护DNA不被降解同时具有较低的细胞毒性。对于利用非病毒基因载体进行基因递送具有长远前景。

Description

一种阳离子聚合物、制备方法及应用

技术领域

本发明属于基因载体材料技术领域，具体涉及一种阳离子聚合物、制备方法及应用。

背景技术

长期以来，基于基因疗法的治疗顽固性疾病的新方法因其巨大的优势而得到发展。将治疗基因导入靶细胞和细胞核对治疗的成功起着重要作用。其中，病毒载体表现出高转染效率，但同时会扰乱免疫反应，并产生非特异性炎症。为了避免这些并发症，非病毒载体的构建和发展是非常必要的。

阳离子聚合物由于具有较低致免疫性以及可以多功能修饰受到了广泛关注，但其部分毒性以及在体内的不稳定性限制了这类载体的发展应用。为了解决这些问题，含有酯键、磷酸酯键以及缩醛键在内的各种类型的高分子非病毒基因载体成为如今基因载体研究的重要方向。

小口径人工血管和支架的快速内皮化是解决内膜增生、血栓形成和再狭窄等问题的关键。基因治疗可以通过转染内皮细胞的方法促进内皮细胞的增殖和迁移，有利于实现生物材料表面的快速内皮化。

有文献报道很多基因载体，但是这些载体对于癌细胞以及肾成纤维细胞有较为理想的转染效果，而对于血管内皮细胞还没有有效的基因载体，亟需为血管内皮细胞研发一种高效基因载体。目前，尚没有用此类载体转染内皮细胞的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种阳离子聚合物，该聚合物可作为谷胱甘肽响应型基因载体，该基因载体是利用细胞内外环境中谷胱甘肽含量的差异，制备得到的一种响应型基因载体。本发明的基因载体在细胞内可以被还原有效释放基因，在细胞外稳定。具有的高缓冲容量可以有效保护DNA不被降解同时具有较低的细胞毒性。对于利用非病毒基因载体进行基因递送具有长远前景。

本发明的另一个目的是，提供一种阳离子聚合物的制备方法。

本发明的另一个目的是，提供一种阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种阳离子聚合物，表示为通式(Ⅰ)；

其中，所述m和n均为正整数。

一种上述技术方案中所述的阳离子聚合物的制备方法，包括以下步骤：

将N,N'-双(丙稀酰)胱胺(CBA)，组胺(His)，氨乙基哌嗪(AEP)按照摩尔质量比为2:X:Y的比例分散于溶剂中，在45℃下避光反应6天，得到初级反应混合物；并且所述X+Y＝2；

再向所述初级反应混合物中再次加入氨乙基哌嗪(AEP)，再次加入氨乙基哌嗪(AEP)的量为第一次加入氨乙基哌嗪(AEP)摩尔质量的10％，在45℃下避光反应2天，得到最终反应混合物；

向所述最终反应混合物中加入去离子水，采用盐酸酸化至pH值为4，采用透析膜透析纯化至pH值为4，并将产物冻干、收集，制备得到所述阳离子聚合物。

上述技术方案中，所述透析膜的型号为MWCO 1000。

上述技术方案中，所述冻干的过程为在-40℃冰箱冷藏过夜，在-48℃冷藏干燥机保存。

上述技术方案中，所述溶剂为甲醇与水的混合物，甲醇与水的体积比为9:1。

上述技术方案中，所述盐酸的浓度为6mol/L。

一种上述技术方案中所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体的应用。

一种上述技术方案中所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体在细胞转染过程中的应用。

一种上述技术方案中所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体在内皮细胞转染过程中的应用。

一种上述技术方案中所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体在血管内皮细胞转染过程中的应用。

本发明的优点和有益效果为：

(1)本发明的阳离子聚合物载体负载基因后进入细胞，载体中的双硫键智能响应细胞内的谷胱甘肽进行断裂，释放目的基因有效转染内皮细胞。具有双硫键的聚合物在中性生理条件下很稳定，但在细胞内的还原性环境下降解，有利于负载基因后，有效转染细胞。

(2)本发明的阳离子聚合物载体毒性低，具有更好的生物相容性。

(3)本发明的阳离子聚合物载体中的组胺基团提高了聚合物的缓冲容量，有利于提高内涵体逃逸功能。提高基因递送能力，达到促进内皮细胞黏附增殖，促进内皮化及血管形成。以解决目前非病毒载体面临的问题。

附图说明

图1为本发明的阳离子聚合物合成反应路线图；

图2a为本发明的阳离子聚合物的结构式；

图2b为本发明的阳离子聚合物的核磁氢谱图；

图3为琼脂糖凝胶电泳阻滞图，其中(1)为载体负载基因的电泳图；(2)为加入了DTT后观察基因被释放情况的电泳图；

图4为人脐静脉内皮细胞的相对细胞活力图。

图5为划痕实验细胞迁移图。(1)EA.hy926细胞在不同时间的迁移过程，(2)利用Image-Pro Plus(6.0)软件计算的12h的迁移面积。其中，(A)只加入单独pZNF580基因的细胞作为无处理对照组，(B)、(C)、(D)实施例2得到的不同质量比的载体及基因的复合物(60/1、80/1、100/1)，(E)PEI25Da/pZNF580(质量比为1/1)作为对照基因复合物。

对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。

实验过程中使用的组胺(His)、氨乙基哌嗪(AEP)、b-聚乙烯亚胺25kDa(b-PEI25kDa)、二硫苏糖醇(DTT)、溴化乙锭(EtBr)购自北京Sigma-Aldrich。N,N-半胱氨酸双丙烯酰胺(CBA)购自中国北京Alfa-Aser公司，3-(4,5-二甲基噻唑-2-酰基)-2,5-二苯基四唑溴化铵(MTT)和二甲基亚砜(DMSO)购自北京鼎国昌盛生物科技有限公司。EA.hy926细胞取自中国科学院细胞库。ZNF580基因来源：ZNF580是由武警后勤学院生理与病理实验室张文成课题组首先克隆并于Genbank注册的C2H2型转录因子新基因，注册号为AF184939。pEGFP为市售。

实施例1

一种上述技术方案中所述的阳离子聚合物的制备方法，包括以下步骤：

将N,N'-双(丙稀酰)胱胺(CBA)，组胺(His)，氨乙基哌嗪(AEP)按照摩尔数比为2:X:Y的比例分散于溶剂中，所述溶剂(溶剂为甲醇与水的混合物，甲醇与水的体积比为9:1。)，其中X＝Y＝1，在45℃下避光反应6天，得到初级反应混合物；所述溶剂为甲醇与水的混合物，甲醇与水的体积比为9:1；

再向所述初级反应混合物中再次加入氨乙基哌嗪(AEP)，再次加入10％摩尔过量的氨乙基哌嗪(AEP)，在45℃下避光反应2天，得到最终反应混合物；

向所述最终反应混合物中加入去离子水，采用6M盐酸酸化至pH值为4，采用透析膜(MWCO 1000)透析纯化，并将产物在-40℃冰箱冷藏过夜，在-48℃冷藏干燥机保存，制备得到所述阳离子聚合物。

得到的最终产物——阳离子聚合物，采用400MHz液体核磁(Av-500,Brukercorporation,Billerica,MA,USA.)进行表征；结果见图2。

其中，所得产物的分子量是2800Da即2800g/mol，计算得出m＝n＝4。

所述X和Y分别为组胺(His)和氨乙基哌嗪(AEP)的摩尔质量占比，且X+Y＝2的其他情况，代替实施例1中的X＝1，Y＝1，得到阳离子聚合物，也表现出和实施例1所合成的阳离子聚合物相同性质。

实施例2

将基因载体(实施例1的到的阳离子聚合物)与pZNF580复合，制备不同w/w比(基因载体与pZNF580的重量比)的基因复合物。

步骤为：在搅拌条件下，取浓度为200微克/毫升的pZNF580水溶液5微升，按w/w比(基因载体与pZNF580的重量比)分别为1，2，5，10，20，40，60，80，100滴加到基因载体水溶液中，搅拌1小时，得到不同负载量的基因复合物。对照组均采用PEI25kDa，取浓度为200微克/毫升的pZNF580水溶液5微升，按w/w比(1/1)滴加到PEI25kDa中，搅拌1小时。

实施例3

琼脂糖凝胶电泳实验考查基因载体负载基因的能力以及在还原条件下基因载体对基因的释放能力。

步骤为：采用实施例2制备得到的不同w/w比(基因载体与pZNF580的重量比)的基因复合物，孵育30分钟后与6×loading buffer混匀。为了考察基因载体在还原条件下对基因的释放能力，不同w/w比的基因复合物孵育30分钟后，加入2.5mM DTT继续孵育30分钟，然后样品在1×TAE缓冲溶液，0.8％琼脂糖凝胶，电压100伏的条件下进行电泳30分钟后，在紫外灯照射下观察质粒pZNF580在凝胶电泳中的分布位置并拍照记录。

分析结果：图3为琼脂糖凝胶电泳图。

基因载体具有负载基因的能力。实施例1制备的基因载体在w/w＝1是能够完全负载基因。在DTT存在的还原条件下，载体中的双硫键断裂，在质量比为1/1，2/1，5/1时，基因被有效释放。

实施例4

基因载体、基因复合物的细胞毒性由MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)比色法进行评价，制备的载体与基因的质量比为80/1，并且利用PEI25Da作对照。

步骤为：EA.hy926细胞接种到96孔板(1×104细胞/孔)上，细胞生长到90％后，将细胞培养基换为无血清培养基，进行饥饿处理12h。之后重新更换为无血清DMEM培养基，将不同浓度的基因载体和基因复合物水溶液加入到培养基中，混合均匀，4小时后弃去培养基，更换为完全培养基，继续培养48小时。48h后向每个孔中加入5mg·mL^-1的MTT溶液20μL，继续培养4h，使甲瓒充分结晶。培养，小心弃去孔内培养基，而后向孔内加150μL DMSO，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在490nm波长处测量各孔的光密度值(OD)。利用如下公式计算相对细胞活性(％)：

相对细胞活性(％)＝(OD-ODblank)/(OD0-ODblank)×100％

其中，OD值为实验组的吸光度值，OD0是培养基中细胞的吸光度值，以及ODblank是培养基的吸光度值。

分析结果：图4为细胞活性，分别测定了实施例1制备的基因载体及其基因复合物、PEI25kDa载体。

实施例1制备的载体的毒性很低，细胞活性很高，并且在高浓度下仍具有很高的细胞活性。相对于基因载体来说，基因复合物处理细胞后，细胞具有更高的活性，这是由于pZNF580能够促进内皮细胞增殖和迁移。

实施例5

利用划痕实验来评价人脐静脉内皮细胞经基因复合物转染后的迁移能力。

步骤为：以质量比为60/1、80/1、100/1(实施例1制备的基因载体与pZNF580的重量比)基因复合物以及PEI25Da(PEI25Da/pZNF580质量比为1/1)基因复合物转染EA.hy926细胞。48h后，在单层细胞中使用200μL枪头均匀划痕，用D-Hanks缓冲液洗涤细胞碎片。然后，利用倒置显微镜监测不同时间点(0、6、12h)的迁移过程，并根据图像计算12h后细胞的迁移面积。迁移面积百分比按以下公式计算：

相对愈合面积(％)＝(划痕面积-未愈合面积)/划痕面积×100％

分析结果：图5为EA.hy926细胞在不同时间的迁移过程(1)以及利用Image-ProPlus(6.0)软件计算的12h的迁移面积(2)。

相对于PEI25kDa基因复合物，实施例1制备的载体的基因复合物转染细胞后，细胞的迁移能力增强。基因复合物的质量比为80/1时，细胞的迁移面积最大。这是因为载体中的双硫键智能响应细胞内的谷胱甘肽进行断裂，释放目的基因有效转染内皮细胞，并且载体中的组胺基团提高了聚合物的缓冲容量，有利于提高内涵体逃逸功能。提高基因递送能力，达到促进内皮细胞黏附增殖的效果。

以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种阳离子聚合物，其特征在于，所述阳离子聚合物表示为通式(Ⅰ)；

其中，所述m和n为正整数。

2.一种如权利要求1所述的阳离子聚合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将N,N'-双(丙稀酰)胱胺，组胺，氨乙基哌嗪按照摩尔质量比为2:X:Y的比例分散于溶剂中，在45℃下避光反应6天，得到初级反应混合物；所述X+Y＝2；

再向所述初级反应混合物中再次加入氨乙基哌嗪(AEP)，再次加入氨乙基哌嗪(AEP)的量为第一次加入氨乙基哌嗪(AEP)摩尔质量的10％，在45℃下避光反应2天，得到最终反应混合物；

向所述最终反应混合物中加入去离子水，采用盐酸酸化至pH值为4，采用透析膜透析纯化至pH值为4，并将产物冻干、收集，制备得到所述阳离子聚合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述透析膜的型号为MWCO 1000。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述冻干的过程为在-40℃冰箱冷藏过夜，在-48℃冷藏干燥机保存。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇与水的混合物，甲醇与水的体积比为9:1。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述盐酸的浓度为6mol/L。

7.一种如权利要求1所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体的应用。

8.一种如权利要求1所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体在细胞转染过程中的应用。

9.一种如权利要求1所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体在内皮细胞转染过程中的应用。

10.一种如权利要求1所述的阳离子聚合物作为谷胱甘肽响应型基因载体在血管内皮细胞转染过程中的应用。

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