DE69822473T2

DE69822473T2 - Lipid-polyamid-konjugate und zusammensetzungen zur verabreichung von nucleinsäuremolekülen

Info

Publication number: DE69822473T2
Application number: DE69822473T
Authority: DE
Inventors: Ronald N. Zuckermann; Carol Huang; John E. Murphy; Tetsuo Uno
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1997-08-13
Filing date: 1998-08-13
Publication date: 2004-12-23
Anticipated expiration: 2018-08-14
Also published as: JP3941854B2; US7214384B2; JP2007161722A; JP2001515051A; US6197332B1; US6572881B1; WO1999008711A1; US6569450B1; US20050101525A1; DE69822473D1; EP1003558A1; US20040018962A1; US6982092B2; EP1003558B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen, Verfahren zur Herstellung derselben wie auch Zusammensetzungen und Verfahren zu ihrer Verwendung, zum Beispiel bei der Abgabe biologisch aktiver Agenzien an Zellen.
Die Entdeckung neuer therapeutischer Agenzien, die eine zunehmend komplexe Molekülstruktur haben, hat neue Herausforderungen gebracht, wie diese wirksam an der Zielstelle abgegeben werden können. Beispielsweise haben neuere Entwicklungen in der DNA-Rekombinationstechnologie und bei der Charakterisierung des humanen Genoms eine Identifizierung molekularer Ursprünge vieler genetischer und erworbener Krankheiten und die Konstruktion geeigneter Plasmide, die gewünschte Gene enthalten, ermöglicht. Allerdings bleibt die effiziente Abgabe dieser großen und stark geladenen Konstrukte, die Molekulargewichte von bis zu 10 Millionen Dalton haben und die mehrere zehntausend negative Ladungen enthalten, in Zellen eine große Herausforderung. Untersuchungen, die die Verwendung von neutralen und kationischen Liposomenstrukturen als Vehikel für die Abgabe von Polynucleotiden an Zellen beurteilen, hatten begrenzten Erfolg, da diese eingekapselten Strukturen groß und instabil sind.
Dementsprechend besteht ein starker Bedarf an Verbindungen, die als wirksame Vehikel für die effiziente Abgabe bzw. den Transport großer komplexer Agenzien, zum Beispiel Polynucleotide, an Zellen verwendet werden können.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen und Zusammensetzungen derselben, die insbesondere bei der Abgabe bzw. beim Transport von bioaktiven Agenzien in Zellen einsetzbar sind. Die vorliegende Er findung stellt spezifisch Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen mit der folgenden allgemeinen Formel bereit:
die ein sich wiederholendes Trimer aus monomeren Untereinheiten umfasst und die folgende Formel hat:
wobei
m eine ganze Zahl, ausgewählt aus dem Bereich von 2 bis etwa 48, ist,
Ra ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -H, -SH, -COOH, Sulfonyl, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder -Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor, umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann;
jedes R₁ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor, umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; wobei weniger als etwa 75% der sich wie derholenden Einheiten ein R₁ umfassen, welches Wasserstoff ist;
Rc ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -H, -SH, -NH₂, Sulfonyl, Hydrazin, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor, umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; und
jede Gruppe W ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂-Phenyl, -CH₂CH₂O-, CH₂CH=CH und -CR₂R₃-, wobei R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor, umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann;
und wobei
jede Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen außerdem mindestens ein Heteroatom umfasst;
mindestens eine Gruppe ausgewählt aus Ra, Rc, R₁ in einer einzelnen monomeren Untereinheit, und W in einer einzelnen monomeren Untereinheit eine Lipidgruppierung umfasst;
und die Lipidgruppierung ausgewählt ist aus einem Phosphoglycerid, einem Glycosylglycerid, einem Sphingolipid, einem ge sättigten oder ungesättigten Sterol und einer Fettsäure oder einem Fettalkohol mit 8 bis ungefähr 24 Kohlenstoffatomen.
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen können hergestellt werden durch:

a) Inkontaktbringen
(1) eines Lipidreaktanten mit
(2) einem Oligomerreaktanten, wobei der Oligomerreaktant die folgende allgemeine Formel hat:
worin n eine ganze Zahl, ausgewählt aus dem Bereich von 1 bis 48, ist und m eine ganze Zahl von etwa 2 bis etwa 48 ist, wobei T_a und T_c unabhängig voneinander aus einer terminalen Gruppe und einer reaktiven Gruppierung, welche zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist, ausgewählt sind, wobei R₁ für jede monomere Einheit,
in dem Oligomerreaktanten ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Wasserstoffatom, einer Hydroxygruppe, einer Aminogruppe, einer Carboxylgruppe, einer Sulfonylgruppe, -SH, einer gegebenenfalls substituierten, verzweigten oder geradkettigen aliphatischen Gruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält, wobei die aliphatische Gruppe gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat; einer gegebenenfalls substituierten Arylgruppe, die von etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur hat, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält; einer gege benenfalls substituierten Arylalkylgruppe, die etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur hat, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält, wobei die Alkylgruppe des Arylalkyls gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat; und einer reaktiven Gruppierung, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist; wobei, wenn R₁, R_a oder R_c eine Aryl- oder Arylalkylgruppe mit weniger als etwa 5 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur ist, diese Hauptkettenstruktur außerdem ein Heteroatom oder mehrere Heteroatome umfasst; wobei R₁ bei mindestens einer monomeren Einheit kein Wasserstoffatom ist; wobei W für jede monomere Einheit ausgewählt ist aus einer gegebenenfalls substituierten, verzweigten oder geradkettigen zweiwertigen Gruppierung, die 1 bis etwa 50 Atome in der Hauptkette hat, die Kohlenstoff enthält und gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält und gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen enthält, wobei die optionale Substitution von W eine reaktive Gruppierung sein kann, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist; wobei mindestens einer der Reste T_a, T_c, W für eine einzelne monomere Einheit oder R₁ für eine einzelne monomere Einheit eine reaktive Gruppierung umfasst, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist; dann
b) Umsetzen des Lipidreaktanten mit dem Oligomerreaktanten, um den Lipidreaktanten mit dem Oligomerreaktanten zu verknüpfen.

In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die eine Lipidverknüpfte Polyamidverbindung der vorliegenden Erfindung und ein biologisch aktives Agens umfasst.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Induzieren der Aufnahme eines biologisch aktiven Agens durch eine Zelle in vitro bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Bereitstellen einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines biologisch aktiven Agenses und eine Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung der vorliegenden Erfindung umfasst; dann
Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einer wirksamen Dosis der Zusammensetzung in vitro,
wobei die biologische Probe eine Zelle umfasst.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer solchen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zum Induzieren der Aufnahme eines biologisch aktiven Agens durch eine Zelle in vivo durch Verabreichen der Zusammensetzung und des Agenses an eine Person bereit.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Nucleinsäure komplexiert mit einer Lipid-verknüpften Polyamidverbindung umfasst, zur Herstellung eines Medikaments für die Expression eines Gens in einem Säuger bereit, wobei die Nucleinsäure dazu in der Lage ist, das Gen in dem Säuger funktionell zu exprimieren, und der Komplex das Gen wirksam in eine Zelle in dem Säuger transfiziert.
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren bereit, um den Nuklease-induzierten Polynucleotid-Abbau im Wesentlichen zu inhibieren, wobei das Verfahren umfasst:
Inkontaktbringen eines Polynucleotids mit einer den Abbau inhibierenden Menge der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung und Einbringen des Polynucleotids und der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung in eine Nuklease-enthaltende Umgebung.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer stabilen Zubereitung einer Polynucleinsäure komplexiert mit einem Transportvehikel, wobei das Verfahren umfasst:

a) Bereitstellen einer Polynucleinsäure in einem ersten flüssigen Trägerstoff als verdünnte Polynucleinsäurelösung, die im Wesentlichen Fällmittel-frei ist;
b) Bereitstellen einer Transportvehikel-bildenden Verbindung in einem zweiten flüssigen Trägerstoff als Transportvehikellösung, die im Wesentlichen Fällmittel-frei ist;
c) Kombinieren der verdünnten Polynucleinsäurelösung mit der Transportvehikellösung, um eine verdünnte Zubereitung aus Transportvehikel/Polynucleinsäure-Komplex zu bilden; und
d) Reduzieren des Volumens der verdünnten Zubereitung, um eine stabile Zubereitung aus Transportvehikel/Nucleinsäure-Komplex zu bilden,

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Reaktionsschema zur Herstellung von Lipidverknüpften Polyamidverbindungen.
2 ist eine Plasmidkarte von Vektor CMVkm2.
3 zeigt den Effekt des +/–-Ladungsverhältnisses eines Komplexes von Plasmid-DNA (pCMVkmLUC) und eines Lipidverknüpften Polyamids der vorliegenden Erfindung (d. h. Verbindung 16 aus Tabelle 2) auf die Transfektion von HT1080-Zellen. Die Luciferaseaktivität in transfizierten Zellen wird auf der y-Achse in (pg/20 μl) gezeigt und das +/–-Ladungsverhältnis ist auf der x-Achse aufgetragen. Die nicht ausgefüllten Balken beziehen sich auf Zellen, die in FCS-ergänztem Medium gewachsen sind, und die ausgefüllten Balken beziehen sich auf Zellen, die in OptiMEM (d. h. Serum-freiem Medium) gewachsen sind.
4 zeigt die Beziehung zwischen Transfektionseffizienz und Gesamtzahl der monomeren Einheiten in der oligomeren Gruppierung von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung. Die Luciferaseaktivität (alle normalisiert gegenüber Luciferaseaktivität, die dem 36-mer entspricht (d. h. m = 12)) in transfizierten HT1080-Zellen ist auf der y-Achse aufgetragen und die Oligomerlänge ist auf der x-Achse aufgetragen. Die Lipid-verknüpften Polyamid/DNA-Komplexe hatten ein +/–-Ladungsverhältnis von 2 : 1.
5 zeigt einen Vergleich bei der Transfektionseffizienz zwischen DMPE-verknüpften Polyamidverbindungen (d. h. Verbindungen 16 und 23) und DOPE-verknüpften Polyamidverbindungen (d. h. Verbindungen 20 und 24). Die nicht ausgefüllten Balken beziehen sich auf Zellen, die in FCS-ergänztem Medium gewachsen sind, und die ausgefüllten Balken beziehen sich auf Zellen, die in OptiMEM (d. h. Serum-freiem Medium) kultiviert wurden.
6 zeigt die Luciferaseexpression in Lungen-, Leber- und Milzgewebe von Balb/C-Mäusen nach einer in vivo-Transfektion mit Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung (Verbindung 16)/pCMVkmLUC-Komplex (+/–-Ladungsverhältnis 8 : 1). Die Luciferaseexpression wurde 24 Stunden nach intravenöser Injektion des Lipid-verknüpften Polyamids gemessen.
7 zeigt die Zeta-Potential-Stabilität über einen Zeitraum von 8 Tagen für eine Lipid-konjugiertes Polyamid (Verbindung 16)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, die durch das erfindungsgemäße „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren hergestellt wurde.
8 zeigt die Zeta-Potential-Stabilität über einen Zeitraum von 8 Tagen für eine Lipid-konjugiertes Polyamid (Verbindung 23)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, die durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren hergestellt wurde.
9 zeigt die Partikelgrößenstabilität einer Lipidverknüpftes Polyamid (Verbindung 16)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, die durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren hergestellt wurde, über einen Zeitraum von 8 Tagen.
10 zeigt die Partikelgrößenstabilität einer Lipidkonjugiertes Polyamid (Verbindung 23)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, die durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren hergestellt wurde, über einen Zeitraum von 8 Tagen.
11 erläutert die Stabilität einer Lipid-verknüpftes Polyamid (Verbindung 16)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, die durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren hergestellt wurde, und einer DMRIE-C^TM/DNA-Komplex-Formulierung, die durch ein herkömmliches Formulierungsverfahren hergestellt wurde. HT1080-Zellen wurden zwei Tage nach der Formulierung mit Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplex und mit DMRIE-C^TM/DNA-Komplex unmittelbar nach der Formulierung transfiziert. Resultate sind für transfizierte Zellen gezeigt, welche in FCS-ergänztem Medium und optiMEM-Medium kultiviert worden waren.
12 veranschaulicht die Stabilität einer Lipidverknüpftes Polyamid (Verbindung 16)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex (+/–-Ladungsverhältnis 2 : 1)-Formulierung, hergestellt durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren, und einer DMRIE-C^TM/DNA-Komplex-Formulierung, hergestellt durch ein herkömmliches Formulierungsverfahren. HT1080-Zellen wurden 18 Tage nach der Formulierung mit Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplex transfiziert und mit DMRIE-C^TM/DNR-Komplex unmittelbar nach der Formulierung transfiziert. Die Resultate sind für transfizierte Zellen gezeigt, welche sowohl in FCS-ergänztem Medium wie auch in optiMEM-Medium kultiviert worden waren.
13 veranschaulicht die Stabilität einer Lipidverknüpftes Polyamid (Verbindung 23)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, hergestellt durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren und einer DMRIE-C^TM/DNA-Komplex-Formulierung, hergestellt durch ein herkömmliches Formulierungsverfahren. HT1080-Zellen wurden mit dem Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplex 4 Tage nach der Formulierung und mit dem DMRIE-C^TM/DNA-Komplex unmittelbar nach seiner Formulierung transfiziert. Die Resultate sind für transfizierte Zellen gezeigt, welche sowohl in FCS-ergänztem Medium als auch in optiMEM-Medium kultiviert worden waren.
14 veranschaulicht die Stabilität einer Lipidverknüpftes Polyamid (Verbindung 23)/DNA (pCMVkmLuc)-Komplex-Formulierung, hergestellt durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren, und einer DMRIE-C^TM/DNA-Komplex-Formulierung, hergestellt durch ein herkömmliches Formulierungsverfahren. HT1080-Zellen wurden mit dem Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplex 12 Tage nach Formulierung und mit dem DMRIE-C^TM/DNA-Komplex unmittelbar nach Formulierung transfiziert. Gezeigt sind auch die Effekte einer Verdoppelung der Menge des Transfektionsmediums auf die Transfektionseffizienz. Die Resultate sind für transfizierte Zellen gezeigt, die sowohl in FCS-ergänztem Medium als auch in optiMEM-Medium kultiviert wurden.
15 veranschaulicht die Transfektionseffizienz unter Verwendung eines herkömmlichen und eines „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahrens. „Mischen" bezieht sich auf ein herkömmliches Formulierungsverfahren (in dem das Transportvehikel und DNA unmittelbar vor der Transfektion vermischt wurden). „Vorgeformt" bezieht sich auf eine Formulierung von Transportvehikel/DNA-Komplexen durch das „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren, gefolgt von einer Transfektion 1 bis 5 Tage später. Die Zelltoxizität ist ebenfalls gezeigt. Resultate sind für transfizierte Zellen angegeben, welche in FCS-ergänztem Medium kultiviert worden waren.
Allgemeine Verfahren und detaillierte Beschreibung
Die Ausdrücke „Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung" und „Lipid-verknüpfte Verbindung" werden hierin austauschbar verwen det, um erfindungsgemäße Verbindungen zu bezeichnen, die sowohl eine oligomere Amidgruppierung als auch eine oder mehrere Lipidgruppierung(en) haben.
Die Ausdrücke „oligomer" und „oligomeres Amid" werden hier austauschbar verwendet, um 2 oder mehr Monomereinheiten zu bezeichnen, die durch eine Amidbindung miteinander verknüpft sind; d. h.
Der Ausdruck „Monomer" oder „monomere" Einheit bezieht sich auf die Einheit, die durch die folgende Formel definiert ist:
Der Ausdruck „Lipid", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine hydrophobe oder amphipatische Gruppierung. Eine Lipidgruppierung kann direkt an die oligomere Amidgruppierung gebunden sein oder kann gegebenenfalls indirekt über eine Linkergruppierung an die oligomere Amidgruppierung gebunden sein.
Die Ausdrücke „oligemerer Reaktant", „Oligomerreaktant" und „oligomerer Amidreaktant" und „Lipidreaktant" betreffen hier reaktive Spezies, aus denen Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindungen synthetisiert werden.
Der Ausdruck „Hauptkette" bezieht sich hierin auf die Gerüststruktur einer Gruppierung, die typischerweise entweder eine geradkettige, verzweigte oder cyclische Anordnung von kovalent gebundenen Kohlenstoff- oder Heteroatomen ist (d. h. die Gerüststruktur umfasst keines der Wasserstoffatome oder alternativ Substitutionsgruppen, die daran gebunden sind).
Der Ausdruck „gegebenenfalls substituiert", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf den Ersatz von Wasserstoff mit einem einwertigen Rest, z. B. Hydroxyl-, Carboxyl-, Phosphor, Amino-, Halogen-, Alkyl-, Aryl-, Arylalkyl-, Thioamido-, Amido-, Nitro-, Cyano-, Halogenalkyl- und dergleichen.
Der Ausdruck „aliphatisch" bezieht sich hierin auf geradkettige, verzweigte und cyclische Verbindungen, die keine aromatischen Eigenschaften haben, die Kohlenstoffatome und gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome (d. h. eine oder mehrere funktionelle Gruppen, z. B. ein substituiertes Amino, ein Alkoxy, ein Carbonyl, ein Ester und dergleichen) und gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen (d. h. Alkenyl bzw. Alkinyl) enthalten.
Der Ausdruck „Aryl", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf aromatische Gruppen wie z. B. monocyclische und polycyclische aromatische Gruppen, die ein oder mehrere Heteroatome eingebaut haben (z. B. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor). Der Ausdruck „polycyclisch" bezieht sich hierin sowohl auf eine kondensierte als auch eine nicht kondensierte cyclische Struktur, in der mindestens eine cyclische Struktur aromatisch ist. Beispiele für Arylgruppierungen umfassen Phenyl, Naphthyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Arylalkyl" bezieht sich hierin auf eine Alkylgruppe, die optionale funktionelle Gruppen eingebaut hat und mit einer Arylgruppe substituiert ist. Beispiele für Arylalkylgruppierungen umfassen Benzyl, Picolyl und dergleichen.
Der Ausdruck „Transportvehikel", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Verbindung und/oder Struktur, die mit einer biologisch aktiven Verbindung Komplexe bildet und die Abgabe einer biologisch aktiven Verbindung an eine Zielstelle erleichtert. Geeignete Transportvehikel, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen z. B. Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung, Lipide, polykationische nicht-Lipidverbindungen, Liposome und dergleichen.
Der Ausdruck „Komplex", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Struktur, die durch Wechselwirkung zwischen 2 oder mehreren Verbindungen oder Strukturen gebildet wird. Eine solche Wechselwirkung kann über chemische Wechselwirkung, die z. B. kovalente, ionische oder sekundäre Bindungen (z. B. Wasserstoffbrückenbindung) und dergleichen, oder über physikalische Wechselwirkung, wie z. B. Einkapselung, einschließen, und dergleichen, erfolgen.
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung können z. B. mit einer biologisch aktiven Verbindung mit niedrigem Molekulargewicht (einschließlich z. B. Oligonukleotide) über kovalente Bindung durch eine dazwischen positionierte Aminosäuresequenz, die geeignet ist, durch endogene proteolytische Enzyme abgebaut zu werden, komplexiert werden. So führt das Aussetzen des Komplexes Abbauenzymen zu einer Spaltung und anschließenden Freisetzung der biologisch aktiven Verbindung aus dem Komplex. Lipid-konjugierte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung können auch mit biologisch aktiven Verbindungen wie Polynucleotide über ionische oder sekundäre Bindung oder alternativ über Einkapselung oder Einschluss einen Komplex bilden.
Die Ausdrücke „Polynucleotid" und „Polynucleinsäure" werden hierin austauschbar verwendet, um DNA, RNA und Analoga davon, Peptidnukleinsäuren wie auch DNA oder RNA, die nicht-Phosphat-enthaltende Nukleotide haben, zu bezeichnen. Polynucleotide, die in der Praxis der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, können einzelsträngige, doppelsträngige oder chimere einzel- oder doppelsträngige Moleküle sein.
LIPID-VERKNÜPFTE POLYAMIDVERBINDUNGEN
Die vorliegende Erfindung stellt Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der folgenden allgemeinen Formel bereit
wobei
m eine ganze Zahl, ausgewählt aus dem Bereich von 2 bis etwa 48 ist,
Ra ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -OH, -H, -SH, -COOH, Sulfonyl, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder -Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor, umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann;
jedes R₁ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder -Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor, umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; wobei weniger als ungefähr 75% der sich wiederholenden Einheiten ein R₁ umfassen, welches Wasserstoff ist.
Rc ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -H, -SH, -NH₂, Sulfonyl, Hydrazin, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; und
jede Gruppe W ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂-Phenyl-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH=CH- und -CR₂R₃-, wobei R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12-Aryl-, -Arylalkyl-, -Arylalkenyl- oder -Arylalkinyl-Gruppe, von denen mindestens ein Heteroatom, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann;
und wobei
jede Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen außerdem mindestens ein Heteroatom umfasst;
mindestens eine Gruppe, ausgewählt aus Ra, Rc, R₁ in einer einzelnen monomeren Untereinheit und W in einer einzelnen monomeren Untereinheit eine Lipidgruppierung umfasst;
und die Lipidgruppierung ausgewählt ist aus einem Phosphoglycerid, einem Glycosylglycerid, einem Sphingolipid, einem gesättigten oder ungesättigtem Styrol und einer Fettsäure oder einem Fettalkohol mit 8 bis ungefähr 24 Kohlenstoffatomen.
Die ganze Zahl m ist typischerweise nicht mehr als 40, noch typischer nicht mehr als etwa 25. Üblicherweise ist die ganze Zahl m nicht mehr als etwa 15, typischerweise nicht mehr als etwa 12 und noch typischer nicht mehr als etwa 8.
Heteroatome (d. h. Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor), die in die Hauptkettenstruktur aliphatischer Gruppierungen und die Alkylkomponente von Arylalkylgruppierungen eingebaut sind, bilden typischerweise eine funktionelle Gruppe, z. B. ein substituiertes Amin, ein Carbonyl, ein Alkoxy, einen Ester und dergleichen. Somit haben aliphatische und Arylalkylgruppierungen, die in den erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, gegebenenfalls eine funktionelle Gruppe oder mehrere funktionelle Gruppen darin eingebaut. Heteroatome, die in die Hauptkettenstruktur von Arylgruppierungen eingebaut sind, sind als Ringatome in cyclischen Arylgruppierungen eingebaut.
Wenn R₁, Ra und Rc aliphatisch sind, enthalten sie typischerweise mindestens 2 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur und enthalten noch typischer mindestens etwa 3 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur. Aryl und Arylalkyl als R₁-, Ra- und Rc-Gruppen können linear oder cyclisch sein. Aryl und Arylalkyl als R₁, Ra und Rc, die weniger als etwa 5 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur haben, haben typischerweise ein oder mehrere Heteroatome in der Hauptkettenstruktur, z. B. Stickstoff und/oder Sauerstoff. Typischerweise haben Aryl und Arylalkyl als R₁, Ra und Rc mindestens etwa 5 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur.
Ra ist typischerweise -OH, -H, -SH, -COOH, Sulfonyl oder eine Lipidgruppierung, die gegebenenfalls an eine Linkergruppierung gebunden ist. Rc ist typischerweise -OH, -H, -SH, -NH₂, Sulfonyl, Hydrazin oder eine Lipidgruppierung, die gegebenen falls an eine Linkergruppierung gebunden ist. Vorzugsweise ist entweder Ra oder Rc eine Lipidgruppierung, die gegebenenfalls an eine Linkergruppierung gebunden bzw. mit dieser verknüpft ist.
R₁ kann eine Seitenkette sein, die bei physiologisch relevantem pH kationisch, anionisch oder neutral ist.
Physiologischer pH ist typischerweise mindestens etwa 5,5 und typischer mindestens etwa 6,0. Noch typischer ist physiologischer pH mindestens etwa 6,5. Üblicherweise ist physiologischer pH kleiner als etwa 8,5 und typischer kleiner als etwa 8,0. Noch typischer ist physiologischer pH kleiner als etwa 7,5. Geeignete kationische Seitenketten umfassen z. B. Aminoalkyl (z. B. Aminoethyl, Aminopropyl, Aminobutyl, Aminopentyl und dergleichen) wie auch Derivate davon; (S)-α-Methylethylendiamino und Derivate davon; Trimethylaminoethyl und Derivate davon; Guanidinoalkyl (z. B. Guanidionethyl, Guanidinopropyl, Guanidinobutyl, Guanidinopentyl und dergleichen, und Derivate davon); Aminobenzyl und Derivate davon; Pyridinium und Derivate davon und andere ähnliche kationische Gruppierungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet geläufig sind.
Geeignete neutrale Seitenketten umfassen z. B. (S)- oder (R)-α-Methylbenzyl und Derivate davon. Benzyl und Derivate davon; Phenethyl und Derivate davon; Naphthylmethyl und Derivate davon; (S)- oder (R)- α-Methylnaphthyl und Derivate davon; N-Propylpyrrolidinon und Derivate davon; Cyclohexylmethyl und Derivate davon; Furfuryl und Derivate davon; 3,4,5-Trimethoxybenzyl und Derivate davon; Methoxyethyl und Derivate davon; p-Methoxyphenethyl und Derivate davon; Isoamyl („IsoA") und Derivate davon; und andere ähnliche neutrale Gruppierungen, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Geeignete anionische Seitenketten umfassen z. B. Carboxymethyl, Carboxyethyl und dergleichen, und Derivate davon; Benzoesäure und Derivate davon; Phosphate und Derivate davon; Sulfate und Derivate davon; und andere ähnliche anionische Gruppierungen, die dem Fachmann bekannt sind.
Gegebenenfalls kann R₁ eine Gruppierung sein, die bei natürlich vorkommenden oder nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren gefunden wird oder R₁ kann eine Lipidgruppierung sein, die gegebenenfalls an eine Linkergruppierung gebunden ist. Der Ausdruck „natürlich vorkommende Aminosäure", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Ala, Cys, Asp, Glu, Phe, His, Ile, Lys, Leu, Met, Asn, Gln, Arg, Ser, Thr, Val, Trp und Tyr. Der Ausdruck „nicht natürlich auftretende Aminosäure" bezieht sich auf Aminosäuren, die typischerweise in der Natur nicht gefunden werden, einschließlich z. B. D-Isomere natürlich auftretender Aminosäuren, 2-Aminoadipinsäure, 2-Aminobuttersäure, Norvalin, Norleucin, Ornithin und dergleichen.
Typischerweise haben weniger als etwa 75% der sich wiederholenden Einheiten ein R₁, das Wasserstoff ist. Noch typischer haben weniger als etwa 50% der sich wiederholenden Einheiten ein R₁, das Wasserstoff ist. Noch typischer haben weniger als etwa 25% der sich wiederholenden Einheiten ein R₁, das Wasserstoff ist. Noch typischer ist R₁ für jede der monomeren Einheiten nicht Wasserstoff.
W ist typischerweise -CH₂CH₂,
(d. h. Toluylsäure) -CH₂CH₂-O-, -CH₂-CH=CH, oder (II) -CR₂R₃-, worin R₂ und R₃ für jede sich wiederholende Einheit einwertige Gruppierungen sind, die unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: einem Wasserstoffatom; einer Hydroxy-Gruppe; einer gegebenenfalls substituierten, verzweigten oder geradkettigen aliphatischen Gruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält, wobei die aliphatische Gruppe gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat; einer gegebenenfalls substituierten Arylgruppe, die etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatome in der Hauptkettenstruktur hat, welche gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält; einer gegebenenfalls substituierten Arylalkylgruppe, die etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur enthält, welche gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält, wobei die Alkylkomponente des Arylalkyls gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat; und einer Lipidgruppierung, die gegebenenfalls an eine Linkergruppierung gebunden ist,
wobei, wenn jedes R₂ und R₃ eine Aryl- oder Arylalkylgruppe mit weniger als etwa 5 Kohlenstoffatomen in der Hauptkettenstruktur ist, die Hauptkettenstruktur typischerweise ein Heteroatom oder mehrere Heteroatome umfasst, z. B. Sauerstoff und/oder Stickstoff.
Wenn R₂ und R₃ aliphatisch sind, enthalten sie typischerweise mindestens 2 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur und enthalten noch typischer mindestens etwa 3 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur. Die Aryl- und Arylalkylgruppen R₂ und R₃ können linear oder cyclisch sein. Die Aryl- und Arylalkylgruppen R₂ und R₃, die weniger als etwa 5 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur haben, haben typischerweise auch ein Heteroatom oder mehrere Heteroatome in der Hauptkettenstruktur, z. B. Stickstoff und/oder Sauerstoff. Typischer haben die Aryl- und Arylalkylgruppen R₂ und R₃ mindestens etwa 5 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur.
R₂ und R₃ sind typischerweise Gruppierungen, die natürlich auftretende oder nicht natürlich auftretende Aminosäuren sind. Üblicherweise ist mindestens einer der Reste R₂ und R₃ ein Wasserstoffatom. Am Typischsten sind R₂ und R₃ für alle monomeren Einheiten beide Wasserstoff, so dass Verbindung (I) eine Lipid-verknüpfte, N-substituierte Polyglycinverbindung ist.
Die Lipidgruppierung kann für ein Monomer oder mehrere Monomere an Ra, Rc, R₁ positioniert sein oder kann für ein Monomer oder mehrere Monomere an einer Substitutionsposition in W positioniert sein. Lipidgruppierungen können direkt an eine monomere Einheit gebunden sein oder können indirekt über eine Linkergruppierung an eine monomere Einheit gebunden sein.
Der Ausdruck „Linker", der hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Gruppierung, die zur Verknüpfung der oligomeren Amid- und Lipidgruppierungen miteinander derart wirkt, dass der molekulare Abstand zwischen den zwei Gruppierungen größer ist als bei einer direkten Bindung der Lipid- und oligomeren Rmidgruppierungen aneinander. Linkergruppierungen können relativ klein sein, 1 bis etwa 20 Atome in der Hauptkette haben oder alternativ polymer sein. Kleine Linkergruppierungen sind gegebenenfalls substituiert und haben typischerweise 1 bis etwa 20 Atome in einer Hauptkette (z. B. Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen). Typischerweise haben kleine Linkergruppierungen weniger als etwa 18 Atome in einer Hauptkette und typischer weniger als etwa 15 Atome in einer Hauptkette. Normalerweise haben kleine Linkergruppierungen weniger als etwa 10 Atome in einer Haupt kette und haben gegebenenfalls weniger als etwa 5 Atome in einer Hauptkette.
Linkergruppierungen können von bifunktionellen Molekülen wie z. B. 6-Aminohexansäure, 2-(2-(2-Aminoethoxy)ethoxy)ethoxyessigsäure und dergleichen, abgeleitet sein, die fähig sind, sowohl mit Oligomeren wie auch mit Lipidreaktanten zu reagieren. Linkergruppen können auch von Gruppen wie z. B. Acyl- und substituierten Acyl-Gruppen, Sulfonyl und substituierten Sulfonylgruppen und anderen ähnlichen reaktiven Gruppierungen abgeleitet sein, welche während einer chemischen Synthese verwendet werden, um eine Bindung der Lipidgruppierung an die oligomere Gruppierung zu erleichtern.
Polymere Linkergruppierungen sind gegebenenfalls substituierte (z. B. durch Hydroxy-, Carboxy-, Phospho-, Amino- und dergleichen), im Wesentlichen lineare Polymere mit einer Hauptkette, die Kohlenstoff und gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält. Polymere Linkergruppierungen haben ein durchschnittliches Molekulargewicht zwischen etwa 300 Dalton und etwa 15.000 Dalton, typischerweise von weniger als etwa 10.000, typischer von weniger als etwa 5.000 Dalton und noch typischer von noch weniger als etwa 3.000 Dalton und gegebenenfalls von weniger als etwa 1.000 Dalton. Geeignete polymere Linkergruppierungen umfassen z. B. Polyethylenglykole, Polypropylenglykole, Polyvinylalkohole, Polyvinylpyrrolidone und dergleichen.
Lipidgruppierungen sind hydrophobe Gruppierungen oder amphipatische Gruppierungen, die entweder neutral (d. h. haben keine Ladung oder eine Nettoladung von 0) oder geladen sind und die entweder natürlich sind oder synthetisch hergestellt sind. Typischerweise ist die Lipidgruppierung in Lipidverknüpften Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung amphipatisch.
Geeignete Lipidgruppierungen umfasssen: (1) Gegebenenfalls substituierte Aryl- oder Arylalkylgruppierungen mit 14 bis 50 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkettenstruktur, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält, wobei die Alkylkomponente der Arylalkylgruppierung gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat; (2) gegebenenfalls substituierte, verzweigte oder geradkettige aliphatische Gruppierungen, die 10 bis 50 Kohlenstoffatome in einer Hauptkettenstruktur haben, welche gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält und gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat.
Typischerweise haben Aryl- und Arylalkyllipidgruppierungen mindestens 16 Kohlenstoffatome und haben typischerweise mindestens 20 Kohlenstoffatome und sogar noch typischer mindestens 30 Kohlenstoffatome. Aliphatische Lipidgruppierungen, die in erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, haben typischerweise mindestens 12 Kohlenstoffatome und noch typischer mindestens 14 Kohlenstoffatome. Üblicherweise haben die aliphatischen Lipidgruppierungen mindestens 18 Kohlenstoffatome, üblicher mindestens 24 Kohlenstoffatome und noch üblicher mindestens 30 Kohlenstoffatome.
Die Anzahl der Lipidgruppierungen in erfindungsgemäßen Lipidverknüpften Polyamidverbindungen kann in Abhängigkeit vom gewünschten Grad der Hydrophobie variieren und wird auch mit der Oligomerlänge (d. h. n × m) und der Größe der Lipidgruppierung variieren. Wenn beispielsweise die Lipidgruppierung 30 Kohlenstoffatome oder weniger hat, werden erfindungsgemäße Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen typischerweise eine Anzahl von Lipidgruppierungen, die kleiner ist als die vom Computer als 90% der Gesamtzahl der monomeren Gruppen bestimmten Zahl (d. h. n × m) (d. h. wenn n = 3 und m = 3, dann ist die Anzahl der Lipidgruppierungen, die an die Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung geknüpft ist, typischerweise weniger als etwa 8) damit verknüpft haben. Wenn die Lipidgruppierung 30 Kohlenstoffatome oder weniger hat, haben die Lipidverknüpften Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung eine Anzahl von Lipidgruppierungen, die kleiner als etwa 80 der Gesamtzahl an monomeren Gruppen, typischer weniger als etwa 75% der Gesamtzahl der monomeren Gruppen und noch typischer weniger als etwa 60% der Gesamtzahl der monomeren Gruppen, ist, damit geknüpft.
Wenn die Lipidgruppierung mehr als etwa 30 Kohlenstoffatome hat, haben die erfindungsgemäßen Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen typischerweise eine Anzahl von Lipidgruppierungen gebunden, die weniger ist als die Zahl, die per Computer als 50% der Gesamtzahl an monomeren Gruppen bestimmt wurde.
Geeignete Lipidgruppierungen umfassen solche, die ein hydrophobes Ende oder mehrere hydrophobe Enden haben, die gegebenenfalls substituierte aliphatische, geradkettige Gruppierungen sind, wobei jedes hydrophobe Ende unabhängig etwa 8 bis etwa 30 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette hat, welche zusätzlich gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, Phosphor und dergleichen enthält. Typischerweise haben hydrophobe Enden mindestens etwa 10 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette und noch typischer mindestens etwa 12 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette. Hydrophobe Enden, die in Lipidverknüpften Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet werden, haben typischerweise nicht mehr als etwa 26 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette und noch typischer haben sie nicht mehr als etwa 24 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette.
Natürliche Lipidgruppierungen, die bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können z. B. von folgenden Verbindungen abgeleitet werden: Phospholipide, einschließlich z. B. Phosphoglyceride (einschließlich Acylphosphoglyceride (beispielsweise Phosphatitsäure, Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol, Phosphatidylinositolphosphat, Phosphatidylinusitolbiphosphat, Phosphatidylglycerin, Diphosphatidylglycerin und dergleichen) und Etherphosphorglyceride); Glycosylglyceride (z. B. Monogalactosyldiacylglycerin, Digalactosyldiacylglycerin, Sulfochinovosyldiacylglycerin, Dimanosyldiacylglycerin, Galactophoranosyldiacylglycerin, Galactosylglucosyldiacylglycerin, Galactosylglucosylglycerin, Glucosylgalactosylglucosyldiacylglycerin und dergleichen); Sphingolipide (z. B. Sphingosine, Glycosylceramide, Ganglioside und dergleichen) und gesättigte und ungesättigte Sterole (z. B. Cholesterin, Ergosterol, Stigmasterol, Sitosterol und dergleichen) und andere ähnliche natürliche Lipide.
Geeignete synthetische Lipidgruppierungen können z. B. von Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DMPE) (Genzyme Corp., Cambridge), DMRIE-C^TM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), 2,3-Dioleyloxy-N-[2(spermin-carboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) (Lipofectamine^TM, GibcoBRL, Gaitherburg, MD), 3β-[N-(N', N'-Dimethylaminoethyl)carbamoyl]cholesterin, Tfx-50 (Promega Corp., Madison, WI), N, N1, N2, N3-Tetramethyl-N, N1, N2, N3-tetrapalmitylsperimin (TM-TPS) (Cellfectin, GibcoBRL, Gaithersburg, MD), Dipalmitoylphosphatidylethanolaminospermin und dergleichen abgeleitet sein.
Geeignete Lipidgruppierungen umfassen auch solche, die von Fettsäuren und Fettalkoholen mit etwa 8 bis etwa 24 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkette abgeleitet sind. Typischerweise haben die Fettsäuren und Fettalkohole mindestens etwa 10 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette und noch typischer mindestens etwa 12 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette. Üblicherweise haben die Fettsäuren und -alkohole, von denen Lipidgruppierungen abgeleitet sind, weniger als etwa 20 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette.
Typischerweise ist Ra eine Lipidgruppierung oder eine an eine Linkergruppierung gebundene Lipidgruppierung. Ein besonders nützlicher Lipidgruppen-enthaltender Rest Ra ist der Phosphatidylalkylamino-substituierte Acylrest mit der Formel
worin p eine ganze Zahl, ausgewählt aus 2 und 3, ist und jeder Rest R₄ unabhängig aus Alkyl- oder Alkenylgruppierungen mit etwa 6 bis etwa 25 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkette ausgewählt ist. Typischerweise hat R₄ bis zu etwa 22 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette, typischer bis zu etwa 20 Kohlenstoffatomen und noch typischer sogar bis zu etwa 18 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkette. Typischerweise hat R₄ mindestens etwa 8 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette, noch typischer mindestens etwa 10 Kohlenstoffatome und sogar noch typischer mindestens etwa 12 Kohlenstoffatome in einer Hauptkette.
Beispiele für R₄-Gruppierungen umfassen Dodecyl, Tridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Hexadecyl, Heptadecyl, Octadecyl und dergleichen. p ist vorzugsweise 2.
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung können gegebenenfalls mit Mitteln verknüpft oder komplexiert sein, die z. B. Zielvermögen, strukturelle Merkmale, biologische Aktivität verleihen oder die Abbaustellen und dergleichen einführen. Geeignete Mittel umfassen z. B. Mono-, Di- und Polysaccharide, Polyethylenglykole, Aminosäuren, Peptide, Polypeptide, Proteine (einschließlich z. B. Lipoproteine, Glykoproteine, Antikörper und dergleichen), Vernetzungsmittel, Marker (z. B. Fluorescein, Biotin, ³²P und dergleichen) und dergleichen.
Der Fachmann auf diesem Gebiet wird erkennen, dass R₁, Rc, Ra, W und die besondere verwendete Lipidgruppierung in einfacher Weise verändert werden können, um die physikalisch chemischen Eigenschaften der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung zur Abgabe bzw. zum Transport eines besonderen Typs einer biologisch aktiven Verbindung zu optimieren. Beispielsweise haben oligomere Gruppierungen der vorliegenden Erfindung, die zur Verwendung in der Abgabe von Polynucleinsäuren an Zellen geeignet sind, eine positive Nettoladung und sind fähig, Polynucleinsäuren zu kondensieren, so dass diese in der Größe kompakter sind, was ihre Abgabe an Zellen erleichtert.
Erfindungsgemäße Verbindungen sind zur Verwendung bei der Abgabe bzw. dem Transport von Polynucleinsäuren in Zellen geeignet. Verbindungen, die zur Verwendung bei der Abgabe von Polynucleinsäuren an Zellen geeignet sind, umfassen z. B. solche, in denen R₁ ¹ eine kationische Seitenkette ist, R₁ ² und R₁ ³ beide neutrale Seitenketten sind, W jeweils CH₂ ist, Rc NH₂ ist und Ra durch die Formel (III) definiert ist, z. B. Verbindungen, die in Tabelle 2, in Beispiel I, dargestellt sind.
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung bilden in Lösung typischerweise konzentrationsabhängige geordnete zwei- oder dreidimensionale Strukturen. Solche Strukturen umfassen zweidimensionale Anordnungen, z. B. eine geladene Einzelschicht oder eine Lipid-Doppelschichtoberfläche, und dreidimensionale Strukturen wie z. B. Micellen, Vesikel und Liposome. Typischerweise sind geordnete Strukturen, die aus Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung mit sich selbst gebildet werden, ausreichend klein, dass sie Licht nicht streuen. Micellen, Vesikel und Liposome, die aus Lipid-verknüpften Verbindungen, komplexiert mit Polynucleotiden, hergestellt sind, haben typischerweise durchschnittliche Partikelgrößen, die kleiner als etwa 1 μm, typischer kleiner als etwa 500 nm, und noch typischer kleiner als etwa 200 nm sind.
Erfindungsgemäße Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen können zusätzlich zur Abgabe von biologisch aktiven Mitteln an Zellen auch in anderen Anwendungen eingesetzt werden, z. B. bei der Durchmusterung peptidartiger Verbindungen auf biologische Aktivität, beim Einbau in Biosensoren derart, dass die oligomere Gruppierung die Fähigkeit hat, einen Zielliganden zu binden, und dergleichen. Für Arzneimittel-Screening-Anwendungen beispielsweise können Bibliotheken-Lipidverknüpfte-Polyamidverbindungen mit einer Vielzahl von R₁-Gruppen synthetisiert werden und anschließend entsprechend den Verfahren zur Synthese und Durchmusterung modifizierter Peptid-Bibliotheken auf biologische Aktivität durchgemustert werden, wie es in der PCT-Veröffentlichung WO 91/19735 (veröffentlicht am 26. Dezember 1991) beschrieben ist.
SYNTHESE VON LIPID-VERKNÜPFTEN POLYAMIDVERBINDUNGEN
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung können sowohl durch Festphasen- als auch durch Lösungsphasen-Verfahren synthetisiert werden. Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen können durch ein Verfahren hergestellt werden, das umfasst:

a) Inkontaktbringen
(1) eines Lipidreaktanten mit
T_a und T_c jeweils unabhängig ausgewählt sind aus einer terminalen Gruppe und einer reaktiven Gruppierung, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist, wobei R₁ für jede monomere Einheit,
worin n eine ganze Zahl, ausgewählt aus 1 bis etwa 48 ist und m eine ganze Zahl, ausgewählt aus dem Bereich von 2 bis ungefähr 48; in dem Oligomerreaktanten ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem Wasserstoffatom; einer Hydroxygruppe; einer Aminogruppe; einer Carboxylgruppe; einer Sulfonylgruppe; -SH; einer gegebenenfalls substituierten, verzweigten oder geradkettigen aliphatischen Gruppe mit 1 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkettenstruktur, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält, wobei die aliphatische Gruppe gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat; einer gegebenenfalls substituierten Arylgruppe mit etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkettenstruktur, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält; einer gegebenenfalls substituierten Arylalkylgruppe mit etwa 3 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkettenstruktur, die gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält, wobei die Alkylkomponente des Arylalkyls gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen hat, und einer reaktiven Gruppierung, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist, wobei, wenn R₁, Ra oder Rc eine Aryl- oder Arylalkylgruppe mit weniger als etwa 5 Kohlenstoffatomen in einer Hauptkettenstruktur ist, die Hauptkettenstruktur typischerweise ein oder mehrere Heteroatome umfasst, z. B. Sauerstoff und/oder Stickstoff, wobei R₁ für mindestens eine monomere Einheit kein Wasserstoffatom ist, wobei W für jede monomere Einheit aus einer gegebenenfalls substituierten, verzweigten oder geradkettigen, zweiwertigen Gruppierung mit 1 bis etwa 50 Atomen in einer Hauptkette, die Kohlenstoff enthält und gegebenenfalls Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel und Phosphor enthält und gegebenenfalls eine oder mehrere Doppel- oder Dreifachbindungen enthält, wobei die optionale Substitution von W eine reaktive Gruppierung sein kann, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist, ausgewählt ist; wobei mindestens eine der Gruppen T_a, T_c, W für eine einzelne monomere Einheit oder R₁ für eine einzelne monomere Einheit eine reaktive Gruppierung umfasst, die zu einer weiteren Reaktion mit dem Lipidreaktanten fähig ist; dann
b) Umsetzen des Lipidreaktanten mit dem Oligomerreaktanten, um den Lipidreaktanten an den Oligomerreaktanten zu binden bzw. zu knüpfen.

Der Ausdruck „Lipidreaktant", der hier verwendet wird, bezieht sich auf eine reaktive Spezies mit einer Lipidgruppierung, die fähig ist, an einer chemischen Reaktion teilzunehmen, z. B. an einer nucleophilen Verdrängung, Kondensation und dergleichen. Lipidreaktanten, die funktionelle Gruppen wie z. B. -NH₂, -COOH, -SH, -OH, -SO₂Cl und -CHO, haben, sind zur Synthese Lipid-verknüpfter Verbindungen der vorliegenden Erfindung besonders nützlich. Lipidreaktanten, die zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen Lipidreaktanten mit einer der hierin beschrie benen Lipidgruppierungen, die mit dem oligomeren Reaktanten oder einem Linker reagieren können oder die modifiziert werden können, um mit dem oligomeren Reaktanten oder einem Linker zu reagieren. Typischerweise sind Lipidreaktanten primäre, sekundäre oder tertiäre Amine. Bevorzugte Lipidreaktanten sind Phosphatidylethanolamine.
Der Ausdruck „Oligomerreaktant", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein oligomeres Amid, das fähig ist, an einer chemischen Reaktion wie beispielsweise einer nukleophilen Verdrängung, Kondensation und dergleichen, teilzunehmen. Oligomerreaktanten werden typischerweise mit einer Abgangsgruppe acyliert, die für eine nukleophile Verdrängung durch ein Nukleophil, z. B. ein Amin, anfällig ist. Oligomerreaktanten, die zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen alle vorher beschriebenen oligomeren Amidsubstituenten.
Der Ausdruck „reaktive Gruppierung", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Gruppierung, die fähig ist, an einer Reaktion mit dem Lipidreaktanten teilzunehmen. Typische reaktive Gruppierungen umfassen z. B. -NH₂, -OH, -H, -SH, -COOH, Acyl (z. B. Acetyl), Benzoyl, Sulfonyl (z. B. Dansyl), Amid, Hydrazin (typischerweise eine T_c-Gruppe) und Derivate davon (einschließlich Alkyl-substituierte Derivate) und dergleichen. Typischerweise ist die reaktive Gruppierung eine Acylgruppierung, die mit einer Abgangsgruppe substituiert ist, die für eine nukleophile Verdrängung durch ein Nukleophil wie ein Amin anfällig ist.
Beispielhafte terminale Gruppen umfassen Ra- und Rc-Gruppierungen, die keine reaktiven Gruppierungen sind, Gruppierungen, die biologisch aktive Agenzien, Targeting-Agenzien (z. B. ein Zellrezeptorligand, Antikörper, usw.), Marker, Aminosäurereste, die z. B. als Abbaustelle für endogene proteolytische Enzyme wirken, und dergleichen. Diese terminalen Gruppen sind typischerweise mit dem Lipidreaktanten nicht weiter reaktiv.
Der Oligomerreaktant und der Lipidreaktant können gegebenenfalls über eine Linkergruppierung (die gegebenenfalls von einer reaktiven Gruppierung abgeleitet sein kann) aneinander gebunden sein. Alternativ kann die Linkergruppierung, die von einem Molekül stammt, das zur Reaktion sowohl mit dem oligomeren Reaktanten als auch dem Lipidreaktanten fähig ist, gegebenenfalls vor einer Reaktion zwischen Lipidreaktant und Oligomerreaktant an den Lipidreaktanten oder Oligomerreaktanten gebunden werden. So kann der Lipidreaktant entweder direkt oder indirekt über die Linkergruppierung mit dem Oligomerreaktanten verknüpft werden.
Der Ausdruck „reagieren bzw. reagierend", der hier verwendet wird, bezieht sich auf eine oder mehrere chemische Reaktionen, die in der Bildung einer chemischen Bindung zwischen dem Lipidreaktanten und dem Oligomerreaktanten, entweder direkt oder indirekt über die Linkergruppierung, resultieren. Geeignete Reaktionen umfassen z. B. Kondensation (z. B. Acylierung und dergleichen) und eine nukleophile Verdrängung.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung können beispielsweise über eine Reihe nukleophiler Verdrängungsreaktionen entsprechend dem Festphasenverfahren, das von Zuckermann et al., PCT WO 94/06451 (veröffentlicht am 31. März 1994) beschrieben wird, hergestellt werden. Das Verfahren kann unter Verwendung automatisierter Peptidsynthesegeräte durchgeführt werden, mit denen eine schnelle Synthese von Oligomerreaktanten von Interesse ermöglicht wird. Diese Geräte sind z. B. von Applied Biosystems im Handel erhältlich.
Spezifischerweise wird eine Monomeranordnung zu Verbindungen durch sequenzielle Addition von „Submonomer"-Einheiten bzw. monomeren Untereinheiten an die wachsende Kette erreicht. In einem Verfahren der Monomeranordnung besteht jeder Zyklus der Monomeraddition aus zwei Schritten:

(1) Acylierung eines sekundären Amins, das an den festen Träger gebunden ist, mit einem Acylierungsmittel, das eine Abgangsgruppe (d. h. eine Gruppe, die für eine nukleophile Verdrängung durch ein Nucleophil wie ein Amin empfänglich ist) und eine Carbonylgruppe (z. B. eine Carboxylgruppe) hat, (d. h. der „Acylierungsschritt"); gefolgt von
(2) einer nukleophilen Verdrängung der Abgangsgruppe mit einer ausreichenden Menge eines Submonomers, das eine primäre, sekundäre oder tertiäre Aminogruppe hat, um eine Seitenkette einzuführen (d. h. der „nucleophile Verdrängungsschritt").

Ein Schema für die Reaktion ist in 1 dargestellt. Beispiele für Acylierungsmittel umfassen Halogenessigsäure, Halogenmethylbenzoesäure und dergleichen. Die Verdrängungseffizienz der Abgangsgruppe wird durch den verwendeten Typ eines Acylierungsmittels moduliert. Wenn beispielsweise eine Halogenessigsäure verwendet wird, so hat sich gezeigt, dass Jod im Vergleich zu Chlor bei der Verdrängung der Abgangsgruppe effizienter ist. Geeignete Submonomere umfassen Alkylamine, Alkinylamine, aromatische Amine, Alkoxyamine, Semicarbazide, Acylhydrazide und Derivate davon, und dergleichen.
Eine Oligomersynthese unter Verwendung des Submonomer-Ansatzes erfolgt in der Carboxy-zu-Amino-Richtung. Das Oligomer wird bis zur gewünschten Länge aufgebaut, dann terminiert, z. B. mit einer Bromacetamid-Gruppe. Ein Vorteil der Verwendung des Zusammenfügens von Submonomeren in fester Phase zum Aufbau von Oligomerreaktanten der vorliegenden Erfin dung besteht darin, dass die Notwendigkeit für N-α-geschützte Monomere eliminiert wird, da nur reaktive Seitenketten-Funktionalitäten geschützt werden müssen.
Typischerweise wird die Verbindung als eine Reihe sich wiederholender Di-, Tri- oder Tetramer-Einheiten synthetisiert. Ein Beispiel für ein kationisches Oligomer auf Trimer-Basis hat die folgende Monomersequenz in Richtung Aminoterminus (T_a) zu Carboxyterminus (T_c)

(1) positiv geladenes Monomer
(2) neutrales Monomer und
(3) neutrales Monomer.

Die Ausdrücke „neutrales Monomer" und „positiv geladenes Monomer", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf die Nettoladung der monomeren Einheit.
Eine weitere Reaktion des Oligomerreaktanten mit dem Lipidreaktanten kann durch eine weitere Acylierung und/oder nucleophile Verdrängung erfolgen. Beispielsweise kann ein oligomerer Reaktant, der halogenacyliert ist (z. B. worin T_a eine Bromacetylgruppe ist) mit einem Lipidreaktanten umgesetzt werden, der ein primäres, sekundäres oder tertiäres Amin ist. Auf diese Weise erfolgt eine Verknüpfung durch nucleophile Verdrängung des Broms unter Bildung einer Lipidverknüpften Polyamidverbindung.
LIPID-VERKNÜPFTE POLYAMIDZUSAMMENSETZUNGEN UND VERWENDUNGEN DERSELBEN
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, die eine Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung (Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen) der vorliegenden Erfindung und eine wirksame Menge eines biologisch aktiven Agenses umfassen. Die hierin verwendeten Ausdrücke „effektive bzw. wirksame Menge" und „effektive bzw. wirksame Dosis" beziehen sich auf eine Menge an biologisch aktivem Agens oder an biologisch aktives Agens enthaltender Lipid-konjugierter Polyamidzusammensetzung der vorliegenden Erfindung, die ausreichend ist, um eine biologische Antwort nachweisbar zu induzieren oder daran teilzunehmen, z. B. Signaltransduktion, Transkription, Translation, Lymphozytenaktivierung, einschließlich z. B. Antikörperproduktion und dergleichen, und zwar z. B. in einem Säuger, einer Zelle oder einem Vogel. Der hierin verwendete Ausdruck „biologisch aktives Agens" bezieht sich auf ein Agens, das nach Verabreichung in einer wirksamen Menge an z. B. eine Zelle, einen Säuger oder einen Vogel, eine biologische Antwort induziert oder daran teilnimmt. Wenn das biologisch aktive Agens ein Polynucleotid ist, werden die relativen Mengen an Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung zu Polynucleinsäure typischerweise so ausgewählt, dass das +/–-Ladungsverhältnis von Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung zu Polynucleotid in der Zusammensetzung mindestens etwa 2 und weniger als etwa 10 ist. Typischerweise ist das +/–-Ladungsverhältnis kleiner als etwa 8 und noch typischer ist es kleiner als etwa 4. Das Ladungsverhältnis wird entsprechend der folgenden Gleichung mittels Computer errechnet: Ladungsverhältnis = (nL × ML)/(3.03 × MDNA)worin n_L die Anzahl an Mol Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung ist, M_L = Nettoanzahl der Ladungen/Mol Lipid-verknüpftes Polyamid, und wobei M_DNA = Mikrogramm DNA.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in flüssiger oder fester Form sein und können gegebenenfalls pharma zeutisch annehmbare Exzipienzien enthalten. Solche Exzipienzien können als Füllstoffe, Verarbeitungshilfsmittel, Abgabe-Enhancer und Modifikationsmittel und dergleichen verwendet werden. Geeignete Exzipienzien umfassen z. B. Calciumphosphat, Magnesiumstearat, Talk, Monosaccharide, Disaccharide, Polysaccharide, Gelatine, Cellulose, Methylcellulose, Natriumcarboxymethylcellulose, Dextrose, Polyvinylalkohol, Polyvinylpyrrolidinon, niedrig schmelzende Wachse, Ionenaustauschharze und dergleichen wie auch Kombinationen von 2 oder mehr davon. Eine ausführliche Diskussion pharmazeutisch annehmbarer Exzipienzien ist in „Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Pub. Co., NJ 1991) verfügbar.
In den Zusammensetzungen können auch zusätzliche Agenzien eingeschlossen sein wie z. B. Marker, Nährstoffe und dergleichen. Wenn beispielsweise das biologisch aktive Agens ein Polynucleotid ist, können Agenzien, die eine Endocytose der gewünschten Nucleinsäuren begünstigen oder eine Bindung der Nucleinsäuren an die Zelloberfläche unterstützen, oder beides, in erfindungsgemäße Zusammensetzungen eingearbeitet werden.
Flüssige Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können in Form einer Lösung, Suspension oder Emulsion mit einem flüssigen Träger vorliegen. Geeignete flüssige Träger umfassen z. B. Wasser, Kochsalzlösung, ein pharmazeutisch annehmbares organisches Lösungsmittel (pharmazeutisch annehmbare organische Lösungsmittel), pharmazeutisch annehmbare Öle oder Fette, Gemische davon und dergleichen. Der flüssige Träger kann andere geeignete pharmazeutisch annehmbare Additive, z. B. Solubilisierungsmittel, Emulgatoren, Nährstoffe, Puffer, Konservierungsmittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel, Viskositätsregulatoren, Stabilisatoren und dergleichen enthalten. Geeignete organische Lösungsmittel umfassen z. B. einwertige Alkohole wie Ethanol und mehrwertige Alkohole wie Glykole. Geeignete Öle umfassen z. B. Sojabohnenöl, Kokosnussöl, Olivenöl, Saflour-Öl, Baumwollsamenöl und dergleichen. Zur parenteralen Verabreichung kann der Träger auch in Form eines Ölesters vorliegen, z. B. Ethyloleat, Isopropylmyristat und dergleichen.
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induzierung der Aufnahme eines biologisch aktiven Agenses durch eine Zelle in vitro bereit, wobei das Verfahren umfasst:
Bereitstellen einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines biologisch aktiven Agenses und eine Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung umfasst; dann
Inkontaktbringen einer biologischen Probe mit einer wirksamen Dosis der Zusammensetzung in vitro, wobei die biologische Probe eine Zelle umfasst.
Der Ausdruck „biologische Probe", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Probe, die eine oder mehrere Zellen oder Gewebe umfasst. Zellen, die zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen z. B. Säugerzelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, Eierstockzellen von chinesischen Hamstern (CHO), HeLa-Zellen, Babyhamster-Nieren (BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), humane hepatozelluläre Carcinom-Zellen (z. B. Hep G2), humane Embryonennierenzellen, Babyhamster-Nierenzellen, Maussertoli-Zellen, Hundenierenzellen, Buffalo-Rattenleberzellen, humane Lungenzellen, humane Leberzellen, mamere Tumorzellen der Maus, andere Säugerzellen (einschließlich humaner) (z. B. Stammzellen, insbesondere hematopoetische Zellen, Lymphozyten, Makrophagen, dentritische Zellen, Tumorzellen und dergleichen) und dergleichen.
Geeignete Gewebe zur Verwendung als Proben in der vorliegenden Erfindung umfassen z. B. Gewebe, das von Säugern stammt, z. B. Muskel, Haut, Gehirn, Lunge, Leber, Milz, Blut, Knochenmark, Tymus, Herz, Lymphe, Knochen, Knorpel, Pankreas, Niere, Gallenblase, Magen, Darm, Hoden, Eierstock, Uterus, Rectum, Nervensystem, Auge, Drüse, Bindegewebe und dergleichen.
Modi zur Verabreichung an eine Probe umfassen z. B. ex vivo Verabreichung an Proben, die von einem Subjekt stammen, und in vitro-Verabreichung an eine Probe. Verfahren zur Durchführung dieser Verabreichungsmodi sind dem Fachmann gut bekannt. Wenn das biologische Agens z. B. ein Polynucleotid ist, können eine ex vivo-Abgabe und eine Reimplantation transformierter Zellen in ein Subjekt erreicht werden, wie es z. B. in der internationalen Publikation WO 93/14778 (veröffentlicht am 15. August 1993) beschrieben ist.
In noch einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer Zusammensetzung bereit, die eine Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung und ein biologisch aktives Agens umfasst, bei der Herstellung eines Medikaments zur Induzierung der Aufnahme eines biologisch aktiven Agenses durch eine Zelle in vivo durch Verabreichung der Zusammensetzung und des Agenses an ein Subjekt bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner die Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Nucleinsäure komplexiert mit einer Lipid-verknüpften Polyamidverbindung umfasst, zur Herstellung eines Medikaments für die Expression eines Gens in einem Säuger bereit,
wobei die Polynucleinsäure dazu in der Lage ist, das Gen in dem Säuger funktionell zu exprimieren, und
der Komplex das Gen wirksam in eine Zelle in dem Säuger transfiziert.
Der hier verwendete Ausdruck „Subjekt" bezeichnet Vögel und Säugetiere, einschließlich z. B. Nager und Menschen. Eine direkte Verabreichung an ein Subjekt kann typischerweise durch Injektion entweder subkutan, intraperetonial, intravenös oder intramuskulär erreicht werden oder kann durch Abgabe in den Interstitialraum eines Gewebes erfolgen. Die Zusammensetzungen können auch in einen Tumor oder eine Läsion verabreicht werden. Weitere Modi der Verabreichung umfassen eine orale und pulmonale Verabreichung, als Suppositorien und transdermale Anwendungen und dergleichen wie auch eine Verabreichung über Nadeln und Genkanonen oder Hyposprays.
Die Lipid-verknüpften Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind bei der Induzierung der Aufnahme des biologisch aktiven Agenses durch Zellen wirksam, wenn sie mit einem biologisch aktiven Agens kombiniert werden. Der hierin verwendete Ausdruck „induzieren" sowie seine verschiedenen grammatikalischen Äquivalente beziehen sich auf die Durchführung der Aufnahme eines biologisch aktiven Agenses durch eine Zelle. Verfahren, die zur Detektion der Aufnahme von biologisch aktiven Agenzien durch Zellen verwendet werden, werden in Abhängigkeit vom Typ des verwendeten biologisch aktiven Agenses variieren, allerdings wird der Fachmann auf diesem Gebiet wissen, dass die Zellaufnahme durch eine Vielzahl bekannter Assays und histologischer Techniken wie auch einer Vielzahl diagnostischer Verfahren, welche z. B. klinische diagnostische Verfahren (z. B. Linderung von Symptomen usw.) einschließen, detektiert werden kann.
Typischerweise sind Verbindungen der vorliegenden Erfindung bei der Verstärkung der Aufnahme des biologisch aktiven Agenses durch Zellen wirksam. Wenn die Aufnahme eines biologisch aktiven Agenses durch eine Zelle verstärkt wird, ist die Aufnahme des biologisch aktiven Agenses durch die Zelle typischerweise mindestens etwa 5% höher als die Aufnahme des biologischen Agenses in reiner Form (z. B. im Wesentlichen frei von Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung). Wenn die Aufnahme erhöht ist, ist die Aufnahme des biologisch aktiven Agenses durch die Zelle typischerweise mindestens etwa 10 größer als die Aufnahme des biologisch aktiven Agenses in reiner Form, typischerweise sogar noch mindestens etwa 15 höher und noch typischer mindestens etwa 20% höher.
Die wirksame Menge an biologisch aktivem Agens und entsprechend die wirksame Dosis einer Lipid-verknüpftes Polyamid/biologisches Agens enthaltenden Zusammensetzung wird natürlich in Abhängigkeit von bekannten Faktoren wie die pharmacodynamischen Charakteristika des besonderen biologisch aktiven Agenses, seines Verabreichungsmodus und seines Verabreichungswegs, dem Alter, der Gesundheit und dem Gewicht des Rezipienten, der Natur und dem Ausmaß der Symptome, der Art (den Arten) gleichzeitiger Behandlung, Häufigkeit der Behandlung, gewünschtem Effekt und dergleichen variieren. Allerdings kann die genaue Menge für einen besonderen Patienten und ein besonderes biologisch aktives Mittel in einfacher Weise durch Routineexperimente durch einen Arzt, der Spezialist auf diesem Gebiet ist, bestimmt werden. Ein Fachmann wird auch erkennen, dass die genaue Menge an Lipidverknüpfter Verbindung, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen verwendet wird, in einfacher Weise durch Routine-Durchmusterungsstudien unter Bestimmung des optimalen Verhältnisses von Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung zu biologisch aktivem Agens zur Induzierung der gewünschten Reaktion bestimmt werden kann. Zusammensetzungen von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen komplexiert mit biologisch aktiven Agenzien können als Einzeldosis oder in mehreren Dosen verabreicht werden. Mehrere Dosen können entweder kontinuierlich, in Intervallen oder als Kombination von beiden verabreicht werden. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung wird eine in vivo wirksame Menge von etwa 0,01 mg/kg/Tag bis etwa 50 mg/kg/Tag oder etwa 0,05 mg/kg/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag biologisch aktives Agens liegen.
Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind bei der Induzierung der Aufnahme von Polynucleotiden in Zellen besonders wirksam. Eine Polynucleotidaufnahme durch Zellen kann durch Verwendung von Proteinexpressionsassays oder Polynucleotidhybridisierungstechniken detektiert werden. Zusammensetzungen können bezüglich der Transfektionseffizienz durchgemustert und optimiert werden, indem ein Reportergen in die DNA eingebaut wird und bezüglich des Reportergen-Produkts unter Verwendung von Standard-Immunassay-Verfahren oder biologischer oder enzymatischer Aktivitätsassays (wie z. B. ein Luciferase-Assay) untersucht wird.
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen sind in Kombination mit Polynucleotiden bei der Inhibierung eines Nukleaseinduzierten Polynucleotidabbaus, der durch in Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten vorhandenen Nukleasen verursacht wird, besonders wirksam. Als Resultat können kleinere Mengen an Polynucleotiden unter Verwendung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen wirksamer verabreicht werden.
Somit stellt die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur substanziellen Inhibierung eines durch Nuklease induzierten Polynucleotid-Abbaus bereit, wobei das Verfahren Inkontaktbringen eines Polynucleotids mit einer den Abbau inhibierenden Menge der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung und Einbringen des Polynucleotids und der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung in eine Nuklease enthaltende Umgebung umfasst. Die Inhibierung eines Nuklease-induzierten Polynucleotid-Abbaus kann nachgewiesen werden, indem eine Probe eines durch Lipid-verknüpftes Polyamid-geschützten Polynucleotids und eine Kontrollprobe eines ungeschützten Polynucleotids beispielsweise in Serum für verschiedene Zeiträume inkubiert wird und die Gemische dann durch Gelelektrophorese analysiert werden, um zu bestimmen, wann ein Abbau des geschützten Polynucleotid im Vergleich zum ungeschützten Polynucleotid auftritt (z. B. wenn etwa 50% des Polynucleotids abgebaut ist). Der Grad des Abbaus kann unter Verwendung bekannter Quantifizierungsverfahren wie z. B. radioaktive Markierung und dergleichen überwacht werden.
Typischerweise ist eine die Degradierung bzw. den Abbau hemmende Menge an Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung die Menge an Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung, die ausreicht, um den Nuklease-induzierten Polynucleotid-Abbau eines Polynucleotids für mindestens etwa 5 Minuten, verglichen mit nicht geschütztem (d. h. reinem) Polynucleotid, zu inhibieren. Noch typischer ist die Menge an Lipid-verknüpfter Polyamidverbindung ausreichend, um einen Nuklease-induzierten Polynucleotid-Abbau für mindestens 10 Minuten, typischer für mindestens etwa 30 Minuten, noch typischer für mindestens 60 Minuten, noch typischer für mindestens 90 Minuten und sogar noch typischer für mindestens 120 Minuten im Vergleich zu ungeschütztem Polynucleotid zu inhibieren. Lipid-konjugierte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung sind bei der Inhibierung eines Nuklease-induzierten Polynucleotid-Abbaus zu einem Grad wirksam, das eine durch Lipid-verknüpftes Polyamid geschützte Polynucleinsäure typischerweise weniger als etwa 80 des Abbaus erleidet, den ungeschütztes (d. h. reines) Polynucleotid während desselben Zeitraums erleidet; typischer liegt dieser Wert unter etwa 50%, noch typischer sogar unter etwa 30% und noch typischer unter etwa 20%.
VERDÜNNUNGS-KONZENTRIERUNGS-VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG STABILER POLYNUCLEINSÄURE/TRANSPORTVEHIKEL-KOMPLEX-ZUBEREITUNGEN
In noch einer weiteren Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer stabilen Zubereitung einer Polynucleinsäure komplexiert mit einem Transportvehikel bereit, wobei das Verfahren umfasst:

a) Kombinieren einer Polynucleinsäure mit einem ersten flüssigen Trägerstoff unter Bildung einer verdünnten Polynucleinsäure, die im Wesentlichen Fällmittel-frei ist;
b) Kombinieren einer Transportvehikel-bildenden Verbindung mit einem zweiten flüssigen Träger unter Bildung einer Transportvehikel-Lösung, die im Wesentlichen Fällmittel-frei ist;
c) Kombinieren der verdünnten Polynucleinsäurelösung mit der Transportvehikel-Lösung, um eine verdünnte Zubereitung aus Transportvehikel/Nucleinsäure-Komplex zu bilden; dann
d) Reduzieren des Volumens der verdünnten Zubereitung, um eine stabile Zubereitung aus Transportvehikel/Nucleinsäure-Komplex zu bilden,

Es wurde festgestellt, dass, wenn Transportvehikel/Polynucleinsäure-Komplexe in flüssigem Trägerstoff gemäß dem „Verdünnungs-Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren formuliert werden, die resultierenden Komplexe bezüglich Partikelgröße und Transfektionseffizienz für relativ lange Zeit räume stabil sind. Außerdem sind die stabilen Zubereitungen charakteristischerweise Fällmittel-frei. Auf diese Weise können stabile Zubereitungen, die erfindungsgemäß nach dem Verdünnungs-Konzentrierungs-Formulierungsverfahren hergestellt werden, hergestellt und bis zu Tagen vor einer Transfektion gelagert werden, ohne dass eine wesentliche Änderung der Transfektionseffizienz auftritt; dies steht im Gegensatz zu herkömmlichen Transportvehikel/Polynucleinsäure-Zubereitungen, in denen gleiche Volumina verdünnter Lösungen von Polynucleinsäure und Transportvehikel unmittelbar vor einer Transfektion vermischt werden.
Der hierin verwendete Ausdruck „Transfektionseffizienz" betrifft die Menge oder Aktivität von exprimiertem Protein oder synthetisierter Polynucleinsäure als Resultat der Verabreichung eines Transportvehikel/Polynucleotid-Komplexes an eine Zelle.
Typischerweise ändert sich die Partikelgrößenverteilung von Transportvehikel/Polynucleotid-Komplexen in stabilen Zubereitungen um weniger als etwa 40% einen Tag nach Zubereitung durch das erfindungsgemäße Verfahren im Vergleich zur Partikelgrößenverteilung der Komplexe unmittelbar nach der Formulierung bzw. Zubereitung. Noch typischer ändert sich die Partikelgrößenverteilung von Transportvehikel/Polynucleotid-Komplexen in den stabilen Zubereitungen um weniger als etwa 30%, noch typischer um weniger als etwa 20% und sogar noch typischer um weniger als etwa 15% einen Tag nach Zubereitung und nach dem erfindungsgemäßen Konzentrierungsverfahren, verglichen mit der Partikelgrößenverteilung der Komplexe unmittelbar nach der Formulierung.
Noch typischer ändert sich die Partikelgrößenverteilung der Transportvehikel/Polynucleotid-Komplexe in den stabilen Zubereitungen um weniger als etwa 40%, sogar noch typischer we niger als etwa 30%, üblicherweise weniger als 20% und noch üblicher um noch weniger als etwa 15% 5–8 Tage nach Formulierung bzw. Zubereitung durch das erfindungsgemäße Verfahren, verglichen mit der Partikelgrößenverteilung der Komplexe unmittelbar nach der Zubereitung.
Der hierin verwendete Ausdruck „verdünnte Polynucleinsäurelösung" bezieht sich auf eine Lösung, die eine Konzentration von weniger als etwa 300 μg Polynucleinsäure pro ml hat. Typischerweise haben verdünnte Polynucleinsäurelösungen Polynucleinsäurekonzentrationen von weniger als etwa 250 μg/ml, typischer von weniger als etwa 150 μg/ml und noch typischer von weniger als etwa 100 μg/ml. Vorzugsweise haben verdünnte Polynucleinsäurelösungen Polynucleinsäurekonzentrationen von weniger als etwa 50 μg/ml.
Die Konzentration an Polynucleinsäure in stabilen Transportvehikel/Polynucleinsäure-Komplex-Zubereitungen ist größer als die Polynucleinsäurekonzentration der verdünnten Polynucleinsäurelösung und ist typischerweise mindestens etwa 150 μg (Polynucleotid)/ml (Zubereitung). Typischer ist die Konzentration an Polynucleotid in einer stabilen Zubereitung bzw. Präparation mindestens etwa 250 μg/ml, noch typischer mindestens etwa 500 μg/ml und sogar noch typischer mindestens etwa 1 mg/ml und noch typischer mindestens etwa 2 mg/ml.
Die Konzentration der Transportvehikel bildenden Verbindung, die in der Transportvehikellösung verwendet wird, wird in Abhängigkeit vom gewünschten Verhältnis DNA zu Transportvehikel und den Löslichkeitseigenschaften der das Transportvehikel bildenden Verbindung, die verwendet wird, variieren. Der Fachmann wird erkennen, dass Konzentration und Volumen der das Transportvehikel bildenden Verbindung in einem zweiten flüssigen Träger eingestellt werden können, so dass das ge wünschte Zielverhältnis von Transportvehikel zu DNA erhalten wird.
Wenn die das Transportvehikel bildende Verbindung ein Lipidverknüpftes Polyamid der vorliegenden Erfindung ist, beträgt die Konzentration der Transportvehikellösung typischerweise nicht mehr als etwa 5 mg/ml, noch typischer nicht mehr als etwa 2,5 mg/ml und typischerweise mindestens etwa 1,25 mg/ml. Die Volumina einer Transportvehikellösung und verdünnter Polynucleinsäurelösung, die kombiniert werden, werden vorzugsweise so ausgewählt, dass das Verhältnis von Lipidverknüpftem Polyamid zu Polynucleinsäure etwa 5 mg Lipidverknüpftes Polyamid zu etwa 1 mg Polynucleinsäure ist. Wenn zum Beispiel eine 5 mg/ml Lipid-verknüpftes Polyamid-Lösung als Transportvehikellösung verwendet wird, wird eine Kombination mit einem gleichen Volumen aus einer 1 mg/ml Polynucleinsäurelösung zu einem Verhältnis von Lipid-verknüpftem Polyamid zu Polynucleinsäure von 5 mg Lipid-verknüpftem Polyamid zu 5 mg Polynucleinsäure führen.
Der erste flüssige Trägerstoff kann derselbe sein wie der zweite flüssige Trägerstoff oder kann ein anderer sein. Geeignete erste und zweite flüssige Träger bzw. Trägerstoffe umfassen die hierin beschriebenen flüssigen Träger. Der Ausdruck „Transportvehikel", der hier verwendet wird, bezieht sich auf eine geordnete Struktur, die fähig ist ein Polynucleotid zu komplexieren oder einzuhüllen. Geeignete Transportvehikel umfassen Liposome, Mizellen, Vesikel und dergleichen. Der hierin verwendete Ausdruck „Transportvehikel bildende Verbindung" bezieht sich auf eine Verbindung, die fähig ist, ein Transportvehikel zu bilden. Beispiele für Transportvehikel bildende Verbindungen umfassen amphipatische Lipide, polykationische Nicht-Lipidverbindungen, Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen und dergleichen.
Nachdem die verdünnte Polynucleotidlösung und die Transportvehikelpräparation kombiniert wurden, wird das Volumen des resultierenden Gemisches verringert. Geeignete Verfahren zur Reduzierung des Volumens des resultierenden Gemisches umfassen zum Beispiel Zentrifugationsfiltration, Vakuumfiltration wie auch andere Verfahren zur Volumenverringerung, die dem Fachmann bekannt sind. Typischerweise wird das Volumen des resultierenden Gemisches derart reduziert, dass die Konzentration an Polynucleotid in der Zubereitung größer als etwa 150 μg/ml ist. Die Endkonzentration der konzentrierten Zubereitung kann nach dem Volumenverringerungsschritt gesenkt werden, indem ausreichend flüssiger Träger zu der Zubereitung gegeben wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen.
Der hierin verwendete Ausdruck „Fällmittel-frei" bezieht sich auf eine Zubereitung oder eine Lösung, die von festem Material, d. h. Fällmittelmaterial, frei ist, wie es visuell mit dem bloßen Auge detektiert wird.
Es wurde festgestellt, dass eine Transfektion von Zellen unter Verwendung stabiler Transportvehkel/Polynucleotidkomplex-Zubereitungen typischerweise effizienter ist als die mit Komplexen, die durch das herkömmliche Verfahren des Vermischens gleicher Volumina an verdünnten Polynucleotidlösungen und Transportvehikel unmittelbar vor Transfektion gebildet werden, was in 14 erläutert ist.
Die Erfindung wird nun detaillierter anhand der folgenden nicht-limitierenden Beispiele beschrieben.
Beispiel 1
Herstellung von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen
A. Synthese von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen
(1) Synthese von Oligomerreaktant
Ein mit Fritte ausgestattetes Reaktionsgefäß wurde mit 100 mg Fmoc-Rink-Amidharz mit einem Substitutionsgrad von etwa 0,50 mmol/g Harz beschickt. 2 ml Dimethylformamid (DMF) wurden zu dem Harz gegeben. Das Gemisch wurde für ein bis zwei Minuten bewegt, um das Harz zu quellen, dann wurde das DMF ablaufen gelassen. Die Fmoc-Gruppen wurden entfernt, indem 2,0 ml 20% Piperidin in DMF zu dem Harz gegeben wurden, dann wurde eine Minute gerührt. Die Lösung wurde dann vom Harz ablaufen gelassen. Weitere 2 ml 20% Piperidin in DMF wurden zu dem Harz gegeben, anschließend folgte 15-minütige Bewegung, wonach das DMF vom Harz ablaufen gelassen wurde.
Das Harz wurde durch Zugabe von 2 ml DMF zum Harz gewaschen, anschließend wurde unter Bildung einer einheitlichen Aufschlämmung bewegt. Die Harzaufschlämmung wurde bewegt, indem Argon durch den Boden des mit einer Fritte versehenen Gefäßes nach oben perlen gelassen wurde. Das DMF wurde durch Vakuumfiltration durch den mit Fritte versehenen Boden des Reaktionsgefäßes entfernt, bis das Harz trocken schien (typischerweise etwa 5 Sekunden). Der Waschschritt wurde 6-mal mit DMF wiederholt.
Das entblockierte Amin wurde dann durch Zugabe von 850 μl 1,2 M Bromessigsäure in DMF zu dem Harz, an schließend 200 μl N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) acyliert. Das Gemisch wurde für 45 Minuten bei 35°C bewegt, dann wurde die Lösung vom Harz ablaufen gelassen. Das Harz wurde mit 6 × 2 ml-Aliquots DMF gewaschen. Eine Aminverdrängung wurde durch Behandeln des Harzes mit 850 μl einer 1 M Lösung eines Amins in Dimethylsulfoxid (DMSO) durchgeführt. Das Gemisch wurde für 20 Minuten bei 35°C bewegt, dann wurde die Aminlösung vom Harz ablaufen gelassen. Nach dem Schritt der Aminverdrängung wurde das Harz mit 6 × 2 ml-Aliquots DMF gewaschen. Dies beendete einen Zyklus der Acylierung und Verdrängung.
Der zweite Zyklus wurde durch Acylierung unter Verwendung von Bromessigsäure und DIC, gefolgt von einer Verdrängung mit einem sekundären Amin, wie es oben beschrieben ist, initiiert. Dieser Acylierungs/Verdrängungs-Zyklus wurde wiederholt, bis das gewünschte Oligomer erhalten worden war.
Der N-Terminus des resultierenden Oligomers wurde für 45 Minuten bei 35°C mit 850 μl Bromessigsäure in DMF (1,2 M) und 200 μl DIC acyliert.
(2) Verdrängung von Bromid aus dem bromacetylierten Oligomerreaktanten mit Dimyristoylphosphatidylethanolamin
Eine Menge von 254 mg Dimyristoylphosphatidylethanolamin (DMPE) (Genzyme, Cambridge, MA) wurde in 2 ml 15 Methanol in Chlorbenzol suspendiert, dann mit 30 μl wässrigem 12,8 N KOH behandelt. Die resultierende DMPE-Lösung wurde zu dem bromacetylierten Oligomer an Harz aus (1) oben gegeben und die Reaktion wurde durch Einperlenlassen von Argon für eine Sekunde alle 30 Sekunden über einen Zeitraum von 40 Stunden bei 35°C bewegt. Als nächstes wurde das Harz gründlich mit 15% Methanol in Chlorbenzol gewaschen, um nichtumgesetztes DMPE zu entfernen.
Die resultierende Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung wurde vom Harz abgespalten und unter Verwendung von 95% TFA in Wasser entschützt, dann unter Erhalt eines Rohproduktes lyophilisiert.
Dieses Verfahren wurde wiederholt, wobei Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE) und Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) verwendet wurden. Lipid-konjugierte Polyamidverbindungen, die entsprechend diesem Verfahren hergestellt wurden, sind in der folgenden Tabelle 2 angegeben.
Tabelle 2: Beispiele für Lipid-verknüpfte, N-substituierte Polyglycinverbindungen, die sich wiederholende Trimer-Einheiten+ haben
B. Charakterisierung Lipid-verknüpfter Polyamidverbindungen
Das lyophilisierte Rohprodukt aus Teil A wurde in 5 ml 50 (V/V) Acetonitril in Wasser gelöst und die resultierende Lösung wurde auf eine Delta-Pak^TM C4-Säule (15 μm, 3000 aufgetragen, welche mit 80% (V/V) Lösungsmittel B (0,1% (V/V) TFA in Acetonitril) in Lösungsmittel A (0,1% (V/V) TFA in Wasser) äquilibriert worden war und sich in einem Water Prep LC3000-System befand, das mit einem UV-Detektor (Waters Corp., Milford, MA) ausgestattet war. Peaks wurden mit einem linearen Gradienten von 80% (V/V) Lösungsmittel B in Lösungsmittel A bis 100% Lösungsmittel B über 20 Minuten, gefolgt von 100% Lösungsmittel B für 15 Minuten bei einer Durchflussgeschwindigkeit von 50 ml/min., eluiert. Die Peaks wurden bei 220 nm überwacht, wobei die Fraktionen, die die gewünschten Lipid-konjugierten Polyamidverbindungen enthielten, kombiniert und im Vakuum konzentriert wurden.
Produkte wurden durch analytische Reverse-Phase-HPLC unter Verwendung einer Vydac C4-Säule (5 μm 300, 1,0 × 150 mm) an einem MAGIC 2002-Flüssigkeitstomatographiesystem (Michrom BioResource, Auburn, CA) und durch Elektrosprayionisierungsmassenspektrometrie (Micromas, FISONS Instruments, Beverly, MA) charakterisiert.
Die Chromatographie der Reaktionsprodukte aus Teil A (2) dieses Beispiels erzeugte große scharfe Peaks, welche den Lipidverknüpften Polyamidverbindungen entsprachen, und viel kleinere Peaks, die den nicht-umgesetzten Oligomeren entsprachen. Die Massenspektroskopie bestätigte die theoretischen Molekulargewichte der synthetisierten Lipid-konjugierten Polyamidverbindungen aus Teil A(2) in diesem Beispiel. Somit bestätigen diese Resultate die vorhergesagten Molekulargewichte der Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen.
Beispiel 2
Herstellung von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen, komplexiert mit Plasmid-DNA
Lipid-verknüpfte Polyamide (aus Beispiel 1), komplexiert mit Plasmid-DNA, wurden hergestellt. Das in diesen Experimenten verwendete Plasmid war pCMVkmLUC. Das Plasmid pCMVkmLUC wurde konstruiert, indem das luc+-Gen aus pSP-luc+ (Promega Corp. Madison, WI) in den Expressionsvektor pCMVkm2 insertiert wurde. Die Sequenz des Vektors CMVkm2 ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Eine Plasmidkarte des Vektors CMVkm2 ist in 1 gezeigt.
Kurz ausgedrückt, pSP-luc+ wurde mit den Restriktionsenzymen Nhel-EcoRV (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) verdaut und ein Fragment mit 1691 bp wurde durch Standardverfahren isoliert. Dieses Fragment wurde in pCMVkm2 insertiert, welches mit Xbal, EcoRV verdaut wurde, wobei der Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) verwendet wurde. Das luc+-Gen wurde in pCMVkm2 kloniert, so dass eine Expression durch den CMV Immediate Early-Enhancer-Promotor gesteuert wurde und durch das Rinderwachstumshormon Polyadenylierungssignal terminiert wurde.
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen, die in Beispiel 1 synthetisiert wurden, wurden in einer Konzentration von 5 mM in sterilem Wasser gelöst und für eine Minute mit Ultraschall behandelt, wodurch eine klare Lösung erhalten wurde. Es wurde eine 5 mM Lösung von pCMVkmLUC in sterilem Wasser hergestellt. Gleiche Volumina der Lösung der Lipid-konjugierten Polyamidverbindung und der Plasmidlösung wurden vor der Transfektion vermischt und für 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Zur Transfektionsstudie wurde OptiMEM (Gib coBRL, Gaithersburg, MD) anstelle von sterilem Wasser verwendet.
Komplexe wurden auch hergestellt, indem Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen mit DOPE oder Cholesterin in einem gleichen molaren Verhältnis vermischt wurden, dann unter Bildung von Liposomen mit Ultraschall behandelt wurden. Zu diesen vorgeformten Liposomen wurde dann Plasmid-DNA gegeben, um Komplexe zu bilden.
Komplexe aus Lipofectin^® (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) und DMRIE-C^TM (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) und Plasmid-DNA wurden in den folgenden Beispielen nach Anweisungen des Herstellers hergestellt.
Beispiel 3
Charakterisierung Lipid-verknüpfter Polyamidverbindungen komplexiert mit Plasmid-DNR
Eine Rehydratisierung der lyophilisierten Verbindung 16 (siehe Tabelle 2) in sterilem Wasser produzierte eine klare Lösung, die Licht nicht streute. Unter Negativ-Färbungs-Elektronenmikroskopie erschien die Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung in dieser Lösung als Aggregat meist zylindrischer Mizellen mit einigen sphärischen Mizellen mit Durchmessern zwischen etwa 10 und etwa 15 nm. Während des Mischens einer Lösung der Verbindung 16 mit der pCMVkmLUC-Lösung aus Beispiel 3 zeigten Messungen der dynamischen Lichtstreuung (N4Plus, Coulter Instruments, Miami, FL) an, dass Partikelgrößen ein Minimum von etwa 120 nm erreichten, wenn das +/–-Ladungsverhältnis zwischen etwa 2 und etwa 4 lag. Die Partikelgrößen dieser Komplexe erhöhten sich leicht, wenn das Ladungsverhältnis verändert wurde. Eine Elektronenmikroskopie mit negativer Färbung zeigte bei einem 2 : 1 +/–- Ladungsverhältnis-Komplex die Bildung von homogenen, sphärischen Partikeln mit Durchmessern von etwa 150 nm an.
Messungen der dynamischen Lichtstreuung wurden in ähnlicher Weise aufgenommen, wobei Verbindung 23 mit pCMVkmLUC vermischt wurde. Die Partikelgrößen des resultierenden Lipidverknüpften Polyamid/DNA-Komplexes erreichten ein Minimum von 120 nm, wenn das +/–-Ladungsverhältnis zwischen etwa 2 und etwa 4 lag. Wenn das Ladungsverhältnis zunahm oder abnahm, nahmen die Partikelgrößen dieser Komplexe leicht zu.
Zeta-Potential-Messungen (Delsa 400, Coulter Instruments) zeigten, dass das Zeta-Potential des Verbindung 16-DNA-Komplexes stetig zunahm, wenn das Verhältnis Lipidverknüpftes Polyamid zu DNA anstieg und eine Ladungsneutralisierung bei einem Ladungsverhältnis zwischen etwa 0,5 und 1 realisiert wurde.
Die Komplexbildung wurde auch durch einen Agarosegel-Mobilitäts-Verschiebungsassy charakterisiert. Komplexe der Verbindung 16 mit 1 μg pCMVkmLUC mit einem +/–-Ladungsverhältnis von 1 oder darüber wurden auf ein 1% Agarosegel (70 V, 1 Stunde) aufgebracht, um die Verzögerung der komplexierten Plasmid-DNA im Vergleich zu reiner Plasmid-DNR zu untersuchen. Eine Gel-Mobilitätsverschiebung bestätigte, dass die Plasmid-DNA im Komplex zurückgehalten wurde.
Beispiel 4
Charakterisierung der DNA-Stabiliät in Komplexen mit Lipidverknüpften Polyamidverbindungen
Um zu bestimmen, ob Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der vorliegenden Erfindung einen Abbau bzw. eine Degradierung von komplexierter DNA durch DNase I (Boehringer Mannheim, India napolis, IN) inhibieren, wurden Lipid-verknüpfte Polyamid-DNA-Komplexe mit DNase I behandelt und die Resultate wurden durch Agarosegelelektrophorese analysiert. pCMVkmLUC (10 μg) und Lipid-verknüpfte/pCMVkmLUC-Komplexe, die 10 μg pCMVkmLUC enthielten, wurden bei 37°C mit 10 Einheiten DNase I in 50 μl 10 mM MgCl₂ für 15 Minuten inkubiert. Ein Aliquot (1 μg DNA) Komplex/DNase-Gemisch wurde auf 1% Agarosegel (70 V, 1 Stunde) aufgeladen (das Ladepuffer enthielt 1% SDS), um die Integrität der Plasmid-DNA zu untersuchen.
Die Resultate zeigten, dass Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen, die entweder aromatische oder aliphatische R₁-Gruppen haben, bei der Bereitstellung von Resistenz gegenüber einem DNase-Abbau wirksam waren, allerdings schienen aromatische R₁-Gruppen eine etwas größere Resistenz gegenüber einer Degradierung zu liefern. Diese Resultate legen nahe, dass Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen mit aromatischen R₁-Gruppen stärker mit DNA komplexieren.
Darüber hinaus schienen Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen der Formel (IV), die das R₁ ¹ : R₁ ² : R₁ ³-Motiv Aminoethyl : 2-(4'-methoxyphenyl)ethyl : 2-(4'-methoxyphenyl)-ethyl haben, die Plasmid-DNA stärker zu schützen als andere Motive, wie es durch die größere Menge an super-geknäulter Plasmid-DNA, die zurückgehalten wurde, klar wird. Dieses Resultat scheint von der Länge der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung unabhängig zu sein. Die Plasmid-DNA-Stabilität wurde auch als Funktion des Komplex-+/–-Ladungsverhältnisses beurteilt.
Lipitoid/Polynucleotid-Komplexe mit unterschiedlichen Ladungsverhältnissen wurden hergestellt, indem verschiedene Mengen der Verbindung 16 mit einer festgelegten Menge an Plasmid-DNA vermischt wurden. Es wurde bei keinem der beurteilten Ladungsverhältnisse, d. h. +/– 10 : 1, 8 : 1, 4 : 1 und 2 : 1 eine signifikante Degradierung bzw. ein signifikanter Abbau beobachtet. Allerdings wurde die Superknäul-Konformation bei höheren Ladungsverhältnissen verglichen mit niedrigeren Ladungsverhältnissen zu einem größeren Ausmaß beibehalten.
Beispiel 6
Transfektionsverfahren und Assay
In den Transfektionsstudien wurden 3 Zelllinien verwendet, nämlich HT1080 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, Eingangsnr. CCL 121), NIH3T3 (aus Kulturmaterialbestand von Chiron Corp. Emeryville, CA) und Cos6M (aus dem Labor von E. Glazer, Chiron Corp. Emeryville, CA). Vor einer Transfektion wurden die Zellen (2 ml einer Suspension mit 1 × 10⁵ Zellen/ml DME-FCS) in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen (Corning, Cambridge, MA) platziert und leicht bewegt, um die Zellen gleichmäßig zu dispergieren. Die Zellen wurden 24 Stunden später transfiziert.
Zur Transfektion wurden sowohl transiente wie auch stabile Komplexe, die Plasmid (GibcoBRL, Gaithersburg, MD) enthielten, verwendet. Ein Transfektionsmedium komplexierter DNA wurde mit 1 μg pCMVkmLUC/Vertiefung und mit einer Konzentration von 1 μg/100 μl in jede Vertiefung gegeben. Alle untersuchten Bedingungen wurden in jeweils 2 Vertiefungen durchgeführt. Die Zellen wurden für 3 Stunden bei 37°C mit Transfektionsmedium kultiviert. Das Transfektionsmedium wurde mit Hilfe einer Pipette, ohne die Zellenschicht zu stören, entfernt und durch 2 ml DME-FCS (für Serum-positive Bedingungen) oder OptiMEM (für Serum-freie Bedingungen) ersetzt. Die Zellen wurden erneut für 48 Stunden inkubiert, dann wurde das Medium verworfen. Die Zellen wurden dann zweimal mit DPBS (JRH Biosciences, Lenexa, KS) gespült.
Reporter-Lysepuffer (300 ml/Vertiefung) (Promega Corp., Madison, WI) wurde in die Vertiefungen gegeben und die Zellen wurden für 15 bis 20 Minuten an einem Schüttler lysieren gelassen. Das Zelllysat aus jeder Vertiefung wurde unter Verwendung eines Zellschabers (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA) in ein Eppendorf-Rohr transferiert, worauf ein Gefrier(Ethanol-Trockeneis)-Tau-Zyklus und eine Mikrozentrifugation bei maximaler Geschwindigkeit für 2 Minuten folgten.
Die Glühwürmchen-Luciferase-Aktivität wurde für die Lysate analysiert, wobei der Luciferase-Assay-Kit (Promega Corp., Madison, WI) und ein automatisiertes ML2250-Luminometer (Dynatech, Chantilly, VA) entsprechend den Anweisungen des Herstellers verwendet wurden.
Beispiel 7
Beurteilung der Transfektionseffizienz als Funktion der Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplex-Ladungsdichte
Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplexe wurden von Beispiel 16 und pCMVkmLUC in OptiMEM, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist, hergestellte diese hatten +/–-Ladungsdichten von 0,5 : 1, 1 : 1, 2 : 1, 4 : 1 und 8 : 1. HT1080-Zellen wurden transfiziert und entsprechend dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren analysiert. Die Beziehung zwischen Transfektionseffizienz, d. h. Luciferase-Aktivität, und Komplexladungsdichte ist in 2 gezeigt. Die Resultate zeigen, dass eine Transfektion von HT1080-Zellen unter Verwendung von Verbindung 16 am effizientesten war, wenn die +/–-Ladungsdichte des Komplexes etwa 2 : 1 war. Die Resultate zeigen auch, dass Serum offensichtlich keinen signifikanten Einfluss auf die Transfektionseffizienz hat.
Beispiel 8
Beurteilung des Effektes der Oligomerlänge auf die Transfektionseffizienz von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen
Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexe wurden aus den Verbindungen 15–19 mit einem +/–-Ladungsverhältnis von 2 : 1 in OptiMEM entsprechend Beispiel 2 hergestellt. Die Verbindungen 15–19 haben alle dieselbe allgemeine Struktur, d. h. Formel (IV), identische Seitenketten und Lipidgruppen, unterscheiden sich aber bezüglich der Oligomerlänge, d. h. die ganze Zahl m ist für jede dieser Verbindungen anders. Die ganze Zahl m ist 2, 3, 4, 8 und 12, für die Verbindungen 15, 16, 17, 18 bzw. 19. HT1080-Zellen wurden mit Komplexen, die aus jeder dieser Verbindungen hergestellt wurden, transfiziert, dann, wie in Beispiel 6 beschrieben, analysiert.
Die in 3 gezeigten Resultate zeigen, dass für diese besondere Serie von Verbindungen die Transfektionseffizienz für Verbindung 16 (m = 3) am höchsten ist.
Beispiel 9
Effekt des Lipidgruppierungstyps auf die Transfektionseffizienz
Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexe wurden aus den Verbindungen 16 und 23, beides DMPE-verknüpfte Verbindungen, und den Verbindungen 20 und 24, beide DOPE-verknüpfte Verbindungen, die ein +/–-Ladungsverhältnis von 2 : 1 haben, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. HT1080-Zellen wurden unter Verwendung dieser Komplexe transfiziert und die Transfektionseffizienz wurde entsprechend den in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren analysiert.
Die in 4 gezeigten Resultate zeigen eine höhere Transfektionseffizienz für die DMPE-verknüpften Verbindungen im Vergleich zu den DOPE-verknüpften Verbindungen an.
Beispiel 10
Transfektion verschiedener Zelllinien unter Verwendung Lipidverknüpfter Polyamidverbindungen
Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Plasmid-Komplexe wurden aus den Verbindungen 16 und 23 in OptiMEM mit einem +/–-Ladungsdichteverhältnis von 2 : 1 entsprechend Beispiel 2 hergestellt. Außerdem wurden Lipofectin^®/pCMVkmLUC- und DMRIEC^TM/pCMVkmLUC-Komplexe entsprechend den Anweisungen des Herstellers für OptiMEM hergestellt. HT1080-, Cos6M- und NIH3T3-Zellen wurden mit den Komplexen transfiziert und anschließend entsprechend Beispiel 6 auf Luciferaseaktivität untersucht.
Die Resultate sind in Tabelle 3 angegeben. Diese Resultate beweisen die höhere Transfektionseffizienz von Lipidverknüpften Polyamidverbindungen im Vergleich zu im Handel verfügbaren Transfektionspräparaten.
Tabelle 3 Transfektionseffizienz⁺ Lipid-verknüpfter Polyamidverbindungen Transfektionsvehikel
Beispiel 11
Transfektion von HT1080-Zellen unter Verwendung verschiedener Lipid-verknüpfter Polyamidverbindungen
Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Plasmid-Komplexe wurden aus einigen der Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen aus Beispiel 1 in OptiMEM, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt. Die Komplexe hatten ein +/–-Ladungsdichteverhältnis von 2 : 1. Außerdem wurden Lipofectin^® (pCMVkmLUC- und DMRIE-C^TM/pCMVkmLUC-Komplexe entsprechend den Anweisungen des Herstellers bezüglich OptiMEM hergestellt. HT1080-Zellen wurden mit den Komplexen transfiziert und anschließend entsprechend Beispiel 6 auf Luciferaseaktivität untersucht. Die Resultate sind unten in Tabelle 4 angegeben.
Tabelle 4. Transfektionseffizienz^+a Lipid-verknüpfter Polyamidverbindungen
Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen mit sich wiederholenden n-mer-Einheiten sowohl mit kationischen wie auch mit neutralen Seitenketten (R₁) waren bei der Vermittlung einer Transfektion im Allgemeinen wirksamer als Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen, die nur kationische Seitenketten hatten.
Beispiel 12
In vivo-Transfektion unter Verwendung eines Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung/pCMVkmLUC-Komplexes
Ein Präparat eines Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexes wurde hergestellt, indem 200 μl einer Lösung von 60 μg von pCMVkmLUC in 200 μl D5W (5% Dextrose) mit 200 μl 2,9 mg Verbindung 16 in 200 μl in D5W (5% Dextrose) vermischt wurden, so dass das +/–-Ladungsverhältnis des Komplexes 8 : 1 war. Das Endvolumen der Lipid-verknüpftes Polyamid/DNA-Komplex-Präparation war 400 μl. Eine 400 μl-Dosierung der Präparation wurde in die Schwanzvene einer Balb/C-Maus injiziert.
Die Maus wurde 24 Stunden nach der Injektion getötet und die Lungen, die Leber, das Herz, die Nieren und die Milz wurden entnommen. Die entnommenen Organe wurden in 2,0 ml-Röhrchen mit Schraubverschluss gelegt, wobei 1/3 des Volumens der Röhrchen mit Glasperlen (BioSpec Products, Inc., Bartlesville, OK) gefüllt war. Die Röhrchen wurden in flüssigem Stickstoff gefroren, dann bei –70°C gelagert.
Um Luciferase aus den entnommenen Organen zu extrahieren, wurde ein 300 μl-Aliquot 1 × X-Reporter-Lysepuffer (Promega Corp., Madison, WI) in jedes Röhrchen gegeben. Die Inhalte der Röhrchen wurden 1 Minute bei 4°C homogenisiert. Nach Zugabe eines 200 μl-Aliquots 1 × RLB in jedes Röhrchen wurden die Röhrcheninhalte für 30 Minuten im kalten Raum verwirbelt. Die Röhrchen und ihre Inhalte wurden dann in einem Ethanol/Trockeneis-Bad gefroren, dann in einem Wasserbad mit 20°C aufgetaut, und zwar in 3 Zyklen. Die Röhrchen wurden dann mit 12.500 Upm für 5 Minuten in einem kalten Raum zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde der Überstand mittels Pipette gesammelt.
Der Überstand wurde unter Verwendung des Promega-Luciferaseassay-Systems und des automatischen Luminometers Dynatech ML2250 (Dynatech, Chantilly, VA) nach den Anweisungen des Herstellers analysiert.
Die in 5 gezeigten Resultate geben an, dass Luciferase in Lungen-, Leber-, Gewebe- und in geringerem Ausmaß in Milzgewebe der Maus exprimiert wird. Diese Resultate beweisen die Wirksamkeit von Lipid-verknüpften Polyamidverbindungen bei der Vermittlung einer in vivo-Transfektion.
Beispiel 13
Verdünnungs-Konzentrierungs-Verfahren zur Formulierung stabiler Zubereitungen bzw. Präparationen von Transportvehikel/Polynucleotid-Komplexen.
I. Ladungsberechnungen
Die Konzentration negativer Ladungen an DNA wurde als 3,03 nmol Phosphat/1 μg DNA, basierend auf einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 330 Dalton für jedes Nukleotid, berechnet. Das Formelgewicht jeder Lipid-verknüpften Polyamidverbindung wurde als Semitrifluoracetatsalz berechnet (50 der Aminogruppen bilden mit TFA ein Salz) und die Konzentration der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung wurde auf der Basis des lyophilisierten Produktes aus Beispiel 1 bestimmt.
II. Komplexbildung
Alle Stufen wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. Zur Herstellung aller Stammlösungen wurde gereinigtes Wasser mit Diagnosequalität (DGPW) verwendet. Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexe wurden hergestellt und zwar mit +/–-Ladungsverhältnissen von 0,5 : 1, 1 : 1, 2 : 1, 4 : 1 und 8 : 1. Eine verdünnte Lösung von 50 μg/ml Polynucleotid wurde hergestellt, was 151 μmol negativer Ladung entsprach. 5 mM Lösungen der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung 16 wurden hergestellt.
Ein Volumen der DNA-Lösung wurde schnell zu einem gleichen Volumen wie jeder Lösung Lipid-verknüpften Polyamids unter leichtem Rühren gegeben. Es wurde beobachtet, dass ein langsamer Zusatz der zwei Lösungen leicht zur Bildung größerer Komplexe und gelegentlicher Präzipitate führen kann. Bessere Resultate wurden erreicht, wenn die DNA-Lösung zu der Lipidkonjugierten Polyamidlösung gegeben wurde, als beim umgekehrten Vorgehen.
Die Formulierungen wurden unter Verwendung von im Handel verfügbarer Ultrafiltrations-Membrankonzentrator-Vorrichtungen mit einem geeigneten nominalen Molekulargewicht-Cutoff-Wert (z. B. 100 kd) konzentriert. 2 ml jeder verdünnten Lipidverknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplex-Präparation bzw. Zubereitung (in 30% (V/V) Ethanol) wurden in ein Centricon^®-100 (Amicon Inc., Beverly, MA)-Gerät gegeben und für 30 Minuten oder bis das Volumen des Retentats, das den Komplex enthielt, etwa 50 μl war, mit 1000 × g zentrifugiert. Das Filtrat wurde aus dem Sammelbehälter am Boden entfernt. Das Retentat wurde mit 200 ml 5% Glukose verdünnt und auf 50 μl konzentriert, indem das obige Vorgehen wiederholt wurde. Dieser Vorgang wurde erneut wiederholt, um eine konzentrierte, stabile Zubereitung herzustellen, die 1 mg/ml pCMVkmLUC in 5% Glukose enthielt. Das Verfahren kann kalt (z. B. bei 4°C) oder bei Umgebungstemperatur durchgeführt werden. Im Allgemeinen kann die Endkonzentration an DNA im Retentat 1 mg/ml hoch sein, ohne dass eine sichtbare Präzipitation auftritt.
Zeta-Potential-Messungen wurden für jede konzentrierte Präparation am Tag 1, Tag 2 und Tag 8 nach der Formulierung vorgenommen. Die Resultate, die in den 6 und 7 dargestellt sind, zeigen, dass das Zeta-Potential der Komplexe in der konzentrierten Präparation über einen Zeitraum von 8 Tagen im Wesentlichen stabil blieb.
Messungen der dynamischen Lichtstreuung (N4 Plus, Coulter Instruments, Miami, FL) wurden für jede konzentrierte Zubereitung eines Lipid-konjugierten Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexes durchgeführt. Die Resultate, die in den 8 und 9 dargestellt sind, zeigen, dass die Partikelgrößen der Komplexe auch über einen Zeitraum von 8 Tagen im Wesentlichen stabil blieben.
HT1080-Zellen wurden mit jeder konzentrierten Zubereitung eines Lipid-verknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexes 2 und 18 Tage nach der Formulierung (Verbindung 16) und 4 und 12 Tage nach der Formulierung entsprechend dem in Beispiel 6 beschriebenen Verfahren transfiziert. Eine Zubereitung von DMRIE-C^TM/pCMVkmLUC-Komplexen wurde unter Anwendung herkömmlicher Verfahren, die in Beispiel 2 beschrieben sind, hergestellt und HT1080-Zellen wurden transfiziert. Die Zellkonfluenz wurde unter Verwendung eines Mikroskops gemessen und der prozentuale Anteil lebender Zellen wurde bestimmt.
Die in den 10 bis 12 angegebenen Resultate zeigen, dass die Luciferaseaktivität in Zellen, die mit Lipidverknüpftes Polyamid/pCMVkmLUC-Komplexen, welche nach dem „Konzentrierungs"-Formulierungsverfahren hergestellt wurden, transfiziert waren, höher war als für DMRIE-CTM/pCMVkmLUC-Komplexe, die nach herkömmlichen Verfahren hergestellt wurden. Die Resultate zeigen, dass die Zellkonfluenz für die 0,5 : 1–1 : 1- und 2 : 1-+/–-Ladungsverhältnis-Komplexe und DMRIE-C^TM hoch ist und für die 4 : 1- und 8 : 1-+/–-Ladungsverhältniskomplexe niedriger ist. Eine Verdopplung der Menge der Transfektionszubereitung erhöhte die Luciferaseexpression in Komplexen mit einem +/–-Ladungsverhältnis von 2 : 1, verringerte aber die Expression in Komplexen mit einem +/–-Ladungsverhältnis von 4 : 1, wie es in 14 gezeigt ist. 14 zeigt auch, dass die Zellkonfluenz verringert war, wenn die Menge des Komplexes mit einem +/–-Ladungsverhältnis von 4 : 1 verdoppelt wurde.
Der Effekt der Verwendung des herkömmlichen Verfahrens zur Herstellung von Transportvehikel/DNA-Komplexen, wie in Beispiel 2 beschrieben, wurde mit einer Verwendung des Konzentrierungsverfahrens zur Herstellung eines Transportvehikels/DNA-Komplexes verglichen. Lipid-verknüpfte Polyamidverbindungen (16 und 23)/pCMVkmLUC-Komplexe wurden nach den in Beispiel 2 beschriebenen herkömmlichen Verfahren hergestellt. HT1080-Zellen wurden innerhalb von 30 Minuten nach Formulierung transfiziert. Die Resultate werden als „Mischen" in 15 bezeichnet. In entsprechender Weise wurde Lipidverknüpfte Polyamidverbindung (16 und 23)/pCMVkmLUC-Komplexe nach dem Konzentrierungsverfahren hergestellt, worauf sich eine Transfektion von HT1080-Zellen 1 bis 7 Tage nach de_r Formulierung anschloss. Die Resultate sind als „vorgeformt" in den 14 und 15 bezeichnet. Komplexe von Lipofectin und DMRIE-C mit pCMVkmLUC wurden ebenfalls unter Verwendung des herkömmlichen Formulierungsverfahrens, das in Beispiel 2 beschrieben ist, hergestellt. Die in 15 gezeigten Resultate geben an, dass die Luciferaseaktivität in Fällen, die mit Komplexen, welche durch das Konzentrierungsverfahren hergestellt worden waren, transfiziert waren, höher war als in Fällen, die mit Komplexen transfiziert waren, welche durch das herkömmliche Verfahren hergestellt waren. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Färben mit Tryphan-Blau gemessen.
Obgleich die Erfindung anhand bestimmter bevorzugter Ausführungsformen detailliert beschrieben wurde, wird einzusehen sein, dass Modifikationen und Variationen innerhalb des Geistes und Rahmens liegen, der in den Ansprüchen beschrieben und beansprucht ist.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung, die ein sich wiederholendes Trimer aus monomeren Untereinheiten umfasst und die Formel besitzt:
wobei m eine ganze Zahl ausgewählt aus dem Bereich von 2 bis ungefähr 48 ist, Ra ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -H, -SH, -COOH, Sulfonyl, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12 Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; jedes R₁ unabhängig ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12 Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; wobei weniger als ungefähr 75% der sich wiederholenden Einheiten ein R₁ umfassen, welches Wasserstoff ist; Rc ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -H, -SH, -NH₂, Sulfonyl, Hydrazin, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12 Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; und jede Gruppe W ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂-Phenyl-, -CH₂CH₂O-, -CH₂CH=CH- und -CR₂R₃-, wobei R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer aliphatischen C1-C8-Gruppe oder einer C3-C12 Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkenyl-Gruppe, von denen jede mindestens ein Heteroatom ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stickstoff, Schwefel, Sauerstoff und Phosphor umfassen kann; und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann; und wobei jede Aryl-, Arylalkyl-, Arylalkenyl- oder Arylalkinyl-Gruppe mit weniger als 5 Kohlenstoffatomen außerdem mindestens ein Heteroatom umfasst; mindestens eine Gruppe ausgewählt aus Ra, Rc, R₁ in einer einzelnen monomeren Untereinheit, und W in einer einzelnen monomeren Untereinheit, eine Lipidgruppierung umfasst; und die Lipidgruppierung ausgewählt ist aus einem Phosphoglycerid, einem Glycosylglycerid, einem Sphingolipid, einem gesättigten oder ungesättigten Sterol und einer Fettsäure oder einem Fettalkohol mit 8 bis ungefähr 24 Kohlenstoffatomen.
Verbindung nach Anspruch 1, wobei R₁ ¹ bei physiologisch relevantem pH eine kationische Seitenkette ist, und R₁ ² und R₁ ³ beide bei physiologisch relevantem pH neutrale Seitenketten sind.
Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Lipidgruppierung ein Phosphatidylethanolamin oder ein Phosphatidylpro panolamin ist, das eine Phosphoglyceryl-Kopfgruppe besitzt, die zwei Alkyl- oder Alkenyl-Gruppierungen mit 6 bis ungefähr 25 Kohlenstoffatomen umfasst.
Verbindung nach Anspruch 1, 2 oder 3, wobei keine der Gruppen R₁ Wasserstoff ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Gruppe R₁ eine kationische Seitenkette ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aminoalkyl, (S)-α-Methylethylendiamino, Trimethylaminoethyl, Guanidinoalkyl, Aminobenzyl, Pyridinium, kationischen Seitenketten, die man bei natürlich vorkommenden Aminosäuren findet, und Derivaten davon ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Gruppe R₁ eine neutrale Seitenkette ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (S)-α-Methylbenzyl, (R)-α-Methylbenzyl, Benzyl, Phenethyl, Naphthylmethyl, (S)-α-Methylnaphthyl, (R)-α-Methylnaphthyl, N-Propylpyrrolidon, Cyclohexylmethyl, Furfuryl, 3,4,5-Trimethoxybenzyl, Alkoxyalkyl, Isoamyl, p-Methoxyphenethyl, neutralen Seitenketten, die man bei natürlich vorkommenden Aminosäuren findet, und Derivaten davon ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei mindestens eine Gruppe R₁ eine anionische Seitenkette ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carboxy, Carboxymethyl, Carboxyethyl, Benzoesäure, Phosphaten, Sulfaten, und Derivaten davon ist.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei jede Gruppe W -CR₂R₃- ist.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei R₂ und R₃ Wasserstoff sind.
Verbindung nach Anspruch 8, wobei R₂ oder R₃ eine Lipidgruppierung ist, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verknüpft sein kann.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei Ra ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -H, -SH, -COOH, Sulfonyl, und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verbunden sein kann.
Verbindung nach Anspruch 11, wobei R_a eine Lipidgruppierung ist, welche mit einer Linkergruppierung verbunden sein kann.
Verbindung nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei R_c ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -OH, -H, -SH, -NH₂, Sulfonyl, Hydrazin, und einer Lipidgruppierung, wobei die Lipidgruppierung mit einer Linkergruppierung verbunden sein kann.
Verbindung nach Anspruch 13, wobei Rc eine Lipidgruppierung ist, welche mit einer Linkergruppierung verbunden sein kann.
Zusammensetzung, die die Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und ein biologisch aktives Agens umfasst.
Verfahren zum Induzieren der Aufnahme eines biologisch aktiven Agens durch eine Zelle in vitro wobei das Verfahren umfasst: Bereitstellen einer Zusammensetzung, die eine wirksame Menge eines biologisch aktiven Agens und eine Lipid-verknüpfte Polyamidverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst; und das Inkontaktbringen einer biologischen Probe, welche eine Zelle umfasst, mit einer wirksamen Dosis der Zusammensetzung in vitro.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das biologisch aktive Agens eine Nucleinsäure ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 15 zur Verwendung beim Induzieren der Aufnahme eines biologisch aktiven Agens durch eine Zelle in vivo, durch Verabreichen der Zusammensetzung und des Agens an einen Patienten.
Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das biologisch aktive Agens eine Nucleinsäure ist.
Zusammensetzung, die eine Nucleinsäure komplexiert mit der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst, zur Verwendung beim Exprimieren eines Gens in einem Säuger, wobei die Nucleinsäure dazu in der Lage ist, das Gen in dem Säuger funktionell zu exprimieren, und der Komplex das Gen wirksam in eine Zelle in dem Säuger transfiziert.
Verwendung einer Zusammensetzung entsprechend Anspruch 15 zur Herstellung eines Medikamentes zum Induzieren der Aufnahme eines biologisch aktiven Agens durch eine Zelle in vivo, durch Verabreichen der Zusammensetzung und des Agens an einen Patienten.
Verwendung nach Anspruch 21, wobei das biologisch aktive Agens eine Nucleinsäure ist.
Verwendung einer Zusammensetzung, die eine Nucleinsäure komplexiert mit der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 umfasst, zur Herstellung eines Medikamentes für die Expression eines Gens in einem Säuger, wobei die Nucleinsäure dazu in der Lage ist, das Gen in dem Säuger funktionell zu exprimieren, und der Komplex das Gen wirksam in eine Zelle in dem Säuger transfiziert.
Verfahren, um die Nuclease-induzierte Polynucleotid-Degradierung im Wesentlichen zu inhibieren, wobei das Verfahren umfasst: Inkontaktbringen eines Polynucleotids mit einer Degradierungs-inhibierenden Menge der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, und Einbringen des Polynucleotids und der Lipid-verknüpften Polyamidverbindung in eine Nuclease-enthaltende Umgebung.
Verfahren zum Herstellen einer stabilen Zubereitung einer Nucleinsäure komplexiert mit einem Transportvehikel, wobei das Verfahren umfasst: a) Bereitstellen einer Nucleinsäure in einem ersten flüssigen Trägerstoff als verdünnte Nucleinsäurelösung, die im Wesentlichen Fällmittel-frei ist; b) Bereitstellen einer Lipid-verknüpften Polyamidverbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in einem zweiten flüssigen Trägermaterial als Transportvehikellösung, die im Wesentlichen Fällmaterial-frei ist; c) Kombinieren der verdünnten Nucleinsäurelösung mit der Transportvehikellösung, um eine verdünnte Zubereitung aus Transportvehikel/Nucleinsäure-Komplex zu bilden; und d) Reduzieren des Volumens der verdünnten Zubereitung, um eine stabile Zubereitung aus Transportvehikel/Nucleinsäure-Komplex zu bilden, wobei die Konzentration der Nucleinsäure in der stabilen Zubereitung höher ist als die Konzentration der Nucleinsäure in der verdünnten Nucleinsäurelösung, und wobei die stabile Zubereitung im Wesentlichen Fällmittel-frei ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei das Transportvehikel ein Liposom ist.