ES2546937T3 - Terapia génica basada en fibroblastos y células endoteliales para el sistema pulmonar - Google Patents
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Abstract
Uso de células de mamífero transfectadas, viables, seleccionadas de fibroblastos y células endoteliales, conteniendo dichas células de mamífero transfectadas al menos un transgen expresable que codifica un factor angiogénico o vasoactivo para la preparación de una composición farmacéutica para aliviar un trastorno pulmonar en un paciente o síntomas del mismo, en donde dicha composición farmacéutica se ha de administrar a la circulación pulmonar de un paciente mamífero.
Description
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E07009031
09-09-2015
cm/2 u 85% del valor de 30 minutos, lo que indica una excelente supervivencia de las células trasplantadas. También se evalúa la supervivencia de células marcadas con CMTMR en instantes posteriores de 2, 4, 7 y 14 días y 1, 2, 3 y 6 meses para establecer el transcurso del tiempo de supervivencia de células trasplantadas en los pulmones de ratas receptoras. No se observaron señales brillantemente fluorescentes en ninguno de los pulmones a los que se inyectaron células de la musculatura lisa no marcadas.
En el tejido del bazo, hígado y músculo esquelético no se identificaron señales fluorescentes. En 2 de 4 riñones examinados, podían identificarse señales fluorescentes irregulares. Ninguna de éstas parecía ajustarse a la forma de una célula entera, y se presumió que representan a las células que fueron cortadas o destruidas durante la inyección de células o poco después. Además, no se identificaron señales fluorescentes en órgano alguno fuera del pulmón 7 días después de la inyección.
EJEMPLO 5 -DETECCIÓN DE EXPRESIÓN DE BETA-GALACTOSIDASA EN TEJIDO
En varios instantes después de la transferencia génica basada en células, se sacrificó a los animales y se les abrió el pecho. La arteria pulmonar se lava con solución salina y la tráquea se canula y se lava con 2% de paraformaldehído hasta que los pulmones están bien inflados. Se toman cortes transversales de los segmentos basal, medio y apical de los dos pulmones, y se obtienen muestras del hígado, bazo, riñón y músculo gastrocnemio de determinados animales. Las muestras se incuban en 2% de paraformaldehído con 0,2% de glutaraldehído durante 1 hora, y luego se enjuagan en PBS. El tejido se incuba a continuación durante 18 horas a 37ºC con una disolución de cromógeno que contiene 0,2% de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido (X-Gal, Boehringer Mannheim, Laval, Quebec), ferrocianuro de potasio 5 milimolar (Sigma), ferricianuro de potasio 5 milimolar (Sigma) y cloruro de magnesio 2 milimolar (Sigma), todos disueltos en solución salina tamponada con fosfato. Las muestras se enjuagan luego en PBS, se embeben en compuesto OCT (Miles Laboratories), se cortan en secciones de 10 micras y se tiñen para contraste con rojo neutro.
Luego se examinan al microscopio secciones vistas, y se pueden estimar el número de células que se tiñen intensamente de azul. Dado que se utiliza una placa de células para la tinción in vitro para determinar la eficiencia de la transfección para cada una de las series de reacción, se puede hacer para cada animal una estimación del porcentaje de células que fueron transfectadas con el plásmido de gen informador pCMV-βGal. Utilizando esta información y el cálculo matemático descrito para aproximar el número de células T fluorescentes presentes, puede hacerse una estimación del número total de células transfectadas restantes en el momento del sacrificio de los animales.
En un cierto número de reacciones de transfección separadas utilizando el plásmido pCMV-βGal, se puede obtener una eficiencia media de la transfección del orden de 40 -50% con los fibroblastos dérmicos in vitro. No se observa tinción alguna en cultivos transfectados simulados.
Tras la incubación con la disolución de cromógeno X-Gal, se puede observar una evidencia microscópica de la expresión transgénica basada en células a las 48 horas después de la inyección de células fibroblastos dérmicos transfectadas con pCMV-βGal en la vena yugular interna, observándose múltiples células que se tiñen de azul intenso a lo largo del pulmón, lo que representa al menos el 30% de las células transfectadas originales que fueron inyectadas. Al igual que con las células marcadas por fluorescencia, la mayoría de las células que expresan betagalactosidasa parecen estar alojadas dentro de la microvasculatura distal del pulmón. No se detecta evidencia de expresión alguna de beta-galactosidasa en cualquiera de los pulmones de los animales a los que se inyectaron células de fibroblastos dérmicos no transfectadas. No se observa evidencia alguna de patología pulmonar, tal como se determina por la presencia de un infilitrado polimorfonuclear anormal o linfocítico, engrosamiento septal o destrucción alveolar.
EJEMPLO 6 -ESTUDIOS DE PREVENCIÓN DE MONOCROTALINA
Para determinar si la transferencia génica basada en células de VEGF165 sería capaz de inhibir el desarrollo de la hipertensión pulmonar en un modelo animal de la enfermedad, se prepararon como se describe anteriormente fibroblastos dérmicos que habían sido transfectados con pVEGF o pcDNA 3.1 (un vector vacío). La secuencia codificadora de longitud completa de VEGF165 se generó realizando una reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa utilizando ARN total extraído de células de la musculatura lisa aórtica humana y los siguientes cebadores específicos para la secuencia siguiente: sentido 5' TCGGGCCTCCGAAACCATGA 3', antisentido 5' CCTGGTGAGAGATCTGGTTC 3'. Esto generó un fragmento de 649 pb que se clonó en el vector pGEM-T (Promega, Madison, Wisconsin) y se secuenció para confirmar la identidad. El fragmento fue clonado después en el vector de expresión pcDNA 3.1 en el sitio de restricción EcoR1, y la orientación correcta se determinó utilizando un digesto diferencial. El vector deficiente en inserto (pcDNA 3.1) se utilizó como un control para los experimentos de monocrotalina. Todo el ADN del plásmido se introdujo en una cepa JM 109 de E. coli a través del método de transformación por choque térmico, y las bacterias se cultivaron durante la noche en medio LB que contenía 100 microgramos/mililitro de ampicilina. El plásmido se purificó después utilizando un kit de purificación libre de
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