DE4446937C2 - Neues Cholesterolderivat, dessen Herstellung und Verwendung für den liposomalen Gentransfer - Google Patents

Neues Cholesterolderivat, dessen Herstellung und Verwendung für den liposomalen Gentransfer

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Description

Die Erfindung betrifft ein neues Cholesterolderivat für den liposomalen Gentransfer sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die Gentechnik.
Kationische Liposomen sind effektive nichtvirale Transfektionsreagentien für tierische Zellen in vitro (P. Felgner, G. Ringold, Nature 337/1989/, 387-388). Das erste Reagenz dieser Art, DOTMA (N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N- trimethylammoniumchlorid), ist nach Mischung mit einer äquimolaren Menge von DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin)in der Lage, eine Reihe von Säugerzellen in vitro und in vivo zu transfizieren.
Die Synthese von DOTMA verläuft über viele Stufen mit einer verhältnismäßig geringen Ausbeute. Das handelsübliche Mittel, Lipofektin, welches DOTMA und DOPE enthält, ist darüber hinaus relativ teuer. Andere kationische Liposomreagentien mit kommerziell zugänglichen kationischen Amphiphilen haben sich als relativ toxisch gegenüber den behandelten Zellen erwiesen (Pinnaduwage et al, Biochim. Biophys. Acta 289/1989/, 33-37). X. Gao und L. Huang (Biochem. Biophys. Res. Comm. 179/1991/, 280-285) haben das kationische Cholesterolderivat 3ß[N-(N',N'- Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterol (DC-Chol) beschrieben. Es kann in einer Stufe hergestellt werden, Liposomen mit diesem Lipid transfizieren effizienter und sind weniger toxisch gegenüber den behandelten Zellen als das Lipofektin-Reagenz.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein neues kationisches Lipid zu finden, das bei mit DC-Chol vergleichbarer Transfek­ tionsfähigkeit eine geringere Toxizität aufweist und damit insbesondere für eine in vivo-Anwendung geeignet ist.
Die Aufgabe wird gemäß den Ansprüchen gelöst, das Herstellungsverfahren ist in dem folgenden Schema formelmäßig dargestellt.
Das neue Mittel unter Einsatz von DAC-Chol hat gegenüber den bisher verwendeten Mitteln den Vorteil, bei hochsensiblen Zellen nicht toxisch zu sein und sowohl in vitro als auch in vivo zu erfolgreichen Transfektionen zu führen. Die Anwendung des Mittels wird an Glioblastoma-Zellen der Ratte, die sonst nur mit geringer Effektivität transfiziert werden können, gezeigt. Es werden Transfektionsraten erreicht, die im Vergleich zur Calciumphosphat-Präzipitationstechnik (CPPT) bis zu 10fach höher sind. Dieser Befund dürfte auf eine kompaktere Formation der DNA, einen besseren Liposom-Zellkontakt über die positiven Ladungen der Vesikel und auf die höhere Stabilität in Hinsicht auf die DNA abbauenden Enzyme zurückzuführen sein. Dadurch kann es vorteilhaft für den direkten liposomalen Gentransfer eingesetzt werden. So lassen sich z. B. auch Immunliposomen durch Kopplung von Organ- bzw. gewebespezifischen Antikörpern unter Zusatz von DAC-Chol/DOPE herstellen. Bei vorheriger Inkubation der zu transfizierenden DNA mit Kernproteinen (z. B. HMG-1) läßt sich eine erhöhte Integration und Expression des Fremdgens nach Verkapselung bzw. Assoziation in DAC-Chol/DOPE-Liposomen erreichen. Eine weitere Erhöhung der Aufnahme (Fusion) der DAC-Chol-Liposomen ist möglich, wenn man Fusionsproteine bzw. inaktivierte Viren in die Liposomenmembran rekonstituiert bzw. assoziiert.
Von Vorteil ist ferner, daß man diese Liposomen ohne nennenswerte Toxizitäten bzw. Immunreaktionen über automatische oder nachfüllbare Pumpsysteme zum direkten in vivo-Gentransfer (intratumoral bzw. Organ-spezifisch) verabreichen kann. Mit dieser Methode, die auch für andere Liposomen anwendbar ist, wird eine im Vergleich zu retroviralen bzw. adenoviralen in vivo-Methoden eine weit höhere Transfektionseffektivität erreicht. Damit können Tumorzellen, die sich in unterschiedlichem Maße zu einem bestimmten Zeitpunkt in Proliferation befinden, transfiziert und abgetötet werden.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
Ausführungsbeispiele 1. Herstellung von 3ß(N-(N,N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl)- cholesterol (DAC-Chol)
Die symmetrische Form von Dimethylethylendiamin wird nach der Vorschrift von Gao et al (Biochem. Biophys. Res. Comm. 179; 280) mit Chlorformylcholesterol umgesetzt. Das erhaltene ölige Produkt wird einer Säulenchromatographie (Silicagel 60, Laufmittel Trichlormethan/Methanol = 9 : 1) unterworfen. Das abgetrennte DAC-Chol besitzt nach der dünnschichtchroma­ tografischen Reinigung (Laufmittel: Trichlormethan/Methanol = 65 : 35) einen Rf-Wert von 0,53-0,57.
Für die weitere Verwendung wird DAC-Chol mit DOPE im Verhältnis 3 : 2 gemischt.
2. Marker- und TNF-alpha-Gentransfer mit kationischen Liposomen in Vergleich zur Calciumphosphat-Präzipitationstechnik (CPPT) in vitro
Der Marker-Gentransfer führt zu einer vierfach höheren Transfektionsrate für kationische Liposomen als mit der CPPT- Methode. Die humanen Zellinien N64 und N31 zeigen beim Vergleich mit den üblichen Transfektionsmethoden (CPPT) eine 4-10fach höhere Transfektionsrate bei Verwendung von DAC-Chol/DOPE- Liposomen. Beim Einsatz von F98 Glioblastoma-Zellen von Ratten werden jedoch nur geringe Unterschiede beobachtet. Interessanterweise ist die Präparation gemäß der Erfindung trotz des aus dem DNA-Anteil resultierenden hohen Gehaltes an DAC-Chol/DOPE-Liposomen nicht toxisch, was sowohl anhand von Vitalitätstesten (MTT) als auch an morphologischen Parametern nachgewiesen werden kann.
Tabelle 1
Maximale Transfektionseffizienz (aus 3 Experimenten, in % der transfizierten Zellen (5 × 10-9, 5 mg DNA (pBAG))
Tabelle 2
hTNF Expression nach Gentransfer von F98 Zellen
Die Resultate sind ein Mittel aus 4 Experimenten + Standardabweichung. Der t-Test für unabhängige Proben zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen den Ergebnissen der 3 Techniken.
Die hTNF-Sekretion nach dem Transfer mit den verschiedenen Methoden liegt zwischen 1-2 ng/ml. Die ausgeschiedene TNF-alpha Menge bewirkt eine deutliche Wachstumshemmung von F98-Zellen innerhalb von 5 Tagen. Die Wachstumshemmung wird von morphologischen Änderungen und vom Zelltod begleitet. F98- Zellen, die mit dem leeren (pWG29del3-)Vektor transfiziert wurden, exprimierten keine nachweisbaren Mengen von TNF und erwiesen sich als morphologisch intakt.
3. Die Stimulierung der TNF-alpha Expression von DAC-Chol-Liposomen durch Dexamethason
Tabelle 3
Dexamethason-stimulierte Expression von hTNF in transfizierten Zellen
Dexamethason kann die hTNF-Produktion in F98 Zellklonen, gewonnen nach Transfektion mit DAC-Chol-Liposomen, bis zum 18fachen steigern. Ausgehend von den vorhergehenden Ergebnissen werden kationische DAC-Chol-Liposomen für den in vivo-Marker Gentransfer ausgewählt.
4. LacZ Gentransfer mit DAC-Chol/DOPE Liposomen in vivo
Nach dem in vivo-Marker Gentransfer mittels DAC-Chol-Liposomen in implantierte Rattentumore (F98, 6 mg LacZ/10 ml DAC- Chol/DOPE) konnte nachgewiesen werden, daß diese Liposomen beim direkten Gentransfer in der Lage waren, bis zu 3 Zellschichten um die Injektionsebene herum zu transfizieren (gemessen an einer positiven X-Gal-Färbung). In normalem Hirngewebe konnte dagegen keine Färbung durch endogene β-Galactosidase nachgewiesen werden.
5. In vivo Gentransfer mit DAC-Chol/DOPE Liposomen nach Pumpapplikation
Das in Chloroform gelöste kationische Cholesterolderivat (DAC- Chol, 304 mg) wird mit der chloroformischen Lösung des Helferlipids Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE, 195,5 mg), in unterschiedlichen molaren Verhältnissen gemischt und das Lösungsmittel am Rotationsverdampfer entfernt. Den dabei entstandenen Lipidfilm, der unter N2-Strom zur vollständigen Entfernung des Chloroforms 2 Stunden nachgetrocknet wird, hydratisiert man anschließend mit 500 ml 20 mM PBS-Puffer pH 7,4 bzw. serumfreiem Medium, in dem sich 100 mg eines Markergens [z. B. pUT 651 (β-Gal-Gen Vector) oder pUT 650 (Luciferase-Gen- Vektor)] bzw. eines Therapiegens [z. B. pUT 649 Thymidikinase- Gen-Vektor, (Suicidgenvektor), Zyzokingen-Vektoren] befindet. Die Suspension wird kurzzeitig beschallt (Badbeschaller), um eine Partikelgröße von 100-120 nm zu erreichen.
Dieser Liposomen/DNA-Komplex ist über einen Zeitraum von mindestens 3 Tagen bei 37°C biologisch aktiv (gemessen an der Transfereffizienz des Markergens) und stabil, d. h. er zeigt während dieser Periode keinerlei Präzipitationsneigung.
Im Anschluß an die Präparation des Liposomen/DNA-Komplexes wird dieser entweder über ein kontinuierliches Applikationssystem (z. B. Pumpapplikation) oder durch wiederholte Einzelgaben über Kathetersysteme, mit/ bzw. ohne Reservoir oder unterbrechbaren Pump- bzw. Infusionssystemen in vivo verabreicht (z. B. stereotaktische Implantation eines Kathetersystems in einen Hirntumor bzw. die Tumorhöhle).
6. In vitro und in vivo Transfer von Oligonukleotiden
Die Lipidfilmherstellung erfolgt wie in Bsp. 5 beschrieben. Im entsprechenden Puffer oder serumfreien Medium werden dem Lipidfilm bzw. den präformierten Liposomen (5 µM) 0,5 µM Oligo­ nukleotide (hCD44/Sense und Antisense; 21 Basenpaare, hCD56/Sense und Antisense) zugesetzt. In Abhängigkeit von der biologischen Stabilität der Komplexe lassen sich diese z. B. in vitro 4 h mit CD44 expremierenden Glioblastomzellen (U373) inkubieren. Dies führt zur 98%igen Blockade der DC44 Expression, wie aus der Tabelle 4 in Zusammenhang mit den Abb. 1 und 2 entnommen werden kann. Für die in vivo Anwendung sind die im Bsp. 5 ausgeführten Applikationsarten anwendbar.
Tabelle 4
Expression von Adhäsionsmolekülen durch humane Glioblastomzellinien
7. Herstellung von Liposomen mit rekonstituierten Fusions­ proteinen zum Gen- und Oligonukleotidtransfer
10 mg F und/oder HN-Protein des Sendai Virus oder die Fusionsproteine anderer Viren bzw. artifiziell hergestellte Proteine werden mit verschiedenen Phospholipiden (z. B. PC, PS, SM, CH, mit 2,5-10 mg) ggf. unter Zusatz eines Detergens (Bsp. Triton X 100) gemischt, das Detergens wird durch Dialyse, Säulentrennung "Biobead"-Behandlung oder Zentrifugation entfernt und ggf. in Anwesenheit von 2 mM CaCl2, werden die gewählten Genkonstrukte mit bzw. ohne vorherige Komplexierung durch Kernproteine (z. B. HMG-1) oder geeignete Kationen (z. B. Poly-L-Lysin) bzw. Oligonukleotide im Puffer zugesetzt.
Mit diesen Liposomensuspensionen inkubiert man dann in unterschiedlichen Zeit- und Konzentrationsprogrammen Glio­ blastomazellen, Lebertumorzellen, Nierenzellen usw. in vitro bzw. wie in Bsp. 5 beschrieben in vivo (Bestimmung der Transfereffizienz).
8. Herstellung von Immunliposomen zum Gen- und Oligo­ nukleotidtransfer
Zur Herstellung von Anti-CEA, Anti Thy 1.1., Anti-CD44, Anti- CD56 wurden modifizierte Antikörper an verschiedene Liposomentypen mit "Anker" gekoppelt.
Sie setzen sich aus an Phosphatidylethanolamin (PE) gekoppeltem Succinidyl-4-(p-maleinimidophenyl)-butyrat (SMPB) zusammen. Über diese Anker werden mit Succinimidyl-S- acetylthioacetat (SATA)-modifizierte monoklonale Antikörper kovalent an die Liposomen gebunden. In einem Rundkolben vereinigt man 42,2 mg SMPB, mit einer Lösung von 16,88 µl (118,16 µmol) Triethylamin in Methanol (5 ml, wasserfrei) und gibt nach vollständigem Auflösen der beiden Substanzen 88,62 mg in Chloroform gelöstes PE hinzu. Die Kopplungsreaktion findet durch Rühren des vor Tageslicht geschützten Ansatzes unter Stickstoffatmosphäre statt (3 h). Anschließend erfolgt eine DC-Kontrolle (Laufmittel: Chloroform: Methanol: Wasser = 65 : 25 : 4). Danach wird die Methanol/Chloroform-Phase am Rotationsverdampfer entfernt. Der entstandene gelbe Lipidfilm wird in 15 ml Chloroform gelöst und mit einer 0,9%igen Natriumchloridlösung (2×, je 15 ml) extrahiert. Die Abtrennung der Phasen erfolgt durch Zentrifugation (23°C, 15 min., 5000 U/min.). Die obere Phase wird verworfen und die gesammelten restlichen Phasen mit Natriumsulfat getrocknet. Die Chloroformphase wird eingeengt, die Masse des Rückstandes bestimmt und ein DC angefertigt. Die säulenchromatographische Trennung des MPB-PE erfolgt durch Gradientenelution. Während der Immunliposomenpräparation werden in der Phase der Anker-Liposomenbildung die DNA- bzw. die Oligonukleotidkonstrukte in das Innere der Vesikel eingeschlossen. In anschließenden Gentransferexperimenten läßt sich die Transfereffizienz und die biologische Wirksamkeit nachweisen.
9. Immunliposomen mit fusogener Komponente zum Gentransfer
Die DNA wird mit Polykationen (z. B. Poly-L-Lysin) komplexiert, so daß sehr kleine Partikel (ca. 15 nm) entstehen. Durch temporäre Kopplung eines lipophilen Ankermoleküls wird eine erhöhte Partizipation an den liposomalen Membranen bei der Herstellung der Vesikel erzielt. Die Poly-L-Lysin-DNA- Komplexe, die dabei auf der Liposomenaußenseite verankert werden, können durch die chemische Spaltbarkeit der Kopplungsgruppe (zwischen Poly-L-Lysin und der lipophilen Ankergruppe) anschließend wieder abgetrennt werden. Die Verankerung der 'targeting'-Komponenten (hCEA und modifiziertes Transferin), die der Bindung und Aufnahme in die Zielzelle dienen, läßt sich auf der Außenseite der Liposomen durch chemisches Crosslinking ermöglichen. Dafür wurde ein liposomal verankerter Crosslinker verwendet. Die so hergestellten Liposomen haben einen Durchmesser von <200 nm und sind Oligolamellar. Die spaltbare Koppplungsgruppe kann chemisch unterschiedlicher Natur sein. Der Ethylenglycol-bis- Succinimidylsuccinat-Crosslinker kann durch Hydroxylamin bei pH 8,5 gespalten werden.
Legende zu den Abbildungen
Abb. 1
Durchflußzytometrische Messung des Effekts von CD44 Antisense Oligonukleotiden auf die Expression des Adhäsionsmoleküls CD44 (U343 Zellen).
Abb. 2
Effekt von CD44 Antisense auf das Invasionsverhalten von Glioblastomzellen
Hemmung der Invasion von U373 MG Zellen (humane Glioblastomzellen) in vitro durch CD44 Antisense Oligonukleotide. Die U373 MG Zellen werden zunächst mit 1 µM Liposomen (kationische) 48 h inkubiert. Anschließend gewinnt man die Zellen für den Invasionsassay.

Claims (4)

1. 3β[N-(N,N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterol (DAC- Chol)
2. Verfahren zur Herstellung von DAC-Chol, dadurch gekenn­ zeichnet, daß man N,N'-Dimethylethylendiamin und Chlorformyl­ cholesterol in äquimolaren Mengen miteinander umsetzt und das erhaltene Produkt durch Chromatographie reinigt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reinigung säulenchromatographisch mit Silicagel und dem Fließmittel Trichlormethan/Methanol 9 : 1 und nachfolgend dünnschichtchromatographisch mit dem Fließmittel Trichlor­ methan/Methanol 65 : 35 durchführt.
4. Verwendung von DAC-Chol für den direkten liposomalen Gentransfer in vivo, durch kontinuierliche oder in gezielten Zeitintervallen wiederholt durchgeführte Applikation unter Einsatz von automatischen oder nachfüllbaren Pumpsystemen.
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