DE69233725T2

DE69233725T2 - Verwendung von DNA oder RNA zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Tumoren

Info

Publication number: DE69233725T2
Application number: DE69233725T
Authority: DE
Inventors: Elizabeth G. Ann Arbor Nabel; Gary J. Ann Arbor Nabel
Original assignee: University of Michigan
Current assignee: University of Michigan
Priority date: 1991-06-28
Filing date: 1992-06-26
Publication date: 2009-02-12
Anticipated expiration: 2012-06-27
Also published as: JPH06509329A; EP0591408A4; WO1993000052A1; CA2112375A1; DE69233725D1; EP0591408A1

Description

Bereich der Technik
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von DNA oder RNA zum Modulieren des Immunsystems eines Tiers durch die in vivo-Einbringung von rekombinanten Genen.
Stand der Technik
Die wirksame Behandlung von vielen erworbenen und ererbten Erkrankungen bleibt eine Hauptherausforderung für moderne Medizin. Die Fähigkeit zur Bereitstellung von therapeutischen Mitteln bei speziellen Stellen in vivo wäre ein Gewinn bei der Behandlung von z. B. lokalisierten Erkrankungen. Zusätzlich wäre die Fähigkeit, zu verursachen, dass ein therapeutisches Mittel durch das Kreislaufsystem perfundiert, zur Behandlung von z. B. ererbten Erkrankungen und erworbenen Erkrankungen oder Krebs wirksam.
Zum Beispiel wäre es wünschenswert, in einer kontinuierlichen Weise ein Antitumormittel oder Toxin in großer Nähe zu einem Tumor zu verabreichen. In ähnlicher Weise wäre es wünschenswert, eine Perfusion von z. B. Insulin in das Blut einer Person, welche an Diabetes leidet, zu verursachen. Jedoch gibt es für viele therapeutische Mittel kein zufriedenstellendes Verfahren zu entweder Stellen-spezifischer oder systemischer Verabreichung.
Zusätzlich wäre es für viele Erkrankungen wünschenswert, entweder lokal oder systemisch, die Expression eines fehlerbehafteten endogenen Gens, die Expression eines exogenen Gens oder die Suppression eines endogenen Gens zu verursachen. Wieder bleiben diese nicht-realisierte Ziele.
Insbesondere die Pathogenese von Atherosklerose ist durch drei grundlegende biologische Prozesse gekennzeichnet. Diese sind: 1) Proliferation von glatten Intimamuskelzellen zusammen mit akkumulierten Makrophagen; 2) Bildung durch die proliferierten glatten Muskelzellen von großen Mengen an Bindegewebematrix; und 3) Akkumulation von Lipid, prinzipiell in der Form von Cholesterolestern und freiem Cholesterol, in Zellen sowie in umgebendem Bindegewebe.
Endothelzellverletzung ist ein initiierendes Ereignis und wird durch Beeinflussung der Permeabilitätsbarriere des Endothels, Veränderungen bei den nicht-thrombogenen Eigenschaften der Endotheloberfläche und Förderung von prokoagulanten Eigenschaften des Endothels manifestiert. Monozyten migrieren zwischen Endothelzellen, werden als Fängerzellen aktiv und differenzieren zu Makrophagen.
Makrophagen synthetisieren und sekretieren dann Wachstumsfaktoren, einschließlich den Thrombozytenwachstumsfaktor (PDGF), Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) und transformierenden Wachstumsfaktor alpha (TGF-α). Diese Wachstumsfaktoren sind bei der Stimulierung der Migration und Proliferation von Fibroblasten und glatten Muskelzellen in der atherosklerotischen Plaque sehr wirksam. Zusätzlich können Plättchen mit der verletzten Endothelzelle und der aktivierten Makrophage Wechselwirken, um die Bildung von Wachstumsfaktoren und Thrombusbildung zu potenzieren.
Zwei Hauptprobleme beim klinischen Management von koronarer Herzerkrankung schließen Thrombusbildung bei akuter Myokardischämie und Restenose nach koronarer Angioplastie (PTCA) ein. Beide beziehen allgemeine zelluläre Ereignisse ein, einschließlich Endothelverletzung und Freisetzung von wirksamen Wachstumsfaktoren durch aktivierte Makrophagen und Plättchen. Koronare Angioplastie erzeugt ein Aufbrechen der atherosklerotischen Plaque und eine Entfernung des Endothels. Diese Gefäßverletzung fördert Plättchenaggregation und Thrombusbildung an der PTCA-Stelle. Ferner resultieren eine Freisetzung von Mitogenen aus Plättchen und Makrophagen, glatte Muskelzellen-Proliferation und Monozyteninfiltration in Restenose.
Eine empirische Therapie mit Antiplättchen-Arzneistoffen hat dieses Problem nicht verhindert, welches bei einem Drittel der Patienten, die sich einer PTCA unterziehen, auftritt. Eine Lösung für Restenose ist, Plättchenaggregation, Thrombusbildung und glatte Muskelzellen-Proliferation zu verhindern.
Thrombusbildung ist auch ein kritisches zelluläres Ereignis beim Übergang von stabilen zu instabilen Koronarsyndromen. Die Pathogenese bezieht höchstwahrscheinlich akute Endothelzellverletzung und/oder Plaquebruch, Fördern der Disjunktion der Endothelzellanbindung und Führen zum Einwirken von zugrundeliegenden Makrophagenschaumzellen ein. Dies kann zur Möglichkeit von im Kreislauf befindlichen Plättchen führen, zu adhärieren, zu aggregieren und Thromben zu bilden.
Die intravenöse Verabreichung von thrombolytischen Mitteln, wie Gewebeplasminogenaktivator (tPA), resultiert in Lyse des Thrombus bei ungefähr 70% der Patienten, welche einen akuten Myokardinfarkt erfuhren. Nichtsdestoweniger schlägt bei ungefähr 30% der Patienten eine Reperfusion fehl und von jenen Patienten, welche sich einer anfänglichen Reperfusion der von Infarkt betroffenen Arterie unterziehen, erfahren ungefähr 25% eine wiederauftretende Thrombose innerhalb von 24 Stunden. Deshalb bleibt eine wirksame Therapie für Rethrombose eine therapeutische Hauptherausforderung, welcher die medizinische Welt heute gegenübersteht.
Wie vorstehend angegeben, ist eine wirksame Therapie für Rethrombose bei weitem nicht die einzige therapeutische Hauptherausforderung, welche heute besteht. Andere schließen die Behandlung von anderen ischämischen Zuständen, einschließlich instabile Angina, Myokardinfarkt oder chronische Gewebeischämie oder sogar die Behandlung von erworbenen und ererbten Erkrankungen oder Krebs ein. Diese könnten durch die wirksame Verabreichung von Antikoagulanzien, vasodilatorischen, angiogenen, Wachstumsfaktoren oder Wachstumsinhibitoren an einen Patienten behandelt werden. So bleibt ein starker empfundener Bedarf für eine wirksame Therapie bei allen diesen klinischen Situationen.
Zusätzlich ist es wünschenswert, in der Lage zu sein, das Immunsystem eines Tiers zu modulieren. Insbesondere wurde viel Bemühen auf die Entwicklung von Impfstoffen gerichtet, um einen immunologischen Schutz vor Infektion bereit zu stellen. Jedoch ist die Entwicklung von sicheren Impfstoffen, welche leicht an eine große Anzahl von Patienten verabreicht werden können, problematisch und für viele Erkrankungen, wie z. B. AIDS, ist bisher noch kein sicherer und wirksamer Impfstoff verfügbar. Ferner ist es auch manchmal wünschenswert, eine Immunantwort eines Tiers spezifisch zu supprimieren, um eine Abstoßung eines Transplantats zu verhindern. Bemühungen zur Suppression von Transplantatabstoßung resultierten in der Entwicklung von Arzneistoffen, welche vielmehr in einer allgemeinen Suppression der Immunantwort resultieren als in einer spezifischen Suppression von Transplantationsantigenen, und solche Arzneistoffe sind nicht immer wirksam. So bleibt ein Bedarf für ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Tiers.
WO 90/11734 beschreibt ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung in einem Patienten durch Verursachen der Expression eines exogenen therapeutischen Proteins durch eine Zelle, welche an die Wände eines Gefäßes gebunden ist, oder die Zellen eines Organs, welches durch dieses Gefäß perfundiert wird, in dem Patienten.
Offenbarung der Erfindung
Demgemäß ist eine Aufgabe der vorliegenden Offenbarung die Bereitstellung eines neuen Verfahrens zur Stellen-spezifischen Verabreichung eines therapeutischen Mittels.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Perfusion eines therapeutischen Mittels in den Blutstrom eines Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Verursachung der Expression eines exogenen Gens in einem Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Verursachung der Expression eines fehlerbehafteten endogenen Gens in einem Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Suppression der Expression eines endogenen Gens in einem Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zum Stellen-spezifischen Ersetzen von geschädigten Zellen in einem Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung durch Verursachen von entweder der Stellen-spezifischen Verabreichung eines therapeutischen Mittels oder der Perfusion eines therapeutischen Mittels in den Blutstrom eines Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung durch Verursachen von entweder der Expression eines exogenen Gens, der Expression eines fehlerbehafteten endogenen Gens oder der Suppression der Expression eines endogenen Gens in einem Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung durch Stellen-spezifisches Ersetzen von geschädigten Zellen in einem Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, einen Kit zur Stellen-spezifischen Instillation von normalen oder transformierten Zellen in einen Patienten bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, einen Kit zum Stellen-spezifischen Transformieren von Zellen in vivo bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Tiers bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Tiers, wobei das Tier für ein fremdes Molekül empfindlich gemacht wird, bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems eines Tiers zur Abstoßung von Proteinen, um gegen Infektion durch einen Mikroorganismus oder Virus zu schützen, bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Tiers, wobei das Tier für ein fremdes Molekül tolerabel gemacht wird, bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Tiers, wobei die Neigung zur Abstoßung eines Transplantats verringert wird, bereit zu stellen.
Es ist eine andere Aufgabe der vorliegenden Offenbarung, einen neuen Kit zum Transformieren von Zellen durch systemische Verabreichung in vivo bereit zu stellen.
Es wurde durch die Erfinder entdeckt, dass diese und andere Aufgaben dieser Offenbarung, welche während dem Verlauf der folgenden detaillierten Beschreibung offensichtlich werden, durch (a) ein Verfahren, welches entweder (i) Stellen-spezifische Instillation von entweder normalen (nicht transformierten) oder transformierten Zellen in einen Patienten oder (ii) Stellen-spezifische Transformation von Zellen in einem Patienten umfasst, und (b) einen Kit, der einen Katheter für (i) Stellen-spezifische Instillation von entweder normalen oder transformierten Zellen oder (ii) Stellen-spezifische Transformation von Zellen enthält, erreicht werden.
Stellen-spezifische Instillation von normalen Zellen kann zum Ersetzen von geschädigten Zellen verwendet werden, während Instillation von transformierten Zellen zum Verursachen der Expression von entweder einem fehlerbehafteten endogenen Gen oder einem exogenen Gen oder der Suppression eines endogenen Genprodukts verwendet werden kann. Eine Instillation von Zellen in die Wände der Blutgefäße eines Patienten kann zur Verursachung der stetigen Perfusion eines therapeutischen Mittels in den Blutstrom verwendet werden.
Die Erfinder haben auch entdeckt, dass es durch Transformieren von Zellen eines Tiers, in vivo, möglich ist, das Immunsystem des Tiers zu modulieren. Insbesondere ist es durch Transformieren von Zellen eines Tiers mit einem rekombinanten Gen durch Stellen-spezifische oder systemische Verabreichung möglich, das Immunsystem des Tiers zu modulieren, wobei das Tier für das Molekül, welches das rekombinante Gen kodiert, empfindlich gemacht wird. Alternativ ist es durch Transformieren von Zellen eines Tiers mit einem rekombinanten Gen, speziell an einer Stelle, welche die Spezifität des Immunsystems bestimmt, wie z. B. der Thymus, möglich, das Immunsystem eines Tiers zu modulieren, wobei die Immunantwort auf das Molekül, welches durch das rekombinante Gen kodiert wird, supprimiert wird.
Angesichts des Vorstehenden und basierend auf der hier enthaltenen Offenbarung stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung einer DNA- oder RNA-Sequenz und eines Vehikels für die Sequenz, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus viralen Vektoren besteht, welche die in vivo-Bereitstellung der Sequenz bei Tumorzellen ermöglichen, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Säuger durch direkte Injektion des Medikaments in den Tumor oder die Stelle des Tumors, so dass die Zellen des Tumors transformiert werden, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz ein Bestandteil sind, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus DNA- oder RNA-Sequenzen besteht, welche Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren, einschließlich Induktoren der Differenzierung, wie Stimulantien, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Inhibitoren/Induktoren der Differenzierung, wie TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Interleukin-1 und Interferone, kodieren, bereit.
Eine vollständigere Würdigung der Erfindung und viele der vorhandenen Vorteile davon werden leicht erhalten, wenn dieselbe durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung, wenn sie in Verbindung mit den angefügten Figuren betrachtet wird, besser verstanden wird.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 und 2 veranschaulichen die Verwendung eines Katheters bei der chirurgischen oder perkutanen Implantierung von Zellen in ein Blutgefäß oder bei der Transformierung von Zellen in vivo, welche an der Wand eines Blutgefäßes eines Patienten vorhanden sind;
3 zeigt die Beziehung zwischen den % der Zielzelllyse und dem Effektor:Ziel-Verhältnis für CTL-Zellen; und
4 zeigt die Ergebnisse einer Western-Blot-Analyse.
Die hier offenbarten Verfahren können zur Behandlung von Erkrankungen, wie ererbten Erkrankungen, systemischen Erkrankungen, Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Erkrankungen von besonderen Organen, oder Tumoren durch Instillieren von normalen oder transformierten Zellen oder durch Transformieren von Zellen verwendet werden.
Die Zellen, welche in den vorliegenden Verfahren instilliert werden können, schließen Endothel-, glatte Muskel-, Fibroblasten-, Monozyten-, Makrophagen- und Parenchymzellen ein. Diese Zellen können Proteine herstellen, welche eine therapeutische oder diagnostische Wirkung haben können und welche natürlich vorkommen können oder in rekombinantem genetischem Material auftreten können.
Nun unter Bezugnahme auf die Figuren, wobei gleiche Bezugszeichennummern identische oder entsprechende Teile überall in den mehreren Ansichten bezeichnen, und stärker besonders auf 1 davon, veranschaulicht diese Figur die Verwendung eines Katheters mit einem Design wie in U.S. Patent 4,636,195 offenbart. Dieser Katheter kann zur Bereitstellung von normalen oder genetisch veränderten Zellen an den Wänden eines Gefäßes oder zur Einbringung von Vektoren für die lokale Transformation von Zellen verwendet werden. In der Figur ist 5 die Wand des Blutgefäßes. Die Figur zeigt den Katheterkörper 4, der durch das Aufblasen von aufblasbaren Ballonmitteln 1 und 2 an der Stelle gehalten wird. Der Abschnitt des Katheterkörpers 4, der sich zwischen den Ballonmitteln 1 und 2 befindet, ist mit Instillationsöffnungsmittel 3 ausgerüstet. Der Katheter kann ferner mit einem Führungsdrahtmittel 6 ausgerüstet sein. 2 veranschaulicht die Verwendung eines ähnlichen Katheters, der sich von dem in 1 veranschaulichten Katheter durch die Tatsache unterscheidet, dass er mit nur einem einzigen aufblasbaren Ballonmittel 2 und einer Vielzahl von Instillationsöffnungsmitteln 3 ausgerüstet ist. Dieser Katheter kann bis zu zwölf individuelle Instillationsöffnungsmittel 3, wobei fünf veranschaulicht sind, enthalten.
Im Falle einer Bereitstellung bei einem Organ kann der Katheter in die Hauptarterie, welche das Gewebe versorgt, eingebracht werden. Zellen, welche rekombinante Gene oder Vektoren enthalten, können durch eine zentrale Instillationsöffnung nach temporärer Okklusion des Arterienkreislaufs eingebracht werden. In dieser Weise können Zellen oder Vektor-DNA bei einer großen Menge von Parenchymgewebe, verteilt durch den Kapillarkreislauf, bereitgestellt werden. Rekombinante Gene können auch in das Gefäßsystem unter Verwendung der Zwei-Ballon-Kathetertechnik in den Arterienkreislauf proximal zum Zielorgan eingebracht werden. In dieser Weise können die rekombinanten Gene direkt in den Kreislauf sekretiert werden, der das einbezogene Gewebe perfundiert, oder können direkt in dem Organ synthetisiert werden.
In solchen Verfahren können die therapeutischen Mittel durch Gefäßzellen, welche spezielle Organe versorgen, die durch die Erkrankung beeinflusst werden, sekretiert werden. Zum Beispiel kann ischämische Kardiomyopathie durch Einbringen von angiogenen Faktoren in den Koronarkreislauf behandelt werden. Diese Vorgehensweise kann auch für periphere, vaskuläre oder cerebrovaskuläre Erkrankungen, wobei angiogene Faktoren den Kreislauf zum Gehirn oder anderen Geweben verbessern können, verwendet werden. Diabetes mellitus kann durch Einbringung von Glucose-empfindlichen Insulin-sekretierenden Zellen in den Portalkreislauf, wobei die Leber normalerweise einer höheren Insulinkonzentration ausgesetzt ist als andere Gewebe, behandelt werden.
Zusätzlich zur Bereitstellung von lokalen Konzentrationen von therapeutischen Mitteln kann das Verfahren auch zur Bereitstellung von rekombinanten Genen bei Parenchymgeweben verwendet werden, da hohe Konzentrationen von viralem Vektor und anderen Vektoren in einem speziellen Kreislauf bereitgestellt werden können. Unter Verwendung dieser Vorgehensweise können auch Defizite von Organ-spezifischen Proteinen behandelt werden. Zum Beispiel können in der Leber α-Antitrypsininhibitordefizit oder Hypercholesterinämie durch Einbringung von α-Antitrypsin- oder das LDL-Rezeptorgen behandelt werden. Zusätzlich kann diese Vorgehensweise zur Behandlung eines Malignoms verwendet werden. Sekretion von speziellen rekombinanten Toxingenen in den Kreislauf von inoperablen Tumoren stellt eine therapeutische Wirkung bereit. Beispiele schließen Akustikusneurinome oder bestimmte Hämangiome, welche ansonsten nicht entfernbar sind, ein.
In klinischen Situationen werden diese therapeutischen rekombinanten Gene in Zellen eingebracht, welche den Kreislauf des einbezogenen Organs versorgen. Obwohl die Arterien- und Kapillarkreisläufe die bevorzugten Orte für die Einbringung dieser Zellen sind, sind auch Venensysteme geeignet.
In ihrer Verwendung bei der Behandlung von lokalem Gefäßschaden stellt die vorliegende Offenbarung die Expression von Proteinen, welche diesen Zustand in situ lindert, bereit. Da Gefäßzellen an diesen Stellen gefunden werden, können sie als Träger zum Übertragen der therapeutischen Mittel verwendet werden.
Folglich beruhen bestimmte hier offenbarte Verfahren auf einer genetischen Veränderung von Endothel- und anderen Gefäßzellen oder somatische Zellen-Gentherapie zum Übertragen von therapeutischen Mitteln (d. h. Proteinen, Wachstumsfaktoren) auf die lokalisierte Region einer Gefäßverletzung. Um Gentransplantation in die Zellen erfolgreich zu verwenden, müssen vier Anforderungen erfüllt sein. Erstens, das Gen, welches in die Zelle implantiert wird, muss identifiziert und isoliert werden. Zweitens, das Gen, welches exprimiert wird, muss kloniert werden und für genetische Manipulation zugänglich sein. Drittens, das Gen muss in die Zelle in einer Form, welche exprimiert wird oder funktionell ist, eingebracht werden. Viertens, die genetisch veränderten Zellen müssen in der Gefäßregion, wo es notwendig ist, platziert werden.
Die veränderten Zellen oder der passende Vektor können chirurgisch, perkutan oder intravenös in einen Abschnitt einer Gefäßwand eines Patienten eingebracht oder daran angebracht werden. Alternativ werden einige der Zellen, welche an der Gefäßwand eines Patienten vorliegen, mit dem gewünschten genetischen Material oder durch direktes Verwenden des Vektors transformiert. In einigen Fällen können Gefäßzellen, welche genetisch nicht modifiziert sind, durch diese Verfahren eingebracht werden, um Zellen zu ersetzen, welche auf der Gefäßoberfläche verloren oder geschädigt sind.
Jedwedes Blutgefäß kann behandelt werden; das heißt Arterien, Venen und Kapillaren. Diese Blutgefäße können in oder nahe bei jedwedem Organ im menschlichen oder Säugerkörper sein.
Einbringung von normalen oder genetisch veränderten Zellen in ein Blutgefäß:
Dies kann wie folgt veranschaulicht werden:
I. Etablierung von Endothel- oder anderen Gefäßzellen in Gewebekultur.
Zu Beginn wird eine Zelllinie etabliert und in flüssigem Stickstoff gelagert. Vor der Kryohaltbarmachung wird ein Aliquot zur Infektion oder Transfektion mit einem Vektor, viral oder andersartig, welcher das gewünschte genetische Material enthält, genommen.
Endothel- oder andere Gefäßzellen können enzymatisch von einem Segment eines Blutgefäßes unter Verwendung von Techniken, welche früher in J. W. Ford, et al., In Vitro, 17, 40 (1981) beschrieben wurden, abgeleitet werden. Das Gefäß wird herausgeschnitten, über einem Edelstahlstab umgekehrt und in 0,1% Trypsin in Ca⁺⁺- und Mg⁺⁺-freier Hank-Mineralsalzlösung (BSS) mit 0,125% EDTA bei einem pH-Wert von 8 für 10 min bei 37°C inkubiert.
Zellen (0,4 bis 1,5 × 10⁶) werden durch Zentrifugation gesammelt und in Medium 199 (GIBCO), welches 10% fötales Kälberserum, Endothelzell-Wachstumsergänzungsmittel (ECGS, Collaborative Research, Waltham, MA) zu 25 μg/ml, Heparin zu 15 U/ml und Gentamycin (50 μg/ml) enthält, resuspendiert. Zellen werden in eine 75 cm²-Gewebekulturflasche, welche mit Gelatine (2 mg/ml in destilliertem Wasser) vorbeschichtet wurde, gegeben. Zellen werden jeden zweiten Tag in das vorstehende Medium gegeben, bis sie Konfluenz erreichen.
Nach zwei Wochen in Kultur können das ECGS und Heparin von dem Medium weggelassen werden, wenn Schweineendothel kultiviert wird. Wenn glatte Gefäßmuskelzellen oder Fibroblasten gewünscht sind, können das Heparin und ECGS vollständig von dem Kultivierungsverfahren weggelassen werden. Aliquote von Zellen werden in flüssigem Stickstoff durch Resuspendieren zu ungefähr 10⁶ Zellen in 0,5 ml eiskaltem fötalem Kälberserum auf Eis gelagert. Ein gleiches Volumen von eiskaltem fötalem Kälberserum, welches 10% DMSO enthält, wird zugegeben und Zellen werden in eine vorgekühlte Corning-Gefrierflasche mit Schraubverschluss überführt. Diese Zellen werden in eine Gefriervorrichtung mit –70°C für 3 Stunden vor einer Langzeitlagerung in flüssigem Stickstoff überführt.
Die Zellen werden dann mit einem Vektor, der das gewünschte genetische Material enthält, infiziert.
II. Einbringung von Zellen, welche normale oder exogene Proteine exprimieren, in das Gefäßsystem.
A. Einbringung von Zellen, welche relevante Proteine exprimieren, durch Katheterisierung.
Der Patient wird zur Katheterisierung, entweder chirurgisch oder perkutan, vorbereitet, wobei auf strenges Einhalten von sterilen Techniken geachtet wird. Nach einer passenden Anästhesie wird ein Absperrverfahren an dem Zielblutgefäß durchgeführt oder eine Nadel wird in das Zielblutgefäß eingesetzt. Das Gefäß (5) wird punktiert und ein Katheter, wie in U.S. Patent 4,636,195 beschrieben, (erhältlich von USCI, Billerica, MA) wird mit Führungsdrahtmittel (6) unter fluoroskopischer Führung, falls notwendig, in das Gefäß (5) vorgerückt (1). Dieses Kathetermittel (4) ist zur Einbringung von infizierten Endothelzellen in eine einzelne Region der Arterie designed. Der Katheter weist ein proximales und distales Ballonmittel (2) beziehungsweise (1) (z. B. kann jedes Ballonmittel etwa 3 mm in der Länge und etwa 4 mm in der Breite aufweisen) mit einer Länge eines Kathetermittels zwischen den Ballonen auf. Die Länge des Kathetermittels zwischen den Ballonen weist ein Öffnungsmittel, welches mit einem Instillationsöffnungsmittel (3) verbunden ist, auf. Wenn die proximalen und distalen Ballone aufgeblasen sind, wird ein zentraler Raum in dem Gefäß erzeugt, was eine Instillation von infizierten Zellen durch die Öffnung ermöglicht.
Eine Region des Blutgefäßes wird durch anatomische Merkpunkte identifiziert und das proximale Ballonmittel (2) wird aufgeblasen, um das Endothel durch mechanische Verletzung (z. B. durch energisches Bewegen eines teilweise aufgeblasenen Ballonkatheters in dem Gefäß) oder durch mechanische Verletzung in Kombination mit kleinen Mengen eines proteolytischen Enzyms wie Dispase, Trypsin, Collagenase, Papain, Pepsin, Chymotrypsin oder Cathepsin oder durch Inkubation mit diesen proteolytischen Enzymen alleine freizulegen. Zusätzlich zu proteolytischen Enzymen können Liposen verwendet werden. Die Region des Blutgefäßes kann auch durch Behandlung mit einem milden Detergenz oder dergleichen, wie NP-40, Triton X100, Deoxycholat oder SDS, freigelegt werden.
Die Freilegungsbedingungen werden angepasst, um einen im Wesentlichen vollständigen Verlust des Endothels für Zelltransfers oder ungefähr 20 bis 90%, bevorzugt 50 bis 75%, Zellverlust von der Gefäßwand für direkte Infektion zu erreichen. In einigen Fällen kann es sein, dass eine Zellentfernung nicht notwendig ist. Der Katheter wird dann derart vorgerückt, dass das Instillationsöffnungsmittel (3) in der Region des freigelegten Endothels platziert ist. Infizierte, transfizierte oder normale Zellen werden dann in den einzelnen Abschnitt der Arterie über dreißig Minuten instilliert. Wenn das Blutgefäß ein Organ perfundiert, welches etwas Ischämie tolerieren kann, z. B. Skelettmuskel, ist distale Perfusion kein Hauptproblem, kann aber durch einen externen Shunt eingerichtet werden, falls notwendig, oder unter Verwendung eines Katheters, der distale Perfusion ermöglicht. Nach der Instillation der infizierten Endothelzellen wird der Ballonkatheter entfernt und die Arterienpunktierstelle und der lokale Hautschnitt werden kuriert. Wenn distale Perfusion notwendig ist, kann ein alternativer Katheter, der zur Ermöglichung von distaler Perfusion designed wurde, verwendet werden.
B. Einbringung von rekombinanten Genen direkt in Zellen an der Wand eines Blutgefäßes oder perfundiert durch einen speziellen Kreislauf in vivo; Infektion oder Transfektion von Zellen an der Gefäßwand und Organen.
Chirurgische Techniken werden wie vorstehend beschrieben verwendet. Anstelle einer Verwendung von infizierten Zellen wird ein gewünschtes genetisches Material eines transduzierenden viralen Vektors mit hohem Titer (10⁵ bis 10⁶ Partikel/ml) oder DNA, komplexiert mit einem Bereitstellungsvektor, direkt in die Gefäßwand unter Verwendung der Zwei-Ballon-Kathetertechnik instilliert. Dieser Vektor wird in Medium, welches Serum und Polybren (10 μg/ml) enthält, instilliert, um die Effizienz der Infektion zu steigern. Nach einer Inkubation im Totraum, welcher durch den Katheter gebildet wird, für einen passenden Zeitraum (0,2 bis 2 Stunden oder länger) wird dieses Medium durch Unterdruck entfernt, es wird mit Phosphat-gepufferter Salzlösung schonend gewaschen und der Arterienkreislauf wird wiederhergestellt. Ähnliche Protokolle werden für eine postoperative Erholung verwendet.
Die Gefäßoberfläche kann durch mechanische Freilegung alleine, in Kombination mit kleinen Mengen an proteolytischen Enzymen wie Dispase, Trypsin, Collagenase oder Cathepsin oder durch Inkubation mit diesen proteolytischen Enzymen alleine vorbereitet werden. Die Freilegungsbedingungen werden angepasst, um einen passenden Zellverlust von der Gefäßwand zu erreichen.
Viraler Vektor oder DNA-Vektor-Komplex werden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium unter Verwendung von gereinigtem Virus oder Komplexen, welche autologes Serum und Adhäsionsmoleküle wie Polybren (10 μg/ml), Poly-L-lysin, Dextransulfat oder jedwede polykationische Substanz, welche physiologisch geeignet ist, oder einen Hybridantikörper, der gegen das Umhüllungsglycoprotein des Virus oder den Vektor und das relevante Ziel in der Gefäßwand oder in dem Gewebe, welches durch das Gefäß perfundiert wird, gerichtet ist, enthalten, um die Effizienz der Infektion durch Erhöhen der Adhäsion von viralen Partikeln an den relevanten Zielzellen zu steigern, instilliert. Der Hybridantikörper, der gegen das Umhüllungsglycoprotein des Virus oder den Vektor oder die relevante Zielzelle gerichtet ist, kann durch eines von zwei Verfahren hergestellt werden. Antikörper, welche gegen unterschiedliche Epitope gerichtet sind, können chemisch vernetzt (G. Jung, C. J. Honsik, R. A. Reisfeld und H. J. Muller-Eberhard, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 4479 (1986); U. D. Staerz, O. Kanagawa und M. J. Bevan, Nature, 314, 628 (1985); und P. Perez, R. W. Hoffman, J. A. Titus und D. M. Segal, J. Exp. Med., 163, 166 (1986)) oder biologisch unter Verwendung von Hybridhybridoma gekuppelt (U. D. Stearz und M. J. Bevan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 1453 (1986); und C. Milstein und A. C. Cuello, Nature, 305, 537 (1983)) werden. Nach einer Inkubation im zentralen Raum des Katheters für 0,2 bis 2 Stunden oder länger wird das Medium durch Unterdruck entfernt, es wird mit Phosphat-gepufferter Salzlösung schonend gewaschen und der Kreislauf wird wiederhergestellt.
Unter Verwendung eines unterschiedlichen Katheterdesigns (siehe 2) kann auch ein unterschiedliches Protokoll zur Instillation verwendet werden. Diese zweite Vorgehensweise bezieht die Verwendung eines einzelnes Ballonmittel (2)-Katheters mit multiplen Öffnungsmitteln (3), welche eine Hochdruckbereitstellung des Retrovirus in den teilweise freigelegten Arteriensegmenten ermöglichen, ein. Die Gefäßoberfläche wird wie vorstehend beschrieben vorbereitet und fehlerbehafteter Vektor wird unter Verwendung von ähnlichen Adhäsionsmolekülen eingebracht. In diesem Fall dient die Verwendung eines Hochdruckbereitstellungssystems zur Optimierung der Wechselwirkung von Vektoren mit Zellen in benachbartem Gefäßgewebe.
Die vorliegende Offenbarung stellt auch die Verwendung von Wachstumsfaktoren, welche lokal durch Katheter oder systemisch bereitgestellt werden, um die Effizienz der Infektion zu steigern, bereit. Zusätzlich zu retroviralen Vektoren sind Herpesvirus-, Adenvirus- oder andere virale Vektoren geeignete Vektoren für die vorliegende Technik.
Es ist auch möglich, Zellen in einem Organ oder Gewebe zu transformieren. Direkte Transformation von Organ- oder Gewebezellen kann durch eines von zwei Verfahren erreicht werden. In einem ersten Verfahren wird eine Hochdrucktransfektion verwendet. Der Hochdruck wird verursachen, dass der Vektor durch die Blutgefäßwände in das umgebende Gewebe migriert. In einem zweiten Verfahren ermöglicht eine Injektion in ein Kapillarbett, gegebenenfalls nach Verletzung, um ein Auslaufen zu ermöglichen, eine direkte Infektion der umgebenden Gewebe.
Die Zeit, welche zur Instillation der Vektoren oder Zellen erforderlich ist, wird von der besonderen Ausführungsform dieser Offenbarung, welche verwendet wird, abhängen. So wäre eine geeignete Zeit zur Instillation von Zellen oder Vektoren in ein Blutgefäß 0,01 bis 12 Std., bevorzugt 0,1 bis 6 Std., am stärksten bevorzugt 0,2 bis 2 Std. Alternativ können für Hochdruckinstillation von Vektoren oder Zellen kürzere Zeiten bevorzugt sein.
Erhalten der Zellen:
Der Ausdruck „genetisches Material" betrifft im Allgemeinen DNA, welche ein Protein kodiert. Dieser Ausdruck umfasst auch RNA, wenn er für einen RNA-Virus- oder anderen Vektor, basierend auf RNA, verwendet wird.
Transformation ist der Vorgang, durch welchen Zellen ein exogenes Gen durch direkte Infektion, Transfektion oder ein anderes Aufnahmemittel aufgenommen haben.
Der Ausdruck „Vektor" wird gut verstanden und ist mit der oft verwendeten Umschreibung „Kloniervehikel" synonym. Ein Vektor ist eine nicht-chromosomale doppel-strängige DNA, welche ein intaktes Replikon umfasst, so dass der Vektor repliziert wird, wenn er in einem einzelligen Organismus platziert wird, zum Beispiel durch ein Transformationsverfahren. Virale Vektoren schließen Retroviren, Adenviren, Herpesvirus, Papovirus oder anderweitig modifizierte natürlich vorkommende Viren ein. Vektor bedeutet auch eine Formulierung von DNA mit einer Chemikalie oder Substanz, welche eine Aufnahme durch Zellen ermöglicht.
Hier werden auch Verfahren zur Inhibierung der Expression eines Gens offenbart. Vier Vorgehensweisen können zum Erreichen dieses Ziels verwendet werden. Diese schließen die Verwendung von Antisense-Mitteln, entweder synthetische Oligonukleotide, welche zu der mRNA komplementär sind, (Maher III, L. J. und Dolnick, B. J. Arch. Biochem. Biophys., 253, 214–220 (1987) und Zamecnik, P. C., et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83, 4143–4146 (1986)) oder die Verwendung von Plasmiden, welche das reverse Komplement dieses Gens exprimieren, (Izant, J. H. und Weintraub, H., Science, 229, 345–352, (1985); Cell, 36, 1077–1015 (1984)) ein. Zusätzlich können katalytische RNAs, welche Ribozyme genannt werden, spezifisch RNA-Sequenzen abbauen (Uhlenbeck, O. C., Nature, 328, 596–600 (1987), Haseloff, J. und Gerlach, W. L., Nature, 334, 585–591 (1988)). Die dritte Vorgehensweise bezieht „intrazelluläre Immunisierung" ein, wobei Analoga von intrazellulären Proteinen spezifisch ihre Funktion beeinflussen können (Friedman, A. D., Triezenberg, S. J. und McKnight, S. L., Nature, 335, 452–454 (1988)), was nachstehend im Detail beschrieben wird.
Die ersten Vorgehensweisen können zur spezifischen Beseitigung von Iranskripten in Zellen verwendet werden. Der Verlust eines Iranskripts kann durch S1-Nuklease-Analyse und Expression des unter Verwendung eines funktionellen Tests bestimmten Bindungsproteins bestätigt werden. Einsträngige Oligonukleotidanaloga können zum Beeinflussen der Verarbeitung oder Translation der Transkriptionsfaktor-mRNA verwendet werden. Kurz, synthetische Oligonukleotide oder Thiolderivatanaloga (20 bis 50 Nukleotide), welche komplementär zum Kodierstrang des Zielgens sind, können hergestellt werden. Diese Antisense-Mittel können gegen unterschiedliche Regionen der mRNA hergestellt werden. Sie sind zur nicht translatierten 5'-Region, der Translationsinitiierungsstelle und anschließenden 20 bis 50 Basenpaaren, der zentralen Kodierregion oder der nicht translatierten 3'-Region des Gens komplementär. Die Antisense-Mittel können mit Zellen, welche vor der Aktivierung transfiziert wurden, inkubiert werden. Die Effizienz von Antisense-Kompetitoren, welche auf unterschiedliche Teile der Messenger-RNA gerichtet sind, kann verglichen werden, um zu bestimmen, ob spezielle Regionen bei der Verhinderung der Expression dieser Gene wirksamer sind.
RNA kann auch in einer autokatalytischen Weise wirken, wobei Autolyse verursacht wird oder spezifisch komplementäre RNA-Sequenzen abgebaut werden (Uhlenbeck, O. C., Nature, 328, 596–600 (1987), Haseloff, J. und Gerlach, W. L., Nature, 334, 585–591 (1988), und Hutchins, C. J., et al., Nucleic Acids Res., 14, 3627–3640 (1986)). Die Anforderungen für eine erfolgreiche RNA-Spaltung schließen eine Hammerkopfstruktur mit einer konservierten RNA-Sequenz in der Region, welche diese Struktur flankiert, ein. Regionen, welche benachbart zu dieser katalytischen Domäne sind, werden zu einer speziellen RNA komplementär gemacht, wodurch das Ribozym auf spezielle zelluläre mRNAs zielgerichtet wird. Um die Herstellung eines speziellen Zielgens zu inhibieren, kann die mRNA, welche dieses Gen kodiert, spezifisch unter Verwendung von Ribozymen abgebaut werden. Kurz, jede GUG-Sequenz innerhalb dem RNA-Iranskript kann als ein Ziel für den Abbau durch das Ribozym dienen. Diese können durch DNA-Sequenzanalyse identifiziert werden und GUG-Stellen, welche das RNA-Iranskript durchspannen, können für einen spezifischen Abbau verwendet werden. Stellen in der nicht translatierten 5'-Region, in der Kodierregion und in der nicht translatierten 3'-Region können zielgerichtet werden, um zu bestimmen, ob eine Region beim Abbau dieses Iranskripts wirksamer ist. Synthetische Oligonukleotide, welche 20 Basenpaare einer komplementären Sequenz strangaufwärts der GUG-Stelle, die Hammerkopfstruktur und ∼20 Basenpaare einer komplementären Sequenz strangabwärts dieser Stelle kodieren, können an der relevanten Stelle in der cDNA eingesetzt werden. In dieser Weise kann das Ribozym auf das gleiche zelluläre Kompartiment wie die endogene Nachricht zielgerichtet werden. Die Ribozyme, welche strangabwärts von speziellen Enhancern eingesetzt werden, die einen hohen Level an Expression in speziellen Zellen ergeben, können auch erzeugt werden. Diese Plasmide können in relevante Zielzellen unter Verwendung von Elektroporation und Cotransfektion mit einem Neomycin-resistenten Plasmid, pSV2-Neo oder einem anderen selektierbaren Marker eingebracht werden. Die Expression dieser Transkripte kann durch Northern-Blot und S1-Nuldease-Analyse bestätigt werden. Wenn bestätigt, kann die Expression von mRNA durch S1-Nuklease-Schutz bewertet werden, um zu bestimmen, ob eine Expression dieser Transkripte Gleichgewichtslevels der Ziel-mRNA und der Gene, welche sie reguliert, verringert. Der Level des Proteins kann auch untersucht werden.
Gene können auch durch Herstellen von mutanten Iranskripten ohne Domänen, welche für Aktivierung erforderlich sind, inhibiert werden. Kurz, nachdem die Domäne identifiziert wurde, wird eine mutante Form, welche zur Stimulierung der Funktion nicht in der Lage ist, synthetisiert. Dieses trunkierte Genprodukt kann strangabwärts des SV-40-Enhancers in ein Plasmid, welches das Neomycinresistenzgen enthält, (Mulligan, R. und Berg, P., Science, 209, 1422–1427 (1980) (in einer getrennten Transkriptionseinheit) eingesetzt werden. Dieses Plasmid kann in Zellen eingebracht und unter Verwendung von G418 selektiert werden. Die Gegenwart der mutanten Form dieses Gens wird durch S1-Nuklease-Analyse und durch Immunopräzipitation bestätigt. Die Funktion des endogenen Proteins in diesen Zellen kann durch zwei Wege bewertet werden. Erstens, die Expression des normalen Gens kann untersucht werden. Zweitens, die bekannte Funktion dieser Proteine kann bewertet werden.
Im Falle, dass diese mutante interzelluläre beeinflussende Form für ihre Wirtzelle toxisch ist, kann sie an einem induzierbaren Kontrollelement, wie Metallothionein-Promotor, eingebracht werden. Nach der Isolierung von stabilen Linien können Zellen mit Zn oder Cd inkubiert werden, um dieses Gen zu exprimieren. Seine Wirkung auf Wirtzellen kann dann bewertet werden.
Eine andere Vorgehensweise zur Inaktivierung von speziellen Genen ist eine Überexpression von rekombinanten Proteinen, welche die Expression oder Funktion von anderen Aktivitäten antagonisieren. Wenn zum Beispiel gewünscht ist, die Expression von TPA zu erniedrigen (z. B. in einer klinischen Situation von disseminierender Thrombolyse), könnte man Plasminogenaktivator-Inhibitor überexprimieren.
Fortschritte in der Biochemie und Molekularbiologie in den letzten Jahren führten zum Aufbau von „rekombinanten" Vektoren, wobei zum Beispiel Retroviren und Plasmide hergestellt werden, welche exogene RNA beziehungsweise DNA enthalten. In besonderen Fällen kann der rekombinante Vektor heterologe RNA oder DNA einschließen, womit RNA oder DNA gemeint sind, welche ein Polypeptid kodieren, das normalerweise nicht durch den Organismus hergestellt wird, welcher für Transformation durch den rekombinanten Vektor empfindlich ist. Die Herstellung der rekombinanten RNA- und DNA-Vektoren wird gut verstanden und muss nicht im Detail beschrieben werden. Jedoch wird eine kurze Beschreibung dieses Verfahrens hier für Bezugnahme aufgenommen.
Zum Beispiel können ein Retrovirus oder ein Plasmidvektor gespalten werden, wobei lineare RNA oder DNA mit ligierbaren Termini bereitgestellt werden. Diese Termini werden an exogene RNA oder DNA mit komplementären ähnlichen ligierbaren Termini gebunden, wobei ein biologisch funktionelles rekombinantes RNA- oder DNA-Molekül mit einem intakten Replikon und einer gewünschten phenotypischen Eigenschaft bereitgestellt wird.
Eine Vielzahl von Techniken ist für RNA- und DNA-Rekombination verfügbar, wobei benachbarte Enden von getrennten RNA- oder DNA-Fragmenten maßgeschneidert werden, um Ligierung zu ermöglichen.
Die exogene, d. h. Donor-, RNA oder DNA, welche in den hier offenbarten Verfahren verwendet werden, werden von geeigneten Zellen erhalten. Der Vektor wird unter Verwendung von bekannten Techniken aufgebaut, wobei eine transformierte Zelle erhalten wird, welche zur in vivo-Expression des therapeutisches Mittel-Proteins in der Lage ist. Die transformierte Zelle wird durch in Kontakt bringen einer Zielzelle mit einer RNA- oder DNA-enthaltenden Formulierung, welche Transfer und Aufnahme der RNA oder DNA in die Zielzelle ermöglicht, erhalten. Solche Formulierungen schließen zum Beispiel Retroviren, Plasmide, liposomale Formulierungen oder Plasmidkomplexe mit polykationischen Substanzen wie Poly-L-lysin, DEAC-Dextran und zielrichtende Liganden ein.
Die vorliegende Offenbarung stellt so die genetische Veränderung von Zellen als ein Verfahren zum Übertragen von therapeutischen oder diagnostischen Mitteln auf lokalisierte Regionen des Blutgefäßes für lokale oder systemische Zwecke bereit. Der Bereich von rekombinanten Proteinen, die in diesen Zellen exprimiert werden können, ist breit und vielfältig. Sie schließt Gentransfer unter Verwendung von Vektoren, welche solche Proteine exprimieren, wie tPA für die Behandlung von Thrombose und Restenose, Angiogenese- oder Wachstumsfaktoren für den Zweck von Gefäßneubildung und vasoaktive Faktoren zur Linderung von Vasokonstriktion oder Vasospasmus, ein. Diese Technik kann auch auf genetische Behandlung von ererbten Störungen oder erworbenen Erkrankungen, lokalisiert oder systemisch, ausgedehnt werden. Die hier offenbarten Verfahren können auch zur Einbringung von normalen Zellen an speziellen Stellen von Zellverlust, zum Beispiel zum Ersetzen von Endothel, welches während Angioplastie oder Katheterisierung beschädigt wurde, verwendet werden.
Zum Beispiel wird bei der Behandlung von ischämischen Erkrankungen (thrombotische Erkrankungen) genetisches Material, welches tPA oder Modifizierungen davon, Urokinase oder Streptokinase kodiert, zum Transformieren der Zellen verwendet. Bei der Behandlung von ischämischem Organ-(z. B. Herz, Niere, Darm, Leber, usw.)-Versagen kann genetisches Material, welches Rekollateralisierungsmittel, wie transformierenden Wachstumsfaktor α (TGF-α), transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF β), Angiogenin, Tumornekrosefaktor α, Tumornekrosefaktor β, sauren Fibroblastenwachstumsfaktor oder basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, kodiert, verwendet werden. Bei der Behandlung von vasomotorischen Erkrankungen kann genetisches Material, welches Vasodilatoren oder Vasokonstriktoren kodiert, verwendet werden. Diese schließen atrialen natriuretischen Faktor, Thrombozytenwachstumsfaktor oder Endothelin ein. Bei der Behandlung von Diabetes kann genetisches Material, welches Insulin kodiert, verwendet werden.
Die hier offenbarten Verfahren können auch bei der Behandlung von Malignomen durch Platzieren der transformierten Zellen in der Nähe des Malignoms verwendet werden. Bei dieser Verwendung kann genetisches Material, welches Diphtherietoxin, Pertussistoxin oder Choleratoxin kodiert, verwendet werden.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Offenbarung die Therapie eines Malignoms durch entweder Stimulieren einer Immunantwort gegen Tumorzellen oder Inhibieren von Tumorzellwachstum oder Metastatisierung durch genetische Modifizierung in vivo bereit. Diese Vorgehensweise unterscheidet sich von früheren Verfahren, in welchen Tumorzellen in vitro vermehrt, modifiziert und selektiert werden.
Gemäß dieser Ausführungsform werden eine DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz, einschließlich rekombinante Gene, bei Tumorzellen in vivo bereitgestellt, mit (1) retroviralen oder viralen Vektoren als Vehikel, (2) DNA- oder RNA/Liposom-Komplexen als Vehikel, (3) chemischen Formulierungen, welche die DNA- oder RNA-Sequenz enthalten, und gekuppelt an ein Trägermolekül, welches eine Bereitstellung der Sequenz bei den Zielzellen ermöglicht, oder (4) durch Verwenden von Zell-vermitteltem Gentransfer, um Gene an speziellen Stellen in vivo bereit zu stellen, was z. B. auf der Verwendung von glatten Gefäßmuskelzellen oder Endothelzellen, welche in vitro transduziert wurden, als ein Vehikel zur Bereitstellung des rekombinanten Gens an der Stelle des Tumors beruht.
In dieser Hinsicht ist der Gegenstand der vorliegenden Erfindung, wie durch die angefügten Patentansprüche definiert, die Verwendung einer DNA- oder RNA-Sequenz und eines Vehikels für die Sequenz, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus viralen Vektoren, welche die in vivo-Bereitstellung der Sequenz bei Tumorzellen ermöglichen, besteht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Säuger durch direkte Injektion des Medikaments in den Tumor oder die Stelle des Tumors, so dass die Zellen des Tumors transformiert werden, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz ein Bestandteil ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus DNA- oder RNA-Sequenzen besteht, welche Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren kodieren, einschließlich Induktoren der Differenzierung, wie Stimulantien, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Inhibitoren/Induktoren der Differenzierung, wie TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Interleukin-1 und Interferone.
In einer Ausführungsform dieser Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung das Immunsystem, welches Schutz gegen Krebs bereitstellt und eine wichtige Rolle als eine adjuvante Behandlung eines Malignoms spielt. Immuntherapie stellte sich als vielversprechend als eine adjuvante Vorgehensweise bei der Behandlung von Malignomen heraus. Sowohl zytolytische T-Zellen als auch Lymphokine können Tumorzellzerstörung ermöglichen und Strategien zur Steigerung von Tumorregression durch Verabreichung von Zytokinen oder Tumor-infiltrierenden Lymphozyten haben Wirksamkeit in Tiermodellen und Studien an Menschen gezeigt. Zum Beispiel ist bekannt, dass Lymphokin-aktivierte Killerzellen (LAK) und Tumor-infiltrierende Lymphozyten (TIL) neoplastische Zellen lysieren und teilweise oder vollständige Tumorabstoßung hervorrufen können. Expression von Zytokingenen in malignen Zellen weist auch gesteigerte Tumorregression auf.
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Gentransfer-Vorgehensweise gegen Tumore durch die Einbringung von rekombinanten Genen direkt in Tumorzellen in vivo bereit, wobei hingegen herkömmliche Gentransfertechniken auf die Modifizierung von Tumorzellen in vitro, gefolgt von einem Transfer der modifizierten Zellen fokussiert waren. Die Vorgehensweisen des Standes der Technik sind nachteilig, da sie die Zellen einer Selektion in unterschiedlichen Wachstumsbedingungen von jenen, welche in vivo auftreten, unterwerfen und da sie auch erfordern, dass Zelllinien für jedes Malignom etabliert werden, wobei das Anpassungsvermögen an eine Erkrankung des Menschen außerordentlich viel schwieriger gemacht wird.
Gene, welche zur Modifizierung von Tumorzellen in vivo verwendet werden können, schließen Gene ein, welche eine DNA-Sequenz enthalten (oder die korrespondierende RNA-Sequenz kann verwendet werden), die ein intrazelluläres, sekretiertes oder Zelloberflächenmolekül kodiert, welches für den Patienten exogen ist und welches (1) für den Patienten immunogen ist, (2) Abstoßung, Regression oder beides des Tumors induziert oder (3) für die Zellen des Tumors toxisch ist. Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist die DNA- oder RNA-Sequenz jedoch ein Bestandteil, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus DNA- oder RNA-Sequenzen besteht, welche Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren kodieren, einschließlich Induktoren der Differenzierung, wie Stimulantien, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Inhibitoren/Induktoren der Differenzierung, wie TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Interleukin-1 und Interferone.
Die Vektoren, welche die DNA-Sequenz (oder die korrespondierende RNA-Sequenz) enthalten, welche gemäß der hier offenbarten Verfahren verwendet werden können, können ein eukaryotischer Expressionsvektor, der die DNA- oder die RNA-Sequenz von Interesse enthält, sein. Techniken zum Erhalten von Expression von exogenen DNA- oder RNA-Sequenzen in einem Wirt sind bekannt. Siehe zum Beispiel Korman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), (1987) 84: 2150–2154.
Dieser Vektor, wie vorstehend angegeben, kann an den Patienten in einem retroviralen oder anderem viralen Vektor-(d. h. einem viralen Vektor)-Vehikel, einem DNA- oder RNA/Liposom-Komplex oder unter Verwendung von Zell-vermitteltem Gentransfer verabreicht werden. Ferner kann der Vektor, wenn in nicht-viraler Form vorliegend, als eine DNA- oder RNA-Sequenz-enthaltende chemische Formulierung, gekuppelt an ein Trägermolekül, welches eine Bereitstellung bei der Wirtzelle ermöglicht, verabreicht werden. Ein solches Trägermolekül wird einen Antikörper, der für die Zellen spezifisch ist, bei welchen der Vektor bereitgestellt wird, oder ein Molekül, welches zur Wechselwirkung mit einem Rezeptor, der mit den Zielzellen in Zusammenhang steht, in der Lage ist, einschließen.
Zell-vermittelter Gentransfer kann gemäß hier offenbarten Verfahren verwendet werden. In dieser Weise vertraut man auf die Bereitstellung von rekombinanten Genen in lebenden Organismen durch Transfer des genetischen Materials in Zellen, welche von dem Wirt abgeleitet sind, und durch Modifizierung in Zellkultur, gefolgt von der Einbringung der genetisch veränderten Zellen in den Wirt. Eine veranschaulichende Verpackungszelllinie, welche gemäß dieser Ausführungsform verwendet werden kann, wird in Danos et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) (1988) 85: 6460 beschrieben.
Die DNA- oder RNA-Sequenz, welche das Molekül kodiert, das gemäß den hier offenbarten Verfahren verwendet wird, kann an den Patienten, welcher ein Mensch oder ein Tier verschieden von einem Menschen sein kann, entweder lokal oder systemisch verabreicht werden. Die systemische Verabreichung wird bevorzugt unter Verwendung der chemischen nicht-viralen DNA- oder RNA-Formulierung, gekuppelt an ein Trägermolekül, welches eine Bereitstellung bei den Wirtzellen ermöglicht, durchgeführt. Jedwede der Verabreichungen kann durch i. v.- oder i. m.-Injektion oder subkutane Injektion unter Verwendung von jedwedem bekanntem Mittel oder durch die Verwendung des Katheters wie hier beschrieben durchgeführt werden.
Die retroviraler Vektor-Vehikel, welche gemäß den hier offenbarten Verfahren verwendet werden, umfassen ein virales Partikel, welches von einem natürlich vorkommenden Retrovirus abgeleitet ist, welches genetisch verändert wurde, um es Replikationsfehlerbehaftet zu machen und um ein rekombinantes Gen von Interesse zu exprimieren. Nachdem das Virus sein genetisches Material bei einer Zelle bereitgestellt hat, erzeugt es nicht zusätzliches infektiöses Virus, bringt aber exogene rekombinante Gene in die Zelle ein.
In anderen viralen Vektoren ist das verwendete Viruspartikel von anderen natürlich vorkommenden Viren abgeleitet, welche genetisch verändert wurden, um sie Replikationsfehlerbehaftet zu machen und um rekombinante Gene zu exprimieren. Solche virale Vektoren können von Adenvirus, Papillomavirus, Herpesvirus, Parvovirus, usw. abgeleitet sein.
Die Sequenzen können auch als DNA- oder RNA/Liposom-Komplex verabreicht werden. Solche Komplexe umfassen ein Gemisch von Fettpartikeln, Lipiden, welche an genetisches Material binden, DNA oder RNA, was einen hydrophoben Überzug bereitstellt, was ermöglicht, dass genetisches Material in Zellen bereitgestellt wird. Diese Formulierung stellt einen nicht-viralen Vektor für Gentransfer bereit. Liposome, welche gemäß der Erfindung verwendet werden, können DOPE (Dioleylphosphatidylethanolamin), CUDMEDA (N-(5-Cholestrum-3-β-ol-3-urethanyl)-N',N'-dimethylethylendiamin) umfassen.
Wie vorstehend angegeben können auch andere nicht-virale Vektoren gemäß den hier offenbarten Verfahren verwendet werden. Diese schließen chemische Formulierungen von DNA oder RNA, gekuppelt an ein Trägermolekül (z. B. einen Antikörper oder einen Rezeptorliganden), welches eine Bereitstellung bei Wirtzellen für den Zweck des Verändern der biologischen Eigenschaften der Wirtzellen ermöglicht, ein. Der hier verwendete Ausdruck „chemische Formulierungen" betrifft Modifizierungen von Nukleinsäuren, um zu ermöglichen, dass die Nukleinsäureverbindungen an ein Protein oder Lipid oder Derivat davon, Trägermolekül, kuppeln. Solche Trägermoleküle schließen Antikörper, welche spezifisch für die Wirtzellen oder Rezeptorliganden sind, d. h. Moleküle, welche zur Wechselwirkung mit Rezeptoren in der Lage sind, die mit den Wirtzellen in Zusammenhang stehen, ein.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung werden jedoch virale Vektoren verwendet.
Die Moleküle, welche gemäß den hier offenbarten Verfahren verwendet werden können, schließen die folgenden ein: (1) Gene, welche Immunstimulantien, wie Klasse I-Histokompatibilitätsgene, Klasse II-Histokompatibilitätsgene, bakterielle Gene, einschließlich mycobakterielle (PPD) Gene, und Gene, welche Hitzeschockproteine kodieren, virale Glycoproteine-kodierende Gene, einschließlich Gingivostomatitisvirus-G-Protein, Influenzahämagglutinin und Herpesvirus-Glycoprotein β, minor Histokompatibilitätsantigene, fremde Proteine, wie Lysozym oder Rinderserumalbumin, und Onkogene, einschließlich EIA, P53 (Mutanten) und tax; (2) Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren, einschließlich Induktoren der Differenzierung, wie Stimulantien, einschließlich Interleukin-2(IL-2), IL-4, -3, -6 oder -8, Inhibitoren/Induktoren der Differenzierung, wie TNF-α oder -β, TGF-β (1, 2 oder 3), IL-1, lösliche Wachstumsfaktorrezeptoren (PDGF-, FGF-Rezeptoren), rekombinante Antikörper für Wachstumsfaktoren oder Rezeptoren, Analoga von Wachstumsfaktoren (PDGF, FGF), Interferone (α, β oder γ) und Adhäsionsmoleküle; oder (3) Toxine oder negative selektierbare Marker, einschließlich Thymidinkinase, Diphtherietoxin, Pertussistoxin oder Arzneistoff-empfindliche Proteine. Wie anderswo hier angemerkt sind die DNA- oder RNA-Sequenz, welche gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden, jedoch ein Bestandteil, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus DNA- oder RNA-Sequenzen besteht, welche Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren kodieren, einschließlich Induktoren der Differenzierung, wie Stimulantien, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Inhibitoren/Induktoren der Differenzierung, wie TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Interleukin-1 und Interferone.
Die DNA/RNA-Sequenz wird bevorzugt von einer Quelle der gleichen Spezies wie der Patient erhalten, dies ist aber nicht absolut erforderlich, und die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von DNA-Sequenzen, welche von einer Quelle einer Spezies, welche unterschiedlich von dem Patienten ist, gemäß dieser Ausführungsform bereit. In den hier offenbarten Verfahren werden Gene, welche Immunstimulantien und Toxine oder negative selektierbare Marker kodieren, entsprechend zu (1) und (3) vorstehend, bevorzugt von einer Spezies ausgewählt, welche unterschiedlich zu der Spezies ist, zu welcher der Patient gehört. Für Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren, entsprechend zu (2) vorstehend, verwendet man bevorzugt ein Gen, welches von einer Spezies erhalten wird, welche die selbe wie die Spezies des Patienten ist.
Bei der Verwendung der hier offenbarten Verfahren kann bei der Behandlung von AIDS genetisches Material, welches lösliches CD4 oder Derivate davon kodiert, verwendet werden. Bei der Behandlung von genetischen Erkrankungen, zum Beispiel Wachstumshormondefizienz, wird genetisches Material, welches die benötigte Substanz kodiert, zum Beispiel humanes Wachstumshormon, verwendet. Alle diese genetischen Materialien sind für einen Fachmann leicht erhältlich.
Hier auch offenbart wird ein Kit zur Behandlung einer Erkrankung in einem Patienten, welcher einen Katheter und eine Lösung, die entweder ein Enzym oder ein mildes Detergenz enthält, wobei der Katheter zum Einsetzen in ein Blutgefäß angepasst ist und einen Katheterhauptkörper mit einem Ballonelement enthält, welches zum Einsetzen in das Gefäß angepasst ist und sich gegen die Wände des Blutgefäßes ausdehnen kann, um so den Katheterhauptkörper an der Stelle in dem Blutgefäß zu halten, und Mittel, welche von dem Katheterhauptkörper getragen werden, zur Bereitstellung einer Lösung in dem Blutgefäß enthält, und die Lösung, welche das Enzym oder milde Detergenz enthält, ist eine physiologisch verträgliche Lösung. Die Lösung kann ein proteolytisches Enzym, wie Dispase, Trypsin, Collagenase, Papain, Pepsin oder Chymotrypsin, enthalten. Zusätzlich zu proteolytischen Enzymen können Liposen verwendet werden. Als ein mildes Detergenz kann die Lösung NP-40, Triton X100, Deoxycholat, SDS oder dergleichen enthalten.
Alternativ kann der Kit eine physiologisch verträgliche Lösung, welche ein Mittel wie Heparin, Poly-L-lysin, Polybren, Dextransulfat, ein polykationisches Material oder zweiwertige Antikörper enthält, enthalten. Diese Lösung kann auch Vektoren oder Zellen (normal oder transformiert) enthalten. Der Kit kann einen Katheter und sowohl eine Lösung, welche ein Enzym oder mildes Detergenz enthält, als auch eine Lösung, welche ein Mittel wie Heparin, Poly-L-lysin, Polybren, Dextransulfat, ein polykationisches Material oder zweiwertigen Antikörper enthält und welche gegebenenfalls Vektoren oder Zellen enthalten kann, enthalten.
Der Kit kann einen Katheter mit einem einzelnen Ballon und einer zentralen distalen Perfusionsöffnung zusammen mit verträglichen Lösungen enthalten, um eine Einbringung von Zellen in ein spezielles Organ oder Vektoren in ein Kapillarbett oder Zellen in ein spezielles Organ oder Gewebe, welche durch dieses Kapillarbett perfundiert werden, zu ermöglichen.
Alternativ kann der Kit einen Katheterhauptkörper enthalten, der zwei beabstandete Ballonelemente aufweist, welche zum Einsetzen in ein Blutgefäß, wobei beide expandierbar gegen die Wände des Blutgefäßes zum Bereitstellen einer Kammer in dem Blutgefäß sind, und zum Halten des Katheterhauptkörpers an der Stelle angepasst sind. In diesem Fall ist das Mittel zur Bereitstellung einer Lösung in der Kammer zwischen den Ballonelementen lokalisiert. Der Kit kann einen Katheter enthalten, der eine Vielzahl von Öffnungsmitteln zur Bereitstellung der Lösung in dem Blutgefäß aufweist.
So stellt die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung in einem Patienten durch Verursachen der Expression eines exogenen therapeutisches Mittel-Proteins durch eine Zelle, welche an die Wände eines Gefäßes gebunden ist, oder die Zellen eines Organs, welches durch dieses Gefäß perfundiert wird, in dem Patienten bereit, wobei das Protein die Erkrankung behandelt oder für diagnostische Zwecke nützlich sein kann. Das Verfahren kann zur Behandlung von Erkrankungen, wie eine ischämische Erkrankung, eine vasomotorische Erkrankung, Diabetes, ein Malignom, AIDS oder eine genetische Erkrankung, verwendet werden.
Das Verfahren kann exogene therapeutisches Mittel-Proteine, wie tPA und Modifizierungen davon, Urokinase, Streptokinase, sauren Fibroblastenwachstumsfaktor, basischen Fibroblastenwachstumsfaktor, Tumornekrosefaktor α, Tumornekrosefaktor β, transformierenden Wachstumsfaktor α, transformierenden Wachstumsfaktor β, atrialen natriuretischen Faktor, Thrombozytenwachstumsfaktor, Endothelin, Insulin, Diphtherietoxin, Pertussistoxin, Choleratoxin, lösliches CD4 und Derivate davon und Wachstumshormon zur Behandlung von Erkrankungen, verwenden.
Das Verfahren kann auch exogene Proteine mit diagnostischem Wert verwenden. Zum Beispiel kann ein Markerprotein, wie β-Galactosidase, zur Beobachtung von Zellmigration verwendet werden.
Es ist bevorzugt, wenn die Zellen, in welchen eine Expression des exogenen therapeutisches Mittel-Proteins erzeugt wird, Endothelzellen sind.
Andere Merkmale der hier offenbarten Verfahren werden im Verlauf der folgenden Beschreibungen, welche zur Veranschaulichung gegeben werden, offensichtlich.
Die unten angegebenen Daten zeigen die Durchführbarkeit des Endothelzelltransfers und der Gentransplantation; dass Endothelzellen stabil in situ an der Arterienwand durch Katheterisierung implantiert werden können und ein rekombinantes Markerprotein, β-Galactosidase, in vivo exprimieren.
Da die Atherogenese im Schwein Ähnlichkeiten zu Menschen aufweist, wurde ein durch Inzucht erzeugter Schweinestamm, das Yucatan-Minischwein (Charles River Laborstories, Inc., Wilmington, MA) als ein Tiermodell (1) gewählt. Eine primäre Endothelzelllinie wurde aus der inneren Jugularvene eines 8 Monate alten weiblichen Minischweins etabliert. Die Endothelzellidentität dieser Linie wurde dadurch bestätigt, dass die Zellen Wachstumscharakteristika und eine Morphologie aufwiesen, welche typisch für Schweineendothel in Gewebekultur sind. Endothelzellen exprimieren auch Rezeptoren für die acetylierte Form von Lipoprotein niedriger Dichte (AcLDL), im Gegensatz zu Fibroblasten und anderen Mesenchymzellen (2). Als auf ACLDL-Rezeptorexpression analysiert wurde, enthielten mehr als 99% der kultivierten Zellen diesen Rezeptor, wie durch fluoreszente ACLDL-Aufnahme beurteilt wurde.
Zwei unabhängige β-Galactosidase-exprimierende Endothellinien wurden nach der Infektion mit einem murinen amphotropen β-Galactosidase-transduzierenden retroviralen Vektor (BAG), welcher Replikations-fehlerbehaftet ist und sowohl β-Galactosidase- als auch Neomycinresistenz-Gene (3) enthält, isoliert. Zellen, welche diesen Vektor enthielten, wurden nach ihrer Fähigkeit, in der Gegenwart von G-418 zu wachsen, selektiert. Mehr als 90% der selektierten Zellen synthetisierten nach histochemischer Anfärbung β-Galactosidase. Die Endothelnatur dieser genetisch veränderten Zellen wurde auch durch Analyse der fluoreszenten ACLDL-Aufnahme bestätigt. Infektion mit BAG-Retrovirus wurde ferner durch Sothern-Blot-Analyse bestätigt, welche die Gegenwart von intakter proviraler DNA bei ungefähr einer Kopie pro Genom enthüllte.
Endothelzellen, welche von diesem durch Inzucht erzeugtem Stamm abgeleitet sind, der genidentisch ist, waren zur Untersuchung in mehr als einem Minischwein verwendbar und wurden in neun unterschiedlichen experimentellen Probanden getestet. Unter allgemeiner Anästhesie wurden die Oberschenkel- und Hüftarterien exponiert und ein Katheter wurde in das Gefäß eingebracht (1). Intimagewebe der Arterienwand wurden mechanisch durch energisches Bewegen eines teilweise aufgeblasenen Ballonkatheters in dem Gefäß freigelegt. Die Arterie wurde mit Heparin versetzter Salzlösung gespült und mit der neutralen Protease, Dispase (50 U/ml), inkubiert, was jedwede verbleibenden luminalen Endothelzellen entfernte. Restliches Enzym wurde schnell mit α2-Globulin in Plasma über Entleeren der Katheterballone und Ermöglichen, dass Blut durch das Gefäßsegment fließt, inaktiviert. Die kultivierten Endothelzellen, welche β-Galactosidase exprimierten, wurden unter Verwendung eines speziell gestalteten Arterienkatheters (USCI, Billerica, MA), der zwei Ballone und eine zentrale Instillationsöffnung enthielt, (1) eingebracht.
Als diese Ballone aufgeblasen wurden, wurde ein geschützter Raum in der Arterie erzeugt, in welchen durch die zentrale Öffnung 3 (1) Zellen instilliert wurden. Diese Endothelzellen, welche β-Galactosidase exprimierten, ließ man für 30 Minuten inkubieren, um ihr Binden an das freigelegte Gefäß zu ermöglichen. Der Katheter wurde dann entfernt, der Arterienzweig ligiert und der Schnitt geschlossen.
Segmente der Arterie, welche mit β-Galactosidase-exprimierendem Endothel beimpft wurden, wurden 2 bis 4 Wochen später entfernt. Eine grobe Untersuchung des Arterienprüfkörpers nach Anfärben unter Verwendung des X-gal-Chromogens zeigte multiple Bereiche von blauer Färbung im Vergleich zu einer Arterie, auf welcher nicht-infiziertes Endothel ausgesät worden war, was β-Galactosidase-Aktivität anzeigt. Lichtmikroskopie dokumentierte β-Galactosidase-Anfärbung primär in Endothelzellen der Intima in experimentell besäten Gefäßen.
Hingegen wurde kein Nachweis von einem ähnlichen Anfärben in Kontrollsegmenten, welche Endothelzellen erhielten, die keine β-Galactosidase enthielten, beobachtet. β-Galactosidase-Anfärbung war gelegentlich in tieferen Intimageweben sichtbar, was einen Einschluss oder eine Migration von ausgesätem Endothel in der vorher verletzten Gefäßwand vorschlägt. Lokale Thrombose wurde in den ersten beiden experimentellen Probanden beobachtet. Diese Komplikation wurde in darauffolgenden Untersuchungen durch Verabreichung von Acetylsalicylsäure vor dem Endothelzell-Transferverfahren und Verwendung von Heparin-Antikoagulation zum Zeitpunkt der Beimpfung minimiert. Bei Fällen von Thrombusbildung wurde β-Galactosidase-Anfärbung in Endothelzellen, welche sich aus der Gefäßwand zur Oberfläche des Thrombus erstreckten, gesehen.
Ein Hauptanliegen von Gentransplantation in vivo betrifft die Herstellung von Replikationskompetentem Retrovirus aus gentechnisch veränderten Zellen. In diesen Tests wurde dieses potentielle Problem durch die Verwendung eines Replikations-fehlerbehafteten Retrovirus minimiert. Kein Helfervirus war unter diesen Linien nach 20 Passagen in vitro nachweisbar. Obwohl fehlerbehaftete Viren wegen ihrer hohen Infektionsrate und ihrer stabilen Integration in das Wirtzellgenom (4) verwendet wurden, kann diese Vorgehensweise für Gentransfer auf andere virale Vektoren angepasst werden.
Ein zweites Anliegen bezieht die lange Dauer der Expression von rekombinanten Genen in vivo ein. Endothelzellexpression von β-Galactosidase erschien in Gefäßen, welche bis zu sechs Wochen nach der Einbringung in das Blutgefäß in der vorliegenden Untersuchung untersucht wurden, konstant.
Diese Tests haben gezeigt, dass genetisch veränderte Endothelzellen in die Gefäßwand des Yucatan-Minischweins durch Arterienkatheterisierung eingebracht werden können. Folglich kann das vorliegende Verfahren für die lokalisierte biochemische Behandlung einer Gefäßerkrankung unter Verwendung von gentechnisch verändertem Endothel als ein Vektor verwendet werden.
Eine Hauptkomplikation von momentanen Eingriffen für Gefäßerkrankung, wie Ballonangioplastie oder Einsetzen eines Implantats in ein erkranktes Gefäß, ist ein Bruch der arteriosklerotischen Plaque und Thrombusbildung an Stellen von lokaler Gewebeverletzung (5). Teilweise wird dies durch Endothelzellverletzung (6) vermittelt. Die vorliegenden Daten zeigen, dass genetisch veränderte Endothelzellen zum Zeitpunkt des Eingriffs eingebracht werden können, um lokale Thrombose zu minimieren.
Diese Technik kann auch in anderen ischämischen Situationen verwendet werden, einschließlich instabile Angina oder Myocardinfarkt. Zum Beispiel können antithrombotische Wirkungen durch Einbringen von Zellen, welche Gene für Gewebeplasminogenaktivator oder Urokinase exprimieren, erreicht werden. Diese Technologie ist auch zur Behandlung von chronischer Gewebeischämie nützlich. Zum Beispiel Bildung von angiogenen oder Wachstumsfaktoren (7) zur Stimulierung der Bildung von Kollateralgefäßen bei ernsthaft ischämischem Gewebe, wie dem Myocard. Schließlich ist somatisches Gen-Ersatz für systemisch ererbte Erkrankungen unter Verwendung von Modifizierungen dieser Endothelzellgentransfertechnik machbar.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Modulierung des Immunsystems eines Tiers durch in vivo-Transformation von Zellen des Tiers mit einem rekombinanten Gen. Die Transformation kann in einer nicht-Stellen- spezifischen oder systemischen Weise oder einer Stellen-spezifischen Weise durchgeführt werden. Wenn die Transformation in einer systemischen Weise oder an Stellen, welche verschieden von jenen sind, die Spezifität auf das Immunsystem übertragen, wie der Thymus, durchgeführt wird, dann wird das Immunsystem derart moduliert, dass es in dem Tier resultiert, welches für das Molekül empfindlich gemacht ist, das das rekombinante Gen kodiert. Wenn die Transformation in einer Stellen-spezifischen Weise durchgeführt wird und an einer Stelle lokalisiert ist, welche die Spezifität des Immunsystems bestimmt, z. B. der Thymus, wird alternativ das Immunsystem derart moduliert, dass es in dem Tier resultiert, welches für das Molekül tolerierbar gemacht ist, das das rekombinante Gen kodiert.
Der Ausdruck ,empfindlich gemacht' bedeutet, dass das Immunsystem eine stärkere Antwort auf das Molekül, welches durch die DNA kodiert wird, nach der in vivo-Transformation verglichen mit vor der Transformation zeigt. Der Ausdruck ,tolerierbar gemacht' bedeutet, dass das Immunsystem eine verringerte Antwort auf das Molekül, welches durch das rekombinante Gen kodiert wird, nach der Transformation verglichen mit vor der Transformation zeigt. So kann man ein Immunsystem derart modulieren, dass es entweder eine Resistenz oder eine Toleranz für das Molekül, welches durch die DNA kodiert wird, bereitstellt.
Beispiele von Molekülen, für welche es wünschenswert sein kann, eine Resistenz bereit zu stellen, schließen ein: Zelloberflächenmoleküle, wie Tumorantigene (karzinoembryonales Antigen), Protozoenantigene (Pneumocystis), virale Antigene (HIV gp120 und gp160, H. Influenza-Antigen und Hepatitis B-Oberflächenantigen), Lyme-Krankheit-Antigen, bakterielle Antigene und Transplantationsantigene (Klasse I oder II), ras oder andere Onkogene, einschließlich erb-A oder neu; Zytoplasmaproteine, wie das raf-Onkogen, src-Onkogen und abl-Onkogen; nukleäre Proteine, wie E1A-Onkogen, mutantes p53-Onkogen, tat, tax, rev, vpu, vpx, Hepatitis-Kernantigen, EBNA und virale Gene; und sekretierte Proteine, wie Endotoxin, Choleratoxin, TNF und Osteoklasten-aktivierender Faktor.
Beispiele von Molekülen, für welche es wünschenswert sein kann, eine Resistenz bereit zu stellen, schließen ein: Zelloberflächenmoleküle, wie Wachstumsfaktorrezeptoren, Insulinrezeptoren, Thyroidhormonrezeptoren, Transplantationsantigene (Klasse I oder II), Blutgruppenantigene und LDL-Rezeptor; Zytoplasmaproteine, wie Cytochrom P450, Galactosyltransferase, Dystrophin, Neomycinresistenzgen und bakterielles Hitzeschockprotein; nukleäre Proteine, wie Retinoblastom und transdominantes rev; und sekretierte Proteine, wie Wachstumshormon für Kleinwüchsige, Insulin für Diabetiker und Adenosindeaminase.
Es gilt als selbstverständlich, dass die Nukleinsäure, DNA, RNA oder ein Derivat davon in dem rekombinanten Gen jedweden geeigneten Ursprung aufweisen kann. Das heißt, die Nukleinsäure kann von einer natürlich vorkommenden Quelle isoliert werden oder kann synthetischen Ursprungs sein.
Das rekombinante Gen kann in die Zellen des Tiers unter Verwendung von jedwedem herkömmlichem Vektor eingebracht werden. Solche Vektoren schließen virale Vektoren, kationische Lipide, komplexiert an DNA oder RNA (DNA- oder RNA/Liposome), und DNA- oder RNA-Komplexe mit Polykationen, wie DEAE, Dextran und Polybren, ein.
Wie vorstehend angegeben kann das rekombinante Gen in Zellen in einer Stellen-spezifischen Weise eingebracht werden, um Resistenz für das Molekül, welches durch das rekombinante Gen kodiert wird, zu verleihen. Geeignete Stellen schließen z. B. Endothelzellen oder Retikuloendothelzellen im Gefäßsystem oder jedwedes spezielle Gewebe oder Organ ein. Die Form der Zubereitung, welche den Vektor und das rekombinante Gen enthält, welche in der Transformation verwendet werden, wird von dem speziellen Gewebe, welches transformiert wird, abhängen. Geeignete Zubereitungen zum Transformieren von Endothelzellen werden anderswo in dieser Beschreibung beschrieben. Zusätzlich können Zubereitungen, welche für orale oder andere Verabreichungsmittel (z. B. endoskopisch) geeignet sind, zur Bereitstellung von mukosaler Resistenz verwendet werden. Eine solche Zubereitung kann Detergenzien, Gelatinen, Kapseln oder andere Bereitstellungsvehikel einschließen, um gegen Abbau zu schützen und die Bereitstellung bei der mukosalen Oberfläche zu steigern, zusätzlich zu dem Vektor und Gen.
Alternativ kann das rekombinante Gen in einer Stellen-spezifischen Weise in eine Stelle eingebracht werden, welche die Spezifität des Immunsystems bestimmt. Der Thymus ist eine solche Stelle (siehe: A. M. Posselt et al., Science, Bd. 249, S. 1292 (1990)). Folglich kann durch Stellen-spezifisches Einbringen eines rekombinanten Gens in den Thymus das Immunsystem derart moduliert werden, dass es in einer Toleranz für das Molekül, welches durch das Gen kodiert wird, resultiert. In dieser Weise kann Transplantatabstoßung supprimiert werden. Die gleichen vorstehend beschriebenen Zubereitungen und Techniken, welche zur Stellen-spezifischen Transformation von Tumoren verwendet werden, können zum Einbringen des rekombinanten Gens in den Thymus verwendet werden.
Speziell kann die Transformationszubereitung direkt in den Thymus oder Tumor oder in die Gefäßversorgung des Thymus oder Tumors injiziert werden.
Das vorliegende Verfahren kann bei jedwedem Tier, wie Hühnchen oder Säugern wie Rindern, Pferden, Katzen, Hunden, Affen, Lemuren oder Menschen, praktiziert werden.
Wenn das rekombinante Gen unter Verwendung eines Liposoms eingebracht wird, ist es bevorzugt, zuerst in vitro die optimalen Werte für die DNA zu bestimmen: Lipidverhältnisse und die absoluten Konzentrationen von DNA und Lipid als eine Funktion von Zelltod und Transformationseffizienz für den besonderen Zelltyp, der transformiert wird, und diese Werte in der in vivo-Transformation zu verwenden. Die in vitro-Bestinimimg dieser Werte kann einfach unter Verwendung der im experimentellen Abschnitt dieser Beschreibung beschriebenen Techniken durchgeführt werden.
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Offenbarung betrifft einen Kit zur systemischen in vivo-Einbringung eines rekombinanten Gens in Zellen eines Tiers. Ein solcher Kit wird ungefähr die optimale Menge eines Trägers, wie eines Lipids, und Nukleinsäure und/oder ein Bereitstellungsmittel, z. B. ein Endoskop oder eine Spritze, einschließen. Der Kit kann auch Anweisungen zur Verabreichung der transformierenden Zubereitung enthalten. Der Träger und die Nukleinsäure können gefriergetrocknet sein und können getrennt oder vorgemischt abgepackt sein. Der Kit kann auch eine Lösung zur optimalen Rekonstitution der Komplexe des Trägers und der Nukleinsäure enthalten, welche eine wirksame Bereitstellung bei Zellen in vivo bereitstellen. Eine solche Lösung kann einen oder mehr Bestandteile, wie Puffer, Zucker, Salze, Proteine und Detergenzien, enthalten.
Es wurden im Allgemeinen die hier offenbarten Verfahren beschrieben, wobei durch Bezugnahme auf bestimmte spezielle Beispiele, welche hier nur für Veranschaulichungszwecke bereitgestellt werden und mit welchen nicht beabsichtigt ist, einschränkend zu sein, wenn nicht Anderweitiges angegeben ist, ein weitergehendes Verständnis erhalten werden kann.
Experimenteller Abschnitt:
A. Analyse von AcLDL-Rezeptorexpression in normalen und β-Galactosidase-transduzierten Schweineendothelzellen.
Endothelzellkulturen, welche vom Yucatan-Minischwein abgeleitet waren, wobei zwei Unterlinien mit BAG-Retrovirus oder 3T3-Fibroblastenkontrollen infiziert worden waren, wurden auf die Expression von AcLDL-Rezeptor unter Verwendung von fluoreszentem markiertem AcLDL analysiert.
Endothelzellen wurden von äußeren Jugularvenen unter Verwendung der neutralen Protease Dispase (8) abgeleitet. Herausgeschnittene Venensegmente wurden mit Dispase (50 U/ml in Hank-Mineralsalzlösung) gefüllt und bei 30°C für 20 Minuten inkubiert. Endothel, welches durch dieses Mittel erhalten wurde, wurde in Medium 199 (GIBCO, Grand Island, N. Y.), ergänzt mit fötalem Kälberserum (10%), 50 μg/ml Endothelzell-Wachstumsergänzungsmittel (ECGS) und Heparin (100 μg/ml), vorgehalten. Diese Zellen wurden mit BAG-Retrovirus infiziert und durch Resistenz gegen G-418 selektiert. Zellkulturen wurden mit (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3^,-tetramethylindocarbacyaninperchlorat) (Dil) AcLDL (Biomedical Technologies, Stoughton, MA) (10 μg/ml) für 4 bis 6 Std. bei 37°C inkubiert, gefolgt von drei Spülungen mit Phosphat-gepufferter Salzlösung, welche 0,5% Glutaraldehyd enthielt. Zellen wurden durch Phasenkontrast und Fluoreszenzmikroskopie visualisiert.
B. Verfahren zur Einbringung von Endothelzellen durch Katheterisierung.
Ein Zwei-Ballon-Katheter wurde zur Instillation von Endothelzellen verwendet. Der Katheter weist einen proximalen und distalen Ballon auf, jeweils 6 mm in der Länge und 5 mm in der Breite, mit einer Länge von 20 mm zwischen den Ballonen. Der zentrale Abschnitt des Katheters weist eine 2 mm-Pore, verbunden mit einer Instillationsöffnung, auf. Das Aufblasen der proximalen und distalen Ballone isoliert einen zentralen Raum, was eine Instillation von infizierten Zellen durch die Öffnung in ein einzelnes Segment des Gefäßes ermöglicht. Für eine schematische Darstellung der Zelleinbringung durch einen Katheter siehe die 1 und 2.
Die Tierpflege wurde gemäß „Principles of Laborstory Animal Care" und „Guide for the Care and Use of Laborstory Animals" (NIH-Veröffentlichungsar. 80–23, überarbeitet 1978) durchgeführt. Weibliche Yucatan-Minischweine (80 bis 100 kg) wurden mit Pentobarbital (20 mg/kg) anästhesiert, intubiert und mechanisch beatmet. Diese Probanden wurden einer sterilen chirurgischen Exponierung der Hüft- und Oberschenkelarterien unterzogen. Die distale Oberschenkelarterie wurde punktiert und der Zwei-Ballon-Katheter wurde durch den Führungsdraht in die Hüftarterie vorgerückt. Die äußere Hüftarterie wurde identifiziert; der proximale Ballon wurde teilweise aufgeblasen und proximal und distal passiert, um so das Endothel mechanisch freizulegen. Der Katheter wurde dann mit dem zentralen Raum in der Region des freigelegten Endothels positioniert und beide Ballone wurden aufgeblasen. Das freigelegte Segment wurde mit Heparin versetzter Salzlösung gespült und restliche adhärente Zellen wurden durch Instillation von Dispase (20 U/ml) für 10 min entfernt. Das freigelegte Gefäß wurde ferner mit einer Heparinlösung gespült und die BAG-infizierten Endothelzellen wurden für 30 min instilliert. Der Ballonkatheter wurde anschließend entfernt und antegrader Blutfluss wurde wieder aufgebaut. Die Gefäßsegmente wurden 2 bis 4 Wochen später herausgeschnitten. Ein Teil der Arterie wurde in 0,5%igem Glutaraldehyd für fünf Minuten platziert und in Phosphat-gepufferter Salzlösung gelagert und ein anderer Teil wurde in einem Paraffinblock für Schnittherstellung fixiert. Die Gegenwart von retroviraler exprimierter β-Galactosidase wurde durch eine histochemische Standardtechnik (19) bestimmt.
C. Analyse von Endothelzellen in vitro und in vivo.
β-Galactosidase-Aktivität wurde durch histochemisches Anfärben von (A) primären Endothelzellen von dem Yucatan-Minischwein, (B) einer Unterlinie, welche durch Infektion mit dem retroviralen BAG-Vektor abgeleitet wurde, (C) einem Segment von normaler Kontrollarterie, (D) einem Arteriensegment, welches mit Endothel instilliert wurde, das mit dem retroviralen BAG-Vektor infiziert worden war, (E) einem mikroskopischen Querschnitt der normalen Kontrollarterie und (F) einem mikroskopischen Querschnitt der Arterie, welche mit Endothel instilliert wurde, das mit dem retroviralen BAG-Vektor infiziert worden war, dokumentiert.
Endothelzellen in Gewebekultur wurden in 0,5% Glutaraldehyd vor dem histochemischen Anfärben fixiert. Die enzymatische Aktivität des E. coli β-Galactosidase-Proteins wurde zur Identifizierung von infizierten Endothelzellen in vitro und in vivo verwendet. Der β-Galactosidase-tranduzierende Mo-MuLV-Vektor (2), (BAG), wurde freundlicherweise von Dr. Constance Cepko bereitgestellt. Dieser Vektor verwendete den Wildtyp-Mo-MuLV-LTR als einen Promotor für das β-Galactosidase-Gen. Der frühe Simian-Virus 40 (SV-40)-Promotor, welcher an das Tn5-Neomycin-Resistenzgen gebunden ist, stellt Resistenz gegen den Arzneistoff G-418 bereit und wird strangabwärts des β-Galactosidase-Gens eingesetzt, wobei ein Marker zur Selektion von Retrovirus-enthaltenden β-Galactosidase-exprimierenden Zellen bereitgestellt wird. Dieses fehlerbehaftete Retrovirus wurde aus Fibroblasten-ψ-am-Zellen (3,10) hergestellt und in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) und 10% Kälberserum vorgehalten. Die Zellen wurden zweimal wöchentlich nach Trypsinierung passagiert. Der Überstand mit Titern von 10⁴ bis 10⁵/ml G-418-resistenten Kolonien wurde zu Endothelzellen bei Zweidrittel-Konfluenz gegeben und für 12 Stunden in DMEM mit 10% Kälberserum bei 37°C in 5% CO₂ in der Gegenwart von 8 μg/ml Polybren inkubiert. Virusüberstände wurden entfernt und Zellen wurden in Medium 199 mit 10% fötalem Kälberserum, ECGS (50 μg/ml) und Endothelzell-konditioniertem Medium (20%) für zusätzliche 24 bis 48 Stunden vor einer Selektion in G-418 (0,7 pg/ml eines 50%igen racemischen Gemisches) vorgehalten. G-418-resistente Zellen wurden isoliert und auf β-Galactosidase-Expression unter Verwendung von histochemischer Standardfärbung (9) analysiert. Zellen, welche stabil das β-Galactosidase-Enzym exprimieren, wurden in Dauerkultur zur Verwendung, wie benötigt, vorgehalten. Gefrorene Aliquote wurden in flüssigem Stickstoff gelagert.
D. Immuntherapie eines Malignoms durch in vivo-Gentransfer.
Ein retroviraler Vektor mit dem H-2K^S-Gen wurde hergestellt. CT26-Zellen wurden mit diesem Vektor in vitro infiziert, nach G418-Resistenz selektiert und durch Fluoreszenzgesteuerte Zellsortierung (FACS) analysiert. Tranduzierte CT26-Zellen zeigten eine höhere mittlere Fluoreszenzintensität als nicht infizierte CT26-Zellen oder CT26, infiziert mit unterschiedlichen retroviralen Vektoren. Als 10⁶ CT26-Zellen, welche H-2K^S exprimierten, subkutan in BALB/c-Mäuse (H-2^d), welche für dieses Antigen empfindlich gemacht worden waren, injiziert wurden, wurden keine Tumore über einen Zeitraum von 8 Wochen im Gegensatz zur nicht modifizierten CT26 (H-2^d)-Tumorlinie, welche normalerweise bei dieser Dosis Tumore bildet, beobachtet. Die Immunantwort auf H-2K^S kann deshalb Schutz gegen CT26-Zellen, welche dieses Antigen tragen, bereitstellen. Als jedoch mit CT26 H-2K^S und CT26 gemeinsam beimpft wurde, wurde Tumorwachstum beobachtet, was vorschlägt, dass H-2K^S Empfindlichkeit nur auf modifizierte Zellen übertrug.
Um zu bestimmen, ob Schutzwirkungen durch Einbringung von H-2K^S in wachsende CT26-Tumore erreicht werden können, wurden der rekombinante H-2K^S-Reporter oder ein β-Galactosidase-Gen in Tumore entweder mit einem DNA/Liposom oder einem retroviralen Vektor eingebracht. Tumorkapseln (0,5 bis 1 cm Durchmesser) wurden chirurgisch exponiert und multiple Nadelinjektionen (2 bis 10) beim Parenchym bereitgestellt. Mit β-Galactosidase-Reporterplasmiden kann rekombinante Genexpression leicht nach Intratumorinjektion von DNA/Liposom oder retroviralen Vektoren nachgewiesen werden.
In Mäusen, welche Intratumorinjektionen der H-2K^S-DNA/Liposom-Komplexe oder H-2K^S-retroviraler Vektor erhielten, wurde die rekombinante DNA durch PCR in dem Tumor und gelegentlich in anderen Geweben nachgewiesen. Als sie in anderen Organen gefunden wurde, wurde kein Beweis für Entzündung oder Organtoxizität pathologisch nachgewiesen. Eine Immunantwort auf das rekombinante H-2K^S-Protein war in diesen Tieren jedoch offensichtlich. Lymphozyten, welche von dem H-2K^S abgeleitet sind, aber nicht β-Galactosidase-transduzierte Tumore zeigten eine zytolytische Antwort auf H-2K^S, ob durch retrovirale Vektoren oder Liposomen bereitgestellt. Wichtiger, Lymphozyten, welche von dem H-2K^S abgeleitet sind, aber nicht β-Galactosidase-transduzierte Tiere erkannten und lysierten nicht-modifizierte CT26-Zellen, was zeigt, dass diese Stimulierung Immunreaktivität gegen genetisch nicht-modifizierte Tumorzellen induzierte.
Zur Abschätzung der Schutzwirkung der Immunantwort gegen H-2K^S wurde das Tumorwachstum in vivo quantifiziert. Als Tiere keine vorherige Empfindlichmachung für H-2K^S erhielten, zeigte einer von vier Tumoren, welche mit H-2K^S transduziert worden waren, eine Schwächung des Tumorwachstums, welche nicht vollständig war. Hingegen wurde keine Antitumorwirkung in nicht-modifizierten (n=4) oder β-Galactosidase-transduzierten Kontrollen (n=4) gesehen. Da diese Tumore zur Zeit der anfänglichen Injektion groß waren und weiterhin wuchsen, als die primäre Immunantwort erzeugt wurde, wurde ein Versuch zur Optimierung der Antitumorantwort durch Präimmunisierung von Mäusen mit bestrahlten CT26-H-2K^S-Tumorzellen und durch frühere und/oder häufigere Injektionen von Vektor unternommen. Tumore wurden an den Tagen 12 und 32 durch Intratumorinjektion von H-2K^S- oder β-Galactosidase-DNA/Liposom-Vektoren transduziert. Eine Behandlung mit dem H-2K^S-Liposomkomplex verbesserte das Überleben und schwächte das Tumorwachstum im Gegensatz zu β-Galactosidase-transduzierten Tumoren, wo es keinen Unterschied in der Wachstumsrate verglichen mit den nicht-injizierten Kontrollen gab. Eine vollständige Tumorregression wurde in zwei Mäusen durch Erhöhen der Anzahl an Injektionen und durch Bereitstellung von H-2K^S in Tumoren in einem früheren Stadium erreicht. Diese Behandlung war schützend, da Kontrolltiere fortgesetztes Tumorwachstum zeigten und nicht länger als 35 Tage überlebten.
E. Modulierung des Immunsystems.
Die Antwort auf eine Injektion von kationischen Lipiden und Plasmiden wurde nach intravenöser Injektion in BALG/c-Mäuse (6 bis 12 Wochen) bestimmt. In den ersten Experimenten wurde ein Gen, welches das H-2K^S-Molekül kodiert, durch Schwanzveneninjektion eingebracht. Zwei bis vier Wochen später wurden Milzzellen geerntet und auf ihr Vermögen, eine zytolytische T-Zellen-Antwort zu vermitteln, analysiert. Als diese Zellen unter Verwendung von ⁵¹Cr-Zielzellen (CT26-Zellen, welche das H-2Ks-Gen exprimieren) getestet wurden, wurde eine signifikante Zytolyse beobachtet, welche nicht in Tieren gesehen wurde, in welche Kontrollvektor, β-Galactosidase, injiziert worden war (siehe 3). Bis zu 25% der Zielzellen wurden bei Effektor:Ziel-Verhältnissen von 25:1 lysiert.
Zusätzlich zu dieser spezifischen zytolytischen T-Zellen-Antwort wurden serologische oder Antikörperantworten auf Gene, welche durch Expressionsvektorplasmide kodiert wurden, untersucht. Wenn ein Plasmid, welches das gp160-Molekül von HIV kodiert, injiziert wird, wird eine Antikörperantwort in behandelten Mäusen ausgelöst. Im Gegensatz zu Kontrolltieren, in welche kationische Lipide, die β-Galactosidase enthielten, injiziert worden waren, zeigten Mäuse, in welche kationische Lipide mit gp 160-Plasmid injiziert worden waren, eine Antikörperantwort auf die gp 160- und gp 120-Form dieses Moleküls durch Western-Blot-Analyse (siehe 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass systemische Verabreichung von kationisches Lipid/DNA-Komplexen erfolgreich zur Induzierung von Zell-vermittelter und Antikörper-vermittelter Immunität gegen fremde Pathogene verwendet werden kann.
F. Bestimmung der optimalen Transfektionsbedingungen.
(1) Plasmidaufbau
Ein Plasmid, welches das E. coli-lacZ-Gen unter der Kontrolle des Rous-Sarkomvirus LTS (RSV-β-gal) (Norton und Coffin, Mol. Cell. Biol., 5(2), 281–290, 1985) enthält, wurde zur Transfektion von primärem Schweineendothel und HeLa-Zellen verwendet. Zusätzlich wurde ein Plasmid, welches das lacZ-Gen unter der Kontrolle von 5'-flankierender Präproendothelin-1-DNA (–1410 bis +83) (Wilson et al., Mol. Cell. Biol., 10(9), 4854–4862, 1990) enthält, zur Transfektion von Endothelzellen verwendet. Für in vivo-Toxizitätsanalyse wurden das RSV-β-gal-Plasmid und ein Plasmid, welches von dem PLJ-Vektor abgeleitet war, welcher die cDNA enthielt, die ein H-2K^S-MHC-Klasse I-Mausgen kodierte, verwendet.
(2) Zellkultur, Transfektionsanalyse und Toxizität in vitro
Primäre Endothelzellen, welche von dem Yucatan-Minischwein (YPE-Zellen) abgeleitet sind, wurden mit Medium 199 (M199), ergänzt mit 10% FBS, 2 mM 1-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 5 μg/ml Streptomycin, inkubiert. HeLa-Zellen wurden in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), ergänzt mit 5% FBS, 2 mM 1-Glutamin, 50 U/ml Penicillin und 5 μg/ml Streptomycin, vorgehalten. Das DNA-Liposom-Gemisch wurde mit Lipidkonzentrationen von DOPE/DC-Chol zwischen 2,5 und 25 μM, gegeben zu 0,2 ml Serum-freien Medium oder Ringer-Laktatlösung, in Polystyrolröhrchen hergestellt. Nach sanftem Mischen ließ man die Lösung bei Raumtemperatur für 15 bis 20 Minuten stehen. Für Transfektionsanalyse ließ man Zellen in 60 mm-Gewebekulturschalen bei 75% Konfluenz oder höher wachsen. Die Zellen wurden zweimal mit Serum-freiem Medium oder mit Laktat versetzter Ringer-Lösung gewaschen und dann in 0,5 ml des gleichen Mediums gegeben. Die DNA-Liposom-Lösung (0,2 ml) wurde dann langsam zu den Zellen mit sanftem Mischen mit einem Endvolumen von 0,7 ml gegeben. Dies resultierte in DNA-Konzentrationen zwischen 0,7 und 7 μg/m1 (13 bis 130 nM) und Lipidkonzentrationen von 7 bis 70 μM. Man ließ die Transfektion für 1 bis 5 Stunden fortschreiten, worauf die Zellen in Medium, welches wie vorstehend beschrieben ergänzt worden war, gegeben wurden. 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion wurde die enzymatische Aktivität des E. coli β-Galactosidase-Proteins zur Identifizierung von transfizierten Zellen durch Anfärben mit dem X-gal-Chromagen verwendet. Toxizität in vitro wurde durch zytopathische Wirkung oder Trypanblau-Ausschluss abgeschätzt.
(3) Tierstudien
Für intravenöse Injektionen wurden die DNA/Liposome wie beschrieben für die in vitro-Transfektionsuntersuchungen in 0,2 ml Serum-freiem M199 oder Laktat versetzter Ringer-Lösung hergestellt. Nach 15 bis 20 min Inkubation wurde das Gemisch auf 0,7 ml verdünnt und 0,1 bis 0,2 ml dieser Verdünnung wurden dann sofort in die Schwanzvene von erwachsenen weiblichen BALG/c-Mäusen injiziert. Blut wurde vor der Injektion und 9 bis 11 Tage nach der Injektion gesammelt und die Serumchemien wurden untersucht. 2 bis 3 Wochen nach der Injektion wurden die Leber, Niere, Lunge, das Herz und Gehirn für histologische und PCR-DNA-Amplifizierungsanalyse wie vorstehend beschrieben entnommen. Intratumorinjektion von CT26-Zellen (Fearson et al., Cell, 60, 397–403, 1990) und Analyse wurden auch gemäß den vorstehenden Protokollen durchgeführt.
(4) Ergebnisse
Die optimalen Bedingungen für Transfektion und Toxizität von DNA/Liposomen wurden anfänglich in vitro bestimmt. Um maximale Transfektion ohne Toxizität in vitro zu erhalten wurden das Verhältnis von DNA zu kationischem Lipid, die absolute Konzentration von DNA oder Lipiden und die Bedingungen für das Gemisch von DNA und kationischen Lipiden untersucht. Die kationisches Lipid-Zubereitung war eine Formulierung aus zwei Verbindungen, welche Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) und Cholesten-3-β-ol-3-urethanyl-N',N'-dimethylethylendiamin (DC-chol) einschließen. Die Transfektionseffizienzen dieses Reagenzes waren gleich oder besser als jene von Lipofectin® (BRL) in mehreren Zelllinien in vitro. Endothelzellen, welche typischerweise schwer zu transfizieren sind, und HeLa-Zellen, welche leicht unter Verwendung einer Vielzahl von Techniken transfiziert werden können, wurden durch Transfektion in vitro untersucht.
Zur Bestimmung der optimalen Bedingungen zur Transfektion von Endothelzellen wurde das Lipid anfänglich bei unterschiedlichen Konzentrationen verwendet, während die DNA-Konzentration konstant gehalten wurde. Maximale Transfektionseffizienz wurde unter Verwendung von 0,7 μg/ml DNA (13 nM) und 21 μM DOPE/DC0Chol-Lipid gesehen, wobei ein starker Abfall bei der Anzahl an transfizierten Zellen bei höheren oder niedrigeren Lipidkonzentrationen auftrat. Als nächstes wurde die DNA-Konzentration verändert, als die Lipidkonzentration konstant gehalten wurde. Diese Analyse enthüllte eine ähnliche Empfindlichkeit für die DNA-Konzentration, wobei die Anzahl an transfizierten Zellen signifikant bei Inkrementen von DNA-Konzentration von nur 0,4 μg/ml abnahm. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verhältnis von DNA zu Lipid für maximale Transfektionseffizienz wichtig ist und dass die absolute Konzentration von jeder Komponente beim Bestimmen der Effizienz der Transfektion auch wichtig ist. Ein Anstieg der DNA- und Lipidkonzentration über die optimale Konzentration von 0,7 μg/ml DNA (13 nM) und 21 μM DOPE/DC-Chol verringerte die Anzahl an lebensfähigen Zellen und erhöhte die Transfektionseffizienz der verbleibenden lebensfähigen Zellen nicht. Lipidkonzentrationen von höher als 35 μM verringerten die Anzahl an lebensfähigen Zellen um 50% im Vergleich zur nicht-transfizierten Kontrolle, wogegen die optimale Konzentration von 0,7 μg/ml DNA (13 nM) und 21 μM Lipid keine Wirkung auf die Zelllebensfähigkeit nach 5 Stunden Inkubation hatte.
Um die optimalen Konzentrationen der Transfektion in einem unterschiedlichen Zelltyp zu vergleichen wurden Transfektionen an HeLa-Zellen durchgeführt. In diesem Fall wurde ein etwas unterschiedliches optimales Verhältnis von DNA und Lipid beobachtet. Spitzentransfektionseffizienzen wurden bei der gleichen Lipidkonzentration wie bei Endothelzellen (21 μg/ml) erhalten, sie variierte aber weniger bei kleinen Unterschieden in den DNA-Konzentrationen. DNA-Konzentrationen von 1,4 bis 4,2 μg/ml waren gleich wirksam. Als das Verhältnis von DNA zu Lipid beibehalten, aber die Konzentration von jedem dreifach erhöht wurde, wurden wieder sehr wenig Zellen transfiziert, was zeigt, dass sowohl das Verhältnis von DNA zu Lipid als auch die absolute Konzentration von jeder Komponente bei der Maximierung der Anzahl an transfizierten Zellen wichtig sind. Als HeLa-Zellen bei einer Konfluenz von > 80% oder höher transfiziert wurden, gab es bei Verwendung von bis zu 35 μM Lipid keine Toxizität. Als Zellen bei einer niedrigeren Sättigungsdichte transfiziert wurden, wurde die Zelllebensfähigkeit jedoch sehr stark bei nur 7 μM Lipid verglichen mit den nicht-transfizierten Kontrollzellen verringert. Diese Ergebnisse zeigen, dass sich die optimalen Bedingungen für Transfektion und Toxizität abhängig von der Zelllinie etwas unterscheiden können.
Eine andere Variable bei der Herstellung von Liposomen war die Zusammensetzung der Lösung, welche zur Erzeugung der Komplexe der kationischen Lipide mit DNA verwendet wurde. Unter mehreren analysierten Medienlösungen wurde kein wesentlicher Unterschied in der Transfektionseffizienz oder Toxizität mit M199-, McCoys-, OptiMEM- oder RPMI-Medien bemerkt. Eine signifikante Verbesserung der Transfektionseffizienz wurde jedoch unter Verwendung von Ringer-Laktatstandard beobachtet. Die Anzahl an transfizierten Zellen erhöhte sich um mehr als das 3-fache im Vergleich zu dem Serum-freien Medium, obwohl verlängerte Inkubation (≥ 2 Stunden) in einem Verlust der Zelllebensfähigkeit bei einigen Zelltypen resultierte.
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Es gilt als selbstverständlich, dass die Erfindung innerhalb des Umfangs der angefügten Patentansprüche in der Praxis unterschiedlich wie hier speziell beschrieben durchgeführt werden kann.

Claims

Verwendung einer DNA- oder RNA-Sequenz und eines Vehikels für die Sequenz, welches aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus viralen Vektoren, welche die in vivo-Bereitstellung der Sequenz für Tumorzellen ermöglichen, besteht, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung eines Tumors in einem Säuger durch direkte Injektion des Medikaments in den Tumor oder die Stelle des Tumors, so dass die Zellen des Tumors transformiert werden, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz ein Bestandteil ist, der aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus DNA- oder RNA-Sequenzen besteht, welche Immun- und Wachstumsstimulantien/-inhibitoren kodieren, einschließlich Induktoren der Differenzierung, wie Stimulantien, einschließlich Interleukin-2, Interleukin-3, Interleukin-4, Interleukin-6, Inhibitoren/Induktoren der Differenzierung, wie TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Interleukin-1 und Interferone.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz aus einer Spezies erhalten werden, welche die gleiche ist wie der Säuger.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei die DNA- oder RNA-Sequenz aus einer Spezies erhalten werden, welche unterschiedlich von der Spezies des Säugers ist.
Verwendung gemäß Anspruch 1, wobei das Vehikel ein retroviraler oder adenoviraler Vektor ist.