JPH06509328A - 細胞の部位特異的な点滴注入または細胞の部位特異的形質転換による疾患の治療およびそのためのキット - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞の部位特異的な点滴注入または 細胞の部位特異的形質転換による疾患の治療およびそのためのキット これは１９９１年６月２８日出願の米国特許出願番号０７／７２４，５０９の一 部継続出願であり、さらにそれは１９８９年３月３１日出願の米国特許出願番号 ０７／３３１，３３６の一部継続出願（現在、放棄）である。

技術分野 本発明は、細胞の部位特異的な点滴注入または細胞の部位特異的形質転換による 疾患の治療、およびそのためのキットに関する。またこの発明は、生体中へのり コンビナンド遺伝子の導入によって動物の免疫システムを調節する方法に関する 。

背量技術 多くの後天的および先天的な疾患に対する効果的な治療は現代の医学書ことって もまた大きな挑戦課題として残されている。治療薬を生体の特定の部位に運ぶ能 力は、たとえば、局所的な疾患の治療にとって非常に重要なものである。また、 治療薬を循環器系を経由して潅流させることができれば、たとえば、先天的およ び後天的な疾患または癌の治療に効果的である。

たとえば、抗腫瘍剤またはトキシンを腫瘍部位のすぐ近くに確実に投与できるこ とは望ましいことである。同様に、たとえば、糖尿病患者の血液中にインスリン を潅流させることも望ましいことである。しかしながら、多くの治療薬に関して 、特定部位への投与または全身的投与のいずれにおいても満足できる方法はない 。

加えて、多くの疾患において、局所的または全身的に、欠陥のある内因性遺伝子 の発現、外因性遺伝子の発現、あるいは内因性遺伝子の抑制、を起こさせること ができれば望ましいが、これらもまた、また達成されていない課題である。

特に、アテローム性動脈硬化症の発病はっぎの３つの基本的な生物学的なプロセ スで特徴づけられる。これらは：ｌ）血管内膜の平滑筋細胞の増殖とマクロファ ージの堆積；２）平滑筋細胞の増殖による大量の結合組織マトリックスの生成； ３）細胞の中およびそれをとりまく結合組織中での脂質の蓄積（基本的にはコレ ステロールエステルおよびフリーのコレステロールの形で）、である。

最初に起こる事象は内皮細胞の損傷で、これは内皮の浸透膜の干渉となって現れ 、内皮表面の非凝血特性が変化し、内皮の凝血促進特性が昂進する。半球が内皮 細胞間を遊走し、スカベンジャー細胞として活発になり、マクロファージに分化 する。

ついでマクロファージは、血小板誘導成長因子（ＰＤＧＦ）　、線雑芽細胞成長 因子（ＦＧＦ）　、表皮成長因子（ＥＯＦ）、および形質転換成長因子α（ＴＧ Ｆ−α）を合成し、分泌する。これらの成長因子は、アテローム性動脈硬化プラ クの中のｍ維芽細胞および平滑筋細胞の遊走および増殖を強力に刺激する。さら に、血小板は損傷した内皮細胞および活性化されたマクロファージとの相互作用 で成長因子の生産および血栓の生成をもたらす。

冠動脈系の疾患の臨床管理における２つの大きな問題としては、急性の心筋虚血 における血栓の生成および冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄がある。この両 者とも、内皮の損傷、活性化されたマクロファージおよび血小板による成長因子 群の放出といった一般的な細胞事象が関与する。冠動脈形成術を行うと、アテロ ーム性動脈硬化プラクを歌壇し、内皮を除去することになる。この血管の外傷は 、血小板凝集およびＰＴＣＡ部位での血栓生成を促進する。血小板やマクロファ ージからさらにマイトジェンが放出されると、平滑筋細胞の増殖および単球の浸 潤によって再狭窄にいたる。

この問題は、抗血小板剤を使用する経験医学診療では予防できず、ＰＴＣＡ患者 の１７３で起こっている。再狭窄の解決策は、血小板凝集の防止、血栓生成の防 止、ならびに平滑筋細胞の増殖抑制である。

血栓の生成はまた、冠状症候群の安定から不安定への移行における決定的な細胞 現象である。この病因には、多くの場合急性の内皮細胞の損傷あるいはプラクの 歌壇が関与し、内皮細胞の付着部の機能不全を促進し、下層のマクロファージフ オーム細胞を露出させることになる。これによって、謂環している血小板の付着 、凝集、および血栓生成の機会が生まれる。

組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）のような血栓溶解剤の静脈内注射によ って、急性の心筋梗塞患者の約７０％において血栓を溶解するという結果が得ら れている。にもかかわらず、約３０％の患者では再潅流ができず、また梗塞を起 こした動脈でいったん再潅流をした患者の約２５％が、２４時間以内に血栓の再 発を経験している。したがって、再血栓に対する効果的な治療法は現代の医学界 における重要な課題として残されている。

上述のように、再血栓に対する効果的な治療法のみが現在残されている唯一の重 要な課題というわけではない。不安定なアンギーナ、心筋梗塞や慢性の組織虚血 といった、その他の虚血性の症状の治療、あるいは後天性及び遺伝性の疾患や癌 などの治療も重要な課題である。これらの疾患は、抗凝固剤、血管拡張剤、血管 形成剤、成長因子剤や成長抑制剤なとの、患者に対する適切な投与によって治療 することができる。このように、これらの診療分野すべてにおいて効果的な治療 法が切望されている。

さらに、動物の免疫システムを調節できることは望ましいことである。特に、感 染から守る免疫的防御を与えるためのワクチンの開発に関しては多大の努力が払 われてきた。しかしながら、多くの患者に簡単に投与できる安全なワクチンにつ いては問題が多いし、多くの病気（たとえばＡＩＤＳのような）に対しては安全 で効果的なワクチンは今のところ得られていない。さらに、時には、移植の拒絶 を防ぐために、動物の免疫反応を特別に抑えることも望まれている。移植の拒絶 を抑又るための努力は、全体の免疫反応を抑える薬の開発をもたらしたが、これ は移植の抗原だけを特別に抑えるものではなく、このような薬剤は常に効果的と いうわけではない。したがって、動物の免疫システムを調節する方法の必要性が 残されている。

発明の開示 したがって、本発明の一つの目的は、治療薬の部位特異的な投与のための新規な 方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、治療薬を患者の血流の中で潅流させる方法を提供す るものである。

本発明のもう一つの目的は、外因性遺伝子を患者の体内で発現させる方法を提供 するものである。

本発明のもう一つの目的は、欠陥内因性遺伝子を患者の体内で発現させる方法を 提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内の内因性遺伝子の発現を抑制する方法を 提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内の損傷した細胞を部位特異的に置き換え る方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、治療薬の部位特異的な投与または患者の血流内への 潅流、のいずれかによって疾患を治療する方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内で、外因性遺伝子の発現、欠陥のある内 因性遺伝子の発現、または内因性遺伝子の発現の抑制、のいずれかを引き起こす ことによって疾患を治療する方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内の損傷した細胞を部位特異的に置き換え ることによって疾患を治療する方法を提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、患者の体内へ正常または形質転換した細胞を部位特 異的に点滴注入するキットを提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、生体内で細胞を部位特異的に形質転換するキットを 提供するものである。

本発明のもう一つの目的は、動物の免疫システムを調節する方法を提供すること にある。

本発明のもう一つの目的は、外来分子に対する感作性を動物に与えるために動物 の免疫システムを調節する方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、微生物やウィルスによる感染を防ぐために、タンパ ク質を拒娩するための動物の免疫システムを刺激する方法を提供することにある 。

本発明のもう一つの目的は、外来分子の受け入れを動物に許容させるために、動 物の免疫システムを調節する方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、移植を拒絶する傾向を減するために、動物の免疫シ ステムを調節する方法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は、全身的投与によって、生体中で細胞を形質転換させ る新規なキットを提供することにある。

以下の詳細な説明で明らかになる本発明のこれらのおよびその他の目的は、本発 明者らが下記のことを達成することによって、明らかにされたものである：ａ） （ｉ）患者への正常細胞（形質転換されていない）または形質転換された細胞の 部位特異的な点滴注入、または（ｉｉ）患者の細胞の部位特異的な形質転換、の いずれかからなる方法；および、ｂ）カテーテルを含むキットであって、（ｉ） 正常細胞または形質転換された細胞の部位特異的な点滴注入、あるいは、（ｉｉ ）細胞の部位特異的形質転換、のためのもの。

正常な細胞の部位特異的な点滴注入は損傷した細胞を置き換えるために使用でき 、一方形質転換された細胞の点滴注入は欠陥のある内因性遺伝子または外因性遺 伝子のいずれかの発現、あるいは内因性遺伝子産物の抑制、のために利用できる 。患者の血管壁への細胞の点滴注入は血流中への治療薬の確実な潅流に使用する ことができる。

本発明者はまた、生体中で動物の細胞を形質転換させることによって、動物の免 疫システムを調節することが可能であることを見いたした。特に、リコンビナン １遺伝子を併用し、部位特異的または全身的な投与によって動物の細胞を形質転 換させることによって、そのリコンビナント遺伝子がコードしている分子に動物 が感作するように動物の免疫システムを調節することが可能である。あるいは、 リコンビナント遺伝子を併用し、特に動物の免疫システムを特異的に決定する部 位、　（たと之ば胸腺）、の細胞を形質転換させることによって、そのリコンビ ナント遺伝子がコードしている分子に対する免疫反応を抑制するように動物の免 疫システムを調節することが可能である。

図面ｌ単盆説朋 本発明およびこれに付随する多くの利点は、添付図面を参照しながら下記の詳細 な説明を理解するにつれ容易により完全な理解、評価に到達できるものである。

図１および図２は本発明のカテーテルを、外科手術的または経皮的に細胞を血管 内に移植するため、または患者の血管に存在する細胞を生体内で形質転換するた めに、使用する方法を示したものである。

図３は目的細胞の溶解％とそのエフェクター：ＣＴＬ細胞の目標比；を示す。

図４はウェスタン・プロット分析の結果を示す。

本発明を清流ｔ　−ｓ　ｔｈｅ＞辺巖良莫形態ここで、実施態様の１つでは、先 天性の疾患、全身的な疾患、心血管系の疾患、特定の器官の疾患、あるいは腫瘍 などの疾患の治療に、本発明の、正常細胞または形質転換細胞の点滴注入、また は細胞の形質転換の方法を使用している。

末法において点滴注入される細胞には、内皮細胞、平滑筋細胞、線雑芽細胞、単 球、マクロファージ、および実質細胞などがある。これらの細胞は治療効果ない しは診断効果を有するタンパク質で、天然に存在するかまたはりコンビナンド・ 遺伝子物質に由来するタンパク質を産生ずるものである。

つぎに図を参評すると、ここでは、同一または対応する部位には、すべての図に おいて同一の番号を付している。図１では、米国特許４，６３６，１９５に開示 されているデザインのカテーテルを用いた本発明の実施態様を示している（この 特許をここにレファレンスとして援用する）。このカテーテルは正常または遺伝 子的に変換した細胞を血管の壁に供給したり、細胞の局所的形質転換のためにベ クターを導入するために使うことができる。図において互がその血管壁である。

図では膨張可能のバルーン手段１および２を膨らませることによって、カテーテ ル部４が所定の位置に保持されているところを示している。バルーン手段↓およ び２−の間の部分に点滴注入口手段旦が備えられている。このカテーテルにはさ らにガイドワイヤ手段６を備えることもできる。図２は同様のカテーテルの使用 が示されているが、このカテーテルには１個の膨張可能バルーン手段２と複数の 点滴注入口手段ａが備えられている点が図１のカテーテルと異なる。このカテー テルは最大１２個の独立した点滴注入口手段旦を備えることができるが、図では ５個備えているところを示している。

器官への供給のケースでは、このカテーテルは組織への補給を行う主要動脈に導 入される。リコンビナント遺伝子またはベクターを含んだ細胞は、動脈循環を一 時的に閉塞した後、中央の点滴注入口を通して導入される。このようにして、細 胞またはベクターＤＮＡは毛細管循環を通して、大量の実質組織に移入される。

リコンビナント遺伝子もまた、ダブルのバルーンカテーテル手法を目的の器官の すぐ近くの動脈循環に使用して、脈管中に導入することができる。このようにす れば、リコンビナント遺伝子を、関与する組織を潅流する循環系の中に直接分泌 させたり、その器官の中で直接合成させることができる。

１つの実施態様では、治療薬は血管細胞によって分泌され、病気に冒されている 特定の器官に供給されている。たとえば、虚血性心筋症は冠循環系に脈管形成性 の因子を導入することによって治療することができる。このアプローチはまた、 脈管形成性の因子が脳やその他の組織の循環を改善できるような末梢血管や大脳 血管の疾患に使用することができる。真性糖尿病はグルコース反応性のインスリ ン分泌細胞を門脈の循環、（そこでは通常肝臓に他の組織より高いインスリン濃 度が見られる）に導入することによって治療することができる。

治療薬の局所的濃度を高めるためのほか、末法はりコンビナンド遺伝子を実質組 織に供給するためにも使用することができる。なぜならば、末法では高濃度のウ ィルス性ベクターやその他のベクターを特定の循環系に供給することができるか らである。このアプローチを用いて、器官に特異的なタンパク質不全もまた治療 することができる。たとえば、肝臓で、α−アンチトトリシンインヒビター不全 や高コレステロール血症は、α−アンチト１１プシンまたはＬＤＬ受容遺伝子を 導入することによって治療することができる。さらに、このアプローチは悪性疾 患の治療にも利用することができる。手術不能の腫瘍の循環系に対するリコンビ ＋ントトキシン遺伝子の分泌は治療効果をもたらす。例としては、切除不能の聴 覚Ｗ１１Ｉｌｌやあるいはある種の血管腫がある。

臨床的状況においては、これらの治療用リコンビナント遺伝子は関与器官におい てｆ！［供給される細胞の中に導入される。これらの細胞の導入場所としては動 脈系および毛細血管系が好ましいが、静脈系でもよい。

局所的な血管損傷の治療の場合、本発明は、その局所にこの症状を改稗するタン パク質を発現させる。１つの実施態様では、それらの部位に血管細胞が認められ たので、それらを治療薬を運ぶキャリヤとして利用した。

本発明はこのように、その１つの様相においては、内皮およびその他の血管細胞 の遺伝子的な変換、あるいは体細胞の遺伝子治療によって治療薬剤（すなわち、 タンパク質、成長因子群）を損傷した局所に運ぶ。細胞への遺伝子移植を成功さ せるためには、４つの条件を満たさなければならない。第１に、細胞に移植しよ うとする遺伝子を同定し、単離しなければならない。第２に、発現させようとす る遺伝子はクローン化され、遺伝子操作ができるようになっていなければならな い。第３には、遺伝子は発現可能またはその機能が発揮されるような形で細胞に 導入されなければならない。第４に、遺伝子的に変換された細胞は、それが必要 とされる血管部位に正しく存在させなければならない。

本発明によれば、変換された細胞もしくは適当なベクターは、外科的、経皮的に 、または静脈内に導入され、患者の血管壁の１部分に付着させる。あるいは、患 者の血管壁に存在するいくつかの細胞を、望ましい遺伝子材料を用いて、または 直接ベクターを適用して、形質転換させる。場合によっては、血管表面から失わ れたまたは損傷した細胞を置き換えるために、これらの方法を用いて、遺伝子的 に変換されていない血管細胞を導入することもできる。

本発明によって、どのような血管も、すなわち動脈、静脈、毛細血管系も治療す ることができる。これらの血管は、ヒト、あるいはは乳動物類の体内のいずれの 器官の中、あるいはその近辺のものでもよい。

血管への正常なまたは遺伝子的に一変換飢れ夫肩胞ｐ廓Å以下、本発明の実施態 様を説明する。

■、　組織培養中での内皮またはその他の血管細胞の確立最初に、１つの細胞系 が確立され、液体窒素の中に貯蔵される。低温貯蔵に先たって、一定量を取り出 し、希望する遺伝子材料を含んだベクター、ウィルスその他に感染もしくは形質 移入させる。

内皮またはその他の血管細胞を、すでに発表されているＪ、Ｗ、Ｆｏｒｄ他。

Ｉｎ　Ｖｉ−ｊ−ｒｐ、１７．４０　（１９８１）の手法を用いて、酵紫学的に 血管の一部から取り出す。血管を切除し、ステンレススチールのロッドの上に反 転して置き、Ｃａ’およびＭｇ゛″を含まないＨａｎｋのバランス塩溶液（ＢＳ Ｓ）、に０．１２５％のＥＤＴＡを加えた溶液のｏ、ｉ％トリプシン溶液中で、 ｐＨ８，３７°Ｃで１０分間、インキュベートする。

細胞群（０，４から１．５ｘｌＯ６）は遠心分離によって回収され、１０％牛脂 児血清、２５ｔｉｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助液（ＥＣＧＳ。

Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、ウォルサム、マサチューセッ ヅ州）、１５ＬＩ／ｍｌのヘパリン、および５０μｇ７ｍｌのゲンタミシンを含 んだ培養液１９９　（ＧＩＢＣＯ）中に再懸濁させる。細胞を、ゼラチン（蒸留 水中２ｍｇ／ｍｌ）をプレコートした７５ｃｍ２の組織培養フラスコに加える。

細胞群は交合に達するまで、２日ごとに上記培養液が与えられる。

培１２遍間後、ブタの内皮を培養する場合には、ＥＣＧ５およびヘパリンを培養 液から除外する。もし、血管の平滑筋細胞あるいはｌｉＩ雑芽細胞を培養する場 合には、ＥＣＧ５およびヘパリンは培養過程から完全に除外する。細胞のアリコ ートは、約１０’ｌｌｌの細胞を０．５ｍｌの水冷胎児子ウシ血清中に氷の上で 再懸濁させることによって、液体窒素の中で貯蔵する。１０％のＤＭＳＯを含む 同量の水冷胎児子ウシ血清を加え、細胞を冷やしたスクリューキャップ式のコー ニング冷凍チューブに移す。これらの細胞は、長期間の液体窒素中での貯蔵の前 に、３時間−７０℃の冷凍庫に移される。

その後この細胞は、希望する遺伝子材料を含んだベクターに感染させる。

Ｉｌ、正常または外因性タンパク質を発現している細胞の脈管系への導入。

Ａ、関連タンパク質を発現している細胞のカテーテル法による導入。

患者は、無菌手法を厳密に適用して、外科的にまたは経皮的にカテーテルを挿入 できるように準備する。目標とする血管の静脈切開を行うか、あるいは適当な麻 酔処理の後、目標とする血管の中に針を挿入する。血管（５）を穿刺し、米国特 許４，６３６，１９５（７１ようなカテーテル（コれはＵＳＣＩ。

Ｒ１］　］　ｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州から入手可能。この米国特許の開 示をここに援用する）、をもし必要なら蛍光透視ガイドのもとで、ガイドワイヤ 手段（６）により、血管（５）の中に進ませる（図１）。このカテーテル手段（ ４）は、感染した内皮細胞を動脈の別々の部位に導入するようにデザインされて いる。

このカテーテルは、遠位および近位のバルーン手段（２）および（１）を有し、 （それぞれのバルーンの手段は、たとえば長さ約３ｍｍ、幅約４ｍｍである）、 バルーン手段の間には一定の長さのカテーテル手段がある。バルーンの間のカテ ーテル手段は、点滴注入口部（３）につながる１つの口部を有する。遠位および 近位のバルーン手段が膨らまされると、血管の中に１つの中央スペースが形成さ れ、口部を通して感染された細胞を点滴注入することができる。

解剖学的標識点により血管の部位が特定され、血管の理化を行うために、近位の バルーン手段（２）を膨らませ、内皮を機械的外傷（たとえば、血管の中に部分 的に膨らませたバルーンカテーテルを強制的に通過させる）または機械的外傷と 少量のディスパー七、トリプシン、コラゲナーゼ、パパイン、ペプシン、キモト リプシン、またはカテプシンなどの蛋白分解酵素の組み合わせ、あるいはこれら の蛋白分解酵素だけを用いた培養により、理化する。蛋白分解酵素のほか、リパ ーゼも使用できる。血管の当該部位はまた、ＮＰ−４０，ＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ 、デオキシコール酸塩、あるいはＳＤＳなどの弱い洗浄剤による処理によっても 理化できる。

理化の条件は、細胞移入のためには基本的に内皮を完全に落とすか、直接感染の 場合は約２０から９０％、好ましくは５０から７５％、の細胞を血管壷から落と すように調整する。ある場合には、細胞の除去をしなくてもよいこともある。

ついでカテーテルを、点滴注入口（３）が理化された内皮の部位にくるように進 める。つぎに動脈の特定の部分に、感染、または形質移入した、あるいは正常な １Ｉｆｌｌ胞を３０分間点滴注入する。もし、血管がある程度の虚血を許容でき る器官を１１流している場合、たとえば骨格筋、は遠位の潅流は特に問題にはな らないが、もし必要ならば外部シャントで、あるいは遠位の潅流ができるカテー テルを使用して回復させることができる。感染した内皮細胞を点滴注入した後、 バルーンカテーテルをはずし、動脈穿刺部位および皮膚切開箇所を修復する。も し、遠位の潅流が必要ならば、遠位潅流ができるようにデザインされた別のカテ ーテルを使用する。

Ｂ、リコンビナント遺伝子の血管壁の細胞への直接導入、または生体中の特定の 循環系による潅流；器官壁または器官の細胞の感染または形質移入。

上記と同様の外科的手法が用いられる。感染した細胞を使うかわりに、形質導入 したウィルス性ベクター（１０′から１０６個／ｍ１）または運搬ベクターに複 合化したＤＮＡのような高力価の希望する遺伝子材料を、ダブルバルーンカテー テル手法を用いて、器官壁に直接点滴注入する。このベクターは、感染の効果を 高めるために、血清およびポリブレン（１０μｇ／ｍ　１　）を含んだ培養液の 中に注入される。カテーテルによってできたデッドスペース中で、充分な時間（ ０，２から２時間またはそれ以上）培養した後、この培養液は脱気され、燐ｌ！ ｌＨＩ衝生理塩液で静かに洗浄し、そして動脈循環を回復させる。、術後の回復 のためにも同様の手順が適用される。

器官の表面は機械的な理化のみでも、あるいは少量のディスパー七、トリプシン 、コラゲナーゼ、またはカテプシンなどの蛋白分解酵素との組み合わせ、または これらの蛋白分解酵素だけを用いた培養、によっても準備することができる。

暉化の条件は器官壁からの細胞脱落が適当になるように調節される。

ウィルス性ベクターまたはＤＮＡ−ベクター複合体は、精製ウィルスまたは自原 件の血清を含んだ複合体を用いて、ダルベツコの改変イーグル培地に滴下注入す る。または、目標細胞に対するウィルス粒子の付着性を強化して感染効果を高め るために、ポリブレン（］、０１１ｇ／ｍｌ）、ポリーＬ−リジン、デキストラ ンサルフェートのような粘着性の物質、または生理学的に適当なポリカチオン性 物質、またはウィルスあるいはベクターの被膜糖蛋白に対するハイブリッド抗体 や器官壁中あるいは器官から潅流する組織中の関連する目標に対するハイブリッ ド抗体を含んだ複合体を用いる。ウィルスあるいはベクターの被膜糖蛋白や関連 する目暉細胞に月するハイブリッド抗体は、２つの方法のいずれかで作られる。

異なるエピトープに対する抗体は化学的に架橋することができる（Ｇ、Ｊｕｎｇ 、Ｃ。

Ｊ、ｔ（ｏｎｓｉｋ、Ｒ，Ａ、Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ、およびＨ，Ｊ、Ｍｕｌｌｅｒ −Ｅｂｅｒｈａｒｄ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、切ＳＡ、８３゜ ４４７９　（１９８６）；Ｕ、Ｄ、５ｔａｅｒｚ、Ｏ，Ｋａｎａｇａｗａ、およ びＭ、Ｊ、Ｂｅｖａｎ、Ｎ４−ｊｕｒ、−ｑ、３１４，６２８　（１９８５）； およびＰ。

Ｐｅｒｅｚ、Ｒ，Ｗ、Ｈｏｆｆｍａｎ、Ｊ、Ａ、Ｔｉｔｕｓ、およびり、　Ｍ。

Ｓｅｇａｌ、Ｊ、、Ｅ−ｘ、ｐ、Ｍｅ＜ｊ、、１．６３，１−６６　（１９８６ ））、またはハイブリッドハイブリドーマを用いて生物学的にカップリングされ る（Ｕ、Ｄ。

５ｔａｅｒｚおよびＭ、Ｊ、Ｂｅｖａｎ、Ｐｒｏｃ−、Ｎａｔよヨへ交炙史−８ ｃ−↓、ＵＳ−Ａ、８３．１４５３　（１９８６）；およびＣ，Ｍｉｌｓｔｅｉ ｎおよびＡ、Ｃ，Ｃｕｅｌ　］、ｏ、　Ｎａ、ｔ−！Ｊ」友、３０５，５３７　 （１９８３））ｅカテーテルの中央スペースの中で、０．２から２時間またはそ れ以上培養した後、この培養液は脱気され、燐ｌｉ！緩衝生理塩液で静かに洗浄 し、そして循環を回復させる。

異なったカテーテルデザイン（図２参照）を用いて、異なった点滴注入プロトコ ールを使用することもできる。この２番目のアプローチでは、単一のバルーン手 段（２）のカテーテルで、部分的に理化された動脈部分の中にレトロウィルスを 高圧で運搬できるような複数の口部手段（３）を有するものを使用する。器官の 表面は上記のように準備され、同様の粘着性分子を使用して、欠陥ベクターを導 入する。この場合、高圧運搬システムの使用は、ベクターと隣接する血管組織中 の細胞との相互作用を最適なものとするのに役立つ。

本発明はまた、感染の効果を高めるために、成長因子をカテーテルによって局所 的にまたは全身的に使用する方法も提供している。レトロウィルスベクターのほ かに、ヘルペスウィルス、アデノウィルス、あるいはその他のウィルス性ベクタ ーも本性の手法に適したベクターである。

また、器官の中または組織の中で細胞の形質転換を行わせることも可能である。

器官または組繊細胞の直接形質転換は、２つの方法のいずれかで行うことができ る。第１の方法では高圧による形質導入が用いられる。高圧によって、ベクター は血管壁を通して回りの組織中に移行する。第２の方法では、キャピラリーベッ ドの中への注入（これは浸潤させるために損傷を受けた後でもよい）によって、 とりま＜ｓｕｉを直接感染させる。

ベクターや細胞の点滴注入のために必要な時間は本発明のうちとの方法を使用す るかによって異なる。細胞やベクターを血管中に点滴注入するのに適当な時間は ０．０１から１２時間であり、好ましくは０．１から６時間、最も好ましくは０ ．２から２時間である。あるいは、ベクターや細胞の高圧点滴注入を行う場合は 、より短時間が好ましい。

本発明で使用−す−る細胞の一人手−呟”遺伝子的材料″という用語は、一般的 にタンパク質をコードするためのＤＮＡを指す。またＲＮＡについても、ＲＮＡ ウィルスまたはＲＮＡをベースとしたその他のベクターとともに使用されるとき には、この用語を適用する。

形質転換は、直接感染、形質導入、または他の取り込み方法によって外因性遺伝 子を細胞の中に組み込むプロセスである。

ｎベクター”という用語は、広く知られており、よく使われることば”クローニ ングビヒクル”と同義である。ベクターは非染色体の二重らせんＤＮＡで、完全 なレプリコンからなり、単細胞有機物の中におかれたときに、たとえば形質転換 のプロセスによって、複製される。ウィルス性ベクターには、レトロウィルス類 、アデノウィルス類、ヘルペスウィルス、パポウイルス、または変性天然ウィル ス類がある。ベクターはまた、ＤＮＡと細胞によって取り込むことができる化学 品または物質の処方量も意味する。

もう１つの実施態様では本発明は遺伝子の発現を抑制する方法を提供する。この 目的を達成するためには４つのアプローチを使うことができる。これらにはアン チセンス剤の使用が含まれ、ｍＲＮＡに対して相補的な合成オリゴヌクレオチド （Ｍａｈｅｒ　ＩＩＩ、Ｌ、Ｊ、およびＤｏｌｎｉｃｋ、Ｂ、Ｊ、Ａｒｃｈ。

Ｂ↓−ｑ−ｐ九旦町　Ｂ−Ｖ艷旦ｈｙ１ユ、２５３，２１４−２２０　（１９８ ７）およびＺａｍｅｃｎｉｋ、Ｐ、Ｃ，、他、　ＰｊＪ戸ｂＮａ　ｊ　１．　Ａ ｃ　ａｄ、　Ｓ　Ｃｉ−＋８３．４１４３−４１４６．（１９８６））、または この遺伝子の逆相補体を発現するプラスミド（Ｉｚａｎｔ、Ｊ、Ｈ，およびＷｅ ｉｎｔｒａｕｂ、Ｈ，。

Ｓｃｊ、ｅ−ｎｃｅ、２２９，３４５−３５２．（１９８５）ＨＣｅｌｌ、３６ ゜１０７７−１０１５　（１９８４））、のいずれかを使用する。さらに、リポ ザイムと呼ばれる触媒的ＲＮＡ５は特にＲＮＡシーケンスを分解させることがで きる（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｏ，Ｃ，、Ｎ１ｔｕ−ｒｑ、３２８．１５９６−６ ００゜（１９８７）、Ｈａｓｅｌｏｆｆ、Ｊ、およびＧｅｒｌａｃｋ、Ｗ、Ｌ、 。

Ｎ　ａ　、ｔ−ｕ−ｒ’−ｑ、３３４，５８５−５９１．（１９８８））、第３ のアプローチは、°′細胞内免疫化”であり、細胞内タンパク質の類似体が特に それらの機能を阻害する（Ｆｒｉｅｄｍａｎ、Ａ、Ｄ、、Ｔｒｉｅｚｅｎｂｅｒ ｇ、Ｓ、Ｊ、およびＭｃｋｎｉｇｈｔ、Ｓ、Ｌ、、％ｔｙ上ｑ−ｒｅ、３３５， ４５２−４５４（１９８８））もので、以下に詳細を示す。

第１のアプローチは特に細胞内の転写を除去するのに使用できる。転写の除去は Ｓ１ヌクレア一セ分析で確認することができ、結合タンパク質の発現は機能分析 で確認される。転写ファクタｍＲＮＡのプロセシングおよび翻訳の阻害に単一ら せんオリゴヌクレオチド類似体を使用することができる。要約すれば、目的遺伝 子のコード鎖に相補的な合成オリゴヌクレオチドまたはチオールから誘導された アナログ（２０−５０ヌクレオチド）が準備される。これらのアンチセンス剤は ｍＲＮＡの異なる領域ごとに準備される。それらは、遺伝子の５′非翻訳領域、 翻訳開始サイトおよびそれに続＜２０−５０の塩基対、中央のコード領域、また は３′非翻訳領域、に相補的なものである。アンチセンス剤は活性化の前に形質 導入された細胞と一緒に培養される。どの領域がこれらの遺伝子の発現を阻止す るのにより効果的かを確認するために、メツセンジャーＲＮＡの異なる部位に対 するアンチセンス剤の競合物質の効果を比較する。

ＲＮＡはまた、自動触媒的にはたらいて自己融解を起こさせたり、特に相補的Ｒ ＮＡシーケンスを分解させる機能を有している（Ｕｈｌｅｎｂｅｃｋ、Ｏ，Ｃ， 。

Ｎ東上ｕ−ｒ−６，，３２８，５９６−６００（１９８７）、Ｈａｓｅｌｏｆｆ 、Ｊ。

およびＧｅｒｌａｃｋ、Ｗ、Ｌ、、Ｎｊａ−ｔｕ−ｒｅ、３３４，５８５−５９ １゜（１９８Ｂ）、およびＨｕｔｃｈｉｎｓ、Ｃ，Ｊ、、他、Ｎｕｃｌｅｉｃ− Ａｃｉｄｓ　Ｒｅ−８−、−，１４，３６２７−３６４０（１９８６））ｏ　Ｒ ＮＡ開裂がうまくゆくための条件としては、ハンマーヘッド構造とその構造のフ ランキング部位についた保存ＲＮＡシーケンスがある。この触媒的領域の隣接領 域は特定のＲＮＡに対して相補的であり、したがってリボザイムが特定の細胞ｍ ＲＮＡ５を特徴とする特定の目標遺伝子の生産を阻止するためには、この遺伝子 をコードするｍＲＮＡをリボザイムを使用して分解してやればよい。要約すれば 、ＲＮＡ転写の中のどのようなＧＵＧシーケンスもリボザイムを使用した分解の 目標になりえる。これらはＤＮＡシーケンス分析で確認され、ＲＮＡ転写にまた がるＧＵＧサイトがその特異的分解のために使用される。５′非翻訳領域の中の サイトコード領域のサイトおよび３′非翻訳領域の中のサイトが、この転写を分 解するのにより効果的かどうかを決定するための目標とされる。ＧＵＧサイトの 」１流の２０塩基対の相補的シーケンスをコードする合成オリゴヌクレオチド、 ハシマーヘッド構造とこのサイトの下流の一２０塩基対の相補的シーケンスが、 ｃＤＮＡの関係サイトに挿入される。このようにして、リボザイムは同じ細胞区 画を内因性メツセージとして目標にする。特別のエンハンサ−の下流に挿入され たりボザイムは、特定の細胞の中で高い発現を示すものを作り出す。これらのプ ラスミドは、ネオマイシン耐性プラスミドｐｓＶ２−Ｎｅｏまたは選択的マーカ ーとともにエレクトロポレーションおよび同時形質導入によって、関係する目的 細胞に導入される。これらの転写の発現はノーザン・プロットおよびＳ１ヌクレ ア一ゼ分析によって確認される。確認されると、ｍＲＮＡの発現を８１ヌクレア ーゼプロテクシヨンによって、これらの転写の発現が目的ｍＲＮＡおよびそれを 規制する遺伝子の定常レベルを下げているかどうか評価する。タンパク質のレベ ルもまた確認する。

遺伝子はまた、活性化に必要な領域を欠いた変異転写を用意することによって阻 害される。要約すれば、その領域を確定した後、機能を刺激できないような変異 型を合成する。この切形遺伝子を、ネオマイシン耐性遺伝子を含んだプラスミド の５Ｖ−４０エンハンサ−の下流に挿入する（Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｒ，およびＢ ｅｒｇ、Ｐ、、Ｓ、ｃ−１−ｅ７３ｃｅ、２０９．１４２２−１４２７　（１９ ８０）（別の転写ユニットの中）。このプラスミドを細胞の中に導入し、０４１ ８を使って選別する。この遺伝子の変異型の存在は、Ｓ１ヌクレア一ゼ分析およ び免疫沈降法によって確認される。これらの細胞中の内因性タンパク質の機能は ２つの方法によって評価される。第１は、正常な遺伝子の発現を確認する。第２ は、これらのタンパク質の既知の機能を評価する。もし、この細胞間阻害型変異 株がその宿主に対して毒性がある場合には、メタロチオネインプロモーターのよ うな誘導性のコントロールエレメントに導入する。安定した株を単離したあと、 細胞をＺｎまたはＣｄと−ともに培養しこの遺伝子を発現させる。そのあと宿主 細胞に対する影響を評価する。

特定の遺伝子を不活性化させるもう１つのアプローチは、その他の活性の機能や 発現と拮抗するりコンビナンドタンパク質を過剰に発現させることである。たと えば、もしＴＰＡの発現を減らしたい場合（たとえば、播種性の血栓溶解の診療 手段において）には、プラスミノーゲンアクチペーターインヒビターを過剰に発 現させればよい。

近年の生化学および分子生物学の発展により、′リコンビナント”ベクター、た とえばその中のレトロウィルスおよびプラスミドが、外因性のＲＮＡまたはＤＮ Ａをそれぞれ含むもの、を作ることが可能になった。特殊なものでは、リコンビ ナントベクターが非相同のＲＮＡまたはＤＮＡ　（これはりコンビナンドベクタ ーによる形質転換ができる有機体では通常生成されないポリペプチドをコードし たＲＮＡまたはＤＮＡという意味であるが）を含むことも可能になった。リコン ビナントＲＮＡまたはＤＮＡベクターの生産についてはよく知られており、詳細 を説明するまでもない。しかし、参考のためにこのプロセスについて簡単に述べ ておく。

たとえば、レトロウィルスまたはプラスミドベクターは、開裂により連結可能な 末端部をもつ直１１ＲＮＡまたはＤＮＡにすることができる。これらの末端部は 相補的な同様の連結可能な末端部を有する外因性ＲＮＡまたはＤＮＡと結びつき 、完全なレプリコンおよび希望する発現特性を有して生物学的機能を発揮できる リコンビナントＲＮＡまたはＤＮＡ分子となる。

ＲＮＡおよびＤＮＡの組換えには、別々のＲＮＡまたはＤＮＡの隣りあった末端 フラグメントを連結しやすいように調整するなど、種々の手法がある。

本発明で使用する外因性、すなわちドナーである、ＲＮＡまたはＤＮＡは適当な 細胞群から得ることができる。公知の手法を使って、ベクターを作り、治療薬タ ンパク質の生体中発現が可能な形質転換細胞を得る。形質転換細胞は、目的細胞 を、目的細胞の中にＲＮＡまたはＤＮＡを取り込み形質転換できるような処方の ＲＮＡまたはＤＮＡに接触させることにより得ることができる。そのような処方 には、たとえば、レトロウィルス類、プラスミド類、リポソーム組成物、または ポリーＬ−リジン、ＤＥＡＣ−デキストランのようなポリカチオン性の物質およ び目的リガンドなどが含まれる。

このように本発明は、治療薬または診断薬を、局所的または全身的な目的のため に、血管の局所に送り込む方法として、細胞の遺伝子的変換を利用する方法を提 供するものである。これらの細胞中で発現されるリコンビナントタンパク質の範 囲は広くかつｆｌ類が多い。これには、血栓症および再狭窄症、脈管形成の治療 のためのｔＰＡ、　または再血管形成の目的のための成長因子、および血管収縮 または血管けいれんを改善するための血管作用性因子、などのタンパク賓を発現 するベクターを使用する遺伝子変換も含まれる。この手法はまた、遺伝的疾患、 または後天的な病気、局所的あるいは全身的な疾患に対する遺伝子的な治療にお よぶものである。本発明はまた、細胞が失われた特定の部位に正常な細胞を導入 する、たとえば、血管形成手術やカテーテル処置の間に損傷した内皮を置き換え る、ためにも使用できる。

たとえば、虚血性疾患（血栓症）の治療においては、ｔＰＡまたはその修飾物、 ウロキナーゼまたはストレプトキナーゼなどをコードする遺伝子的材料が、細胞 を形質転換するために使用される。虚血性器官（たとえば、心臓、腎臓、大腸、 肝臓、など）疾患の治療においては、形質転換成長因子ａ　（ＴＧＦ−α）、形 質転換成長因子ｓ　（ＴＧＦ−β）、アンジオジェニン、腫瘍壊死因子α、腫瘍 壊死因子β、酸性フィブロブラスト成長因子または基本フィブロブラスト成長因 子のような側副枝再生剤（ｒｅｃｏｌｌａｔｅｒａｌｉｚａｔＬｏｎ　ａｇｅｎ ｔｓ）をコードする遺伝子的材料を使用することができる。血管運動系の疾患の 治療においては、血管拡張剤または血管収縮剤をコードする遺伝子的材料を使用 することができる。これらには、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板誘導成 長因子またはエンドセリンが含まれる。糖尿病の治療においては、インスリンを コードする遺伝子的材料を使用することができる。

本発明はまた、悪性疾患の近接部に形質転換した細胞を置くことによって悪性疾 患を治療するのに利用することができる。この用途では、ジフテリアトキシン、 百日咳トキシン、またはコレラトキシンをコードする遺伝子的材料が使われる。

実施例の１つでは、本発明は腫瘍細胞に対する免疫反応を刺激するかあるいは腫 瘍細胞の成長を抑制するか、または生体中での遺伝子的変性による転位のいずれ かによる悪性疾患の治療法を提供する。このアプローチは、腫瘍細胞をインと１ ・口で増殖、変性、選択する点がこれまでの方法と異なる。

本実施例によれば、水沫はＤＮＡシーケンスまたはＲＮＡシーケンス（リコンビ ナント遺伝子も含む）を生体内の腫瘍細胞に次のような方法で送ることに使用さ れる。（１）レトロウィルスまたはウィルスベクターをビヒクルとして、（２） ＤＮＡまたはＲＮＡ／リポソームをビヒクルとして、（３）ＤＮＡまたはＲＮＡ シーケンスを含んだ化学処方品で、そのシーケンスを目的細胞に運搬しやすいよ うなキャリヤ分子と結合させたものを利用して、または（４）細胞媒介の遺伝子 移送を利用して遺伝子を生体内の特定の部位に送る、たとえば、インビトロで形 質転換された血管平滑筋細胞や内皮細胞をビヒクルとして使用し腫瘍部位ヘリコ ンビナント遺伝子を送る。

本実施例は１面では、本発明は癌に対する防御方法を提供するために免疫システ ムに依拠し、悪性疾患のための補助的治療法として重要な役割を果たすものであ る。免疫療法はｒでに悪性疾患の治療のための補助的アプローチとして有用なこ とが認められている。細胞溶解性Ｔ細胞およびリンフ才力インの両方とも腫瘍細 胞の破壊を容易にすることができ、サイトカインまたは腫瘍浸透リンパ球の投与 が、腫瘍の退行を推し進める戦略として効果のあることが、動物モデルおよび大 体実験で認められている。たとえば、リンフ才力イン活性化キラー細胞（ＬＡＫ ）および腫瘍浸透リンパ球（Ｔ　Ｉ　Ｌ）は腫瘍性の細胞を溶解し、部分的また は完全に腫瘍を撃退できることが知られている。悪性細胞の中でのサイトカイン 遺伝子の発現もまた腫瘍の退行を促すものである。

本発明は、生体中の腫瘍細胞にリコンビナント遺伝子を直接導入する方法によっ て、ｎ、ｍに対する遺伝子導入の新しいアプローチを提供するものであるが、従 来の遺伝子導入法がインビトロでの腫瘍細胞の変性に重点を置き、そしてその変 性された細胞を移入するという点が水沫とは対照的である。従来のアプローチで は、生体内で活動する細胞とは異なる成長条件のもとで細胞の選択が行われると いう点が不都合であり、またそれぞれの悪性疾患ごとに細胞種を確立しなければ ならず、したがって、ヒトの病気に対する適用がきわめて難しいものであった。

本実施例で使用される遺伝子は、細胞内の、分泌された、または細胞表面の分子 が患者にとって外因性のものであり、かつ、（１）患者に免疫原性のあるもの、 （２）＠瘍に対して拒絶、退行、またはその両方を誘導するもの、（３）腫瘍の 細胞に対して毒性のあるもの、をコードしたＤＮＡシーケンス（または対応する ＲＮＡシーケンスのものでもよい）を含んだものである。

本発明で使用できるＤＮＡシーケンス（または対応するＲＮＡシーケンス）を含 んだベクターとしては、そのようなりＮＡまたはＲＮＡシーケンスを含んた裏抜 性発現ベクターである。外因性ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを宿主の中で発現 させる手法はすでに知られている。たとえば、ここにレファレンスとして援用す る、Ｋｏｒｍａｎら、ｇｒ文居、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ−（１９ ８７）８４，２１．５０−２１５４、を参照されたい。

このベクターは、上記のように、レトロウィルスまたはその他のウィルスベクタ ー（すなわち、ウィルスベクター）に入れて、ＤＮＡまたはＲＮＡ／リポソーム 複合体、または細胞媒介の遺伝子トランスファー、にょって患者に投与すること ができる。さらに、このベクターが非ウィルス性の形として存在する場合は、Ｄ ＮＡまたはＲＮＡシーケンスを含んだ化学処方品で、そのシーケンスを宿主細胞 に運搬しやすいようなキャリヤ分子と結合させたものを利用して投与することが できる。そのようなキャリヤ分子としては、そのベクターが供給される先の細胞 に対して特異的な抗体、または目的細胞に結合したレセプターと反応し得る分子 である。

本発明に基づいて、細胞媒介の遺伝子トランスファーを使用することができる。

この方法の場合、リコンビナント遺伝子の生体への供給は、宿主から取り出され た細胞への遺伝子的材料の導入および細胞培養での変性、そして遺伝子的に変換 された細胞の宿主への導入、にょることになる。本実施例で使用可能な典型的な 細胞系パッケージは、Ｄａｎｏｓ、他、Ｐ工ＱＣ，ＮＡ上ユニー、−ｑすＬ−ミ 釘↓−（、、Ｕ−８−Ａ）−（１９８８）８５　：　６４６０．ｌ：記載されて おり、ココニレファレンスとして援用する。

本発明に基づいた分子をコードするＤＮＡシーケンスまた４ｔＲＮＡシーケンス は患者、これはヒトあるいはヒトでない動物でもよい、に局所的にあるいは全身 的のいずれかで投与する。全身的投与の場合、非ウィルス性のＤＮＡまたはＲＮ Ａ化学処方品方晶宿主細胞に運搬しやすいようなキャリヤ分子と結合させたもの を利用して行うのが望ましい。これらの投与は、ＩＶまたはＩＭ注射、または公 知の手段を使った皮下注射、または本発明によるカテーテルの使用などで行うこ とができる。

本発明で用いられるレトロウィルスビヒクルは、天然のレトロウィルスから誘導 したウィルス粒子で、本発明に基づいて、天然のレトロウィルスを遺伝子的に変 換し複製欠陥とし、必要なリコンビナント遺伝子を発現させるようにしたもので ある。いったんウィルスが遺伝子的材料を細胞に供給すると、それ以外の感染性 のウィルスを発生させることなく、外因性のりコンビナンド遺伝子を細胞に導入 する。

その他のウィルスベクターでは、使用されるウィルス粒子は、その他の天然ウィ ルスから誘導されたもので、天然のレトロウィルスを遺伝子的に変換し複製欠陥 とし、必要なりコンビナンド遺伝子を発現させるようにしたものである。そのよ うなウィルスベクターはアデノウィルス、乳頭腫ウィルス、ヘルペスウィルス、 バルボウイルスなどから誘導される。

本発明のシーケンスはまた、ＤＮＡまたはＲＮＡ／リポソーム複合体として投与 することもできる。そのような複合体は、脂肪粒子、脂質（これらは遺伝子材料 に結合する）、ＤＮＡまたはＲＮＡ　（これらは疎水性の被膜を提供する）、の 混合物であり、遺伝子材料を細胞に送り込む。この組成物は遺伝子トランスファ ーのための非ウィルス性ベクターを提供するものである。本発明で用いられるリ ポソームは、ＤＯＰＥ　（ジオレイル・フォスファチジル・エターノルアミン） 、ＣＵＤＭＥＤＡ　（Ｎ−（５−コレストラム−３−β−オール３−ウレサニル ）−Ｎ’　、Ｎ’−ジメチルエチレンジアミン）を含んだものを使用できる。

上に述べたように、本発明にはその他の非ウィルス性のベクターも使用すること ができる。これらには、キャリヤ分子（たとえば、抗体またはレセプターリガン ド）と結合させたＤＮＡまたはＲＮＡの化学処方品があり、これらは宿主細胞の 生物学的特性を変えるための宿主細胞への送り込みを容易にする。ここで用いる ”化学処方品”という用語は、核酸化合物をタンパク質や脂質、またはその誘導 物のキャリヤ分子にカップリングさせるための核酸変性物を指す。そのようなキ ャリヤ分子としては、宿主細胞に対して特異的な抗体またはレセプターリガンド 、すなわち、宿主細胞に結合したレセプターと反応し得る分子である。

この分子として本発明で使用できるものには下記のものがある＝　（１）免疫刺 激剤をコードした遺伝子で、クラスエ組織適合性遺伝子、クラスＩＩ組織適合性 遺伝子、バクテリア遺伝子（ミコバクテリア（ＰＰＤ）遺伝子および熱シヨツク タンパク質をコードした遺伝子など）、ウィルス性グリコプロティン（水胞性ロ 内炎つィルスＧタンパク質、インフルエンザ血球凝集素およびヘルペスウィルス グリコプロティンβなど）をコードする遺伝子、マイナー組織適合性抗原、リゾ チームや牛血清アルブミンのような外部タンパク質、およびＥＩＡＳＰ５３　（ 変異種）ならびにｔａｘを含む発ガン性遺伝子；　（２）免疫および成長刺激剤 ／抑制剤で、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−４，３，６または８を 含む刺激剤のような分化の誘発剤、ＴＮＦ−αまたはβ、ＴＧＦ−β（１，２ま たは３）、ＩＬ−１のような抑制剤／誘発剤、溶解性成長因子レセプター（ＰＤ ＧＦ、ＦＧＦレセプター）、成長因子またはレセプターに対するリコンビナント 抗体、成長因子の相似体（ＰＤＧＦ、ＦＧＦ）、インターフェロン（α、βまた はγ）および粘着性分子；または（３）トキシンまたは逆選択性マーカー（チミ ジンキナーゼ、ジフテリアトキシン、百日咳トキシンまたは薬剤感受性タンパク 質なと）。

このＤＮＡ／ＲＮＡシーケンスは患者として同種のソースから入手するのが望ま しいが、これは絶対的に要求されることではなく、本発明ではこの実施態様にお いて、患者の異なったソースからから得たＤＮＡシーケンスを使用する方法を提 供している。本発明の好ましい実施態様では、免疫刺激剤をコードした遺伝子お よびトキシンまたは逆選択性マーカー（上記の（１）および（３）に対応するも の）は、患者が属する種とは異なった種から選ばれている。免疫および成長刺激 剤／抑制剤（上記の（２）に対応するもの）は、もう１つ別の好ましい実施態様 に基づいて、“患者の種と同一の種から得られた遺伝子を採用している。

本発明をＡＩＤＳの治療に使用する場合、溶解性ＣＤ４またはその誘導物をコー ドする遺伝子材料を使用することができる。遺伝子的な疾患の治療の場合（たと えば成長ホルモン欠乏）にはその必要とする物質をコードする遺伝子的材料（た とえばヒト成長ホルモン）を使用することができる。これらすべての遺伝子材料 は、本分野の技術に習熟した当業者ならば容易に入手することができる。

もう１つの別の実施態様において、本発明は患者の病気を治療するキットを提供 するが、このキットはカテーテル、ならびに酵素または弱性の洗浄剤のいずれか を含み、カテーテルは血管の中に挿入できるようになったものであり、かつ、前 記血管の中に挿入できるようになったバルーンエレメントを備え、かつ、カテー テル部を血管の中に正しく保持できるように、血管の壁に対して膨らませること ができるようになっている主カテーテル部、ならびに主カテーテル部に備えられ た血管の中に溶液を供給するための手段、を含み、酵素または弱性の洗浄剤を含 んだ溶液は生理学的に許容される溶液である。この溶液は、ディスパーゼ、トリ プシン、コラゲナーゼ、パパイン、ペプシン、キモトリプシンなとの蛋白分解酵 素を含む。弱性の洗浄剤として、この溶液はＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸｌｏｏ 、デオキシコール酸塩、あるいはＳＤＳなどを含む。

あるいは、このキットには生理学的に許容される溶液として、ヘパリン、ポリ− １，−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェート、ポリカチオン性物質の ような薬剤、または二価の抗体を含んだものでもよい。この消液はまた、ベクタ ー類または細胞類（正常または形質転換されたもの）を含んでもよい。さらに別 の実施例では、このキラ）・はカテーテルおよび酵素または弱性の洗浄剤を含ん たｖ４液と、ヘパリン、ポリーＬ−リジン、ポリブレン、デキストランサルフェ ート、ポリカチオン性物質のような薬剤、または二価の抗体を含んだ消液（この 溶液にはベクター類または細胞類を含んでもよい）の両方を含んだものでもよい 。

このキットは、１個のバルーンと中央の遠位潅流口を備えたカテーテル、ならび に特定の器官への細胞の導入、またはキャピラリーベッドへのベクターの導入、 あるいはこのキャピラリーベッドによって潅流される特定の器官や組織への細胞 の導入を行うのに許容される溶液を含んでもよい。

あるいは、このキットは、間隔を開けて設けられ、血管に挿入できるようにした ２つのバルーンエレメントを有し、血管の中に１つのチャンバ（室）を形成でき るように、また主カテーテルを所望の位置に保持できるように、この両方のエレ メントとも血管の壁に対して膨らませることができるようになっている１つの主 カテーテル部を含んだものでもよい。この場合、チャンバへ溶液を供給する手段 は、２つのバルーンの間に設ける。このキットは血管の中へ溶液を送り出すため の複数の出口手段を備えたカテーテルとしてもよい。

このように、本発明は患者の疾患を治療する方法として、器官の壁に付着してい る細胞、または患者のこの器官から潅流される細胞に外因性の治療性タンパク質 を発現させようとするもので、このタンパク質が疾患を治療し、または診断目的 に有用なものとなる。本発明方法は虚血性疾患、血管運動系疾患、糖尿病、悪性 疾患、ＡＩＤＳ、または遺伝子的疾患の治療に用いることができる。

キナーゼ、ストレプトキナーゼ、酸性フィブロプラスト成長因子、塩基性フィブ ロブラスト成長因子、腫瘍壊死因子α、腫瘍壊死因子β、形質転換成長因子α、 形質転換成長因子β、心房性ナトリウム排泄増加因子、血小板から誘導された成 長因子、エンドセリン、インスリン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン、コ レラトキシン、溶解性ＣＤ４またはその誘導物、および成長ホルモンなどを疾患 治療のために使用できる。

水洗では診断効果を持つ外因性タンパク質もまた使用できる。たとえば、β−ガ ラクトシダーゼのようなマーカープロティンを細胞遊走をモニタするために使用 で餐る。

外因性の治療性タンパク質炙発現させる細胞類は内皮細胞類が好ましい。

本発明のその他の特性は以下の参考実施例の説明を通して明らかになると思われ るが、これらの実施例は本発明の説明のためであって、本発明を限定するもので はない。

下記の報告データは、内皮細胞の移植および遺伝子移植の可能性を示すものであ り；内皮細胞はカテーテル法により安定的に動脈壁に１ｎ−ｓｉｔリ−移植され 、リコンビナントマーカープロティン、β−ガラクトシダーゼを生体内で発現し ている。

ブタのしゆく層形成はヒトのそれと近似性があるので、動物モデルとして、通交 のブタ系列、ユカタン・ミニビッグ（Ｃｈａｒｌｅｓ　ＲｌｖｅｒＬａｂｏｒａ ｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ、、ウイルミントン、マサチューセッツ州）が選ばれた（ １）。最初の内皮細胞系は、８力月の雌ミニビッグの内部頚静脈から確立された 。この種の内皮細胞としての同定は、この細胞群が組織培養においてブタの内皮 に特有の成長特性および形態学的特性を示したことにより確認された。この内皮 細胞はまた、線維芽細胞やその他の間葉細胞群（２）とは対照的に、アセチル化 低密度すポタンパク質（ＡｃＬＤＬ）のレセプターを発現した。

Ａ　ＣＬ　Ｄ　Ｌレセプター発現の分析を行ったところ、蛍光ＡＣＬＤＬの取り 込みで判断して、培養した細胞の９９％以上がこのレセプターを含んでいた。

２系列の独立したβ−ガラクトシダーゼ−発現内皮細胞系を、ネズミの両栄養性 β−カラクトシダーゼー形質導入レトロウィルスベクター（ＢＡＧ）で感染させ た後単離した。このベクターは複製欠陥でβ−ガラクトシダーゼおよびネオマイ シン耐性遺伝子（３）の両方を含んだものである。Ｇ−４１８の存在下での成長 能力の点から、このベクターを含んだ細胞種が選ばれた。組織化学的染色により 、選ばれた細胞群の９０％以上がβ−ガラクトシダーゼを合成した。また、これ らの遺伝子的に変性された細胞群の内皮特性も蛍光ＡＣＬＤＬ取り込みの分析で 確認された。ＢＡＧレトロウィルスによる感染も、さらにサザン・プロット分析 により立証されたが、それによれば完全なプロウィルスＤＮＡがほぼ１ゲノムあ たり１コピー存在することが明かとなった。

この通交の同系種からとられた内皮細胞群は、２匹以上のミニビッグの研究に供 することができ、９項目の異なった実験課題で試験を行った。通常の麻酔処理の もとで、大腿および回腸動脈を露出し、カテーテルを器官に導入した（図１）。

動脈壁の内膜組織本、少し膨らませたバルーンカテーテルを強制的に器官内に通 し、機械的に裸化した。動脈をヘパリン化した生理食塩水で洗浄し、中性プロテ アーゼおよびディスパー七（５０１Ｊ／ｍｌ＞とともに培養した。これにより、 残っていた管腔内皮細胞も除去された。残った酵素は、カテーテルバルーンをし ぼませ器官の区画中を血液が流れるようにした後、血漿中でα２グロブリンによ り急速に不活化した。β−ガラクトシダーゼを発現した培養内皮細胞群を、２バ ルーンで中央に１個の点滴注入口を持った特別にデザインされた（図１）動脈カ テーテル（ＬＪＳＣＩ、Ｂｉｌ　１ｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州）を使用し て導入した。

これらのバルーンが膨らまされた時、動脈の中に保護されたスペースができ、そ の中に点滴注入０旦を通して細胞が注入される（図１）。β−ガラクトシダーゼ を発現するこれらの内皮細胞群は、裸化された器官への付着を容易にするため３ ０分間培養される。そのあとカテーテルが取り除かれ、動脈支流が結さっされ、 切開部が閉じられた。

β−カラクトシダーヤー発現内皮を接種された動脈部分を、２−４遍間後取り除 いた。Ｘ、　−ｇ　ａ　１クロマグンを用いた染色の後の動脈標本の全体検査で 、複数の青色着色区域が見られ、感染していない内皮を植え付けた動脈との比較 において、β−ガラクトシダーゼ活性を示している。光学ｇ微鏡では主として実 験的に埴え付けた器官の内膜の内皮細胞にβ−ガラクトシダーゼ着色が記録され ている。

対照的に、β−ガラクトシダーゼを含まない内皮細胞を受け取ったコントロール 区画では同様の着色はなんら認められなかった。β−ガラクトシダーゼ着色は、 しばしば深部の内膜組織に認められ、これは植え付けた内皮が以前に損傷した器 官壁に捕らえられるか、または移入することを示唆している。局所的な血栓症が 最初の２つの実験課題で観察された。この複雑化は、その後の研究で内皮細胞移 植手順に先たってアセチルサリチル酸を投与し、また接種の時にヘパリン抗凝血 剤を使用することによって抑えることができた。血栓が形成されるケースでは、 β−ガラクト・シダーゼ着色が器官壁から血栓の表面に至る範囲の内皮細胞に見 られた。

主体での遺伝子移植に関する第１の関心は、遺伝子的に生成された細胞からの、 ｔｌＦ％能力のあるレトロウィルスの生産である。これらのテストにおいては、 複製欠陥のレトロウィルスを使用することで、この問題を最小にすることができ た。

これらの細胞系統では、試験管中で２０回継代させた後でもヘルパーウィルスは まったく検出されなかった。感染の確度が高いことと宿主細胞ゲノムに対する同 化が安定しているという理由で欠陥ウィルスを使用したが、遺伝子移植における このアプローチはその他のウィルスベクターでも利用可能である。

２番目の関心は、生体中におけるリコンとナンド遺伝子の発現継合に関するもの である。現在の研究では、器官の中での内皮細胞のβ−ガラクトシダーゼ発現は 血管への導入後６週間までは安定している。

これらのテス）・は、遺伝子的に変換された内皮細胞は、動脈カテーテル法によ ってユカタン・ミニビッグの血管型に導入可能であることを示している。したが って水洗は、遺伝子的に変換された内皮をベクターとして用い、血管系の疾患の 局所的な生化学的治療に使用可能である。

バルーンによる血管形成とか病気の器官への移植組織の挿入といった血管系疾患 における現在の介入的な方法がもたらす大きな合併症は、アテローム硬化プラー クの破壊ならびに局所的な組織の外傷部位での血栓形成（５）である。部分的に は、内皮細胞損傷がこの合併の媒介となっている（６）。本データは、介入が存 在するときに局所的な血栓症を抑えるために、遺伝子的に変換された内皮細胞の 使用が可能であることを示している。

この手法は、不安定な狭心症や心筋梗塞を含めて、その他の虚血性疾患治療にも 使用可能である。たとえば、組織プラスミノーゲンアクチベーターやウロキナー ゼの遺伝子を発現する細胞を導入することで抗血栓効果を得ることができる。

この手法はまた、慢性的な組織虚血症の治療にも有用である。たとえば、重症の 虚血組織、たとえば心筋、に側副枝血管の生成を刺激するための脈管形成または 成長因子（７）を形成させるのがそれである。最後に、全身的な先天性疾患のた めの体細胞の遺伝子取り替えも、この内皮細胞遺伝子移植手法を応用すれば可能 である。

本発明のもう一つの方向は、リコンビナント遺伝子を使って、生体内で動物の＠ 胞の形質転換をおこなうことにより、動物の免疫システムを調節する方法に関す る。この形質転換は、非部位特異的または全身的に行うか、あるいは部位特異的 のいずれかで行われる。もし形質転換が全身的に行われるかまたはその免疫シス テムの特異性を与える部位以外の所、たとえば、胸腺、で行われる場合には、リ コンビナント遺伝子がコードする分子に動物が感作されるように、その免疫シス テ１、を調節する。あるいは、もし形質転換が部位特異的に行われ、かつその免 疫システムの特異性を決定する部位で局部的、たとえば、胸腺、に行われる場合 には、リコンビナン］・遺伝子がコードする分子を動物が許容するように、その 免疫システムを調節する。

”−作されるパという用語は、その免疫システムが、生体内形質転換後の方が形 質転換前にくらべて、ＤＮＡでコードされたその分子に対、して強い反応を示す ことを意味する。

”許容する”という用語は、その免疫システムが、形質転換後の方が形質転換前 にくらべて、リコンビナント遺伝子にコードされた分子に対して弱い反応を示す ことを意味する。このようにして、免疫システムを調節して、ＤＮＡにコードさ れた分子に対して、抵抗か許容のいずれかを与えるようにすることができる。

抵抗を与えるのが望ましい分子の例としては次のものがあげられる：細胞表面分 子、たとえば、腫瘍抗原（がん胎児性抗原）、原生動物抗原にューモシスティス ）、ウィルス性抗原（ＨＩＶｇｐ１２０およびｇｐ１６０、Ｈ，インフルエンザ 抗原、およびＨＢｓ抗原）、ライム病抗原、細菌性抗原、および移植抗原（クラ ス■またはＩＩ）、ｒａｓまたはその他の発ガン性遺伝子でｅｒｂ−Ａまたは、 ｎｅｕを含む；細胞質タンパク質、たとえばｒａｆ癌遺伝子、ｓｒｃ癌遺伝子、 およびａｂｌ癌遺伝子；核タンパク賀、たとえばＥＩＡ癌遺伝子、変異９５３癌 遺伝子、ｔａｔ、ｔａｘ、ｒｅｖ、ｖｐｕ、ｖｐｘ、肝炎コア抗原、ＥＢＮＡお よびウィルス遺伝子；および分泌タンパク質、たとえばエンドトキシン、コレラ トキシン、ＴＮＦ、および破骨細胞活性化因子。

抵抗（許容）を与えるのが望ましい分子の例としてはっぎのものがあげられる： 細胞表面分子、たとえば、成長因子レセプター、インスリンレセプター、甲状腺 ホルモン、移摘抗原（クラス■またはＩＩ）、血液型抗原、およびＬＤＬレセプ ター；細胞質タンパク質、たとえばチトクロームＰ４５０、ガラクトシルトラン スフェラーゼ、シストロフィン、ネオマイシン耐性遺伝子、および細菌性熱シヨ ツクタンパク質；核タンパク質、たとえば網膜芽細胞腫およびトランスドミナン トｒｅｖ；および分泌タンパク質、たとえば小人用成長ホルモン、糖尿病用イン スリン、アデノシン脱アミノ酵素。

リコンビナント遺伝子の中の核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体の起源はと のようなものでもよい。すなわち、核酸は天然のソースから分離されたものでも 、合成したものでもよい。

リコンビナント遺伝子は動物の細胞の中に従来からあるベクターを使って導入さ れる。それらのベクターとしては、ウィルス性ベクター、ＤＮＡまたはＲＮＡに 複合化されたカチオン性の脂質（ＤＮＡまたはＲＮＡ／リポソーム）およびＤＥ ＡＥ、デキストラン、およびポリプレンなどのＤＮＡまたはＲＮＡとポリカチオ ンの複合体がある。

上述のようにリコンビナント遺伝子は、リコンビナント遺伝子にコードされた分 子に抵抗を与えるために、細胞の中に部位特異的に導入される。適当な部位とし ては、たとえば、血管系またはいずれの特定組織または器官の内皮細胞または細 網内皮細胞がある。形質転換に使用するベクターおよびリコンとナンドを含んだ 製剤の形態は形質転換を行う組織によって異なったものとなる。内皮細胞を転換 する場合の適当な製剤についてはこの明細書の他の箇所で述べている。さらに、 経口またはその他の投与方法（たとえば、内視鏡法）に適する製剤は粘膜抵抗を 与えるために使用できるであろう。そのような製剤には、ベクターおよび遺伝子 以外に、洗浄剤、ゼラチン、カプセルまたはその他の供給用ビヒクルなどを、劣 化防止および粘膜表面への供給を容易にするために含ませることができる。

あるいは、リコンビナント遺伝子は部位特異的に、免疫システムの特異性を決定 する部位に導入される。胸腺はそのような部位である（Ａ、Ｍ。

Ｐｏ５ｓｅｌｔ、他、５ｃｉｅｎｃｅ、ｖｏｌ、２４９．ｐ、１２９２（１９９ ０）参照）。このように、リコンビナント遺伝子を部位特異的に胸腺に導入して やると、その免疫システムは遺伝子にコードされた分子を許容するように調節さ れる。このようにして、移植の拒絶は抑制される。部位特異的に腫瘍を転換する ために使用した上記と同じ製剤と手法を、胸腺にリコンビナント遺伝子を導入す るのにも使用できる。特に、転換のための製剤は胸腺または腫瘍部あるいは胸腺 や腫瘍部の血液供給系に直接注入することができる。

水洗は、とのような動物、たとえば鶏；または牛、馬、猫、犬、猿、キツネザル あるいは人間などのは乳動物にも適用することができる。

リコンビナント遺伝子をリポソームを使って導入する場合、最初にインビトロで ＤＮＡに対する最適値を決定するのが望ましい：特定の形質転換すべき細胞につ いての細胞死亡および転換効率の係数としての脂質、そしてこれらの数値をイン ビボでの転換に使用するための、脂質比およびＤＮＡの絶対濃度。これらの数値 のインビトロでの決定は、本明細書の実験の部で述べる手法を使用すれば簡単に できる。

本発明のもう一つの方向は、動物の細胞にリコンビナント遺伝子を生体内で全身 に導入するためのキットに関する。そのようなキットには、脂質などのキャリヤ の最適数量、および核酸、および／または内視鏡またはシリンジなどの供給の手 段、が含まれるであろう。このキットにはまた、形質転換用製剤の投与のための 説明も含まれるであろう。キャリヤおよび核酸は凍結乾燥され、別々にパッケー ジされるかあるいはプレミックスすることもできる。このキットにはさらに、キ ャリヤおよび核酸の複合体を最適に再構成するための溶液が含まれ、これらを生 体の細胞に効率的に供給するための手段となる。そのような溶液には、緩衝液、 ｍｌ、塩類、タンパク質類、および洗浄剤なと１つまたはそれ以上の成分を含ま せることができる。

発明を一般的に説明してきたが、本明細書中に提供しているいくつかの実施例を 参照することによってさらに理解を深めることができると思われる。たたし、こ れらは説明のためのものであって、特に断らないかぎり本発明を限定するもので はない。

実験の部： Ａ、正常なブタ内皮細胞およびβ−ガラクトシダーゼが導入されたブタ内皮細胞 中でのＡＣＬＤＬし七ブター発現の分析。

ユカタン・ミニビッグから採取した内皮細胞系で、ＢＡＧレトロウィルスまたは ３７３線帷芽細胞コントロールで感染させた２つのサブ系について、蛍光標識し たＡｃＬＤＬを用いてＡｃＬＤＬレセプターの発現を調べた。

中性のプロテアーゼ　デイスパーザ（８）を用いて、外部頚静脈から内皮細胞を 採取した。切除した静脈部分をデイスパーザ（５０Ｕ／ｍｌ、Ｈａｎｋｓのバラ ンス塩泊涜中）で満たし、３０℃で２０分間インキュベートした。この方法で得 た内皮を、胎児子ウシ血清（１０％）、５０μｇ／ｍｌの内皮細胞成長補助液（ ＥＣＧＳ）、およびヘパリン（ｌｏ０μｇ／ｍｌ）を添加した培養液１９９（Ｇ ＩＢＣＯ，Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌａｎｄ、＝ニーヨーク州）の中で保管した。

これらの細胞はＢＡＧレトロウィルスに感染させ、Ｇ−４１８耐性のあるものを 選んだ。この細胞種を、（１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’　、３’− テトラメチルインドカルバシアニン・バークロレート）（Ｄｉｌ）ＡｃＬＤＬ（ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ＋スタウトン、マサチューセ ッツ州）（１０μｇ／ｍｌ）とともに４−６時間、３７℃で培養し、０．５％グ ルタルアルデヒドを含んだ燐酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。位相差および蛍 光顕！１ｍ錆で細胞を視見化した。

Ｂ、カテーテルによる内皮細胞の導入法。

内皮細胞の点滴注入にはダブルバルーンカテーテルを使用した。このカテーテル は近位および遠位のバルーンを有し、それでれ長さ６ｍｍ、幅５ｍｍ、ｍｍ−ン の間の距離は２０ｍｍである。カテーテルの中央部には点滴注入口につながる２ ｍｍの孔がある。近位および遠位のバルーンによって中央にスペースができ、器 官（血管）の特定の区画に注入口を通して感染させた細胞の点滴注入ができるよ うになっている。カテーテルによる細胞導入の図解は、図１および図２を参照さ れたい。

動物の管理は、”　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ｏｆ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉ ｍａｌ　Ｃａｒｅ”および”Ｇｕｉｄｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｃａｒｅ　ａｎｄＵ ｓｅ　ｏｆ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ａｎｉｍａｌｓ”　（ＮＩＨＰｕｂｌｉｃ ａｔｉｏｎ　Ｎｏ、８０−２３．１９７８年改訂）に準拠した。雌のユカタン・ ミニビッグ（８０−１００ｋｇ）をベンドパルビタール（２０ｍｇ／ｋｇ）で麻 酔処理し、挿管し、機械的換気を行った。これらの個体の回腸および大腿動脈を 無菌手術で露出させた。遠位の大腿動脈を穿刺し、がイドワイヤを使ってダブル バルーンカテーテルを回腸動脈に入れた。外部回腸動脈を確認し；近位のバルー ンを少し膨らませ、内皮を機械的に裸化させるために遠位および近位を通過させ た。ついで、カテーテルの中央スペースが裸化された内皮の位置にくるように調 整して置き、両方のバルーンを膨らませた。裸化された区画をヘパリ〉化した生 理食塩水で洗浄し、残留付着している細胞をデイスバーゼ（２００／ｍ　］、　 ）を１．０分間点滴注入し除去した。裸化された器官（血管）はさらにヘパリン Ｗ４液で洗浄し、ＢＡＧ感染内皮細胞を３０分間点滴注入した。その後、バルー ンカテーテルを取り外し、血流を順行状態に戻した。当該器官部分を２−４週間 後に切除した。その動脈の１部を０．５％グルタルアルデヒド溶液に５分間入れ 、慎ｅ緩衝生理食塩水に入れて保存し、他の部分を切断細分のためにパラフィン ブロックで覆った。β−ガラクトシダーゼ発現のレトロウィルスの存在が標準組 織化学手法により確認された（１９）。

Ｃ，インビトロおよびインビボの内皮細胞の分析。

β−カラクトシダーゼ活性は組織化学着色法により下記のものについて記録され た。（Ａ）ユカタン・ミニビッグから取り出された一次内皮細胞、　（Ｂ）ＢＡ Ｇレトロウィルスベクターに感染させたサブ系、（Ｃ）正常な動脈のコントロー ル区画、　（Ｄ）ＢＡＧレトロウィルスベクターに感染させた内皮を点滴注入し た動脈の区画、　（Ｅ）正常コントロール動脈のＷ微鏡区画、および（Ｆ）ＢＡ Ｇレトロウィルスベクターに感染させた内皮を点滴注入した動脈の顕微端区画。

組織培養の中の内皮細胞は、組織化学的着色の前に０．５％グルタルアルデヒド の中で固定された。インビトロおよびインビボにおける感染された内皮細胞を確 認するために、Ｅ、ｇｏ−１−ｉ−β−力ラうトシダーゼタンパク質の酵素活性 を利用した。β−カラクトシダーゼ形質導入Ｍｏ−ＭｕＬＶベクター（２）、（ ＢＡＧ）は、Ｄｒ、Ｃｏｎ５ｔ、ａｎｃｅ　Ｃｅｐｋｏの好意により提供された 。

このベクターはワイルドタイプのＭｏ−ＭｕＬＶ　ＬＴＲをβ−ガラクトシダー ゼ遺伝子のプロモーターとして使用している。Ｔｎ５ネオマイシン耐性遺伝子に リンクしたサルウィルス４０　（ＳＶ−４，０）早期プロモーターが薬剤Ｇ−４ １８に対する抵抗性を与えるが、これをβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の下流に挿 入し、レトロウィルスを含んたβ−ガラクトシダーゼ発現細胞を選択するための マーカーとさせる。この欠陥レトロウィルスはフィブロブラストψａｍ細胞（３ ，１０）から準備し、ダルベツコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）および１０％ 子ウシ血清の中で保存する。細胞はトリプシン化の後、−週間に２回議代させた 。細胞に、上澄み液（力価］、、Ｏ’−１，０’／ｍ１．Ｇ−４１８耐性８＝＋ ｏ＝−）を２７３交合で加、ｔ、１．０％子ウつ血ｒ１１１ＪＤえたＤＭＥＭ中 で１２時間、３７℃、５％ｃｏ７．８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、培養 した。ウィルス性の上澄み液を取り除き、細胞をＩＯ％胎児子ウシ血清、ＥＣＧ ５　（５０μｇ／ｍｌ）、を加えた培養液１９９、さらにＧ−４１，８（５０％ ラセミ混合体０．７μｇ／ｍｌ）の中での選別に先立って、２４から４８時間内 皮細胞調整培養液（２０％）で、保存した。

Ｇ−４１，８耐性細胞を単離し、標準の組織化学的着色（９）を用いて、β−ガ ラクトシダーゼ発現の分析を行った。β−カラクトシダーゼ酵素を安定的に発現 している細胞を連続培養しその後の必要に備えた。冷凍アリコートは液体窒素中 で保存した。

Ｄ、生体内遺伝子移入による悪性疾患の免疫療法。

レトロウィルス性ベクター、すなわちＨ−２Ｋ”を用意した。ＣＴ２６細胞がイ ンビトロで感染され、０４１８耐性のものが選ばれ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡ Ｃ３）により分析された。形質導入されたＣＴ２６細胞は、感染されていないＣ Ｔ２６細胞ならびに他のレトロウィルスベクターで感染されたものより、高い平 均蛍光強度を示した。Ｈ−２Ｋ　”を発現する１０’ＣＴ２６細胞をこの抗原に 感作されたＢＡＩ、Ｂ／Ｃマウス（Ｈ−２’）に皮下注射で与えた時、無調整の ＣＴ２６　（Ｈ−２″）Ｍｌｌ糸系統は常にこの投与量で腫瘍が発生するのとは 対照的に、８週間腫瘍の発生は見られなかった。Ｈ−２Ｋ”に対する免疫反応は 従って、この抗原をもったＣＴ２６細胞に保護を与えた。しかしＣＴ２６Ｈ−２ に’とＣＴ２６を同時接種したときは、腫瘍の成長がみられ、これはＨ，−２に ’が、変性した細胞にだけ感受性を与えることを示唆している。

Ｔ（−２に’を成長中のＣＴ２６！ｌ瘍に導入したときに防御効果があるかどう か調べるために、す７ンビナントＨ−２に＠リポーターまたはβ−カラクシトダ ーゼ遺伝子を、ＤＮＡ／リポソームまたはレトロウィルスベクターのいずれかと ともに、腫瘍に導入した。腫瘍カプセル（直径０．５−１ｃｍ）を外科的に露出 し、多針注射（２−１０）を実質組織に与えた。β−ガラクシトダーセリポータ ーブラスミドとともに、リコンビナント遺伝子発現は、ＤＮＡ／リポソームまた はレトロウィルスベクターを腫瘍内に注射した後、容易に検出された。

Ｈ−２に、”ＤＮＡ／リポソーム複合体またはＨ−２に＠レトロウィルスベクタ ーのｌｌｌ瘍内注射を受けたマウスでは、ＰＣＨによって腫瘍の中あるいは時と してその他の組織の中にリコンビナントＤＮＡがＰＣＲによって検出された。そ の他の器官に検出された時は、病理学的には炎症または器官毒性の徴候はなんら 認められなかった。しかしながら、これらの動物においては、リコンビナントＨ −２に、”タンパク質に対する免疫反応は明白であった。Ｈ−２に″′由来のβ −カラクシトダーゼ形質導入ＩＩ瘍由来ではないリンパ球はレトロウィルスベク ターによってもたらされたかあるいはリポソームによってもたらされたかを問わ ずに、Ｈ−２に’に対する細胞溶解反応を示し、た。さらに重要なことは、その Ｈ−２に’由来のβ−カラクシトダーゼ形質導入動物由来ではないリンパ球は無 変性のＣＴ２６細胞を認識し溶解したことであり、これはこの刺激が遺伝子的に 変性されていない腫瘍細胞に月する免疫反応を誘発したことを示している。

Ｈ−２ＫＴ′に対する免疫反応の防御効果を評価するために、生体中の腫瘍の成 長を定量した。事前にＨ−２Ｋ　’の感作を受けていない動物では、）（−２に ’で形質導入された４つの腫瘍のうち１つで腫瘍成長の減衰が完全ではないが見 られた。

対照的に、無変性（ｎ＝４）またはβ−ガラクシトダーゼ形質導入のコントロー ル（ｎ＝４）では抗腫瘍効果は見られなかった。これらの腫瘍は最初の注射の時 点ですでに大きなものであり、その後最初の免疫反応が出てくるまでにも成長し 続けていたため、マウスをＣＴ２６Ｈ−２Ｋ”腫瘍細胞によって事前に免疫処理 したり、ベクターの早期および／または頻繁な注射などによって抗腫瘍反応が適 正になるように工夫した。１２および３２日目に、Ｈ−２に′！またはβ−カラ クシトダーゼＤＮＡ／リポソームベクターの腫瘍的注射によって、腫瘍は形質導 入された。

Ｈ−２に″リポソーム複合体による処理によって、生存率が改善され、腫瘍の成 長が減衰した。対照的に、β−カラクシトダーゼ形質導入腫瘍では注射をしてい ないコントロールとの間に成長率の差は見られなかった。完全な腫瘍の退縮は２ 匹のマウスにおいて、注射の回数を増やすことと早い段階でＨ−２に’を腫瘍に 与えることにより達成された。コントロール区の動物では腫瘍が成長し続け、３ ５日以降の生存はなかったことから、この処理は防御効果があった。

Ｅ、免疫システムの調節。

カチオン性の脂質およびプラスミドの注射に対する反応は、ＢＡＬＢ／Ｃマウス （６−１２週令）への静脈内注射により確認された。最初の実験では、Ｈ−２に ′分子をコードした遺伝子を尾静脈注射により導入した。２から４週間後、肺臓 細胞を取り出し、溶解性Ｔ細胞反応を弱める能力を分析した。これらの細胞を“ ’Ｃｒ目的細胞（ｌＩ−２に’を発現しているＣＴ２６細胞）を使用してテスト した結果、顕著な細胞溶解性が餞察された。これは、コントロールベクターであ るβ−カラクシトダーセを注射した動物では見られなかったものである（図３参 照）。

目的細胞の２５％までが溶解しており、効果細胞；目的細胞比は２５：１であっ た。

この特別の溶解性Ｔ１ｍ胞反応に加えて、発現ベクタープラスミドにコードされ た遺伝子の血清学的または抗体反応も調査した。）ｉＩＶのｇ、６１６０分子を コードしたプラスミドを注射したとき、処理をしたマウスでは抗体反応が出た。

β−〃ラクシトダーゼを含んだカチオン性脂質を注射したコントクールのマウス の場合と対照的に、ｇｐ１６０プラスミドを含んだカチオン性の脂質を注射した マウスでは、この分子のｇｐｔｓｏおよびｇｐ１２０の形に対して抗体反応が見 られることが、ウェスタン・プロット分析で示された（図４参照）、これらの結 果は、カチオン性脂質／ＤＮＡの全身的投与が、外部の病原菌に対して細胞媒介 または抗体媒介の免疫性をうまく誘発させるのに使用できることを示して４．Ｓ る。

Ｆ、最適形質移入条件の決定。

（１）プラスミドの構築 ラウスサルツマ肉腫ウィルスＬＴ３　（Ｒ３Ｖ−β−ｇａｌ）（Ｎ□ｏｒｔｏｎ ａｎｄ　Ｃｏｆｆ１ｎ、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　、５　（２）、２８１ −１９０．１９８５）のコントロールのもとで、足よ−（仄よ↓　１ａｃＺを含 んだプラスミドを、ブタの一次内皮およびヒーラ−（ＨｅＬａ）細胞への形質移 入に使用した。さらに、プレプロエンドセリン−１５′−フランキングＤＮＡ（ −１４１０から＋８３）（Ｗｉｌｓｏｎ他、Ｍｏ１．Ｃｅ１１．’Ｂｉｏ１．、 ｔｏ（９）、４８５４−４８６２．１９９０）のコントロールのもとで、１ａｃ Ｚ遺伝子を含んだプラスミドを、内皮細胞への形質移入に使用した。生体での毒 性分析に、Ｒ８Ｖ−β−ｇａｌプラスミド、およびＨ−２に＠マウスＭＨＣクラ ス■遺伝子をコードするｃＤＮＡを含んたＰＬＪベクターから取り出されたプラ スミドを使用した。

（２）細胞培養、形質移入分析、およびインビトロ毒性ユカタン・ミニビッグか ら取り出された一次内皮細胞（ＹＰＥ細胞）を、ｌＯ％ＦＢＳ、２ｍＭ　ｌ−グ ルタミン、５００７ｍ１ペニシリン、および５１ｔｆｌ／ｍｌストレプトマイシ ンを添加した１９９培養液（Ｍ２Ｏ３）で培養した。ヒーラ−細胞は、５％ＦＢ Ｓ、２ｍＭ　ｌ−グルタミン、５０Ｕ／ｍ１ペニシリン、および５μｇ７ｍｌス トレプトマイシンを添加したダルベツコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）の中で保 存した。ＤＮＡリポソーム混合体は、ポリスチレンチューブの中で、０．２ｍｌ の血清を含まない溶媒またはリンゲルの乳酸培液に２．５から２５μＭＩＩｌ質 濃度のＤＯＰＥ／ＤＣ−ｃｈｏｌを加えて準備した。ゆるやかに攪はんしたあと 、その溶液を１５−２０分間室温で放置した。形質移入のために、細胞を６０ｍ ｍ組織培養皿で７５％交会またはそれ以上で成長させた。細胞は、血清を含まな い溶媒またはリンゲルの乳酸溶液で２回洗浄し％　Ｏ−１５ｍ１の同じ溶液中に 入れた。ＤＮＡリポソーム溶液（０，２ｍ１）を、ゆるやかに攪はんしながら、 ゆっくり細胞に加え、最終的に０．７ｍｌの容量にした。これによって、ＤＮＡ 濃度は０．７から７μｇ／ｍｌ　（１３−１３０ｎＭ）の間となり、脂質濃度は ７−７０μＭとなった。１−５時間形質移入を進行させ、そのあと細胞を上記の 添加溶媒中に入れた。２４−４８時間の形質移入の後、形質移入細胞を確認する ために、Ｅ、ｃｏｌｉβ−カラクシトダーゼタンパク質の酵素活性を利用して、 Ｘ−ｇａｌクロマゲン染色を行った。インビトロ毒性は、細胞変性効果またはト リバンプルー排除法で評価した。

（３）動物の検討 静脈注射用として、インビトロの形質移入を検討するために、前記のようにＤＮ Ａリポソームを０．２ｍｌの血清を含まないＭ２Ｏ３または乳酸化リンゲル溶液 に入れたものを用意した。１５−２０分の培養の後、この混合物を０．７ｍｌに 希釈し、この希釈液０．１−０．２ｍｌを直ちに雌、成人のＢＡＬＢ／（！マウ スの尾静脈に注射した。血液は注射前および注射後９−１１日に採取され、血清 化学分析が行われた。注射１ｇ！！２−３週間で腎臓、肝臓、肺、心臓、および 脳が取り出され、前記のように組織分析およびＰＣＲＤＮＡ増幅分析に供された 。ＣＴ２６細胞の主要細胞内注射（Ｆｅａｒｏｎ他、Ｃｅ１ｌ、６０．３９７− ４０３）およびその分析も前記のプロトコールにしたがって実施された。

（４）結果 ＤＮＡ／リポソームの形質移入のための最適条件および毒性を、まず最初にイン ビトロで確認した。インビトロにおいて毒性を示さない最大の形質移入を得るた めに、カチオン性脂質に対するＤＮＡの比、ＤＮＡまたは脂質の絶対濃度、ＤＮ Ａおよびカチオン性脂質の混合条件について検討した。カチオン性脂質の請合液 は２つの化合物の処方晶で、ジオレイル・フオスファチジル・エタノールアミン （１）ＯＰＥ）およびコレステシー３−β−オール　３−ウレサニルーＮｌ。

Ｎ′−ジメチルエチレンジアミン（ＤＣ−ｃｈｏｌ）を含んだものである。この 薬剤のインビトロの形質移入効率は、いくつかの細胞系列において、リポフエク チン（商！’！り（ＢＲＬ）と同等かそれ以上であった。内皮細胞（これは形質 移入が難しい典型的なもの）、およびヒーラ−細胞（これは種々の手法で簡単に 形質移入が可能である）、の形質移入を、インビトロで確認した。

内皮細胞の形質移入の最適条件を決定するため、最初にＤＮＡ濃度は一定にし、 脂質の濃度を変えたものを使用した。最高の形質移入効率は０．７ｎｇ／ｍｌの ＤＮＡおよび２１μＭのＤＯＰＥ／ＤＣＯｃｈｏｌ脂質を使用したときに見られ 、脂質濃度が高くなったり、または低くなると形質移入された細胞の数が急激に 減少した。次に、脂質濃度を一定に保ち、ＤＮＡ濃度を変えた。この分析におｐ ｚてＤＮＡ濃度に対する同様の傾向、すなわちＤＮＡ濃度の増加、０．４μｇ７ ｍｌという低濃度でも、に対応して形質移入される細胞の数が著しく減少するこ とが明かとなった。これらの結果は、ＤＮＡの脂質に対する比が形質移入の最高 効率に重要であることを示しており、またそれやれの成分の絶対濃度もまた形質 移入の効率決定に重要であることを示している。ＤＮＡおよび脂質の最適濃度、 すなわちＤＮＡ０．７μｇ／ｍｌ　（１３ｎＭ）、ＤＯＰＥ／ＤＣ−ｃｈｏ１２ ｉμＭ、を越えた増加は、生育可能な細胞の数を減らし、かつ生き残った細胞の 形質移入効率をＬげるものではなかった。３５ｔｔＭ以上の脂質濃度は、形質移 入されて６ｓないコントロールと比較して生育可能な細胞数を５０％減少させ、 一方、最適濃度のＤＮＡ０．７μｇ／ｍｌおよび脂質２１μＭにおいては、培養 ５時間以上では生育可能細胞数に対する影響はなかった。

異なった細胞のタイプの形質移入における最適濃度を比較するために、ヒーラ− 細胞でも形質移入を実施した。この場合、ＤＮＡと脂質の最適比は多少異なるこ とが観察された。形質移入効率のピークは、脂質濃度は内皮細胞の場合と同じ（ ２１μｇ／ｍｌ）であったが、ＤＮＡ濃度では異なり少し低いところであった。

ＤＮＡ濃度１．４−４．２μｇ／ｍｌでは同様に効果的であった。再び、ＤＮＡ と脂質の比は変えないで、それでれの濃度を１／３に減らしたところ、ごく僅か の細胞だけが形質移入され、形質移入細胞数を最高にするためにはＤＮＡと脂質 の比ならびにそれぞれの成分の絶対濃度の両方が重要であることが示された。も し、ヒーラ−細胞が〉８０％またはそれ以上の交合で形質移入される場合、３５ μＭ迄の脂質を使用しても毒性はなかった。細胞が低い飽和濃度で形質移入され たときは、脂質７μＭの低濃度でも形質移入されていないコントロールと比較し て、細胞の生育可能性は著しく減少した。これらの結果は、形質移入の最適条件 および毒性は細胞の系統によって多少異なることを示している。

リポソームの準備におけるもう１つの変数は、カチオン性脂質とＤＮＡの複合体 を作るために用いられる溶液の組成である。分析したいくつかの溶媒溶液、Ｍ　 １９９、ＭｃＣｏｙｓ、ＯｐｔｉＭＥＭ、またはＲＰＭＩ媒体においては、形質 移入効率ならびに毒性の点において実質的な差異はなかった。しかし、標準の乳 酸化リンゲルを使用した場合、形質移入効率が著しく向上した。形質移入された 細胞の数は、血清を含まない媒体に比べて、３倍以上増加した。たたし、長時間 の培ｌ！（≧２時１１５）では、いくつかの細胞系統において細胞生育性の低下 が見引−用」■デ惣 １．　Ｊ、Ｓ；Ｒｅｉｔｍａｎ、Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ、Ｄ、Ｌ、Ｆｒｙ。

△−ｔ−小−ｑ」Σｃｌｑ−ｃｌｅ−ｒｏｓｉｓ　４３．　１１９　（１９８２ ）。

２、　Ｒ，Ｅ、Ｐｉｔｏｓ、Ｔ、Ｌ、Ｉｎｎｅｒａｒｉｔｙ、Ｊ、Ｎ。

Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ、Ｒ，Ｗ、Ｍａｈｌｅｙ。

八ｒｔｅｒ４ｏｓｃ↓ｅｒｏ６↓ｓ　１，１１７　（１９８１）；Ｔ、Ｊ、Ｃ， Ｖａｎ　Ｂｅｒｋｅｌ、Ｊ、Ｆ、Ｋｒｕｉ、ｊｔＦＥ旦８　Ｌｑ↓ｔ−１３２， ６１（１９８１）　；Ｊ、Ｃ，Ｖｏｙｔａ。

Ｐ、Ａ　Ｎｅｔｌ、ａｎｄ、Ｄ、Ｐ、Ｖｉａ、Ｅ、Ｐ、Ｚｅｔｔｅｒ。

Ｊ　、Ｃ−ｇ−ｊ、−−１−５一旦ｉｑ１．，９９．８１Ａ　（要約）（１９８ ４）　；Ｊ、Ｍ、Ｗｉｌｓｏｎ、Ｄ、Ｅ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ。

Ｄ、Ｍ、ＪｅｆｆｅｒＳｏｎ、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ。

Ｐ−ｒ−ｏ−ｃ−、Ｎ　ａ　％−し−Ａｃ１」ｂ−，５ｃ　ｉ、−１菜」Ｌ−− Ａ、、８４゜４４２１　（１９８８）。

３、　Ｊ、Ｐｒ１ｃｅ、Ｄ、Ｔｕｒｎｅｒ、Ｃ，Ｃｅｐｋｏ、Ｐｒｏｃ。

Ｎ−６ｔ、−１−、Ａｃａｄ、−８ｃ−ｉ、１．−ＳＬ」、、８４，１５６　（ １９８７）。

４、　Ｒ，Ｍａｎｎ、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｄ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ。

Ｃｅ１ｌ、３３．　１５３　（１９Ｂ３）　；Ｃ，Ｌ、Ｃｅｐｋｏ、Ｂ、Ｅ。

Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌ、ｉｇａｎ、Ｃｅ１ｌ　３７゜＋０５３　（ ］、、９８４）　； Ｍ、Ａ、Ｅｇｌｉｔｉｓ、Ｗ、Ｆ、Ａｎｄｅｒｓｏｎ。

司↓−ｏｔｅｃｈｎｉ−え見ｅｓ　６，６０８　（１９８８）。

５、　Ｓ、Ｇ、Ｅｌｌｆ、ｓ、Ｇ、Ｓ、Ｒｏｕｂｉｎ、Ｓ、Ｂ、Ｋｉｎｇ。

Ｊ、Ｓ、Ｄｏｕｇｌａｓ、Ｗ、Ｓ、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ　ｅｔ　ａｌ−、。

ｃｉ、ｒｃｕニーＢｔｉｏｎ　７７．３７２　（１９８８）　；Ｌ、Ｓｃｈｗａ ｒｔｚ、Ｍ、Ｇ、Ｂｏｕｒａｓｓａ。

Ｊ、Ｌｅｓｐｅｒａｎｃｅ、Ｈ，Ｅ、Ａｌｄｒｉｇｅ。

Ｆ、Ｋａｚｉｍ、ｅｔ、ａｌｌ、Ｎ、Ｅｎ　１．Ｊ、Ｍｅｄ、３１８゜１７１４ 　（１９８８）。

６、　Ｐ、Ｃ，Ｂｌｏｃｋ、Ｒ，に、Ｍｙｌｅｒ、Ｓ、５ｔｅｒｔｚｅｒ。

Ｊ、Ｔ、Ｆａｌｌｏｎ、Ｉｊ一旦ｎ１１．Ｊ、Ｍｅｄ、３０５，３８２（１９８ １）；Ｐ、Ｍ、５ｔｅｅｌｓ、Ｊ、Ｈ，Ｃｈｅｓｅｂｒｏ。

Ａ、Ｗ、５ｔａｎｓｏｎ、Ｃ１ｒｃ、Ｒ３ｓ、−５７，１０５（１９８５）；＋ Ｊ、Ｒ，Ｗｉｌ　ｅｎｔｚ、Ｔ、Ａ、５ａｎｂｏｒｎ、Ｃ，Ｃ。

Ｈａｎｄｅｎｓｃｈｊ−１ｄ、Ｃ，Ｒ，Ｖａｌ　ｅｒｉ、Ｔ、Ｊ、Ｒｙａｎ。

Ｄ、Ｐ、Ｆａｘｏｎ、、ｑｉ工ｇｕｌａｔｉ空旦　７５，６３６（＋９８７）； Ｗ、ＭｃＢｒｉｄｅ、Ｒ，Ａ、Ｌａｎｇｅ、Ｌ、Ｄ。

Ｈｉ　１１　ｉ　ｓ、Ｎ、Ｅ−ｎ３−−↓−ニーＪ、Ｍｅｄ−、−３１８．１７ ３４（１，９８８）。

７、　Ｊ、Ｆｏｌｋｍａｎ、Ｍ、Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ、３ｃ土ｅ　ｎ　ｃ　ｅ− ２３５，４４２（１９８７）；Ｓ、Ｊ、Ｌｅｉｂｏｖｉｃｈ、　Ｐ、Ｊ。

Ｐｏ１ｖｅｒｉｎｉ、夏−ｒ、ＭｉｃｈａｅｌＳｈｅｐａｒｄ、Ｄ、Ｍ。

Ｗｉｓｅｍａｎ、Ｖ、５ｈａｖｅｌｙ、Ｎ、Ｎｕｓｅｉｒ。

Ｎ６ｔ−ｕ−几且　３２９，６３０　（１９８７）；Ｊ、Ｆｏｌｋｍａｎ。

Ｍ、に、］、］ａｇｓｂｒｕｎ、Ｎａｔ−止ｍ旦３２９，６７１　（１９８７） 。

８、　Ｔ、Ｍａｔｓｕｍｕｒａ、Ｔ、Ｙａｍａｎｋａ。

Ｓ、Ｈａｓｈｉｚｕｍｅ、Ｙ、Ｉｒ１ｅ、に、Ｎ１ｔｔａ、１１士」Ｊトー鵠１ 尺ｘｐ、−陸主４ユ４５，３７７　（１９７５）；Ｄ、Ｇ、Ｓ。

Ｔｈ１ｌｏ、Ｓ、Ｍｕｌｌｅｒ−Ｋｕｓｅｌ、Ｄ、Ｈｅ１ｎｒｉｃｈ。

１、Ｋａｕｆ　ｆｅｒ、Ｅ、Ｗｅｉｓｓ、Ａｒｔｅｒｙ、’８．２５ａ（１，９ ８０）。

９、　Ａ、Ｍ、ＤＰｎｎｅｎｂｅｒｇ、Ｍ、Ｓｕｇａ、Ｍｅｔｈｏｄｓｆ−Ｑ、 　、７　ｓ↓ｕ　−ｄ　ｙ　ｉ−ルｇ　−Ｍ　ｃ２−ｎ　Ｑ　ｒ３１交ユｅａｒ Ｐｈａｇｏ、、ｃｙｔｅＳ、Ｄ、○、Ａｄａｍｓ、Ｐ、Ｊ、Ｅｄｅｌｓｏｎ。

ＩＬ　Ｓ、Ｋｏｒｅｎ、Ｅｄｓ、（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

ニューヨーク、＋９８１）、ｐｌ）３７５−３９５゜１０、Ｒ，Ｄ、Ｃｏｎｅ、 Ｒ，Ｃ，Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、、−Ａ−ｃ−ａｃｊ、−３− ｃ−ｉ、Ｕ、Ｅ＞−−八−，８１，６３４９（１９８４）。

米国特許出願番号０７／７２４，５０９．１９９１年６月２８日出願、および０ ７／３３１，３３６．１９８９年３月３１日出願の開示をここにＩＪファレンス として援用する。

いうまでもなく、上記教示に照らせば本発明は多くの改変法や変形法外１可能で ある。したがって、添付のクレームの範囲におし）て、本発明１よここに特に記 載した以外の方法でも実施可能であることを了解されたしλ。

図８ 効果細胞：目的細胞比 静脈内注射 ０□溶液Ｃ／Ｈ−２Ｋｓ ◆□リポフェクチン／Ｈ−２Ｋｓ ｏ−＝−−−−リポフェクチン／　Ｒ５Ｖ−Ｂ−ＧＡＬフロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ａ６１Ｍ　２５１００ ／／　Ａ６１Ｋ　３７１０２　ＡＤＵ　８３１４−４Ｃ３７／２４　ＡＤＰ　８ ３１４−４Ｃ ３７１５４ＡＢＮ　８３１４−４Ｃ （８１）指定国　ＥＰ（ＡＴ、ＢＥ、ＣＨ，ＤＥ。

ＤＫ、ＥＳ、ＦＲ，ＧＢ、ＧＲ，ＩＴ、ＬＵ、ＭＣ，ＮＬ、　ＳＥ）、　ＣＡ、 ＪＰ Ｉ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．患者の疾患を治療するのに必要なキットで、１つのカテーテル手段と醇素ま たは弱性の洗浄剤を含む溶液で構成され、（ｉ）当該カテーテル手段は血管に挿 入できるようになっており、主カテーテル部は、当該血管に挿入できるように、 また当該主カテーテル部を当該血管内の所望の位置に保持できるように当該血管 の壁に対して膨らますことができるようなバルーンエレメント、および当該血管 の中に溶液を供給するための手段を主カテーテル部に備えたもので構成され；そ して（ｊ．ｉ）当該溶液は生理学的に許容される溶液であるキット。 ２．溶液が当該酵素として、ディスバーゼ、トリプシン、コラゲナーゼ、ババイ ン、ペプシン、キモトリプシンおよびリパーゼよりなる群から選ばれる少なくと も１種類以上のものを含むものである、請求項第１項記載のキット。 ３．溶液が、ＮＰ−４０、ＴｒｉｔｏｎＸ１００、デオキシコール酸塩、および ＳＤＳよりなる群から選ばれる少なくとも１種類以上のものを含むものである、 請求項第１項記載のキット。 ４．主カテーテル部が、血管に挿入できるように、また血管の中に１つのチャン バを形成できるように、また主カテーテルを所望の位置に保持できるように、血 管の壁に対して膨らませることができるようにした２つの間隔を開けたバルーン エレメント手段、および当該溶液を当該チャンバヘ供給する手段を当該バルーン エレメントの間に設けた構成になるものである、請求項第１項記載のキット。 ５．溶液を当該血管の中へ供給する手段が複数の出口手段で構成されている、請 求項第１項記載のキット。 ６．患者の疾患を治療するのに必要なキットで、１つのカテーテル手段と生理学 的に許容される溶液で構成され、 （ｉ）当該カテーテル手段は血管に挿入できるようになっており、主カテーテル 部は、当該血管に挿入できるように、また当該主カテーテルを当該血管内の所望 の位置に保持できるように当該血管の壁に対して膨らますことができるようなバ ルーンエレメント、および当該血管の中に溶液を供給するための手段を主カテー テルに備えたものデ構成され；そして（ｉｉ）当該生理学的に許容される溶液は 、ヘパリン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリプレン、デキストランサルフェート、ポリ カチオン性物質、および二価の抗体よりなる群から選ばれる少なくとも１種類以 上の物質を含むキット。 ７．生理学的に許容される溶液がさらにＤＮＡを含むものである、請求項第６項 記載のキット。 ８．生理学的に許容される溶液がさらに成長因子を含むものである、請求項第６ 項記載のキット。 ９．患者の疾患を治療するのに必要な方法であって、当該患者の血管の壁または 器官あるいは組織に付着させた細胞に、当該疾患を治療する外因性の冶療剤タン パケ質を発現させることを特徴とする方法。 １０．疾患が虚血性疾患、血管運動性疾患、糖尿病、悪性疾患、ＡＩＤＳ，また は選伝子的疾患である、請求項第９項記載の方法。 １１．疾患が全身性の疾患である、請求項第９項記載の方法。 １２．外因性治療剤タンパク質がｔＰＡまたはその修飾物、ウロキナーゼ、スト レプトキナーゼ、酸性線維芽細胞成長因子、塩基性線維芽細胞成長因子、腫瘍壊 死因子α、腫瘍壊死因子β、形質転換成長因子α、形質転換成長因子β、心房性 ナトリウム排泄増加因子、血小板から誘導された成長因子、エンドセリン、イン スリン、ジフテリアトキシン、百日咳トキシン、コレラトキシン、溶解性ＣＤ４ およびその誘導物、および成長ホルモンよりなる群から選ばれるものである、請 求項第９項記載の方法。 １３．細胞が内皮細胞、血管平滑筋細胞、線維芽細胞、結合組織細胞、マクロフ ァージ、単球、および実質細胞よりなる群から選ばれるものである、請求項第９ 頃記載の方法。 １４．部位特異的に細胞を点滴注入することを特徴とする疾癒を治療する方法。 １５．細胞が形質転換された細胞である、請求項第１４項記載の方法。 １６．細胞が正常細胞である、請求項第１４項記載の方法。 １７．生体内で部位特異的に細胞を形質転換することを特徴とする疾患を愚者の 体内で治療する方法。 １８．さらに患者の血管壁または器官や組織に付着させた細胞に外因性の治療剤 ダンバク質を発現させるための手段を含み、その手段が、当該患者の血管壁また は器官や組織に付着させた細胞の中にＲＮＡまたはＤＮＡを移入または取り込ま せるための処方品で構成されるものである、請求項第１項記載のキット。 １９．処方品がレトロウイルス、アラスミド、リポソーム処方品、またはポリカ チオン性物質を含んだプラスミド複合体を含むものである、請求項第１８項記載 のキット。 ２０．処方品がリボソーム処方品である、請求項第１８項記載のキット。 ２ｔ．疾患が腫瘍に関連した悪性疾患であり、また細胞が、（１）患者に対して 外因性であり、そして（２ａ）当該患者に対して免疫的であり、（２ｂ）当該腫 瘍に対して拒絶、退行、またはその両方を誘導し、または（２ｃ）当該腫瘍の細 胞に対して毒性がある分子であって、細胞内の、分泌された、または細胞表面の 分子をコードするＤＮＡシーケンスまたはＲＮＡシーケンスとともに形質転換さ れたものである、請求項第１７項に記載の方法。 ２２．分子が当該患者に対して免疫的である、請求項第２１項記載の方法。 ２３．分子が当該腫瘍に対して拒絶、退行、またばその両方を誘導するものであ る、請求項第２１項記載の方法。 ２４．分子が成長刺激剤または抑制剤である、請求項第２３項記載の方法。 ２５．分子が細胞分化の誘導剤である、請求項第２３項記載の方法。 ２６．分子が当該腫瘍細胞に対して毒性があるものである、請求項第２１項記載 の方法。 ２７．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが当該患者と同じ種から得られたものであ る、請求項第２１項記載の方法。 ２８．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが当該患者と異なる種から得られたもので ある、請求項第２１項記載の方法。 ２９．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを当該患者に対してウイルス性ベクターに 入れて局部的に投与する、請求項第２１項記載の方法。 ３０．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを当該患者に対してＤＮＡまたはＲＮＡノ リポソーム複合体として局部的に投与する、請求項第２１項記載の方法。 ３１．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスを当該患者に対して細胞系を介して局部的 に投与する、請求項第２１項記載の方法。 ３２．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが、当該患者の目的細胞に対して当該ＤＮ ＡまたはＲＮＡシーケンスの供給を容易にするようなキャリヤ分子に当該ＤＮＡ またはＲＮＡシーケンスをカップリングさせたものを含む化学処方品として、全 身的に患者に投与されるものである請求項第２１項記載の方法。 ３３．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが、クラスＩ組織適合性遺伝子、クラスＩ １組織適合性遺伝子、免疫刺激特性を有するペプチドをコードするバクテリア遺 伝子、免疫刺激特性を有するウイルス性グリコプロテインをコードする遺伝子、 マイナー組織適合性抗原をコードする遺伝子、ラインザイム又は牛血清アルブミ ンをコードする遺伝子、および発ガン性遺伝子よりなる群から選ばれたものであ る、請求項第２１項記載の方法。 ３４．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが、インターロイキン−１、２、３、４、 ６または８、ＴＮＦ−αまたはβ、ＴＧＦ−β（１、２または３）、溶解性成長 因子、成長因子またはレセプターまたはそれらの相似体に対するリコンヒナント 抗体、インターフェロンα、βまたはγ、および粘着性分子をコードするＤＮＡ またはＲＮＡシーケンスよりなる群から選ばれたものである、請求項第２１項記 載の方法。 ３５．ＤＮＡまたはＲＮＡシーケンスが、チミジンキナーゼ、ジフテリアトキシ ン、百日咳トキシンまたは薬剤感受性タンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮ Ａシーケンスよりなる群から選ばれたものである、請求項第２１項記載の方法。 ３６．該酸および供給用ビヒクルまたはウイルス性ベクターを用いて動物の組織 にリコンビナント遺伝子を生体内で導入することによって、動物の免疫システム を調節する方法。 ３７．導入が部位特異的に行われ、当該リコンビナント遺伝子を動物の胸線に導 入する、請求項第３６項記載の方法。 ３８．導入が、当該遺伝子によってコードされる分子に対する動物の免疫システ ムを刺激するものである、請求項第３６項記載の方法。 ３９．導入が、当該遺伝子を含む組成物を注射することによって直接、当該細胞 を含む組織に対して行われる、請求項第３６項記載の方法。 ４０．導入が、当該遺伝子を含む組成物を経口投与または管腔内投与することに よって粘膜表面に対して行われる、請求項第３６項記載の方法。