JP2003509463A

JP2003509463A - 肺系のための細胞ベースの遺伝子治療

Info

Publication number: JP2003509463A
Application number: JP2001524610A
Authority: JP
Inventors: スチュワート，ダンカン，ジェー．，
Original assignee: アン−ゴー−ジェンインコーポレーテッド
Priority date: 1999-09-23
Filing date: 1999-09-23
Publication date: 2003-03-11
Also published as: EP1220679B1; ES2546937T3; EP1220679A1; ATE364387T1; CA2383093A1; EP1839667A3; AU5724499A; WO2001021184A1; DE69936320D1; MXPA02003131A; BR9917500A; EP1839667B1; IL148826A; IL192893A0; IL192893A; DE69936320T2; IL148826A0; EP1839667A2

Abstract

(57)【要約】血管新生促進因子または他の治療因子をコードしている発現可能なトランス遺伝子を含む真皮または他の起源のトランスフェクトされた線維芽細胞を、患者の肺循環器系に投与することによって、細胞ベースの遺伝子転移を行う。細胞が発現してトランス遺伝子の発現産物を分泌し、これが発現部位で局所的に作用し、あるいは他の身体器官へ患者の循環器系によって運ばれる場合もある。この方法は、発現される血管新生促進因子による肺高血圧症の治療において、特に有用である。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）本発明は医学的治療および組成物、およびその有用な手順に関する。詳細には
本発明は、ホ乳類患者の肺系への投与用の細胞ベースの遺伝子導入システムに関
する。

【０００２】（発明の背景）細胞ベースの遺伝子導入は知られているが、患者の遺伝子治療を行うための比
較的新しく実験的な技法である。この手順では、患者の身体に導入されるのが望
ましい遺伝子（導入遺伝子）を含むＤＮＡ配列が細胞外で、たとえば酵素による
切断、その後の挿入ＤＮＡ配列を用いたＤＮＡの組換えを使用することによって
作製される。次いで患者自身の細胞などのホ乳類細胞をｉｎｖｉｔｒｏで培養
し、発現できる形で導入遺伝子を取り込むように処理する。導入遺伝子はホ乳類
細胞にとって外来でもよく、既に細胞中に存在する遺伝子の追加的なコピーであ
ってもよく、特定の患者において欠失しているか無くなっている、遺伝子の発現
産物の量または正常な遺伝子のコピーの量を増加させる。ついで、治療目的には
、身体中で必要とされる遺伝子産物を遺伝子が発現できるように導入遺伝子を含
む細胞が患者に導入される。たとえばリポフェクション、エレクトロポレーショ
ン、またはトランスフェクトされた細胞を得るための他の認められている手段に
よって、転移される遺伝子のＤＮＡを含むウイルスを用いて細胞のトランスフェ
クションを引き起こすなどの、遺伝子工学的な技法によって、培養中の細胞によ
る外来性の取り込みを行わせることができる。時にはこれに、患者への細胞の投
与は導入遺伝子を発現するトランスフェクトされた細胞に限られるように、発現
できる形で導入遺伝子を首尾よく取り込んだ細胞を選択する培養が続く。他の場
合は、取り込みプロセスにかけた細胞すべてを投与する。

【０００３】過去においてこの手順は、導入遺伝子の発現産物による治療が必要な身体の器
官に導入遺伝子を含む細胞を直接投与することを必要とした。したがって、適切
な媒体中のトランスフェクトされた細胞が治療を必要とする肝臓または筋肉に直
接注入されるか、または全身性動脈循環器系を介して注入されて、治療を必要と
する器官に入るようにした。

【０００４】このような遺伝学的に改変された細胞を患者の全身性動脈循環器系に導入する
これまでの試みは、いくつかの問題点に遭遇してきた。たとえば、最良の治療的
な利点のために遺伝子発現産物が必要とされる特定の器官または身体部分付近で
の遺伝学的に改変された細胞の非常に高度な同化を保証するのは困難であった。
特異性がないことは遺伝学的に改変された細胞を過剰量投与することにつながり
、これは浪費的で高価であるばかりでなく、副作用の危険性が増大する。さらに
移植される遺伝学的に改変された細胞の多くは、全身性動脈循環器系に投与され
ると生存できない。なぜなら細胞は、比較的高い動脈圧に遭遇するからである。
細胞を含めた粒子状物質を脳および心臓などの他の全身性循環器系に注入するこ
とによって、塞栓形成による悪い結果、すなわち局所貧血およびさらには梗塞に
つながる可能性がある。

【０００５】本発明の一目的は、ホ乳類への細胞ベースの遺伝子導入の新規な手順を提供す
ることである。

【０００６】本発明の他の目的は、真皮（または他の）線維芽細胞を使用する細胞ベースの
遺伝子治療の新規な手順を提供することである。

【０００７】本発明の他の目的は、血管新生促進因子を発現する導入遺伝子を含む、新規な
遺伝子工学的に処理した細胞を提供することである。

【０００８】（発明の概要）本発明は、導入遺伝子の担体として患者の線維芽細胞、内皮細胞および骨髄に
由来する前駆細胞を使用する遺伝子治療（すなわち細胞ベースの遺伝子導入）の
目的で、ヒトを含めたホ乳類の肺系は遺伝学的に改変された細胞を身体に導入す
る潜在的に魅力的な手段を提供するという発見に基づく。肺系には、それ自体を
細胞ベースの遺伝子導入に非常に適合したものにするいくつかの特有の特徴があ
る。したがって、肺のミクロ循環器系の低い動脈圧および比較的せん断力の低い
大きな表面積によって、移植された細胞が生存するチャンスが増大する。換気型
の肺のミクロ循環器系の多量の酸素注入によっても、移植された細胞の生命力が
向上する。

【０００９】さらに、肺循環器は天然のフィルタとして機能し、注入した細胞を効率的かつ
効果的に保持することができる。さらに、肺は２つの循環器（肺動脈および気管
支）を有する。これは細胞などの粒子状物質の注入が前述の悪い結果につながる
可能性がある脳および心臓などの他の全身性循環器とは対照的である。肺は多量
の血管系を持つ。肺内皮の表面積が広いことによって、ミクロ循環器系中で捕ら
えられた移植された細胞が内皮層を越えて移動し血管周囲の空間に住みつくこと
が可能になる。

【００１０】身体の他のいかなる循環器とも異なり、肺循環器は心臓から出る物すべてを受
け取る。したがって肺循環器は、遺伝子産物を循環器中に放出するための最大の
便宜（ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ）を提供する。肺のこの際だった性質は肺の遺伝
子治療、全身性疾患および肺疾患の治療に特に有用である。

【００１１】トランスフェクトされた細胞の患者への簡単な静脈内注射後にトランスフェク
トされた細胞は肺循環器系の小さな動脈−毛細管移行領域に留まると考えられて
いる。静脈内に投与される産物は静脈の循環と共に心臓の右側、次いで肺へと移
動する。本発明に従って投与されるトランスフェクトされた細胞は肺の循環器系
の小さな動脈−毛細管移行領域に留まるようであり、次いで管腔から血管周囲の
空間に移動し、そこから導入遺伝子の発現産物を肺に送達し、本発明の方法を肺
疾患の治療に特に適用できるものにする。他の身体器官の疾患を治療するために
、いくつかの因子、特に安定した因子を全身性呼吸器に分泌することができる。

【００１２】したがって本発明の第１の態様によると、ホ乳類患者の遺伝子治療を行うため
の方法が提供され、この方法は線維芽細胞、内皮細胞および骨髄に由来する前駆
細胞から選択される遺伝学的に改変されたホ乳類細胞を患者の肺系へ投与するこ
とを含み、投与後に肺循環器において少なくとも１つの遺伝子産物を生成するこ
とができる少なくとも１つの発現可能な導入遺伝子を前記細胞が含む。

【００１３】本発明の他の態様によると、線維芽細胞、内皮細胞および前駆細胞から選択さ
れる遺伝学的に改変されたホ乳類細胞が提供され、前記細胞は治療因子をコード
している少なくとも１つの発現可能な導入遺伝子を含む。

【００１４】本発明の他の態様では、疾患の症状を軽減させるためにホ乳類患者に投与する
ための薬剤の調製に、線維芽細胞、内皮細胞および前駆細胞から選択される生命
力のあるトランスフェクトされたホ乳類細胞を使用することを提供し、前記トラ
ンスフェクトされたホ乳類細胞は治療因子をコードしている少なくとも１つの発
現可能な導入遺伝子を含む。

【００１５】本発明の他の態様は、線維芽細胞、内皮細胞および前駆細胞から選択されるホ
乳類細胞の遺伝学的改変体を調製する方法であり、この方法は前記ホ乳類細胞を
治療因子をコードしている少なくとも１つの遺伝子を用いてトランスフェクトし
て、ｉｎｖｉｖｏで前記治療因子を発現することができるトランスフェクトさ
れた細胞を生成するすることを含む。

【００１６】（好ましい実施形態の説明）本発明の方法および産物においては、治療因子をコードしている非常にさまざ
まな導入遺伝子を使用することができる。肺系疾患の治療は本発明の主な焦点で
あるが、本発明はこのような治療だけに限られない。導入遺伝子によって発現さ
れ、肺の下流の他の身体器官の循環器によって送達される治療因子は、本発明の
範囲内である。古典的な血友病の治療用のＦａｃｔｏｒＶＩＩＩなどの治療因
子、およびさまざまな出血障害を治療するための他の凝固因子を発現する導入遺
伝子を使用することができる。他の例には以下のものがある。

【００１７】ホルモン、たとえば脳下垂体不全の治療用の成長ホルモン、インシュリン、甲
状腺不全および下垂体障害を治療するためのチロイド刺激ホルモン（ＴＳＨ）、
および他のホルモンを発現する導入遺伝子、Ａｐｏ１などの有用なリポタンパク質、リポタンパク質リパーゼなどの脂質代
謝に関係がある他のタンパク質／酵素を発現する導入遺伝子、プロスタサイクリンおよび他の血管作動性物質を発現する導入遺伝子、抗酸化物およびフリーラジカルスカベンジャーを発現する導入遺伝子、免疫仲介体のレベルを低下させる作用を中和するための可溶性サイトカイン受
容体（たとえば可溶性ＴＮＦα受容体）、またはサイトカイン受容体アンタゴニ
スト（たとえばＩＬ１ｒａ）を発現する導入遺伝子、炎症性疾患において起こるような病原性細胞接着プロセスを阻害するために、
可溶性接着分子（たとえばＩＣＡＭ−１）を発現する導入遺伝子、細胞の感染を阻害するための、ウイルスの可溶性受容体（たとえばＨＩＶ用の
ＣＤ４、ＣＸＣＲ４、ＣＣＲ５）を発現する導入遺伝子、感染との戦闘用に免疫応答を活性化させるための、サイトカイン（たとえばＩ
Ｌ−２）を発現する導入遺伝子、導入遺伝子としてののう胞繊維症遺伝子。

【００１８】肺に留まりこのような因子および他の産物を発現する導入遺伝子を含むトラン
スフェクトされた細胞は、適切な因子の全身性の源として作用するはずである。

【００１９】本発明の１つの好ましい態様は、肺高血圧症（ＰＨ）の治療である。原発性肺
高血圧症（ＰＰＨ）および他のＰＨの原因は、内皮機能の重度の異常性と関係が
あり、これはその発病において重要な役割を果たしているようである。血管拡張
剤、抗トロンビンおよび抗増殖因子、一酸化窒素（ＮＯ）は、実験条件および臨
床条件の両方において肺の圧力を低下させることが証明されている。しかしなが
ら、長期のウイルスベースの方法によって、重大な局部的炎症を引き起こす可能
性がある。ＰＰＨを治療するための以前の他の試みはプロスタサイクリンの使用
を伴ない、連続的な投与が使用されるが、これは困難で高価な手順であり、副作
用が生じがちである。

【００２０】この第２の好ましい態様では、本発明はＰＰＨの症状（および他のＰＨの原因
）を軽減する方法を提供し、この方法はそれらに苦しむ患者の肺系に真皮または
他の起源の形質転換されたホ乳類線維芽細胞、骨髄に由来するかあるいは全身性
循環器から単離された内皮細胞または前駆細胞を投与することからなり、前記ト
ランスフェクトされた細胞は肺循環器に切り離すための血管新生促進因子をコー
ドする少なくとも１つの発現可能な導入遺伝子を含むものである。

【００２１】本発明のこの好ましい態様における有用な血管新生促進因子の具体例には一酸
化窒素シンターゼ（ＮＯＳ）、あらゆるさまざまな知られている形の血管内皮細
胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、すなわち最も一般的で本明細書において使用するのに
好ましいＶＥＧＦ_１６５、ＶＥＧＦ_２０５、ＶＥＧＦ_１８９、ＶＥＧＦ_１２１、
ＶＥＧＦ_ＢおよびＶＥＧＦ_Ｃ（本明細書では集合的にＶＥＧＦと呼ぶ）、線維芽
細胞増殖因子（ＦＧＦ、酸性および塩基性）アンギオポエチン−１およびアンギ
オポエチン、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）、肝細胞増殖因
子（細胞分散因子）および低酸素症誘導因子（ＨＩＦ）がある。これらの血管新
生促進因子の遺伝子を構成しているＤＮＡ配列は知られており、組換えＤＮＡ技
術の標準的な方法（たとえばＤＮＡの酵素による切断および組換え）によって作
製することができ、前述のような標準的な遺伝子工学技術（ウイルスによるトラ
ンスフェクション、エレクトロポレーション、リポフェクション、ポリカチオン
性タンパク質の使用など）によって発現可能な形でホ乳類細胞に導入される。こ
の因子に関する多大な経験および実際の効果的な発現レベルのために、ＶＥＧＦ
は好ましい血管新生促進因子である。

【００２２】血管の疾患の治療において治療用物質として使用するものとして、前述のよう
な血管新生促進因子が以前から提案されていた。しかしながら、この研究からは
、このような血管新生促進因子が肺高血圧症の治療においても非常に有用であろ
うことは、予測できない。本発明の範囲が何らかの特定の理論または操作の形態
に限られるべきであるとは考えていないが、血管新生促進因子は、新しい血管形
成を誘導する能力に加えた諸性質を有している可能性もあるようである。これら
の他の性質には、肺循環器において一酸化窒素生成および活性を増大させる、お
よび／またはエンドセリン−１の生成を低下させる能力が含まれ、したがってエ
ンドセリン−１生成における肺細胞の一酸化窒素のバランスを改善する。

【００２３】トランスフェクションしその後患者の肺系に導入するための細胞を調製する際
には、皮膚の線維芽細胞、本発明の細胞ベースの遺伝子導入治療の最終的な受容
体から得られる内皮または前駆のホ乳類細胞から始めるのが好ましい。皮膚の線
維芽細胞は患者の外部皮膚層から単純かつ容易に得られ、標準的な技法によるｉ
ｎｖｉｔｒｏでの培養用に用意される。たとえば伏在静脈を取り除き内皮細胞
を培養することによって、内皮細胞が最終的な受容体から摘出される。前駆細胞
は骨髄のバイオプシーからを得ることができ、または循環している血液から単離
しｉｎｖｉｔｒｏで培養することができる。培養方法は、再び植え込むための
ヒト細胞を培養するために、特別な予防措置を伴なう標準的な培養技法である。

【００２４】本発明によると、患者からの皮膚の線維芽細胞を遺伝子導入用の細胞として使
用することが非常に好ましい。当業者が細胞タイプの理論的な選択を行うならば
、それは平滑筋細胞などの元来患者の肺系において見られる細胞タイプであろう
。線維芽細胞の使用は直感的なものではない。驚くことに、線維芽細胞はこの作
業に非常に適しており、平滑筋細胞などの細胞に関して重大かつ予想外の利点を
示すことが分かっている。技法の選択が適切であれば、線維芽細胞を培養中に生
育させることは容易であり、導入遺伝子を用いてトランスフェクトすることも容
易であることが判明している。患者の肺系への導入後に、線維芽細胞によって多
量のトランスフェクト体、ｉｎｖｉｖｏでの血管新生促進因子の高度な発現が
生み出される。平滑筋細胞と比較して、肺系においておそらく繊維症を引き起こ
すであろうという、線維芽細胞に関して予想される多大な危険性は具体化されて
いない。

【００２５】ｉｎｖｉｔｒｏでの体細胞の受容体細胞への遺伝子導入、すなわち遺伝子工
学によるものは、前述のような遺伝子導入を得るための標準的で商業的に利用可
能な手法によって行われる。この方法はポリカチオン性タンパク質（たとえばＳ
ＵＰＥＲＦＥＣＴ）、またはリポフェクション（たとえばＧＥＮＥＦＥＣＴＯＲ
の使用による）、市販されていて遺伝子導入を向上させる試薬の使用を含むこと
が好ましい。しかしながら、エレクトロポレーション、アデノおよびレトロウイ
ルスを含めたウイルスによる遺伝子導入の方法などの、リポフェクションおよび
ポリカチオン性タンパク質の使用以外の他の方法を使用することができる。これ
らの方法および技法は当業者にはよく知られており、本発明の方法における使用
に容易に適合される。リポフェクションは、真皮の線維芽宿主細胞に関して使用
するための最も好ましい技法である。

【００２６】周辺静脈または中央静脈のいずれかへの細胞の注入によって、遺伝子工学的に
処理した細胞の肺循環器への再導入が行われ、前述のようにそこから細胞は循環
によって肺系に移動し、肺の血管床の最小の動脈中に留まる。やや不便ではある
が、肺循環器への直接的な注射を選ぶこともできる。ボーラスの形で（すなわち
短時間の間に細胞をすべて注射する）注入を行うことができ、長時間かけた少数
の細胞の連続的な注入によっても注入を行うことができ、一定時間かけて数回に
わたって限られたサイズのボーラスを投与することによって代替的に行うことも
できる。

【００２７】トランスフェクトされた細胞自体は大部分が（または全てが）肺循環器中、特
に患者の肺の動脈中に保持されるが、その導入遺伝子の発現産物はこの方法では
制限されない。発現産物はトランスフェクトされた細胞から発現および分泌され
、患者の正常な循環によって他の場所へ移動し、下流の身体器官において治療効
果を発揮することができる。したがって、本発明の方法の好ましい使用は肺疾患
の治療においてであるが、発現産物は患者の肺系と最初に接するので、好ましい
使用はこのような治療だけには限られない。トランスフェクト体は、患者の他の
身体器官の治療用に設計されている産物を発現する導入遺伝子を含む可能性があ
る。肺系において発現されるこのような産物は、他の所定の器官を標的とし、患
者の本来の循環器系によってそこに送達されるはずである。

【００２８】以下の具体的で非制限的な実施例において、例示的な目的で本発明をさらに記
載する。

【００２９】実施例１皮膚線維芽細胞の外植片の培養生後２１日のＦｉｓｈｅｒの３４４匹のラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＣｏ．）を入手し、ケタミンおよびキシラジンの過量摂取によって殺傷した。
毛を注意深く剃り背中の皮膚を切り取り、２％ペニシルアミンおよびストレプト
マイシンを含むリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）溶液（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、Ｂｕｒｌ
ｉｎｇｔｏｎ、Ｏｎｔａｒｉｏ）にすぐに移した。メスを使用して、上皮および
深部の脂肪および結合組織を除去した。真皮組織を約４ミリメートル平方の小片
に切断し、個々のフィブロネクチン被覆型（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣ
ｏ．、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）組織培養プレート（Ｆａｌｃ
ｏｎ、ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎＣａｎａｄａ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕ
ｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）の上に置いた。次いで、３７℃においてＯ_２９５％およ
びＣＯ_２５％である湿気のある環境下で、２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および
２％ペニシルアミンおよびストレプトマイシン（いずれもＧｉｂｃｏＢＲＬ）
を有するＤｕｌｂｅｃｃｏの改質型イーグル培地で次いで外植片を生育させ、そ
の培地を２日ごとに交換した。ひとたび多くの薄いスピンドル形の細胞（真皮の
外植片から生育したもの）をはっきりと見ることができるまで、０．０５％トリ
プシン／ＥＤＴＡ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を使用して外植片を継代培養し、残り
の外植片組織を取り除いた。次いでその後の実験において使用するまで、２０％
ＦＣＳおよび２％ペニシルアミンおよびストレプトマイシンを有するＤＥＭＥ中
で細胞を生育させた。

【００３０】抗体および標準的な染色技法を使用して、効果的なタイプに関して細胞の純度
をチェックして、利用可能で効果的な線維芽細胞系統の細胞のおよその数を判定
した。

【００３１】実施例２蛍光性細胞の標識５〜９回継代培養した細胞を８０％が融合するまで生育させ、次いで蛍光運搬
体、クロロメチルトリメチルローダミン（ＣＭＴＭＲ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓＩｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、Ｏｒｅｇｏｎ）を用いて標識した。ＣＭ
ＴＭＲはｅｘｖｉｖｏでの標識された細胞を検出する非常に正確な方法を提供
する。なぜなら、分子は細胞の細胞質への通過後に不可逆的なエステル化および
グルコン化を経て、それによって膜を透過しない最終生成物が生じるからである
。したがってこの活性蛍光運搬体は元の標識された細胞から近隣の細胞または構
造体に拡散することができず、製造者に従って数カ月間かけてｉｎｖｉｖｏで
検出することができる。凍結乾燥した生成物をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ
）中に溶かして１０ミリモルの濃度にすることによって、蛍光性プローブを作製
した。この溶液を２０℃で保存し、使用の直前に血清を含まないＤＭＥＭ中で最
終濃度２５マイクロモルに希釈した。細胞を標識剤に４５分間暴露させ、次いで
ＰＢＳで２回洗浄し、通常の培地（１０％ＦＣＳおよび２％ペニシリンおよびス
トレプトマイシンを有するＤＭＥＭ）に置き換えた。細胞を一晩生育させ、受容
体のＦｉｓｈｅｒの３４４匹のラットの頚静脈内に注射するために２４時間後に
摘出した。

【００３２】カバースリップ上で細胞を平板培養し、その細胞を蛍光運搬体を用いてインキ
ュベートして時間をかけて蛍光性の質および期間を判定することによって、一連
のｉｎｖｉｔｒｏ実験も行った。２５マイクロモルの濃度において、蛍光運搬
体、ＣＭＴＭＲ、を用いてインキュベーションした直後に、培養した細胞の１０
０％がローダミンフィルタ下で観察すると強烈に蛍光を発していることを発見し
た。標識後４８時間および７日後にも細胞を観察し、無数の細胞分裂があったに
もかかわらず、カバースリップ上に存在する１００％の細胞が、鮮やかに蛍光を
発し続けた（データは示さず）。

【００３３】実施例３ｅｘｖｉｖｏでのＣＭＶ−βＧａｌプラスミドを用いた細胞のト
ランスフェクションサイトメガロウイルスエンハンサー／プロモーターの制御下でβ−ガラクトシ
ダーゼ遺伝子を含むベクターＣＭＶ−βＧａｌ（ＣｌｏｎｔｅｃｈＩｎｃ．、
ＰａｌｏＡｌｔｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をレポーター遺伝子として使用し
て、ｉｎｖｉｖｏでの導入遺伝子発現の行程に従った。線維芽細胞を生育させ
、７０〜８０％融合させた。リポソームとＤＮＡの最適な比は、リポソーム６μ
ｇ／ＤＮＡ１μｇであると判定した。ＤＭＥＭ培地（添加剤なし）で細胞を洗浄
し、ＤＭＥＭ６．４ｍｌをそれぞれの１００ｍｍプレートに加えた。Ｇｅｎｅｆ
ｅｃｔｏｒ（ＶｅｎｎｏｖａＩｎｃ．、ＰａｂｌｏＢｅａｃｈＦｌａ）２
００μｌをＤＭＥＭ０．８ｍｌ中で希釈し、ＤＭＥＭ０．８ｍｌ中で希釈したＤ
ＮＡ（ＣＭＶ−βｇａｌ）１６μｇと混合させた。次いでリポソーム溶液をプレ
ートの表面全体に一滴ずつ加え、それを穏やかに撹拌し３０℃で８時間インキュ
ベートした。ウイルスベクターの使用を避け、同時にｉｎｖｉｖｏでの有意な
トランスフェクション効率を得るためにこの方法を使用した。Ｇｅｎｅｆｅｃｔ
ｏｒ産物は、最適化されたリポソーム調製物である。次いでこのＧｅｎｅｆｅｃ
ｔｏｒ−ＤＮＡ複合体が細胞表面と相互作用し、細胞質に運ばれ、その後でプラ
スミドＤＮＡは核に転位することができる。

【００３４】次いでトランスフェクション培地を、２０％ＦＢＳおよび２％ペニシリン／ス
トレプトマイシンを有するＭ１９９に置き換え、２４〜４８時間インキュベート
した。この方法によって、トランスフェクション効率が４０％と６０％の間とい
う結果となった。

【００３５】実施例４動物手術および蛍光によって標識した組織中の細胞の検出動物に関する手順はすべて、ＡｎｉｍａｌＣａｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅ
ｏｆＳｔ．Ｍｉｃｈａｅｌ’ｓＨｏｓｐｉｔａｌＴｒｏｎｔｏ、Ｃａｎａ
ｄａによって承認された。キシラジン（４．６ミリグラム／キログラム）および
ケタミン（７０ミリグラム／キログラム）の腹膜内注射によって、生後６週間の
Ｆｉｓｈｅｒの３４４匹のラット（ＣｈａｒｌｅｓＲｉｖｅｒＣｏ．Ｓｔ．
Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ）に麻酔をかけ、頚部を剃ってヨウ素およびエ
タノールで清掃した。メスを用いて中央頚部を切断し、右内部、外側および共通
のけい静脈を同定した。外径が０．０２ミリメートルのプラスチックチューブを
２３ゲージ針に接続し、滅菌食塩水（Ｂａｘｔｅｒ）でフラッシュした。次いで
チューブを使用して外側けい静脈を管状にし、大動脈の上にあると考えられる約
５センチメートルの静脈に導入し、早急な静脈血の戻りを使用してカテーテルの
位置を確認した。

【００３６】肺中の細胞生存の時間行程および導入遺伝子の発現を判定するための実験では
、蛍光運搬体、ＣＭＴＭＲで標識したか、あるいはプラスミドベクターＣＭＶ−
βＧａｌを用いてトランスフェクトした皮膚の線維芽細胞をトリプシン処理し、
８５０ｒｐｍで５分間遠心分離した。余分な培地を取り除き、細胞のペレットを
全容量が２ミリリットルのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液中で再懸濁した。次
いでこれらの再懸濁した細胞のアリコート５０マイクロリットルを取り出し、血
球計測板のグリッド上で計測してＰＢＳの１ミリリットル当たりに存在する細胞
の総数を判定した。次いでその溶液を細胞が約５００，０００個の１ミリリット
ルのアリコートに分け、滅菌的な方法で動物ケア施設に送った。次いで穏やかに
撹拌することによってこれらの細胞を再懸濁し、外側けい静脈のカルテールを介
して動物に注射した。１〜２分かけてゆっくりと溶液を注入し、次いで除去する
前にカルテールを滅菌食塩水で再びフラッシュした。外側けい静脈を結さつし、
切り口を３〜０本の断続的で吸収性のある縫合糸で閉じて、動物を手術から回復
させた。

【００３７】標識した細胞（それぞれのタイムポイントでｎ＝３）の送達、または食塩水の
注射（ネガティブコントロール、ｎ＝３）から３０分または２４時間後に、麻酔
薬の過量摂取によって動物を殺傷し、腹腔を開いた。肺動脈および気管を食塩水
でフラッシュし、右および左の肺を摘出した。両方の肺の基底、内側および先端
部分から横方向の断片を取り出し、肝臓、脾臓、腎臓およびガストロネミウス（
ｇａｓｔｒｏｎｅｍｉｕｓ）筋から試験片を得た。組織の試験片をＯＣＴ化合物
（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｋＵ．Ｓ．Ａ．Ｉｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、
Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中に正面向きに埋め込み、次いで液体窒素中でフラッシ
ュ凍結した。２つの異なる組織レベルで少なくとも２００ミクロンに分離された
これらの凍結ブロックから１０ミクロン断片を切断し、次いでこれらの断片をロ
ーダミンフィルタを使用して蛍光顕微鏡下で観察し、それぞれの正面向きの組織
の試験片中で強く蛍光している細胞の数を計測した。

【００３８】肺全体中に存在する標識した細胞の総数の推定値を提供するために、それぞれ
の肺部分における蛍光性細胞の総数を計測し、計測した部分の数を平均化した。
円錐台の体積についてシンプソンの法則を使用することによって、数学的近似値
を肺中に存在する細胞の総数とすることができる。この等式は３つの異なる部分
の関連領域の円錐の総体積に基づいており、以下の通りである。

【００３９】体積＝〔（面積（基底部分））＋（面積（中央部分））×肺の高さ〕／３＋〔
（面積（先端部分））／２×肺の高さ／３〕＋〔λ／６×（肺の高さ／３）^３〕器官の摘出後に肺の高さを測定し、それぞれの横方向部分の面積は面積測定法
によって決定した。これらの部分の総体積で割った３つの部分に存在する細胞の
平均数によって、単位体積当たりの細胞数の推定値を得た。この数字に肺全体の
体積を掛けることによって、肺中の細胞の総数の推定値が得られた。多数の隣接
する肺部分における１つ１つの細胞の外見を正確なものにするために、ラットに
約５００，０００個のＣＭＴＭＲ標識細胞を注射し、早急に殺傷した。肺を作製
し、通常の方法で摘出し埋め込み、２０の一連部分（それぞれ厚さ５ミクロン）
を肺の柔組織から取り出した。ローダミンフィルタを使用してそれぞれの部分を
観察し、際だった個々の細胞および隣接部分で判定されるその存在を同定した。
１つ１つの細胞を同定することができる５ミクロン部分の数を計測し、ｉｎｖ
ｉｖｏでの肺動脈の平滑筋細胞の平均寸法を得た。観察した平均径は１６．４±
１．２２ミクロンであった。したがって、シンプソンの式を使用して計算した細
胞の総数に０．６１を掛けて、平均でそれぞれ１６．４ミクロン部分中の１細胞
の存在を正確なものにした。

【００４０】線維芽細胞送達の３０分後、３７３±３６個のＣＭＴＭＲ標識細胞／ｃｍ^２を
肺部分中において同定し、これは注射された細胞の総数の約６０％であった。２
４時間後、ＣＭＴＭＲ標識細胞がわずかに減少し（３１７±４個／ｃｍ^２、すな
わち３０分後の値の８５％）、これは移植された細胞の優れた生存力を示す。そ
の後のタイムポイント２、４、７および１４日目、１、２、３および６カ月目に
おけるＣＭＴＭＲ標識細胞の生存も評価して、受容体ラットの肺中における移植
された細胞の生存の時間行程を確立した。標識していない平滑筋細胞を注射した
いずれの肺においても、鮮やかな蛍光シグナルは見られなかった。

【００４１】脾臓、肝臓および骨格筋組織では、蛍光シグナルは同定されなかった。観察し
た４つの腎臓のうちの２つでは、不規則な蛍光シグナルを同定することができた
。これらはいずれも細胞全体の形状とは一致しないようであり、細胞の注射中あ
るいはその直後にせん断または破壊された細胞を表すようであった。さらに、注
射から７日後には、肺以外のいずれの器官においても蛍光シグナルは同定されな
かった。

【００４２】実施例５組織中のβ−ガラクトシダーゼ発現の検出細胞ベースの遺伝子導入後のさまざまなタイムポイントにおいて、動物を殺傷
し胸部を開いた。肺動脈を食塩水でフラッシュし、気管を管状化し、肺が充分膨
張するまで２％パラホルムアルデヒドでフラッシュした。両方の肺の基底、内側
および先端部分から横方向の断片を取り出し、ある動物の肝臓、脾臓、腎臓およ
びガストロネミウス筋から試験片を得た。その試験片を２％パラホルムアルデヒ
ドおよび０．２％グルタルアルデヒド中で１時間インキュベートし、次いでＰＢ
Ｓ中でリンスした。次いで組織を、クロモゲン溶液を用いて３７℃で１８時間イ
ンキュベートした。この溶液は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−
Ｄ−ガラクトシダーゼ（Ｘ−Ｇａｌ、ＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒＭａｎｎｈｅｉｍ
、Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ）０．２％、フェロシアンカリウム（Ｓｉｇｍａ）
５ミリモル、フェロシアンカリウム（Ｓｉｇｍａ）５ミリモル、および塩化マグ
ネシウム（Ｓｉｇｍａ）２ミリモルを含み、これらはすべてリン酸緩衝食塩水中
に溶解している。次いで試験片をＰＢＳ中でリンスし、ＯＣＴ化合物（Ｍｉｌｅ
ｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中に埋め込み、１０ミクロン部分に切断し、淡
い赤色で対比染色した。

【００４３】正面向きの部分を顕微鏡によって観察し、強く青色に染色されている細胞の数
を評価することができた。それぞれの反応シリーズのトランスフェクション効率
を判定するために、細胞の１ディシュをｉｎｖｉｔｒｏでの染色用に使用する
ので、レポーター遺伝子プラスミドｐＣＭＶ−βＧａｌを用いてトランスフェク
トされた細胞のパーセンテージの評価を、それぞれの動物について行うことがで
きる。この情報および存在する蛍光性細胞の数の近似について記載する数学的計
算を使用して、動物の殺傷時に残っているトランスフェクトされた細胞の総数の
評価を行うことができる。

【００４４】ｐＣＭＶ−βＧａｌプラスミドを使用するいくつかの別のトランスフェクショ
ン反応において、ｉｎｖｉｔｒｏでの皮膚の線維芽細胞について約４０〜５０
％の平均トランスフェクション効率を得ることができる。疑似のトランスフェク
ト培地では、染色は見られない。

【００４５】Ｘ−Ｇａｌクロモゲン溶液を用いたインキュベーションの後に、ｐＣＭＶ−β
Ｇａｌでトランスフェクトされた皮膚の線維芽細胞の内部けい動脈への注射の４
８時間後の、細胞ベースの導入遺伝子発現の顕微鏡による証拠を見ることができ
、強烈に青色に染色された多数の細胞が肺全体で見られ、注射された元のトラン
スフェクトされた細胞の少なくとも３０％である。蛍光によって標識された細胞
に関しては、β−ガラクトシダーゼを発現している細胞の大部分は、肺の末端微
細血管中に留まるようである。トランスフェクトされていない皮膚の線維芽細胞
を注射した動物からのいずれの肺においても、β−ガラクトシダーゼ発現の証拠
は検出されない。異常な多形核球の存在、またはリンパ球の侵入、隔膜肥大また
は肺胞の破壊によって判定される、肺の病状に関する証拠も検出されていない。

【００４６】実施例６モノクロタリン阻害の実験ＶＥＧＦ_１６５の細胞ベースの遺伝子導入が病気である動物モデルの肺高血圧
症を阻害することができるかどうか判定するために、ｐＶＥＧＦまたはｐｃＤＮ
Ａ３．１（エンプティーベクター）のいずれかでトランスフェクトした皮膚の線
維芽細胞を前述のように作製した。ヒト大動脈の平滑筋細胞から抽出したすべて
のＲＮＡ、および以下の配列の特異的なプライマー：センス５’ＴＣＧＧＧＣ
ＣＴＣＣＧＡＡＡＣＣＡＴＧＡ３’、アンチセンス５’ＣＣＴＧＧＴＧＡＧＡ
ＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣ３’を使用する逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって、Ｖ
ＥＧＦ_１６５の完全長のコード配列が生成した。これによって６４９ｂｐの断片
が生成され、これをｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、
Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）にクローン化し、配列決定して同一性を確認した。次いで
この断片をＥｃｏＲ１制限部位において発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にクロー
ン化し、異なる消化物を使用して正しい方向を決定した。挿入欠失ベクター（ｐ
ｃＤＮＡ３．１）を、モノクロタリン実験用のコントロールとして使用した。形
質転換の熱ショック法によってプラスミドＤＮＡすべてをＥ．ＣｏｌｉのＪＭ１
０９菌株に導入し、１００マイクログラム／ミリリットルのアンピシリンを含む
ＬＢ培地中で細菌を一晩培養した。次いで製造者の指示（ＱｉａｇｅｎＥｎｄ
ｏｔｏｘｉｎ−ＦｒｅｅＭａｘｉＫｉｔ、ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．、Ｍｉｓ
ｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔａｒｉｏ）に従って、エンドトキシンを含まない精製
キットを使用してこのプラスミドを精製し、Ａ_２６０とＡ_２８０の比が１．７５
より大きく濃度が少なくとも１．０マイクログラム／マイクロリットルであるプ
ラスミドＤＮＡを生成した。

【００４７】トランスフェクトされた皮膚の線維芽細胞をトリプシン処理し、５００，００
０個の細胞のアリコートに分けた。次いで６〜８週間後のＦｉｓｈｅｒの３４４
匹のラットに麻酔をかけ、外部けい静脈中のカテーテル、５００，０００ｐＶＥ
ＧＦ（ｎ＝５）、またはｐｃＤＮＡ３．１（ｎ＝３）をトランスフェクトした細
胞を介して８０ミリグラム／モノクロタリン１キログラム（ｎ＝１３）（Ａｌｄ
ｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ．、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉ
ｎ）単独、またはモノクロタリンと共に皮下に注射した。

【００４８】モノクロタリンは植物のアルカロイドであり、その代謝産物は肺内皮を傷つけ
、肺高血圧症の動物モデルを提供する。

【００４９】静脈を縛り、通常の方法で切り口を閉じ、動物を回復させた。注射後２８日目
に、動物に再度麻酔をかけ、Ｍｉｌｌａｒマイクロチップカテーテルを右内部の
けい静脈を介して右心室に再度挿入した。右側の収縮期圧を記録し、次いでカテ
ーテルを上部の動脈に挿入し、全身の動脈圧を記録した。次いで動物を殺し、心
臓を摘出した。右心室（ＲＶ）と左心室および隔膜（ＬＶ）の重量比（ＲＶ／Ｌ
Ｖ比）を、長期の肺高血圧症への肥大性応答の指標として判定した。肺静脈を介
して滅菌リン酸緩衝食塩水で肺をフラッシュし、気管を介して２％パラホルムア
ルデヒドを穏やかに吸引させた。次いで肺の断片を後のＲＮＡ抽出のために液体
窒素中でスナップ凍結、またはパラフィン固定および分画用の２％パラホルムア
ルデヒド中の浸漬によって固定した。右側の収縮期圧およびＲＶ／ＬＶ比をｐＶ
ＥＧＦ、ｐｃＤＮＡ３．１、およびモノクロタリン単独のグループの間で比較し
た。

【００５０】ラットの肺から抽出したＲＮＡを定量化し、それぞれの動物からの合計５マイ
クログラムのＲＮＡをハツカネズミの白血病ウイルスの逆転写酵素を使用して逆
転写し、結果として生じたｃＤＮＡのアリコートを以下の配列の特異的なプライ
マー：センス５’ＣＧＣＴＡＣＴＧＧＣＴＴＡＴＣＧＡＡＡＴＴＡＡＴＡＣＧ
ＡＣＴＣＡＣ３’、アンチセンス５’ＧＧＣＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡ
ＴＣＣＧＣＡＴＡＡＴ３’を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって
、６５℃のアニーリング温度で３０サイクルかけて増幅させた。５０マイクロリ
ットルの反応のうち１０マイクロリットルは、１．５％アガロースゲル上で行っ
た。上流プライマーはｐｃＤＮＡ３．１ベクターのＴ７プライマー部位内部に位
置し、したがっていかなる内生ＲＮＡ転写物ともアニールするはずがなく、下流
プライマーはＶＥＧＦのコード領域のエクソン４内部に位置した。したがって、
首尾の良いＰＣＲ反応によって、外来性ＶＥＧＦのＲＮＡのみを選択的に増幅さ
せることができたはずである。ＲＮＡの量および質を調節するために、同じ逆転
写反応の第２のアリコートを、構築的に発現される遺伝子ＧＡＰＤＨに関する以
下のプライマー：センス５’ＣＴＣＴＡＡＧＧＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＣ
ＡＴ３’、アンチセンス５’ＧＡＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＴＧ
ＴＡ３’を用いて増幅した。５８℃のアニーリング温度で２５サイクルかけてこ
の反応を行った。５０マイクロリットルの反応のうち１０マイクロリットルは、
１．５％アガロースゲル上で行い、ＶＥＧＦのＰＣＲから得たシグナルと比較し
た。

【００５１】パラホルムアルデヒド固定したラットの肺をその長軸に垂直に切断し、正面向
きにパラフィン固定した。断片を得て、ｅｌａｓｔｉｎ−ｖｏｎＧｉｅｓｓｅ
ｎ（ＥＶＧ）の技法を使用して染色した。何も知らない観察者によってこれらの
断片を評価し、Ｃ＋コンピュータ画像システムを使用して４０倍の倍率下で、そ
れぞれの断面内で認知可能な媒体を用いてすべての血管を測定した。それぞれの
血管の内側面積を決定し、それぞれの動物について０〜３０、３０〜６０、６０
〜９０、９０〜１２０、および１２０ミクロンを超える外径の血管サイズの平均
値を得た。それぞれのサイズの平均値をｐＶＥＧＦ、ｐｃＤＮＡ３．１、および
モノクロタリン単独のグループの間で比較した。

【００５２】モノクロタリン注射（ｎ＝１１）単独から４週間後、右側の収縮期圧は４８±
２ｍｍＨｇに増大したが、ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトされた細胞（ｎ
＝３）を受け取った動物では改善が見られず、平均ＲＶＳＰは４８±２ｍｍＨｇ
のままであった。しかしながら、ｐＶＥＧＦでトランスフェクトされた線維芽細
胞（ｎ＝５）を用いて治療した動物では、ＲＶ圧は３２±２ｍｍＨｇに大幅に低
下した（ｐ＜０．０００１）。

【００５３】長期の肺高血圧症から予想されるように、モノクロタリン注射（ｎ＝１３）後
、ベースラインからＲＶ／ＬＶ比は０．３４５±０．０１５に大幅に上昇し、ｐ
ｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトされたグループ（ｎ＝３）でもほぼ同様であ
った。ＶＥＧＦの遺伝子導入（ｎ＝５）の後、ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェ
クトされたグループよりも大幅にこの比が低下した。動脈圧の違いは見られなか
った。肺内皮毒性モノクロタリンおよびトランスフェクトした細胞を注射した４
週間後、ＭＣＴグループおよびｐｃＤＮＡ３．１グループにおいてＲＶ／ＬＶ比
が大幅に上昇したが、ｐＶＥＧＦでトランスフェクトした動物では低下した。

【００５４】組織断片の形態学的分析によって、モノクロタリン単独およびｐｃＤＮＡ３．
１で治療したグループの両方において、０〜３０、３０〜６０、６０〜９０ミク
ロンのグループの血管の内側面積が、ＶＥＧＦで治療した動物と比較して大幅に
増大したことが明らかになった。コントロールベクター、ｐｃＤＮＡ３．１でト
ランスフェクトした動物においても、同様の結果が見られた。ＶＥＧＦの細胞ベ
ースの遺伝子導入の後に、外径が０〜９０ミクロンの血管において、内側の厚さ
および面積の大幅な減少を観察した。

【００５５】プラスミドベースのプライマーを使用し、ポリメラーゼ連鎖反応を使用するこ
とによって、外来性ＶＥＧＦ転写物を選択的に増幅させた。すべてのサンプル中
に常に存在するハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨを増幅させることによって、
ＲＮＡの質および充填量を評価した。これによって、細胞ベースの遺伝子導入か
ら２８日後に外来性ＲＮＡが転写され、おそらく転写物（おそらく翻訳されたタ
ンパク質）の存在がＶＥＧＦで治療した動物のＲＶＳＰの低下に関する原因であ
ったことが証明された。

【００５６】殺傷直後に左心室穿刺によって動物から採取した血液を、ｐＨ、酸素充填量（
ｐＯ２）、二酸化炭素充填量（ｐＣＯ２）および飽和の％について分析した。そ
の結果を以下に与える。

【００５７】

【表１】血液の分析データ

【００５８】これらの結果は、ＶＥＧＦでトランスフェクトしたグループの動脈のＯ_２圧お
よび飽和が、トランスフェクトした細胞を受け取っていない動物よりもよりも良
いことを予備的に示す。このことは肺の血行動態および肺の血管形態の改善と一
致し、肺静脈中で起こる可能性のある静脈シャントへの重要な右から左への移動
に対して論じられる。

【００５９】予備的な指標によれば、「シャンティング」の形成、すなわち肺系の静脈と細
管の間の新しい通路の形成（静脈をバイパスさせそれによって血液酸素の取り込
みを制限する）は、問題のある程度で起こるわけではない。

【００６０】実施例７モノクロタリン逆行の実験ＶＥＧＦ_１６５の皮膚の線維芽細胞の細胞ベースの遺伝子導入が、病気である
動物モデルの明らかな肺高血圧症の進行を逆行または阻害することができるかど
うかを判定するために、６〜８週齢のＦｉｓｈｅｒ３４４ラット複数匹に１キロ
グラム当たり８０ミリグラムのモノクロタリンを皮下に注射した。モノクロタリ
ン注射の１４日後に、動物に再度麻酔をかけ、Ｍｉｌｌａｒカテーテルを右心室
に通してＲＶ圧を記録した。次いでｐＶＥＧＦまたはｐｃＤＮＡ３．１のいずれ
かでトランスフェクトした皮膚の線維芽細胞を、５００，０００個の細胞のアリ
コートの形で外部けい静脈に注射して、動物を回復させた。モノクロタリン注射
の２８日後、および細胞ベースの遺伝子導入の１４日後に、動物に再度麻酔をか
け、Ｍｉｌｌａｒミクロチップカテーテルを右内部のけい静脈を介して右心室に
再度挿入した。右心室の収縮期圧（ＲＶＳＰ）を記録し、次いでカテーテルを上
行する大動脈に挿入し、全身の動脈圧を記録した。次いで動物を殺傷し、心臓を
摘出した。ＲＶ／ＬＶ比を、長期の肺高血圧症への肥大性応答の指標として判定
した。ｐＶＥＧＦとｐｃＤＮＡ３．１グループの間で右心室の収縮期圧およびＲ
Ｖ／ＬＶ比を比較すると、モノクロタリン注射の２週間後では、ＲＶＳＰが上昇
し、ｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトされた細胞を受け取った動物では、モ
ノクロタリン送達の４週間後に圧力がさらに上昇して５５±５ｍｍＨｇになるこ
とが分かる。しかしながらｐＶＥＧＦで処置した動物では、ＲＶＳＰは少量増大
しただけだった。肺内皮毒性モノクロタリンを注射した４週間後、ｐｃＤＮＡ３
．１グループにおいてＲＶＳＰが大幅に増大したが、ｐＶＥＧＦでトランスフェ
クトした動物では大幅に低下した。

【００６１】ＲＶ／ＬＶ比はｐｃＤＮＡグループにおいて大幅に増大したが、その後のＶＥ
ＧＦの遺伝子導入で、その比は大幅に低下した。動脈圧の違いは見られなかった
。モノクロタリンを注射して４週間後、ｐｃＤＮＡ３．１グループにおいてその
比がさらに上昇したが、ｐＶＥＧＦでトランスフェクトした動物では大幅に低下
した。

【００６２】考察本発明によって、トランスフェクトされた線維芽細胞を使用する肺の脈管構造
への首尾の良いウイルスによらない遺伝子導入の証拠が示され、この手法を使用
するＰＨの治療における血管細胞新生戦略の将来性のある治療効力が証明される
。蛍光標識技法およびβ−ガラクトシダーゼを使用するレポーター遺伝子の研究
の両方によって判定されるように、この送達の方法は４８時間目に肺中に保持さ
れていた高い割合の細胞と関係があり、適度ではあるが１４日を超える持続的な
遺伝子発現とも関係があった。これらの結果は、脈管構造への脈管内遺伝子送達
のウイルスベースの方法に関して、以前に証明されたこととほぼ同じである（Ｓ
ｃｈａｃｈｔｎｅｒ、Ｓ．Ｋ．、Ｊ．Ｊ．Ｒｏｍｅ、Ｒ．Ｆ．Ｈｏｙｔ、Ｊｒ．
、Ｋ．Ｄ．Ｎｅｗｍａｎ、Ｒ．Ｖｉｒｍａｎｉ、Ｄ．Ａ．Ｄｉｃｈｅｋ、１９９
５．Ｉｎｖｉｖｏａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄｇｅｎｅｔ
ｒａｎｓｆｅｒｖｉａｔｈｅｐｕｌｍｏｎａｒｙａｒｔｅｒｙｏｆ
ｒａｔｓ．Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．７６：７０１−７０９；ａｎｄＲｏｄｍａｎ、
Ｄ．Ｍ．、Ｈ．Ｓａｎ、Ｒ．Ｓｉｍａｒｉ、Ｄ．Ｓｔｅｐｈａｎ、Ｆ．Ｔａｎｎ
ｅｒ、Ｚ．Ｙａｎｇ、Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌ、Ｅ．Ｇ．Ｎａｂｅｌ、１９９７．Ｉ
ｎｖｉｖｏｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒｙｔｏｔｈｅｐｕｌｍｏｎａｒ
ｙｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｉｎｒａｔｓ：ｔｒａｎｓｇｅｎｅｄｉｓｔ
ｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｖａｓｃｕｌａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒ
ｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６
：６４０−６４９を参照のこと）。

【００６３】しかしながら、本発明によって提供される細胞ベースの技法によって、潜在的
な免疫原性ウイルス構築体の使用が回避され、この技法はいかなる重度の肺また
は全身性の炎症とも関係がなく、肺の微小脈管構造中のより選択的な導入遺伝子
の発現、特に末端の肺動脈領域の特定の部位での導入遺伝子発現のターゲティン
グを可能にし、これは肺脈管の耐性、したがってＰＨの判定を主に担う。

【００６４】本発明は、遺伝子工学によって処理した細胞の生存、細胞の特定の部位への選
択性、および肺中での導入遺伝子の発現を含めた、肺循環器の細胞ベースの遺伝
子導入手法の実現性に関するいくつかの重要な問題を取り扱っている。移植した
細胞は、肺で効率的に保持された。

【００６５】大部分の細胞は小さな肺動脈中に留まるようであったという発見は、解剖学的
構造上のフィルタとして肺が果たす正常な生理学的役割と合致し、したがって再
懸濁された細胞などの比較的大きな粒子が肺の脈管構造中に留まると考えられる
。しかしながら、高い選択的な方法での前毛細血管の抵抗血管へのこの細胞の「
ターゲティング」は、ある種の肺脈管疾患の治療において非常に有用なものとな
る可能性がある。末端動脈レベルでの血管作動性遺伝子の過剰発現によって、脈
管領域中での肺脈管耐性の制御において重要な特定の部位への効果が提供され、
遺伝子導入の生物学的な結果が増幅される可能性がある。実際に、ＶＥＧＦでト
ランスフェクトした細胞を投与されたモノクロタリン処置動物において見られる
特定の部位でのＲＶＳＰの低下は、対応する全身の圧力の低下なく起こり、トラ
ンスフェションのこの方法の特異性が際だっている。したがってこの手法は、気
管内の遺伝子送達などの他の肺選択的遺伝子導入戦略に関して重大な利点を提供
する可能性があり、主に気管での過剰発現、またはカテーテルベースの肺脈管遺
伝子導入につながる結果となり、これによって拡散型巨大脈管および全身性の過
剰発現物が生成する（Ｒｏｄｍａｎ、Ｄ．Ｍ．、Ｈ．Ｓａｎ、Ｒ．Ｓｉｍａｒｉ
、Ｄ．Ｓｔｅｐｈａｎ、Ｆ．Ｔａｎｎｅｒ、Ｚ．Ｙａｎｇ、Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌ
、Ｅ．Ｇ．Ｎａｂｅｌ、１９９７．Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎｅｄｅｌｉｖｅｒ
ｙｔｏｔｈｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎｉｎｒａ
ｔｓ：ｔｒａｎｓｇｅｎｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎａｎｄｖａｓｃｕｌ
ａｒｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ
．ＣｅｌｌＭｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６：６４０−６４９；ａｎｄＮａｂｅｌ、
Ｅ．Ｇ．、Ｚ．Ｙａｎｇ、Ｄ．Ｍｕｌｌｅｒ、Ａ．Ｅ．Ｃｈａｎｇ、Ｘ．Ｇａｏ
、Ｌ．Ｈｕａｎｇ、Ｋ．Ｊ．Ｃｈｏ、Ｇ．Ｊ．Ｎａｂｅｌ．１９９４．Ｓａｆｅ
ｔｙａｎｄｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｃａｔｈｅｔｅｒｇｅｎｅｄｅｌ
ｉｖｅｒｙｔｏｔｈｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅｉ
ｎａｐａｔｉｅｎｔｗｉｔｈｍｅｔａｓｔａｔｉｃｍｅｌａｎｏｍａ
．Ｈｕｍ．ＧｅｎｅＴｈｅｒ．５：１０８９−１０９４を参照のこと）。

【００６６】器官特異的なトランスフェクションが全体的に比較的少ないにもかかわらずこ
の重要な効果が発生し、これはトランスフェクトされた細胞がそのサイズを基づ
いて、肺圧を制御する際に重要な役割を果たす前毛細血管の肺の抵抗血管を標的
にするという事実によるものであるらしい。肺脈管遺伝子導入のこの方法は、既
存の技法に優る利点を有している可能性がある。これは身体に送達される外来性
導入遺伝子の全体的な「量」を最小限にすることにより、このことによって望ま
しくない副作用の発生率を理論的に低下させることができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 CA02 DA02 EA04 GA13 HA17 4B065 AA90 AB01 BA02 CA44 4C084 AA13 CA17 CA53 CA56 DA45 DB52 DB54 NA10 NA13 NA14 NA20 ZA42 ZA59 ZB21 4C087 AA01 AA02 BB63 BB64 BB65 CA04 DA40 NA10 NA13 NA14 ZA42 ZA59 ZB21

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】患者の肺疾患またはその症状を軽減させるためにホ乳類患者
の肺循環器に投与するための薬剤である、線維芽細胞、内皮細胞および前駆細胞
から選択される生命力のあるトランスフェクトされたホ乳類細胞の調製における
使用であって、前記トランスフェクトされたホ乳類細胞が血管新生促進因子また
は一酸化窒素シンターゼをコードしている少なくとも１つの発現可能な導入遺伝
子を含む使用。
【請求項２】前記ホ乳類細胞が皮膚の線維芽細胞である、請求項１に記載
の使用。
【請求項３】前記血管新生促進因子が血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞
増殖因子、アンギオポエチン−１、トランスフォーミング増殖因子−β、肝細胞
増殖因子（細胞分散因子）または低酸素症誘導因子（ＨＩＦ）である、請求項１
または請求項２に記載の使用。
【請求項４】前記血管新生促進因子が血管内皮細胞増殖因子、ＶＥＧＦで
ある、請求項３に記載の使用。
【請求項５】前記ホ乳類細胞が前記トランスフェクトされた細胞の最終的
な受容体に由来する、前記請求項のいずれかに記載の使用。
【請求項６】前記肺疾患が肺高血圧症である、前記請求項のいずれかに記
載の使用。
【請求項７】線維芽細胞、内皮細胞および骨髄に由来する前駆細胞から選
択される遺伝学的に改変された生命力のあるホ乳類細胞であって、前記細胞が血
管新生促進因子、一酸化窒素シンターゼ、リポタンパク質、血管作動性物質、抗
酸化剤、フリーラジカルスカベンジャー、可溶性サイトカイン受容体、可溶性接
着分子、ウイルスまたはサイトカインの可溶性受容体、またはのう胞繊維症の遺
伝子をコードしている少なくとも１つの発現可能な導入遺伝子を含むホ乳類細胞
。
【請求項８】改変された皮膚の線維芽細胞を含む、請求項７に記載の細胞
。
【請求項９】遺伝学的に改変されて血管新生促進因子をコードしている発
現可能な導入遺伝子を含む皮膚の線維芽細胞を含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】前記導入遺伝子が血管内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖
因子、アンギオポエチン−１、トランスフォーミング増殖因子−β、および肝細
胞増殖因子から選択される血管新生促進因子をコードしている、請求項９に記載
の細胞。
【請求項１１】遺伝学的に改変されて血管内皮細胞増殖因子、ＶＥＧＦを
コードしている発現可能な導入遺伝子を含む皮膚の線維芽細胞を含む、請求項１
０に記載の細胞。
【請求項１２】プロスタサイクリンを生成する発現可能な導入遺伝子を含
む、請求項７または請求項８に記載の細胞。
【請求項１３】一酸化窒素シンターゼ用の発現可能な導入遺伝子を含む、
請求項７または請求項８に記載の細胞。
【請求項１４】皮膚の線維芽細胞、内皮細胞および骨髄に由来する原種幹
細胞から選択されるホ乳類細胞の形質転換体を調製する方法であって、血管新生
促進因子、一酸化窒素シンターゼ、リポタンパク質、血管作動性物質、抗酸化剤
、フリーラジカルスカベンジャー、可溶性サイトカイン受容体、可溶性接着分子
、ウイルスまたはサイトカインの可溶性受容体、またはのう胞繊維症の遺伝子を
コードしている少なくとも１つの遺伝子を有する前記ホ乳類細胞をトランスフェ
クトして、ｉｎｖｉｖｏで前記導入遺伝子の産物を発現することができる形質
転換した細胞を生成することを含む方法。
【請求項１５】前記ホ乳類細胞が皮膚の線維芽細胞である、請求項１４に
記載の方法。
【請求項１６】前記血管新生促進因子が血管内皮細胞増殖因子、線維芽細
胞増殖因子、アンギオポエチン−１、トランスフォーミング増殖因子−β、また
は肝細胞増殖因子から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】前記血管新生促進因子が血管内皮細胞増殖因子、ＶＥＧＦ
である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】リポフェクションによって前記トランスフェクションを行
う、請求項１４から１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】ホ乳類患者の遺伝子治療を行うための方法であって、投与
後に肺循環器中で少なくとも１つの遺伝子産物を発現することができる少なくと
も１つの発現可能な導入遺伝子を含み、皮膚の線維芽細胞、内皮細胞および骨髄
に由来する前駆細胞から選択される遺伝学的に改変されたホ乳類細胞をｅｘｖ
ｉｖｏで前記ホ乳類患者の肺系へ投与することを含み、前記導入遺伝子が血管新
生促進因子、一酸化窒素シンターゼ、リポタンパク質、血管作動性物質、抗酸化
剤、フリーラジカルスカベンジャー、可溶性サイトカイン受容体、可溶性接着分
子、ウイルスまたはサイトカインの可溶性受容体、またはのう胞繊維症の遺伝子
をコードしている導入遺伝子である方法。
【請求項２０】前記遺伝学的に改変された細胞が皮膚の線維芽細胞である
、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】前記発現可能な導入遺伝子が血管新生促進因子をコードし
ている遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記発現可能な導入遺伝子が一酸化窒素シンターゼ、血管
内皮細胞増殖因子、線維芽細胞増殖因子、アンギオポエチン−１、トランスフォ
ーミング増殖因子−β、および肝細胞増殖因子から選択される血管新生促進因子
をコードしている遺伝子である、請求項１９から２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】前記血管新生促進因子が血管内皮細胞増殖因子、ＶＥＧＦ
である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】肺高血圧症に苦しむホ乳類患者の症状を軽減させる方法で
あって、血管新生促進因子をコードしている発現可能な導入遺伝子を含むｅｘ
ｖｉｖｏで遺伝学的に改変された皮膚の線維芽細胞を前記ホ乳類患者の肺循環器
系へ投与することを含む方法。
【請求項２５】肺高血圧症に苦しむホ乳類患者の症状を軽減させるために
ホ乳類患者の肺循環器に投与するための薬剤である、血管新生促進因子をコード
している発現可能な導入遺伝子を含むｅｘｖｉｖｏで遺伝学的に改変された皮
膚の線維芽細胞の調製における使用。