DE19517532C2 - HBV-Vektoren und Zellen zu ihrer Bereitstellung - Google Patents

HBV-Vektoren und Zellen zu ihrer Bereitstellung

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Description

Die Erfindung betrifft HBV-Vektoren, Verfahren zu ihrer Bereitstellung und hierfür verwendbare Zellen sowie die Verwendung der HBV-Vektoren.
Für eine Gentherapie werden effiziente Verfahren benötigt, um eine "therapeuti­ sche" DNA in ausgewählte Zielorgane zu überführen. Bislang werden hierzu vor allem retrovirale Vektoren verwendet, die jedoch den Nachteil besitzen, daß die zu behandelnden Zellen zuerst in vitro propagiert, infiziert und dann wieder in den Patienten zurückgebracht werden müssen. Ziel einer Gentherapie sollte jedoch die Behandlung von Zellen in situ sein.
Für eine Gentherapie in vivo ist die strikte Organspezifität des eingesetzten Vektor­ systems unbedingte Voraussetzung. Von besonderem Interesse sind hierfür die Hepatozyten der Leber. Die Leber ist die Quelle der meisten Serumproteine und spielt eine zentrale Rolle bei der Regulation des Stoffwechsels in den peripheren Organen. Deshalb manifestiert sich in der Leber auch eine Vielzahl verschiedener, erblich bedingter Stoffwechseldefekte. Darüberhinaus ist die Leber auch bei einigen, nur sehr schlecht therapierbaren Virusinfektionen betroffen. Des weiteren könnte die Leber, vorausgesetzt, es gäbe ein geeignetes Gentransfersystem, als Bioreaktor zur Sezernierung verschiedenster Proteine benutzt werden. Damit könnten auch bei der Therapie von Erkrankungen, die sich nicht in der Leber manifestieren, neue Wege beschritten werden.
Aus J. Virol. 67 (6), 1993, Seiten 3254-3263 geht hervor, daß die am 5'-Ende des Genoms von HBV gelegene ε-Region für die Verpackung des HBV-Genoms notwendig ist.
Ein leberzellspezifisches Gentransfersystem, für das eine Anwendung in vivo in Betracht käme, gibt es allerdings bisher nicht.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Gentransfersys­ tem bereitzustellen, das leberzellspezifisch ist und für eine in vivo Gentherapie geeignet ist.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein HBV-Vektor, bei dem ein oder mehrere funktionelle Gene, die zur Replikation von HBV notwendig sind, zumindest teilweise deletiert sind.
Der Ausdruck "HBV" weist auf Hepatitis B Virus hin. Dies ist ein DNA-Virus mit einer Genomlänge von 3.2 kb. Das Genom von Hepatitis B Virus enthält vier teilweise überlappende offene Leserahmen (ORF): den Pol-ORF (HBV-Polymerase), die S-ORFs (Oberflächenproteine), die C-ORFs (Capsidproteine) und den X-ORF (viraler Transaktivator). Hepatitis B Virus ist leberzellspezifisch.
Der Ausdruck "HBV-Vektor" umfaßt jeglichen HBV-Vektor, der sich für einen Gentransfer, besonders bei einer Gentherapie, ganz besonders bei einer in vivo Gentherapie eignet. Der Ausdruck "Vektor" betrifft dabei ein DNA-Molekül wie auch ein Viruspartikel.
Der Ausdruck "bei dem ein oder mehrere funktionelle Gene, die zur Replikation von HBV notwendig sind, zumindest teilweise deletiert sind" weist darauf hin, daß in einem erfindungsgemäßen HBV-Vektor ein bis alle Gene, die zur Replikation von HBV notwendig sind, teilweise oder vollständig deletiert sind. Solche Gene sind insbesondere jene, die für die Polymerase, die Oberflächenproteine und die Capsidproteine von HBV codieren. Aufgrund vor­ stehender Deletion kann sich ein erfindungsgemäßer HBV-Vektor in einer eukaryo­ tischen Zelle nicht mehr selbständig replizieren.
Vorteilhaft ist es, wenn in einem erfindungsgemäßen HBV-Vektor die Gene für die Polymerase, die Oberflächenproteine und die Capsidproteine von HBV zumindest teilweise deletiert sind. Besonders vorteilhaft ist es, wenn diese Gene vollständig deletiert sind.
Weiterhin ist es von Vorteil, wenn in einem erfindungsgemäßen HBV-Vektor auch das Gen des Transaktivators von HBV mutiert oder teilweise bzw. vollständig deletiert ist.
Ein bevorzugter HBV-Vektor der vorliegenden Erfindung ist pHBV/V1. Seine DNA- Sequenz ist in Fig. 1 angegeben. In pHBV/V1 sind die Gene für die Polymerase, die Oberflächenproteine und die Capsidproteine von HBV vollständig deletiert. Ebenso weist das Gen für den Transaktivator von HBV eine ochre Mutation auf, pHBV/V1 wurde bei der DSM (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen) unter DSM 9947 am 3. Mai 1995 hinterlegt.
In einem erfindungsgemäßen HBV-Vektor kann aufgrund seiner Deletion eine Fremd-DNA inseriert und diese dann in den Zellen, die den HBV-Vektor aufnehmen, exprimiert werden. Eine Fremd-DNA kann jegliche DNA, insbesondere ein diagno­ stisch und/oder therapeutisch wirksames Gen sein. Die Länge der Fremd-DNA kann variieren, wobei es vorteilhaft ist, wenn sie etwa 3 kb nicht übersteigt. Diese Länge entspricht auf Proteinebene einem Molekulargewicht von mehr als 100 000, was für gentherapeutische Anwendungen gut ausreicht.
Die Insertion einer Fremd-DNA in einen erfindungsgemäßen HBV-Vektor erfolgt über die "multiple cloning site" des letzteren. Damit ist es auch möglich, die Fremd-DNA zwischen zwei inverse terminale Repetitionen von Adeno-assoziierten Viren zu inserieren. Dies würde die Integrationsfrequenz sowie die Integrations­ spezifität der Fremd-DNA in einem speziellen Chromosom erhöhen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bereit­ stellung vorstehender HBV-Vektoren. In einem solchen Verfahren wird der Defekt in der selbständigen Replikation eines erfindungsgemäßen HBV-Vektors über­ wunden, indem dieser in Zellen transfiziert wird, die funktionelle HBV-Proteine exprimieren. Die Expression der HBV-Proteine kann transient und/oder stabil sein, wobei eine stabile Expression bevorzugt ist. Durch das erfindungsgemäße Ver­ fahren werden HBV-Vektoren als DNA-Moleküle wie auch als Virus-Partikel bereit­ gestellt.
Zur Herstellung vorstehender Zellen können übliche Verfahren verwendet werden. Günstig ist es, Hepatomzellen, z. B. Hep G2-Zellen (vgl. Knowles, B. B. et al., Science 209, (1980), 497-499), mit Expressionsplasmiden zu transfizieren, die für funktionelle HBV-Proteine codieren. Besonders günstig ist es, wenn die Gene für die einzelnen funktionellen HBV-Proteine auf verschiedenen Expressionsplasmiden vorliegen.
Zur Herstellung vorstehender Expressionsplasmide erweist es sich als günstig, übliche, Selektionsmarker aufweisende HBV-Vektoren zu verwenden und in diesen den für die Verpackung notwendigen Epsilon-Bereich sowie unterschiedliche funktionelle HBV-Gene zu deletieren. Die DNA-Sequenz von HBV, einschließlich des Epsilon-Bereiches, ist bekannt (vgl. z. B. Fujiyama, A. et al., Nucl. Acids Res. 13, (1983), 4601-4610; Polack, J. R. und Ganem, D., J. Virol. 67, (1993), 3254-­ 3263).
Für die Transfektion von Hepatomzellen, z. B. Hep G2-Zellen, mit vorstehenden Expressionsplasmiden können übliche Verfahren verwendet werden. Für eine transiente Expression der funktionellen HBV-Proteine eignet sich z. B. ein DEAE- Dextranverfahren (vgl. McCutchan, J. H. und Pagano, J. S., J. Natl. Cancer Inst. 41, (1968), 351-357), während für eine stabile Expression z. B. ein Calcium­ phosphat-Präzipitationsverfahren (vgl. Graham, F. L. und von der Eb, A. J., Virology, 52 (1973), 456-467), zu nennen ist. Es werden Zellen erhalten, die funktionelle HBV-Proteine exprimieren. Solche Zellen sind ebenfalls Gegenstand der vorliegen­ den Erfindung. Von diesen werden solche bevorzugt, welche die Polymerase, die Oberflächenantigene und die Capsidproteine von HBV exprimieren, insbesondere stabil exprimieren.
Mit der vorliegenden Erfindung wird ein Gentransfersystem bereitgestellt, das leberzellspezifisch ist und sich für eine Gentherapie, insbesondere eine in vivo Gentherapie eignet. Das Gentransfersystem umfaßt HBV-Vektoren und Zellen, in denen diese Vektoren bereitgestellt werden können.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, Fremd-DNA in Leberzellen zu übertragen und dort zu exprimieren. Damit eröffnet sie nicht nur Möglichkeiten zur Behandlung monogener Stoffwechseldefekte, z. B. familiäre Hypercholesterinämie, Hyperamo­ nämie, Hyperbilirubinämie, Phenylketonurie, α1-Antitrypsinmangel, Hämophilie, etc., sondern auch zur Therapie multifaktorieller Erkrankungen, wie der Virushe­ patitiden, z. B. HBV, HCV, HDV, und nicht zuletzt des primären Leberzellkarzinoms.
Des weiteren gibt die vorliegende Erfindung die Möglichkeit, die Leber als Bioreak­ tor zur Sezernierung beliebiger therapeutischer Proteine ins Blut zu benutzen. Dadurch ergeben sich neue Aspekte in der Gentherapie, die weit über das ur­ sprüngliche Zielorgan hinausgehen, wie beispielsweise die Therapie von malignen Erkrankungen, von Virusinfektionen oder allgemein von Erkrankungen, welche sich nicht in der Leber manifestieren.
Darüberhinaus ist es mit der vorliegenden Erfindung möglich, verschiedenste Verfahren zur Abtötung von Viren in entnommenen Körperflüssigkeiten, z. B. Blut, zu monitoren. Hierzu kann ein erfindungsgemäßer, mit einem Minotor-Gen ver­ sehener HBV-Vektor der Körperflüssigkeit vor Beginn des Verfahrens zugegeben und dann in gewissen Zeitabständen bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung eignet sich somit bestens als Reagens für Diagnose und/oder Therapie.
Kurze Beschreibung der Zeichnung
Die Fig. 1 zeigt die DNA-Sequenz eines erfindungsgemäßen HBV-Vektors, pHBV/- V1. Diese DNA-Sequenz umfaßt folgendes:
Nukleotidnr. Elemente
3262-3272 "direct repeat II" von HBV
3496-3504 "direct repeat I" von HBV
3519-3579 Epsilon-Bereich von HBV
3694-3748 "multiple cloning site"
3962-3970 "direct repeat II" von HBV
4196-4204 "direct repeat I" von HBV
4288-4293 Poly A-Region
Die übrigen Nukleotide umfassen solche des Klonierungsvektors pSPT 19 (vgl. Beispiel 1).
Fig. 2 (nachgereicht) zeigt schematisch die Vorgehensweise bei der Klonierung der Plasmide pHBV-LDL und pHBV-PAH.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Konstruktion eines erfindungsgemäßen HBV-Vektors, pHBV/V1
Aus dem Plasmid pBRHBadr4 (vgl. Fujiyama, A. et al., vorstehend), das einen HBV Subtyp, adr 4, enthält, wurde ein 621 bp langes BamHI/Stu I-Fragment von adr 4 herausgeschnitten und in den mit BamHI/Sma I geöffneten Klonierungsvektor pSPT 19 (vgl. Katalog von Boehringer Mannheim, Bestellnr. 909815) inseriert. Es wurde das Plasmid pSPT 0.2x HBV erhalten. Dieses Plasmid enthält alle für die HBV- Replikation notwendigen, regulatorischen Elemente der EII/Cp-Region. In pSPT 0.2x HBV wurde an der BamHI-Restriktionsstelle ein komplettes 3215 bp langes HBV- Genom (BamHI/BamHI-Fragment) von pBRHBadr4 (vgl. vorstehend) eingesetzt. Es wurde das Plasmid pSPT 1.2x HBV erhalten. In diesem Plasmid liegen die vor­ stehenden, regulatorischen Elemente der EII/Cp-Region am 5'Ende und auch am 3'- Ende des HBV-Anteils vor. Ferner wurde in den X-ORF (vgl. vorstehend) von pSPT 1.2x HBV eine ochre Mutation im Codon 8 eingefügt. Es wurde das Plasmid pSPT 1.2x HBV Mx erhalten. Dieses Plasmid wurde mit Stul und Ncol (Schnittstellen im HBV-Genom) gespalten und die funktionellen Gene von HBV wurden entfernt. Stattdessen wurde eine "multiple cloning site" eingefügt. Es wurde ein erfindungs­ gemäßer HBV-Vektor, pHBV/V1, erhalten.
Beispiel 2 Expression einer Fremd-DNA in einem erfindungsgemäßen HBV-Vektor, pHBV/V1
In die "multiple cloning site" of pHBV/V1 von Beispiel 1 wurde eine bekannte Fremd-DNA inseriert. Dies war das Luciferase-Gen bzw. das LacZ-Genfragment. Im ersten Fall wurde das Plasmid pV1/HBV-Luc und im zweiten das Plasmid pV1/HBV- LacZ erhalten. Beide Plasmide wurden zu einer transienten Transfektion von HepG2-Zellen (vgl. vorstehend) verwendet.
Es zeigte sich, daß beide Fremd-DNAs exprimiert wurden. Dies ist auch ein Nach­ weis für die Replikation von pHB/V1 in Zellen, die HBV-WT-Partikel produzieren.
Beispiel 3 (nachgereicht)
Die vorliegende Erfindung betrifft einen HBV-Vektor, bei dem ein oder mehrere funktionelle Gene, die zur Replikation von HBV notwendig sind, zumindest teilweise deletiert sind. Ein solcher Vektor wird für die Herstellung der nachfolgenden Ex­ pressionsplasmide verwendet. Im einzelnen handelt es sich um folgende Expres­ sionsplasmide:
pV1/HBV-LUC
In den erfindungsgemäßen HBV-Vektor ist ein Indikator-Gen, nämlich das Lucifera­ se-Gen integriert.
pHBV-LDL
In den erfindungsgemäßen HBV-Vektor ist ein therapeutisches Gen, nämlich das humane LDL-Rezeptor-Gen integriert (vgl. Fig. 2).
pHBV-PAH
In den erfindungsgemäßen HBV-Vektor ist ein therapeutisches Gen, nämlich das humane Phenylalaninhydroxylase-Gen integriert (vgl. Fig. 2)
pV1-HBV-LUC, pHBV-LDL bzw. pHBV-PAH werden jeweils zur Transfektion der erfindungsgemäßen HepG2-Zellen verwendet. Die Transfektion erfolgt über das DEAE-Dextranverfahren.
Es werden HBV-Partikel erhalten, welche die einzelnen Expressionsplasmide in Form von RNA enthalten. Mittels CsCI-Dichtegradientenzentrifugation werden die HBV- Partikel bis zu 100-fach angereichert, bevor sie einer Dialyse gegen physiologischen Puffer unterzogen werden. Von den erhaltenen Dialysaten werden jeweils 10-100 ml für intravenöse Verabreichungen verwendet. Beispielsweise werden 10 ml des pV1-HBV-LUC-Dialysats an drei Schimpansen intravenös verabreicht. Zu verschie­ denen Zeitpunkten werden Organproben entnommen und auf die Expression des Luciferase-Gens getestet. Hierfür wird ein üblicher Luciferase-Test durchgeführt.
Es zeigt sich, daß das Luciferase-Gen in Leberzellen, nicht aber in Zellen anderer Organe, wie Niere, Milz, Magen oder Gehirn, exprimiert wird.
Damit wird deutlich, daß sich die vorliegende Erfindung eignet, Fremd-Gene in Leberzellen einzuführen und zu exprimieren. Da Leberzellen sich nur etwa einmal pro Jahr teilen, können Fremd-Gene, selbst wenn sie nur extrachromosomal vor­ liegen, dauerhaft exprimiert werden. Insofern eignet sich die vorliegende Erfindung nicht nur für diagnostische sondern auch für therapeutische Zwecke.

Claims (8)

1. HBV-Vektor, bei dem ein oder mehrere funktionelle Gene, die zur Replika­ tion von HBV notwendig sind, zumindest teilweise deletiert sind.
2. HBV-Vektor nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ferner das Gen für den Transaktivator von HBV mutiert oder teilweise bzw. vollstän­ dig deletiert ist.
3. HBV-Vektor nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Gene für die Polymerase, die Oberflächenproteine und die Capsidproteine von HBV deletiert sind und das Gen für den Transaktivator von HBV mutiert ist.
4. HBV-Vektor nach Anspruch 3, hinterlegt bei der DSM unter DSM 9947.
5. Verfahren zur Bereitstellung eines HBV-Vektors nach Anspruch 3 mit den folgenden Verfahrensschritten:
  • a) Transfektion von Säugerzellen mit dem HBV-Vektor nach Anspruch 3, wobei die Säugerzellen die Polymerase, die Oberflächenproteine und die Capsidproteine von HBV exprimieren, und
  • b) Isolierung des in (a) erhaltenen HBV-Vektors.
6. Säugerzellen, exprimierend die Polymerase, die Oberflächenproteine und die Capsidproteine von HBV.
7. Verwendung des HBV-Vektors nach einem der Ansprüche 1-4 als Rea­ gens für die leberzellspezifische Diagnose und/oder Therapie.
8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei die Therapie eine in vivo Genthera­ pie ist.
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