DE69232497T2

DE69232497T2 - Behandlung von krankheiten durch ortsspezifische instillation von zellen oder ortsspezifische transformation von zellen sowie ausrüstung dafür

Info

Publication number: DE69232497T2
Application number: DE69232497T
Authority: DE
Inventors: G. Nabel; J. Nabel
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2012-06-27
Also published as: EP0591385A4; JP2002239010A; JP2001213806A; EP1213032A1; EP1013287A3; WO1993000051A1; DK0591385T3; DE69232497D1; ATE385810T1; JP3712409B2; JPH06509328A; EP0591385A1; EP1013287A2; EP1927368A3; ATE214576T1; DE1213032T1; EP1927368A2; ES2301602T3; EP1213032B1; US5328470A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung von Krankheiten durch die ortsspezifische Transformation von Zellen, insbesondere ein Verfahren zur Modulation des Immunsystems eines Lebewesens durch die In-vivo-Einführung rekombinanter Gene.

Technischer Hintergrund

Die effektive Behandlung von vielen erworbenen und ererbten Krankheiten bleibt eine Hauptherausforderung der modernen Medizin. Die Fähigkeit, therapeutische Mittel spezifischen Stellen in vivo zuführen zu können, wäre ein Vorteil bei der Behandlung von beispielsweise lokalisierten Erkrankungen. Außerdem wäre die Fähigkeit, das Verteilen eines therapeutischen Mittels durch das Kreislaufsystem zu bewirken, für die Behandlung von beispielsweise vererbten Erkrankungen und erworbenen Erkrankungen oder Krebs effektiv.
Beispielsweise wäre es günstig, ein Antitumormittel in enger Nähe zu einem Tumor auf gleichmäßige Weise zu verabreichen.
Außerdem wäre es für viele Erkrankungen günstig, entweder lokal oder systemisch die Expression eines defizienten endogenen Gens, die Expression eines exogenen Gens oder die Unterdrückung eines endogenen Gens zu bewirken. Wiederum bleiben dies nicht realisierte Ziele.
Außerdem ist es günstig, das Immunsystem eines Lebewesens modulieren zu können. Insbesondere wurde viel Arbeit auf die Entwicklung von Vakzinen zur Bereitstellung eines immunologischen Schutzes vor einer Infektion gerichtet. Jedoch ist die Entwicklung sicherer Vakzine, die an eine große Zahl von Patienten leicht verabreicht werden können, problematisch, und für viele Krankheiten, beispielsweise AIDS, ist noch keine sichere und wirksame Vakzine verfügbar. Ferner ist es manchmal auch günstig, die Immunantwort von Lebewesen spezifisch zu unterdrücken, um eine Transplantatabstoßung zu verhindern. Arbeiten zur Unterdrückung einer Transplantatabstoßung führten zur Entwicklung von Arzneimitteln, die zu einer allgemeinen Unterdrückung der Immunantwort statt einer spezifischen Unterdrückung der Transplantationsantigene führen, und diese Arzneimittel sind nicht immer wirksam. Daher besteht nach wie vor Bedarf nach einem Verfahren zur Modulation des Immunsystems eines Lebewesens.

Beschreibung der Erfindung

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zum Bewirken der Expression eines exogenen Gens bei einem Patienten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zum Bewirken der Expression eines defizienten endogenen Gens bei einem Patienten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zum Unterdrücken der Expression eines endogenen Gens bei einem Patienten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung einer Krankheit durch Bewirken entweder der Expression eines exogenen Gens, der Expression eines defizienten endogenen Gens oder der Unterdrückung der Expression eines endogenen Gens bei einem Patienten.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Modulation des Immunsystems eines Lebewesens.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Modulation des Immunsystems eines Lebewesens zur Sensibilisierung des Lebewesens für ein Fremdmolekül.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Stimulation des Immunsystems eines Lebewesens zur Zurückweisung von Proteinen, um vor einer Infektion durch einen Mikroorganismus oder Virus zu schützen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Modulation des Immunsystems eines Lebewesens, um dem Lebewesen Toleranz gegenüber einem Fremdmolekül zu verleihen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Modulation des Immunsystems eines Lebewesens, um die Tendenz zu einer Transplantatabstoßung zu verringern.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten, dass diese und andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung, die im Laufe der folgenden detaillierten Beschreibung der Erfindung deutlich werden, durch (a) eine Zusammensetzung zur ortsspezifischen Transformation von Zellen bei einem Patienten gemäß den beigefügten Ansprüchen 1-6 gelöst werden.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung entdeckten, dass durch eine Transformation von Zellen eines Lebewesens in vivo das Immunsystem des Lebewesens moduliert werden kann. Insbesondere kann durch Transformation von Zellen eines Lebewesens mit einem rekombinanten Gen durch ortsspezifische oder systemische Verabreichung das Immunsystem des Lebewesens so moduliert werden, dass das Lebewesen für das Molekül, das das rekombinante Gen codiert, sensibilisiert wird. Alternativ kann durch Transformation von Zellen eines Lebewesens mit einem rekombinanten Gen spezifisch an einer Stelle, die die Spezifität des Immunsystems bestimmt, beispielsweise der Thymus, das Immunsystem eines Lebewesens so moduliert werden, dass es die Immunantwort auf das durch das rekombinante Gen codierte Molekül unterdrückt.
Ein vollständigeres Verständnis der Erfindung und viele der damit verbundenen Vorteile derselben werden ohne weiteres erhalten, wenn diese unter Bezug auf die folgende detaillierte Beschreibung besser verstanden wird.

Bestes Verfahren zur Durchführung der Erfindung

In einer Ausführungsform wird die vorliegende Erfindung der zur Behandlung von Erkrankungen, wie vererbten Erkrankungen, systemischen Erkrankungen, Erkrankungen spezieller Organe oder von Tumoren durch Transformation von Zellen verwendet.
Transformation ist der Prozess, durch den Zellen ein exogenes Gen durch direkte Infektion, Transfektion oder andere Mittel der Aufnahme aufnehmen.
Der Ausdruck "Vektor" ist bekannt und synonym mit der häufig verwendeten Phrase "Klonierungsvehikel". Ein Vektor ist nicht-chromosomale doppelsträngige DNA, die ein intaktes Replikon umfasst, so dass der Vektor repliziert wird, wenn er in einen einzelligen Organismus beispielsweise durch einen Transformationsprozess gebracht wird. Virale Vektoren umfassen Retroviren, Adenoviren, Herpesviren, Parvoviren oder sonstige modifizierte natürlich vorkommende Viren. Vektor bedeutet auch eine Formulierung aus DNA mit einer Chemikalie oder Substanz, die eine Aufnahme durch Zellen ermöglicht.
In einer weiteren Ausführungsform sorgt die vorliegende Erfindung für die Hemmung der Expression eines Gens. Vier Ansätze können verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen. Diese umfassen die Verwendung von Antisensemitteln, zweierlei synthetischen Oligonucleotide, die zum RNA komplementär sind (L. J. Maher III und B. J. Dolnick, Arch. Biochem. Biophys., 253, 214-220 (1987) und P. C. Zamecnik et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 4143-4146 (1986)) oder die Verwendung von Plasmiden, die das reverse Komplement dieses Gens exprimieren (J. H. Izant und H. Weintraub, Science, 229, 345-352 (1985); Cell, 36, 1077-1015 (1984)). Außerdem können katalytische RNAs, die Ribozyme genannt werden, spezifisch RNA-Sequenzen abbauen (O. C. Uhlenbeck, Nature, 328, 596-600 (1987), J. Haseloff und W. L. Gerlach, Nature, 334, 585-591 (1988)). Der dritte Ansatz umfasst "intrazelluläre Immunisierung", wobei Analoga intrazellulärer Proteine spezifisch deren Funktion stören können (A. D. Friedman, S. J. Triezenberg und S. L. McKnight, Nature, 334, 452-454 (1988)), was detailliert im folgenden beschrieben ist.
Die ersten Ansätze können verwendet werden, um spezifisch Transkripts in Zellen zu entfernen. Der Verlust eines Transkripts kann durch S1-Nuclease-Analyse und die unter Verwendung eines funktionellen Tests bestimmte Expression von Bindungsprotein bestätigt werden. Einzelsträngige Oligonucleotidanaloga können dazu verwendet werden, die Prozessierung oder Translation der mRNA des Transkriptionsfaktors zu stören. Kurz gesagt, können synthetische Oligonucleotide oder Thiolderivatanaloga (20-50 Nucleotide), die zum Codierungsstrang des Zielgens komplementär sind, hergestellt werden. Diese Antisensemittel können gegen unterschiedliche Regionen der mRNA hergestellt werden. Sie können komplementär zur 5'-gelegenen nicht-translatierten Region, zur Translationsinitiierungsstelle und den anschließenden 20-50 Basenpaaren, zur zentralen Codierungsregion oder zur 3'-gelegenen nicht-translatierten Region des Gens sein. Die Antisensemittel können mit transfizierten Zellen vor einer Aktivierung inkubiert werden. Die Wirksamkeit von auf unterschiedliche Teile der Messenger-RNA gerichteten Antisensekonkurrenten kann verglichen werden, um zu bestimmen, ob spezifische Regionen hinsichtlich der Verhinderung der Expression dieser Gene wirksamer sind.
RNA kann auch auf autokatalytische Weise wirken, wobei es eine Autolyse bewirkt oder spezifisch komplementäre RNA- Sequenzen abbaut (O. C. Uhlenbeck, Nature, 328, 596-600 (1987), J. Haseloff und W. L. Gerlach, Nature, 334, 585-591 (1988) und C. J. Hutchins et al., Nucleic Acids Res., 14, 3627-3640 (1986)). Die Anforderungen für eine erfolgreiche RNA-Spaltung umfassen eine Hammerkopfstruktur mit einer konservierten RNA-Sequenz in der diese Struktur flankierenden Region. An diese katalytische Domäne angrenzende Regionen wurden komplementär zu einer spezifischen RNA gebildet, wodurch das Ribozym auf spezifische zelluläre mRNAs zielgerichtet wird. Zur Hemmung der Produktion eines spezifischen Zielgens kann die dieses Gen codierende mRNA unter Verwendung von Ribozymen spezifisch abgebaut werden. Kurz gesagt, kann jede GUG-Sequenz innerhalb des RNA-Transkripts als Target für einen Abbau durch das Ribozym dienen. Diese können durch DNA-Sequenzanalyse identifiziert werden und das RNA-Transkript durchspannende GUG-Stellen können für einen spezifischen Abbau verwendet werden. Stellen in der 5'- gelegenen nicht-translatierten Region, in der Codierungsregion und in der 3'-gelegenen nicht-translatierten Region können als Target verwendet werden, um zu bestimmen, ob eine Region hinsichtlich eines Abbaus dieses Transkripts wirksamer ist. Synthetische Oligonucleotide, die 20 Basenpaare einer komplementären Sequenz stromaufwärts der GUG- Stelle, die Hammerkopfstruktur und ~20 Basenpaare einer komplementären Sequenz stromabwärts dieser Stelle codieren, können an der relevanten Stelle in der cDNA inseriert werden. Auf diese Weise kann das Ribozym auf das gleiche zelluläre Kompartiment wie die endogene Botschaft zielgerichtet werden. Ribozyme, die stromabwärts von spezifischen Enhancersequenzen, die eine hochgradige Expression in spezifischen Zellen ergeben, inseriert sind, können ebenfalls erzeugt werden. Diese Plasmide können in relevante Target- zellen unter Verwendung von Elektroporation und Cotransfektion mit einem neomycinresistenten Plasmid, pSV2-Neo, oder einem anderen selektionsfähigen Marker eingeführt werden. Die Expression dieser Transkripte kann durch Northern-Blot- und S1-Nucleaseanalyse bestätigt werden. Wenn sie bestätigt wird, kann die Expression von mRNA durch S1-Nuclease-Schutz bewertet werden, um zu bestimmen, ob die Expression dieser Transkripte die Gleichgewichtskonzentrationen der Target- mRNA und der Gene, die sie reguliert, verringert. Die Proteinkonzentration kann ebenfalls geprüft werden.
Gene können auch durch die Herstellung von mutierten Transkripten, denen zur Aktivierung erforderliche Domänen fehlen, gehemmt werden. Kurz gesagt, wird nach der Identifizierung der Domäne eine mutierte Form, die zur Stimulierungswirkung nicht fähig ist, synthetisiert. Dieses gestutzte Genprodukt kann stromabwärts der SV-40-Enhancersequenz in ein Plasmid, das das Neomycinresistenzgen enthält, inseriert werden (R. Mulligan und P. Berg, Science, 209, 1422-1427 (1980) (in einer getrennten Transkriptionseinheit). Dieses Plasmid kann in Zellen eingeführt und unter Verwendung von G418 selektiert werden. Das Vorhandensein der mutierten Form dieses Gens wird durch S1-Nucleaseanalyse und durch Immunfällung bestätigt. Die Funktion des endogenen Proteins in diesen Zellen kann auf zwei Wegen bewertet werden. Erstens kann die Expression des normalen Gens geprüft werden. Zweitens kann die bekannte Funktion dieser Proteine bewertet werden. Im Falle, dass diese mutierte interzellulär störende Form gegenüber ihrer Wirtszelle toxisch ist, kann sie auf einem induzierbaren Steuerelement, beispielsweise einem Metallothioneinpromotor, eingeführt werden. Nach der Isolierung stabiler Linien können Zellen mit Zn oder Cd inkubiert werden, um dieses Gen zu exprimieren. Seine Wirkung auf Wirtszellen kann dann bewertet werden.
Fortschritte in der Biochemie und Molekularbiologie in den letzten Jahren führten zur Konstruktion von "rekombinanten" Vektoren, in denen beispielsweise Retroviren und Plasmide so hergestellt wurden, dass sie exogene RNA bzw. DNA enthalten. In speziellen Fällen kann der rekombinante Vektor heterologe RNA oder DNA umfassen, wobei RNA oder DNA gemeint ist, die für ein Polypeptid, das üblicherweise nicht durch den einer Transformation durch den rekombinanten Vektor zugänglichen Organismus hergestellt wird, codiert. Die Herstellung rekombinanter RNA- und DNA-Vektoren ist bekannt und muss nicht detailliert beschrieben werden. Jedoch wird eine kurze Beschreibung dieses Verfahrens hier als Bezug aufgenommen.
Beispielsweise kann ein Retrovirus oder Plasmidvektor so gespalten werden, dass er lineare RNA oder DNA mit ligierbaren Enden ergibt. Diese Enden werden an exogene RNA oder DNA mit komplementären in gleicher Weise ligierbaren Enden gebunden, wobei ein biologisch funktionelles rekombinantes RNA- oder DNA-Molekül mit einem intakten Replikon und einer gewünschten phänotypischen Eigenschaft gebildet wird.
Eine Vielzahl von Techniken stehen zur RNA- und DNA- Rekombination zur Verfügung, wobei die zu verbindenden Enden von getrennten RNA- oder DNA-Fragmenten maßgeschneidert werden, um eine Ligation zu ermöglichen.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete exogene, d. h. Donor-, RNA oder DNA wird aus geeigneten Zellen erhalten. Der Vektor wird unter Verwendung bekannter Techniken so kostruiert, dass eine transformierte Zelle mit der Fähigkeit zur In-vivo-Expression des Proteins des therapeutischen Mittels erhalten wird. Die transformierte Zelle wird durch Kontaktieren einer Targetzelle mit einer RNA- oder DNA-haltigen Formulierung, die einen Transfer und eine Aufnahme der RNA oder DNA in die Targetzelle gestattet, erhalten. Diese Formulierungen umfassen beispielsweise Retroviren, Plasmide, Liposomenformulierungen oder Plasmidkomplexe mit polykationischen Substanzen, wie Poly-L-lysin, DEAC- Dextran, und Zielrichtungsliganden.
In einer ihrer Ausführungsformen sorgt die vorliegende Erfindung für die Therapie einer bösartigen Erkrankung durch entweder Stimulation einer Immunantwort auf Tumorzellen oder Hemmung des Wachstums von Tumorzellen oder der Metastase durch genetische Modifizierung in vivo. Dieser Ansatz unterscheidet sich von früheren Verfahren, bei denen Tumorzellen in vitro vermehrt, modifiziert und selektiert wurden.
Gemäß dieser Ausführungsform wird das vorliegende Verfahren verwendet, um eine DNA-Sequenz oder eine RNA- Sequenz, die rekombinante Gene umfasst, an Tumorzellen in vivo mit
(1) Retrovirus- oder Virusvektoren als Vehikeln,
(2) DNA oder RNA/Liposom-Komplexen als Vehikeln,
(3) chemischen Formulierungen, die die DNA- oder RNA- Sequenz enthalten und an ein Trägermolekül, das die Zufuhr der Sequenz zu den Targetzellen ermöglicht, gekoppelt sind, oder
(4) unter Verwendung eines zellvermittelten Gentransfers zur Zufuhr von Genen an spezifischen Stellen in vitro, beispielsweise unter Nutzung der Verwendung von Zellen der glatten Gefäßmuskulatur oder Endothelzellen, die in vitro transduziert wurden, als Vehikel zur Zufuhr des rekombinanten Gens an der Stelle des Tumors,
zu liefern.
In einem Aspekt dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das Immunsystem, das Schutz gegenüber Krebs bieten soll und eine wichtige Rolle als unterstützende Behandlung einer bösartigen Erkrankung spielen soll. Immuntherapie erwies sich als vielversprechend als unterstützender Ansatz zur Behandlung bösartiger Erkrankungen. Sowohl cytolytische T-Zellen als auch Lymphokine können die Zerstörung von Tumorzellen ermöglichen, und Strategien zur Verstärkung einer Tumorregression durch die Verabreichung von Cytokinen oder den Tumor infiltrierenden Lymphocyten zeigten Wirksamkeit bei Tiermodellen und Versuchen an Menschen. Beispielsweise ist bekannt, dass Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) und tumorinfiltrierende Lymphocyten (TIL) neoplastische Zellen lysieren und eine partielle oder vollständige Tumorabstoßung produzieren können. Die Expression von Cytokingenen in bösartigen Zellen verstärkte ebenfalls die Tumorregression.
Die vorliegende Erfindung liefert einen neuen Gentransferansatz gegen Tumore durch die direkte Einführung rekombinanter Gene in Tumorzellen in vivo, wobei sich im Gegensatz dazu traditionelle Gentransfertechniken auf die Modifizierung von Tumorzellen in vivo und eine anschließende Übertragung der modifizierten Zellen konzentrierten. Die Ansätze des Standes der Technik sind nachteilig, da sie die Zellen einer Selektion unter gegenüber den in vivo wirkenden Wachstumsbedingungen verschiedenen Wachstumsbedigungen unterwerfen und da sie auch erfordern, dass Zelllinien für jede bösartige Erkrankung etabliert werden, wodurch die Anpassungsfähigkeit an menschliche Erkrankungen beträchtlich schwieriger gemacht ist.
Gene, die mit dieser Ausführungsform verwendet werden können, umfassen Gene, die eine DNA-Sequenz (oder es kann die entsprechende RNA-Sequenz verwendet werden) mit Codierung für ein intrazelluläres, sezerniertes oder Zelloberflächenmolekül, das exogen zu dem Patienten ist und das
(1) immunogen gegenüber dem Patienten ist,
(2) eine Abstoßung, Regression des Tumors oder beides induziert oder
(3) gegenüber den Zellen des Tumor toxisch ist, enthalten.
Die Vektoren, die die DNA-Sequenz (oder die entsprechende RNA-Sequenz), die gemäß der Erfindung verwendet werden kann, enthalten, können ein eukaryotischer Expressionsvektor, der die interessierende DNA- oder RNA-Sequenz enthält, sein. Techniken zum Erreichen einer Expression von exogenen DNA- oder RNA-Sequenzen in einem Wirt sind bekannt. Siehe beispielsweise Korman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), (1987), 84: 2150-2154, das hier als Bezug aufgenommen ist.
Dieser Vektor kann, wie oben angegeben ist, an den Patienten in einem Vehikel aus einem Retrovirus- oder sonstigen Virusvektor (d. h. einem viralen bzw. Virusvektor), einem DNA- oder RNA/Liposom-Komplex oder unter Verwendung von zellvermitteltem Gentransfer verabreicht werden. Ferner kann der Vektor, wenn er in Nichtvirusform vorhanden ist, als an ein Trägermolekül, das eine Zufuhr zur Wirtszelle ermöglicht, gekoppelte, eine DNA- oder RNA-Sequenz enthaltende chemische Formulierung verabreicht werden. Dieses Trägermolekül kann einen Antikörper, der für die Zellen, denen der Vektor zugeführt wird, spezifisch ist, oder ein Molekül mit der Fähigkeit der Wechselwirkung mit einem Rezeptor, der mit den Targetzellen verbunden ist, umfassen.
Zellvermittelter Gentransfer kann gemäß der Erfindung verwendet werden. In diesem Modus baut man auf die Zufuhr rekombinanter Gene zu lebenden Organismen durch Transfer des genetischen Materials in vom Wirt stammende Zellen und eine Modifizierung in einer Zellkultur, gefolgt von der Einführung genetisch veränderter Zellen in den Wirt. Eine erläuternde Verpackungszelllinie, die gemäß dieser Ausführungsform verwendet werden kann, ist bei Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1988), 85: 6460, das hier als Bezug aufgenommen ist, beschrieben.
Die erfindungsgemäß verwendete DNA- oder RNA-Sequenz mit Codierung für das Molekül kann an den Patienten, der ein menschliches oder nicht-menschliches Lebewesen sein kann, entweder lokal oder systemisch verabreicht werden. Die systemische Verabreichung wird vorzugsweise unter Verwendung der an ein Trägermolekül, das die Zufuhr zu den Wirtszellen ermöglicht, gekoppelten chemischen Formulierung von Nichtvirus-DNA oder -RNA durchgeführt. Jede der Verabreichungen kann durch IV- oder IM-Injektion oder subkutante Injektion unter Verwendung bekannter Mittel oder durch die Verwendung des Katheters gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Retrovirusvektorvehikel umfassen ein von einem natürlich vorkommenden Retrovirus stammendes Viruspartikel, das genetisch so verändert wurde, dass es replikationsdefizient ist und ein gemäß der Erfindung interessierendes rekombinantes Gen exprimiert. Wenn das Virus sein genetisches Material einer Zelle zuführt, erzeugt es nicht weitere infektiöse Viren, sondern es führt exogene rekombinante Gene in die Zelle ein.
Bei anderen Virusvektoren stammt das verwendete Viruspartikel von anderen natürlich vorkommenden Viren, die genetisch so geändert wurden, dass sie replikationsdefizient sind und rekombinante Gene exprimieren. Diese Virusvektoren können von Adenoviren, Papillomaviren, Herpesviren, Parvoviren u. dgl. stammen.
Die Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung können auch als DNA oder RNA/Liposom-Komplex verabreicht werden. Diese Komplexe umfassen ein Gemisch von Fettteilchen, Lipiden, die an genetisches Material, DNA oder RNA, binden, wobei ein hydrophober Überzug gebildet wird, der die Zufuhr genetischen Materials zu Zellen ermöglicht. Diese Formulierung liefert einen Nichtvirusvektor für Gentransfer. Gemäß der Erfindung verwendete Liposomen können DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin), CUDMEDA (N-(5-Cholestrum-3-β-ol- 3-urethanyl)-N',N'-dimethylethylendiamin) umfassen.
Wie im vorhergehenden angegeben, können andere Nichtvirusvektoren auch gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese umfassen an ein Trägermolekül (beispielsweise einen Antikörper oder Rezeptorliganden), das eine Zufuhr zu Wirtszellen zum Zwecke der Veränderung der biologischen Eigenschaften der Wirtszellen ermöglicht, gekoppelte chemische Formulierungen von DNA oder RNA. Der hier verwendete Ausdruck "chemische Formulierungen" bezeichnet Modifikationen von Nucleinsäuren, die eine Kopplung der Nucleinsäureverbindungen an ein Trägermolekül aus einem Protein oder Lipid oder Derivat derselben ermöglichen. Diese Trägermoleküle umfassen Antikörper, die für die Wirtszellen oder Rezeptorliganden, d. h. Moleküle mit der Fähigkeit zur Wechselwirkung mit Rezeptoren, die mit den Wirtszellen verbunden sind, spezifisch sind.
Die Moleküle, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, umfassen die folgenden:
(1) Gene mit Codierung für Immunstimulanzien, wie Klasse- I-Histokompatibilitätsgene, Klasse-II-Histokompatibilitätsgene, Bakteriengene einschließlich von Mycobakterien(PPD)- genen und Genen mit Codierung für Wärmeschockproteine, Virusglykoproteine codierende Gene einschließlich von Vesikuläre-Stomatitis-Virus-G-Protein, Influenzahämagglutinin und Herpesvirus-Glycoprotein β, schwächere Histokompatibilitätsantigene, Fremdproteine, wie Lysozym oder Rinderserumalbumin, und Oncogene einschließlich von EIA, P53 (Mutanten) und Tax;
(2) Immun- und Wachstumsstimulanzien/-inhibitoren einschließlich von Differenzierungsinduktoren, wie Stimulanzien, umfassend Interleukin-2 (IL-2), IL-4, 3, 6 oder 8, Differenzierungsinhibitoren/-induktoren, wie TNF-α oder β, TGF-β (1, 2 oder 3), IL-1, löslichem Wachstumsfaktor und -Rezeptoren (PDGF-, FGF-Faktoren und -Rezeptoren), rekombinante Antikörper zu Wachstumsfaktoren oder -Rezeptoren, Analoga von Wachstumsfaktoren (PDGF, FGF), Interferone (α, β oder γ) und Haftmoleküle.
Die DNA/RNA-Sequenz wird vorzugsweise aus einer Quelle der gleichen Art wie der Patient erhalten, doch ist dies nicht absolut erforderlich und die vorliegende Erfindung bietet die Verwendung von DNA- oder RNA-Sequenzen, die aus einer Quelle einer gegenüber dem Patienten unterschiedlichen Art erhalten wurde, gemäß dieser Ausführungsform. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden Gene mit Codierung für Immunstimulanzien entsprechend dem obigen (1) vorzugsweise von einer gegenüber der Art, zu dem der Patient gehört, unterschiedlichen Art gewählt. Für Immun- und Wachstumsstimulanzien/-inhibitoren entsprechend dem obigen (2) wird gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung vorzugsweise ein Gen verwendet, das von einer Art, die zur Art des Patienten gleich ist, erhalten wird.
Die vorliegende Erfindung ist wie in den beigefügten Ansprüchen 1-6 definiert.
Andere Merkmale der vorliegenden Erfindung werden im Laufe der folgenden Beschreibungen beispielhafter Ausführungsformen deutlich, wobei diese zur Erläuterung der Erfindung angegeben sind und diese nicht beschränken sollen.
Die im folgenden angegebenen Daten zeigen die Durchführbarkeit einer Gentransplantation in vivo.
Ein Hauptpunkt einer Gentransplantation in vivo betrifft die Herstellung von replikationskompetenten Retroviren aus gentechnisch veränderten Zellen. In diesen Tests wurde dieses mögliche Problem durch die Verwendung eines replikationsdefizienten Retrovirus minimiert. Kein Helfervirus war in diesen Linien nach 20 Durchgängen in vitro nachweisbar. Obwohl defiziente Viren wegen ihrer hohen Infektiositätsrate und ihrem stabilen Einbau in das Wirtszellgenom (4) verwendet wurden, ist dieser Ansatz für Gentransfer an andere Virusvektoren anpassbar.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Lebewesens durch eine In-vivo-Transformation von Zellen des Lebewesens 1 mit einem rekombinanten Gen. Die Transformation kann entweder auf nicht-ortsspezifische oder systemische Weise oder ortsspezifische Weise durchgeführt werden.
Ein Immunsystem kann daher moduliert werden, um entweder Resistenz oder Toleranz gegenüber dem durch die DNA codierten Molekül bereitzustellen.
Beispiele für Moleküle, für die die Bildung einer Resistenz günstig sein kann, umfassen: Zelloberflächenmoleküle, wie Tumorantigene (karzinomembryonisches Antigen), Protozoenantigene (Pneumocystis), Virusantigene (HIV gp120 und gp160, H.-influenza-Antigen und Hepatitis-B-Oberflächenantigen), das Antigen der Lyme-Krankheit, Bakterienantigene und Transplantationsantigene (Klasse I oder II), ras- oder andere Oncogene einschließlich von erb-A oder neu; Cytoplasmaproteine, wie das raf-Oncogen, src-Oncogen und abl- Oncogen; nucleäre Proteine, wie das E1A-Oncogen, ein mutiertes p53-Oncogen, tat, tax, rev, vpu, vpx, Hepatitiskernantigen, EBNA und Virusgene; und sezernierte Proteine, wie Endotoxin, Choleratoxin, TNF und Osteoclastenaktivierungsfaktor.
Beispiele für Moleküle, für die die Bildung einer Resistenz günstig sein kann, umfassen: Zelloberflächenmoleküle, wie Wachstumsfaktorrezeptoren, Insulinrezeptoren, Thyroidhormonrezeptoren, Transplantationsantigene (Klasse I oder II), Blutgruppenantigene und LDL-Rezeptor; Cytoplasmaproteine, wie Cytochrom P450, Galactosyltransferase, Dystrophin, Neomycinresistenzgen und Bakterienwärmeschockprotein; nucleäre Proteine, wie Retinoblastom und transdominantes rev; und sezernierte Proteine, wie Wachstumshormon für Kleinwüchsige, Insulin für Diabetiker und Adenosindesaminase.
Es ist auch verständlich, dass die Nucleinsäure, DNA, RNA oder ein Derivat derselben, in dem rekombinanten Gen von jeder geeigneten Herkunft sein kann, d. h. die Nucleinsäue kann aus einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert oder von synthetischer Herkunft sein.
Das rekombinante Gen kann in die Zellen des Lebewesens unter Verwendung eines herkömmlichen Vektors eingeführt werden. Die Vektoren umfassen Virusvektoren, kationische Lipide, die mit DNA oder RNA komplexiert sind (DNA oder RNA/Liposome) und DNA- oder RNA-Komplexe mit Polykationen, wie DEAE, Dextran und Polybren.
Wie im vorhergehenden angegeben, kann das rekombinante Gen in Zellen auf ortsspezifische Weise eingeführt werden, um gegenüber dem durch das rekombinante Gen codierten Molekül Resistenz zu verleihen. Geeignete Stellen umfassen beispielsweise Endothelzellen oder Reticuloendothelzellen im Gefäßsystem oder einem spezifischen Gewebe oder Organ. Die bei der Transformation verwendete Form der Zubereitung, die den Vektor und das rekombinante Gen enthält, hängt von dem zu transformierenden spezifischen Gewebe ab. Geeignete Zubereitungen zur Transformation von Endothelzellen sind an anderer Stelle dieser Beschreibung beschrieben. Insbesondere kann die Transformationszubereitung direkt in den Tumor oder in die Gefäßversorgung des Tumors injiziert werden.
Das vorliegende Verfahren kann an jedem Lebewesen, wie Hühnchen oder Säugetieren, wie Kühen, Pferden, Katzen, Hunden, Affen, Lemuren oder Menschen, durchgeführt werden.
Wenn das rekombinante Gen unter Verwendung eines Liposoms eingeführt wird, werden vorzugsweise zunächst in vitro die optimalen Werte für die DNA : Lipid-Verhältnisse und die absoluten Konzentrationen von DNA und Lipid als Funktion des Zelltods und der Transformationeffizienz für die spezielle Art der zu transformierenden Zelle bestimmt und diese Werte bei der In-vivo-Transformation verwendet. Die Invitro-Bestimmung dieser Werte kann ohne weiteres unter Verwendung der im experimentellen Abschnitt dieser Beschreibung beschriebenen Techniken durchgeführt werden.
Beispielsweise kann die vorliegende Erfindung in einem Kit für die systemische Einführung eines rekombinanten Gens in Zellen eines Lebewesens in vivo verwendet werden. Dieses Kit kann in etwa die optimale Menge eines Trägers, beispielsweise eines Lipids, und Nucleinsäure und/oder ein Zufuhrmittel, beispielsweise ein Endoskop oder eine Spritze, umfassen. Das Kit kann auch Vorschriften zur Verabreichung der Transformationszubereitung enthalten. Der Träger und die Nucleinsäure können gefriergetrocknet und getrennt oder vorgemischt abgepackt sein. Das Kit kann auch eine Lösung zur optimalen Wiederherstellung der Komplexe des Trägers und der Nucleinsäure, die eine wirksame Zufuhr zu Zellen in vivo bietet, enthalten. Diese Lösung kann ein oder mehrere Bestandteile, wie Puffer, Zucker, Salze, Proteine und Detergenzien, enthalten.
Nach der allgemeinen Beschreibung der Erfindung kann ein weiteres Verständnis unter Bezug auf bestimmte spezifische Beispiele, die hier lediglich zu Zwecken der Erläuterung gegeben sind, erhalten werden.

Experimentelles:

A. Immuntherapie von Bösartigkeit durch In-vivo- Gentransfer

Ein Retrovirusvektor mit dem H-2KS-Gen wurde hergestellt. CT26-Zellen wurden mit diesem Vektor in vitro infiziert, bezüglich G418-Resistenz selektiert und mittels Fluoreszenzsortierung aktivierter Zellen (FACS) analysiert. Transduzierte CT26-Zellen zeigten eine höhere mittlere Fluoreszenzintensität als nicht-infizierte CT26-Zellen oder mit unterschiedlichen Retrovirusvektoren infizierte CT26- Zellen. Wenn 10&sup6; CT26-Zellen, die H-2KS exprimieren, subkutan in für dieses Antigen sensibilisierte BALB/c-Mäuse (H-2d) subkutan injiziert wurden, wurden über einen Zeitraum von 8 Wochen keine Tumore beobachtet, im Gegensatz zu der nicht-modifizierten CT26-(H-2d)-Tumorlinie, die bei dieser Dosis routinemäßig Tumore bildete. Die Immunreaktion auf H-2KS könnte daher Schutz vor CT26-Zellen, die dieses Antigen tragen, bieten. Wenn CT26-H-2Ks und CT26 jedoch gemeinsam eingeimpft wurden, wurde Tumorwachstum beobachtet, was nahelegt, dass H-2KS nur modifizierten Zellen Empfindlichkeit verlieh.
Um zu bestimmen, ob Schutzwirkungen durch die Einführung von H-2KS in wachsende CT26-Tumore erreicht werden konnten, wurde das rekombinante H-2KS-Reportergenoder ein β-Galactosidasegen in Tumore entweder mit einem DNA/Liposom- oder einem Retrovirusvektor eingeführt. Tumorkapseln (Durchmesser von 0,5-1 cm) wurden chirurgisch freigelegt und das Parenchym erhielt mehrfache Nadelinjektionen (2-10). Mit β-Galactosidasereporterplasmiden konnte eine Expression des rekombinanten Gens nach der Injektion von DNA/Liposom- oder Retrovirusvektoren in den Tumor ohne weiteres nachgewiesen werden.
In Mäusen, die Injektionen der H-2KS-DNA/Liposom- Komplexe oder des H-2KS-Retrovirusvektors in den Tumor erhielten, wurde die rekombinante DNA mittels PCR im Tumor und gelegentlich in anderen Geweben nachgewiesen. Wenn sie in den anderen Organen gefunden wurde, wurde kein Beweis für eine Entzündung oder Organtoxizität pathologisch nachgewiesen. Eine Immunreaktion auf das rekombinante H-2KS- Protein war bei diesen Lebewesen jedoch offenkundig. Von den mit H-2KS, jedoch nicht mit β-Galactosidase transduzierten Tumoren stammende Lymphocyten belegten eine cytolytische Reaktion auf H-2KS, unabhängig davon, ob dieses durch Retrovirusvektoren oder Liposome geliefert wurde. Noch wichtiger ist, dass von den mit H-2KS, jedoch nicht mit β-Galactosidase transduzierten Lebewesen stammende Lymphocyten nicht-modifizierte CT26-Zellen erkannten und lysierten, was belegt, dass diese Stimulierung eine Immunreaktivität gegenüber genetisch nicht-modifizierte Tumorzellen induzierte.
Zum Beleg der Schutzwirkung der Immunreaktion gegen H-2KS wurde das Tumorwachstum in vivo quantitativ erfasst. Wenn Lebewesen keine vorherige Sensibilisierung für H-2KS erhielten, zeigte einer von vier mit H-2KS transduzierten Tumoren eine Abschwächung des Tumorwachstums, die nicht vollständig war. Im Gegensatz dazu wurde bei nichtmodifizierten (n = 4) oder mit β-Galactosidase transduzierten Kontrollen (n = 4) keine Antitumorwirkung beobachtet. Da diese Tumore zum Zeitpunkt der Anfangsinjektion groß waren und während der Bildung der primären Immunreaktion weiter wuchsen, wurde ein Versuch zur Optimierung der Antitumorreaktion durch Vorimmunisierung von Mäusen mit bestrahlten CT26- H-2KS-Tumorzellen und durch frühere und/oder häufigerere Injektionen des Vektors unternommen. Die Tumore wurden an den Tagen 12 und 32 durch Injektion von H-2KS- oder β-Galactosidase-DNA/Liposom-Vektoren in den Tumor transduziert. Die Behandung mit dem H-2KS-Liposom-Komplex verbesserte das Überleben und schwächte das Tumorwachstum im Gegensatz zu mit β-Galactosidase transduzierten Tumoren, bei denen kein Unterschied hinsichtlich der Wachstumsrate im Vergleich zu den nicht-injizierten Kontrollen bestand. Eine vollständige Tumorregression wurde bei zwei Mäusen durch Erhöhen der Zahl der Injektionen und durch die Zufuhr von H-2KS zu Tumoren in einem früheren Stadium erreicht. Diese Behandlung war schützend, da Kontrolltiere ein fortgesetztes Tumorwachstum zeigten und nicht länger als 35 Tage überlebten.

B. Bestimmung optimaler Transfektionsbedingungen

(1) Plasmidkonstruktion

Ein Plasmid, das das E. coli-lacZ-Gen unter der Kontrolle des Rous Sarcoma Virus LTS (RSV-β-gal) (Norton und Coffin, Mol. Cell. Biol., 5 (2), 281-290, 1985) enthielt, wurde zur Transfektion von Primärendothelzellen von Schweinen und HeLa-Zellen verwendet. Außerdem wurde ein Plasmid, das das lacZ-Gen unter der Kontrolle von 5'-flankierender DNA von Präproendothelin-1 (-1410 bis +83) enthielt (Wilson et al., Mol. Cell. Biol., 10(9), 4854-4862, 1990), zur Transfektion von Endothelzellen verwendet. Für eine In- vivo-Toxizitätsanalyse wurde das RSV-β-gal-Plasmid und ein von dem PLJ-Vektor stammendes Plasmid, das die cDNA mit Codierung für ein H-2KS-Maus-MHC-Klasse-I-Gen enthielt, verwendet.

(2) Zellkultur, Transfektionsanalyse und Toxizität in vitro.

Primärendothelzellen, die von dem Yucatan-Minischwein stammten (YPE-Zellen), wurden mit Medium 199 (M199), das mit 10% FBS, 2 mM 1-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 5 ug/ml Streptomycin ergänzt war, inkubiert. HeLa-Zellen wurden in nach Dulbecco modifiziertem Eagles-Medium (DMEM), das mit 5% FBS, 2 mM 1-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 5 ug/ml Streptomycin ergänzt war, gehalten. Das DNA- Liposom-Gemisch wurde mit Lipidkonzentrationen von DOPE/DC-Chol zwischen 2,5 und 25 uM, die zu 0,2 ml serumfreien Medien oder Ringer-Lactatlösung in Polystyrolröhrchen gegeben wurden, hergestellt. Nach leichtem Mischen wurde die Lösung 15-20 min lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Zur Transfektionsanalyse wurden Zellen in Gewebekulturschalen von 60 mm mit 75% Zusammenfließen oder mehr gezüchtet. Die Zellen wurden zweimal mit serumfreien Medien oder Ringer-Lactatlösung gewaschen und dann in 0,5 ml der gleichen Medien gegeben. Die DNA-Liposomlösung (0,2 ml) wurde dann langsam unter leichtem Rühren mit einem Endvolumen von 0,7 ml zu den Zellen gegeben. Dies führte zu DNA-Konzentrationen zwischen 0,7 und 7 ug/ml (13-130 nM) und Lipidkonzentrationen von 7-70 uM. Die Transfektion wurde 1-5 h ablaufen gelassen und die Zellen wurden danach in, wie im vorhergehenden beschrieben, ergänzte Medien gegeben. Nach 24-48 h nach der Transfektion wurde die enzymatische Aktivität des E. coli-β-Galactosidaseproteins zur Identifizierung transfizierter Zellen durch Anfärben mit dem X-gal- Chromagen verwendet. Die Toxizität in vitro wurde durch die cytopathische Wirkung oder Trypanblauausschluss festgestellt.

(3) Tieruntersuchungen

Für intravenöse Injektionen wurden die DNA/Liposome wie im vorhergehenden für die In-vitro- Transfektionsuntersuchungen beschrieben, in 0,2 ml serumfreiem M199 oder Ringer-Lactatlösung hergestellt. Nach 15- bis 20-minütiger Inkubation wurde das Gemisch auf 0,7 ml verdünnt und 0,1-0,2 ml dieser Verdünnung wurden dann sofort in die Schwanzvene von ausgewachsenen, weiblichen BALB/c-Mäusen injiziert. Blut wurde vor der Injektion und 9 -11 Tage anschließend an die Injektion entnommen und die Serumchemie wurde geprüft. Nach ~2-3 Wochen nach der Injektion wurden die Leber, Niere, Lunge, das Herz und das Hirn zur histologischen und PCR-DNA-Amplifikationanalyse wie im vorhergehenden beschrieben extrahiert. Die Injektion von CT26-Zellen in den Tumor (Fearon et al., Cell., 60, 397-403, 1990) und die Analyse wurden ebenfalls gemäß früheren Protokollen durchgeführt.

(4) Ergebnisse

Die optimalen Bedingungen für eine Transfektion und die Toxizität von DNA/Liposomen wurden am Anfang in vitro bestimmt. Um eine maximale Transfektion ohne Toxizität in vitro zu erreichen, wurden das Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid, die absolute Konzentration von DNA oder Lipiden und die Bedingungen zum Mischen von DNA und kationischen Lipiden untersucht. Die kationische Lipidzubereitung war eine Formulierung aus zwei Verbindungen, die Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesten-3-β-ol-3- urethanyl-N',N'-dimethylethylendiamin (DC-chol) umfasst. Die Transfektioneffizienzgrade dieses Reagens waren gleich denen oder größer als die von Lipofectin® (BRL) in mehreren Zelllinien in vitro. Endothelzellen, die typischerweise schwierig zu transfizieren sind, und HeLa-Zellen, die ohne weiteres unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken transfiziert werden können, wurden durch Transfektion in vitro geprüft.
Zur Bestimmung der optimalen Bedingungen für die Transfektion von Endothelzellen wurde das Lipid anfangs mit unterschiedlichen Konzentrationen verwendet, während die DNA-Konzentration konstant gehalten wurde. Die maximale Transfektionseffizienz wurde bei Verwendung von 0,7 ug/ml DNA (13 nM) und 21 uM DOPE/DC-Chol-Lipid beobachtet, mit einer starken Abnahme der Zahl der transfizierten Zellen bei höheren oder niedrigeren Lipidkonzentrationen. Als nächstes wurde die DNA-Konzentration verändert, während die Lipidkonzentration konstant blieb. Diese Analyse ergab eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber der DNA-Konzentration, wobei die Zahl der transfizierten Zellen signifikant mit Inkrementen der DNA-Konzentration von bis hinunter zu 0,4 ug/ml abnahm. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verhältnis von DNA zu Lipid für eine maximale Transfektionseffizienz wichtig ist und dass die absolute Konzentration jeder Komponente ebenfalls bei der Bestimmung der Transfektionseffizienz wichtig ist. Eine Erhöhung der DNA- und Lipidkonzentration über die optimale Konzentration von 0,7 ug/ml DNA (13 nM) und 21 uM/DOPE/DC-Chol hinaus reduzierte die Zahl der lebensfähigen Zellen und sie erhöhte die Transfektionseffizienz der verbliebenen lebensfähigen Zellen nicht. Lipidkonzentrationen von größer als 35 uM verringerte die Zahl der lebensfähigen Zellen im Vergleich zur nicht- transfizierten Kontrolle um 50%, während die optimale Konzentration von 0,7 ug/ml DNA (13 nM) und 21 uM Lipid keine Wirkung auf die Lebensfähigkeit der Zellen nach 5-stündiger Inkubation hatte.
Um die optimalen Konzentrationen einer Transfektion in einer unterschiedlichen Zellart zu vergleichen, wurden Transfektionen an HeLa-Zellen durchgeführt. In diesem Fall wurde ein leicht unterschiedliches optimales Verhältnis von DNA und Lipid beobachtet. Spitzentransfektionseffizienzgrade wurden bei der gleichen Lipidkonzentration wie bei Endothelzellen beobachtet (21 ug/ml), sie variierten jedoch weniger mit kleinen Unterschieden hinsichtlich der DNA- Konzentrationen. DNA-Konzentrationen von 1,4-4,2 ug/ml waren gleich wirksam. Auch wurden, wenn das Verhältnis von DNA zu Lipid beibehalten wurde, jedoch die Konzentration der einzelnen dreifach vermindert wurde, sehr wenige Zellen transfiziert, was erläutert, dass sowohl das Verhältnis von DNA zu Lipid als auch die absolute Konzentration jeder Komponente zur Maximierung der Zahl der transfizierten Zellen wichtig sind. Wenn HeLa-Zellen mit > 80% zusammenfließen oder darüber transfiziert wurden, bestand keine Toxizität bei Verwendung von bis zu 35 uM Lipid. Wenn Zellen mit einer geringeren Sättigungsdichte transfiziert wurden, war die Lebensfähigkeit der Zellen jedoch dramatisch mit nur 7 uM Lipid im Vergleich zu den nicht-transfizierten Kontrollzellen verringert. Diese Ergebnisse belegen, dass die optimalen Bedingungen für Transfektion und Toxizität in Abhängigkeit von der Zelllinie etwas differieren können.
Eine weitere Variable bei der Herstellung von Liposomen war die Zusammensetzung der zur Bildung von Komplexen der kationischen Lipide mit DNA verwendeten Lösung. Unter mehreren analysierten Medienlösungen wurde kein wesentlicher Unterschied hinsichtlich Transfektionseffizienz oder Toxizität mit M199-, McCoys-, OptiMEM- oder RPMI-Medien festgestellt. Eine signifikante Verbesserung hinsichtlich der Transfektionseffizienz wurde jedoch unter Verwendung von Standard-Ringer-Lactat beobachtet. Die Zahl der transfizierten Zellen nahm im Vergleich zum serumfreien Medium mehr als dreifach zu, obwohl eine verlängerte Inkubation (≥2 h) zu einer Abnahme der Lebensfähigkeit der Zellen bei einigen Zellarten führte.

Zitierte Veröffentlichungen

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Offensichtlich sind zahlreiche Modifikationen und Variationen der vorliegenden Erfindung im Licht der obigen Lehre möglich. Es ist daher selbstverständlich, dass die Erfindung innerhalb des Umfangs der beigefügten Ansprüche anders als speziell hier beschrieben durchgeführt werden kann.

Claims

1. Zusammensetzung mit der Fähigkeit zur In-vivo-Transformation von Tumorzellen oder die Tumorzellen umgebendem Gewebe bei einem Säugetier durch direkte Injektion einer DNA- oder RNA-Sequenz in einen Tumor oder den Tumor umgebendes Gewebe, umfassend

eine DNA- oder RNA-Sequenz mit Codierung für ein intrazelluläres, sezerniertes oder Zelloberflächenmolekül, das zu dem Säugetier exogen und für das Säugetier immunogen ist, und

ein Vehikel für die Sequenz, das aus der aus viralen Vektoren, Liposomen oder Trägermolekülen, die die In-vivo-Zufuhr der Sequenz zu den Tumorzellen oder dem die Tumorzellen umgebenden Gewebe erleichtern, bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

2. Zusammensetzung mit der Fähigkeit zur In-vivo-Transformation von Tumorzellen oder die Tumorzellen umgebendem Gewebe bei einem Säugetier durch direkte Injektion einer DNA- oder RNA-Sequenz in einen Tumor oder ein den Tumor umgebendes Gewebe, umfassend:

eine DNA- oder RNA-Sequenz mit Codierung für Immunstimulanzien in dem Säugetier und

wobei die DNA oder RNA ein aus der Gruppe, die aus Klasse- I-Histokompatibilitätsgenen, Klasse-II-Histokompatibilitätsgenen, Bakteriengenen mit Codierung für Peptide mit immunstimulierenden Eigenschaften, Genen mit Codierung für Virusglykoproteine mit immunstimulierenden Eigenschaften, Genen mit Codierung für schwächere Histokompatibilitätsantigene, Genen mit Codierung für Lysozym oder Rinderserumalbumin und Onkogenen besteht, ausgewähltes Element ist.

3. Zusammensetzung mit der Fähigkeit zur In-vivo-Transformation von Tumorzellen oder die Tumorzellen umgebendem Gewebe bei einem Säugetier durch direkte Injektion einer DNA- oder RNA-Sequenz in einen Tumor oder den Tumor umgebendes Gewebe, umfassend:

eine DNA- oder RNA-Sequenz und

ein Vehikel für die Sequenz, das aus der aus viralen Vektoren, Liposomen oder Trägermolekülen, die die In-vivo-Zufuhr der Sequenz zu den Tumorzellen oder dem die Tumorzellen umgebenden Gewebe erleichtern, bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

wobei die DNA- oder RNA-Sequenz ein aus der Gruppe, die aus DNA- oder RNA-Sequenzen mit Codierung für Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren einschließlich Differenzierungsinduktoren, wie Stimulantien, umfassend Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Interleukin-8, einen Differenzierungssinhibitor/Differenzierungsinduktor, wie TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Interleukin-1, lösliche Wachstumsfaktoren, Analoga von Wachstumsfaktoren, Interferone und Haftmoleküle besteht, ausgewähltes Element ist.

4. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz von einer Art erhalten wird, die der des Säugetiers entspricht.

5. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz von einer Art erhalten wird, die von der Art des Säugetiers verschieden ist.

6. Zusammensetzung gemäß einem der Ansprüche 1-3, wobei das Vehikel ein Retrovirus oder Adenovirus ist.