DE60115667T2 - Säureempfindliche verbindungen, deren herstellung und verwendungen - Google Patents

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Description

  • Die Erfindung betrifft säureempfindliche Verbindungen und deren Herstellung. Diese Verbindungen enthalten mindestens einen hydrophilen Substituenten und einen zyklischen Orthoester, der säureempfindlich ist. Diese Verbindungen sind nützlich, entweder, um Konjugate (beispielsweise Liposomen, Komplexe und Nanopartikel) mit biologisch aktiven Substanzen zu bilden und diese in Zellgeweben oder -kompartimenten, deren pH sauer ist, freizusetzen, oder als nichtionische oberflächenaktive Mittel, um Teilchen zu stabilisieren, die eine biologisch wirksame Substanz umkapseln, und sie anschließend im sauren Milieu zu destabilisieren, oder auch als Träger, der kovalent mit einem therapeutischen Molekül verbunden ist, um es in Zellgeweben oder -kompartimenten, deren pH-Wert sauer ist, freizusetzen.
  • Die Freisetzung biologisch wirksamer Substanzen in Geweben oder Zellen, die eine ausgeprägte Azidität gegenüber den normalen physiologischen aufweisen, ist ein bekanntes Problem, das Gegenstand zahlreicher Untersuchungen ist, ohne dass diese bisher vollständig zufrieden stellende Ergebnisse ergeben hätten. So sind zahlreiche pH-empfindliche Liposomen entworfen worden, um biologisch wirksame Substanzen freizusetzen, wobei aus der Ansäuerung bestimmter Gewebe oder des Endosoms Vorteile gezogen werden.
  • So sind beispielsweise von Yatvin et al. (Science, Band 210, 1253-4 [1980]) pH-empfindliche Lipide entworfen worden, die in der Lage sind, sich in die Lipiddoppelschicht herkömmlicher Liposome einzufügen, und welche die Formel besitzen:
    Figure 00010001
  • Das in diesem Lipid vorhandene Homocystein liegt bei neutralem oder alkalischem pH-Wert in seiner offenen Form vor und ähnelt dann einer Fettsäure, die sich perfekt in die Liposomendoppelschicht einfügt. Bei saurem pH-Wert liegt es in geschlossener Form vor: Es bildet dann ein zyklisches Thiolacton, das so einem neutralen Lipid ähnelt, das die liposomale Doppelschicht destabilisiert und so die Freisetzung des Wirkstoffs erlaubt. Ein solches Molekül erlaubt die Freisetzung medikamentöser Moleküle in Körperregionen, in welchen der pH niedriger als der physiologische pH-Wert ist, beispielsweise in primären Tumoren, Metastasen oder auch entzündeten oder infizierten Stellen.
  • In dem amerikanischen Patent US 5 965 434 sind amphiphatische Lipide vorgeschlagen, die einen kationischen lipophilen und pH-empfindlichen Teil enthalten mit der Formel:
    Figure 00020001
    in welcher R1 und R2 unabhängig voneinander CH3(CH2)14, CH3(CH2)12 und CH3(CH2)7CHCH(CH2)7 bedeuten und R3 einen Substituenten 1-Methylimidazol, Imidazol, 4,9-Dioxo-1,12-dodecandiamin, Cysteamin, 1-(3-Aminopropyl)imidazol, Morpholin, 4-Aminopyridin, Pyridin, Guanidin, Hydrazin, Thiouronium oder Piperazin bedeutet.
  • Diese Verbindungen weisen die Besonderheit auf, dass sie eine positive Gesamtladung (an der Verbindung R3) tragen, die größer wird, wenn der pH-Wert von 8,0 auf 4,5 gesenkt wird. Diese Modifizierung der Ladung führt zu einer Konformationsumwandlung des Liposoms, die es ihm erlaubt, seinen Inhalt abzugeben. Diese Lipide erlauben so die Freisetzung von medikamentösen Molekülen oder Nukleinsäuren in einem sauren Milieu, dessen pH-Wert bis zu 4,5 variiert.
  • Weiterhin sind in der Patentanmeldung WO 97/31624 pH-empfindliche ("triggerable lipids") Phospholipide vorgeschlagen, die eine Vinylätherfunktion enthalten, die im Cytoplasma abgebaut werden kann, und die die allgemeine Formel besitzen:
    Figure 00030001
    in welcher p und q 0 oder 1 sind, wobei mindestens eine der beiden 1 ist, R1 und R2 jeweils unabhängig voneinander ein Alkyl oder ein Alken bedeuten, das 12 bis 24 Kohlenstoffatome enthält, und R eine Gruppe bedeutet, die aus 2-Aminoethyl, 2-(Trimethylamino)ethyl, 2-(N,N-Dimethylamino)ethyl, 2-(Trimethylammonium)ethyl, 2-Carboxy-2-aminoethyl, Succinamidoethyl oder Inosityl ausgewählt ist.
  • Diese Phospholipide werden mit anderen Phospholipiden vermischt, die ihrerseits Komplexe mit Liganden von Zellrezeptoren sind, um Liposomen zu bilden, die in der Lage sind, bei einem sauren pH-Wert Konformationsveränderungen zu erfahren. Solche Liposomen erlauben die Umkapselung zahlreicher medikamentöser Substanzen und auch von Nukleinsäuren für die Gentherapie.
  • Es ist ein weiterer Ansatz beschrieben worden (Kratz et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 16(3), 245-88 [1999]), in welchem ein therapeutisches Molekül kovalent mit einem Polymer über eine säureempfindliche Bindung derart verbunden wird, dass die Freisetzung des therapeutischen Moleküls in einem schwach sauren Tumorgewebe oder auch in Endosomen und Lysosomen nach zellulärer Internalisierung des polymeren Konjugats sichergestellt wird. Zahlreiche mögliche Bindungen sind so beschrieben worden, beispielsweise die Acetal-, Disulfid-, Hydrazon-, cis-Aconitril-, Trityl- oder auch silylierte Ätherbindung.
  • Jedoch haben alle bisher entwickelten pH-empfindlichen Verbindungen den Nachteil, dass sie, was ihre Empfindlichkeit betrifft, nicht modifizierbar sind. So wäre es sehr interessant, über säurelabile Verbindungen verfügen zu können, deren Sensibilität in Abhängigkeit von beispielsweise dem Targetgewebe oder den Targetzellen, der freizusetzenden biologisch wirksamen Substanz oder auch den vorgesehenen Verwendungen modifiziert werden kann. Ganz allgemein wäre es außerdem interessant, über neue pH-empfindliche Verbindungen verfügen zu können, die sich leicht herstellen lassen und insbesondere für die Transfektion von Nukleinsäuren effizient sind.
  • Zur Lösung dieses Problems ist von der Anmelderin eine neue Familie säureempfindlicher Verbindungen entwickelt worden, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie einen zyklischen Orthoester und mindestens einen hydrophilen Substituenten umfassen, der aus Polyalkylen-Glykolen, Mono- bzw. Polysacchariden, hydrophilen therapeutischen Molekülen oder Resten vom Typ Polyamin ausgewählt ist.
  • Solche Verbindungen sind für die Vektorisierung und Freisetzung von biologisch wirksamen Substanzen in sauren Regionen des Organismus aufgrund der zyklischen Orthoesterfunktion, die säureempfindlich ist, nützlich. Sie sind besonders interessant, da die pH-Empfindlichkeit der Verbindung in Abhängigkeit von der Auswahl des Substituenten, der am zentralen Kohlenstoffatom vorhanden ist, und der Größe des Orthoesterzyklus modifiziert werden kann. So wird es möglich, die Kinetik der Hydrolyse dieser Verbindungen innerhalb weiter Grenzen zu variieren und somit den Zeitraum zu modifizieren, der für die Freisetzung der biologisch wirksamen Substanz erforderlich ist. Außerdem haben die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen den zusätzlichen Vorteil, dass sie sich autokatalytisch im sauren Milieu abbauen. Dabei führt der teilweise Abbau der erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen zur fortschreitenden Freisetzung einer Säure (beispielsweise von Ameisensäure, wenn sich die Ausgangsverbindung von einem Orthoformiat ableitet, Essigsäure, wenn sich die Ausgangsverbindung von einem Orthoacetat ableitet, oder Benzoesäure, wenn sich die Ausgangsverbindung von einem Orthobenzoat ableitet) die eine Senkung des pH-Werts bewirkt, welche ihren Abbau weiter begünstigt.
  • Insbesondere weisen die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen die allgemeine Formel auf:
    Figure 00050001
    in der:
    • • g eine ganze Zahl ist, die die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen kann,
    • • G ein Wasserstoffatom, ein 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltendes, gesättigtes oder ungesättigtes Alkylradikal in gerader oder verzweigter Kette oder ein 6 bis 14 Kohlenstoffatome enthaltendes Arylradikal darstellt,
    • • G1 und G2 Folgendes darstellen:
    • (a) das eine ein aus den Radikalen vom Typ Polyamin ausgewähltes hydrophiles Substituent und das andere ein aus den Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen, den steroiden Derivaten oder den hydrophoben Dendrimeren ausgewähltes hydrophobes Substituent, oder
    • (b) eines eine lineare, hydrophobe Alkylgruppe mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen und eventuell mit einer oder mehreren Unsättigung(en), und die andere eine Gruppe der allgemeinen Formel:
      Figure 00050002
      in der i eine ganze Zahl von 1 bis 4 und j eine ganze Zahl von 9 bis 23 ist und der hydrophile Substituent aus den Radikalen vom Typ Polyamin ausgewählt wird, oder
    • (c) eines ein aus den Polyalkylen-Glykolen oder den Mono- oder Polysacchariden ausgewählter hydrophiler Substituent ist und das andere ein aus den Imin-Polyalkylen ausgewählter Substituent oder
    • (d) eines aus den Glykol-Polyalkylenen oder den Mono- oder Polysacchariden ausgewähltes hydrophiles Substituent und das andere ein aus den Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen, den Steroid-Derivaten, den hydrophoben Dendrimeren oder den kovalenten konjugierten Doppelbindungen zwischen einem Mono- oder Bi-Ketten-Alkyl ausgewähltes hydrophobes Substituent ist, oder ein hydrophobes Dendrimer und ein Glykol-Polyalkylen-Molekül mit 1 bis 20 monomerischen Einheiten, oder
    • (e) eines ein aus den Glykol-Polyalkylenen oder den Mono- oder Polysacchariden ausgewähltes hydrophiles Substituent und das andere ein therapeutisches Molekül ist oder
    • (f) eines ein therapeutisches Molekül hydrophiler Art und das andere ein aus dem Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen, den Steroid-Derivaten oder den hydrophoben Dendrimeren ausgewähltes hydrophobes Substituent ist.
  • Der am zentralen Kohlenstoffatom des Orthoesters befindliche Substituent G wird derart ausgewählt, dass die Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindung modifiziert wird. So wird, je stärker die Gruppe G Elektronen abgebend ist, die Säureempfindlichkeit der Verbindung höher, und je stärker die Gruppe G Elektronen anziehend ist, wird die Säureempfindlichkeit der Verbindung geringer. So hat es sich gezeigt, dass die Auswahl des Radikals G für die Bestimmung und Modifizierung der Eigenschaften der säureempfindlichen Verbindungen mit der Formel (I) von besonderer Bedeutung ist. Entsprechend einem bevorzugten erfindungsgemäßen Merkmal wird G aus dem Wasserstoffatom, Alkylradikalen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen in der gesättigten oder ungesättigten geradkettigen oder verzweigten Kette oder den Arylradikalen ausgewählt. Besonders vorteilhaft wird G aus dem Wasserstoffatom, Methyl, Ethyl oder Phenyl ausgewählt.
  • Dabei sind erfindungsgemäß unter "Arylradikalen" einwertige aromatische Kohlenwasserstoffradikale zu verstehen. Die erfindungsgemäßen Arylradikale enthalten im Allgemeinen von 6 bis 14 Kohlenstoffatome. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Arylradikale ausgewählt aus Phenyl, Naphthyl, beispielsweise 1-Naphthyl bzw. 2-Naphthyl, Biphenylyl, beispielsweise 2-Biphenylyl, 3-Biphenylyl bzw. 4-Biphenylyl, Anthryl oder Fluorenyl. Davon ist Phenyl besonders bevorzugt. Die Arylradikale, insbesondere Phenyl, können gegebenenfalls substituiert sein, beispielsweise monosubstituiert, disubstituiert, trisubstituiert oder tetrasubstituiert, wobei die Substituenten gegebenenfalls voneinander verschieden sind. Vorzugsweise werden diese Substituenten aus Halogenatomen, (C1-C8)Alkylradikalen oder (C1-C8)Alkoxyradikalen ausgewählt. Bei den monosubstituierten Phenylradikalen kann sich dieser Substituent in 2-Position, 3-Position oder 4-Position befinden. Bei disubstituierten Phenylradikalen können sich diese Substituenten in 2,3-Position, 2,4-Position, 2,5-Position, 2,6-Position, 3,4-Position oder 3,5-Position befinden. Bei trisubstituierten Phenylradikalen können sich diese Substituenten beispielsweise in 2,3,4-Position, 2,3,5-Position, 2,4,5-Position, 2,4,6-Position, 2,3,6-Position oder 3,4,5-Position befinden.
  • Je nachdem, ist jeder der Subsituenten G1 und G2 entweder direkt mit dem zyklischen Orthoester oder indirekt über ein Abstandshaltermolekül, das aus den dem Fachmann bekannten Molekülen ausgewählt ist, verbunden. Ein solches Abstandshaltermolekül erlaubt es gleichzeitig, die Bindung sicherzustellen und den/die betreffenden Substituenten von dem zyklischen Orthoester zu entfernen, um eine unerwünschte Wechselwirkung des säureempfindlichen zyklischen Orthoesters mit seinem/seinen Substituenten abzuschwächen. Bevorzugte Abstandshaltermoleküle können beispielsweise je nach Charakter der Substituenten G1 oder G2 aus Alkylen (1 bis 6 Kohlenstoffatome), Karbonylbindungen, Estern, Äthern, Amid, Karbamat, Thiokarbamat, Glycerin, Harnstoff, Thioharnstoff oder einer Kombination aus mehreren dieser Gruppen ausgewählt werden. So kann beispielsweise, wenn der hydro phobe Substituent ein Steroid-Derivat ist, das Abstandshaltermolekül eine Bindung vom Typ Karbamat N-C(O)-O- sein oder, wenn der hydrophobe Substituent ein Bi-Ketten-Alkyl ist, kann das Abstandshaltermolekül aus den Gruppen mit der Formel -Alkyl-C(O)-N, ausgewählt werden, wobei die zwei Alkylketten dann am Stickstoffatom befestigt sind.
  • Entsprechend einem bevorzugten erfindungsgemäßen Merkmal können die Radikale vom Typ Polyamin definiert werden als geradkettige oder verzweigte Alkyle, die mindestens 3 Kohlenstoffatome enthalten, und wovon mindestens eine der Methylengruppen durch eine Aminogruppe ersetzt werden kann, die gegebenenfalls (beispielsweise mit einer Methylgruppe) substituiert ist, und das/die terminale/n Methyl/e mit einer oder mehreren Gruppen substituiert ist/sind, die aus (primären, sekundären, tertiären oder quaternären) Aminen, Guanidinen oder zyklischen Guanidinen ausgewählt ist/sind. Vorzugsweise werden diese Radikale vom Typ Polyamin aus Polyaminradikalen ausgewählt, die bereits bekannt und in der Literatur für die Vektorisierung von Nukleinsäuren beschrieben sind, beispielsweise in den Veröffentlichungen WO 96/17823, WO 97/18185, WO 98/54130 oder auch WO 99/51581. Dabei kann es sich insbesondere beispielsweise handeln um Polyamine mit der allgemeinen Formel:
    Figure 00080001
    in welcher
    • – R ein Wasserstoffatom, mit Ausnahme von einer einzigen der Gruppen R, die fehlt und daher die kovalente Bindung mit dem zyklischen Orthoester bedeutet,
    • – n eine ganze Zahl von 1 bis 9 und
    • – m eine ganze Zahl von 2 bis 6, wobei die Werte von m in den verschiedenen Gruppen -(CH)m-NH- gegebenenfalls voneinander verschieden sein können, bedeutet.
  • Entsprechend einer weiteren Alternative kann es sich auch handeln um ein Radikal vom Typ Polyamin mit der allgemeinen Formel:
    Figure 00090001
    in welcher:
    • – R1, R2 und R3 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -(CH2)q-NRR', wobei q zwischen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 variieren kann, und dies unabhängig zwischen den verschiedenen Gruppierungen R1, R2 und R3, und R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung -(CH2)q'-NH2, wobei q' zwischen 1, 2, 3, 4, 5 und 6 variieren kann, und dies unabhängig zwischen den verschiedenen Gruppierungen R und R', und
    • – m und p unabhängig voneinander eine ganze Zahl, die von 1 bis 6 variieren kann, bedeuten und
    • – n eine ganze Zahl bedeutet, die von 0 bis 6 variieren kann, wobei, wenn n größer als 1 ist, m andere Werte und R3 andere Bedeutungen in der allgemeinen Formel annehmen kann, und, wenn n gleich 0 ist, mindestens eines von R1 und R2 kein Wasserstoffatom bedeutet.
  • Entsprechend einem anderen erfindungsgemäßen Merkmal kann das Radikal vom Typ Polyamin auch von einem Substituenten repräsentiert werden, dessen allgemeine Formel gleich der vorhergehenden ist, wobei aber R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Gruppierung mit der Formel (1) bedeuten:
    Figure 00090002
    in welcher r eine ganze Zahl bedeutet, die von 0 bis 6 variieren kann, und die Gruppen R5 unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, einen Alkyl-, Karbamat- oder aliphatischen bzw. aromatischen Acylsubstituenten, der gegebenenfalls halogeniert ist, bedeuten, unter der Voraussetzung, dass wenigstens eine der Gruppen R1, R2 und R3 mindestens eine Gruppierung mit der Formel (1) enthält.
  • So wird ein Radikal vom Typ Polyamin erhalten, das eine oder mehrere terminale Guanidinfunktionen enthält.
  • Entsprechend einer weiteren erfindungsgemäßen Abwandlung kann das Radikal vom Typ Polyamin auch ein Polyamin wie die weiter oben beschriebenen bedeuten, aber mit einer terminalen Gruppe vom Typ zyklisches Guanidin (anstelle eines Amins oder eines Guanidins) mit der allgemeinen Formel (2):
    Figure 00100001
    in welcher:
    • • m und n unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 3 und derart bedeuten, dass m + n größer als oder gleich 1 ist, und
    • • R1 eine Gruppierung mit der allgemeinen Formel (3): -[-(CH2)p-Y-]q-(*) (3) bedeutet, in welcher p und q unabhängig voneinander ganze Zahlen von 0 bis 10 bedeuten und Y eine Karbonyl-, Amino-, Methylamino- oder Methylengruppe bedeutet und in verschiedenen Gruppierungen [(CH2)p-Y] verschiedene Bedeutungen haben kann, und (*) entweder ein Wasserstoffatom oder eine kovalente Bindung bedeutet, unter der Voraussetzung, dass R, an ein beliebiges Atom der allgemeinen Formel (2) gebunden sein kann, Z eingeschlossen, und dass es eine einzige Gruppe R1 in Formel (2) gibt,
    • • X eine Gruppe NR2 oder CHR2 bedeutet, wobei R2 entweder ein Wasserstoffatom oder die Bindung mit der Gruppe R, wie zuvor definiert bedeutet, und
    • • die Gruppierung
      Figure 00110001
      bedeutet:
    • – 1. Fall: eine Gruppierung mit der allgemeinen Formel (4):
      Figure 00110002
      in welcher W' CHR''' oder NR''' bedeutet und R'' und R''' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, Methyl, oder die Bindung mit der Gruppe R, wie zuvor definiert bedeuten, oder
    • – 2. Fall: eine Gruppierung mit der allgemeinen Formel (5):
      Figure 00110003
      in welcher W' CHR''' oder NR''' bedeutet und R' und R''' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom, Methyl, oder die Bindung mit der Gruppe R, wie zuvor definiert bedeuten.
  • Ganz allgemein kann sich ein beliebiges weiteres Radikal vom Typ Polyamin, von welchem dem Fachmann bekannt ist, dass es sich an Nukleinsäuren, insbesondere über elektrostatische Wechselwirkungen, anlagert, ebenfalls eignen.
  • Erfindungsgemäß sind unter Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen die hydrophoben Radikale zu verstehen, die aus ein oder zwei geradkettigen Alkylketten bestehen, die 10 bis 24 Kohlenstoffatome enthalten und gegebenenfalls eine oder mehrere Ungesättigtheiten enthalten. Im Fall der Bi-Ketten-Alkyle kann es sich beispielsweise um zwei Alkylketten handeln, die derart an ein Stickstoffatom gebunden sind, dass ein Dialkylaminosubstituent gebildet wird, wobei die zwei Alkylketten beispielsweise geradkettig sind und 10 bis 24 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls eine oder mehrere Ungesättigtheiten enthalten. Dabei kann es sich auch um gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, beispielsweise Palmitin-, Öl-, Stearin- oder Myristinsäure, handeln. Vorzugsweise besitzen die Mono- oder Bi-Ketten-Alkyle 12 bis 18 Kohlenstoffatome und sind besonders bevorzugt aus Gruppen ausgewählt, die 12, 14, 16 oder 18 Kohlenstoffatome (in jeder Alkylkette) besitzen.
  • Unter "Steroid-Derivat" sind erfindungsgemäß die Substituenten zu verstehen, die beispielsweise aus Sterolen, Steroiden und Steroidhormonen ausgewählt sind. Besonders bevorzugt werden die Steroid-Derivate aus Cholesterin, Cholestanol, 3-α-5-Cyclo-5-α-cholestan-6-β-ol, Cholinsäure, Cholesterylformiat, Chotestanylformiat, 3α,5-Cyclo-5a-cholestan-6β-ylformiat, Cholesterylamin, 6-(1,5-Dimethylhexyl)-3a,5a-dimethylhexadecahydrocyclopenta[a]cyclopropa[2,3]cyclopenta[1,2-f]naphthalen-10-ylamin, Cholestanylamin oder Dexamethason ausgewählt.
  • Die erfindungsgemäßen hydrophoben Dendrimeren werden vorzugsweise aus hydrophoben Polyalkyläthern oder hydrophoben Polyaryläthern ausgewählt. Besonders vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen hydrophoben Dendrimeren aus Polybenzyläthern ausgewählt.
  • Erfindungsgemäß werden die Polyalkylen-Glykole vorzugsweise aus Polyalkylen-Glykolen mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 102 bis 105 Dalton (Da) ausgewählt und gegebenenfalls kovalent an ein Targetingelement gebunden. Besonders vorteilhaft werden die erfindungsgemäßen Polyalkylen-Glykole aus Polyethylen-Glykolen (PEG) mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 102 bis 105 Da und besonders bevorzugt zwischen 500 bis 105 Da ausgewählt.
  • Erfindungsgemäß sind unter "Mono- oder Polysaccharid" die Moleküle zu verstehen, die aus einem oder mehreren Sacchariden, gegebenenfalls kovalent an ein Targetingelement gebunden, bestehen. Beispielhaft sind Pyranosen und Furanosen, beispielsweise Glucose, Mannose, Rhamnose, Galactose, Fructose oder Maltose, Lactose, Saccharose, Sucrose, Fucose, Cellobiose, Allose, Laminarobiose, Gentiobiose, Sophorose und Melibiose, zu nennen. Weiterhin kann es sich um "komplexe" Saccharide handeln, das heißt mehrere Saccharide, die kovalent miteinander verbunden sind, wobei jeder Zucker vorzugsweise aus der zuvor genannten Liste ausgewählt wird. Als geeignete Polysaccharide sind zu nennen die Dextrane, α-Amylose, Amylopektin, Fructane, Mannane, Xylane und Arabinane. Vorzugsweise werden die erfindungsgemäßen Mono- oder Polysaccharide aus natürlichen oder handelsüblichen Derivaten ausgewählt, die sich mit pharmakologischen Verwendungen vertragen, wie natürlichen Zuckern, Cyclodextrinen oder Dextranen.
  • Entsprechend einer anderen erfindungsgemäßen Alternative kann das Polyalkylen-Glykol oder das Mono- bzw. Polysaccharid gegebenenfalls kovalent an ein Targetingelement gebunden sein. In diesem Fall kann es sich entweder um ein extrazelluläres Targetingelement handeln, das es erlaubt, die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen oder die Zusammensetzungen, die sie enthalten, auf bestimmte Zelltypen oder gewünschte Gewebe (beispielsweise Tumor-, Leber- und blutbildende Zellen) zu richten, oder es kann sich um ein intrazelluläres Targetingelement handeln, das eine Ausrichtung auf bestimmte bevorzugte Zellkompartimente (beispielsweise Mitochondrien und Zellkern) erlaubt.
  • Von den erfindungsgemäß verwendbaren Targetingelementen sind Zucker, Peptide, Proteine, Oligonukleotide, Lipide, Neuromediatoren, Hormone, Vitamine oder ihre Derivate zu nennen. Vorzugsweise handelt es sich um Zucker, Peptide, Vitamine oder Proteine wie Antikörper oder Antikörperfragmente, Zellrezeptorliganden oder Fragmente davon, Rezeptoren oder auch Rezeptorfragmente. So kann es sich beispielsweise um Liganden von Rezeptoren für Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für Cytokine, Rezeptoren vom Typ Zelllektine, Folatrezeptoren oder Liganden mit der Sequenz RGD mit einer Affinität für die Rezeptoren für Adhäsionsproteine wie die Integrine handeln. Beispielsweise sind die Rezeptoren für Transferrin, HDL und LDL oder den Transporter des Folats zu nennen. Das Targetingelement kann auch ein Zucker sein, der es erlaubt, auf Lektine abzuzielen, wie Rezeptoren für Asialoglycoproteine oder Syalyde wie Sialyl Lewis X oder auch das Antikörperfragment Fab oder ein Antikörper mit Einfachkette (ScFv).
  • Erfindungsgemäß sind unter "Polyalkylen-Iminen" die in der Veröffentlichung WO 96/02655 beschriebenen Polymere, nämlich die Polymere zu verstehen, welche die Monomereinheiten mit der allgemeinen Formel umfassen:
    Figure 00140001
    in welcher R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe mit der Formel:
    Figure 00140002
    sein kann, n eine ganze Zahl von 2 bis 10 bedeutet und p und q ganze Zahlen bedeuten, die so gewählt werden, dass die Summe p + q derart ist, dass das mittlere Molekulargewicht des Polymers 100 bis 107 Da beträgt.
  • Dabei ist es selbstverständlich, dass in dieser Formel der Wert von n zwischen den verschiedenen Grundeinheiten -NR-(CH2)n- variieren kann. Somit umfasst diese Formel gleichzeitig die Homopolymere und die Heteropolymere. Die kommerziellen Polyalkylen-Imine bilden eine interessante Alternative. Dabei sind die Polyethylen-Imine (PEI) besonders bevorzugt und speziell das PEI 25K (PEI mit einem mittleren Molekulargewicht von 25 kDa), PEI 50K, PEI 100K oder auch PEI 200K.
  • Erfindungsgemäß sind unter "therapeutischen Molekülen" die Moleküle zu verstehen, die es erlauben, eine Erkrankung zu verhüten oder zu bekämpfen, die sich in den Regionen des Organismus manifestiert hat und eine stärkere Azidität als die normale physiologische erzeugt. Solche Regionen sind insbesondere, aber nicht ausschließlich:
    • – Tumoren, insbesondere Tumorzellen und auch normale Zellen in der Nähe dieser Tumoren (beispielsweise Tumorendothelzellen), die eine stärkere lokale Azidität als die normale physiologische aufweisen (N. Raghunand et al., Drug Resistance Updates, 3, 30-38 [2000]),
    • – ischämische Muskeln, beispielsweise der Herzmuskel, an welchen die Azidose teilweise von der Milchsäure verursacht wird, die von der anaeroben Vergärung von Kohlenwasserstoffen vom Typ Zucker oder Fettsäuren erzeugt wird,
    • – entzündete Bereiche, in welchen die Produktion von Superoxidionen von Makrophagen viel Sauerstoff verbraucht, oder
    • – Gewebe, in welchen eine infektiöse oder entzündliche Stoffwechselstörung eine lokale Azidose erzeugt.
  • Entsprechend einer anderen Alternative erlauben es die erfindungsgemäßen "therapeutischen Moleküle", eine Erkrankung durch ihre Freisetzung in einem sauren Zellkompartiment, beispielsweise im Endosom von Zellen, das sauer ist, zu verhüten oder zu bekämpfen.
  • Die therapeutischen Moleküle können so beispielsweise ausgewählt werden aus Peptiden, Oligopeptiden, Proteinen, Antigenen und deren Antikörpern, Enzymen und deren Inhibitoren, Hormonen, Antibiotika, Analgetika, Bronchodilatatoren, antimikrobiellen Wirkstoffen, blutdrucksenkenden Wirkstoffen, Herz-Kreislauf-Wirkstoffen, auf das Zentralnervensystem einwirkenden Wirkstoffen, Antihistaminika, Antidepressiva, Beruhigungsmitteln, Antikonvulsiva, entzündungshemmenden Substanzen, Stimulantien, Antiemetika, Diuretika, Antispasmodika, antüschämischen Wirkstoffen, den Zelltod begrenzenden Wirkstoffen oder Anti-Krebs-Wirkstoffen.
  • Weiterhin sind unter "biologisch wirksamen Substanzen" die Substanzen zu verstehen, die entweder aus den wie zuvor definierten therapeutischen Molekülen oder aus Nukleinsäuren ausgewählt sind.
  • Erfindungsgemäß ist unter einer "Nukleinsäure" sowohl eine Desoxyribonukleinsäure als auch eine Ribonukleinsäure zu verstehen. Dabei kann es sich um natürliche oder künstliche Sequenzen handeln und insbesondere um genomische DNA (DNAg), komplementäre DNA (DNAc), Messenger-RNA (RNAm), Transfer-RNA (RNAt), ribosomale RNA (RNAr), Hybridsequenzen oder synthetische bzw. halbsynthetische Sequenzen und gegebenenfalls modifizierte Oligonukleotide. Diese Nukleinsäuren können beispielsweise humanen, tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen oder synthetischen Ursprungs sein. Sie können durch ein beliebiges dem Fachmann bekanntes Verfahren erhalten werden, insbesondere durch das Screening von Banken, durch chemische Synthese oder gemischte Verfahren, einschließlich der chemischen oder enzymatischen Modifizierung von Sequenzen, die durch das Screening von Banken erhalten worden sind. Sie können auch chemisch modifiziert werden.
  • Was insbesondere die Desoxyribonukleinsäuren betrifft, so können sie einfach- oder doppelsträngig sein wie kurze Oligonukleotide oder längere Sequenzen. Insbesondere werden die Nukleinsäuren vorteilhafterweise beispielsweise von Plasmi den, Vektoren, Episomen oder Expressionskassetten gebildet. Diese Desoxyribonukleinsäuren können insbesondere einen gegebenenfalls funktionellen Replikationsursprung in der Targetzelle, ein oder mehrere Markergene, die Transkription oder die Replikation regulierende Sequenzen, Gene von therapeutischem Interesse, gegebenenfalls modifizierte antisense-Sequenzen oder Regionen der Bindung an andere Zellkomponenten tragen.
  • Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure eine Expressionskassette, die aus einem oder mehreren Genen von therapeutischem Interesse unter der Kontrolle eines oder mehrerer Promotoren und eines in den Targetzellen wirksamen Transkriptionsterminators gebildet wird.
  • Erfindungsgemäß ist unter einer "Expressionskassette für ein interessierendes Gen" ein DNA-Fragment zu verstehen, das in einen Vektor mit spezifischen Restriktionsloci insertiert werden kann. Das DNA-Fragment umfasst eine Nukleinsäuresequenz, die für eine RNA oder ein interessierendes Polypeptid kodiert, und außerdem die für die Expression dieser Sequenz erforderlichen Sequenzen (beispielsweise Aktivator/en, Promotor/en und Polyadenylierungssequenzen). Die Kassette und die Restriktionsloci sind entworfen, um eine Insertion der Expressionskassette in einen für die Transkription und die Translation geeigneten Leserahmen sicherzustellen.
  • Dabei handelt es sich im Allgemeinen um ein Plasmid oder ein Episom, das ein oder mehrere therapeutisch interessierende Gene trägt. Beispielhaft sind die Plasmide zu nennen, die in den Patentanmeldungen WO 96/26270 und WO 97/10343 beschrieben sind, die hiermit als Bezugnahme aufgenommen werden.
  • Erfindungsgemäß ist unter einem interessierenden therapeutischen Gen insbesondere jedes Gen zu verstehen, das für ein Proteinprodukt kodiert, das eine therapeutische Wirkung hat. Dabei kann das so kodierte Proteinprodukt insbesondere ein Protein oder ein Peptid sein. Dieses Proteinprodukt kann gegenüber der Targetzelle homolog exogen oder endogen sein, das heißt ein Produkt, das normalerweise in der Targetzelle exprimiert wird, wenn diese nicht erkrankt ist. In diesem Fall er laubt die Expression eines Proteins beispielsweise, eine unzureichende Expression in der Zelle oder die Expression eines aufgrund einer Modifizierung inaktiven oder schwach aktiven Proteins zu beheben oder auch dieses Protein zu überexprimieren. Das interessierende therapeutische Gen kann auch für einen Mutanten eines Zellproteins kodieren, der beispielsweise eine erhöhte Stabilität oder eine modifizierte Wirkung hat. Das Proteinprodukt kann auch gegenüber der Targetzelle heterolog sein. In diesem Fall kann ein exprimiertes Protein beispielsweise eine defizitäre Aktivität in der Zelle ergänzen oder beitragen und es dieser erlauben, gegen eine Erkrankung zu kämpfen oder eine Immunantwort zu stimulieren.
  • Von den erfindungsgemäßen therapeutischen Produkten sind insbesondere zu nennen Enzyme, Blutderivate, Hormone, Lymphokine (Interleukine, Interferone oder TNF, beispielsweise: FR 92/03120), Wachstumsfaktoren, Neurotransmitter oder deren Vorläufer oder Syntheseenzyme, trophische Faktoren (beispielsweise BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 oder auch HARP/Pleiotrophin), Apolipoproteine (beispielsweise ApoAI, ApoAIV oder ApoE: FR 93/05125), Dystrophin oder ein Minidystrophin (FR 91/11947), das Protein CFTR, das mit der Mukoviszidose verknüpft ist, Gene von Tumorsuppressoren (beispielsweise p53, Rb, Rap1A, DCC oder k-rev: FR 93/04745), Gene, die für Faktoren kodieren, die an der Koagulation beteiligt sind (Faktoren VI, VIII, IX), Gene, die an der DNA-Reparatur beteiligt sind, Selbstmordgene (Thymidinkinase, Cytosindeaminase), Gene für Hämoglobin oder andere Proteintransporteure, Enzyme des Metabolismus und Katabolismus.
  • Die Nukleinsäure von therapeutischem Interesse kann ebenfalls ein Gen oder eine Antisens-Sequenz sein, dessen/deren Expression in der Targetzelle es erlaubt, die Expression von zellulären Genen oder der zellulären mRNA-Transkription zu kontrollieren. Solche Sequenzen können beispielsweise in der Targetzelle in zu zellulären mRNA komplementäre RNA translatiert werden und blockieren so deren Translation zu einem Protein gemäß dem in dem Patent EP 140 308 beschriebenen Verfahren. Die therapeutischen Gene umfassen auch die Sequenzen, die für Ribozyme kodieren, die in der Lage sind, Target-RNA selektiv zu zerstören ( EP 321 201 ).
  • Wie weiter oben beschrieben, kann die Nukleinsäure auch ein oder mehrere Gene enthalten, die für ein Antigenpeptid kodieren, das in der Lage ist, bei Mensch oder Tier eine Immunantwort hervorzurufen. In dieser speziellen Ausführungsform erlaubt die Erfindung, entweder die Herstellung von Impfstoffen oder von immuntherapeutischen Mitteln, die bei Mensch oder Tier, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren oder Krebs, angewendet werden. Dabei kann es sich insbesondere um spezifische Antigenpeptide der Viren Epstein-Barr, HIV, Hepatitis B ( EP 185 573 ), Pseudo-Tollwut, "syncitia forming virus", andere Viren oder spezifische Tumorpeptidantigene ( EP 259 212 ) handeln.
  • Vorzugsweise umfasst die Nukleinsäure auch Sequenzen, welche die Expression des therapeutisch interessierenden Gens und/oder des Gens, das für das Peptidantigen in der gewünschten Zelle oder dem gewünschten Organ kodiert, erlauben. Dabei kann es sich um Sequenzen handeln, die natürlicherweise für die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese Sequenzen in der Lage sind, in der infizierten Zelle zu funktionieren. Es kann sich auch um Sequenzen anderen Ursprungs handeln (die für die Expression anderer Proteine verantwortlich sind, oder auch synthetische Sequenzen). Insbesondere kann es sich um Promotorsequenzen von Eukaryontengenen oder Virusgenen handeln. Beispielsweise kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle stammen, die infiziert werden soll. Weiterhin kann es sich um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht sind beispielsweise die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV und RSV zu nennen. Außerdem können diese Expressionssequenzen durch Addition von beispielsweise Aktivierungs- und Regulationssequenzen modifiziert werden. Es kann sich auch um induzierbare oder repressierbare Promotoren handeln.
  • Weiterhin kann die Nukleinsäure auch, insbesondere stromaufwärts von dem therapeutisch interessierenden Gen, eine Signalsequenz enthalten, die das synthetisierte therapeutische Produkt in die Sekretionswege der Targetzelle lenkt. Diese Signalsequenz kann die natürliche Signalsequenz des therapeutischen Produktes sein, es kann sich aber auch um eine beliebige andere funktionelle Signalsequenz oder eine künstliche Signalsequenz handeln. Die Nukleinsäure kann auch eine Signalsequenz enthalten, die das synthetisierte therapeutische Produkt in ein spezielles Kompartiment der Zelle lenkt.
  • Entsprechend einem bevorzugten erfindungsgemäßen Merkmal werden die säureempfindlichen Verbindungen insbesondere ausgewählt aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel:
    Figure 00200001
    in welcher:
    • • g eine ganze Zahl gleich 0 oder 1 ist,
    • • G einen Substituenten bedeutet, der aus dem Wasserstoffatom, geradkettigen oder verzweigten gesättigten oder ungesättigten Alkylsubstituenten, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, oder Arylen, die 6 bis 14 Kohlenstoffatome enthalten, ausgewählt ist, und
    • • G1 und G2 bedeuten:
    • (a) einer einen hydrophilen Substituenten, der aus Radikalen vom Typ Polyamin ausgewählt ist, und der andere einen hydrophoben Substituenten, der aus ein- bzw. zweikettigen Alkylen oder aus Steroid-Derivaten ausgewählt ist,
    • (b) einer eine hydrophobe geradkettige Alkylgruppe, die 10 bis 24 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls eine oder mehrere Ungesättigtheiten enthält, und der andere eine Gruppe mit der allgemeine Formel:
      Figure 00210001
      in welcher i eine ganze Zahl von 1 bis 4 und j eine ganze Zahl von 9 bis 23 ist, und der hydrophile Substituent aus Radikalen vom Typ Polyamin ausgewählt ist,
    • (c) einer einen hydrophilen Substituenten, der aus Polyalkylen-Glykolen ausgewählt ist, und der andere einen Substituenten, der aus Polyalkylen-Iminen ausgewählt ist,
    • (d) einer einen hydrophilen Substituenten, der aus Polyalkylen-Glykolen ausgewählt ist, und der andere einen hydrophoben Substituenten, der aus ein- bzw. zweikettigen Alkylen, Steroid-Derivaten oder kovalenten Konjugaten eines ein- bzw. zweikettigen Alkyls oder eines Steroid-Derivates mit einem Polyalkylen-Glykolmolekül, das 1 bis 20 Monomereinheiten enthält, ausgewählt ist, oder
    • (e) einer einen hydrophilen Substituenten, der aus Polyalkylen-Glykolen ausgewählt ist, und der andere ein therapeutisches Molekül bedeutet.
  • Besonders bevorzugt werden die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen ausgewählt aus Verbindungen mit der allgemeinen Formel:
    Figure 00210002
    in welcher:
    • • g eine ganze Zahl gleich 0 oder 1 ist,
    • • G einen Substituenten bedeutet, der aus dem Wasserstoffatom, geradkettigen oder verzweigten gesättigten oder ungesättigten Alkylradikalen, die 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthalten, oder Phenyl ausgewählt ist, und
    • • G1 und G2 bedeuten:
    • (a) einer einen hydrophilen Substituenten, der aus Radikalen vom Typ Polyamin ausgewählt ist, und der andere einen hydrophoben Substituenten, der aus ein- bzw. zweikettigen Alkylen oder Steroid-Derivaten ausgewählt ist, oder
    • (d) einer einen hydrophilen Substituenten, der aus Polyalkylen-Glykolen ausgewählt ist, und der andere einen hydrophoben Substituenten, der aus ein- bzw. zweikettigen Alkylen oder Steroid-Derivaten ausgewählt ist.
  • Die neuen säureempfindlichen Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I) können in Form von nicht-toxischen und pharmazeutisch verträglichen Salzen vorliegen. Diese nicht-toxischen Salze umfassen die Salze mit anorganischen Säuren (Salz-, Schwefel-, Bromwasserstoff-, Phosphor- und Schwefelsäure) oder mit organischen Säuren (Essig-, Propion-, Bernstein-, Malein-, Hydroxymalein-, Benzoe-, Fumar-, Methansulfon- oder Oxalsäure).
  • Die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen können entsprechend zahlreicher Verfahren hergestellt werden, die aus den in der Literatur für die Synthese von eine zyklische Orthoestergruppe enthaltenden Molekülen beschriebenen ausgewählt werden (beispielsweise kann man sich aus den Beispielen unterrichten, die in der Übersicht Synthesis, Robert H. DeWolfe, 153-172 [1974] gegeben werden). Entsprechend einer Alternative können die säureempfindlichen Verbindungen mit der Formel (I) beispielsweise erhalten werden durch die Umsetzung eines Alkohols mit der Formel G1OH mit einem Orthoester mit der allgemeinen Formel:
    Figure 00230001
    in welcher g, G, G1 und G2 wie für die allgemeine Formel (I) definiert sind und Z eine 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltende geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe bedeutet.
  • Diese Substitution kann in Gegenwart eines sauren Katalysators durchgeführt und/oder bei einer Temperatur von 50 bis 150 °C, gegebenenfalls in einem Lösungsmittel, thermisch aktiviert werden. Wenn man sich dafür entscheidet, in Gegenwart eines Lösungsmittels zu arbeiten, so wird dieses aus den herkömmlichen Lösungsmitteln der organischen Chemie ausgewählt, beispielsweise aus den chlorierten organischen Lösungsmitteln, aromatischen Lösungsmitteln oder den Äthern. Wenn ein Katalysator verwendet wird, so kann es sich um eine anorganische bzw. organische Säure und eine Lewis- oder Brönsted-Säure handeln. Beispielsweise kann der Katalysator aus Salz-, Schwefel-, p-Toluolsulfon- und Camphersulfonsäure, Pyridinium-p-toluolsulfonat oder auch Magnesiumchlorid ausgewählt werden. Diese Substitution kann auch begünstigt werden, indem der Alkohol ZOH, der während der Umsetzung erzeugt wird, abdestilliert wird, da er flüchtiger als der Alkohol G1OH ist. Diese kontinuierliche Destillation kann durchgeführt werden, indem bei Atmosphärendruck oder unter Unterdruck erwärmt wird.
  • Der Ausgangsalkohol G1OH steht entweder kommerziell zur Verfügung oder er kann durch ein dem Fachmann bekanntes Verfahren synthetisiert werden, beispielsweise durch Hydratation des entsprechenden Alkens, durch Hydrolyse des entsprechenden Halogen-Derivats oder auch durch Reduktion des entsprechenden Karbonyl-Derivats.
  • Entsprechend einer anderen erfindungsgemäßen Abwandlung kann die Gruppe Z bereits die Gruppe G1 bedeuten, wobei in diesem Fall die Stufe der Umsetzung des Orthoesters mit der allgemeinen Formel (III) mit dem Alkohol G1OH nicht erforderlich ist.
  • Die Verbindung mit der allgemeinen Formel (III) kann erhalten werden durch Umsetzung eines Trialkylorthoesters mit der allgemeinen Formel (IV):
    Figure 00240001
    in welcher Z und G wie zuvor definiert sind und Z1 und Z2 gegebenenfalls voneinander verschieden sind und 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthaltende geradkettige oder verzweigte Alkylgruppen bedeuten,
    mit einem Diol mit der allgemeinen Formel (V):
    Figure 00240002
    in welcher g und G2 wie zuvor definiert sind.
  • Die Reaktion kann gemäß den herkömmlichen Schutzverfahren der Diole zu einem Orthoester durchgeführt werden, beispielsweise gemäß den Verfahren, die beschrieben sind von T.W. Greene und P.G.M. Wuts in Protective Groups in Organic Synthesis (2. Auflage, Wiley-Interscience, 135-136). Im Allgemeinen wird in einem herkömmlichen organischen Lösungsmittel (beispielsweise einem chlorierten organischen Lösungsmittel, einem aromatischem Lösungsmittel oder einem Äther) in Gegenwart eines sauren Katalysators gearbeitet. Der Katalysator kann aus anorga nischen oder organischen Säuren und Lewis- oder Brönsted-Säuren ausgewählt werden. Beispielsweise kann verwendet werden Salz-, Schwefel-, p-Toluolsulfon- und Camphersulfonsäure, Pyridinium-p-toluolsulfonat oder auch Magnesiumchlorid.
  • Der Trialkylorthoester mit der allgemeinen Formel (IV) steht entweder kommerziell zur Verfügung oder er kann gemäß den dem Fachmann bekannten herkömmlichen Verfahren synthetisiert werden, beispielsweise aus dem entsprechenden Ester oder auch durch Substitution der Alkoxygruppen aus einem anderen kommerziellen Trialkylorthoester.
  • Das Diol mit der allgemeinen Formel (V) steht entweder kommerziell zur Verfügung oder es kann durch Umsetzung eines kommerziellen Diols mit G2 oder auch durch direkte Funktionalisierung von G2 zu dem Diol erhalten werden. Diese Funktionalisierung kann beispielsweise in einer Oxidation des entsprechenden Alkens oder auch in der Öffnung eines entsprechenden Epoxids entsprechend den dem Fachmann bekannten Verfahren bestehen.
  • Wenn eines von G1 oder G2 ein Radikal vom Typ Polyamin bedeutet, so steht dieses entweder kommerziell zur Verfügung oder es lässt sich nach den dem Fachmann bekannten herkömmlichen Verfahren erhalten, beispielsweise gemäß den Verfahren, die im Stand der Technik beschrieben sind (beispielsweise in den Veröffentlichungen WO 96/17823, WO 97/18185, WO 98/54130 oder WO 99/51581) oder gemäß analogen Verfahren erhalten.
  • Wenn einer von G1 oder G2 einen hydrophoben Substituenten bedeutet, der aus ein- bzw. zweikettigen Alkylen ausgewählt ist, steht dieser entweder kommerziell zur Verfügung oder er lässt sich gemäß den dem Fachmann bekannten herkömmlichen Verfahren erhalten. So kann beispielsweise, wenn es sich um einen Dialkylaminosubstituenten mit langer Kohlenstoffkette handelt, dieser aus dem entsprechenden primären Amin durch Alkylierung (Monosubstitution eines Halogenalkyls), durch alkylierende Reduktion (aus einem Aldehyd) oder auch durch Kondensati on/Reduktion (Bildung einer Amidfunktion aus einer Säure und anschließend Reduktion) hergestellt werden.
  • Wenn einer von G1 oder G2 einen hydrophoben Substituenten bedeutet, der aus Steroid-Derivaten oder hydrophoben Dendrimeren ausgewählt ist, so wird dieser vorzugsweise aus kommerziell zur Verfügung stehenden Produkten ausgewählt.
  • Wenn einer von G1 oder G2 einen Substituenten bedeutet, der aus Polyalkylen-Glykolen oder Mono- bzw. Polysacchariden ausgewählt ist, so steht dieser entweder kommerziell zur Verfügung oder er lässt sich durch dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren erhalten, insbesondere durch Polymerisation. Wenn dieser Substituent kovalent an ein Targetingelement gebunden ist, kann die Synthese der erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen, die zuvor beschrieben worden ist, vor oder nach der Bindung durch dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren des Targetingelements an diesen Substituenten durchgeführt werden.
  • Wenn einer von G1 oder G2 einen Substituenten bedeutet, der aus Polyalkylen-Iminen ausgewählt ist, so steht dieser entweder kommerziell zur Verfügung oder er lässt sich gemäß dem Fachmann bekannten herkömmlichen Verfahren oder gemäß den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren, beispielsweise in der Veröffentlichung WO 96/02655, erhalten.
  • Das zuvor beschriebene Herstellungsverfahren ist nur beispielhaft, und natürlich kann ein beliebiges anderes gleichwertiges Herstellungsverfahren ebenfalls angewendet werden. So ist es beispielsweise möglich, die Umsetzungen aus einem Diol mit der allgemeinen Formel (V), das die Gruppe G nicht besitzt, aber an dieser Stelle eine gegebenenfalls geschützte funktionelle Gruppe (beispielsweise ein geschütztes Amin) besitzt, durchgeführt werden, indem eine letzte zusätzliche Stufe des Anbringens der Gruppe G (beispielsweise Entfernung der Schutzgruppe des Amins und anschließend Kondensation einer Säure mit der Formel G2COOH) durchgeführt wird.
  • Ein weiterer erfindungsgemäßer Gegenstand betrifft die Zusammensetzungen, die mindestens eine säureempfindliche Verbindung mit der allgemeinen Formel (I) wie zuvor definiert enthalten. Entsprechend einer erfindungsgemäßen Abwandlung enthalten diese Zusammensetzungen mindestens eine biologisch wirksame Substanz und eine säureempfindliche Verbindung mit der allgemeinen Formel (I), in welcher G1 und G2 die in (a), (b), (c) oder (d) angegebenen Definitionen besitzen.
  • Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können außerdem ein oder mehrere Zusatzstoffe enthalten, die in der Lage sind, sich an die Komplexe anzulagern, die zwischen der erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindung und der biologisch aktiven Substanz gebildet werden. In einer anderen Ausführung betrifft die Erfindung somit Zusammensetzungen, die mindestens eine biologisch wirksame Substanz, eine säureempfindliche Verbindung mit der Formel (I), in welcher G, und G2 die in (a), (b), (c) oder (d) angegebenen Definitionen haben, und einen oder mehrere Zusatzstoffe umfassen. Dabei kann es das Vorhandensein dieser Zusatzstoffe (beispielsweise Lipide, Peptide oder Proteine) vorteilhafterweise erlauben, das Transfektionsvermögen der Verbindungen in den Fällen zu erhöhen, in welchen die biologisch wirksame Substanz eine zu transfektierende Nukleinsäure ist.
  • Unter diesem Gesichtspunkt können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen als Zusatzstoff ein oder mehrere neutrale Lipide enthalten. Dabei hat es sich gezeigt, dass es der Zusatz eines neutralen Lipids erlaubt, die Bildung von Nukleolipidteilchen (dann, wenn die biologisch wirksame Substanz eine Nukleinsäure ist) zu verbessern und das Eindringen des Teilchens in die Zelle unter Destabilisierung der Membran zu begünstigen.
  • Insbesondere sind diese neutralen Lipide solche mit zwei Fettkohlenwasserstoffketten. Besonders vorteilhaft werden natürliche, synthetische, zwitterionische oder Lipide, die unter physiologischen Bedingungen keine Ionenladung haben verwendet. Sie können insbesondere ausgewählt werden aus Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamin (POPE), Distearoylphosphatidyl-ethanolamin, Dipalmitoylphosphatidylethanolamin, Dimi rystoylphosphatidyl-ethanolamin sowie deren 1- bis 3-mal N-methylierte Derivate, Phosphatidylglycerinen, Diacylglycerinen, Glycosyldiacylglycerinen, Cerebrosiden (wie insbesondere Galactocerebrosiden), Sphingolipiden (insbesondere Sphingomyelinen) oder auch Asialogangliosiden (insbesondere AsialoGM1 und -GM2).
  • Diese verschiedenen Lipide können entweder durch Synthese oder durch Extraktion aus Organen (Beispiel: Gehirn) oder Eiern durch dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren erhalten werden. Insbesondere kann die Extraktion von natürlichen Lipiden mittels organischer Lösungsmittel (siehe auch Lehninger, Biochemistry) durchgeführt werden.
  • Vorzugsweise enthalten, wenn die biologisch wirksame Substanz eine Nukleinsäure ist, die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen 0,01 bis 20 Äquivalente Zusatzstoffe auf ein Äquivalent Nukleinsäuren in mol/mol und besonders bevorzugt 0,5 bis 5.
  • Die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen können je nach den Substituenten G1 und G2, die sich auf beiden Seiten des zyklischen Orthoesters befinden, verschiedene Verwendungen finden.
  • Wenn die Substituenten G1 und G2 die in (a), (b) oder (c) in der allgemeinen Formel (I) eingegebenen Definitionen haben, können die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen Konjugate (beispielsweise vom Typ Liposomen, Komplexe oder auch Nanopartikel) direkt mit den biologisch wirksamen Substanzen bilden, die anschließend in den Zellgeweben oder -kompartimenten freigesetzt werden können, die saurer als die normalen physiologischen sind. Diese säureempfindlichen Verbindungen sind insbesondere für die Transfektion von Nukleinsäuren nützlich.
  • Wenn die Substituenten G1 und G2 die in (d) in der allgemeinen Formel (I) angegebenen Definitionen haben, so bilden die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen nichtionische oberflächenaktive Mittel, die es erlauben, gleichzeitig die eine biologisch wirksame Substanz umkapselnden Teilchen zu stabilisieren und diese biologisch wirksame Substanz durch Abbau in sehr schwach sauren Regionen mit Säuren des Organismus, insbesondere in Regionen, in welchen der pH-Wert sauer ist und etwa 4 bis etwa 7 beträgt, freizusetzen.
  • Außerdem sind die Polysaccharid- oder Polyalkylen-Glykol-Substituenten und insbesondere das Polyethylen-Glykol (PEG) dafür bekannt, dass sie gewisse "Tarneigenschaften" den Teilchen verleihen, an welche sie angelagert sind, wobei sie die unspezifische Adsorption durch Serumproteine und demzufolge das Erkennen dieser Teilchen durch Makrophagen verhindern (siehe beispielsweise Torchilin et al., Biochim. Biophys. Acta, 1195, 11-20 [1994] oder Papahadjopoulos et al., PNAS, 88, 11460-4 [1991]). So haben die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen, die ein PEG-Molekül enthalten, einen Vorteil hinsichtlich der Unschädlichkeit und auch einen zusätzlichen Vorteil in dem Sinne, dass sie die Gefahr einer Wechselwirkung mit anderen Proteinen verringern. In den sauren Regionen des Organismus erlaubt der Abbau des in den erfindungsgemäßen Verbindungen vorhandenen Orthoesters die Trennung der PEG-Moleküle vom Rest des Teilchens, was die biologisch wirksame Substanz erneut "verfügbar" macht (es findet ein "Verschwinden der Tarneigenschaft" statt). So kann ein selektiver Transfer auf saure Gewebe erwartet werden.
  • Schließlich bilden, wenn die Substituenten G- und G2 die in (e) oder (f) in der allgemeinen Formel (I) gegebenen Definitionen haben, die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen kovalente Konjugate mit einem therapeutischen Molekül, die so dessen Vektorisierung und anschließend dessen Freisetzung in sauren Regionen des Organismus erlauben. Dabei haben diese kovalenten Konjugate denselben Charakter wie die von Kratz et al. beschriebenen, aber mit einer neuen säureempfindlichen Bindung zwischen dem therapeutischen Molekül und dem "Vektorteil", was den Vorteil hat, gegenüber den bisher verwendeten pH-empfindlichen Bindungen eine modifizierbare Empfindlichkeit zu erreichen.
  • So hat die Erfindung weiterhin zum Gegenstand die Verwendung von wie zuvor definierten säureempfindlichen Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I) zur Herstellung eines Arzneimittels, das zur Bekämpfung von Krankheiten vorgesehen ist. In diesem Fall bestimmt die jeweilige Krankheit die Auswahl der biologisch wirksamen Substanz.
  • In einer besonders vorteilhaften Abwandlung können, wenn die biologisch wirksame Substanz eine Nukleinsäure ist, die säureempfindlichen Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I), in welcher G1 und G2 die in (a), (b) oder (c) gegebenen Definitionen erfüllen, zur Herstellung eines Arzneimittels verwendet werden, das für die in-vitro-, ex-vivo- oder in-vivo-Transfektion von Nukleinsäuren, insbesondere in Primärzellen oder in etablierten Zelllinien vorgesehen ist. Dabei kann es sich beispielsweise um Fibroblasten-, Muskel-, Nerven- (Neuronen, Astrozyten, Glyazellen) und Leberzellen, Zellen der Hämatopoeselinie (beispielsweise Lymphozyten, CD34, Dendritenzellen) oder auch um Epithelzellen in ausdifferenzierter oder pluripotenter (Vorläufer-)Form handeln.
  • Schließlich können in einer anderen erfindungsgemäßen Alternative die säureempfindlichen Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I), in welcher G1 und G2 die in (e) oder (f) gegebenen Definitionen erfüllen, als Arzneimittel verwendet werden.
  • In den vorhergehenden Fällen bauen sich die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen in den Zellgeweben oder -kompartimenten ab, deren pH-Wert saurer als der normale physiologische ist. Es ist jedoch entsprechend einer Alternative möglich, die Azidität in der Targetzone des Organismus durch eine dem Fachmann bekannte allgemeine oder lokale Behandlung auszulösen oder zu erhöhen. Beispielhaft ist die Injektion eines sauren Mittels in den zu behandelnden Bereich oder auch die intravenöse Injektion von Glucose, die eine spezifische Ansäuerung von Tumorgewebe verursacht, zu nennen (T. Volk et al., Br. J Cancer, 68 [3], 492-500 [1993]). So können die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen auch in Bereichen des Organismus verwendet werden, die a priori nicht sauer sind und welche durch dem Fachmann bekannte Behandlungen angesäuert worden sind.
  • Bei allen zuvor beschriebenen Verwendungen der erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen umfassen diese:
    • – entweder eine säureempfindliche Verbindung mit der allgemeinen Formel (I), in welcher G1 und G2 die in (e) oder (f) gegebenen Definitionen erfüllen, oder
    • – eine säureempfindliche Verbindung mit der allgemeinen Formel (I), in welcher G1 und G2 die in (a), (b), (c) oder (d) gegebenen Definitionen erfüllen, und eine biologisch wirksame Substanz
    und können für ihre beispielsweise topische, kutane, orale, rektale, vaginale, parenterale, intranasale, intravenöse, intramuskuläre, subkutane, intraokuläre, transdermale, intratracheale oder auch intraperitoneale Verabreichung formuliert werden. Vorzugsweise enthalten die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen einen pharmazeutisch verträglichen Träger für eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion in das gewünschte Organ, oder für eine Verabreichung auf topischem Wege (durch die Haut und/oder Muskel). Dabei kann es sich insbesondere um isotonische, sterile Lösungen oder auch um trockene, insbesondere gefriergetrocknete Zusammensetzungen handeln, die es durch Zugabe je nachdem von sterilisiertem Wasser oder physiologischem Serum die Bildung injizierbarer Gelöster erlauben. Die Dosen an biologisch wirksamen Substanzen, die für die Injektion verwendet werden, sowie die Anzahl der Verabreichungen können in Abhängigkeit von verschiedenen Parametern angepasst werden, insbesondere in Abhängigkeit von der Art und Weise der Verabreichung, der betreffenden Erkrankung, des zu exprimierenden Gens, wenn die biologisch wirksame Substanz eine Nukleinsäure ist, oder auch der Dauer der gewünschten Behandlung. Was insbesondere die Art und Weise der Verabreichung betrifft, so kann es sich entweder um eine direkte Injektion in das Gewebe, bzw. den Blutkreislauf, oder um eine Behandlung von kultivierten Zellen mit anschließender in-vivo-Reimplantation durch Injektion oder Implantation handeln. Die erfindungsgemäß betroffenen Gewebe sind beispielsweise Muskeln, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Knochenmark, Thymus, Herz, Lymphe, Blut, Knochen, Knorpel, Bauchspeicheldrüse, Nieren, Harnblase, Magen, Darm, Hoden, Eierstöcke, Rektum, Nervensystem, Augen, Drüsen oder auch Bindegewebe.
  • Außer den vorhergehenden Merkmalen umfasst die Erfindung auch weitere Merkmale und Vorteile, die anhand der folgenden Beispiele und Figuren näher erläutert werden, die als die Erfindung erläuternd und nicht deren Umfang beschränkend anzusehen sind. Insbesondere werden von der Anmelderin beispielhaft verschiedene Vorschriften sowie Reaktionszwischenprodukte vorgeschlagen, die in der Lage sind, zur Herstellung der Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I) verwendet zu werden. Selbstverständlich liegt es innerhalb der Kenntnisse des Fachmanns, sich von diesen Vorschriften und/oder Zwischenprodukten anregen zu lassen, analoge Vorschriften zu entwickeln, um zu anderen erfindungsgemäßen Verbindungen mit der allgemeinen Formel (I) zu gelangen.
  • FIGUREN
  • 1: Veränderung des Fluoreszenzanteils in Abhängigkeit von der Zeit bei pH 5 von Komplexen, die zwischen DNA und einem kationischen Vergleichslipid oder der säureempfindlichen syn- oder trans-Verbindung A gebildet wurde, mit 3 verschiedenen Verhältnissen: 0,4; 1,7 oder 6,0 mmol kationisches Lipid oder säureempfindliche Verbindung/μg DNA.
  • 2: Wirksamkeit einer in-vitro-Transfektion in HeLa-Zellen von Komplexen, die zwischen DNA und der syn- oder trans-Verbindung A oder einem kationischem Vergleichslipid gebildet wurden, mit verschiedenen Ladungsanteilen, mit oder ohne Serum. Auf der Ordinate ist die Expression der Luciferase in pg/Loch/μg Protein angegeben. Auf der Abszisse ist das Verhältnis von Ladung syn- oder trans-Verbindung A oder kationisches Vergleichslipid/DNA angegeben.
  • 3: Veränderung der Größe (nm) von kationischen Vergleichs-Lipidnukleolipidteilchen/DNA in Abhängigkeit von der Menge an Verbindung C oder Verbindung D oder Brij 700 oder eines nicht säureempfindlichen Analogen der Verbindung D (Analoges D), die in Bezug auf die Menge DNA (Gewicht/Gewicht) verwendet wurde. Eine geringe Größe zeigt, dass die Nukleolipidteilchen stabilisiert waren. Eine sehr große Größe zeigt, im Gegenteil, eine Destabilisierung der Nukleolipidteilchen, die dann die Tendenz hatten, sich zu aggregieren.
  • 4: Veränderung der Größe (nm) von kationischen Vergleichs-Lipidnukleolipidteilchen/DNA/Verbindung oder Analoges D in Abhängigkeit von der Zeit mit unterschiedlichen Verhältnissen (Gewicht/Gewicht), mit pH gleich 5. Eine geringe Größe der Nukleolipidteilchen zeigt, dass diese stabilisiert waren. Eine sehr große Größe zeigt, im Gegenteil, eine Destabilisierung der Nukleolipidteilchen, die dann die Tendenz hatten, sich zu aggregieren.
  • 5: Veränderung der Größe (nm) von kationischen Vergleichs-Lipidnukleolipidteilchen/DNA/Verbindung C oder Verbindung E in Abhängigkeit von der Zeit bei verschiedenen pH (pH 4, pH 5, pH 6 und pH 7,4). Das Verhältnis von Verbindung C oder Verbindung E/DNA war auf 1 (nmole/μg DNA) festgelegt.
  • 6: Schematische Darstellung des Plasmids pXL3031.
  • 7: Dosis-Antwort-Kurve der Verbindung D auf die in-vivo-Gentransferaktivität durch kationische Lipidkomplexe/DOPE/DNA (5/5/1). Die Verbindung "Analoges D" wurde als Negativkontrolle verwendet. Die Daten sind Mittelwerte (Linien) und die Einzelwerte (Punkte) von 4 Balb/C-Mäusen, die subkutane Tumoren M109 hatten.
  • BEISPIELE
  • Die üblichen Reagentien und Katalysatoren wie Triethylamin, Trifluoressigsäure, Trifluoressigsäureanhydrid, tert.-Butylbromacetat, Butyrolacton, 3-Aminopropan-1,2-diol, Serinol(2-aminopropan-1,3-diol), Trimethylorthoformiat, Trimethylorthoacetat, p-Toluolsulfonsäure, Pyridinium-p-toluolsulfonat oder Benzotriazol-1- yloxytris(dimethylamino)-phosphoniumhexafluorphosphat(BOP) stehen kommerziell zur Verfügung.
  • Die Waschvorgänge wurden mit wässrigen Lösungen, die mit Natriumchlorid oder Natriumhydrogencarbonat gesättigt waren, oder mit einer konzentrierten Kaliumhydrogensulfatlösung mit 0,5 mol/l durchgeführt.
  • Die hydrophilen Polymere (Polyethylen-Glykole unterschiedlicher Größe) stehen kommerziell zur Verfügung. Die hydrophilen Substituenten vom Typ Polyamine stehen ebenfalls kommerziell zur Verfügung oder lassen sich durch dem Fachmann bekannte herkömmliche Verfahren synthetisieren, wie insbesondere in den folgenden Beispielen angegeben. Die hydrophoben Substituenten (beispielsweise ein- bzw. zweikettige Dialkylamine und Fettalkohole) stehen kommerziell zur Verfügung oder lassen sich entsprechend den dem Fachmann bekannten herkömmlichen Verfahren synthetisieren. So können beispielsweise ein- bzw. zweikettige Dialkylamine aus primären Aminen und den entsprechenden Halogenalkyl-Derivaten, wie in den folgenden Beispielen beschrieben, synthetisieren.
  • Die Protonen-Kernmagnetresonanzspektren (1H-NMR) wurden mit Spektrometern Bruker 300, 400 und 600 MHz aufgezeichnet. Die chemischen Verschiebungen sind in ppm (Teile auf eine Million) und die Vielfachen durch die üblichen Abkürzungen angegeben.
  • Das verwendete Plasmid war pXL3031, das in der Veröffentlichung Gene Therapy 6, 1482-1488 (1999) beschrieben ist, das das Gen luc enthält, das für die Luciferase unter der Kontrolle des Promotors P/E CMV des Cytomegalovirus kodiert. Dieses Plasmid ist in 6 gezeigt. Seine Größe beträgt 3671 bp. Die verwendete Plasmidlösung war auf 1,262 g/l in Wasser für ein injizierbares Präparat verdünnt.
  • Beispiel 1: Synthese von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid ("Ortho 1")
  • 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid ("Ortho 1") hat die Formel:
    Figure 00350001
  • Es kann zweistufig aus 3-Aminopropan-1,2-diol erhalten werden:
  • 1) Herstellung von N-(2,3-Dihydroxy-propyl)-2,2,2-trifluoracetamid
  • In einem mit einem Magnetstab versehenen Kolben wurden 15 g 3-Aminopropan-1,2-diol (164,6 mmol) in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst. Danach wurde das Reaktionsgemisch auf 0 °C in einem Eisbad abgekühlt, und es wurden 21,5 ml Trifluorethylacetat (181,1 mmol) allmählich zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das rohe Reaktionsgemisch wurde anschließend bis zur Trockne eingedampft. Es wurden 29 g eines farblosen reinen Öls (Ausbeute: 95 %) erhalten, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
  • 2) Herstellung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid (Ortho 1)
  • Die 29 g (155 mmol) N-(2,3-Dihydroxy-propyl)-2,2,2-tifluor-acetamid, die in der vorhergehenden Stufe erhalten worden waren, wurden in 75 ml Dichlormethan, ergänzt mit 75 ml Trimethylorthoformiat (685 mmol) gelöst. 300 mg p-Toluolsulfonsäure (1,7 mmol) wurden anschließend zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das Rohprodukt wurde in 500 ml Dichlormethan verdünnt, 3-mal mit 200 ml gesättigtem Natriumhydrogencarbonat und anschließend 3-mal mit 200 ml gesättigtem Natriumchlorid gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat ge trocknet, filtriert und bis zur Trockne aufkonzentriert. Es wurden 30 g eines reinen öligen Produkts (Ausbeute: 85 %) ohne weitere Reinigung erhalten.
  • 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm). Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren im Verhältnis 50/50 beobachtet.
    * 3,33 und 3,37 (2 s : 3H insgesamt); 3,35 bis 3,80 (mts : 3H); 4,10 bis 4,25 (mt 1H); 4,50 (mt : 1H); 5,73 und 5,78 (2s : 1H insgesamt); 6,66 und 7,55 (2 mfs : 1H insgesamt).
  • Beispiel 2: Synthese von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-2-methyl-[1,3]dioxan-5-yl)-acetamid ("Ortho 2")
  • 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-2-methyl-[1,3]dioxan-5-yl)-acetamid ("Ortho 2") hat die Formel:
    Figure 00360001
  • Es kann zweistufig aus 2-Aminopropan-1,3-diol (Serinol) erhalten werden:
  • 1) Herstellung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-hydrox-1-hydroxymethyl-ethyl)-acetamid
  • Zu 4 g 2-Aminopropan-1,3-diol (43,9 mmol) wurden 20 ml Tetrahydrofuran zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt, und es wurden 5,8 ml Trifluorethylacetat (48,3 mmol) allmählich zugegeben. Diese Lösung wurde 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde bis zur Trockne eingedampft, und 3-mal in Dichlormethan aufgenommen, um das Tetrahydrofuran vollständig zu verdampfen. Es wur den 8,1 g eines reinen weißen Pulvers (Ausbeute: 99 %) erhalten und in der folgenden Stufe ohne weitere Reinigung verwendet.
  • 2) Herstellung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-2-methyl-[1,3]dioxan-5-yl)-acetamid (Ortho 2)
  • 7,9 g (42,2 mmol) 2,2,2-Trifluor-N-(2-hydroxy-1-hydroxymethyl-ethyl)-acetamid, die in der vorhergehenden Stufe erhalten worden waren, wurden in 30 ml Dichlormethan, ergänzt mit 16,1 ml Trimethylorthoacetat (126,7 mmol) gelöst. Anschließend wurden 73 mg p-Toluolsulfonsäure (0,42 mmol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das rohe Reaktionsprodukt wurde in 150 ml Dichlormethan verdünnt, 3-mal mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend 3-mal mit 50 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, abfiltriert und bis zur Trockne aufkonzentriert. Es wurden 9,9 g eines reinen weißen Feststoffs ohne weitere Reinigung erhalten (Ausbeute: 96 %).
  • 1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm). Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren im Verhältnis von etwa 75/25 beobachtet.
    * 1,49 und 1,50 (2 s : 3H insgesamt); 3,34 und 3,35 (2 s: 3H insgesamt); 3,66 und 3,82 (bzw. dmt, J = 12 Hz und dd, J = 11 und 8 Hz : 2H insgesamt); 3,90 bis 4,00 und 4,20 bis 4,35 (2 mts: 1H insgesamt); 3,97 und 4,33 (bzw. dd, J = 11 und 5 Hz und dmt, J = 12 Hz : 2H insgesamt); 6,38 und 7,04 (2 mfs vergleichmäßigt: 1H insgesamt).
  • Beispiel 3: Synthese der Verbindungen syn- und trans-4-{4-[(2-{3-[4-(3-Aminopropylamino)-butylamino]-propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-dioctadecylbutyramidtetraacetat
  • In diesem Beispiel wird ein Syntheseweg beschrieben für die säureempfindliche Verbindung A in ihren zwei diastereoisomeren Formen syn und trans mit der Formel:
    Figure 00380001
    Verbindung A a-Synthese von syn- und trans-4-(4-Aminomethyl-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-N,N-dioctadecylbutyramid (Lipidteil-O-Orthol-NH2)
  • Diese Synthese verläuft dreistufig: Funktionalisierung des Dioctadecylamins zu Alkohol und Anbringen an der Ortho-1-Gruppe, deren Schutzgruppe anschließend abgespalten wird.
  • 1) Herstellung von 4-Hydroxy-N,N-dioctadecylbutyramid
  • Zu 4,6 g Aluminiumchlorid (34 mmol) wurden 25 ml Chloroform gegeben, und das Ganze auf etwa 10 °C in einem thermostatierten Bad abgekühlt. 6,4 ml Triethylamin (46 mmol) in 15 ml Chloroform wurden tropfenweise zugegeben, anschließend wurde das Reaktionsgemisch sich auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen. 6 g Dioctadecylamin (11,5 mmol), gemischt mit 1 ml Butyrolacton (13,8 mmol) in 110 ml Chloroform, wurden allmählich zu dem Gemisch durch einen Fülltrichter zugegeben.
  • Die Reaktion fand nach 2 Stunden Rühren mit einem Magnetrührer bei Umgebungstemperatur nicht mehr statt. Es wurden 75 ml Wasser zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang gerührt. Das Rohprodukt wurde über Celite filtriert und anschließend mit Chloroform gewaschen. Das Filtrat wurde abdekantiert und die organische Phase mit 3-mal 50 ml gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen. Die Chloroformlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Es wurden 4,9 g eines weißen Pulvers nach Chromatographie über Siliciumdioxid (Ausbeute: 70 % erhalten.
  • 2) Herstellung von syn- und trans-N,N-Dioctadecyl-4-{4-[(2,2,2-trifluoracetylamino)-methyl-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-butyramid
  • 2,8 g 4-Hydroxy-N,N-dioctadecylbutyramid, die in der vorhergehenden Stufe (4,6 mmol) erhalten worden waren, wurden mit 2,6 g 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid (Ortho 1, 11,5 mmol) und 90 mg Magnesiumchlorid (0,92 mmol) vermischt. Das Ganze wurde lösungsmittelfrei 2 Stunden lang bei 80 °C erhitzt.
  • Das rohe Reaktionsprodukt wurde anschließend in 150 ml Cyclohexan gelöst und 3-mal mit 30 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend 3-mal mit 20 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Die Reinigung wurde durch Chromatographie über Siliciumdioxid durchgeführt. Es wurden 1,2 g bzw. 1,1 g der zwei erwarteten syn- und trans-Diastereoisomeren in Form eines weißen Pulvers (Ausbeute: 62 %) erhalten.
    1H-NMR der syn-Verbindung (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz: 6H); 1,15 bis 1,40 (mt : 60H); 1,52 (mt: 4H); 1,94 (mt: 2H); 2,39 (t, J = 7 Hz : 2H); 3,20 (t breit, J = 8 Hz : 2H); 3,29 (mt : 2H); 3,61 (t, J = 5 Hz : 2H); 3,66 (mt : 2H); 3,79 (dd, J = 8 und 7 Hz : 1H); 4,11 (t, J = 8 Hz : 1H); 4, 50 (mt : 1H); 5, 82 (s : 1H); 8,13 (mf : 1H).
    1H-NMR der trans-Verbindung (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz 6H); 1,15 bis 1,40 (mt : 60H); 1,52 (mt : 4H); 1,95 (mt : 2H); 2,38 (t, J = 7 Hz 2H); 3,21 (t breit, J = 8 Hz : 2H); 3,29 (t breit, J = 8 Hz : 2H); 3,44 (mt : 1H); 3,55 bis 3,75 (mt : 1H); 3,60 (t, J = 6 Hz : 2H); 3,69 (dd, J = 8,5 und 5 Hz : 1H); 4,19 (dd, J = 8,5 und 7 Hz : 1H); 4,50 (mt : 1H); 5,87 (s : 1H); 6,70 (mf : 1H).
  • 3) Herstellung von syn- und trans-4-(4-Aminomethyl-[1,31dioxolan-2-yloxy)-N,N-dioctadecylyramid
  • 1,1 g N,N-Dioctadecyl-4-{4-[(2,2,2-trifluor-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-butyramid, die in der vorhergehenden Stufe (1,37 mmol, syn oder trans) erhalten worden waren, wurden in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst und 10 ml einmolare Natronlauge mit 4 % unter starkem Rühren zugegeben. Die Reaktion wurde eine Nacht lang bei Umgebungstemperatur stattfinden gelassen.
  • Das Tetrahydrofuran wurde danach aufkonzentriert und das Produkt anschließend mit 3-mal 150 ml Diethyläther extrahiert. Die organische Phase wurde über Calciumchlorid getrocknet, filtriert und eingedampft. 840 mg der erwarteten Produkte wurden so isoliert (Ausbeute: 86 %) und wie sie waren im Folgenden verwendet.
  • b – Synthese von (Trifluoracetyl-{3-[trifluoracetyl-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-butyl)amino]-propyl}-amino)-essigsäure (hydrophiler Teil Polyamin-COOOH)
  • Diese Synthese verlief zweistufig: Schutz der vier Amine des Spermins, anschließend Substitution eines der primären Amine mit geschützter Bromessigsäure.
  • 1) Synthese von 2,2,2-Trifluor-N-[3(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-N-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-butyl)-acetamid
  • 8 g Spermin (39,5 mmol) wurden in 75 ml Dichlormethan gelöst und 33 ml Triethylamin (237 mmol) zugegeben, anschließend wurde das Reaktionsgemisch in einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Dann wurden 41,5 g Trifluoressigsäureanhydrid, gelöst in 100 ml Dichlormethan, tropfenweise 1 Stunde lang durch einen Tropftrichter zugegeben. Anschließend wurde das Gemisch sich auf Umgebungstemperatur er wärmen gelassen und die Reaktion eine Nacht lang unter Rühren stattfinden gelassen.
  • Danach wurden 75 ml einer Lösung mit 5 % Natriumhydrogencarbonat zu dem Reaktionsgemisch zugegeben und wurde die Lösung 15 Minuten lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Die wässrige Phase wurde 3-mal mit 150 ml Dichlormethan extrahiert. Die organischen Phasen wurden vereinigt und mit 3-mal 100 ml einer 0,5 M konzentrierten Kaliumhydrogensulfatlösung und anschließend 3-mal mit 100 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und bis zur Trockne aufkonzentriert. Es wurden 22,5 g eines reinen gelben Pulvers ohne weitere Reinigung isoliert (Ausbeute: 97 %).
  • 2) Herstellung von (Trifluoracetyl-{3-[trifluoracetyl-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-butyl)-aminol-propyl}-amino)- essigsäure
  • Zu 1 g Natriumhydrid (60 % in Öl, das heißt 25,6 mmol) wurden 60 ml trockenes Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde unter einem Argonstrom in einem Eisbad abgekühlt, anschließend wurden 10 g 2,2,2-Trifluor-N-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-N-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-butyl)-acetamid, die zuvor (17 mmol) erhalten worden waren, gelöst in 40 ml trockenem Dimethylformamid tropfenweise zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei Umgebungstemperatur stehen gelassen und anschließend erneut in einem Eisbad abgekühlt und 3,66 g tert.-Butylbromacetat (18,7 mmol) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde eine Nacht lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Es wurden 500 ml Ethylacetat zugegeben, anschließend wurde das Gemisch 3-mal mit 100 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und 3-mal mit 100 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Danach wurde die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und bis zur Trockne aufkonzent riert. Es wurde so ein gelbes Öl isoliert, das das erwartete unreine Produkt in Form des tert.-Butylesters enthielt.
  • Das rohe Reaktionsprodukt wurde in 50 ml Dichlormethan verdünnt, und es wurden 50 ml Trifluoressigsäure zugegeben. Die Lösung wurde 3 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Danach wurde das Reaktionsgemisch bis zur Trockne eingedampft und anschließend in 50 ml Dichlormethan verdünnt. Das Produkt wurde mit 3-mal 150 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung extrahiert. Die erhaltene wässrige Phase wurde 3-mal mit 30 ml Dichlormethan gewaschen und anschließend mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Das Produkt wurde mit 3-mal 300 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und bis zur Trockne aufkonzentriert. Die Reinigung wurde durch Chromatographie über Siliciumdioxid verfolgt (Elution: Dichlormethan/Methanol 8/2). Es wurden 3,5 g eines gelben Pulvers erhalten (Gesamtausbeute der zwei Stufen: 32 %).
    1H-NMR (400 MHz, (CD3)2SO d6 bei einer Temperatur von 373 K, δ in ppm): 1,62 (mt : 4H); 1,80 bis 2,00 (mt : 4H); 3,28 (mt : 2H)); 3,30 bis 3,60 (mt : 10H); 4,01 (s : 2H); 9,15 bis 9,35 (mf : 1H).
  • c – Synthese von syn- und trans-4-{4-[(2-{3-[4-(3-Amino-propylamino)-butylamino]propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-dioctadecylbutyramid-tetraacetat (säureempfindliche Verbindung A)
  • Diese Synthese erfolgte dreistufig: Kondensation der zwei Moleküle, deren Synthese zuvor in a und b beschrieben worden ist, anschließend Entfernung der Schutzgruppe von Polyamin und schließlich Versalzung. Für das syn- und das trans-Produkt wurde dieselbe Vorschrift angewendet.
  • 1) Synthese von syn- und trans-N,N-Dioctadecyl-4-(4-{[2-(trifluoracetyl-{3-[trifluoracetyl-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propy]-amino}-butyl)-amino]-propyl}-amino)-acetylamino]-methyl}-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-butyramid
  • Zu 800 mg 4-(4-Aminomethyl-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-N,N-dioctadecylbutyramid (1,13 mmol syn oder trans), die zuvor (Stufe a) erhalten worden waren, gelöst in 10 ml Dichlormethan, wurden nacheinander 390 μl Triethylamin (2,8 mmol), 800 mg (Trifluoracetyl-{3-[trifluoracetyl-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-butyl)-amino]-propyl}-amino)-Essigsäure (1,24 mmol), die zuvor in Stufe b erhalten worden waren, und 600 mg BOP zugegeben. Die Lösung wurde 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das rohe Reaktionsprodukt wurde aufkonzentriert, in 150 ml Ethylacetat aufgenommen, 3-mal mit 40 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend 3-mal mit 40 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Nach Trocknung über Magnesiumsulfat, Filtration und Eindampfen wurde das Produkt durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Elution: Ethylacetat). Es wurden 1,1 g eines weißen Pulvers isoliert (Ausbeute: 73 %).
  • 2) Herstellung von syn- und trans-4-{4-[(2-{3-[4-(3-Amino-propylamino)-butylamino]-propylamino}-acetylamino-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-dioctadecylbutyr
  • 290 mg N,N-Dioctadecyl-4-(4-{[2-(trifluoracetyl-{3-[trifluoracetyl-(4-{trifluoracetyl-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-butyl)-amino]-propyl}-amino)-acetylamino]-methyl}-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-butyramid (0,22 mmol, syn oder trans), die zuvor erhalten worden waren, wurden in 3 ml Tetrahydrofuran gelöst und 3 ml einmolare Natronlauge mit 4 % unter starkem Rühren zugegeben. Die Umsetzung wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur stattfinden gelassen.
  • Danach wurde das Lösungsmittel aufkonzentriert und anschließend das Rohprodukt in einem Gemisch Dichlormethan/Methanol 1/1 aufgenommen. Die rohe Lösung wurde durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak, 45/45/10). Das Produkt wurde aufkonzentriert und anschließend nach Wasserzugabe gefriergetrocknet. Es wurden 180 mg weißes gefriergetrocknetes Produkt erhalten (Ausbeute: 87 %).
  • 3) Herstellung des syn- und trans-Diastereoisomeren von 4-{4-[(2-{3-[4-(3-Amino-propylamino)-butylamino]-propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-dioctadecyl-butyramid-tetraacetat (Verbindung A)
  • Das in der vorhergehenden Stufe in Form einer freien Base erhaltene Produkt wurde quantitativ über einem Ionenaustauscherharz versalzt: Es wurde in einem Gemisch Wasser/Ethanol gelöst und in einer Kolonne eluiert, die einen großen Überschuss an Acetatharz enthielt (BIO-RAD, AG1-X2 Harz).
    1H-NMR der syn-Verbindung (400 MHz, CDCl3, δ in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz : 6H); 1,20 bis 1,40 (mt : 60H); 1,52 (mt : 4H); 1,65 bis 1,90 (mt : 8H); 1,93 (mt : 2H); 1,97 (s : 3H); 2,37 (t, J = 7 Hz : 2H); 2,73 (mt : 4H); 2,81 (t, J = 6,5 Hz : 2H); 2,89 (mt : 4H); 2,95 (t, J = 6,5 Hz : 2H); 3,15 bis 3,30 (mt : 4H); 3,32 (AB, J = 17 Hz 2H); 3,45 (dt, J = 14 und 6,5 Hz : 1H); 3,55 bis 3,65 (mt : 1H); 3,61 (t doppelt, J = 7 und 2 Hz : 2H); 3,74 (t, J = 8 Hz : 1H); 4,06 (t, J = 8 Hz : 1H); 4,31 (mt : 1H); 5, 79 (s : 1H); 7, 81 (t, J = 5, 5 Hz : 1H).
    1H-NMR der trans-Verbindung (400 MHz, CDCl3, δ in ppm): 0,88 (t, J = 7 Hz 6H); 1,05 bis 1,45 (mt : 60H); 1,51 (mt : 4H); 1,65 bis 1,90 (mt : 8H); 1,92 (mt 2H); 1,97 (s : 3H); 2,37 (t, J = 7 Hz : 2H); 2,73 (mt : 4H); 2,80 (t, J = 6 Hz : 2H); 2,88 (mt : 4H); 2,96 (t, J = 6 Hz : 2H); 3,15 bis 3,55 (mt : 8H); 3,57 (t breit, J = 6 Hz : 2H); 3,69 (dd, J = 7,5 und 5,5 Hz : 1H); 4,11 (t, J = 7,5 Hz : 1H); 4,43 (mt 1H); 5,85 (s : 1H); 7,73 (t breit, J = 5,5 Hz : 1H).
  • Beispiel 4: Synthese von 4-{4-[(2-{3-[Bis-(3-amino-propyl)-amino]-propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxyl}-N,N-ditetradecyl-butyramidtetrahydrochlorid
  • In diesem Beispiel wird ein Syntheseweg für die säureempfindliche Verbindung B in Form eines äquimolaren Gemischs aus den syn- und trans-Diastereoisomeren beschrieben mit der Formel:
    Figure 00450001
    Verbindung B a-Synthese von 4-(4-Aminomethyl-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-N,N-ditetradecylbutyramid (Lipidteil-O-Orthol-NH2)
  • Diese Synthese erfolgte in vier Stufen: Synthese des Ditetradecylamins, das zu einem Alkohol funktionalisiert wurde, der an der Ortho-1-Gruppe angebracht wurde, deren Schutzgruppe danach abgespalten wurde.
  • 1) Ditetradecylamin-Hydrochlorid
  • Zu 74 g Bromtetradecan (267,1 mmol) wurden 400 ml Ethanol und 57 g Tetradecyiamin (267,1 mmol) gegeben. 70,8 g Natriumcarbonat (667 mmol) wurden suspendiert, und das Reaktionsgemisch wurde eine Nacht lang unter Rückfluss erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde danach bis zur Trockne eingedampft, in 1,5 1 Dichlormethan aufgenommen und 3-mal mit 200 ml Wasser und anschließend 1-mal mit 400 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Calciumchlorid getrocknet und aufkonzentriert.
  • Die Versalzung wurde durch Lösen in der Wärme des Rohprodukts in 600 ml Isopropanol durchgeführt, zu welchem 300 ml 5 N Salzsäure in Isopropanol gegeben wurden. Die so erhaltene klare Lösung wurde abkühlen gelassen, was eine Kristallisation des erwarteten Produkts auslöste. Nach Filtration und Waschen mit Isopropanol (Ausbeute: 41 %) wurden 48,4 g eines flockigen weißen Pulvers erhalten.
  • 2) Herstellung von 4-Hydroxy-N,N-ditetradecylbutyramid
  • 22,4 g Aluminiumchlorid (168,1 mmol) wurden in 75 ml Chloroform gegeben, und das Ganze wurde in einem Eiswasserbad auf etwa 10 °C abkühlen gelassen. 39 ml Triethylamin (280,1 mmol) in 100 ml Chloroform wurden tropfenweise zugegeben, anschließend wurde das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen. Zu dem Gemisch wurden unter magnetischem Rühren 25 g Ditetradecylamin-hydrochlorid (56 mmol), gemischt mit 5,2 ml Butyrolacton (67,2 mmol) in 350 ml Chloroform allmählich zugegeben. Die Reaktion fand nach 2 Stunden bei Umgebungstemperatur nicht mehr statt.
  • Danach wurden 200 ml Wasser zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten lang gerührt. Das Rohprodukt wurde über Celite filtriert und anschließend mit Chloroform gewaschen. Das Filtrat wurde abdekantiert und die organische Phase 3-mal mit 150 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die Chloroformlösung wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Es wurden 21,2 g eines weißen Pulvers mit einer Ausbeute von 76 % nach Chromatographie über Siliciumdioxid (Ethylacetat/Cyclohexan 1/1) erhalten.
  • 3) Herstellung von N,N-Ditetradecyl-4-{4-[(2,2,2-trifluor-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-butyramid
  • 3,5 g 4-Hydroxy-N,N-ditetradecylbutyramid (7,1 mmol), die in der vorhergehenden Stufe erhalten worden waren, wurden mit 1,8 g 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy- [1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid (Ortho 1, 7,8 mmol) und 18 mg Pyridinium-p-toluolsulfat (PPTS, 0,071 mmol) vermischt. Das Ganze wurde lösungsmittelfrei 3 Stunden lang bei 80 °C erhitzt.
  • Das rohe Reaktionsprodukt wurde anschließend in 200 ml Heptan gelöst, 3-mal mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und 3-mal mit 50 ml Acetonitril gewaschen und anschließend bis zur Trocken aufkonzentriert.
  • Eine kleine Fraktion des Rohprodukts wurde über Siliciumdioxid gereinigt, um dieses Zwischenprodukt zu charakterisieren, der Rest wurde als solcher für die folgende Stufe verwendet. Die Chromatographie über Siliciumdioxid (Cyclohexan/Ethylacetat 7/3 Vol./Vol.) erlaubte es, einige Milligramm eines öligen Produkts zu isolieren.
  • 4) Herstellung von 4-(4-Aminomethyl-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-N,N-ditetradecylbutyramid
  • Das in der vorhergehenden Stufe erhaltene Rohprodukt wurde in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst, wozu 20 ml 4%ige Natronlauge gegeben wurden. Das Reaktionsgemisch wurde eine Nacht lang unter starkem Rühren bei Umgebungstemperatur stehen gelassen.
  • Danach wurde das Tetrahydrofuran aufkonzentriert und anschließend das Produkt mit 3-mal 200 ml Diethyläther extrahiert. Die organische Phase wurde über Calciumchlorid getrocknet, filtriert und eingedampft. Eine Chromatographie über Siliciumdioxid (Dichlormethan/Methanol 9/1 Vol./Vol.) erlaubte es, 1,6 g eines farblosen Öls zu isolieren (Ausbeute in den beiden Stufen: 38 %):
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren im Verhältnis 50/50 beobachtet.
    * 0,89 (t, J = 7 Hz : 6H); 1,15 bis 1,45 (mt : 44H); 1,52 (mt : 4H); 1,58 (mf : 2H); 1,95 (Quintett, J = 6,5 Hz : 2H); 2,39 (t, J = 6,5 Hz : 2H); 2,75 bis 3,00 (mt : 2H); 3,21 (mt : 2H); 3,29 (mt : 2H); 3,60 (mt : 2H); 3,71 bis 3,80 (bzw. dd, J = 7,5 Hz und 6 Hz und t, J = 7,5 Hz : 1H insgesamt); 4,06 und 4,14 (2 t, J = 7,5 Hz : 1H insgesamt); 4,21 und 4,33 (2 mts : 1H insgesamt); 5,82 und 5,85(2 s: 1H insgesamt).
  • b-Synthese von [(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-essigsäure in Form des Trifluoracetats (hydrophiler Teil vom Typ Polyamin-COOH)
  • Die vorgeschlagene Synthese fand in 6 Stufen ausgehend von 3-Aminopropanol und 3,3'-Imino-bispropylamin statt.
  • 1) Herstellung von 2 2 2-Trifluor-N-{3-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propylamino]-propel}-acetamid
  • 35 g 3,3'-Imino-bispropylamin (266,7 mmol) wurden in 150 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran unter einem Argonstrom gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt, und es wurden 65 ml Trifluorethylacetat (546,8 mmol) tropfenweise (sehr langsam) durch einen Tropftrichter zugegeben. Nach der Zugabe (3 Stunden später) wurde das Reaktionsgemisch auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen und das Rühren einige Stunden unter Argon fortgesetzt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde durch Papier filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockne aufkonzentriert, mehrere Male in Dichlormethan aufgenommen, wobei die abschließende Trocknung in einem Trockenschrank bei 40 °C unter einem Vakuum 16 Stunden lang durchgeführt wurde. Es wurden 85,3 g eines weißen Pulvers ohne zusätzliche Reinigung rein isoliert (Ausbeute: 99 %).
  • 2) Herstellung von (3-Hydroxy-propylamino)-tert.-butylacetat
  • 196 ml 3-Aminopropanol (2,56 mol) wurden in 250 ml Dichlormethan verdünnt, und das Ganze wurde in einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt. 20 g tert.-Butylbromacetat (102,5 mmol), gelöst in 200 ml Dichlormethan, wurden anschließend tropfenweise zugegeben, wobei das Reaktionsgemisch auf 0° gehalten wurde. Nach der Zugabe (2 Stunden später) wurde das Reaktionsgemisch 3 Stunden lang auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen.
  • Das Rohprodukt wurde 3-mal mit 150 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend 3-mal mit 150 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Calciumchlorid getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Es wurden 17,8 g eines farblosen Öls (Ausbeute: 92 %) isoliert.
  • 3) Herstellung von [(3-Hvdroxy-propyl)-trifluoracetyl-aminol-tert.-butylacetat
  • 17,65 g (3-Hydroxy-propylamino)-tert.-butylacetat(93,3 mmol) wurden in 100 ml Dichlormethan gelöst, und das Ganze wurde in einem Eisbad auf 0 °C abgekühlt. Es wurden 26 ml Triethylamin (186,6 mmol) zugegeben und anschließend tropfenweise 21,5 g Trifluoressigsäureanhydrid (102,6 mmol) durch einen Tropftrichter zugegeben. Nach der Zugabe wurde das Reaktionsgemisch eine Nacht lang unter Magnetrühren auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen.
  • Diese Lösung wurde danach 3-mal mit 50 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung, 3-mal mit 50 ml einer 0,5 M Kaliumhydrogensulfatlösung und 3-mal mit 50 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wurde über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Es wurden 24,5 g eines hellgelben Öls (Ausbeute: 92 %) isoliert.
  • 4) Herstellung von [(3-brom-propyl)-trifluoracetyl-amino]-tert.-butylacetat
  • 10 g [(3-Hydroxy-propyl)-trifluoracetyl-amino]-tert.-butyl-acetat (35 mmol) wurden in 150 ml Tetrahydrofuran gelöst. 12,4 g Triphenylphosphin (47,3 mmol) wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde auf 15 bis 20 °C thermostatiert. 15,1 g Kohlenstofftetrabromid (45,6 mmol), gelöst in 60 ml Acetonitril, wurden tropfenweise durch einen Tropftrichter zugegeben, und das Ganze wurde 4 Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde dann bis zur Trockne aufkonzentriert, in Ethylacetat aufgenommen und durch Papier filtriert. Das Filtrat wurde bis zur Trockne aufkonzentriert, in Cyclohexan aufgenommen und durch eine Fritte Nr. 3 filtriert. Das Filtrat wurde erneut aufkonzentriert und durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Cyclohexan/Ethylacetat 8/2 Vol./Vol.). Es wurden 10,4 g eines hellgelben Öls isoliert (Ausbeute: 85 %).
  • 5) Herstellung von [(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-tert.-butyl-acetat
  • 26 g [(3-Brom-propyl)-trifluoracetyl-amino]-tert.-butylacetat (74,7 mmol) und 24,1 g 2,2,2-Trifluor-N-{3-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propylamino]-propyl}-acetamid (74,7 mmol) wurden in 130 ml Acetonitril gelöst. Es wurden 30 g Kaliumcarbonat (224 mmol) suspendiert, und das Ganze wurde 6 Stunden lang unter Rückfluss erhitzt.
  • Das Reaktionsgemisch wurde durch Papier filtriert und bis zur Trockne aufkonzentriert. Anschließend wurde das Rohprodukt durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Cyclohexan/Ethylacetat 2/8 Vol./Vol.). Es wurden 16,6 g eines hellgelben Öls isoliert (Ausbeute: 38 %).
  • 6) Herstellung des Trifluoracetatsalzes der [(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-essigsäure
  • Zu 15,8 g [(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-tert.-butylacetat (28,76 mmol) wurden 50 ml Dichlormethan und anschließend 50 ml Trifluoressigsäure gegeben. Das Gemisch wurde einige Stunden lang bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann bis zur Trockne aufkonzentriert. Es wurden 18,7 g eines hellgelben Honigs isoliert (Ausbeute: 100 %).
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): bei Umgebungstemperatur wurde ein Gemisch aus Rotameren beobachtet.
    * 1,80 bis 2,10 (mt : 6H); 3,12 (mt : 6H); 3,29 (mt : 4H); 3,50 (mt : 2H); 4,13 und 4,29 (s breit bzw. mt : 2H insgesamt); 9,50 bis 9,75 (mt : 2H).
  • c – Synthese von 4-{4-[(2-{3-[Bis-(3-amino-propyl)-amino]–propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-ditetradecylbutyramidhydrochlorid (Verbindung-B)
  • Diese Synthese verläuft dreistufig: Kondensation der zwei in den vorhergehenden Teilen a und b erhaltenen Moleküle, anschließend Entfernung der Schutzgruppe von dem Polyamin und Versalzung.
  • 1) Herstellung von 4-[4-({2-[(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-acetylamino}-methyl)-[1,3]dioxolan-2-yloxy]-N,N-ditetradecylbutyramid
  • Zu 1,65 g 4-(4-Aminomethyl-[1,3]dioxolan-2-yloxy)-N,N-ditetradecylbutyramid (2,76 mmol), gelöst in 30 ml Dichlormethan, wurden nacheinander 1,9 ml Triethylamin (13,8 mmol), 2 g [(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-essigsäure (Trifluoracetatsalz, 3,04 mmol) und 1,8 g BOP (4,14 mmol) gegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde lang bei Umgebungstemperatur gerührt.
  • Das rohe Reaktionsgemisch wurde dann bis zur Trockne aufkonzentriert, in 200 ml Ethylacetat aufgenommen, mit 40 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung, 3-mal mit 40 ml einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend 3-mal mit 40 ml einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen. Das Produkt wurde anschließend durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Elution: Ethylacetat). Es wurden 2,2 g eines hellgelben Honigs isoliert (Ausbeute: 72 %).
  • 2) Herstellung von 4-{4-[(2-{3-[Bis-(3-amino-propyl)-aminol-propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-ditetradecylbutyramid
  • 2,1 g 4-[4-({2-[(3-{Bis-[3-(2,2,2-trifluor-acetylamino)-propyl]-amino}-propyl)-trifluoracetyl-amino]-acetylamino}-methyl)-[1,3]dioxolan-2-yloxy]-N,N-ditetradecylbutyramid (1,88 mmol) wurden in 30 ml Tetrahydrofuran gelöst und 30 ml einmolare Natronlauge mit 4 % unter starkem Rühren zugegeben. Die Reaktion wurde eine Nacht lang bei Umgebungstemperatur ablaufen gelassen.
  • Danach wurde das Lösungsmittel aufkonzentriert und anschließend das Rohprodukt in einem Gemisch aus Dichlormethan/Methanol 1/1 aufgenommen. Diese Rohlösung wurde durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Dichlormethan/Methanol/Ammoniak, 45/45/10, Vol./Vol./Vol.) Das Produkt wurde aufkonzentriert und anschließend nach Zugabe von Wasser gefriergetrocknet. Es wurden 1,3 g eines weißen Lyophilisats erhalten (Ausbeute: 84 %).
  • 3) Herstellung von 4-{4-[(2-{3-[Bis-(3-amino-propyl)-amino]-propylamino}-acetylamino)-methyl]-[1,3]dioxolan-2-yloxy}-N,N-ditetradecyl-butyramidtetrahydrochlorid (Verbindung B)
  • Das in der vorhergehenden Stufe in Form einer freien Base erhaltene Produkt wurde anschließend quantitativ über einem Ionenaustauscherharz versalzt: Es wurde in Wasser gelöst und in einer Säule eluiert, die einen großen Überschuss Harzchlorid enthielt (FLUKA, DOWEX 21K). Die Struktur des erhaltenen weißen Lyophilisats wurde durch 1H-NMR bestätigt.
    1H-NMR (300 MHz, (CD3)2SO d6, δ in ppm): Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren im Verhältnis von 50/50 beobachtet.
    * 0,89 (t, J = 7 Hz : 6H); 1,15 bis 1,40 (mt : 44H); 1,40 bis 1,60 (mt : 4H); 1,72 (mt 8H); 2,31 (mt : 2H); 2,40 bis 2,55 (mt : 6H); 2,70 bis 2,90 (mt : 6H); 3,15 bis 3,75 und 4,00 bis 4,40 (2 Reihen von mt: 13H insgesamt); 5,83 und 5,86 (2 s : 1H gesamt).
  • Beispiel 5: Synthese der PEGisierten Lipide C und D
  • In diesem Beispiel wird ein Syntheseweg für die PEGisierten Lipide Octadecanol-Orthol-PEG5000-OMe und Cholesterin-Orthol-PEG5000-OMe beschrieben, die sich nur durch ihren Lipidteil unterscheiden: Octadecanol für die Verbindung C und Cholesterin für die Verbindung D. Diese zwei säureempfindlichen Verbindungen haben die allgemeine Formel:
    Figure 00530001
    Verbindung C
    Figure 00530002
    Verbindung D
  • a-Synthese von C-(2-Octadecyloxy-[1,3]dioxolan-4-yl)-methylamin und C-{2-[17-(1,5-Dimethyl-hexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yloxy]-[1,3]dioxolan-4-yl}-methylamin (Lipidteile-O-Orthol-NH2)
  • Diese Synthese verläuft zweistufig ausgehend von der Verbindung Ortho 1 durch Substitution der exozyklischen Methoxygruppe durch Fettalkohol (Cholesterin oder Octadecanol) und anschließende Entfernung der Schutzgruppe des Amins.
  • 1) Herstellung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-octadecyloxy-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid
  • 3 g 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-acetamid (Ortho 1, 13,09 mmol) wurden mit 3,54 g Octadecanol (13,09 mmol) vermischt. Das Gemisch wurde bei 80 °C geschmolzen und 2 Stunden lang nach Zugabe von 32 mg Pyridinium-p-toluolsulfonat (0,13 mmol) stehen gelassen. Das rohe Reaktionsgemisch wurde in Cyclohexan gelöst, mit einer gesättigten Natriumhydrogencarbonatlösung und anschließend mit einer gesättigten Natriumchloridlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und anschließend bis zur Trockne aufkonzentriert. Dieses Rohprodukt wurde wie es war für die folgende Stufe verwendet.
  • 1') Herstellung von N-{2-[17-(1,5-Dimethyl-hexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yloxy]-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl}-2,2,2-trifluoracetamid
  • Die Vorschrift war gleich der zuvor beschriebenen, wobei die Reaktion auch ohne Katalysator durchgeführt werden kann.
  • 2) Herstellung von C-(2-Octadecyloxy-[1,3]dioxolan-4-yl)-methylamin
  • 6,12 g des Rohprodukts von Stufe 1 (13,09 mmol) wurden in 20 ml Tetrahydrofuran gelöst. Das Reaktionsgemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt, und es wurden 30 ml 4%ige Natronlauge zugegeben. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur bis zum völligen Verschwinden des Reagens (4 Stunden lang) gerührt.
  • Anschließend wurde das Lösungsmittel teilweise aufkonzentriert und anschließend 3-mal mit 200 ml Diethyläther extrahiert. Die organische Phase wurde über Calciumchlorid getrocknet, filtriert und eingedampft. Das rohe Reaktionsprodukt wurde durch Chromatographie über Siliciumdioxid gereinigt (Dichlormethan/Methanol 9/1, Vol./Vol.). Es wurden 2,6 g eines weißen Pulvers erhalten (Ausbeute: 53 % in den aufeinander folgenden Stufen 1 und 2).
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm). Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren mit einem Verhältnis von etwa 50/50 beobachtet.
    * 0,89 (t, J = 7 Hz : 3H); 1,20 bis 1,45 und 1,58 (2 mts : 32H insgesamt); 2,75 bis 3,00 (mt : 2H); 3,53 (mt : 2H); 3,65 bis 3,85 (mt : 1H); 4,00 bis 4,40 (mt : 2H); 5,81 und 5,84 (2 s : 1H insgesamt).
  • 2') Herstellung von C-{2-[17-(1,5-Dimethyl-hexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yloxy]-[1,3]dioxolan-4-yl}-methylamin
  • Die Vorschrift war gleich derjenigen für Stufe 2). Es wurden 1,4 g eines weißen Pulvers erhalten (Ausbeute: 22 % in den aufeinander folgenden Stufen 1' und 2').
    1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm). Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren in einem Verhältnis von etwa 50/50 beobachtet.
    * 0,69 (s : 3H); 0,85 bis 1,75-1,86 und 2,00 (mts : 26H insgesamt); 0,88 (mt : 6H); 0,93 (d, J = 7 Hz : 3H); 1,01 (s : 3H); 2,33 (mt : 2H); 2,75 bis 3,00 (mts : 2H); 3,50 (mt : 1H); 3,71 bis 3,85, bis 4,05 und 4,16 (4 mts : 2H insgesamt); 4,20 und 4,35 (2 mts : 1H insgesamt); 5,36 (mt : 1H); 5,93 und 5,96 (2 s : 1H insgesamt):
  • b-Synthese der Säure des Methoxy-polyethylenglykols 5000 (hydrophiler Teil MeO-PEG5000-COOH)
  • Es ist nur eine Stufe erforderlich: Oxidation der terminalen Hydroxygruppe des handelsüblichen Methoxy-Polyethylenglykols.
  • 20 g MeO-PEG5000-OH (4 mmol) wurden in 100 ml eines Gemischs aus gleichen Volumina Wasser/Acetonitril gelöst. 312 mg 2,2,6,6-Tetramethyl-piperidinyloxyl (2 mmol) und anschließend 6,4 g [Bis-(acetoxy)-iod]benzol (20 mmol) wurden zugegeben und das Reaktionsgemisch unter Rühren 16 Stunden lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen.
  • Das rohe Reaktionsprodukt wurde anschließend bis zur Trockne eingedampft, in 40 ml eines Gemischs aus Dichlormethan/Ethanol (1/1, Vol./Vol.) aufgenommen und anschließend durch Zusatz von 500 ml Diethyläther ausgefällt. Es wurden 19 g eines weißen Pulvers durch Filtration und Waschen mit Äther erhalten (Ausbeute: 95 %).
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): 3,39 (s : 3H); 3,40 bis 3,95 (mts : 404H); 4,15 (s : 2H).
  • c – Synthese von Methoxy-(polyethylenglykol-5000)-N-(2-octadecyloxy-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl)-amid (Verbindung C) und Methoxy-(polyethylenglykol-5000)-N-{2-[17-(1,5-dimethyl-hexyl)-10,13-dimethyl-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14 15 16 17-tetradecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-yloxy]-[1,3]dioxolan-4-ylmethyl}-amid (Verbindung D)
  • Verbindung C:
  • 1,2 g MeO-PEG5000-COOOH (0,24 mmol), die in den vorhergehenden Stufen erhalten worden waren, wurden in 5 ml Dichlormethan gelöst. Es wurden 188 μl Triethylamin (1,34 mmol) und anschließend 100 mg C-(2-Octadecyloxy-[1,3]dioxolan-4-yl)-methylamin (0,27 mmol) zugegeben. Danach wurden 143 mg BOP (0,32 mmol), 1,2 Äquivalente) zugegeben und die Reaktion eine Stunde lang bei Umgebungstemperatur unter Rühren stattfinden gelassen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von Diethyläther (60 ml) ausgefällt, zentrifugiert, mit Äther gewaschen und anschließend in einen präparativen Hochleistungsflüssigkeitschromatographen (HPLC) eingespritzt. Es wurden die reinsten Fraktionen isoliert und so 415 mg weißes Lyophilisat erhalten (Ausbeute: 32 %).
    1H-NMR (300 MHz, CDCl3, δ in ppm): Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren mit einem Verhältnis von etwa 50/50 beobachtet.
    * 0,90 (t, J = 7 Hz : 3H); 1,20 bis 1,40 und 1,50 bis 1,75 (mts : 32H); 3,39 (s : 3H); 3,40 bis 3,95 (mts : 448H); 4,02 und 4,03 (2 s : 2H insgesamt); 4,00 bis 4,25 (mts 3H insgesamt); 5,80 und 5,84 (2 s : 1H insgesamt).
  • Verbindung D:
  • Die Vorschrift war gleich der für die Herstellung der Verbindung C. Indem die reinsten Fraktionen isoliert wurden, wurden 395 mg weißes Lyophilisat erhalten (Ausbeute: 30 %):
    1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm): Es wurde ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren mit einem Verhältnis von etwa 50/50 beobachtet.
    * 0,68 (s : 3H); 0,85 bis 1,75-1,85 und 2,00 (mts : 26H insgesamt); 0,87 (mt : 6H); 0,92 (d, J = 7 Hz : 3H); 1,00 (s : 3H); 2,33 (mt : 2H); 3,39 (s : 3H); 3,40 bis 3,90 (mts : 448H); 4,00 bis 4,20 (mts : 1H insgesamt); 4,01 und 4,04 (2 s : 2H insgesamt); 4,28 und 4,46 (2 mts : 1H insgesamt); 5,35 (mt : 1H); 5,90 und 5,95 (2 s 1H insgesamt).
  • Beispiel 6: Synthese des PEGisierten Lipids E
  • In diesem Beispiel wird ein Syntheseweg für das PEGisierte Lipid Octadecanol-Ortho2-PEGsooo-OMe beschrieben, das die allgemeine Formel hat:
    Figure 00580001
    Verbindung E a-Synthese von 2-Methyl-2-octadecyloxy-[1,3]dioxan-5-ylamin (hydrophober Lipidteil-O-Ortho2-NH2)
  • Diese Synthese verläuft zweistufig ausgehend von dem Substrat Ortho 2, dessen Synthese zuvor beschrieben worden ist, durch Substitution der exozyklischen Methoxygruppe mit Octadecanol und anschließende Entfernung der Schutzgruppe des Amins.
  • 1) Herstellung von 2,2,2-Trifluor-N-(2-methyl-2-octadecyloxy-[1,3]dioxan-5-yl)-acetamid
  • 3 g 2,2,2-Trifluor-N-(2-methoxy-2-methyl-[1,3]dioxan-5-yl)-acetamid (12,34 mmol) wurden mit 3 g Octadecanol (11,1 mmol) vermischt. Das Gemisch wurde bei 80 °C geschmolzen und 2 Stunden lang stehen gelassen, um das während des Austauschs des Alkohols erzeugte Methanol zu verdampfen.
  • Das geschmolzene Reaktionsgemisch wurde in 50 ml Acetonitril gegossen, was seine Ausfällung bewirkte. Das erwartete Produkt wurde durch Umkristallisation von Acetonitril gereinigt. Es wurden 2,85 g eines weißen Pulvers isoliert (Ausbeute: 53 % nach Umkristallisation).
  • 2) Herstellung von 2-Methyl-2-octadecyloxy-[1,3]dioxan-5-ylamin
  • 1 g des Trifluoracetamid-Derivats der vorhergehenden Stufe (2,08 mmol) wurde in 10 ml Tetrahydrofuran gelöst, welchem 10 ml einmolare Natronlauge mit 4 % zugesetzt wurden. Das Gemisch wurde bei Umgebungstemperatur kräftig gerührt, bis zum totalen Verschwinden des Reagens (4 Stunden lang).
  • Anschließend wurde das Lösungsmittel teilweise aufkonzentriert und anschließend mit 3-mal 100 ml Diethyläther extrahiert. Die organische Phase wurde über Calciumchlorid getrocknet, filtriert und bis zur Trockne eingedampft. So wurden 810 mg eines weißen Pulvers ohne Reinigung isoliert (Ausbeute: 100 %).
    1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz : 3H); 1,20 bis 1,50 (mt 30H); 1,49 (s : 3H); 1,62 (mt : 2H); 1,67 (s breit : 2H); 2,71 (mt : 1H); 3,46 (t, J = 7 Hz : 2H), 3,54 (d breit, J = 10 Hz : 2H); 4,30 (dd, J = 10 und 1,5 Hz : 2H).
  • b – Synthese von Methoxy-(polyethylenglykol-5000)-N-(2-methyl-2-octadecyloxy-[1,3]dioxan-5-yl)-amid (Verbindung E)
  • Die letzte Stufe besteht in der Kondensation des Lipidamins mit der Säure des PEG (deren Synthese in Beispiel 5 beschrieben worden ist).
  • 1,15 g MeO-PEG5000-COOOH (0,23 mmol) wurden in 5 ml Dichlormethan gelöst. Es wurden 181 μl Triethylamin (1,30 mmol) und anschließend 100 mg 2-Methyl-2- octadecyloxy-[1,3]dioxan-5-ylamin (0,26 mmol) zugegeben. Es wurden 172 mg BOP (0,39 mmol) zugegeben, und die Reaktion wurde unter Rühren bei Umgebungstemperatur eine Stunde lang stattfinden gelassen.
  • Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von Diethyläther (60 ml) ausgefällt, zentrifugiert, mit Äther gewaschen und anschließend in einen präparativen HPLC eingespritzt. Indem die reinsten Fraktionen isoliert wurden, wurden 420 mg weißes Lyophilisat erhalten (Ausbeute: 34 %).
    1H-NMR (400 MHz, CDCl3, δ in ppm): 0,89 (t, J = 7 Hz : 3H); 1,20 bis 1,50 (mt 30H); 1,48 (s : 3H); 1,55 bis 1,75 (mt : 2H); 3,39 (s : 3H); 3,40 bis 3,90 (mt 448H); 3,89 (d breit, J = 8,5 Hz : 1H); 4,05 (s : 2H); 4,30 (d breit, J = 12 Hz : 2H); 7,57 (d, J = 8,5 Hz : 1H).
  • Beispiel 7: Untersuchung der Verpackung von DNA mit der säureempfindlichen syn- bzw. trans-Verbindung A
  • Die zuvor hergestellte säureempfindliche syn- und trans-Verbindung A haben eine analoge Struktur zu den kationischen Lipiden, die herkömmlicherweise für die nichtvirale DNA-Transfektion verwendet werden und besitzen außerdem in ihrer Struktur eine zyklische Orthoesterfunktion, die dazu beiträgt, dass sie säureempfindlich gemacht werden.
  • Die Aufgabe dieses Beispiels ist es daher zu zeigen, dass die säureempfindliche syn- und trans-Verbindung A ihr Vermögen zum Verpacken der zu transfektierenden DNA, das den kationischen Lipiden eigen ist, behält, wobei sie auch das Vermögen hat, sich im sauren Milieu abbauen zu lassen und somit die verpackte DNA freizusetzen. Dies kann leicht durch einen Fluoreszenzversuch mit Ethidiumbromid (BET) gezeigt werden. Das Fehlen der Fluoreszenz zeigt die Abwesenheit der freien DNA, was bedeutet, dass die DNA verpackt ist.
  • Im Folgenden wurden die zwei Formen syn und trans der säureempfindlichen Verbindung A, wie sie in Beispiel 3 hergestellt worden waren, und das nicht säureempfindliche Analoge verwendet, das in der Veröffentlichung WO 97/18185 beschrieben ist und die Formel hat: H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-CH2-CO-Gly-N[(CH2)N[(CH2)17-CH3]2, die als Bezug verwendet wurde. Dieses nicht säureempfindliche Analoge wird im Folgenden als "kationisches Bezugslipid" bezeichnet.
  • Die DNA wird mit zunehmenden Mengen an kationischem Bezugslipid oder der säureempfindlichen syn- oder trans-Verbindung A durch Mischen gleicher Volumina von Lipidlösungen mit unterschiedlichen Gehalten in den DNA-Lösungen zusammengebracht. Es wurden so Proben aus 800 μl von DNA-Komplexen mit einer Konzentration von 10 μg/ml in einer 150 mM Natriumchloridlösung mit zunehmenden Mengen an kationischem Bezugslipid oder säureempfindlicher syn- oder trans-Verbindung A hergestellt.
  • Zum Zeitpunkt t = 0 wurden zu diesen Probekörpern 200 μl Puffer mit einer Konzentration von 0,1 mol/l bei pH 5 zugegeben und die Probekörper in einem Wärmeschrank bei 37 °C gelagert. Die Fluoreszenz mit Ethidiumbromid (BET) wurde im Laufe der Zeit gemessen (bei 20 °C) unter Verwendung eines FluoroMax-2 (Jobin Y von-Spex) mit einer Anregungs- bzw. Emissionswellenlänge von 260 nm bzw. 590 nm. Die Schlitzbreiten für die Anregung und Emission wurden auf 5 nm eingestellt. Die Höhe der Fluoreszenz wurde nach Zugabe von 3 μl Ethidiumbromid mit 1 g/l pro ml Lösung DNA/kationisches Lipid oder DNA/säureempfindliche Verbindung (0,01 mg DNA/ml) aufgezeichnet.
  • Die Ergebnisse sind in 1 zusammengefasst. Bei pH 5 war, nachdem die Menge an säureempfindlicher syn- oder trans-Verbindung A oder kationischem Bezugslipid, die/das verwendet worden war, um die DNA zu verpacken, zu gering war (0,4 nmol Lipid/μg DNA) und somit die DNA nicht vollständig verpackt war, keine signifikante Veränderung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit messbar. Dafür wurde ein anderes Verhalten der säureempfindlichen syn- und trans-Verbindung A in Bezug auf das kationische Bezugslipid (nicht säureempfindlich) bei größeren Mengen (1,7 nmol Lipid/μg DNA und 6,0 nmol Lipid/μg DNA) beobachtet, welche die vollständige Verpackung der DNA erlaubte. Die säureempfindliche syn- und trans-Verbindung A setzten DNA im Laufe der Zeit frei, wie dies die Erhöhung der Fluoreszenz zeigte, was bei dem kationischen Bezugslipid nicht der Fall war, das nicht säureempfindlich war. Weiterhin ist festzustellen, dass diese DNA-Freisetzung einige Stunden nach Zugabe der Säure (pH 5 und 37 °C) stattfand.
  • Weiterhin wurde eine Verschiebung in der Kinetik der Freisetzung der DNA entsprechend der Menge an verwendeter säureempfindlicher Verbindung beobachtet: Die DNA-Freisetzung ist umso schneller, je geringer die verwendete Menge an säureempfindlicher Verbindung A ist.
  • Diese Untersuchung zeigt die bemerkenswerten Eigenschaften der säureempfindlichen syn- und trans-Verbindung A: Sie sind in der Lage, Komplexe mit DNA zu bilden und diese zu verpacken, wobei ihr Abbau in saurem Milieu zu einem Abbau der mit der DNA gebildeten Komplexe und somit zur Freisetzung der DNA führt. Diese säureempfindlichen Verbindungen sind daher besonders nützlich bei der nichtviralen DNA-Transfektion in die Zellen.
  • Beispiel 8: in-vitro-Untersuchung zum Transfektionsvermögen der säureempfindlichen syn- und trans-Verbindung A
  • In diesem Beispiel wird das in-vitro-Transfektionsvermögen der säureempfindlichen syn- und trans-Verbindung A, verglichen mit ihrem im vorhergehenden Beispiel beschriebenen nicht säureempfindlichen Analogen (kationisches Vergleichslipid) gezeigt.
  • Diese Untersuchung wurde mit 4 verschiedenen Beladungsverhältnissen durchgeführt: 1,0 oder 4,0 oder 6,0 oder 10,0 nmol Lipid/μg DNA. Jede dieser Bedingungen wurde mit und ohne Rinderfötusserum ("+ oder – Serum") getestet.
  • Kultivierung der Zellen: HeLa-Zellen (American type Culture Collection [ATCC] Rockville, MD, USA), abgeleitet von einem humanen Cervixepithelkarzinom, wurden in Gegenwart eines Mediums vom Typ MEM ("minimum essential medium") mit 2 mM L-Glutamin, 50 Einheiten/m1 Penicillin und 50 Einheiten/ml Streptomycin kultiviert. Das Medium und die Zusatzstoffe stammten von Gibco/BRL life Technologies (Gaithersburg, MD, USA). Die Zellen wurden in Kolben bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid in einem Inkubator kultiviert.
  • Transfektion: Einen Tag vor der Transfektion wurden die HeLa-Zellen in 24-Loch-Platten mit einer Zellanzahl von 30000 bis 50000 pro Loch übertragen. Diese Verdünnungen repräsentieren etwa 80 % Konfluenz nach 24 Stunden.
  • Für die Transfektion wurden die Zellen zweimal gewaschen und bei 37 ° mit 500 μl des Mediums mit Serum (10 % SVF Vol./Vol.) oder ohne Serum inkubiert.
  • 50 μl Komplexe, die 0,5 μg Plasmid-DNA enthielten, wurden in jede Vertiefung gegeben (die Komplexe wurden mindestens 30 Minuten vor der Zugabe in die Vertiefungen hergestellt).
  • Nach zwei Stunden bei 37 °C wurden die Platten ohne Serum mit 10 % (Vol./Vol.) SVF ("Rinderfötusserum") ergänzt.
  • Alle Platten wurden 36 Stunden lang bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid angeordnet.
  • Bestimmung der Luciferaseaktivität: Die transfektierten Zellen wurden zweimal mit 500 μl PPS (Phosphatpuffer) gewaschen und anschließend mit 250 μl Reagens (Promega cell culture lysis reagent des Kits Luciferase Assay System) lysiert.
  • Ein Aliquot von 10 μl Überstand des zentrifugierten Lysats (12000·g) 5 Minuten bei 4 °C wurde mit dem Luminometer Wallac Victor2 (1420 Multilabel counter) gemessen.
  • Die Luciferaseaktivität wurde durch Emission des Lichts in Gegenwart von Luciferin, Coenzym A und ATP 10 Sekunden lang quantitativ analysiert und auf 2000 behandelte Zellen bezogen. Die Luciferaseaktivität wurde so angegeben in relativen Lichteinheiten ("RLU": "Relative light unit") und mit der Proteinkonzentration des Probekörpers standardisiert, die durch Verwendung des Kits Pierce BCA (Rockford, IL, USA) erhalten worden war.
  • Die in 2 zusammengefassten Ergebnisse zeigen eine beträchtliche Transfektionsaktivität für die drei getesteten Verbindungen (säureempfindliche syn- und trans-Verbindung A und kationisches Vergleichslipid). Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen ihnen festgestellt. Ohne das Serum war die Transfektion in allen Fällen erhöht (105 bis 107 RLU/μg Protein), und das Transfektionsvermögen stieg mit der Menge an säureempfindlicher Verbindung oder kationischem Vergleichslipid. Das Vorhandensein des Serums bewirkte eine Hemmung der Transfektion in allen Fällen.
  • Dieses Beispiel zeigt daher, dass das Transfektionsvermögen der säureempfindlichen Verbindung A in ihren Formen syn und trans, verglichen mit ihrem nichtsäureempfindlichen Analogen (kationisches Vergleichslipid), erhalten geblieben war. Ganz allgemein wird durch die Einführung einer säureempfindlichen zyklischen Orthoesterfunktion in Moleküle vom Typ kationisches Lipid, die dafür bekannt sind, für nichtvirale Transfektion nützlich zu sein, das Vermögen dieser Verbindungen, die DNA wirksam zu transfektieren, nicht zerstört.
  • Beispiel 9: Verwendung der säureempfindlichen Verbindungen C und D als nichtionische oberflächenaktive Mittel für die kolloidale Stabilisierung von transfektierenden DNA-Komplexen/kationisches Lipid
  • In diesem Beispiel wird die Tatsache gezeigt, dass säureempfindliche PEGisierte Lipide vom Typ der in dieser Patentanmeldung in (d) definierten als nichtionische oberflächenaktive Mittel verwendet werden können, die gegenüber DNA transfektierenden Teilchen/kationisches Lipid die Aufgabe eines kolloidalen Stabilisators erfüllen.
  • In diesem Beispiel war das verwendete kationische Lipid das bereits in den Beispielen 7 und 8 verwendete, das in der Veröffentlichung WO 97/18185 beschrieben ist mit der Formel: H2N-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-CH2-CO-Gly-N[(CH2)17-CH3]2 (kationisches Vergleichslipid).
  • Die in Beispiel 5 hergestellten Verbindungen C und D wurden als säureempfindliche PEGisierte Lipide verwendet. Zum Vergleich wurden verwendet BRU 700 (SIGMA) und das PEGisierte Lipid mit der Formel:
    Figure 00650001
    "Analoges D", die gegenüber den Verbindungen C und D nicht säureempfindliche Analoge sind und als nichtionische oberflächenaktive Mittel bekannt sind (siehe beispielsweise die Veröffentlichung WO 98/34648). Die zwei Vergleichsverbindungen wurden mit 10 g/l in Wasser verwendet.
  • Proben aus 1 ml Nukleolipidkomplexen (DNA/kationisches Vergleichslipid) wurden aus DNA mit 10 μg/ml in 75 mM einer Natriumchloridlösung durch äquivolumetrisches Vermischen der Lösung, die das kationische Vergleichslipid und eines der PEGisierten Lipide (Verbindung C, Verbindung D, Brij 700 oder das Analoge D) enthielt, in der DNA-Lösung hergestellt. Diese Proben hatten alle ein Verhältnis von kationischem Vergleichslipid/DNA von 1,5 (nmol Lipid pro μg DNA) und enthielten zunehmende Mengen an PEGisiertem Lipid (angegeben als Verhältnis Gewicht/Gewicht Polymer/DNA).
  • Die Messung der Größe der erhaltenen Teilchen wurde 30 Minuten nach dem Vermischen durchgeführt und erlaubte insbesondere die Untersuchung des Einflusses der Menge des säureempfindlichen PEGisierten Lipids (Verbindung C oder D) oder des nichtsäureempfindlichen PEGisierten Lipids (Brij 700 oder Analoges D) auf die Stabilisierung der Komplexe kationisches Vergleichslipid/DNA.
  • Die Messung des hydrodynamischen Durchmessers wurde mit einem Gerät Coulter N4Plus durchgeführt, indem Kunststoffküvetten (vier transparente Seiten) verwendet wurden, die mit 800 μl von verschiedenen Lösungen mit 0,01 mg DNA/ml gefüllt worden waren, wobei die Messung bei 90° im Ein-Moden-Modus durchgeführt wurde.
  • Die Ergebnisse sind in 3 dargestellt, in welcher die Veränderung der Größe der kationischen Vergleichslipidteilchen/DNA in Abhängigkeit von der Menge an Verbindung C, D, Brij 700 oder des Analogen D gezeigt ist.
  • Dazu ist festzustellen, dass sowohl die säureempfindlichen PEGisierten Lipide als auch ihre stabilen Vergleichsverbindungen die Bildung von kationischen Vergleichslipidteilchen/DNA mit kleiner Größe (kleiner als 100 nm) erlauben, wenn eine Mindestmenge erreicht wird, während dieselben kationischen Vergleichslipidteilchen/DNA spontan aggregieren (Größe von über 1 μm) ohne säureempfindliches PEGisiertes Lipid oder nichtsäureempfindliches Lipid oder wenn dieses in einer zu geringen Menge vorliegt.
  • In diesem Beispiel wird somit gezeigt, dass die Verbindungen C und D und ganz allgemein die säureempfindlichen PEGisierten Lipide des in (d) der allgemeinen Formel (I) definierten Typs als nichtionische oberflächenaktive Mittel verwendet werden können, wobei ihr kolloidales Stabilisierungsvermögen vergleichbar mit demjenigen der stabilen nichtionischen oberflächenaktiven Mittel ist (das heißt der nichtsäureempfindlichen wie Brij 700), die herkömmlicherweise für die colloidale Stabilisierung von Nukleolipidteilchen verwendet werden.
  • Beispiel 10: Einfluss des pH-Werts auf die colloidale Stabilisierung der Komplexe DNA/kationischer Vektor durch die Verbindungen C und D
  • In diesem Beispiel wird die Tatsache veranschaulicht, dass säureempfindliche PEGisierte Lipide vom Typ der in (d) mit der allgemeinen Formel (I) der vorliegenden Patentanmeldung definierten, die als nichtionische oberflächenaktive Mittel zur Stabilisierung von Nukleolipidkomplexen DNA/kationisches Lipid verwendet werden, bei einem sauren pH-Wert abgebaut werden können und somit die Nukleolipidkomplexe freisetzen.
  • Die bemerkenswerte Eigenschaft, die hier genutzt wird, ist das Fehlen einer colloidalen Stabilisierung, wenn ein PEGisiertes Lipid durch ein PEG ohne einen Lipidteil ersetzt wird. Die Formulierung der DNA in Gegenwart eines kationischen Vektors und eines säureempfindlichen PEGisierten Lipids führt in einem ungepufferten Medium zu kleinen Teilchen (siehe Beispiel 9). Dieselbe Untersuchung mit einem PEG allein (das heißt, das nicht an einen Lipidteil gekoppelt ist) ergibt im Gegensatz dazu keine Stabilisierung.
  • Das in diesem Beispiel verwendete säureempfindliche PEGisierte Lipid ist die Verbindung D, die in Beispiel 5 hergestellt wurde, sowie sein nichtsäureempfindliches Analoges, das als "Analoges D" im vorhergehenden Beispiel und im Folgenden bezeichnet wird.
  • Es wurden Proben aus 1 ml Nukleolipidkomplexen (DNA/kationisches Vergleichslipid) aus DNA mit 10 μg/ml in 75 mM einer Natriumchloridlösung durch äquivolumetrisches Mischen der Lösung, die das kationische Vergleichslipid und die Ver bindung D oder das nichtsäureempfindliche Analoge D enthielt, in der DNA-Lösung hergestellt. Diese Proben hatten alle ein Verhältnis von kationischem Vergleichslipid/DNA von 1,5 (nmol Lipid pro μg DNA) und enthielten zunehmende Mengen an PEGisiertem Lipid (angegeben als Verhältnis Gewicht/Gewicht Polymer/DNA).
  • 100 μl des Puffers Essigsäure/Natriumacetat mit pH 5 (0,1 mol/l) wurden zu diesen auf 37 °C thermostatierten Proben in einem Umlufttrockenschrank gegeben. Die Teilchengröße wurde in Abhängigkeit von der Zeit gemessen.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in 4 dargestellt, in welcher die Größe der Nukleolipidteilchen in Abhängigkeit von der Zeit und auch gemäß dem Verhältnis von säureempfindlichem oder nichtsäureempfindlichem PEGisiertem Lipid/DNA (3 Verhältnisse Gewicht/untersuchtes Gewicht: 0,5; 0,75 oder 1) gezeigt ist.
  • Bei dem Analogen D (nichtsäureempfindliches PEGisiertes Lipid) war der pH-Wert ohne Einfluss auf die colloidale Stabilität der Teilchen: die gebildeten Teilchen hatten eine kleine Größe von etwa 100 nm unabhängig vom Verhältnis Analoges D/DNA. Zum Zeitpunkt t = 0 wurde dieselbe Stabilität mit der Verbindung D beobachtet, unabhängig von dem Verhältnis Verbindung D/DNA.
  • Dafür ist eine Zunahme der Größe der Nukleolipidteilchen in Abhängigkeit von der Zeit festzustellen, wenn die Verbindung D als nichtionisches oberflächenaktives Mittel bei saurem pH-Wert (pH 5) verwendet wird. Diese Größenzunahme der Nukleolipidteilchen erfolgt umso schneller, je kleiner das Verhältnis von Verbindung D/DNA ist. So waren nach 4 Stunden die Teilchen bei einem kleinen Verhältnis (0,5) vollständig aggregiert und bei einem großen Überschuss an Verbindung D (Verhältnis von 1) nicht oder nur wenig aggregiert.
  • So ist es möglich festzustellen, dass die Verbindung D gegenüber der Höhe des pH-Werts empfindlich ist. Die Größenzunahme der Nukleolipidteilchen in Abhängigkeit von der Zeit zeigt den Abbau des säureempfindlichen PEGisierten Lipids (Ver bindung D), wenn es sich in einem sauren Milieu befindet (es findet eine "Entpfropfung" des Lipidteils vom säureempfindlichen Teil der Verbindung statt).
  • Außerdem wird, wenn das Verhältnis von säureempfindlichem PEGisiertem Lipid/DNA erhöht wird, auch die für die Aggregation erforderliche Zeit verlängert, was dazu führt zu zeigen, dass, je mehr säureempfindliches PEGisiertes Lipid verwendet wird, es umso mehr abgebaut wird, bevor man sich von der Grenze löst, ab welcher eine Aggregation der Nukleolipidteilchen stattfindet. So wird es möglich, indem die Menge an säureempfindlichem colloidalem Stabilisator angepasst wird, den Zeitraum einzustellen, der für die Freisetzung des Wirkstoffs bei einem gegebenen pH-Wert erforderlich ist.
  • Beispiel 11: in-vivo-Transfektion der DNA, die mit einem Gemisch aus kationischem Lipid/neutralem Colipid/Verbindung D formuliert worden war
  • In diesem Beispiel wird der Einfluss eines nichtionischen oberflächenaktiven Mittels wie Verbindung D auf die Wirksamkeit der Übertragung von DNA, die mit einem Liposomen auf der Basis eines kationischen Lipids formuliert worden ist, gezeigt.
  • 1) Herstellung der Liposomen
  • Das kationische Lipid mit der Formel:
    Figure 00690001
    und das neutrale Lipid DOPE (erhältlich von Avanti Polar Lipids, Birmingham, AL) wurden jeweils in Chloroform gelöst und anschließend in äquimolaren Mengen vermischt.
  • Geeignete Mengen an Verbindung D wurden in Chloroform gelöst und dem Gemisch zugegeben. Die verwendeten Mengen an Verbindung D sind in Mol-% der gesamten Lipidmenge angegeben.
  • Das organische Lösungsmittel wurde anschließend unter einem Argonstrom derart verdampft, dass sich im Boden des Reagenzglases einer feiner Lipidfilm bildete. Dieser Film wurde unter Vakuum mindestens 1 Stunde lang getrocknet und anschließend 2 Stunden lang mit einem Puffer HEPES 20 mM bei pH 7,4 und Dextrose 5 % bei 4 °C rückbefeuchtet. Die so erhaltene Lipidsuspension wurde 30 Minuten lang bei 50 °C erwärmt und anschließend 5 Minuten lang derart mit Ultraschall behandelt, dass sich eine homogene Suspension von Liposomen mit etwa 100 nm bildete.
  • Die verwendete DNA war eine Plasmid-DNA, die das Gen CAT unter der Kontrolle des Promotors CMV enthielt. Die verwendete Plasmid-DNA besaß folgende Kriterien: Endotoxingehalt von unter 20 U/mg, Menge an überspiralisierter DNA über 90 %, Verunreinigung mit E.-coli-DNA von unter 5 %, Verunreinigung mit RNA von unter 5 % und Verunreinigung mit Proteinen von unter 1 %.
  • 2) Herstellung von DNA/Lipid-Komplexen
  • Äquivalente Volumina von Liposomensuspensionen (in geeigneter Konzentration) wurden schnell zu einer DNA-Lösung gegeben, wobei sie schnell und kräftig vermischt wurden. Insgesamt komplexierte sich 1 μg DNA mit 5 nmol kationischem Lipid. Der Durchmesser der gebildeten Komplexe betrug etwa 100 bis 240 nm.
  • 3) in-vivo-Verabreichung
  • In allen Versuchen wurden weibliche Balb/C-Mäuse in einem Alter von etwa 6 Wochen verwendet. Jede Maus erhielt eine subkutane Injektion mit 106 Zellen M109 in die rechte Seite. Nachdem die Tumoren eine Größe von etwa 300 mm3 erreicht hat ten, erhielten die Mäuse jeweils 200 μl Komplexe DNA/Lipide, die 50 μg DNA enthielten, pro intravenöse Injektion. Die Gewebe wurden 24 Stunden nach der Injektion entnommen und bis zu ihrer Verwendung bei –70 °C aufbewahrt.
  • 4) CAT-Versuch
  • Die Gewebe wurden homogenisiert, wobei das Gerät "FastPrep Cell Disrupter FP120" (Bio 101/Savant) verwendet wurde. Danach wurden die Proben mit 1000 U/Minute 5 Minuten lang zentrifugiert. Die Menge des exprimierten Transgens CAT wurde bestimmt, indem die Standardvorschrift CAT ELISA (Roche, IN) befolgt wurde.
  • 5) Ergebnisse
  • Es wurde die Antwort-Dosis-Kurve der Verbindung D auf die Gentransferaktivität von Komplexen DNA/kationisches Lipid/DOPE untersucht. Die Verbindung "Analoges D" wurde als Negativkontrolle verwendet. Wie vorhergesehen fand der bedeutendste Gentransfer in den Lungen statt. Es wurde beobachtet, dass durch die Verwendung der Verbindung "Analoges D" die Transfektionsaktivität in den Lungen und den Tumoren dosisabhängig gehemmt wurde. Wenn die Menge an Verbindung D erhöht wurde, wurde die Transfektionsaktivität in den Lungen ebenfalls gehemmt. Im Gegensatz dazu erschien der Gentransfer in den Tumoren nicht beeinflusst. Diese Ergebnisse entsprechen der Hypothese, dass die saure Umgebung der Tumoren zu einer Abtrennung der PEG-Teile vom Rest des Teilchens nach Extravasation führt.
  • Die erhaltenen und in 7 veranschaulichten Ergebnisse zeigen so, dass es die Verbindung D erlaubt, die Transferaktivität des für die Tumoren spezifischen Gens gegenüber den Lungen um den Faktor 40 zu erhöhen.
  • Beispiel 12: Untersuchung der Stabilität der säureempfindlichen Verbindungen in Abhängigkeit vom pH-Wert
  • In diesem Beispiel wird die Tatsache beschrieben, dass die erfindungsgemäßen säureempfindlichen Verbindungen eine Säureempfindlichkeit haben, die je nach Charakter des vorhandenen Orthoesterzyklus (Zyklus mit 5 oder 6 Gliedern) modifizierbar ist.
  • Dazu wurde die Veränderung der Größe von Nukleolipidkomplexen (gleich denjenigen, die in den Beispielen 9 und 10 verwendet worden waren) in Abhängigkeit von dem pH-Wert und der Zeit für verschiedene säureempfindliche PEGisierte Lipide gemessen, was es erlaubte, verschiedene Empfindlichkeitsbereiche zu überprüfen. Diese Versuche wurden mit feststehenden Verhältnissen von kationischem Vergleichslipid/DNA und säureempfindlichem PEGisiertem Lipid/DNA durchgeführt.
  • Es wurden Proben von 1 ml Komplex DNA/kationisches Vergleichslipid/säureempfindliches PEGisiertes Lipid hergestellt, dass:
    • – das Verhältnis von kationischem Vergleichslipid/DNA 1,5 nmol/μg,
    • – das Verhältnis von säureempfindlichem PEGisiertem Lipid/DNA 0,5 oder 1 und
    • – die DNA-Konzentration 20 μg/ml in 75 mM einer Natriumchloridlösung betrug.
  • Nach 30 Minuten wurden 500 μl einer Pufferlösung mit 0,05 mol/l und 500 μl einer Natriumchloridlösung mit 150 mM zu den bei 37 °C in einem Umlufttrockenschrank thermostatierten Proben gegeben. Es wurde so ein saurer pH-Wert eingestellt und die Teilchengröße in Abhängigkeit von der Zeit gemessen.
  • Die Endkonzentration der Proben betrug 10 μg DNA/ml in 75 mM einer Natriumchloridlösung. Die verwendeten Puffer waren Puffer aus Zitronensäure/Natriumzitrat mit pH 4, pH 5 und pH 6 und ein Puffer Hepes/Natronlauge mit pH 7,4.
  • Die erhaltenen Ergebnisse sind in 5 dargestellt, in welcher die Veränderung der Größe der Nukleolipidteilchen in Abhängigkeit von dem pH-Wert und der Zeit für die in den vorhergehenden Beispielen hergestellten säureempfindlichen Verbindungen C und E gezeigt ist, die sich nur durch den Charakter des verwendeten Orthoesterzyklus (Zyklus mit 5 oder 6 Gliedern) unterschieden.
  • Bei diesen zwei Verbindungen wurde eine Vergrößerung der Nukleolipidteilchen in Abhängigkeit von der Zeit beobachtet, wenn der pH sauer ist, was ihren Abbau beweist. Dafür wurde keine Vergrößerung der Nukleolipidteilchen in Abhängigkeit von der Zeit beobachtet, wenn der pH-Wert 7,4 betrug. Außerdem verläuft die Aggregierung der Nukleolipidteilchen umso schneller, je niedriger der pH-Wert ist.
  • Schließlich wurde eine große kinetische Differenz zwischen den zwei untersuchten Verbindungen C und E festgestellt: Bei pH 6 begann die Aggregation der Nukleolipidteilchen etwa 1 Stunde nach Ansäuern bei Verwendung der Verbindung E, während die Verwendung der Verbindung C eine mindestens 4 Stunden lange Stabilisierung erlaubte.
  • Die Ergebnisse zeigen so mehrere bemerkenswerte Eigenschaften der säureempfindlichen Verbindungen C und E und ganz allgemein der säureempfindlichen Verbindungen dieses Typs gemäß dieser Patentanmeldung:
    • – sie besitzen beide eine hohe Empfindlichkeit bei sauren pH-Werten, und in allen Fällen wurde beobachtet, dass ihre Destabilisierung umso schneller verläuft, je niedriger der pH-Wert ist,
    • – sie sind beide bei physiologischem pH-Wert (pH 7,4) relativ stabil und
    • – ihre Abbaukinetik unterscheidet sich sehr, je nach der verwendeten Orthoestergruppe (Zyklus mit 5 oder 6 Gliedern).

Claims (26)

  1. Säureempfindliche Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie die folgende allgemeine Formel aufweisen:
    Figure 00740001
    in der: • g eine ganze Zahl ist, die die Werte 0, 1, 2, 3 oder 4 annehmen kann, • G ein Wasserstoffatom, ein 1 bis 6 Kohlenstoffatome enthaltendes, gesättigtes oder ungesättigtes, Alkylradikal in gerader oder verzweigter Kette oder ein 6 bis 14 Kohlenstoffatome enthaltendes Arylradikal darstellt, • G1 und G2 Folgendes darstellen: (a) das eine ein aus den Radikalen vom Typ Polyamin ausgewähltes hydrophiles Substituent und das andere ein aus den Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen, den steroiden Derivaten oder den hydrophoben Dendrimeren ausgewähltes hydrophobes Substituent, oder (b) eines eine lineare, hydrophobe Alkylgruppe mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen und eventuell mit einer oder mehreren Unsättigung(en), und die andere eine Gruppe der allgemeinen Formel:
    Figure 00740002
    in der i eine ganze Zahl zwischen 1 und 4 ist und j eine ganze Zahl zwischen 9 und 23 und der hydrophile Substituent aus den Radikalen vom Typ Polyamin ausgewählt wird, oder (c) eines ein aus den Polyalkylen-Glykolen oder den Mono- oder Poly-Sacchariden ausgewähltes Substituent ist und das andere ein aus den Imin-Polyalkylen ausgewähltes hydrophiles Substituent oder (d) eines ein aus den Glykol-Polyalkylenen oder den Mono- oder Polysacchariden ausgewähltes hydrophiles Substituent und das andere ein aus den Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen, den Steroid-Derivaten, den hydrophoben Dendrimeren oder den kovalenten konjugierten Doppelbindungen zwischen einem Mono- oder Bi-Ketten-Alkyl ausgewähltes hydrophobes Substituent ist, oder ein hydrophobes Dendrimer und ein Glykol-Polyalkylen-Molekül mit 1 bis 20 monomerischen Einheiten, oder (e) eines ein aus den Glykol-Polyalkylenen oder den Motto- oder Polysacchariden ausgewähltes hydrophiles Substituent und das andere ein therapeutisches Molekül ist oder (f) eines ein therapeutisches Molekül hydrophiler Art und das andere ein aus den Mono- oder Bi-Ketten-Alkylen, den Steroid-Derivaten oder den hydrophoben Dendrimeren ausgewähltes hydrophobes Substituent ist, sowie deren Salze.
  2. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass G aus Wasserstoff, Methyl, Ethyl oder Phenyl ausgewählt ist.
  3. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet; dass die Mono- oder Bi-Ketten-Alkyle aus einer oder zwei linearen Alkylketten mit 10 bis 24 Kohlenstoffatomen und eventuell einer oder mehreren Unsättigung(en) gebildet werden.
  4. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroid-Derivat aus den Sterolen, den Steroiden und steroidischen Hormonen ausgewählt wird.
  5. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das hydrophobe Dendrimer das Poly(Benzyl-Ester) ist.
  6. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykol-Polyalkylene aus den Glykol-Alkylenen mit einem zwischen 102 und 105 Dalton inbegriffenen durchschnittlichen Molekulargewicht ausgewählt werden.
  7. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Glykol-Polyalkylene aus den Glykol-Polyehtylenen (PEG) mit einem zwischen 102 und 105 Dalton inbegriffenen durchschnittlichen Molekulargewicht ausgewählt werden.
  8. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Mono- oder Poly-Saccharide aus den Pyranosen, den Furanosen, den Dextranen, der α-Amylose, dem Amylopectin, dem Fruktan, den Mannanen, den Xylanen und den Arabinen ausgewählt werden.
  9. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Glykol-Polyalykylen oder das Mono- oder Poly-Saccharid kovalent mit einem Targeting-Element verbunden ist.
  10. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, das das Targeting-Element aus den Zuckern, den Peptiden, den Proteinen, den Oligonukleotiden, den Lipiden, den Neuromediatoren, den Hormonen, den Vitaminen oder ihren Derivaten ausgewählt wird.
  11. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Imin-Polyalkylen aus den Polymeren mit den monomerischen Einheiten der folgenden allgemeinen Formel ausgewählt werden:
    Figure 00760001
    in der R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe mit der folgenden Formel sein kann:
    Figure 00770001
    und n eine zwischen 2 und 10 inbegriffene ganze Zahl ist, p und q zwei derart ausgewählte ganze Zahlen sind, dass die Summe p + q derart ist, dass das durchschnittliche Molekulargewicht des Polymers zwischen 100 und 107 Da inbegriffen ist, wobei es sich von selbst versteht, dass der Wert von n zwischen den unterschiedlichen Motiven -NR-(CH2)n- variieren kann.
  12. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass jedes Substituent G1 und G2 mittels eines „Platzhalter"-Moleküls indirekt mit dem zyklischen Orthoester verbunden ist.
  13. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das genannte „Platzhalter"-Molekül aus den Alkylen (1 bis 6 Kohlenstoffatome), den Karbonyl-, Ester-, Äther-, Amid-, Karabamat-, Thiokarbamat-, Glycerin-, Harnstoff-, Thioharnstoffverbindungen oder einer Verbindung mehrerer dieser Gruppen ausgewählt wird.
  14. Säureempfindliche Verbindungen gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die therapeutischen Moleküle aus den Peptiden, den Oligopeptiden, den Proteinen, den Antigenen und ihren Antikörpern, den Enzymen und ihren Inhibitoren, den Hormonen, den Antibiotika, den Analgetika, den Bronchodilatatoren, den antimikrobiellen Wirkstoffen, den blutdrucksenkenden Wirkstoffen, den Herz-Kreislauf-Wirkstoffen, den auf das zentrale Nervensystem einwirkenden Wirkstoffen, den Antihistaminen, den Antidepressiva, den Beruhigungsmitteln, den Antikonvulsiva, den anti-inflammatorischen Substanzen, den Stimulantien, den Antiemetica, den Diuretika, den Antispasmodika, den anti-ischämischen Wirkstoffen den den Zelltod begrenzenden Wirkstoffen oder den Anti-Krebs-Wirkstoffen ausgewählt werden.
  15. Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine säureempfindliche Verbindung gemäß Definition in den Ansprüchen 1 bis 14 umfassen.
  16. Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, dass sie wenigstens eine biologisch aktive Substanz und eine säureempfindliche Verbindung gemäß Definition in Anspruch 1 umfassen und bei denen G1 und G2 gemäß (a), (b), (c) oder (d) definiert werden.
  17. Zusammensetzungen gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die genannte aktive biologische Substanz entweder ein therapeutisches Molekül gemäß Definition in Anspruch 15 ist oder eine Nukleinsäure.
  18. Zusammensetzungen gemäß Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass sie darüber hinaus einen oder mehrere Zusatzstoffe) umfassen.
  19. Zusammensetzungen gemäß Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Zusatzstoff ein oder mehrere neutrale(s) Lipid(e) ist.
  20. Zusammensetzungen gemäß Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Zusatzstoff aus den natürlichen oder synthetischen, zwitterionischen oder unter physiologischen Bedingungen keine Ionenladungen enthaltenden Lipiden ausgewählt wird.
  21. Zusammensetzungen gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der genannte Zusatzstoff aus dem Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), dem Oleoylpalmitoyl-Phosphatidylethanolamin (POPE), den Di-Stearoyl, -Palmitoyl, -Mirystoyl-Phosphatidylethanolaminen sowie ihren 1 bis 3 Mal N-methylierten Derivaten, den Phosphatidylglycerinen, den Diacylglycerinen, den Glycosyldiacylglycerinen, den Cerebrosiden (wie z. B. insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie z. B. insbesondere den Sphin gomyelinen) oder auch den Asialogangliosiden (wie z. B. insbesondere den AsialoGM1 und GM2) ausgewählt werden.
  22. Zusammensetzungen gemäß Anspruch 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie darüber hinaus einen für eine injizierbre Formulierung pharmazeutisch akzeptablen Träger umfassen.
  23. Verbindungen gemäß Anspruch 15 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass sie darüber hinaus einen für eine Verabreichung auf der Haut und/oder den Schleimhäuten akzeptablen pharmazeutischen Träger umfassen.
  24. Einsatz einer säureempfindlichen Verbindung gemäß Definition in den Ansprüchen 1 bis 14 zur Herstellung eines zur Behandlung von Krankheiten bestimmten Medikaments.
  25. Herstellung einer säureempfindlichen Verbindung gemäß Definition in Anspruch 1 und bei der G1 und G2 gemäß (a), (b), (c) oder (d) definiert sind, zur Herstellung eines zur Transfektion von Nukleinsäuren bestimmten Medikaments.
  26. Die säureempfindlichen Verbindungen gemäß Anspruch 1, bei denen G, und G2 die unter (e) oder (f) angegebenen Definitionen haben, zu Verwendung als Medikament.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004111077A1 (en) 2003-06-18 2004-12-23 Tranzyme Pharma Inc. Macrocyclic antagonists of the motilin receptor
FR2925491B1 (fr) * 2007-12-19 2010-09-03 Oz Biosciences Sas Nouvelle classe de lipides cationiques pour le transport d'agents actifs dans les cellules
KR101014246B1 (ko) 2008-07-03 2011-02-16 포항공과대학교 산학협력단 페하 민감성 금속 나노 입자 및 이의 제조 방법.
GB201307438D0 (en) * 2013-04-25 2013-06-05 Airbus Uk Ltd Fuel Additive
KR101725240B1 (ko) 2015-03-24 2017-04-11 부산대학교 산학협력단 UV-광 반응성 및 pH 반응성을 갖는 이중 자극 반응성 코어-쉘 자성나노입자 및 이를 포함하는 약물 전달체
EP3095790A1 (de) 2015-05-22 2016-11-23 Universite De Bordeaux Nukleosidlipidverbindungen mit ph-empfindlichen dialkylorthoesterketten und deren verwendung zum transport oder zur vektorisierung von mindestens einem therapeutischen wirkstoff
US10822323B2 (en) * 2018-02-26 2020-11-03 Waters Technologies Corporation Acid labile surfactants
CN116656706A (zh) * 2023-04-18 2023-08-29 河南中医药大学第一附属医院 一种酸敏融合蛋白重组质粒及其构建、应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4406686A (en) * 1981-07-24 1983-09-27 Stauffer Chemical Company Haloalkylaminomethyldioxolane herbicide antidotes
FR2722506B1 (fr) * 1994-07-13 1996-08-14 Rhone Poulenc Rorer Sa Composition contenant des acides nucleiques, preparation et utilisations

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