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Die
Erfindung betrifft Zusammensetzungen auf der Grundlage von Nukleinsäuren, deren
Herstellung und deren Verwendung. Insbesondere betrifft sie Zusammensetzungen,
welche wenigstens eine Nukleinsäure und
bestimmte kationische Polymere umfassen, und deren Verwendung für den Transfer
von Nukleinsäuren in
Zellen, insbesondere im Rahmen einer Gentherapie.
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Die
Gentherapie besteht darin, einen Mangel oder eine Anomalie (Mutation,
aberrante Expression u. s. w.) zu korrigieren oder die Expression
eines Proteins von therapeutischem Interesse durch Einführung einer genetischen
Information in die erkrankte Zelle oder das erkrankte Organ sicherzustellen.
Diese genetische Information kann eingeführt werden entweder in vitro
in eine aus dem Organ entnommene Zelle, wobei die modifizierte Zelle
dann in den Organismus wieder eingeschleust wird, oder direkt in
vivo in das geeignete Gewebe. Für
den Transfer von dieser genetischen Information sind verschiedene
Techniken beschrieben worden, darunter verschiedene Transfektionstechniken,
an welchen Komplexe von DNA und von DEAE-Dextran (Pagano et al.,
J. Virol. 1 (1967) 891), von DNA und von nuklearen Proteinen (Kaneda
et al., Science 243 (1989) 375), von DNA und von Lipiden (Felgner
et al., PNAS 84 (1987) 7413), von DNA und von Polylysin, der Einsatz von
Liposomen (Fraley et al., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431) u. s.
w. beteiligt sind. Vor kürzerer
Zeit ist der Einsatz von Viren als Vektoren für den Transfer von Genen als
eine vielversprechende Alternative zu diesen physikalisch-chemischen
Transfektionstechniken in Erscheinung getreten. in dieser Hinsicht
wurden verschiedene Viren auf ihr Vermögen, bestimmte Zellpopulationen
zu infizieren, hin getestet. insbesondere die Retroviren (RSV, HMS,
MMS u. s. w.), das HSV-Virus, die adeno-assoziierten Viren und die
Adenoviren.
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Gleichwohl
erlauben die bis heute entwickelten Techniken nicht, die mit dem
Transfer von Genen in die Zellen und/oder den Organismus verbundenen
Schwierigkeiten auf zufrieden stellende Weise zu meistern. Insbesondere
sind die mit dem Eindringen der Nukleinsäure in die Zellen verbundenen
Probleme nicht vollständig
gelöst.
Tatsächlich
verhindert insbesondere die polyanionische Natur der Nukleinsäuren ihr
Hindurchtreten durch die Zellmembranen hindurch. Wenn auch gezeigt
worden ist, dass die nackten Nukleinsäuren in der Lage sind, durch
die Plasmamembran von bestimmten Zelltypen in vivo hindurchzuwandern
(siehe insbesondere die Anmeldung Nr.
WO
90/11092 ), bleibt die Transfektionseffizienz ziemlich gering.
Außerdem
haben die nackten Nukleinsäuren
eine kurze Plasma-Halbwertszeit aufgrund ihres Abbaus durch die
Enzyme und deren Eliminierung durch das uropoetische System. Auch
wenn außerdem
die rekombinanten Viren erlauben, die Transfereffizienz der Nukleinsäuren zu
verbessern, weist deren Einsatz bestimmte Risiken, wie Pathogenität, Übertragung,
Replikation, Rekombination, Transformation, Immunogenität u. s.
w., auf. Zudem weist deren Herstellung gemäß den Normen der guten Herstellungspraxis
bestimmte Schwierigkeiten auf.
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Die
Patentanmeldung
WO A 93 20090 offenbart
Konjugate von kationischen Polymeren und Oligonukleotiden, die miteinander
durch kovalente Bindung mittels eines Kopplungsmittels gekoppelt
werden, wobei das Verhältnis
von Kationen zu Anionen der Konjugate zwischen 0,8 und 2 eingeschlossen
liegt.
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Die
Patentanmeldung
EPA 0424688 offenbart
ein Verfahren zum Modifizieren von pflanzlichen Zellen, um eine
fremde DNA zu inkorporieren. Dieses Verfahren umfasst einen Vorbehandlungsschritt
der Zellen mit einem Polykation, dann die Behandlung der vorbehandelten
Zelle mit einer Suspension, welche Nukleinsäure und kationische Liposomen
enthält.
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Die
Erfindung stellt eine vorteilhafte Lösung für diese unterschiedlichen Probleme
bereit. Die Anmelderin hat tatsächlich
gezeigt, dass bestimmte kationische Polymere besonders vorteilhafte
Eigenschaften für den
Transfer von Nukleinsäuren
in Zellen in vitro wie in vivo aufweisen. Außerdem weisen diese Polymere
den Vorteil auf, dass sie leicht zugänglich und wenig kostspielig
sind. Die Verwendung der kationischen Polymere gemäß der Erfindung
erlaubt gleichfalls, die mit dem Einsatz von viralen Vektoren verbundenen
Unzulänglichkeiten
(potentielle Gefahren, begrenzte Größe des transferierten Gens,
hoher Preis u. s. w.) zu vermeiden.
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Insbesondere
besteht die Erfindung in dem Nachweis der transfizierenden Eigenschaften
der Polymere der Formel (I):
in welcher:
- – R
ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel
sein kann; - – n
eine ganze Zahl zwischen 2 und 10 eingeschlossen ist;
- – p
und q ganze Zahlen sind,
mit der Maßgabe, dass die Summe p + q
derart ist, dass das mittlere Molekulargewicht des Polymers zwischen
100 und 107 Da eingeschlossen liegt, und
- – wobei
die jeweiligen Anteile des Polymers und der Nukleinsäure derart
ausgewählt
werden, dass das Verhältnis
R der Amingruppen des Polymers zu den Phosphatgruppen der Nukleinsäure zwischen
5 und 30 eingeschlossen liegt.
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Es
versteht sich, dass in der Formel (I) der Wert von n zwischen den
verschiedenen Motiven p variieren kann. So fasst die Formel (I)
zugleich die Homopolymere und die Heteropolymere zusammen.
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Ein
erster Gegenstand der Erfindung besteht folglich in einer Zusammensetzung,
welche gebildet wird aus einer Nukleinsäure und einer Lösung eines
kationischen Polymers, die vereinigt und homogenisiert worden sind,
wobei das kationische Polymer die allgemeine Formel (I) aufweist,
wie oben definiert.
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Die
Erfindung betrifft gleichfalls die Verwendung der kationischen Polymere
der Formel (I) für
den Transfer von Nukleinsäuren
in Zellen.
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Noch
bevorzugter liegt in der Formel (I) n zwischen 2 und 5 eingeschlossen.
Insbesondere weisen die Polymere von Polyethylenimin (PEI) und Polypropylenimin
(PPI) ganz und gar vorteilhafte Eigenschaften auf.
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Die
bevorzugten Polymere für
das Ausführen
der Erfindung sind jene, deren Molekulargewicht zwischen 103 und 5 × 106 Da eingeschlossen liegt. Als Beispiel kann
man Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht von 50000
Da (PEI 50 K) oder Polyethylenimin mit einem mittleren Molekulargewicht
von 800000 Da (PEI 800 K) aufführen.
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Die
im Rahmen der Erfindung eingesetzten Polymere können auf verschiedene Weisen
erhalten werden. Sie können
zuallererst chemisch ausgehend von dem entsprechenden Monomer unter
Bedingungen einer anionischen Polymerisation (beispielsweise Polymerisation
von Ethylenimin) oder durch Reduktion von Polyamiden, die durch
Polykondensation von Disäuren
mit Diaminen erhalten worden sind, oder ferner durch Reduktion von
Iminen, die durch Polykondensation von Dialdehyden mit Diaminen
erhalten worden sind, synthetisiert werden. Außerdem ist eine bestimmte Anzahl
von diesen Polymeren kommerziell zugänglich, wie insbesondere PEI
50 K oder PEI 800 K.
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Um
eine optimale Wirkung der Zusammensetzungen der Erfindung zu erhalten,
werden die jeweiligen Anteile des Polymers und der Nukleinsäure vorzugsweise
derart bestimmt, dass das Molverhältnis R = Amingruppen des Polymers/Phosphatgruppen
der Nukleinsäure
zwischen 0,5 und 50 eingeschlossen, mehr bevorzugt zwischen 5 und
30 eingeschlossen liegt. Ganz besonders vorteilhafte Ergebnisse
werden erhalten, indem 5 bis 15 Äquivalente
von Polymer-Amingruppen pro Nukleinsäure-Ladung eingesetzt werden.
Dieses Verhältnis
kann selbstverständlich
durch den Fachmann auf diesem Gebiet abhängig von dem eingesetzten Polymer, dem
Vorhandensein eines Hilfsstoffs (siehe unten), der Nukleinsäure, der
Zielzelle und der verwendeten Verabreichungsweise angepasst werden.
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In
den Zusammensetzungen der Erfindung kann die Nukleinsäure ebenso
gut eine Desoxyribonukleinsäure
wie eine Ribonukleinsäure
sein. Es kann sich um Sequenzen natürlichen oder artifiziellen
Ursprungs und insbesondere um genomische DNA, cDNA, mRNA, tRNA,
rRNA, hybride Sequenzen oder synthetische oder halbsynthetische
Sequenzen handeln. Außerdem
kann die Nukleinsäure
eine sehr variable Größe haben, welche
vom Oligonukleotid bis zum Chromosom geht. Diese Nukleinsäuren können humanen,
tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen u. s. w. Ursprungs
sein. Sie können
durch eine jegliche Technik, die dem Fach mann auf diesem Gebiet
bekannt ist, und insbesondere durch Screening von Banken, durch
chemische Synthese oder ferner durch gemischte Verfahren, welche
die chemische oder enzymatische Modifizierung von Sequenzen, die
durch Screening von Banken erhalten worden sind, umfassen, erhalten
werden. Sie können außerdem in
Vektoren, wie Plasmidvektoren, eingefügt werden.
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Insbesondere
bezüglich
Desoxyribonukleinsäuren
können
diese einzel- oder doppelsträngig
sein. Diese Desoxyribonukleinsäuren
können
therapeutische Gene, die Transkription oder die Replikation regulierende Sequenzen,
Antisinn-Sequenzen, Bindungsregionen für andere Zellbestandteile u.
s. w. tragen.
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Im
Sinne der Erfindung versteht man unter einem therapeutischen Gen
insbesondere ein jegliches Gen, welches ein Proteinprodukt mit einer
therapeutischen Wirkung kodiert. Das so kodierte Proteinprodukt kann
ein Protein, ein Peptid u. s. w. sein. Dieses Proteinprodukt kann
gegenüber
der Zielzelle homolog sein (d. h. ein Produkt, das normalerweise
in der Zielzelle exprimiert wird, wenn diese keinerlei Pathologie
aufweist). In diesem Falle erlaubt die Expression eines Proteins
beispielsweise eine unzureichende Expression in der Zelle oder die
Expression eines aufgrund einer Modifizierung inaktiven oder schwach
aktiven Proteins zu beheben oder ferner das Protein überzuexprimieren.
Das therapeutische Gen kann auch eine Mutante eines zellulären Proteins
mit einer erhöhten
Stabilität,
einer modifizierten Aktivität
u. s. w. kodieren. Das Proteinprodukt kann gleichfalls gegenüber der
Zielzelle heterolog sein. In diesem Falle kann ein exprimiertes
Protein beispielsweise eine mangelhaft vorhandene Aktivität in der
Zelle vervollständigen
oder beitragen, was es dieser erlaubt, eine Pathologie zu bekämpfen oder
eine Immunantwort zu stimulieren. Das therapeutische Gen kann gleichfalls
ein im Organismus sekretiertes Protein kodieren.
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Unter
den therapeutischen Produkten im Sinne der Erfindung kann man insbesondere
die Enzyme, die Blutderivate, die Hormone, die Lymphokine: Interleukine,
Interferone, TNF u. s. w. (
FR
9203120 ), die Wachstumsfaktoren, die Neurotransmitter oder
deren Vorstufen oder Syntheseenzyme, die trophischen Faktoren, BDNF,
CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, HARP/Pleiotrophin u.
s. w.; die Apolipoproteine: ApoAI, ApoAIV, ApoE u. s. w. (
FR 93 05125 ), Dystrophin
oder ein Minidystrophin (
FR 9111947 ),
das mit Mukoviszidose in Zusammenhang stehende Protein CFTR, die
Tumorsuppressorgene: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev u. s. w. (
FR 93 04745 ), die Gene,
welche an der Gerinnung beteiligte Faktoren: Faktoren VII, VIII,
IX, kodieren, die an der Reparatur der DNA teilnehmenden Gene, die
Suizidgene (Thymidinkinase, Cytosindesaminase) u. s. w. aufführen.
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Das
therapeutische Gen kann gleichfalls ein Gen oder eine Antisinn-Sequenz
sein, deren Expression in der Zielzelle erlaubt, die Expression
von Genen oder die Transkription von zellulären mRNAs zu kontrollieren.
Solche Sequenzen können
beispielsweise in der Zielzelle in zu zellulären mRNAs komplementäre RNAs transkribiert
werden und so deren Translation in Protein blockieren gemäß der in
dem Patent
EP 140 308 beschriebenen
Technik. Es kann sich auch um synthetische, gegebenenfalls modifizierte
Oligonukleotide handeln (
EP 92
574 ). Die Antisinn-Moleküle umfassen gleichfalls die
Sequenzen, die Ribozyme, die in der Lage sind, selektiv Ziel-RNAs
zu zerstören,
kodieren (
EP 321 201 ).
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Wie
weiter oben angegeben, kann die Nukleinsäure gleichfalls ein oder mehrere
Gene umfassen, die ein antigenes Peptid, welches in der Lage ist,
beim Menschen oder beim Tier eine Immunantwort zu erzeugen, kodieren.
Bei dieser besonderen Ausführungsweise
erlaubt die Erfindung folglich die Realisierung entweder von Impfstoffen
oder von immuntherapeutischen Behandlungen, die beim Menschen oder
Tier angewendet werden, insbesondere gegen Mikroorganismen, Viren
oder Krebserkrankungen. Es kann sich insbesondere um für das Epstein-Barr-Virus,
das HIV-Virus, das Hepatitis B-Virus (
EP
185 573 ), das Pseudorabiesvirus spezifische oder ferner
tumorspezifische (
EP 259 212 )
antigene Peptide handeln.
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Bevorzugt
umfasst die Nukleinsäure
gleichfalls Sequenzen, welche die Expression des therapeutischen
Gens und/oder des Gens, welches das antigene Peptid kodiert, in
der gewünschten
Zelle oder dem gewünschten
Organ erlauben. Es kann sich um Sequenzen handeln, die von Natur
aus für
die Expression des betreffenden Gens verantwortlich sind, wenn diese
Sequenzen in der Lage sind, in der infizierten Zelle ihre Funktion
auszuüben.
Es kann sich gleichfalls um Sequenzen unterschiedlicher Herkunft
handeln (die für
die Expression von anderen Proteinen verantwortlich sind oder sogar
synthetisch sind). Es kann sich insbesondere um Promotorsequenzen
von eukaryotischen oder viralen Genen handeln. Es kann sich beispielsweise
um Promotorsequenzen handeln, die aus dem Genom der Zelle, die man
zu infizieren wünscht,
stammen. Es kann sich ebenso um Promotorsequenzen handeln, die aus
dem Genom eines Virus stammen. In dieser Hinsicht kann man beispielsweise
die Promotoren der Gene E1A, MLP, CMV, RSV u. s. w. aufführen. Außerdem können diese
Expressionssequenzen durch Hinzufügung von Aktivierungs-, Regulationssequenzen
oder von Sequenzen, welche eine gewebespezifische Expression erlauben,
modifiziert werden.
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Außerdem kann
die Nukleinsäure
gleichfalls insbesondere strangaufwärts von dem therapeutischen Gen
eine Signalsequenz umfassen, welche das synthetisierte therapeutische
Produkt in Richtung der Sekretionswege der Zielzelle dirigiert.
Diese Signalsequenz kann die natürliche
Signalsequenz des therapeutischen Produkts sein, es kann sich aber
gleichfalls um eine jegliche andere funktionsfähige Signalsequenz oder um eine
künstliche
Signalsequenz handeln.
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Noch überdies
kann die Nukleinsäure
gleichfalls, insbesondere strangaufwärts von dem therapeutischen
Gen, eine Sequenz umfassen, welche das synthetisierte therapeutische
Produkt in Richtung eines bevorzugten Zellkompartiments dirigiert,
wie eine Kernlokalisierungssequenz.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
als solche oder in Kombination mit anderen Verbindungen oder Zusammensetzungen
eingesetzt werden. So umfassen in einer besonderen Ausführungsweise
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
außerdem
einen Hilfsstoff, welcher in der Lage ist, sich mit dem Polymer/Nukleinsäure-Komplex
zu assoziieren und das Transfektionsvermögen zu erhöhen, wobei der Hilfsstoff unter
den Lipiden, Proteinen, Lipopolyaminen und synthetischen Polymeren
ausgewählt
wird, welche in der Lage sind, sich mit dem Polymer/Nukleinsäure-Komplex
zu assoziieren. Wie dies die Beispiele der vorliegenden Anmeldung
zeigen, manifestiert sich diese Erhöhung sowohl in vitro als auch
in vivo.
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Die
in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
bevorzugt eingesetzten Hilfsstoffe sind kationische Lipide (welche
eine oder mehrere kationische Ladungen in ihrem polaren Abschnitt
umfassen) oder neutrale Lipide.
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Bezüglich der
kationischen Lipide kann es sich insbesondere um Lipopolyamine,
d. h. um ein jegliches amphiphiles Molekül, welches wenigstens eine
hydrophile Polyamin-Region und eine lipophile Region, welche miteinander
kovalent durch einen chemischen Arm verbunden sind, umfasst, handeln.
Die Polyamin-Region der im Rahmen der Erfindung eingesetzten Lipopolyamine
entspricht vorteilhafterweise der allgemeinen Formel H2N-(-(CH)m-NH-)l-H, in welcher
m eine ganze Zahl größer oder
gleich 2 ist und l eine ganze Zahl größer oder gleich 1 ist, wobei
m zwischen den verschiedenen Kohlenstoffgruppen, die zwischen zwei
Amingruppen enthalten sind, variieren kann. Vorzugsweise liegt m
zwischen 2 und 6 eingeschlossen und liegt l zwischen 1 und 5 eingeschlossen.
Noch mehr bevorzugt wird die Polyamin-Region durch Spermin oder
ein Analog von Spermin, bei welchem dessen DNA-Bindungseigenschaften
erhalten geblieben sind, repräsentiert.
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Die
lipophile Region kann aus einer oder mehreren, gesättigten
oder ungesättigten
Kohlenwasserstoffketten, Cholesterol, einem natürlichen Lipid oder einem synthetischen
Lipid, welche in der Lage sind, lamellare oder hexagonale Phasen
zu bilden, bestehen.
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Man
setzt im Rahmen der Erfindung vorteilhafterweise Lipopolyamine,
wie in der Patentanmeldung
EP 394
111 definiert, ein. Diese Anmeldung beschreibt gleichfalls
ein Verfahren, das für
die Herstellung dieser Lipopolyamine eingesetzt werden kann. Besonders
vorteilhaft verwendet man im Rahmen der Erfindung Dioctadecylamidoglycylspermin
(DOGS) oder 5-Carboxyspermylamid
von Palmitoylphosphatidylethanolamin (DPPES).
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Andere
Hilfsstoffe, die für
die Herstellung der Zusammensetzungen der Erfindung besonders bevorzugt
sind, werden durch die neutralen Lipide repräsentiert. Die Verwendung von
neutralen Lipiden ist besonders vorteilhaft, wenn das Ladungsverhältnis R
(Amingruppen/Phosphatgruppen) gering ist. Mehr bevorzugt sind die
im Rahmen der Erfindung eingesetzten neutralen Lipide Lipide mit
2 Fettketten.
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Besonders
vorteilhaft setzt man natürliche
oder synthetische, zwitterionische Lipide oder solche, die unter
physiologischen Bedingungen frei von Ionenladung sind, ein. Sie
können
insbesondere unter Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Oleoylpalmitoylphosphatidylethanolamin
(POPE), Distearoyl-, -palmitoyl-, -myristoylphosphatidylethanolamin
wie auch deren 1- bis 3-fach N-methylierten Derivaten; den Phosphatidylglycerolen,
den Diacylglycerolen, den Glycosyldiacylglycerolen, den Cerebrosiden
(wie insbesondere den Galactocerebrosiden), den Sphingolipiden (wie
insbesondere den Sphingomyelinen) oder ferner den Asialogangliosiden
(wie insbesondere den AsialoGM1 und GM2), ausgewählt werden.
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Diese
unterschiedlichen Lipide können
entweder durch Synthese oder durch Extraktion ausgehend von Organen
(Beispiel: dem Gehirn) oder von Eiern durch klassische Techniken,
die dem Fachmann auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, erhalten werden.
Insbesondere kann die Extraktion von natürlichen Lipiden mittels organischer
Lösemittel
ausgeführt
werden (siehe gleichfalls Lehninger, Biochemie).
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Die
Zusammensetzungen der Erfindung umfassen bevorzugt außer dem
kationischen Polymer in den vorstehend aufgeführten Verhältnissen 0,1 bis 20 Moläquivalente
Hilfsstoff auf 1 Moläquivalent
von Phosphatgruppen der Nukleinsäure
und mehr bevorzugt 1 bis 5.
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In
einer besonders vorteilhaften Ausführungsweise umfassen die Zusammensetzungen
der Erfindung ein Targeting-Element, welches erlaubt, den Transfer
der Nukleinsäure
orientiert auszuführen.
Dieses Targeting-Element kann ein extrazelluläres Targeting-Element, welches
erlaubt, den Transfer der Nukleinsäure in Richtung von bestimmten
Zelltypen oder bestimmten gewünschten
Geweben (Tumorzellen, Leberzellen, hämopoetische Zellen u. s. w.)
zu orientieren, sein. Es kann sich gleichfalls um ein intrazelluläres Targeting-Element
handeln, welches erlaubt, den Transfer der Nukleinsäure in Richtung
von bestimmten privilegierten Zellkompartimenten (Mitochondrien,
Zellkern u. s. w.) zu orientieren.
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Das
Targeting-Element ist mehr bevorzugt kovalent oder nicht-kovalent
an das Polymer der Formel (I) gebunden. Die Bindung kann insbesondere
durch ionische Wechselwirkung mit den Ammoniumgruppen oder durch
nukleophilen Angriff der Amingruppen des Polymers an Targenting-Elementen,
welche eine nukleofuge Gruppe (Halogen, Tosylat u. s. w.), einen
aktivierten Ester (Hydroxysuccinimid u. s. w.) oder ferner ein Isothiocyanat
umfassen, erhalten werden. Das Targeting-Element kann gleichfalls
an die Nukleinsäure
gebunden sein.
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Unter
den Targeting-Elementen, die im Rahmen der Erfindung einsetzbar
sind, kann man die Zucker, die Peptide, die Oligonukleotide oder
die Lipide aufführen.
Bevorzugt handelt es sich um Zucker und/oder Peptide, wie Antikörper oder
Antikörperfragmente,
Liganden von zellulären
Rezeptoren oder um Fragmente von diesen, Rezeptoren oder Fragmente
von Rezeptoren u. s. w. Es kann sich insbesondere um Liganden von Wachstumsfaktorrezeptoren,
von Zytokinrezeptoren, von zellulären Lektinrezeptoren oder von
Adhäsionsproteinrezeptoren
handeln. Man kann gleichfalls den Transferinrezeptor, den Rezeptor
der HDL und der LDL aufführen.
Das Targeting-Element kann gleichfalls ein Zucker sein, welcher
erlaubt, zielgerichtet die Asialoglycoproteinrezeptoren anzusteuern,
oder ferner ein Fab-Antikörperfragment,
welches erlaubt, zielgerichtet den Rezeptor des Fc-Fragments der
Immunglobuline anzusteuern.
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Die
erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
in Hinblick auf Verabreichungen auf topischem, kutanem, oralem,
rektalem, vaginalem, parenteralem, intranasalem, intravenösem, intramuskulärem, subkutanem,
intraokularem, transdermalem u. s. w. Wege formuliert werden. Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten vorzugsweise
einen für
eine injizierbare Formulierung, insbesondere für eine direkte Injektion im
Bereich des gewünschten
Organs oder für
eine Verabreichung auf topischem Wege (auf die Haut und/oder Schleimhaut)
pharmazeutisch annehmbaren Träger.
Es kann sich insbesondere um sterile, isotonische Lösungen oder
um trockene, insbesondere lyophilisierte Zusammensetzungen handeln,
die je nach Fall durch Zugabe von sterilisiertem Wasser oder physiologischer
Kochsalzlösung
die Bildung von injizierbaren Lösungen
erlauben. Die für
die Injektion eingesetzten Nukleinsäuredosen wie auch die Anzahl
von Verabreichungen können
abhängig
von verschiedenen Parametern und insbesondere abhängig von
der eingesetzten Verabreichungsweise, der betreffenden Pathologie,
dem zu exprimierenden Gen oder ferner der angestrebten Behandlungsdauer
angepasst werden.
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Wie
weiter oben angegeben, können
die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
für den
Transfer von Nukleinsäuren
in Zellen in vivo, in vitro oder ex vivo eingesetzt werden. Insbesondere
zeigen die Beispiele, dass die kationischen Polymere der Erfindung
eingesetzt werden können,
um auf sehr effiziente Weise Nukleinsäuren in zahlreiche Zellarten
und insbesondere in bestimmte Zellarten, die gewöhnlich schwierig zu transfizieren
sind, zu transferieren. Unter den getesteten Zellarten kann man
insbesondere die Fibroblasten, die Leberzellen, die Karzinome, die
Nierenzellen und die Neuronen aufführen. Außerdem veranschaulichen die nachfolgend
aufgeführten
Beispiele gleichfalls die Effizienz der Polymere der Erfindung für den Transfer
von Genen in vivo. Die mit den Vektoren der Erfindung erhaltenen
Ergebnisse sind jenen, die unter den gleichen Bedingungen mit anderen
Transfektionsmitteln beobachtet werden, überlegen und zeigen so das
hohe Potential der Zusammensetzungen der Erfindung.
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Die
Anmeldung beschreibt ein besonders vorteilhaftes Verfahren für die Behandlung
von Krankheiten, welches die Verabreichung einer Nukleinsäure, welche
in der Lage ist, die Krankheit zu korrigieren, assoziiert mit einem
kationischen Polymer, wie oben definiert, in vivo umfasst. Insbesondere
ist dieses Verfahren anwendbar auf die Krankheiten, die aus einem
Mangel an einem Protein- oder Nukleinsäureprodukt resultieren, und
kodiert die verabreichte Nukleinsäure dieses Proteinprodukt oder
sie enthält
das Nukleinsäureprodukt.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung bilden so besonders
vorteilhafte Hilfsmittel (Tools) für die Verabreichung und den
Transfer von Nukleinsäuren
in vivo.
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Die
Erfindung wird vollständiger
mit Hilfe der folgenden Beispiele, die als veranschaulichend angesehen
werden müssen,
beschrieben.
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Legende der Figuren:
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1:
Transfektionseffizienz von PEI 800 K bei pH 7 abhängig von
dem Verhältnis
R (Armgruppen des Polymers/Phosphatgruppen der Nukleinsäure).
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2:
Transfektionseffizienz von PEI 800 K bei pH 6 abhängig von
der DNA-Menge.
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3:
Transfektionseffizienz von PEI 800 K bei pH 6 abhängig von
dem Verhältnis
R.
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4:
Transfektionseffizienz von PEI 800 K abhängig vom pH.
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5:
Vergleich zwischen PEI 800 K und Polylysin.
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6:
Zytotoxizitätstest
von PEI 50 K.
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7:
Transfektionseffizienz von PEI 50 K in Gegenwart von Hilfsstoffen.
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8:
Wirksamkeit von PEI für
die Transfektion von HeLa-Zellen.
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9:
Wirksamkeit von PEI für
die Transfektion von Leber- und Nierenzellen.
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10:
Wirksamkeit von PEI für
den Transfer von Plasmid-DNA in embryonale Neuronen.
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11:
Wirksamkeit von PEI für
den Transfer von Oligonukleotiden in embryonale Neuronen.
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12:
Wirksamkeit von PEI für
den Transfer von DNA in vivo.
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BEISPIEL 1 – Für den Transfer von Genen in
vivo eingesetzte Plasmide
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Es
wurden drei Arten von Konstrukten eingesetzt, um die Aktivität der Zusammensetzungen
der Erfindung nachzuweisen: Plasmide, welche das Luciferase (Luc)
kodierende Gen umfassen, Plasmide, welche das β-Galactosidase kodierende Gen
(LacZ-Gen) umfassen, und Plasmide, welche das Chloramphenicolacetyltransferase
(CAT) kodierende Gen umfassen.
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1.1 Plasmide, welche das Luc-Gen umfassen
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Das
Plasmid pCMV-luc umfasst den Promotor des Zytomegalievirus (CMV),
welcher aus dem Plasmidvektor pcDNA3 (invitrogen) extrahiert worden
ist durch Schnitt mit den Restriktionsenzymen MluI und HindIII,
welcher sich strangaufwärts
von dem Luciferase kodierenden Gen befindet, inseriert in die MluI-
und HindIII-Stellen in dem Vektor pGL basic Vector (Promega).
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Das
Plasmid pGL2-Luc ist von kommerzieller Herkunft (Promega).
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Das
Plasmid T3RE-Luc enthält
ein synthetisches Oligonukleotid, welches einem palindromischen Schilddrüsenhormon-Response-Element
(Glass et al., Cell 56 (1989) 697) entspricht.
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1.2 Plasmide, welche das LacZ-Gen umfassen.
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Das
Plasmid pCMV-βGal
(Clontech) umfasst den CMV-Promotor, welcher strangaufwärts von
dem LacZ-Gen, welches β-Galactosidase
von Escherichia coli kodiert, gelegen ist. Der Vektor pSV-nls LacZ
(pAOnlsLacZ) umfasst den gleichen Promotor, eine Kernlokalisierungssequenz
(welche von dem SV40-Virus stammt) lokalisiert im Raster und strangaufwärts von
dem LacZ-Gen. Dieses Konstrukt erlaubt die Expression des Fusionsproteins
nls-β-Galactosidase im
Kern der Zellen (siehe De Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
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1.3 Plasmide, welche das CAT-Gen umfassen.
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Die
Plasmide, welche als Reportergen das Chloramphenicolacetyltransferase
(CAT) kodierende Gen unter der Kontrolle des RSV-Promotors (pRSV-CAT)
und des SV40-Promotors (pSV40-CAT) aufweisen, sind veröffentlicht
worden (Boutiller et al., Prog. NeuroPhychoPharmacol. et Biol. Psychiat.
16 (1992) 959; de Luze et al., PNAS 90 (1993) 7322).
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BEISPIEL 2 – Transfer von Nukleinsäure in Fibroblasten
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Dieses
Beispiel beschreibt den Transfer des Plasmids pGL2-luc in 3T3-Fibroblasten
mittels Polyethylenimin von 800000 Da.
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Protokoll:
Es wird eine 5,375 μM
Lösung
von PEI 800 K hergestellt und der pH wird mittels einer 1 N Salzsäurelösung auf
7 eingestellt. Diese Lösung
wird für
die Gentransferexperimente eingesetzt.
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Transfektionsprotokoll:
Die 3T3-Fibroblasten werden in einer Schale mit 24 Vertiefungen
24 h vor der Transfektion ausgesät
(50000 Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit 2 μg pGL2-Luc-Plasmid pro Vertiefung gemäß dem folgenden
Protokoll transfiziert:
2 μg
Plasmid und unterschiedliche Volumina der 5,375 μM Lösung von PEI 800 K (abhängig von
dem gewünschten
Ladungsäquivalentverhältnis) werden
getrennt in 50 μl
150 mM NaCl verdünnt
und gemischt. Nach 10 min werden die beiden Lösungen vereinigt und homogenisiert.
Nach einem erneuten Zeitraum von 10 min werden 900 μl DMEM zugesetzt.
Die so erhaltene Lösung
wird homogenisiert und sie wird nach 10 min auf den vorab mit DMEM-Medium
ohne Serum gespülten
Zellen verteilt. Am Ende von 2 h Transfektion werden 100 μl FCS (fötales Kälberserum)
pro Vertiefung zugegeben. Die Expression wird 24 h später gestoppt.
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Quantitative
Bestimmung der Luciferase: Dafür
wurde der Überstand
in Gegenwart eines Luciferin, Coenzym A und ATP enthaltenden Puffers
inkubiert und das emittierte Licht (im Allgemeinen während 10
s) wurde mit einem Luminometer gemessen (Wood K. (1990) Promega
Notes, 28).
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 1 aufgeführt. Sie
zeigen, dass das PEI erlaubt, das Plasmid pGL2-Luc effizient in
die Fibroblasten zu transferieren. Sie zeigen gleichfalls, dass
die Aktivität
in relativen Lichteinheiten (RLU = „relative light unit") besonders gut ist,
wenn man zwischen 5 und 20 Aquivalente von Amingruppen des PEI bezogen
auf die Phosphatgruppen der DNA verwendet. In einem Kontrollexperiment
ergibt das Plasmid allein ein Signal von etwa 100 RLU.
-
BEISPIEL 3 – Wirkung der DNA-Menge auf
die Transfektionseffizienz
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Auswirkung der Nukleinsäuremenge auf die Transfereffizienz
in 3T3-Fibroblasten durch PEI 800 K.
-
Die
3T3-Fibroblasten werden 24 h vor der Transfektion in einer Schale
mit 24 Vertiefungen ausgesät (50000
Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit steigenden Mengen von pCMV-Luc-Plasmid pro Vertiefung
und einem konstanten Ladungsverhältnis
(9 Äquivalente)
gemäß dem zuvor
beschriebenen Protokoll transfiziert. Es wurden zwei Punkte realisiert,
indem die Plasmidmenge auf zwei μg
pro Vertiefung durch pGEM-Plasmid (PROMEGA), welches das untersuchte
Gen nicht enthält,
vervollständigt
wurde. Am Ende von 3 h Transfektion werden 100 μl FCS-Serum pro Vertiefung zugesetzt.
Die Expression wird 24 h danach gestoppt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 2 dargestellt.
-
Die
Transfektionseffizienz nimmt mit der während der Transfektion eingesetzten
Plasmidmenge zu. Die Zugabe von nicht-transkribierter Träger-DNA
(pGEM) leistet keinen Beitrag zur Transfektion.
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BEISPIEL 4 – Transfer von Nukleinsäuren in
Fibroblasten : Untersuchung des Einflusses des Verhältnisses Amingruppen/Phosphatgruppen.
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Dieses
Beispiel beschreibt den Transfer von Nukleinsäuren in Fibroblasten bei pH
6 mittels einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
welche die Nukleinsäure
und PEI 800 K in unterschiedlichen Verhältnissen R (Amingruppen/Phosphatgruppen)
umfasst.
-
Protokoll:
Es wird eine 5,375 μM
Lösung
von PEI 800 K hergestellt und der pH wird mittels einer 1 N Salzsäurelösung auf
6 eingestellt. Diese Lösung
wird für
die Gentransferexperimente eingesetzt.
-
Die
3T3-Fibroblasten werden in einer Schale mit 24 Vertiefungen 18 h
vor der Transfektion ausgesät (50000
Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit 2 μg pGL2-Luc-Plasmid pro Vertiefung
gemäß dem in
Beispiel 2 eingesetzten Protokoll transfiziert.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 3 aufgeführt. Sie
zeigen, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
im gesamten Spektrum von R-Verhältnissen
zwischen 6 und 22 eingeschlossen besonders effizient sind.
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BEISPIEL 5 – Transfektionseffizienz in
Abhängigkeit
vom pH.
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Dieses
Beispiel beschreibt den Transfer von Nukleinsäuren in Fibroblasten mittels
einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung,
welche die Nukleinsäure
und PEI 800 K umfasst, unter unterschiedlichen pH-Bedingungen.
-
Das
eingesetzte Protokoll ist identisch mit jenem, das in Beispiel 2
beschrieben worden ist. Der pH wird durch die Zugabe von 1 N Salzsäure eingestellt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 4 aufgeführt. Sie
zeigen, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
bei unterschiedlichen pHs und insbesondere in Bereichen eines physiologischen
pHs (pH 5–8)
eingesetzt werden können.
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BEISPIEL 6 – Vergleich der Transfektionseffizienz
von PEI und von Polylysin
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Vergleichsergebnisse, die mit einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung
und mit einem anderen kationischen Polymer, Polylysin, hinsichtlich
des Transfers von Nukleinsäuren in
Fibroblasten erhalten wurden.
-
Protokoll:
Das in diesem Experiment eingesetzte Polylysin (PLL) ist das Polylysin
HBr mit einem mittleren Gewicht von 50 K. Die Endkonzentration an
Chloroquin beträgt
100 μM.
Das PEI wird bei pH 6 eingesetzt.
-
Protokoll:
Die 3T3-Fibroblasten werden in einer Schale mit 24 Vertiefungen
18 h vor der Transfektion ausgesät
(50000 Zellen pro Vertiefung). Sie werden mit pCMV-Luc-Plasmid gemäß dem in
Beispiel 2 eingesetzten Protokoll transfiziert. Die mit PLL in Gegenwart
von Chloroquin transfizierten Zellen werden nach 2 h gespült und in
Medium mit 10% Serum gegeben.
-
Die
Expression wird 24 h später
gestoppt.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 5 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erlauben,
Nukleinsäuren
in Fibroblasten zu transferieren mit einer Effizienz, die deutlich höher als
bei den früheren
kationischen polymeren Vektoren, wie Polylysin, ist.
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BEISPIEL 7 – Vergleich der Transfektionseffizienz
von NIH 3T3-Fibroblasten durch PEI 50 K und PEI 800 K
-
Dieses
Beispiel beschreibt den Einsatz und den Vergleich von zwei Polymeren
von PEI (PEI 50 K und PEI 800 K) für den Transfer von Nukleinsäuren in
Zellen.
-
Protokoll:
Die Zellen werden 24 h vor der Transfektion in einer Menge von 50000
Zellen pro 16 mm-Vertiefung ausgesät. Sie werden mit dem mit PEI
komplexierten Plasmid pCMV-Luc transfiziert. Das Moläquivalentverhältnis Amingruppen
von PEI/Phosphatgruppen der Nukleinsäure variiert von 6 bis 45 Äquivalente.
Für jede
Vertiefung verdünnt
man getrennt das PEI und 2 μg
DNA in 50 μl
NaCl (150 mM). Die Lösungen werden
dann gemischt, dann homogenisiert.
-
Nach
10 min wird dieses Volumen zu den Zellen hinzugegeben. Nach 24 h
werden die Zellen lysiert, die Lyselösung wird zentrifugiert und
der Überstand
eingesetzt, um die Luciferase-Aktivität zu quantifizieren. Die
Quantifizierung des Proteins erfolgt an einem Aliquot von diesem Überstand
durch den BOA-Test. Die Luciferase-Aktivität wird ausgedrückt in Lichteinheiten
(RLU)/10 s Integration/mg Protein.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle aufgeführt.
R | O | 6 Äqu. | 9 Äqu. | 18 Äqu. | 45 Äqu. |
PEI
50 K
RLU/10 s/mg Prot. | 7100 | 11
000 | 760
000 | 12
000 000 | 2
450 000 |
PEI
800 K
RLU/10 s/mg Prot. | 6253 | 200
000 | 16
700 000 | 5
650 000 | 525
000 |
-
Diese
Ergebnisse zeigen klar, dass das PEI 50 K ebenso vorteilhafte transfizierende
Eigenschaften wie PEI 800 K aufweist.
-
BEISPIEL 8 – Zytotoxizitätstest von
PEI
-
Wir
wollten die etwaige Toxizität
von PEI 50 K an NIH 3T3-Fibroblasten untersuchen. Für diese
Untersuchung haben wir den MTT-Test ausgewählt, welcher erlaubt, das Vermögen der
Zellen, MTT-Tetrazolium durch das mitochondriale Enzym Succinatdehydrogenase
zu MTT-Formazan
zu reduzieren, auszuwerten. Das Transfektionsprotokoll ist das gleiche
wie in Beispiel 7 (die DNA-Menge pro Vertiefung bleibt gleich (2 μg), die Anzahl
von Moläquivalent
von Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der DNA variiert von 9 bis
24). Nach 24 h Transfektion werden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen,
dann 90 min mit 0,05 mg/ml MTT inkubiert. Am Ende dieser Inkubation
wird das Medium der Zellen entfernt, die Zellen werden dreimal mit
PBS gewaschen, dann in 1 ml 10% SDS 10 min gelöst. Die optische Dichte der
Proben wird bei 540 nm abgelesen.
-
Die
Ergebnisse sind in der 6 aufgeführt. Sie zeigen, dass unter
den Bedingungen unserer Untersuchung das PEI 50 K keine signifikante
Mortalität
für die
NIH 3T3-Fibroblasten zur Folge hat.
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BEISPIEL 9 – Verwendung eines Hilfsstoffs,
um das Transfektionsvermögen
zu verbessern.
-
Dieses
Beispiel beschreibt die Verwendung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen,
welche ein kationisches Polymer und einen Hilfsstoff umfassen. Der
eingesetzte Hilfsstoff ist entweder ein neutrales Lipid (DOPE) oder
ein Lipopolyamin (DOGS).
-
Protokoll:
Zugabe von DOPE:
-
Es
wurden vier Moläquivalentverhältnisse
von Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der DNA untersucht: 6, 9,
18 und 21. Für
jede Vertiefung werden 12 Nanomole DOPE zu der Mischung von PEI
und DNA zugesetzt. Diese Lösung
wird dann für
die Transfektion, wie in Beispiel 7 beschrieben, eingesetzt.
-
Zugabe
von DOGS: Für
jede Vertiefung werden 4 Moläquivalente
Amingruppen von DOGS/Phosphatgruppen der DNA (entsprechend 6 Nanomolen
von DOGS auf 6 Nanomole von Phosphatgruppen) zu der PEI-Lösung vor
dem Komplexierungsschritt mit der DNA zugesetzt. Die Transfektion
erfolgt dann, wie in Beispiel 7 beschrieben.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 7 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die Zugabe von DOPE oder von DOGS erlaubt, die
Transfektionseigenschaften weiter zu verbessern, insbesondere bei
niedrigen Moläquivalentverhältnissen
von Amingruppen von PEI/Phosphatgruppen der DNA.
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BEISPIEL 10 – Gentransfer in HeLa-Zellen
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für den Transfer
von Genen in unterschiedliche Zellarten und insbesondere in die
Uteruskarzinomzellen HeLa eingesetzt werden können.
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Protokoll:
Die HeLa-Zellen werden 24 h vor der Transfektion in einer Menge
von 50000 Zellen pro 16 mm-Vertiefung ausgesät. Sie werden dann mit dem
Plasmid pCMV-Luc, welches entweder mit PEI oder mit dem Lipopolyamin
(DOGS) komplexiert ist, transfiziert. Es wurden vier Moläquivalentverhältnisse
von PEI 50 K- oder PEI 800 K-Amingruppen/Phosphatgruppen der DNA
untersucht: 6, 9, 18, 21. Das Lipopolyamin wird in einer Konzentration
von 8 Moläquivalenten
Amingruppen/Phosphatgruppen (12 Nanomole von DOGS) eingesetzt.
-
Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 8 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, welche
ein kationisches Polymer gegebenenfalls mit einem Hilfsstoff assoziiert
umfassen, erlauben, die HeLa-Zellen auf viel effizientere Weise
als die früheren
Systeme (insbesondere das Lipopolyamin DOGS) zu transfizieren.
-
BEISPIEL 11 – Transfer von Genen in unterschiedliche
Zellarten
-
Dieses
Beispiel zeigt ferner, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen für den Transfer
von Genen in sehr unterschiedliche Zellarten, wie Fibroblasten,
Uteruskarzinome, Hepatozytome oder Nierenzellen, eingesetzt werden
können.
Insbesondere beschreibt dieses Beispiel die Transfektion von HepG2-Zellen, K562-Zellen
und von primären
Kulturen von glattem Muskel vom Kaninchen durch PEI bei 9 Ladungsäquivalenten
und bei pH 6.
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Die
HepG2-Zellen werden in Schalen mit 24 Vertiefungen 24 h vor der
Transfektion (50000 Zellen pro Vertiefung) ausgesät. Sie werden
mit dem Plasmid pCMV-Luc gemäß dem in
Beispiel 2 beschriebenen Protokoll transfiziert. Nach 4 h Transfektion
werden 100 μl
FCS-Serum pro Vertiefung
zugesetzt. Die Expression wird 30 h danach gestoppt.
-
Die
K562-Zellen werden in Schalen mit 24 Vertiefungen in 0,5 ml RPMI-Medium
ohne Serum eine Stunde vor der Transfektion ausgesät. Sie werden
mit dem Plasmid pCMV-Luc gemäß dem folgenden
Protokoll transfiziert: Die Menge von gewünschtem Plasmid und das PEI
werden getrennt in 50 μl
150 mM NaCl verdünnt
und gemischt. Nach 10 min werden die beiden Lösungen vereinigt und homogenisiert.
Nach einem neuerlichen Zeitraum von 10 min werden 400 μl RMPI zugegeben.
Die so erhaltene Lösung
wird homogenisiert und nach 10 min wird sie auf den Zellen verteilt.
Nach 4 h Transfektion werden 100 μl
FCS-Serum pro Vertiefung zugegeben. Die Expression wird 30 h danach
gestoppt.
-
Die
primären
Kulturen von glattem Muskel vom Kaninchen wurden hergestellt, wie
von Fallier-Becker beschrieben. Die Zellen wurden dann entweder
mit 1 μg
oder mit 2 μg
mit PEI komplexiertem pCMV-Luc-Plasmid (gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen
Protokoll) transfiziert. Die Expression der Luciferase wird 24 h oder
48 h nach der Transfektion gestoppt.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 9 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen die effiziente
Transfektion von sehr vielgestaltigen und unterschiedlichen Zellarten
erlauben.
-
BEISPIEL 12 – Transfer von Plasmid-DNA
in eine primäre
Kultur von embryonalen Neuronen: Nachweis einer biologischen Aktivität
-
Die
primären
Kulturen von Neuronen wurden hergestellt, wie von Lezoualc'h et al. beschrieben.
Nach 36 h wurden die Kulturen mit 2 μg TRE-Luc-Plasmid (welches das
Luc-Gen unter der Kontrolle eines T3-Schilddrüsenhormon-Response-Elements
umfasst) und 0,5 μg
Träger-DNA
pro Vertiefung transfiziert.
-
Es
wurden zwei Versuchsbedingungen untersucht:
- – 9 Äquivalente
von Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen: 1 μg Plasmid
wurde in 2,28 μl
einer wässrigen
Lösung
von PEI 80 0K, 100 mM, pH 7, gegeben.
- – 13 Äquivalente
von Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen: 1 μg Plasmid
wurde in 3,33 μl
einer wässrigen
Lösung
von PEI 800 K, 100 mM, pH 7, gegeben.
-
Vor
der Komplexierung wurde das Plasmid in 50 μl 150 mM NaCl verdünnt und
das PEI wurde ebenfalls in einem zweiten Aliquot von 50 μl 150 mM
NaCl verdünnt.
Die Lösungen
wurden dann gemischt und auf die Zellen während 1 h aufgetragen. Das
Transfektionsmedium wurde dann abgenommen und durch frisches Kulturmedium
mit oder ohne T3 (1 nM) ersetzt. Nach 24 h wurden die Zellen lysiert,
die Lyselösung
wurde zentrifugiert und der Überstand
eingesetzt, um die Luciferase-Aktivität zu quantifizieren.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 10 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erlauben,
die DNA in die neuronalen Zellen zu transferieren und dass die so
transferierte DNA funktionsfähig
ist, denn ihre Aktivität
wird in Gegenwart von T3 verstärkt.
In dem Kontrollexperiment, das in Gegenwart des Plasmids allein
ausgeführt
wurde, wurde keinerlei Luciferase-Aktivität nachgewiesen.
-
BEISPIEL 13 – Transfer von Antisinn-Oligonukleotiden
in eine Primärkultur
von embryonalen Neuronen.
-
Die
Experimente wurden an primären
Kulturen von Neuronen, die wie in Beispiel 12 hergestellt wurden,
ausgeführt.
Nach 36 h wurden die Kulturen mit 2 μM 18-merem Antisinn-Oligonukleotid (ODN),
welches mit 9 Äquivalenten
Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen von PEI 800 K komplexiert
war, transfiziert.
-
Das
eingesetzte ODN ist gegen eine Region des Gens, welche den alpha-Rezeptor
der Schilddrüsenhormone
kodiert, gerichtet. Seine Sequenz ist die folgende:
-
Für 4 Vertiefungen
von 250 μl
Kulturmedium wurden die folgenden Produkte eingesetzt:
- – 8 μl einer 0,25
mM ODN-Lösung,
verdünnt
in 10 μl
150 mM NaCl, und
- – 20,8 μl einer wässrigen
12 mM Lösung
von PEI 800 K, pH 7, die vorab in einem zweiten Aliquot von 51,2 μl 150 mM
NaCl verdünnt
worden waren.
-
Die
Lösungen
wurden dann gemischt und 20 μl
der Mischung wurden auf die Zellen während 45 min aufgetragen. Das
Transfektionsmedium wurde dann abgenommen und durch frisches Kulturmedium
ersetzt. Die Zellen wurden dann in einer 4%-igen Paraformaldehydlösung fixiert,
gespült,
in Mowiol eingedeckt und unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 11 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erlauben,
Antisinn-Oligonukleotide in die neuronalen Zellen zu transferieren.
In dem in Gegenwart von Oligonukleotid allein ausgeführten Kontrollexperiment
wurde keinerlei Fluoreszenz detektiert.
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BEISPIEL 14 – Verwendung der Zusammensetzungen
der Erfindung für
den Transfer von Nukleinsauren in vivo in das Gehirn von neugeborenen
Mäusen.
-
Dieses
Beispiel beschreibt den Transfer des Plasmids pCMV-Luc in vivo in
das Gehirn von neugeborenen Mäusen.
Es zeigt die besonders vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
insbesondere für
Gentherapie-Anwendungen.
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30 μg pCMV-luc-Plasmid
(7,5 μl
einer Stammlösung
mit 4 μg/μl) wurden
in 22,5 μl
5%-iger steriler
Glucoselösung
(Endkonzentration 1 μg/μl) verdünnt. Dann
wurden 8,5 μl
100 mM PEI 800 K (hergestellt in Wasser und auf pH 6,9 gepuffert)
zugesetzt. Die so erhaltene Zusammensetzung enthält folglich 9 Äquivalente
Amingruppen bezogen auf die Phosphatgruppen.
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Die
Mischung wurde schnell gevortext und für intrazerebrale Injektionen
bei neugeborenen Mäusen eingesetzt.
Dafür wurden
die Mäuse
durch Kälte
anästhesiert
(auf eine Aluminiumfolie in Kontakt mit Eis gelegt), dann wurden
2 μl Mischung
(2 μg Nukleinsäure) pro
Maus injiziert. Die Injektionen erfolgten in den Kortex mit Hilfe
eines Mikromanipulators und einer Mikrospritze, die mit einer Mikroelektrode
verbunden waren.
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Die
Gehirne wurden 48 h später
entnommen, homogenisiert, zentrifugiert und der Überstand für die Quantifizierung der Luciferase
eingesetzt. Dafür
wurde der Überstand
in Gegenwart eines Luciferin, Coenzym A und ATP enthaltenden Puffers
inkubiert und das emittierte Licht (im Allgemeinen während 10
s) wurde mit einem Luminometer gemessen (Wood, K. (1990) Promega
Notes, 28).
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Die
erhaltenen Ergebnisse sind in der 12 aufgeführt. Sie
zeigen klar, dass die Zusammensetzungen erlauben, das Plasmid effizient
in das Gehirn der Mäuse
zu transferieren, wohingegen keinerlei signifikante Luciferase-Aktivität beobachtet
wird, wenn der Transfer mittels des Plasmids allein erfolgt.