CN112342246A - 一种非病毒基因载体系统及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及基因运输领域,特别涉及一种非病毒基因载体系统及其制备方法和应用。本申请提供了一种非病毒基因载体系统,包括金属簇;所述金属簇由金属离子以蛋白质为模板而合成;所述蛋白质选自鱼精蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、乳清蛋白和溶菌酶中的一种或多种。本申请的非病毒基因载体系统在生理条件下可稳定担载基因,具有将基因高效运载至细胞核和细胞内示踪的功能,可应用于基因编辑和基因治疗,有效解决现有的基因载体在细胞中转染率低、不具备示踪功能的技术问题。
Description
技术领域
本申请涉及基因运输领域,特别涉及一种非病毒基因载体系统及其制备方法和应用。
背景技术
基因突变和等位基因变异通常会导致疾病异质性,从而可能导致治疗失败。因此,基于精确医学的治疗方法越来越受到关注,尤其是基于CRISPR/Cas9的基因编辑系统被报道以后。CRISPR/Cas9系统可以在特定指导RNA(gRNA)的引导下进行靶向基因组编辑,包括基因敲除,插入和替换。
目前为止,这些基因编辑系统的递送主要依赖于病毒载体或电穿孔。其中,病毒载体转染体系以其转染的高效性在当前的研究中有着广泛的应用。但这些方法仍存在各种可能阻碍临床转化的缺点。例如,病毒转导可能会导致随机插入以及免疫原性、毒性、炎症、致癌性,并且病毒载体载荷低、通用性差;电穿孔则可能导致高细胞死亡率,且不适用于全身递送。非病毒递送是另一种选择。然而,系统给药的非病毒递送仍然是一个挑战,特别是对于基于质粒的CRISPR/Cas9系统而言。研究表明,商业上可买到的脂质体载体用于CRISPR/Cas9质粒和mRNA的细胞内递送时,效率较低;已公开的非病毒载体,制备过程复杂、毒性大、不具备示踪功能。
发明内容
有鉴于此,本申请提供了一种非病毒基因载体系统及其制备方法和应用,有效解决现有的基因载体在细胞中转染率低、对细胞毒性大、不具备示踪功能的技术问题。
本申请第一方面提供了一种非病毒基因载体系统,包括金属簇;所述金属簇由金属离子以蛋白质为模板而合成;所述蛋白质选自鱼精蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、乳清蛋白和溶菌酶中的一种或多种。
作为优选,所述金属簇选自金纳米簇、银纳米簇、铜纳米簇和铁纳米簇中的一种或多种。
本申请第二方面提供了一种非病毒基因载体系统的制备方法,其包括以下步骤:
将可溶性金属盐与蛋白质在介质中反应,制得非病毒基因载体系统;所述蛋白质选自鱼精蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、乳清蛋白和溶菌酶中的一种或多种。
作为优选,所述可溶性金属盐中的金属元素选自金、银、铜和铁中的一种或多种。
作为优选,所述可溶性金属盐选自氯金酸、硝酸银、硫酸铜和氯化铁中的一种或多种。
作为优选,所述将可溶性金属盐与蛋白质在介质中反应具体为将可溶性金属盐与模板蛋白在碱性溶液中反应。
具体的,所述碱性溶液选自氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氨水溶液、碳酸钠水溶液和碳酸氢钠水溶液中的一种或多种。
作为优选,所述将可溶性金属盐与蛋白质在介质中反应具体为将可溶性金属盐与模板蛋白在抗坏血酸溶液中反应。
具体的,本申请的非病毒基因载体系统为牛血清白蛋白-金纳米簇、人血清白蛋白-金纳米簇、鱼精蛋白-金纳米簇、溶菌酶-金纳米簇、鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇、鱼精蛋白-溶菌酶-金纳米簇、鱼精蛋白-人血清白蛋白-金纳米簇、溶菌酶-人血清白蛋白-金纳米簇、牛血清白蛋白-银纳米簇、人血清白蛋白-银纳米簇、鱼精蛋白-银纳米簇、溶菌酶-银纳米簇、鱼精蛋白-牛血清白蛋白-银纳米簇、溶菌酶-牛血清白蛋白-银纳米簇、鱼精蛋白-人血清白蛋白-银纳米簇、鱼精蛋白-铜纳米簇、溶菌酶-铜纳米簇、鱼精蛋白-人血清白蛋白-铜纳米簇、鱼精蛋白-铁纳米簇、溶菌酶-铁纳米簇、鱼精蛋白-人血清白蛋白-铁纳米簇、鱼精蛋白-金/银纳米簇和溶菌酶-金/银纳米簇中的一种或多种。
本申请第三方面提供了所述的非病毒基因载体系统或所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在基因编辑或基因治疗中的应用。
作为优选,所述基因编辑或基因治疗的产品包括用于基因编辑或基因治疗的基因,和所述的非病毒基因载体系统或所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统。
作为优选,所述基因编辑或基因治疗的应用包括以下步骤:
将用于基因编辑或基因治疗的基因与所述的非病毒基因载体系统在介质中反应。
更为优选,所述介质为水性介质。
具体的,所述水性介质选自去离子水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。
作为优选,所述用于基因编辑或基因治疗的基因与所述的非病毒基因载体系统在介质中通过静电作用、氢键作用等非共价作用复合形成负载用于基因编辑或基因治疗的基因的金属簇复合物胶束。
具体的,所述用于基因编辑或基因治疗的基因选自具有基因编辑或基因治疗功能的CRISPR/Cas9质粒和mRNA。
作为优选,非病毒基因载体系统与所述用于基因编辑或基因治疗的基因的质量比值大于1。
更为优选,非病毒基因载体系统与所述用于基因编辑或基因治疗的基因的质量比值大于10。
作为优选,所述用于基因编辑或基因治疗的基因的大小为20-20000个碱基或碱基对。
更为优选,所述用于基因编辑或基因治疗的基因的大小为2000-15000个碱基或碱基对。
本申请第三方面提供了所述的非病毒基因载体系统或所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在基因示踪中的应用。
作为优选,所述基因示踪的应用包括以下步骤:将所需示踪的基因与所述的非病毒基因载体系统在介质中反应。
具体的,本申请的非病毒基因载体系统同时具有基因载体和发光的功能,即本申请的非病毒基因载体系统既能将基因递送至细胞质和细胞核中,病毒基因载体系统自身还具有荧光特性,因此,本申请的非病毒基因载体系统具有基因示踪作用。
更为优选,所述介质为水性介质;所述水性介质选自去离子水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。
作为优选,所述用于基因示踪的基因与所述的非病毒基因载体系统在介质中通过静电作用、氢键作用等非共价作用复合形成负载用于基因示踪的金属簇复合物胶束。
作为优选,非病毒基因载体系统与所述用于基因示踪的基因的质量比值大于1。
作为优选,所述用于基因示踪的基因的大小为20-20000个碱基或碱基对。
更为优选,所述用于基因示踪的基因的大小为2000-15000个碱基或碱基对。
本申请第四方面提供了所述的非病毒基因载体系统或所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在细胞成像中的应用。
作为优选,所述细胞成像的应用包括以下步骤:将所需负载的基因与所述的非病毒基因载体系统在介质中反应。
更为优选,所述介质为水性介质;所述水性介质选自去离子水、生理盐水、缓冲溶液、组织培养液或体液。
作为优选,所需负载的基因与所述的非病毒基因载体系统在介质中通过静电、氢键作用等非共价作用复合形成负载用于细胞成像的金属簇复合物胶束。
具体的,本申请的非病毒基因载体系统同时具有基因载体和发光的功能,即本申请的非病毒基因载体系统既能将基因递送至细胞质和细胞核中,病毒基因载体系统自身还具有荧光特性,因此,本申请的非病毒基因载体系统具有细胞成像作用。
作为优选,非病毒基因载体系统与所述用于细胞成像的基因的质量比值大于1。
作为优选,所述用于细胞成像的基因的大小为20-20000个碱基或碱基对。
更为优选,所述用于细胞成像的基因的大小为2000-15000个碱基或碱基对。
本申请提供了上述技术方案提供的非病毒基因载体系统或所述制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在生理条件下可稳定负载基因,避免了有机溶剂和其它有毒溶剂的使用,反应条件温和,可控性强,并且其具有细胞核靶向功能,可实现基因编辑、基因治疗、基因示踪和细胞成像的作用,本申请公开的非病毒基因载体系统的制备工艺简单,具有良好的生物相容性、水分散性、水溶性和稳定性。实验结果表明:本申请提供的非病毒基因载体系统和上述制备方法制备得到的非病毒基因载体系统的稳定性好,细胞内化和核靶向效果好,基因编辑效率高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇的透射电子显微镜照片;
图2为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇的EDS能谱图;
图3为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇的紫外吸收和荧光光谱图;
图4为本申请实施例25制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒在不同质量比条件下自组装所得金属簇复合物胶束的表面电位结果图;
图5为本申请实施例25制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒在不同质量比条件下静电自组装所得金属簇复合物胶束的电泳阻滞结果图;
图6为本申请实施例25制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束(质量比为10:1)的扫描电镜图;
图7为本申请实施例25制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束(质量比为10:1)的尺寸稳定性结果图;
图8为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇对U2OS细胞的毒性考察结果图;
图9为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒在不同比例形成金属簇复合物胶束时对U2OS细胞的毒性考察结果;
图10为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束转染细胞的细胞内化荧光照片图;
图11为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束转染细胞的细胞内化荧光强度分析结果;
图12为本申请实施例35制备的基因的示意图和结果图。其中,A图为所制备的两个基因的示意图,B图为测序结果,C图为其电泳图;
图13为本申请实施例35制备的基因(pCas9-gRNA1EGFP)、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的金属簇复合物胶束、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的金属簇复合物胶束转染U2OS.GFP细胞后,U2OS.GFP的细胞内GFP基因敲除效果图。其中,a、b、c分别为DAPI荧光、GFP荧光、DAPI和GFP重叠图;
图14为本申请实施例35制备的基因(pCas9-gRNA1EGFP)、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的复合物、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的复合物的细胞内GFP基因敲除荧光分析结果图;
图15为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物对HeLa细胞的毒性考察结果图。其中,a、b、c、d、e依次为空白对照、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的金属簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的金属簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物对HeLa细胞的细胞毒性考察结果;
图16为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物与HeLa细胞共培养后,在E7靶位点的T7E1酶切图。其中,a、b、c、d、e依次为对照组、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物在E7靶位点显示出明显的基因编辑效果;
图17为本申请对照组、本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物与HeLa细胞共培养后,E7蛋白表达水平的结果图。其中,a、b、c、d、e依次为空白对照、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物对HeLa细胞中E7蛋白表达水平的考察结果
图18为本申请实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因的复合物与HeLa细胞共培养后,在潜在脱靶位点的T7E1酶切图;
图19为注射生理盐水和不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的体重随时间的变化图。在图19中,a为生理盐水组,b、c、d、e为不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物组(剂量以基因质量为基准,注射量依次为每只鼠2μg、5μg、10μg、20μg);
图20为小鼠的肿瘤体积随时间的变化图。在图20中,a、b、c、d依次为注射生理盐水、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的肿瘤体积变化;
图21为小鼠的体重随时间的变化图。在图21中,a、b、c、d依次为注射生理盐水、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的肿瘤体积变化。
具体实施方式
本申请实施例公开了一种非病毒基因载体系统及其制备方法和应用,用于解决现有技术中的基因载体在细胞中转染率低、对细胞毒性大、不具备示踪功能的技术缺陷。
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
本申请实施例提供了牛血清白蛋白-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(10.0mL,10.0mM)加入牛血清白蛋白水溶液(10.0mL,40mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌2分钟。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得牛血清白蛋白-金纳米簇。将制备的牛血清白蛋白-金纳米簇置于4℃避光保存。
对本申请得到的牛血清白蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例1得到的牛血清白蛋白-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例2
本申请实施例提供了人血清白蛋白-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(25.0mL,10.0mM)加入人血清白蛋白水溶液(25.0mL,45mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(2mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌2分钟。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得人血清白蛋白-金纳米簇。将制备的人血清白蛋白-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的人血清白蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例2得到的人血清白蛋白-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例3
本申请实施例提供了鱼精蛋白-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(25.0mL,10.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(25.0mL,2.5mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(2.5mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时。溶液颜色逐渐从浅黄色变为黄褐色,制得鱼精蛋白-金纳米簇。将制备的鱼精蛋白-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例3得到的鱼精蛋白-金纳米簇粒径为1-3纳米。
将本申请实施例的鱼精蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜分析、EDS能谱图分析、紫外吸收和荧光光谱图分析,结果如图1~3所示。
实施例4
本申请实施例提供了溶菌酶-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(10.0mL,5mM)和溶菌酶水溶液(10.0mL,10mg/mL)混合。随后将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃过夜,制得溶菌酶-金纳米簇。将制备的溶菌酶-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例4得到的溶菌酶-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例5
本申请实施例提供了鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇,其制备方法如下:
本申请实施例的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇采用一步法合成。首先,将氯金酸水溶液(25.0mL,10.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(25.0mL,2mg/mL)和牛血清白蛋白水溶液(25.0mL,10mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(2.5mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇。将制备的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例5得到的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例6
本申请实施例提供了鱼精蛋白-溶菌酶-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(25.0mL,10.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(25.0mL,2mg/mL)和溶菌酶水溶液(25.0mL,5mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(2.5mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得鱼精蛋白-溶菌酶-金纳米簇。将制备的鱼精蛋白-溶菌酶-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-溶菌酶-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例6得到的鱼精蛋白-溶菌酶-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例7
本申请实施例提供了鱼精蛋白-人血清白蛋白-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(25.0mL,10.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(25.0mL,2mg/mL)和人血清白蛋白水溶液(25.0mL,10mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(2.5mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得鱼精蛋白-人血清白蛋白-金纳米簇。将制备的鱼精蛋白-人血清白蛋白-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例7得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例8
本申请实施例提供了溶菌酶-人血清白蛋白-金纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(25.0mL,10.0mM)加入溶菌酶水溶液(25.0mL,5mg/mL)和人血清白蛋白水溶液(25.0mL,25mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(2.5mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得溶菌酶-人血清白蛋白-金纳米簇。将制备的溶菌酶-人血清白蛋白-金纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-人血清白蛋白-金纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例8得到的溶菌酶-人血清白蛋白-金纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例9
本申请实施例提供了牛血清白蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(10.0mL,8.0mM)加入牛血清白蛋白水溶液(10.0mL,40mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(1mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得牛血清白蛋白-银纳米簇。将制备的牛血清白蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的牛血清白蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例9得到的牛血清白蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例10
本申请实施例提供了人血清白蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(10.0mL,8.0mM)加入人血清白蛋白水溶液(10.0mL,40mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(1mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得人血清白蛋白-银纳米簇。将制备的人血清白蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的人血清白蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例10得到的人血清白蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例11
本申请实施例提供了鱼精蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(10.0mL,6.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(10.0mL,4mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(1mL,0.08M)于37℃反应1小时,制得鱼精蛋白-银纳米簇。将制备的鱼精蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例11得到的鱼精蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例12
本申请实施例提供了溶菌酶-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(5.0mL,8.0mM)加入溶菌酶水溶液(5.0mL,8mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(0.5mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(0.5mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得溶菌酶-银纳米簇。将制备的溶菌酶-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例12得到的溶菌酶-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例13
本申请实施例提供了鱼精蛋白-牛血清白蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(5.0mL,8.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(5.0mL,2mg/mL)和牛血清白蛋白(5.0mL,20mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(0.5mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(0.5mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得鱼精蛋白-牛血清白蛋白-银纳米簇。将制备的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例13得到的鱼精蛋白-牛血清白蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例14
本申请实施例提供了溶菌酶-牛血清白蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(5.0mL,8.0mM)加入溶菌酶水溶液(5.0mL,4mg/mL)和牛血清白蛋白(5.0mL,20mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(0.5mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(0.5mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得溶菌酶-牛血清白蛋白-银纳米簇。将制备的溶菌酶-牛血清白蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-牛血清白蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例14得到的溶菌酶-牛血清白蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例15
本申请实施例提供了鱼精蛋白-人血清白蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(5.0mL,8.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(5.0mL,4mg/mL)和人血清白蛋白(5.0mL,20mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(0.5mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(0.5mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得鱼精蛋白-人血清白蛋白-银纳米簇。将制备的鱼精蛋白-人血清白蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例15得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例16
本申请实施例提供了溶菌酶-人血清白蛋白-银纳米簇,其制备方法如下:
将硝酸银水溶液(5.0mL,8.0mM)加入溶菌酶水溶液(5.0mL,4mg/mL)和人血清白蛋白(5.0mL,20mg/mL)的混合物中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(0.5mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌30分钟。然后在强烈搅拌下加入硼氢化钠(0.5mL,0.10M)于37℃反应1小时,制得溶菌酶-人血清白蛋白-银纳米簇。将制备的溶菌酶-人血清白蛋白-银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-人血清白蛋白-银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例16得到的溶菌酶-人血清白蛋白-银纳米簇粒径为1-3.5纳米。
实施例17
本申请实施例提供了鱼精蛋白-铜纳米簇,其制备方法如下:
将硫酸铜水溶液(10.0mL,5.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(10.0mL,5mg/mL)中。随后将混合物在室温下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,搅拌10分钟。然后向混合物中逐滴加入肼(1mL),常温反应4小时,制得鱼精蛋白-铜纳米簇。将制备的鱼精蛋白-铜纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-铜纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例17得到的鱼精蛋白-铜纳米簇粒径为1-4纳米。
实施例18
本申请实施例提供了溶菌酶-铜纳米簇,其制备方法如下:
将硫酸铜水溶液(10.0mL,5.0mM)加入溶菌酶水溶液(10.0mL,2mg/mL)中。随后将混合物65℃搅拌2分钟。然后,将抗坏血酸水溶液(0.5mL,0.1M)加入到混合物中,65℃反应6小时,制得溶菌酶-铜纳米簇。溶液逐渐由无色变为淡黄色。将制备的溶菌酶-铜纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-铜纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例18得到的溶菌酶-铜纳米簇粒径为1-4纳米。
实施例19
本申请实施例提供了鱼精蛋白-人血清白蛋白-铜纳米簇,其制备方法如下:
将硫酸铜水溶液(10.0mL,5.0mM)加入鱼精蛋白水溶液(10.0mL,2mg/mL)和人血清白蛋白(10.0mL,10mg/mL)的混合物中。随后将混合物在室温下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,搅拌10分钟。然后向混合物中逐滴加入肼(1mL),常温反应4小时,制得鱼精蛋白-人血清白蛋白-铜纳米簇。将制备的鱼精蛋白-人血清白蛋白-铜纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-铜纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例19得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-铜纳米簇粒径为1-4纳米。
实施例20
本申请实施例提供了鱼精蛋白-铁纳米簇,其制备方法如下:
将氯化铁水溶液(10.0mL,60mg/mL)加入鱼精蛋白水溶液(10.0mL,10mg/mL)中。随后将混合物在室温下搅拌15分钟。然后,在剧烈搅拌和通氮气情况下,加入氨水溶液(25%,5mL),常温反应3小时,制得鱼精蛋白-铁纳米簇。将制备的鱼精蛋白-铁纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-铁纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例20得到的鱼精蛋白-铁纳米簇粒径为2-10纳米。
实施例21
本申请实施例提供了溶菌酶-铁纳米簇,其制备方法如下:
将氯化铁水溶液(5.0mL,50mg/mL)加入溶菌酶水溶液(5.0mL,20mg/mL)中。随后将混合物在室温下搅拌15分钟。然后,在剧烈搅拌和通氮气情况下,加入氨水溶液(25%,3mL),常温反应3小时,制得溶菌酶-铁纳米簇。将制备的溶菌酶-铁纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-铁纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例21得到的溶菌酶-铁纳米簇粒径为2-10纳米。
实施例22
本申请实施例提供了鱼精蛋白-人血清白蛋白-铁纳米簇,其制备方法如下:
将氯化铁水溶液(5.0mL,50mg/mL)加入鱼精蛋白水溶液(5.0mL,5mg/mL)和人血清白蛋白水溶液(5.0mL,25mg/mL)中。随后将混合物在室温下搅拌15分钟。然后,在剧烈搅拌和通氮气情况下,加入氨水溶液(25%,3mL),常温反应3小时,制得鱼精蛋白-人血清白蛋白-铁纳米簇。将制备的鱼精蛋白-人血清白蛋白-铁纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-铁纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例22得到的鱼精蛋白-人血清白蛋白-铁纳米簇粒径为2-10纳米。
实施例23
本申请实施例提供了鱼精蛋白-金/银纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(5.0mL,10.0mM)和硝酸银水溶液(5.0mL,6.0mM)加入鱼精蛋白(10.0mL,2.5mg/mL)中。随后将混合物在37℃下搅拌2分钟。然后,将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中,37℃搅拌2分钟。然后在强烈搅拌下于37℃反应12小时,制得鱼精蛋白-金/银纳米簇。将制备的鱼精蛋白-金/银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的鱼精蛋白-金/银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例23得到的鱼精蛋白-金/银纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例24
本申请实施例提供了溶菌酶-金/银纳米簇,其制备方法如下:
将氯金酸水溶液(5.0mL,5mM)和硝酸银水溶液(5.0mL,8.0mM)和溶菌酶水溶液(10.0mL,10mg/mL)混合。随后将氢氧化钠水溶液(1mL,1.0M)加入到混合物中。然后在强烈搅拌下于37℃过夜,制得溶菌酶-金/银纳米簇。将制备的溶菌酶-金/银纳米簇置于4℃避光保存。
本申请对得到的溶菌酶-金/银纳米簇进行透射电子显微镜测试,测试结果表明:本申请实施例24得到的溶菌酶-金/银纳米簇粒径为1-3纳米。
实施例25
本申请实施例为实施例3的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒在不同质量比条件下静电自组装的试验,具体步骤如下:
用去离子水将实施例3制备得到的鱼精蛋白-金纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入pX330质粒(CRISPR/Cas系统的pX330质粒,来源于Addgene),鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的质量比依次为:0.2、0.5、0.8、1、2、5、10;而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装得到金属簇复合物胶束,将金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。
将不同的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒质量比自组装得到的金属簇复合物胶束进行表面电位分析和电泳阻滞分析。
表面电位结果参见图4。由图4可知,本申请实施例制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成表面带正电的复合物。
电泳阻滞结果参见图5,由图5可知,本申请实施例制备的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成稳定的复合物,有效地负载pX330质粒。
当鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的质量比为10:1时,其扫描电镜图参见图6,金属簇复合物胶束为粒径100-120nm左右的纳米颗粒。
当鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的质量比为10:1时,其金属簇复合物胶束的尺寸稳定性参见图7,金属簇复合物胶束在1周内具有稳定的粒径。
实施例26
本申请实施例为实施例4的溶菌酶-金纳米簇与pX458质粒在不同质量比条件下静电自组装的试验,具体步骤如下:
用去离子水将实施例4制备得到的溶菌酶-金纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入pX458质粒(CRISPR/Cas系统的pX458质粒,来源于Addgene),而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装制得金属簇复合物胶束,所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。具体的金属簇与基因如何比例及其电位如表1所示。
表1
编号 | 金属簇来源 | 基因 | 金属簇/基因(质量比) | 电位(mV) |
1 | 实施例4 | pX458 | 0.2 | -20.1±3.5 |
2 | 实施例4 | pX458 | 0.5 | -13.5±2.7 |
3 | 实施例4 | pX458 | 0.8 | -5.2±3.1 |
4 | 实施例4 | pX458 | 1 | 3.1±1.8 |
5 | 实施例4 | pX458 | 2 | 10.6±3.6 |
6 | 实施例4 | pX458 | 5 | 18.7±5.1 |
7 | 实施例4 | pX458 | 10 | 25.3±6.4 |
实验结果证实:本申请实施例4制备的溶菌酶-金纳米簇与pX458质粒的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成表面带正电的复合物。溶菌酶-金纳米簇与pX458质粒的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成稳定的复合物,有效地负载pX458质粒。当溶菌酶-金纳米簇与pX458质粒的质量比为10:1时,其金属簇复合物胶束为粒径80-110nm左右的纳米颗粒,且金属簇复合物胶束在1周内具有稳定的粒径。
实施例27
本申请实施例为实施例3的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒在不同质量比条件下静电自组装的试验,具体步骤如下:
用去离子水将实施例3制备得到的金属簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入基因(Cas9 mRNA,来源于TriLink BioTechnologies),而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装制得金属簇复合物胶束,所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。具体的金属簇与基因如何比例及其电位如表2所示。
表2
实验结果证实:本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇与Cas9 mRNA的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成表面带正电的复合物。鱼精蛋白-金纳米簇与Cas9mRNA的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成稳定的复合物,有效地负载Cas9mRNA。当鱼精蛋白-金纳米簇与Cas9 mRNA的质量比为10:1时,其金属簇复合物胶束为粒径70-100nm左右的纳米颗粒,且金属簇复合物胶束在1周内具有稳定的粒径。
实施例28
本申请实施例为实施例11的鱼精蛋白-银纳米簇与pX458质粒在不同质量比条件下静电自组装的试验,具体步骤如下:
用去离子水将实施例11制备得到的鱼精蛋白-银纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入基因(pX458,来源于Addgene),而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装制得金属簇复合物胶束,所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。具体的金属簇与基因如何比例及其电位如表3所示。
表3
编号 | 金属簇来源 | 基因 | 金属簇/基因(质量比) | 电位(mV) |
1 | 实施例11 | pX458 | 0.2 | -19.4±2.9 |
2 | 实施例11 | pX458 | 0.5 | -8.3±2.7 |
3 | 实施例11 | pX458 | 0.8 | -3.8±0.9 |
4 | 实施例11 | pX458 | 1 | 7.6±2.4 |
5 | 实施例11 | pX458 | 2 | 15.5±3.9 |
6 | 实施例11 | pX458 | 5 | 20.3±4.5 |
7 | 实施例11 | pX458 | 10 | 29.2±5.9 |
实验结果证实:本申请实施例11制备的鱼精蛋白-银纳米簇与pX458质粒的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成表面带正电的复合物。鱼精蛋白-银纳米簇与pX458质粒的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成稳定的复合物,有效地负载pX458质粒。当鱼精蛋白-银纳米簇与pX458质粒的质量比为10:1时,其复合物为粒径80-120nm左右的纳米颗粒,且金属簇复合物胶束在1周内具有稳定的粒径。
实施例29
本申请实施例为实施例11的鱼精蛋白-银纳米簇与Cas9 mRNA在不同质量比条件下静电自组装的试验,具体步骤如下:
用去离子水将实施例11制备得到的鱼精蛋白-银纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入基因(Cas9 mRNA,来源于TriLink BioTechnologies),而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装制得金属簇复合物胶束,所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。具体的金属簇与基因如何比例及其电位如下。
实验结果证实:本申请实施例11制备的鱼精蛋白-银纳米簇与Cas9 mRNA的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成表面带正电的复合物。鱼精蛋白-银纳米簇与基因的金属簇复合物胶束在其质量比大于1时,可形成稳定的复合物,有效地负载Cas9 mRNA。当鱼精蛋白-银纳米簇与Cas9 mRNA的质量比为10:1时,其金属簇复合物胶束为粒径75-110nm左右的纳米颗粒,且金属簇复合物胶束在1周内具有稳定的粒径。
实施例30
本申请实施例为实施例3的鱼精蛋白-金纳米簇的细胞的毒性试验,具体步骤如下:
收集对数期U2OS细胞,调整细胞浓度,接种入96孔板内,每孔中含有约104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;用培养基将实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇分别稀释为200μg/mL、100μg/mL、50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL 7个浓度的样品;设空白对照组和上述实验组,将各个样品加入96孔板,在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养48h。48h后,使用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的活性。
结果参见图8,由图8可知,本申请制备的鱼精蛋白-金纳米簇,细胞毒性很低,具有良好的细胞相容性。
实施例31
本申请实施例为实施例3的鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒在不同质量比条件下静电自组装的金属簇复合物胶束的细胞的毒性试验,具体步骤如下:
收集对数期U2OS细胞,调整细胞浓度,接种入96孔板内,每孔中含有约104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;试验步骤参考实施例25,将实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX330质粒)按照100:1、50:1、25:1、10:1、5:1、2:1、0.5:1混合,制备相应的金属簇复合物胶束;设空白对照组和上述实验组,将样品加入96孔板,以2μg/mL的基因浓度作为基准,每个样品3个复孔;在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养48h。48h后,使用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的活性。
结果参见图9,由图9可知,本申请实施例制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因的金属簇复合物胶束具有良好的细胞相容性,是一种安全的基因传递系统。
实施例32
参照实施例25的制备方法,用去离子水将实施例3制备得到的鱼精蛋白-金纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入FITC标记的pX330质粒,鱼精蛋白-金纳米簇与FITC标记的pX330质粒的质量比为10;而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。
实施例33
本申请实施例为实施例3的鱼精蛋白-金纳米簇与FITC标记的pX330质粒自组装的金属簇复合物胶束转染细胞后的细胞内化荧光试验,具体步骤如下:
收集对数期U2OS细胞,调整细胞浓度,接种入24孔板内,每孔中含有约5×104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;用培养基将实施例32制备的金属簇复合物胶束稀释为相应浓度的样品;设空白对照组和上述实验组,将样品加入24孔板的U2OS细胞中,以基因(FITC标记的pX330质粒)的质量作为基准,每孔加入500ng,每个样品3个复孔;在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,弃培养液,用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次;弃磷酸盐缓冲液,每孔加入1mL 4%多聚甲醛,固定15分钟;弃甲醛,磷酸盐缓冲液洗3~5次后,每孔加入1.5μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),于1mL磷酸盐缓冲液中避光标记10分钟,弃标记液,磷酸盐缓冲液洗5次;加2μL甘油封片,激光共聚焦显微镜观察,结果参见图10。其中,a、b、c、d分别为DAPI荧光、鱼精蛋白-金纳米簇荧光、pX330质粒的标记荧光、荧光叠加图。结果表明,鱼精蛋白-金纳米簇与pX330质粒的金属簇复合物胶束可以实现基因的细胞内传递和核靶向运输。
实施例34
本申请实施例为实施例3的鱼精蛋白-金纳米簇与FITC标记的pX330质粒自组装的金属簇复合物胶束转染细胞的细胞内化荧光强度试验,具体步骤如下:
收集对数期U2OS细胞,调整细胞浓度,接种入24孔板内,每孔中含有约5×104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;
用培养基将实施例32制备的金属簇复合物胶束稀释为相应浓度的样品;
设空白对照组和上述实验组,将样品加入24孔板的U2OS细胞中,以基因(FITC标记的pX330质粒)的质量作为基准,每孔加入500ng,每个样品3个复孔;
在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次,胰蛋白酶消化,收集细胞后通过流式细胞仪检测,结果参见图11,其中A、B图分别为绿色和红色荧光通道,结果表明,鱼精蛋白-金纳米簇与FITC标记的pX330质粒的金属簇复合物胶束可以实现基因的细胞内高效传递。
实施例35
本申请实施例为编码Cas9和gRNA的质粒pX330(Addgene,Plasmid#42230)为基础制备靶向EGFP基因的基因编辑质粒,具体步骤如下:
本申请实施例采用现有技术,以同时编码Cas9和gRNA的质粒pX330(Addgene,Plasmid#42230)为基础制备靶向EGFP基因的基因编辑质粒,其中gRNA1EGFP的靶序列为TGAACCGCATCGAGCTGAA,gRNA2EGFP的靶序列为GAGCGCACCATCTTCTTCA;
将克隆的质粒转化到感受态细胞中,然后提取并纯化质粒;
所得基因(pCas9-gRNA1EGFP和pCas9-gRNA2EGFP)经基因测序,确认gRNA序列的正确性。
测序结果如图12所示,图12为实施例35制备的基因的示意图和结果图。其中,A图为所制备的两个基因的示意图,B图为测序结果,C图为其电泳图。上述结果充分证实了两个基因的成功制备。
实施例36
参照实施例25的制备方法,用去离子水将实施例3制备得到的鱼精蛋白-金纳米簇稀释至0.5mg/mL,分别在持续搅拌条件下加入实施例35制备的两种基因(pCas9-gRNA1EGFP和pCas9-gRNA2EGFP),鱼精蛋白-金纳米簇分别与实施例35制备的两种基因的质量比为10;而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装所得的两种金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。
实施例37
本申请实施例为实施例35的基因(pCas9-gRNA1EGFP)和实施例36的两种金属簇复合物胶束转染细胞后的GFP基因编辑试验,具体步骤如下:
收集对数期U2OS.GFP细胞(恒定表达GFP荧光的U2OS细胞),调整细胞浓度,接种入24孔板内,每孔中含有约5×104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;
用培养基将实施例35制备的基因(pCas9-gRNA1EGFP和pCas9-gRNA2EGFP)、实施例36制备的两种金属簇复合物胶束分别稀释为相应浓度的样品;其中,实施例36的两种金属簇复合物胶束为实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的金属簇复合物胶束、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的金属簇复合物胶束;
设空白对照组和上述各组,将各个样品加入24孔板的U2OS.GFP细胞中,以基因的质量作为基准,每孔加入500ng,每个样品3个复孔;
在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,更换为新鲜培养液;
48h后,弃培养液,用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次;
弃磷酸盐缓冲液,每孔加入1mL 4%多聚甲醛,固定15分钟;
弃甲醛,磷酸盐缓冲液洗3~5次后,每孔加入1.5μL的4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI),于1mL磷酸盐缓冲液中避光标记10分钟,弃标记液,磷酸盐缓冲液洗5次;
加2μL甘油封片,激光共聚焦显微镜观察,结果参见图13。图13为本申请实施例35制备的基因(pCas9-gRNA1EGFP)、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的金属簇复合物胶束、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的金属簇复合物胶束转染U2OS.GFP细胞后,U2OS.GFP的细胞内GFP基因敲除效果图。其中,a、b、c分别为DAPI荧光、GFP荧光、DAPI和GFP重叠图。结果表明,对照组(图13标记为对照组)和单纯的基因(图13标记为pDNA1)均无法有效地发挥基因标记效果,而鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的金属簇复合物胶束(图13标记为复合物1)可以促进基因的细胞内传递,并通过基因编辑的方式降低细胞中GFP的表达量;鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的金属簇复合物胶束(图13标记为复合物2)可以促进基因的细胞内传递,并通过基因编辑的方式降低细胞中GFP的表达量。
实施例38
本申请实施例为实施例35的基因(pCas9-gRNA1EGFP)和实施例36的两种金属簇复合物胶束转染细胞后的GFP基因编辑试验,具体步骤如下:
收集对数期U2OS.GFP细胞(恒定表达GFP荧光的U2OS细胞),调整细胞浓度,接种入24孔板内,每孔中含有约5×104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;用培养基将实施例35制备的基因(pCas9-gRNA1EGFP)、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的金属簇复合物胶束、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的金属簇复合物胶束分别稀释为相应浓度的样品;设空白对照组和上述各组,将各个样品加入24孔板的U2OS.GFP细胞中,以基因(实施例35的基因)的质量作为基准,每孔加入500ng,每个样品3个复孔;在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,更换为新鲜培养液;48h后,弃培养液,用磷酸盐缓冲液清洗细胞3次,胰蛋白酶消化,收集细胞后通过流式细胞仪检测,结果参见图14,图14为本申请实施例35制备的基因(pCas9-gRNA1EGFP)、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的复合物1、实施例36制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的复合物2的细胞内GFP基因敲除荧光分析结果图,图14中对照组和单纯基因(pDNA1)只有右侧一个峰,复合物1组和复合物2组具有两个峰,左侧的峰为U2OS.GFP细胞的GFP被敲除后的细胞群。结果表明,对照组(图14标记为对照组)和单纯的基因(图14标记为pDNA1)均无法有效地发挥基因标记效果,而鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA1EGFP)的金属簇复合物胶束(图14标记为复合物1)可以促进基因的细胞内传递,并通过基因编辑的方式精准降低GFP的表达量;鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNA2EGFP)的金属簇复合物胶束(图14标记为复合物2)可以促进基因的细胞内传递,并通过基因编辑的方式精准降低GFP的表达量。
实施例39
本申请实施例为编码Cas9和gRNA的质粒pX458(Addgene,Plasmid#48138)为基础制备靶向HPV18 E7基因的基因编辑质粒,具体步骤如下:
本申请实施例采用现有技术,以同时编码Cas9和gRNA的质粒pX458(Addgene,Plasmid#48138)为基础制备靶向HPV18 E7基因的基因编辑质粒,其中gRNA的靶序列为GAAGAAAACGATGAAATAGA;将克隆的质粒转化到感受态细胞中,然后提取并纯化质粒;所得质粒(pCas9-gRNAE7)经基因测序,确认gRNA序列的正确性。
实施例40
参照实施例25的制备方法,用去离子水将实施例3制备得到的鱼精蛋白-金纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入实施例39制备的基因(pCas9-gRNAE7,可靶向编辑HPV18 E7基因),鱼精蛋白-金纳米簇与基因的质量比为10;而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。
参照实施例25的制备方法,用去离子水将实施例3制备得到的鱼精蛋白-金纳米簇稀释至0.5mg/mL,在持续搅拌条件下加入pX458质粒,鱼精蛋白-金纳米簇与基因的质量比为10;而后在室温避光条件下静置0.5h,自组装所得的金属簇复合物胶束置于4℃避光保存。
实施例41
本申请实施例为实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因(pCas9-gRNAE7)、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物对HeLa细胞的毒性试验,具体步骤如下:
收集对数期HeLa细胞,调整细胞浓度,接种入96孔板内,每孔中含有约104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;用培养基将实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因(pCas9-gRNAE7)、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物分别稀释为相应浓度的样品;将各个样品加入96孔板,以基因(质粒)的质量作为基准,每孔加入500ng,每个样品3个复孔;在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,更换为新鲜培养液;48h后,使用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的活性。
比较上述材料的细胞毒性,结果参见图15,图15为本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因(pCas9-gRNAE7)、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物对HeLa细胞的毒性结果。其中,a、b、c、d、e依次为空白对照、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物对HeLa细胞的细胞毒性考察结果。由图15可知,与空白对照组相比,鱼精蛋白-金纳米簇、pCas9-gRNAE7基因、鱼精蛋白-金纳米簇与非靶向的pX458对照组基因的复合物均无明显的细胞毒性,而鱼精蛋白-金纳米簇与靶向的实验组基因pCas9-gRNAE7的复合物具有显著的抗肿瘤效果,可抑制HeLa细胞的增殖,可作为一种精准的基因治疗系统。
实施例42
本申请实施例为实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因(pCas9-gRNAE7)、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物转染HeLa细胞的E7靶位点的T7E1酶切试验,具体步骤如下:
收集对数期HeLa细胞,调整细胞浓度,接种入24孔板内,每孔中含有约5×104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;用培养基将实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物分别稀释为相应浓度的样品;设空白对照组和上述各组,将各个样品加入24孔板,以基因(质粒)的质量作为基准,每孔加入500ng,每个样品3个复孔;在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,更换为新鲜培养液。48h后,提取基因组DNA,利用PCR仪扩增出E7靶区域,其引物序列如下表;
PCR产物经柱纯化、退火后用T7E1酶处理。最后,使用琼脂糖凝胶电泳分析相应产物,以检测靶区域的基因编辑(插入/缺失)效率。
图16为实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物与HeLa细胞共培养后,在E7靶位点的T7E1酶切图。其中,a、b、c、d、e依次为对照组、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物在E7靶位点显示出明显的基因编辑效果,说明本申请的基因治疗系统具有精准的基因编辑性能。
实施例43
本申请实施例为实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因(pCas9-gRNAE7)、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物转染HeLa细胞的E7蛋白表达水平试验,具体步骤如下:
细胞与实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物共培养后,收集细胞并用RIPA缓冲液裂解;利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质提取物,并转移至硝酸纤维素膜上;之后,用HPV18 E7和β-肌动蛋白的一抗处理膜,进一步与结合HRP的二抗孵育,并使用ECL系统检测信号。
比较上述材料的基因编辑效果,结果参见图17,图17为对照组、本申请实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物与HeLa细胞共培养后,E7蛋白表达水平的结果图。其中,a、b、c、d、e依次为空白对照、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pX458,对照组基因)的复合物、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物对HeLa细胞中E7蛋白表达水平的考察结果。由图17可知,与空白对照组相比,鱼精蛋白-金纳米簇、基因、鱼精蛋白-金纳米簇与非靶向的对照组基因(pX458)的复合物均对细胞中E7蛋白的表达水平无影响,而鱼精蛋白-金纳米簇与靶向的实验组基因(pCas9-gRNAE7)的复合物可通过基因编辑显著抑制HeLa细胞中的E7蛋白表达,可作为一种精准的基因治疗系统。
实施例44
本申请实施例为实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物转染HeLa细胞的潜在脱靶位点的T7E1酶切图的试验,具体步骤如下:
收集对数期HeLa细胞,调整细胞浓度,接种入24孔板内,每孔中含有约5×104个细胞,在37℃培养24h后除去培养液;设空白对照组和实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7)复合物组,每组6个复孔,实验组以基因(质粒)的质量作为基准,每孔加入500ng;在37℃、饱和湿度、5%CO2细胞培养箱中培养4h后,更换为新鲜培养液。48h后,提取基因组DNA,利用PCR仪扩增出潜在的脱靶区域,其引物序列如下表;
PCR产物经柱纯化、退火后用T7E1酶处理。最后,使用琼脂糖凝胶电泳分析相应产物,以检测潜在脱靶位置的基因突变情况。
图18为实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因的复合物与HeLa细胞共培养后,在潜在脱靶位点的T7E1酶切图。在图18中,对照组(图18标记为pCas9-gRNAE7,-)为不转染基因的组别,无论是对照组(pCas9-gRNAE7,-)还是实验组(pCas9-gRNAE7,+),在3个潜在的脱靶位点(E7 OT1、E7 OT2、E7 OT3)均未发现明显的脱靶,可见,鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物正确作用在E7靶位点,说明本申请的基因治疗系统具有良好的精准治疗性能。
实施例45
本申请实施例提供了生理盐水和不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的体重的试验,具体如下:
正常饲养的雌性Balb/C小鼠(体重18g~20g)50只,随机分为5组,每组10只。其中1组皮下注射生理盐水,另外4组皮下注射不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物(以基因质量为基准,注射量为每只鼠2μg、5μg、10μg、20μg),连续14天监测实验动物的体重。
实验结果证明:1)14天内无小鼠死亡;2)14天后,每组随机选取3只进行心、肝、脾、肺、肾、皮肤、肌肉的病理学切片分析,结果证明:与对照组(注射生理盐水)相比,未观察到注射不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的老鼠的器官和组织有明显病理学损害。
图19为注射生理盐水和不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的体重随时间的变化图。在图19中,a为生理盐水组,b、c、d、e为不同剂量的实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物组(剂量以基因质量为基准,注射量依次为每只鼠2μg、5μg、10μg、20μg)。由图19可知,与对照组相比,所有实验组均无明显的体重变化,证明鱼精蛋白-金纳米簇与基因形成的复合物颗粒对实验动物具有良好的生物相容性,可作为一种安全的基因递送系统。
实施例46
本申请实施例提供了实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的肿瘤抑制效果和安全性评价的试验,具体如下:
正常饲养的雌性Balb/C裸鼠(体重18g~20g)50只,皮下注射HeLa细胞(约3×106个)。约3周后,挑选出肿瘤生长至100mm3左右的其中40只,随机分为4组,每组10只,分别在0、4、8、12天时,瘤内注射生理盐水、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因的复合物,以基因质量为基准,注射量为每只鼠5μg,连续26天监测实验动物的体重和肿瘤体积。
图20为小鼠的肿瘤体积随时间的变化图。在图20中,a、b、c、d依次为注射生理盐水、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的肿瘤体积变化。由图20可知,与生理盐水组相比,单纯的鱼精蛋白-金纳米簇和单纯的实施例39制备的基因本身均没有明显的抗肿瘤作用,而鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物可显著地抑制肿瘤生长,证明了鱼精蛋白-金纳米簇对于基因传递的必要性和有效性。
图21为小鼠的体重随时间的变化图。在图21中,a、b、c、d依次为注射生理盐水、实施例3制备的鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物的小鼠的体重变化。由图21可知,与生理盐水组相比,鱼精蛋白-金纳米簇、实施例39制备的基因、实施例40制备的鱼精蛋白-金纳米簇与基因(pCas9-gRNAE7,实验组基因)的复合物均未造成明显的小鼠体重变化,说明基因本身以及载体与基因的复合物均具有良好的生物相容性。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请原理的前提下,还可以对本申请进行若干改进和修饰,这些改进和修饰也落入本申请权利要求的保护范围内。
对所公开的实施例的上述说明,使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种非病毒基因载体系统,其特征在于,包括金属簇;所述金属簇由金属离子以蛋白质为模板而合成;所述蛋白质选自鱼精蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、乳清蛋白和溶菌酶中的一种或多种。
2.根据权利要求1所述的非病毒基因载体系统,其特征在于,所述金属簇选自金纳米簇、银纳米簇、铜纳米簇和铁纳米簇中的一种或多种。
3.一种非病毒基因载体系统的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
将可溶性金属盐与蛋白质在介质中反应,制得非病毒基因载体系统;所述蛋白质选自鱼精蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、转铁蛋白、乳清蛋白和溶菌酶中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述可溶性金属盐中的金属元素选自金、银、铜和铁中的一种或多种。
5.权利要求1或2所述的非病毒基因载体系统或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在制备基因编辑或基因治疗的产品中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述基因编辑或基因治疗的产品包括用于基因编辑或基因治疗的基因,和权利要求1或2所述的非病毒基因载体系统或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统。
7.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述基因编辑或基因治疗的产品的制备方法包括以下步骤:
将用于基因编辑或基因治疗的基因与权利要求1或2所述的非病毒基因载体系统或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在介质中反应。
8.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,权利要求1或2所述的非病毒基因载体系统或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体与所述用于基因编辑或基因治疗的基因的质量比值大于1。
9.根据权利要求6所述的应用,其特征在于,所述用于基因编辑或基因治疗的基因的大小为20-20000个碱基或碱基对。
10.权利要求1或2所述的非病毒基因载体系统或权利要求3或4所述的制备方法制备得到的非病毒基因载体系统在基因示踪或细胞成像中的应用。
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