DE69936320T2

DE69936320T2 - Zellbasierte gentherapie für das lungensystem

Info

Publication number: DE69936320T2
Application number: DE1999636320
Authority: DE
Inventors: Duncan J. Toronto STEWART
Original assignee: An Go Gen Inc
Current assignee: Northern Therapeutics Inc Ottawa Ontario Ca
Priority date: 1999-09-23
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2008-02-21
Anticipated expiration: 2019-09-24
Also published as: EP1220679A1; IL192893A0; EP1839667A2; AU5724499A; DE69936320D1; MXPA02003131A; JP2003509463A; IL148826A; IL192893A; EP1839667A3; CA2383093A1; EP1839667B1; BR9917500A; EP1220679B1; WO2001021184A1; ES2546937T3; ATE364387T1; IL148826A0

Description

BEREICH DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft medizinische Behandlungen und Zusammensetzungen und Verfahren, die dabei von Nutzen sind. Genauer, sie betrifft Zell-basierte Gentransfer-Systeme zur Verabreichung an das Lungensystem eines Säuger-Patienten.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Zell-basierter Gentransfer ist ein bekanntes, obwohl relativ neues und experimentelles Verfahren zur Durchführung von Gentherapie an einem Patienten. Bei diesem Verfahren werden DNA-Sequenzen, die die Gene enthalten, die in den Körper des Patienten eingeführt werden sollen (die Transgene), extrazellulär hergestellt, z.B. durch Verwendung von enzymatischer Spaltung und darauffolgender Rekombination von DNA mit inserierten DNA-Sequenzen. Säugerzellen wie die eigenen Zellen des Patienten werden dann in vitro gezüchtet und so behandelt, dass sie das Transgen in einer exprimierbaren Form aufnehmen. Die Transgene können zur Säugerzelle fremd sein oder zusätzliche Kopien von Genen sein, die in der Zelle bereits vorhanden sind, um die Menge des Expressionsprodukts des Gens oder Kopien von normalen Genen, die in einem bestimmten Patienten defekt sind oder fehlen, zu erhöhen. Dann werden die Zellen, die das Transgen enthalten, in den Patienten eingeführt, so dass das Gen die benötigten Genprodukte zu therapeutischen Zwecken im Körper exprimieren kann. Die Aufnahme der fremden Gene durch die Zellen in Kultur kann durch gentechnologische Verfahren, z.B. durch Verursachen einer Transfektion der Zellen mit einem Virus, das die DNA des zu übertragenden Gens enthält, durch Lipofektion, durch Elektroporation oder durch andere akzeptierte Verfahren zum Gewinnen von transfizierten Zellen, erreicht werden. Diesem folgt manchmal das selektivem Züchten der Zellen, die das Transgen erfolgreich in einer exprimierbaren Form aufgenommen haben, so dass die Verabreichung der Zellen an den Patienten auf die transfizierten Zellen beschränkt werden kann, die das Transgen exprimieren. In anderen Fällen werden alle Zellen, die dem Aufnahmeprozess unterworfen sind, verabreicht.
Dieses Verfahren erforderte in der Vergangenheit die Verabreichung der Zellen, die das Transgen enthalten, direkt an das Körperorgan, das eine Behandlung mit dem Expressionsprodukt des Transgens benötigte. Deshalb wurden transfizierte Zellen in einem geeigneten Medium direkt in die Leber oder in den Muskel, die die Behandlung benötigten, oder über den systemischen arteriellen Kreislauf injiziert, um in das Organ zu gelangen, das eine Behandlung benötigte.
Frühere Versuche zur Einführung solcher genetisch modifizierter Zellen in den systemischen arteriellen Kreislauf eines Patienten trafen auf eine Vielzahl von Problemen. Zum Beispiel ist es schwierig, eine ausreichend hohe Aufnahme der genetisch modifizierten Zellen durch das spezifische Organ oder den spezifischen Körperteil zu sichern, in dem das Expressionsprodukt für den besten therapeutischen Nutzen benötigt wird. Dieser Mangel an Spezifität führt zur Verabreichung von überschüssigen Mengen der genetisch modifizierten Zellen, was nicht nur verschwenderisch und teuer ist, sondern auch das Risiko von Nebenwirkungen erhöht. Zusätzlich überleben viele der transplantierten, genetisch veränderten Zellen nicht, wenn sie an den systemischen arteriellen Kreislauf verabreicht werden, da sie auf relativ hohen arteriellen Druck treffen. Die Infusion von partikulären Materialien, einschließlich Zellen, an andere systemische Kreisläufe wie das Gehirn und das Herz können auf Grund von Embolisierung, d.h., Ischämie und sogar Infarkt, zu nachteiligen Folgen führen.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein neues Verfahren von zellbasiertem Gentransfer auf Säuger bereitzustellen.
Es ist eine weitere und spezifischere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Verfahren zellbasierter Gentherapie unter Verwendung von dermalen (oder anderen) Fibroblastenzellen bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue, gentechnisch veränderte Zellen, die Transgene exprimierende angiogenetische Faktoren enthalten, bereitzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass das Lungensystem eines Säugers, einschließlich eines Menschen, ein potenziell attraktives Mittel zur Einführung von genetisch veränderten Zellen in den Körper zu Zwecken der Gentherapie, d.h., zellbasiertem Gentransfer, unter Verwendung von Fibroblasten, Endothelzellen oder von Knochenmark abstammenden Vorläuferzellen des Patienten als Träger der Transgene bietet. Das Lungensystem hat eine Anzahl an einzigartigen Merkmalen, die es für einen zellbasierten Gentransfer besonders geeignet werden lassen. Somit erhöhen der geringe arterielle Druck und der hohe Oberflächenbereich mit relativ geringer Scherung im Mikrokreislauf der Lungen die Überlebenschancen der transplantierten Zellen. Eine hohe Sauerstoffanreicherung im Mikrokreislauf der belüfteten Lunge verbessert die Lebensfähigkeit der transplantierten Zellen ebenfalls.
Darüber hinaus fungiert der Lungenkreislauf al natürlicher Filter und ist in der Lage, die infundierten Zellen effizient und wirksam zurückzuhalten. Auch hat die Lunge einen doppelten Kreislauf (Lungenarterie- und Bronchialkreislauf). Dies steht in Gegensatz zu anderen systemischen Kreisläufen wie dem Gehirn und dem Herzen, wo die Infusion partikulärer Materialien wie Zellen zu den vorstehend erwähnten nachteiligen Folgen führen könnte. Die Lunge stellt ein massives vaskuläres System dar. Der hohe Oberflächenbereich des Lungen-Endothels erlaubt die Migration der transplantierten Zellen, die in dem Mikrokreislauf gefangen sind, über die Endothelschicht, um sich im perivaskulären Raum anzusiedeln.
Der Lungenkreislauf erhält, anders als irgendein anderer Kreislauf im Körper, den gesamten Ausstoß des Herzens. Entsprechend bietet er die beste Gelegenheit, ein Genprodukt in den Kreislauf freizusetzen. Diese ausgeprägte Eigenschaft der Lunge ist für die Lungen-Gentherapie und für die Behandlung von systemischen Erkrankungen sowie einer Lungenerkrankung besonders von Nutzen.
Es wird angenommen, dass sich die transfizierten Zellen nach einfacher intravenöser Injektion der transfizierten Zellen in den Patienten in den kleinen arteriell-kapillaren Übergangsregionen des Lungenkreislaufsystems ansiedeln. Intravenös verabreichte Produkte bewegen sich mit dem venösen Kreislauf auf die rechte Seite des Herzens und dann zu den Lungen. Die transfizierten Zellen, die gemäß der Erfindung verabreicht werden, scheinen sich in den kleinen arteriolär kapillären Übergangsregionen des Lungenkreislaufsystems anzusiedeln, und wandern dann von dem intraluminalen zum perivaskulären Raum hinüber, von wo sie Expressionsprodukte der Transgene an die Lungen freisetzen, wodurch das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die Behandlung von Lungenerkrankungen besonders anwendbar wird. Einige Faktoren, insbesonders stabile Faktoren, können zur Behandlung von Erkrankungen anderer Körperorgane an den allgemeinen Kreislauf sezerniert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt die Verwendung von lebensfähigen, transfizierten Säugerzellen, ausgewählt aus Fibroblasten, Endothelzellen und Vorläuferzellen, wobei die transfizierten Säugerzellen mindestens ein exprimierbares Transgen, das einen therapeutischen Faktor codiert, enthält, in der Herstellung eines Arzneimittels zur Verabreichung an einen Säugerpatienten zur Linderung eines Symptoms oder einer Störung zur Verfügung, wobei das Arzneimittel direkt in den Lungenblutkreislauf eines Säugerpatienten zu verabreichen ist.
Noch eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein ex vivo-Verfahren zur Herstellung genetischer Modifikationen von Säugerzellen, ausgewählt aus Fibroblasten, Endothelzellen und Vorläuferzellen, das die Transfektion der Säugerzellen mit mindestens einem Gen umfasst, das einen therapeutischen Faktor codiert, um transfizierte Zellen herzustellen, die in der Lage sind, den therapeutischen Faktor in vivo zu exprimieren.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Viele verschiedene Transgene, die therapeutische Faktoren codieren, können bei den Verfahren und Produkten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Während die Behandlung von Erkrankungen des Lungensystems ein Hauptmittelpunkt der Erfindung ist, ist sie nicht auf solche Behandlungen beschränkt. Therapeutische Faktoren, die durch die Transgene exprimiert werden und durch den Kreislauf an andere Körperorgane stromabwärts der Lungen abgegeben werden, liegen innerhalb des Umfangs dieser Erfindung. Transgene, die therapeutische Faktoren wie Faktor VIII für die Behandlung von klassischer Hämophilie exprimieren, und andere Koagulationsfaktoren zur Behandlung verschiedener Blutungs-Krankheiten, können verwendet werden. Andere Beispiele umfassen:
Transgene, die Hormone, zum Beispiel Wachstumshormone, für die Behandlung von Hypophysenvorderlappen-Dysfunktion, Insulin, Thyroid stimulierendes Hormon (TSH) für die Behandlung von Hypothyreose nach Hypophysenversagen und andere Hormone exprimieren;
Transgene, die vorteilhafte Lipoproteine wie Apo1 und andere Proteine/Enzyme exprimieren, die am Lipidmetabolismus teilnehmen, wie Lipoprotein-Lipase;
Transgene, die Prostacyclin und andere gefäßaktive Stoffe exprimieren;
Transgene, die Antioxidantien und freie Radikalfänger exprimieren;
Transgene, die lösliche Cytokin-Rezeptoren exprimieren, um die Auswirkungen der Schadenshöhe von Immunvermittlern zu neutralisieren, zum Beispiel löslichen TNFα-Rezeptor oder Cytokin-Rezeptor-Antagonisten, zum Beispiel IL1ra;
Transgene, die lösliche Adhäsionsmoleküle, zum Beispiel ICAM-1, exprimieren, um pathologische Zelladhäsionsprozesse wie jene, die bei entzündlichen Krankheiten auftreten, zu unterbrechen;
Transgene, die lösliche Rezeptoren für Viren exprimieren, um die Infektion von Zellen zu verhindern, z.B. CD4, CXCR4, CCR5 für HIV;
Transgene, die Cytokine, zum Beispiel IL-2, exprimieren, um Immunreaktionen zur Bekämpfung von Infektionen zu aktivieren;
das cystische Fibrosegen als Transgen.
Die in der Lunge angesiedelten transfizierten Zellen, die Transgene enthalten, die solche Faktoren und andere Produkte exprimieren, werden als systemische Quelle für den geeigneten Faktor wirken.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von Lungenhochdruck (PH). Primärer Lungenhochdruck (PPH) und andere Ursachen von PH hängen mit schweren Abnormitäten der Endothelfunktion zusammen, die wahrscheinlich eine kritische Rolle bei ihrer Pathogenese spielen. Es wurde gezeigt, dass der gefäßerweiternde, anti-thrombotische und anti-proliferative Faktor Stickstoffoxid (NO) den Lungendruck sowohl unter experimentellen als auch klinischen Bedingungen senken kann. Langfristige, Viren-basierte Verfahren können jedoch eine signifkante örtliche Entzündung hervorrufen. In anderen kürzlich durchgeführten Versuchen, PPH zu behandeln, war die Verwendung von Prostacyclin bei fortlaufender Verabreichung beteiligt; dies ist jedoch ein schwieriges und teures Verfahren, das anfällig dafür ist, Nebenwirkungen hervorzurufen.
Die vorliegende Erfindung stellt, aus dieser zweiten, bevorzugten Ausführungsform heraus, die Verwendung eines Arzneimittels zur Linderung der Symptome von PPH (und anderer Ursachen von PH), zur direkten Verabreichung an das Lungensystem eines Patienten, der daran leidet, zur Verfügung, wobei das Arzneimittel transformierte Säuger-Fibroblastenzellen dermalen oder anderen Ursprungs, Endothelzellen oder Vorläuferzellen, die aus Knochenmark stammen oder aus dem systemischen Kreislauf isoliert sind, umfasst, wobei die transfizierten Zellen mindestens ein exprimierbares Transgen, das einen angiogenetischen Faktor codiert, zur Freisetzung desselben in den Lungenkreislauf umfasst.
Spezifische Beispiele für nützliche angiogenetische Faktoren in dieser bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfassen Stickstoffoxid-Synthase (NOS); vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) in allen seinen verschiedenen bekannten Formen, d.h. VEGF₁₆₅, der das üblichste ist und für die Verwendung hierin bevorzugt wird, VEGF₂₀₅, VEGF₁₈₉, VEGF₁₂₁, VEGF_B, und VEGF_C (zusammen hierin als VEGF bezeichnet); Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) sauer und basisch), Angiopoietin-1 und andere Angiopoietine, transformierenden Wachstumsfaktor-β (TGF-β) und hepatischen Wachstumsfaktor (Scatterfaktor) und Hypoxie-induzierbaren Faktor (HIF). DNA-Sequenzen, die aus den Genen für diese angiogenetischen Faktoren bestehen, sind bekannt, und sie können durch die Standardverfahren rekombinanter DNA-Verfahren (zum Beispiel enzymatischer Spaltung und Rekombination von DNA) hergestellt und durch gentechnologische Standardverfahren wie die vorstehend erwähnten (virale Transfektion, Elektroporation, Lipofektion, Verwendung polykationischer Proteine etc.) in exprimierbarer Form in Säugerzellen eingeführt werden. VEGF ist der bevorzugte angiogenetische Faktor auf Grund der größeren Erfahrung mit diesem Faktor und der Höhe seiner wirksamen Expression in der Praxis.
Angiogenetische Faktoren wie die vorstehend erwähnten wurden kürzlich für die Verwendung als therapeutische Stoffe bei der Behandlung vaskulärer Erkrankungen vorgeschlagen. Aus dieser Arbeit jedoch kann nicht vorhergesagt werden, dass solche angiogenetische Faktoren auch bei der Behandlung von Lungenhochdruck nützlich wären. Während es nicht beabsichtigt ist, dass der Umfang der vorliegenden Erfindung auf eine bestimmte Theorie oder Vorgehensweise beschränkt werden sollte, scheint es, dass angiogenetische Faktoren zusätzlich zu ihrer Fähigkeit, die Bildung neuer Blutgefäße zu induzieren, auch andere Eigenschaften haben können. Diese anderen Fähigkeiten umfassen offenbar die Fähigkeit, die Stickstoffoxid-Produktion und Aktivität zu erhöhen und/oder die Produktion von Endothelin-1 im Lungenkreislauf zu verringern, zum Beispiel um das Gleichgewicht von Stickstoffoxid in den Lungenzellen bei der Endothelin-1-Produktion zu verbessern.
Bei der Herstellung von Zellen für die Transfektion und die nachfolgende Einführung in das Lungensystem eines Patienten wird bevorzugt, mit dermalen Fibroblasten, Säuger-Endothelzellen oder -Vorläuferzellen anzufangen, die von dem späteren Empfänger der Zell-basierten Gentransfer-Behandlung der vorliegenden Erfindung gewonnen werden. Dermale Fibroblasten werden einfach und leicht von den äußeren Hautschichten des Patienten gewonnen und durch Züchtung in vitro durch Standardverfahren bereit gemacht. Endothelzellen werden von dem späteren Empfänger z.B. durch Entfernen der Vena saphena und Züchtung der Endothelzellen geerntet. Vorläuferzellen können von Knochenmark-Biopsien gewonnen oder aus dem zirkulierenden Blut isoliert und in vitro gezüchtet werden. Die Züchtungsverfahren sind Standard-Züchtungsverfahren mit besonderen Vorsichtsmaßnahmen für die Züchtung von menschlichen Zellen mit der Absicht der Reimplantation.
Es wird in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung stark bevorzugt, dermale Fibroblasten von dem Patienten als Zellen für den Gentransfer zu verwenden. Hinsichtlich der Tatsache, dass die logische Wahl von Zelltypen für den herstellenden Fachmann ein Zelltyp wäre, der natürlicherweise im Lungensystem des Patienten zu finden ist, wie zum Beispiel glatte Muskelzellen, geschieht die Verwendung von Fibroblasten gegen die Intuition. Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass Fibroblasten für diese Arbeit ausgesprochen geeignet sind, da sie bedeutende und unerwartete Vorteile gegenüber Zellen wie glatten Muskelzellen besitzen. Es zeigt sich, dass sie leichter in Kultur zu züchten und leichter mit einem Transgen zu transfizieren sind, wenn man die geeignete Auswahl eines Verfahrens beachtet. Sie ergeben nach Einführen in das Lungensystem des Patienten einen höheren Anteil an Transfektanten und einen höheren Expressionsgrad der angiogenetischen Faktoren in vivo. Das vermutetet höhere Risiko, dass Fibroblasten, verglichen mit glatten Muskelzellen möglicherweise eine Fibrose im Lungensystem verursachen, hat sich nicht bewahrheitet.
Der somatische Gentransfer in die Empfängerzellen in vitro, d.h. das gentechnologische Verfahren, wird durch Standard- und im Handel erhältliche Herangehensweisen durchgeführt, um einen Gentransfer herbeizuführen, wie vorstehend erläutert. Das Verfahren umfasst bevorzugt die Verwendung von polykationischen Proteinen (z.B. SUPERFECT^TM) oder von Lipofektion (z.B. durch die Verwendung von GENEFECTOR^TM), Agenzien, die im Handel erhältlich sind und den Gentransfer verstärken. Jedoch können andere Verfahren außer Lipofektion und der Verwendung von polykationischem Protein wie zum Beispiel Elektroporation, virale Verfahren des Gentransfers einschließlich Adeno- und Retroviren verwendet werden. Diese Verfahren und Techniken sind dem Fachmann wohlbekannt und werden bei der Verwendung in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung leicht adaptiert. Lipofektion ist das am stärksten bevorzugte Verfahren zur Verwendung mit dermalen Fibroblasten-Wirtszellen.
Die erneute Einführung der genetisch veränderten Zellen in den Lungenkreislauf kann durch Infusion der Zellen entweder in eine periphere Vene oder eine zentrale Vene erreicht werden, von wo sie sich mit dem Kreislauf, wie vorstehend beschrieben, in das Lungensystem bewegen und sich in den kleinsten Arteriolen des Gefäßbetts der Lungen ansiedeln. Es kann auch eine direkte Injektion in den Lungenkreislauf durchgeführt werden, obwohl dies weniger praktisch ist. Die Infusion kann entweder in Bolusform, d.h. Injektion aller Zellen über einen kurzen Zeitraum, durchgeführt werden, oder sie kann durch kontinuierliche Infusion kleiner Mengen an Zellen über einen langen Zeitraum oder alternativ durch Verabreichen von Boli mit begrenzter Größe zu verschiedenen Gelegenheiten über einen Zeitraum hinweg erreicht werden.
Während die transfizierten Zellen selbst großenteils oder vollständig im Lungenkreislauf und insbesondere in den Arteriolen der Lunge des Patienten zurückgehalten werden, sind die Expressionsprodukte der Transgene davon nicht auf diese Weise beschränkt. Sie können von den transfizierten Zellen exprimiert und sezerniert werden und bewegen sich durch den normalen Kreislauf des Patienten zu anderen stromabwärts gelegenen Körperorganen, wo sie eine therapeutische Wirkung ausüben können. Somit ist, während eine bevorzugte Verwendungsmöglichkeit des Verfahrens der Erfindung in der Behandlung von Lungenerkrankungen liegt, da die Expressionsprodukte anfänglich mit dem Lungensystem des Patienten in Kontakt stehen, es nicht auf solche Behandlungen beschränkt. Die Transfektanten können Transgene enthalten, die Produkte exprimieren, die für die Behandlung anderer Körperorgane des Patienten geplant wurden. Solche Produkte, die im Lungensystem exprimiert werden, werden die anderen vorbestimmten Organe anzielen und durch das natürliche Kreislaufsystem des Patienten dorthin freigesetzt werden.
Die Erfindung wird zu veranschaulichenden Zwecken in den folgenden spezifischen, nicht einschränkenden Beispielen beschrieben.
BEISPIEL 1 – HAUTFIBROBLASTEN-EXPLANTAT-KULTUR
Fisher 344-Ratten (Charles River Co.) wurden im Alter von 21 Tagen erhalten und durch eine Überdosis mit Ketamin und Xylazin getötet. Die Haare wurden sorgfältig abrasiert und die Haut am Rücken wurde ausgeschnitten und sofort in eine phosphatgepufferte Kochsalz (PBS)-Lösung, die 2% Penicillamin und Streptomycin (Gibco BRL, Burlington, Ontario) enthielt, überführt. Das epidermale und tiefe Fett und Bindegewebe wurden unter Verwendung eines Skalpells entfernt. Das Hautgewebe wurde in quadratische Stücke von etwa 4 Millimeter geschnitten, die auf einzelne, mit Fibronectin beschichtete (Sigma Chemical Co., Mississauga, Ontario) Gewebekulturplatten (Falcon, Becton Dickinson Canada, Mississauga, Ontario) platziert wurden. Die Explantate wurden dann in Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium mit 20% fötalem Kälberserum (FKS) und 2% Penicillamin und Streptomycin (alle Gibco BRL) in einer feuchten Umgebung mit 95% O₂ und 5% CO₂ bei 37°C gezüchtet, wobei das Medium jeden zweiten Tag gewechselt wurde. Die Explantate wurden unter Verwendung von 0,05% Trypsin/EDTA (Gibco BRL) einer Passage unterzogen, sobald viele dünne, spindelförmige Zellen deutlich zu sehen waren, die auf dem Hautexplantat wuchsen, und das übrige explantierte Gewebe wurde entfernt. Die Zellen wurden dann in DMEM mit 20% FKS und 2% Penicillamin und Streptomycin gezüchtet, bis sie in weiteren Versuchen verwendet wurden.
Die Reinheit der Zellen hinsichtlich des wirksamen Typs wurde unter Verwendung von Antikörpern und Standard-Färbeverfahren untersucht, um die ungefähre Anzahl an verfügbaren, wirksamen Zellen der Fibroblastenlinie zu bestimmen.
BEISPIEL 2 – FLUORESZENZ-ZELLMARKIERUNG
Zellen zwischen der siebten und der neunten Passage wurden zu 80% Konfluenz gezüchtet und wurden dann mit dem Fluorophor Chlormethyltrimethylrhodamin (CMTMR, Molecular Probes Inc., Eugene, Oregon) markiert. CMTMR ermöglicht ein sehr genaues Verfahren zum Nachweis von ex vivo markierten Zellen, da das Molekül nach der Überführung in das Cytoplasma einer Zelle eine irreversible Veresterung und Glucuronidierung erfährt und dabei ein membranundurchlässiges Endprodukt erzeugt. Dieses aktive Fluorophor ist dann unfähig, von der ursprünglich markierten Zelle in benachbarte Zellen oder Strukturen zu diffundieren und kann, gemäß dem Hersteller, in vivo mehrere Monate lang nachgewiesen werden. Die fluoreszierende Sonde wurde durch Lösen des lyophilisierten Produkts in Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Konzentration von 10 Millimolar hergestellt. Diese Lösung wurde bei 20°C gelagert und direkt vor der Verwendung in serumfreiem DMEM auf eine Endkonzentration von 25 mikromolar verdünnt. Die Zellen wurden 45 Minuten dem Markierungsmittel ausgesetzt und dann zweimal mit PBS gewaschen, und das reguläre Medium (DMEM mit 10% FKS und 2% Penicillin und Streptomycin) wurde ersetzt. Die Zellen wurden über Nacht gezüchtet und 24 Stunden später für die Injektion in die innere Jugularvene der Fisher 344-Empfängerratten geerntet.
Durch Ausstreichen der Zellen auf Deckgläschen und deren Inkubation mit dem Fluorophor zur Bestimmung der Qualität und Dauer der Fluoreszenz mit der Zeit wurde ebenfalls eine Reihe von in vitro-Versuchen durchgeführt. Direkt nach Inkubation mit dem Fluorophor CMTMR in einer Konzentration von 25 micromolar, war zu sehen, dass 100% der gezüchteten Zellen intensiv fluoreszierten, wenn sie unter einem Rhodamin-Filter untersucht wurden. Die Zellen wurden ebenfalls 48 Stunden und 7 Tage nach der Markierung untersucht, und trotz zahlreicher Zellteilungen fluoreszierten 100% der auf dem Deckgläschen vorhandenen Zellen weiterhin leuchtend (Daten nicht gezeigt).
BEISPIEL 3 – EX-VIVO-ZELLTRANSFEKTION MIT DEM CMV-βGal-PLASMID
Der Vektor CMV-βGal (Clontech Inc., Palo Alto, California), der das beta-Galactosidasegen unter Kontrolle der Cytomegalievirus-Enhancer/Promotorsequenz enthält, wurde als Reportergen verwendet, um dem Verlauf der Transgen-Expression in vivo zu verfolgen. Die Fiborblasten wurden auf 70 bis 80% Konfluenz gezüchtet. Das optimale Verhältnis der Liposomen zur DNA wurde mit 6 μg Liposom/1 μg DNA bestimmt. Die Zellen wurden mit DMEM-Medium (keine Zusätze) gewaschen, und jeder 100 mm-Platte wurden 6,4 ml DMEM zugesetzt. 200 μl Genefector (Vennova Inc., Pablo Beach Fla) wurden in 0,8 ml DMEM verdünnt und mit 16 μg DNA (CMV- βGal), das ebenfalls in 0,8 ml DMEM verdünnt war, vermischt. Die Liposomen-Lösung wurde dann tröpfchenweise über die gesamte Oberfläche der Platte zugesetzt, die leicht geschüttelt und bei 30°C 8 Stunden inkubiert wurde. Dieses Verfahren wurde verwendet, um die Verwendung von viralen Vektoren zu vermeiden und gleichzeitig signifkante Tranfektions-Effizienzen in vitro zu erhalten. Das Genefector-Produkt ist eine optimierte Liposomen-Herstellung. Dieser Genefector-DNA-Komplex interagiert dann mit der Zelloberfläche und wird in das Cytoplasma transportiert, wonach die Plasmid-DNA zum Kern translozieren kann.
Dann wurde das Transfektions-Medium durch 20% FBS mit 2% Penicillin/Streptomycin in M199-Medium ersetzt und 24 bis 48 Stunden inkubiert. Dieses Verfahren ergab Transfektions-Effizienzen zwischen 40 und 60%.
BEISPIEL 4 – TIERCHIRURGIE UND NACHWEIS VON FLUORESZENZMARKIERTEN ZELLEN IN GEWEBE
Alle Tierversuche wurden durch das Animal Care Committee des St. Michael's Hospital, Toronto, Kanada, genehmigt. Sechs Wochen alte Fisher 344-Ratten (Charles River Co., St. Constant, Quebec) wurden durch intraperitoneale Injektion von Xylazin (4,6 Milligramm/Kilogramm) und Ketamin (70 Milligramm/Kilogramm) anästhesiert, und die Halsregion wurde rasiert und mit Jod und Ethanol gereinigt. Am mittleren Hals wurde mit einem Skalpell ein Einschnitt gemacht, und die rechten inneren und äußeren und allgemeinen Jugularvenen wurden identifiziert. Ein Plastikröhrchen von 0,02 Millimetern äußerem Durchmesser wurde mit einer 23 Gange-Nadel verbunden und mit steriler Kochsalzlösung (Baxter) gespült. Ein solches Röhrchen wurde dann zur Kannülierung der äußeren Jugularvene verwendet und wurde etwa 5 Zentimeter in die Vene dorthin eingeführt, wovon angenommen wurde, dass es die Höhe der Vena cava superior war, und der schnelle venöse Blutfluss wurde genützt, um die Lokation des Katheters zu bestätigen.
Für Versuche zur Bestimmung des Zeitverlaufs des Zellüberlebens und der Transgen-Expression in der Lunge wurden dermale Fibroblastenzellen, die mit der Fluorophore CMTMR markiert worden waren oder die mit dem Plasmidvektor CMV- βGal transfiziert worden waren, trypsiniert und bei 850 UpM über 5 Minuten zentrifugiert. Das überschüssige Medium wurde entfernt, und das Pellet von Zellen wurde in einem Gesamtvolumen von 2 Millilitern phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) erneut suspendiert. Ein Aliquot von 50 Mikrolitern dieser erneut suspendierten Zellen wurde dann entnommen und auf einem Hämocytometer-Gitter gezählt, um die Gesamtzahl der Zellen zu bestimmen, die pro Milliliter PBS vorhanden waren. Die Lösung wurde dann in Aliquots von 1 Milliliter mit etwa 500.000 Zellen geteilt, und auf sterile Weise in die Tierpflegeanstalt überführt. Diese Zellen wurden dann durch vorsichtiges Verwirbeln erneut suspendiert und über den Katheter in der äußeren Jugularvene in die Tiere injiziert. Die Lösung wurde langsam über eine oder zwei Minuten infundiert und der Katheter wurde dann vor der Entfernung erneut mit steriler Kochsalzlösung gespült. Die äußere Jugularvene wurde ligiert, der Einschnitt mit 3-0 unterbrochenen, absorbierbaren Nähten geschlossen, und die Tiere konnten sich von der Operation erholen.
30 Minuten oder 24 Stunden nach dem Einführen markierter Zellen (n = 3 für jeden Zeitpunkt) oder der Kochsalzinjektion (negative Kontrolle, n = 3) wurden die Tiere durch anästhetische Überdosierung getötet, und die Brusthöhle wurde geöffnet. Die Lungenarterie und die Luftröhre wurden mit Kochsalzlösung gespült, und die rechte und die linke Lunge wurden ausgeschnitten. Querschnitte wurden von den basalen, medialen und apikalen Segmenten beider Lungen entnommen und Proben wurden von der Leber, der Milz, der Niere und dem Gastrocnemius-Muskel gewonnen. Die Gewebeproben wurden en face in OCT-Verbindung (Sakura Finetek USA Inc., Torrance, Kalifornien) eingebettet und dann in Flüssigstickstoff schockgefroren. Schnitte von 10 Mikrons wurden von diesen gefrorenen Blöcken auf zwei verschiedenen Gewebehöhen, die mindestens 200 Mikrons voneinander getrennt waren, herausgeschnitten, und diese Schnitte wurden dann unter einem Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung eines Rhodamin-Filters untersucht, und dann wurde die Zahl der intensiv fluoreszierenden Zellen in jeder en face-Gewebeprobe gezählt.
Um eine Schätzung der Gesamtzahl der markierten Zellen zur Verfügung zu stellen, die in der gesamten Lunge vorhanden waren, wurde die Gesamtzahl der fluoreszierenden Zellen in jedem Lungenabschnitt gezählt und der Durchschnitt über die Anzahl der gezählten Schnitte gebildet. Eine mathematische Annäherung der Gesamtzahl der in der Lunge vorhandenen Zellen konnte durch Verwendung der Regel von Simpson für das Volumen eines stumpfen Kegels gemacht werden. Diese Gleichung legt dem Gesamtvolumen eines Kegels die relativen Flächen von drei verschiedenen Abschnitten zu Grunde, so dass: Volumen = [(Flächebasaler Abschnitt + Flächemittlerer Abschnitt) × Höhe der Lunge]/3 + [Flächeapikaler Abschnitt/2 × Höhe der Lunge/3] + [λ/6 × (Höhe der Lunge/3)3].
Die Höhe der Lunge wurde nach der Entnahme des Organs gemessen und die Fläche jedes Querschnitts wurde durch Planimetrie bestimmt. Die durchschnittliche Anzahl an Zellen, die in den drei Schnitten vorhanden waren, geteilt durch das Gesamtvolumen dieser Schnitte, ergab eine Schätzung der Zellzahl pro Volumeneinheit. Durch Multiplizieren dieser Zahl mit dem Gesamtvolumen konnte eine Schätzung der Gesamtzahl der Zellen innerhalb der Lunge erhalten werden. Um das Auftreten einer einzelnen Zelle in mehreren benachbarten Lungenschnitten zu korrigieren, wurden Ratten 500.000 mit CMTMR markierte Zellen injiziert und sie wurden sofort getötet. Die Lungen wurden präpariert, entnommen und auf die übliche Weise eingebettet, und 20 serielle Schnitte, jeder 5 Mikrons dick, wurden durch das Lungenparenchym hergestellt. Jeder Schnitt wurde unter Verwendung eines Rhodamin-Filters untersucht, und einzelne individuelle Zellen wurden identifiziert und ihre Gegenwart auf benachbarten Schnitten bestimmt. Die Anzahl der Schnitte mit 5 Mikrons, in der eine einzelne Zelle identifiziert werden konnte, wurde gezählt und die durchschnittlichen Ausdehnungen einer glatten Muskelzelle einer Lungenarterie in vivo wurde erhalten. Der beobachtete mittlere Durchmesser betrug 16,4 ± 1,22 Mikrons. Deshalb wurde die Gesamtzahl der Zellen, die unter Verwendung der Formel von Simpson berechnet wurde, mit 0,61 multipliziert, um die Gegenwart von einer Zelle in durchschnittlich jedem 1,64ten Schnitt von zehn Mikrons zu korrigieren.
30 Minuten nach der Abgabe der Fibroblasten wurden 373 ± 36 CMTMR-markierte Zellen/cm² innerhalb der Lungenschnitte identifiziert, die etwa 60% der Gesamtzahl der injizierten Zellen darstellten. Nach 24 Stunden gab es nur einen leichten Rückgang der mit CMTMR-markierten Zellen auf 317 ± 4/cm2 beziehungsweise 85% des 30-Minutenwerts, was ein ausgezeichnetes Überleben der transplantierten Zellen anzeigt. Das Überleben der mit CMTMR markierten Zellen zu späteren Zeitpunkten nach 2, 4, 7 und 14 Tagen und nach 1, 2, 3 und 6 Monaten wird ebenfalls bewertet, um den Zeitverlauf des Überlebens der transplantierten Zellen in der Lunge der Empfängerraten zu etablieren. In keiner der Lungen, denen unmarkierte, glatte Muskelzellen injiziert worden waren, waren hell fluoreszierende Signale zu sehen.
Im Milz-, Leber- und Skelettmuskelgewebe wurden keine fluoreszierenden Signale identifiziert. In 2 von 4 untersuchten Nieren konnten unregelmäßig fluoreszierende Signale identifiziert werden. Keine von diesen schien mit der Form einer ganzen Zelle übereinzustimmen und es wurde angenommen, dass sie jene Zellen repräsentieren, die während der Zellinjektion oder kurz danach geschert oder zerstört wurden. Zusätzlich wurden 7 Tage nach der Injektion in keinem Organ außerhalb der Lunge fluoreszierende Signale identifiziert.
BEISPIEL 5 – NACHWEIS VON BETA-GALACTOSIDASE-EXPRESSION IN GEWEBE
Zu verschiedenen Zeitpunkten nach dem Zell-basierten Gentransfer werden die Tiere getötet und die Brust wurde geöffnet. Die Lungenarterie wird mit Kochsalzlösung gespült und in die Luftröhre wird eine Kanüle eingeführt und sie wird mit 2% Paraformaldehyd gespült, bis die Lungen gut aufgepumpt sind. Transversalschnitte werden von den basalen, medialen und apikalen Segmenten beider Lungen genommen, und Proben werden von der Leber, Milz, Niere und dem Gastrocnemius-Muskel bestimmter Tiere gewonnen. Die Proben werden in 2% Paraformaldehyd mit 0,2% Glutaraldehyd über 1 Stunde inkubiert und dann in PBS gespült. Das Gewebe wird dann 18 Stunden bei 37°C mit einer chromogenen Lösung, enthaltend 0,2% 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid (X-Gal, Boehringer Mannheim, Laval, Quebec), 5 millimolar Kaliumferrocyanid (Sigma), 5 millimolar Kaliumferricyanid (Sigma), und 2 millimolar Magnesiumchlorid (Sigma), alle in phosphatgepufferter Kochsalzlösung gelöst, inkubiert. Die Proben werden dann in PBS gespült, in OCT-Verbindung (Miles Laborstories) eingebettet, in Schnitte von 10 Mikrons geschnitten und mit Neutralrot gegengefärbt.
Die en face-Schnitte werden mikroskopisch untersucht, und die Anzahl an intensiv blaugefärbten Zellen kann geschätzt werden. Da eine Platte an Zellen für die in vitro-Färbung verwendet wird, um die Transfektionseffizienz für jede Reaktionsreihe zu bestimmen, kann eine Schätzung des prozentualen Anteils an Zellen, die mit dem Reportergen-Plasmid pCMV-βGal transfiziert wurden, für jedes Tier gemacht werden. Unter Verwendung dieser Information und der mathematischen Berechnung, die für eine annähernde Berechnung der Anzahl an vorhandenen fluoreszierenden Zellen beschrieben wurde, kann eine Schätzung der Gesamtzahl an transfizierten Zellen, die zum Zeitpunkt der Tötung des Tiers übrigbleiben, gemacht werden.
Bei mehreren getrennten Transfektionsreaktionen unter Verwendung des pCMV-βGal-Plasmids kann mit den dermalen Fibroblasten in vitro eine durchschnittliche Transfektionseffizienz in einer Größenordnung von 40–50% erhalten werden. Bei transfizierten Schein-Kulturen ist keine Färbung zu sehen.
Nach der Inkubation mit der X-Gal-Chromogenlösung ist 48 Stunden nach der Injektion von mit pCMV-βGal transfizierten dermalen Fibroblastenzellen in die innere Jugularvene mikroskopisch eine Zell-basierte transgene Expression zu sehen, wobei mehrere intensiv blau gefärbte Zellen in der Lunge zu sehen sind, die mindestens 30% der ursprünglich transfizierten Zellen repräsentieren, die injiziert wurden. Ebenso wie die fluoreszenzmarkierten Zellen scheinen die meisten beta-Galactosidase exprimierenden Zellen innerhalb des distalen Mikrogefäßsystems der Lunge gelegen zu sein. In keiner der Lungen von Tieren, denen nicht-transfizierte dermale Fibroblastenzellen injiziert wurden, wird ein Hinweis auf eine beta-Galactosidase-Expression nachgewiesen. Kein Hinweis auf eine Lungenpathologie, bestimmt durch die Gegenwart eines abnormalen polymorphnucleären oder Lymphzellen-Infiltrats, einer septalen Verdickung oder alveolären Zerstörung, wird beobachtet.
BEISPIEL 6 – MONOCROTALIN-PRÄVENTIONSSTUDIEN
Um festzustellen, ob der Zell-basierte Transfer von VEGF₁₆₅ in der Lage wäre, die Entwicklung von Lungenhockdruck in einem Tiermodell der Erkrankung zu hemmen, wurden dermale Fibroblasten, die entweder mit pVEGF oder pcDNA 3,1 (einem leeren Vektor) transfiziert worden waren, wie vorstehend beschrieben, hergestellt. Die Codierungssequenz von VEGF₁₆₅ voller Länge wurde durch Durchführen einer reversen Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung von Gesamt-RNA, die aus menschlichen glatten Aorta-Muskelzellen extrahiert wurde, und den folgenden Sequenz-spezifischen Primern erzeugt: Sense 5' TCGGGCCTCCGAAACCATGA 3' (SEQ. ID NO. 1), Antisense 5' CCTGGTGAGAGATCTGGTTC 3' (SEQ. ID NO. 2). Dies erzeugte ein Fragment von 649 Bp, das in den pGEM-T-Vektor (Promega, Madison, Wisconsin) cloniert und sequenziert wurde, um die Identität zu bestätigen. Das Fragment wurde dann an der EcoRI-Restriktionsstelle in den Expressionsvektor pcDNA 3.1 cloniert, und unter Verwendung einer Differentialspaltung wurde die korrekte Orientierung bestimmt. Der inserierte Mangelvektor (pcDNA 3.1) wurde als Kontrolle für die Monocrotalin-Versuche verwendet. Die gesamte Plasmid-DNA wurde über das Hitzeschock-Transformationsverfahren in den JM109-Stamm von E. coli eingeführt, und die Bakterien wurden über Nacht in LB-Medium, das 100 Mikrogramm/Milliliter Ampicillin enthielt, gezüchtet. Daraufhin wurde das Plasmid unter Verwendung eines Endotoxin-freien Reinigungskits gemäß den Anleitungen des Herstellers (Qiagen Endotoxin-Free Maxi Kit, Qiagen Inc., Mississauga, Ontario) gereinigt, wodurch Plasmid-DNA mit einem A₂₆₀/A₂₈₀-Verhältnis von mehr als 1,75 und einer Konzentration von mindestens 1,0 Mikrogramm/Mikroliter hergestellt wurde.
Die transfizierten dermalen Fibroblasten wurden trypsiniert und in Aliquots von 500.000 Zellen geteilt. Sechs bis acht Wochen alte Fisher 344-Ratten wurden dann anästhesiert und ihnen wurden subkutan entweder 80 Milligramm/Kilogramm Monocrotalin (n = 13) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin) allein oder Monocrotalin und, über einen Katheter in die äußere Jugularvene, entweder mit 500.000 pVEGF (n = 5) oder mit pcDNA3.1 (n = 3) transfizierte Zellen injiziert.
Monocrotalin ist ein Pflanzenalkaloid, ein Metabolit, der das Lungenepithel schädigt und somit ein Tiermodell für den Lungenhochdruck zur Verfügung stellt.
Die Vene wurde abgebunden, der Einschnitt auf normale Weise geschlossen, und die Tiere konnten sich erholen. 28 Tage nach der Injektion wurden die Tiere erneut anästhesiert, und ein Millar-Micro Tip-Katheter wurde erneut über die rechte innere Jugularvene in das rechte Ventrikel eingeführt. Der systolische Druck im rechten Ventrikel wurde aufgezeichnet, und der Katheter wurde erneut in die aufsteigende Aorta eingeführt und der systemische arterielle Druck aufgezeichnet. Die Tiere wurden dann getötet und die Herzen herausgeschnitten. Die Gewichtsverhältnisse des rechten Ventrikels (RV) zum linken Ventrikel plus Septum (LV) (RV/LV-Verhältnis) wurden als Indikator für die hypertrophe Reaktion auf anhaltenden Lungenhochdruck bestimmt. Die Lungen wurden über die Lungenarterie mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung gespült und über die Luftröhre vorsichtig mit 2% Paraformaldehyd insuffliert. Die Lungensegmente wurden dann entweder in Flüssigstickstoff für die darauffolgende RNA-Extraktion schockgefroren, oder sie wurden über Eintauchen in 2% Paraformaldehyd für das Einbetten und Schneiden in Paraffin fixiert. Der systolische Druck des rechten Ventrikels und die RV/LV-Verhältnisse wurden zwischen den pVEGF-, pcDNA3.1-Gruppen und der Gruppe mit Monocrotalin allein verglichen.
Die RNA, die aus den Rattenlungen extrahiert wurde, wurde quantifiziert, und 5 Mikrogramm der Gesamt-RNA von jedem Tier wurde unter Verwendung der reversen Transkriptase des Maus-Moloney-Leukämievirus-revers transkribiert, und ein Aliquot der entstandenen cDNA wurde mit Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung der folgenden sequenzspezifischen Primer: Sense 5' CGCTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCAC 3' (SEQ. ID NO. 3), Antisense 5' GGCCTTGGTGAGGTTTGATCCGCATAAT 3' (SEQ. ID NO. 4) mit einer Anelierungstemperatur von 65°C über 30 Zyklen amplifiziert. Zehn Mikroliter einer 50 Mikroliter-Reaktion wurden auf einem 1,5% Agarosegel laufen gelassen. Der stromaufwärts gelegene Primer war innerhalb der T7-Priming-Stelle des pcDNA 3.1-Vektors lokalisiert und sollte deshalb nicht mit einem endogenen RNA-Transkript anelieren und der stromabwärts gelegene Primer war im Exon 4 der Codierungsregion von VEGF lokalisiert. Deshalb würde die erfolgreiche PCR-Region nur exogene VEGF-RNA selektiv amplifizieren. Um die RNA auf Quantität und Qualität hin zu kontrollieren, wurde ein zweites Aliquot derselben reversen Transkriptionsreaktion mit den folgenden Primern für das konstitutiv exprimierte Gen GAPDH amplifiziert: Sense 5' CTCTAAGGCTGTGGGCAAGGTCAT 3' (SEQ. ID. NO. 5); Antisense 5' GAGATCCACCACCCTGTTGCTGTA 3' (SEQ. ID. NO. 6). Diese Reaktion wurde über 25 Zyklen mit einer Anelierungstemperatur von 58°C durchgeführt. Zehn Mikroliter einer 50 Mikroliter-Reaktion wurden auf einem 1,5% Agarosegel laufen gelassen und mit dem Signal verglichen, das von der VEGF-PCR erhalten wurde.
In Paraformaldehyd fixierte Rattenlungen wurden senkrecht zu ihrer Längsachse geschnitten und en face in Paraffin eingebettet. Schnitte wurden gewonnen und unter Verwendung des von Giessen-Elastin (EVG)-Verfahrens gefärbt. Die Schnitte wurden durch einen Beobachter in einem Blindversuch untersucht, der alle Gefäße in jedem Querschnitt mit einem wahrnehmbaren Medium unter 40× Vergrößerung unter Verwendung des C+-Computerabbildungssystems maß. Die mittlere Fläche jedes Gefäßes wurde bestimmt und für jede Gefäßgröße wurde ein Durchschnitt von 0 bis 30, 30 bis 60, 60 bis 90, 90 bis 120 und größer als 120 Mikrons des äußeren Durchmessers für jedes Tier erhalten. Die Durchschnitte jeder Größe wurden zwischen der pVEGF-Gruppe, der pcDNA 3.1-Gruppe und der Gruppe mit Monocrotalin allein verglichen.
Vier Wochen nach der Injektion von Monocrotalin (n = 11) allein wurde der systolische Druck des rechten Ventrikels auf 48 ± 2 mm Hg angehoben und es gab bei den Tieren, die die mit pcDNA 3.1 transfizierten Zellen erhielten (n = 3), keine Verbesserung, wobei der durchschnittliche RVSP („right ventricular systolic Pressure"; systolischer Druck des rechten Ventrikels) bei 48 ± 2 mm Hg blieb. Bei jenen Tieren, die mit den mit pVEGF transfizierten Fibroblasten behandelt wurden (n = 5), war der RV-Druck jedoch signifikant auf 32 ± 2 mm Hg reduziert (p < 0,0001).
Wie aus dem anhaltenden Lungenhochdruck vorhergesehen wurde, war das RV/LV-Verhältnis nach der Monocrotalin-Injektion (n = 13) signifikant auf 0,345 ± 0,015 von der Grundlinie aus erhöht und war in der mit pcDNA 3.1 transfizierten Gruppe (n = 3) sehr ähnlich. Nach dem VEGF-Gentransfer (n = 5) war das Verhältnis signifikant geringer als in der mit pcDNA 3.1 transfizierten Gruppe. Kein Unterschied hinsichtich des Aortadrucks wurde bemerkt. Vier Wochen nach Injektion des Lungen-Endotheltoxins Monocrotalin und transfizierter Zellen ist das RV/LV-Verhältnis in der MCT-Gruppe und in der pcDNA 3.1-Gruppe signifikant erhöht, war jedoch bei den mit pVEGF transfizierten Tieren niedriger.
Eine morphometrische Analyse der Gewebeschnitte zeigte, dass die mittlere Fläche bei den Gefäßgruppen von 0 bis 30, 30 bis 60 und 60 bis 90 Mikrons sowohl in der mit Monocrotalin allein als auch in der mit pcDNA 3.1 behandelten Gruppe im Vergleich zu den mit VEGF behandelten Tieren signifikant erhöht war. Ähnliche Ergebnisse waren bei Tieren zu sehen, die mit dem Kontrollvektor, pcDNA 3.1, transfiziert worden waren. Nach dem Zell-basierten Gentransfer von VEGF wurde eine signifikante Abnahme der mittleren Dicke und der mittleren Fläche in Gefäßen von 0 bis 90 Mikrons externem Durchmesser beobachtet.
Unter Verwendung der auf Plasmid basierenden Primer wurde das exogene VEGF-Transkript unter Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion selektiv amplifiziert. Die RNA-Qualität und -Ladung wurden durch Amplifizieren des Haushaltsgens GAPDG, das in allen Proben übereinstimmend vorhanden war, festgestellt. Dies zeigte, dass die fremde RNA 28 Tage nach Zell-basiertem Gentransfer transkribiert wurde und dass die Gegenwart des Transkripts potenziell und das translatierte Protein wahrscheinlich bei den mit VEGF behandelten Tieren mit der Verringerung von RVSP in Verbindung standen.
Blut, das von den Tieren direkt vor der Tötung durch Punktion des linken Ventrikels entnommen wurde, wurde auf den pH-Wert, die Sauerstoffbeladung (pO2), Kohlendioxidbeladung (pCO2) und %uale Sättigung analysiert. Die Ergebnisse sind im Folgenden angegeben.
DATEN DER BLUTANALYSE
Mit VEGF/Fibroblasten transfizierte Tiere

pH-Wert pCO2 pO2 % Sättigung

Mittel (von 5 Tieren) 7,374 51,2 78,3 86,58

Standardabweichung, SA 0,0502 5,699 17,89 9,867

Mit pcDNA/Fibroblasten transfizierte Tiere

pH-Wert pCO2 pO2 % Sättigung

Mittel (von 3 Tieren) 7,35 58,333 60,8 74,4

SA 0,02 3,761 7,615 7,882
Diese Ergebnisse zeigen vorläufig an, dass die arterielle O₂-Spannung und – Sättigung in der mit VEGF transfizierten Gruppe besser ist als bei Tieren, die null-transfizierte Zellen erhielten. Dies stimmt mit der Verbesserung der pulmonalen Hämodynamik und der vaskulären Morphologie der Lunge überein und spricht gegen eine signifikante Verschiebung von rechts nach links, wie sie in Shunts von Arterie zu Vene in der Lunge auftreten könnte.
Die Erzeugung einer „Shunt"-Bildung neuer Wege zwischen den Arterien und den Kapillaren des pulmonalen Systems, wobei die Venen umgangen werden und dadurch die Aufnahme des Blutsauerstoffs begrenzt wird, tritt gemäß vorläufiger Anzeichen nicht in einem problematischen Ausmaß auf.
BEISPIEL 7 – MONOCROTALIN-UMKEHRSTUDIEN
Um festzustellen, ob der dermale, auf Fibroblastenzellen basierte Gentransfer von VEGF₁₆₅ in der Lage wäre, das Fortschreiten eines etablierten Lungenhochdrucks in einem Tiermodell der Erkrankung umzukehren oder zu verhindern, werden sechs bis acht Wochen alten Fisher 344-Ratten 80 Milligramm/Kilogramm Monocrotalin subkutan injiziert. 14 Tage nach der Monocrotalin-Injektion werden die Tiere anästhesiert und ein Miller-Katheter wird in das rechte Ventrikel eingeführt und der RV-Druck aufgenommen. Dermale Fibroblastenzellen, die entweder mit pVEGF oder pcDNA 3.1 transfiziert waren, werden dann in Aliquots von 500.000 Zellen in die äußere Jugularvene injiziert, und die Tiere konnten sich erholen. 28 Tage nach der Monocrotalin-Injektion und 14 Tage nach dem Zell-basierten Gentransfer werden die Tiere erneut anästhesiert und ein Millar-Micro Tip-Katheter wird erneut über die rechte innere Jugularvene in das rechte Ventrikel eingeführt. Der rechte ventrikuläre systolische Druck (RVSP) wird aufgenommen, und der Katheter wird dann in die aufsteigende Aorta eingeführt und der systemische arterielle Druck aufgenommen. Die Tiere werden dann getötet und die Herzen ausgeschnitten. Die RV/LV-Verhältnisse werden als Indikator der hypertrophen Reaktion auf langdauernden Lungenhochdruck bestimmt. Wenn die rechten ventrikulären systolischen Drücke und die RV/LV-Verhältnisse zwischen den pVEGF- und pcDNA 3.1-Gruppen miteinander verglichen werden, wird herausgefunden, dass der RVSP zwei Wochen nach der Monocrotalin-Injektion erhöht ist, und bei den Tieren, die mit pcDNA 3.1 transfizierte Zellen erhielten, ist der Druck vier Wochen nach der Monocrotalin-Verabreichung weiter auf 55 ± 5 mm Hg erhöht. Bei den mit pVEGF behandelten Tieren steigt der RVSP jedoch nur um eine geringe Menge an. Vier Wochen nach Injektion des pulmonalen endothelialen Toxins Monocrotalin steigt der RVSP in der pcDNA 3.1-Gruppe signifikant an, ist jedoch in den mit pVEGF transfizierten Tieren signifikant verringert.
Das RV/LV-Verhältnis war in der pcDNA-Gruppe signifikant erhöht, aber nach dem VEGF-Gentransfer war das Verhältnis signifikant reduziert. Es wird kein Unterschied im Aortadruck beobachtet. Vier Wochen nach der Injektion von Monocrotalin ist das Verhältnis in der pcDNA 3.1-Gruppe weiter erhöht, ist jedoch bei den mit pVEGF transfizierten Tieren signifikant reduziert.
DISKUSSION
Die vorliegende Erfindung liefert Anhaltspunkte für einen erfolgreichen nicht-viralen Gentransfer zum Lungen-Gefäßsystem unter Verwendung transfizierter Fibroblasten und zeigt unter Verwendung dieses Ansatzes eine mögliche therapeutische Wirksamkeit einer angiogenen Strategie bei der Behandlung von PH zur Verfügung. Dieses Verabreichungsverfahren hing mit einem hohen prozentualen Anteil von Zellen, die bei 48 Stunden in der Lunge zurückgehalten wurden, wie sowohl durch das Fluoreszenz-Markierungsverfahren als auch durch die Reportergen-Untersuchungen unter Verwendung von beta-Galactosidase bestimmt. wurde, und mit mäßiger, jedoch andauernder Genexpression über 14 Tage zusammen. Diese Ergebnisse entsprechen grobgesehen jenen, die früher mit einem auf Viren basierenden Verfahren der intravaskulären Gen-Verabreichung an das Lungen-Gefäßsystem gezeigt wurden (vgl. Schachtner, S.K., J.J. Rome, R.F. Hoyt, Jr., K.D. Newman, R. Virmani, D.A. Dichek, 1995. In vivo adenovirus-mediated gene transfer via the pulmonary artery of rats. Circ. Res. 76:701–709; und Rodman, D.M., H. San, R. Simari, D. Stephan, F. Tanner, Z. Yang, G.J. Nabel, E.G. Nabel, 1997. In vivo gene delivery to the pulmonary circulation in rats: transgene distribution and vascular inflammatory response. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16:640–649).
Jedoch vermeidet das Zell-basierte Verfahren, das durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt wird, die Verwendung eines potenziell immunogenen viralen Konstrukts, war nicht mit einer signifikanten pulmonalen oder systemischen Entzündung assoziiert und erlaubt eine stärker selektive transgene Expression innerhalb des Lungen-Mikrogefäßsystems und insbesondere das Targeting der transgenen Expression, die in der distalen Lungenarteriolen-Region lokalisiert ist, die vor allem für die Bestimmung des pulmonalen vaskulären Widerstands und deshalb die PH verantwortlich ist.
Die vorliegende Erfindung spricht mehrere Schlüsselfragen an, die mit der Machbarkeit eines Zell-basiertem Gentransferansatzes für den Lungenkreislauf in Verbindung steht, einschließlich des Überlebens von genetisch veränderten Zellen und der Selektivität ihrer Lokalisierung und der transgenen Expression in den Lungen. Implantierte Zellen wurden durch die Lungen wirksam behalten.
Das Ergebnis, dass sich die meisten Zellen innerhalb von kleinen Lungenarteriolen aufzuhalten scheinen, stimmt mit der normalen physiologischen Rolle überein, die die Lunge als anatomischer Filter spielt, und es wäre somit zu erwarten, dass sich relativ große Partikel wie resuspendierte Zellen in dem Mikrogefäßsystem der Lunge ansiedeln würden. Dieses ,Targeting' von Zellen auf stark selektive Weise auf das prökapilläre Resistenz-Gefäßbett kann sich jedoch bei der Behandlung bestimmter Erkrankungen der Lungengefäße als sehr nützlich erweisen. Die Überexpression eines vasoaktiven Gens auf der Ebene der distalen Arteriole könnte eine stark lokalisierte Wirkung in einer Gefäßregion bereitstellen, die bei der Kontrolle der pulmonalen Gefäßresistenz kritisch ist, und könnte die biologischen Konsequenzen des Gentransfers verstärken. In der Tat trat die lokale Reduktion von RVSP, die in mit Monocrotalin behandelten Tieren, die VEGF transfizierte Zellen erhielten, ohne entsprechende Verringerung der systemischen Drücke auf, wodurch die Spezifität dieses Transfektionsverfahrens hervorgehoben wird. Dieser Ansatz kann deshalb signifikante Vorteile gegenüber anderen pulmonalen selektiven Gentransfer-Strategien wie der endotrachealen Genzuführung, die eine vorwiegend bronchiale Überexpression ergibt, oder dem auf Katheter basierenden Lungengefäß-Gentransfer bieten, der diffuse makrovaskuläre und systemische Überexpression hervorruft (vgl. Rodman, D.M., H. San, R. Simari, D. Stephan, F. Tanner, Z. Yang, G.J. Nabel, E.G. Nabel, 1997. In vivo gene delivery to the pulmonary circulation in rats: transgene distribution and vascular inflammatory response. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16:640–649; und Nabel, E.G., Z. Yang, D. Muller, A.E. Chang, X. Gao, L. Huang, K.J. Cho, G.J. Nabel, 1994. Safety and toxicity of catheter gene delivery to the pulmonary vasculature in a Patient with metastatic melanoma. Hum. Gene Ther. 5: 1089–1094).
Diese signifikante Wirkung trat trotz einer insgesamt relativ geringen Masse organspezifischer Transfektion auf und war wahrscheinlich der Tatsache zuzuschreiben, dass die transfizierten Zellen, auf Grund ihrer Größe, auf die präkapillären Lungen-Resistenz-Gefäße gerichtet waren, die bei der Kontrolle des Lungendrucks eine kritische Rolle spielen. Dieses Verfahren des pulmonalen vaskulären Gentransfers kann durch Minimieren des Gesamt"ladung" von fremdem Transgen, das dem Körper zugeführt wird, Vorteile gegenüber vorhandenen Verfahren haben und kann deshalb theoretisch das Auftreten von unerwünschten Nebenwirkungen reduzieren.
Sequenzprotokoll

Claims

Verwendung von lebensfähigen, transfizierten Säugerzellen, ausgewählt aus Fibroblasten, Endothelzellen und Vorläuferzellen, wobei die transfizierten Säugerzellen zumindest ein exprimierbares Transgen enthalten, das einen angiogenen oder vasoaktiven Faktor codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung einer Lungenkrankheit oder Symptomen davon in einem Patienten, wobei das Arzneimittel direkt in den Lungenblutkreislauf eines Säugerpatienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Säugerzellen Hautfibroblasten sind.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der angiogene Faktor vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Angiopoietin-1, Transformierender Wachstumsfaktor-β, hepatischer Wachstumsfaktor (Scatterfaktor) oder Hypoxie-induzierbarer Faktor (HIF) ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der angiogene Faktor vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor, VEGF, ist.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Säugerzellen von dem späteren Empfänger der transfizierten Zellen stammen.
Verwendung nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Lungenkrankheit Lungenhochdruck ist.
Verwendung von ex vivo genetisch veränderten Säugerzellen, ausgewählt aus Hautfibroblasten, Endothelzellen und aus dem Knochenmark stammenden Vorläuferzellen, die zumindest ein exprimierbares Transgen enthalten, das mindestens ein Genprodukt nach Verabreichung im Lungenkreislauf exprimieren kann, wobei das Transgen einen angiogenen Faktor, Stickoxidsynthase, ein Lipoprotein, eine vasoaktive Substanz, ein Antioxidans, einen freien Radikalfänger, einen löslichen Cytokinrezeptor, ein lösliches Adhäsionsmolekül, einen löslichen Rezeptor für ein Virus oder ein Cytokin oder das Cystische Fibrose-Gen codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Durchführung von Gentherapie in einem Säugerpatienten, wobei das Arzneimittel direkt in das Lungensystem des Säugerpatienten zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 7, wobei die genetisch veränderten Zellen Hautfibroblastenzellen sind.
Verwendung nach Anspruch 7 oder 8, wobei das exprimierbare Transgen ein Gen ist, das einen angiogenen Faktor codiert.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 9, wobei das exprimierbare Gen ein Gen ist, das einen angiogenen Faktor codiert, ausgewählt aus Stickoxidsynthase, vaskulärem endothelialem Wachstumsfaktor, Fibroblasten-Wachstumsfaktor, Angiopoietin-1, Transformierendem Wachstumsfaktor-β und hepatischem Wachstumsfaktor.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei der angiogene Faktor vaskulärer endothelialer Wachstumfaktor, VEGF, ist.
Verwendung von ex vivo genetisch veränderten Hautfibroblastenzellen, die ein exprimierbares Transgen enthalten, das einen angiogenen Faktor codiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Linderung der Symptome von Lungenhochdruck in einem daran leidenden Säugerpatienten, wobei das Arzneimittel direkt in das Lungenkreislaufsystem des Patienten zu verabreichen ist.