CN110382697A - 用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供在SERPINA1基因中引入双链断裂的组合物及方法。本发明提供减少及消除α1‑抗胰蛋白酶(AAT)的突变体形式(诸如患有α1‑抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的个体中所见的突变体形式)的组合物及方法。

Description

用于治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症的组合物及方法
本申请要求2016年12月22日提交的美国临时申请No.62/438,219的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。
本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且其全部内容通过引用并入本文。2017年12月20日创建的该ASCII拷贝命名为2017-12-20_01155-0005-00PCT_ST25_v2.txt，大小为92,165字节。
α-1抗胰蛋白酶(AAT或A1AT)或血清胰蛋白酶抑制剂是由SERPINA1基因编码的一种丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)(也称为丝氨酸蛋白酶抑制蛋白(serpin))。AAT主要由肝细胞合成和分泌，并且起到抑制肺中嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的作用。没有足够量的功能性AAT，中性粒细胞弹性蛋白酶不受控制并损害肺中的肺泡。因此，导致AAT水平降低或功能正常的AAT水平降低的SERPINA1突变导致肺病变(pathology)。此外，由于AAT在肝细胞中的积累，导致产生不能离开肝脏的错误AAT的SERPINA1突变导致肝脏病变。因此，由SERPINA1突变引起的不充分和不正确形成的AAT导致肺和肝脏病理学两者。
已经描述了超过一百种用于SERPINA1基因的等位基因变体。变体通常根据它们对血清AAT水平的影响进行分类。例如，M等位基因是与正常血清AAT水平目的的正常变体，而Z和S等位基因是与AAT水平降低目的的突变变体。Z和S等位基因的存在与α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD或A1AD)目的，这是一种遗传性疾病，其特征在于SERPINA1基因突变导致异常AAT的产生。
AATD有许多形式和程度。“Z-变体”是最常见的，在肝脏和肺中引起严重的临床疾病。Z-变体的特征在于第5外显子的5’端的单核苷酸变化，其导致在氨基酸位置342(E342K)处谷氨酸到赖氨酸的错义突变。在Z等位基因的同源(ZZ)和杂合(MZ或SZ)的患者中均出现症状。一种或两种Z等位基因的存在导致SERPINA1mRNA不稳定性，并且肝脏肝细胞中的AAT蛋白聚合和聚集。具有至少一个Z等位基因的患者由于肝脏中聚集的AAT蛋白的积累而具有增加的肝癌发病率。除肝脏病理学外，由至少一个Z等位基因表征的AATD还以肺病为特征，这是由于肺泡中AAT的减少和由此导致的中性粒细胞弹性蛋白酶抑制的减少。在北欧人群中，严重ZZ形式(即Z-变体的纯合表达)的流行率为1:2,000，在美国为1:4,500。
需要改善AATD在肝脏和肺中的负面影响。本发明提供了使用CRISPR/Cas系统敲除SERPINA1基因的组合物和方法，从而消除了与AATD患者的肝脏症状目的的突变形式的AAT的产生。
发明概述
实施方案01一种在SERPINA1基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，该方法包括向细胞递送组合物，其中该组合物包含指导RNA，该指导RNA包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案02一种修饰SERPINA1基因的方法，该方法包括向细胞递送组合物，其中该组合物包含(i)RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸及(ii)指导RNA，其包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案03一种治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，该方法包括向有需要的个体施用组合物，由此治疗AATD，其中该组合物包含(i)RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸及(ii)指导RNA，其包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案04一种用于减少或预防α-1抗胰蛋白酶(AAT)在个体的肝脏中累积的方法，该方法包括向有需要的个体施用组合物，由此减少AAT在肝脏中累积，其中该组合物包含(i)RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸及(ii)指导RNA，其包含选自SEQID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案05一种组合物，其包含指导RNA，该指导RNA包含选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案06一种组合物，其包含编码指导RNA的载体，其中该指导RNA包含选自SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案07如实施方案5或6的组合物，其用于诱导细胞或个体中的SERPINA1基因中发生双链断裂(DSB)。
实施方案08如实施方案5或6的组合物，其用于修饰细胞或个体中的SERPINA1基因。
实施方案09如实施方案5或6的组合物，其用于治疗个体中的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。
实施方案10如实施方案5或6的组合物，其用于降低个体中的血清或肝脏AAT浓度。
实施方案11如实施方案5或6的组合物，其用于减少或预防α-1抗胰蛋白酶(AAT)在个体的肝脏中累积。
实施方案12如实施方案1至4中任一项的方法或如实施方案5至11中任一项所使用的组合物，其中组合物会降低血清及/或肝脏AAT水平。
实施方案13如实施方案12所使用的方法或组合物，其中相较于施用组合物之前的血清及/或AAT水平，血清及/或肝脏AAT水平降低至少50％。
实施方案14如实施方案12所使用的方法或组合物，其中相较于施用组合物之前的血清及/或AAT水平，血清及/或AAT水平降低50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至95％、95％至98％、98％至99％或99％至100％。
实施方案15如实施方案1至4或7至14中任一项所使用的方法或组合物，其中组合物导致编辑SERPINA1基因。
实施方案16如实施方案15所使用的方法或组合物，其中编辑计算为经编辑的群组的百分比(编辑百分比)。
实施方案17如实施方案16所使用的方法或组合物，其中编辑百分比在30％与99％之间。
实施方案18如实施方案17所使用的方法或组合物，其中编辑百分比在30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间或95％与99％之间。
实施方案19如实施方案1至4或7至18中任一项所使用的方法或组合物，其中施用或递送组合物至少两次。
实施方案20如实施方案19所使用的方法或组合物，其中施用或递送组合物至少三次。
实施方案21如实施方案19所使用的方法或组合物，其中施用或递送组合物至少四次。
实施方案22如实施方案19所使用的方法或组合物，其中施用或递送组合物至多五、六、七、八、九或十次。
实施方案23如实施方案19至22中任一项所使用的方法或组合物，其中施用或递送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天的间隔进行。
实施方案24如实施方案19至22中任一项所使用的方法或组合物，其中施用或递送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周的间隔进行。
实施方案25如实施方案19至22中任一项所使用的方法或组合物，其中施用或递送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个月的间隔进行。
实施方案26如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中指导序列选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129。
实施方案27如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中指导RNA与人类SERPINA1基因中所存在的靶序列至少部分互补。
实施方案28如实施方案27的方法或组合物，其命中序列处于人类SERPINA1基因的外显子2、3、4或5中。
实施方案29如实施方案27的方法或组合物，其命中序列处于人类SERPINA1基因的外显子2中。
实施方案30如实施方案27的方法或组合物，其命中序列处于人类SERPINA1基因的外显子3中。
实施方案31如实施方案27的方法或组合物，其命中序列处于人类SERPINA1基因的外显子4中。
实施方案32如实施方案27的方法或组合物，其命中序列处于人类SERPINA1基因的外显子5中。
实施方案33如实施方案1至32中任一项的方法或组合物，其中指导序列与SERPINA1的正链中的靶序列互补。
实施方案34如实施方案1至32中任一项的方法或组合物，其中指导序列与SERPINA1的负链中的靶序列互补。
实施方案35如实施方案1至32中任一项的方法或组合物，其进一步包含第二指导序列，其中第一指导序列与SERPINA1基因的正链中的第一靶序列互补，且其中第二指导序列与SERPINA1基因的负链中的第二靶序列互补。
实施方案36如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中指导RNA包含crRNA，其包含指导序列且进一步包含SEQ ID NO:140的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140的核苷酸在指导序列的3’端后。
实施方案37如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中指导RNA为双指导(dgRNA)。
实施方案38如实施方案37的方法或组合物，其中双指导RNA包含crRNA及trRNA，该crRNA包含SEQ ID NO:140的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140的核苷酸在指导序列的3’端后。
实施方案39如实施方案1至36中任一项的方法或组合物，其中指导RNA为单指导(sgRNA)。
实施方案40如实施方案39的方法或组合物，其中sgRNA包含具有SEQ ID NO:130的模式的指导序列。
实施方案41如实施方案39的方法或组合物，其中sgRNA包含SEQ ID NO:130的序列。
实施方案42如实施方案40或41的方法或组合物，其中SEQ ID NO:130中的各N为任何天然或非天然核苷酸，其中该N形成指导序列，且指导序列使RNA指导的DNA结合剂靶向SERPINA1基因。
实施方案43如实施方案39至42中任一项的方法或组合物，其中sgRNA包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列及SEQ ID NO:140的核苷酸中任一个。
实施方案44如实施方案39至43中任一项的方法或组合物，其中sgRNA包含与选自SEQID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
实施方案45如实施方案42的方法或组合物，其中SEQ ID NO:130中的各N经选自SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:129的序列取代。
实施方案46如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中指导RNA包含至少一种修饰。
实施方案47如实施方案46的方法或组合物，其中至少一种修饰包括经2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰的核苷酸。
实施方案48如实施方案46或47的方法或组合物，其中至少一种修饰包括处于各核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
实施方案49如实施方案46至48中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括经2’-氟(2’-F)修饰的核苷酸。
实施方案50如实施方案46至49中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括在5’端前五个核苷酸中的一处或多处的修饰。
实施方案51如实施方案46至50中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括在3’端最后五个核苷酸中的一处或多处的修饰。
实施方案52如实施方案46至51中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括处于前四个核苷酸之间的PS键。
实施方案53如实施方案46至52中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括处于最后四个核苷酸之间的PS键。
实施方案54如实施方案46至53中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括在5’端前三个核苷酸处的经2’-O-Me修饰的核苷酸。
实施方案55如实施方案46至54中任一项的方法或组合物，其中至少一种修饰包括在3’端最后三个核苷酸处的经2’-O-Me修饰的核苷酸。
实施方案56如实施方案46至55中任一项的方法或组合物，其中指导RNA包含SEQ IDNO:130的经修饰核苷酸。
实施方案57如实施方案1至56中任一项的方法或组合物，其中组合物进一步包含可药用赋形剂。
实施方案58如实施方案1至57中任一项的方法或组合物，其中指导RNA及任选的RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸与脂质纳米颗粒(LNP)结合(associate)。
实施方案59如实施方案58的方法或组合物，其中LNP包含CCD脂质。
实施方案60如实施方案59的方法或组合物，其中CCD脂质为脂质A。
实施方案61如实施方案58至60的方法或组合物，其中LNP包含中性脂质。
实施方案62如实施方案61的方法或组合物，其中中性脂质为DSPC。
实施方案63如实施方案58至62中任一项的方法或组合物，其中LNP包含辅助脂质。
实施方案64如实施方案63的方法或组合物，其中辅助脂质为胆固醇。
实施方案65如实施方案58至64中任一项的方法或组合物，其中LNP包含隐形脂质(stealth lipid)。
实施方案66如实施方案58至65的方法或组合物，其中隐形脂质为PEG2k-DMG。
实施方案67如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中组合物进一步包含RNA指导的DNA结合剂。
实施方案68如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中组合物进一步包含编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA。
实施方案69如实施方案67或68的方法或组合物，其中RNA指导的DNA结合剂为Cas切割酶。
实施方案70如实施方案69的方法或组合物，其中RNA指导的DNA结合剂为Cas9。
实施方案71如实施方案67至70中任一项的方法或组合物，其中RNA指导的DNA结合剂经修饰。
实施方案72如实施方案67至71中任一项的方法或组合物，其中RNA指导的DNA结合剂为切口酶(nickase)。
实施方案73如实施方案71或72的方法或组合物，其中经修饰的RNA指导的DNA结合剂包含核定位信号(NLS)。
实施方案74如实施方案67至73中任一项的方法或组合物，其中RNA指导的DNA结合剂为来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。
实施方案75如前述实施方案中任一项的方法或组合物，其中组合物为药物制剂且进一步包含可药用载体。
实施方案76如实施方案1至4或7至75中任一项所使用的方法或组合物，其中组合物会减少或预防α-1抗胰蛋白酶(AAT)在肝脏中累积。
实施方案77如实施方案76所使用的方法或组合物，其中AAT为变形的(misform)。
实施方案78如实施方案1至4或7至77中任一项所使用的方法或组合物，其中非同源末端连接(non-homologous ending joining；NHEJ)在修复SERPINA1基因中的DSB期间引起突变。
实施方案79如实施方案78所使用的方法或组合物，其中NHEJ在修复SERPINA1基因中的DSB期间引起核苷酸缺失或插入。
实施方案80如实施方案80所使用的方法或组合物，其中核苷酸的缺失或插入在SERPINA1基因内诱导移码或无义突变。
实施方案81如实施方案80所使用的方法或组合物，其中在至少50％的肝脏细胞的SERPINA1基因中诱导移码或无义突变。
实施方案82如实施方案81所使用的方法或组合物，其中在50％至60％、60％至70％、70％或80％、80％至90％、90％至95％、95％至99％或99％至100％的肝脏细胞的SERPINA1基因中诱导移码或无义突变。
实施方案83如实施方案79至82中任一项所使用的方法或组合物，其中发生在SERPINA1基因中的核苷酸缺失或插入为在脱靶位点处(的核苷酸缺失或插入)的至少50倍或大于50倍。
实施方案84如实施方案83所使用的方法或组合物，其中发生在SERPINA1基因中的核苷酸的缺失或插入比在脱靶位点处(的核苷酸缺失或插入)多50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。
实施方案85如实施方案1至4或7至84中任一项所使用的方法或组合物，其中施用组合物降低个体中的AAT水平。
实施方案86如实施方案85所使用的方法或组合物，其中AAT水平降低至少40％。
实施方案87如实施方案86所使用的方法或组合物，其中AAT水平降低40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％或80％、80％至90％、90％至95％、95％至99％或99％至100％。
实施方案88如实施方案86或87所使用的方法或组合物，其中在血清、血浆、血液、脑脊液或痰中测量AAT水平。
实施方案89如实施方案86或87所使用的方法或组合物，其中在肝脏及/或血清中测量AAT水平。
实施方案90如实施方案85至89中任一项所使用的方法或组合物，其中通过酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)测量AAT水平。
实施方案91如实施方案1至4或7至90中任一项所使用的方法或组合物，其中个体患有AATD。
实施方案92如实施方案1至4或7至91中任一项所使用的方法或组合物，其中个体为人类。
实施方案93如实施方案91或92所使用的方法或组合物，其中个体患有AATD wt。
实施方案94如实施方案91或92所使用的方法或组合物，其中个体患有遗传性AATD。
实施方案95如实施方案1至4、7至92或94中任一项所使用的方法或组合物，其中个体具有AATD家族病史。
实施方案96如实施方案1至4或7至95中任一项所使用的方法或组合物，其中个体仅具有或主要具有AATD的肝脏症状。
实施方案97如实施方案1至4或7至96中任一项所使用的方法或组合物，其中个体在SERPINA1基因座的Z等位基因为杂合。
实施方案98如实施方案97的方法，其中个体在SERPINA1基因座处具有一个Z等位基因及一个S等位基因。
实施方案99如实施方案1至4或7至98中任一项所使用的方法或组合物，其中个体在AAT的氨基酸序列处不具有E342K突变，但具有降低水平的野生型AAT。
实施方案100如实施方案1至4或7至99中任一项所使用的方法或组合物，其中个体的水肿、腹水或黄疸有所改善、稳定或减缓，或推迟对肝脏移植的需要。
实施方案101如实施方案1至4或7至99中任一项所使用的方法或组合物，其中如通过成像方法或肝酶水平所测量，个体由于施用而具有改善、稳定或减缓变化。
实施方案102如实施方案1至4或7至101中任一项所使用的方法或组合物，其中组合物或药物制剂通过病毒载体施用。
实施方案103如实施方案1至4或7至102中任一项所使用的方法或组合物，其中组合物或药物制剂通过脂质纳米颗粒施用。
实施方案104如实施方案1至4或7至103中任一项所使用的方法或组合物，其中在施用组合物或配制物之前针对SERPINA1基因中的特定突变测试个体。
实施方案105如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:5。
实施方案106如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:6。
实施方案107如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:7。
实施方案108如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:8。
实施方案109如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:9。
实施方案110如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:10。
实施方案111如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:11。
实施方案112如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:12。
实施方案113如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:13。
实施方案114如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:14。
实施方案115如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:15。
实施方案116如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:16。
实施方案117如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:17。
实施方案118如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:18。
实施方案119如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:19。
实施方案120如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:20。
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实施方案122如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:22。
实施方案123如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:23。
实施方案124如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:24。
实施方案125如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:25。
实施方案126如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:26。
实施方案127如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:27。
实施方案128如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:28。
实施方案129如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:29。
实施方案130如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:30。
实施方案131如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:31。
实施方案132如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:32。
实施方案133如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:33。
实施方案134如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:34。
实施方案135如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:35。
实施方案136如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:36。
实施方案137如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:37。
实施方案138如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:38。
实施方案139如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:39。
实施方案140如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:40。
实施方案141如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:41。
实施方案142如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:42。
实施方案143如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:43。
实施方案144如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:44。
实施方案145如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:45。
实施方案146如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:46。
实施方案147如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:47。
实施方案148如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:48。
实施方案149如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:49。
实施方案150如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:50。
实施方案151如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:51。
实施方案152如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:52。
实施方案153如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:53。
实施方案154如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:54。
实施方案155如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:55。
实施方案156如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:56。
实施方案157如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:57。
实施方案158如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:58。
实施方案159如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:59。
实施方案160如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:60。
实施方案161如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:61。
实施方案162如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:62。
实施方案163如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:63。
实施方案164如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:64。
实施方案165如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:65。
实施方案166如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:66。
实施方案167如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:67。
实施方案168如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:68。
实施方案169如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:69。
实施方案170如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:70。
实施方案171如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:71。
实施方案172如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:72。
实施方案173如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:73。
实施方案174如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:74。
实施方案175如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:75。
实施方案176如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:76。
实施方案177如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:77。
实施方案178如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:78。
实施方案179如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:79。
实施方案180如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:80。
实施方案181如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:81。
实施方案182如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:82。
实施方案183如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:83。
实施方案184如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:84。
实施方案185如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:85。
实施方案186如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:86。
实施方案187如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:87。
实施方案188如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:88。
实施方案189如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:89。
实施方案190如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:90。
实施方案191如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:91。
实施方案192如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:92。
实施方案193如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:93。
实施方案194如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:94。
实施方案195如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:95。
实施方案196如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:96。
实施方案197如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:97。
实施方案198如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:98。
实施方案199如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:99。
实施方案200如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:100。
实施方案201如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:101。
实施方案202如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:102。
实施方案203如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:103。
实施方案204如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:104。
实施方案205如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:105。
实施方案206如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:106。
实施方案207如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:107。
实施方案208如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:108。
实施方案209如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:109。
实施方案210如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:110。
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实施方案214如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:114。
实施方案215如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:115。
实施方案216如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:116。
实施方案217如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:117。
实施方案218如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:118。
实施方案219如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:119。
实施方案220如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:120。
实施方案221如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:121。
实施方案222如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:122。
实施方案223如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:123。
实施方案224如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:124。
实施方案225如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:125。
实施方案226如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:126。
实施方案227如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:127。
实施方案228如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:128。
实施方案229如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列为SEQ ID NO:129。
实施方案230如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其进一步包含SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141的序列。
实施方案231如实施方案230的方法或组合物，其包含SEQ ID NO:130的修饰模式。
实施方案232如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中序列选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139。
实施方案233如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:131。
实施方案234如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:132。
实施方案235如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:133。
实施方案236如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:134。
实施方案237如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:135。
实施方案238如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:136。
实施方案239如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:137。
实施方案240如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:138。
实施方案241如实施方案1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列为SEQ ID NO:139。
实施方案242如技术方案232至241中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139的序列包含表2中的相应序列所示的修饰。
实施方案243一种如实施方案5至241中任一项的组合物或配制物的用途，其用于制备用于治疗患有AATD的人类个体的药物。
附图简述
图1显示具有由表7中所提供的指导序列靶向的SERPINA1基因的区的染色体14的示意图。
图2显示在施用x轴上所提供的指导序列后的AAT的编辑百分比(编辑％)及经分泌的AAT的水平。CTG＝CellTiter-Glo。
图3显示靶向SERPINA1的某些指导RNA的脱靶分析。在该图中，三角形表示命中切割位点的标识，而圆圈表示可能存在的脱靶位点的标识。
图4显示HUH7细胞中经AAT靶向的指导物的western印迹。
图5A至图5C显示关于CR003208及对照指导物CR001263的ELISA数据，其显示HUH7细胞中AAT分泌的下降百分比(5A)、HUH7细胞中AAT下降百分比的西方印迹(WB)分析(5B)及脱靶分析(5C)。在图5C中，在目的基因SERPINA2中鉴别到可能存在的单一脱靶位点，如由箭头表示(也参见图3)。人类指导序列及食蟹猴中与相应靶序列互补的序列均为CR003208(SEQ IDNO:107)。应注意，与人类指导序列互补的靶序列的染色体位置列于表1中。
图6A至图6C显示CR001413及对照指导物CR001262的ELISA数据，其显示HUH7细胞中AAT分泌的下降百分比(6A)、HUH7细胞中AAT下降百分比的西方印迹(WB)分析(6B)及脱靶分析(6C)。人类指导序列及食蟹猴中与相应靶序列互补的序列分别为CR001413(SEQ ID NO:51)及GUUGAGGAACAGGCCGUUGC(SEQ ID NO:271)。应注意，与人类指导序列互补的靶序列的染色体位置列于表1中。
图7A至图7C显示CR001400及对照指导物CR001261的ELISA数据，其显示HUH7细胞中AAT分泌的下降百分比(7A)、HUH7细胞中AAT下降百分比的西方印迹(WB)分析(7B)及脱靶分析(7C)。人类指导序列及食蟹猴中与相应靶序列互补的序列分别为SEQ ID NO:38及ACUCACAGUGAAAUCCUGGA(SEQ ID NO:272)。应注意，与人类指导序列互补的靶序列的染色体位置列于表1中。
图8A至图8C显示CR001427及对照指导物CR001262的ELISA数据，其显示HUH7细胞中AAT分泌的下降百分比(8A)、HUH7细胞中AAT下降百分比的西方印迹(WB)分析(8B)及脱靶分析(8C)。人类指导序列及食蟹猴中与相应靶序列互补的序列均为CR001427(SEQ ID NO:65)。应注意，与人类指导序列互补的靶序列的染色体位置列于表1中。
图9A至图9C显示CR001386及对照指导物CR001261的ELISA数据，其显示HUH7细胞中AAT分泌的下降百分比(9A)、HUH7细胞中AAT下降百分比的西方印迹(WB)分析(9B)及脱靶分析(9C)。人类指导序列及食蟹猴中与相应靶序列互补的序列分别为CR001386(SEQ ID NO:24)及GAAGCCGAACUCAGCCAGGC(SEQ ID NO:273)。应注意，与人类指导序列互补的靶序列的染色体位置列于表1中。
图10A至图10C显示CR001404及对照指导物CR001261的ELISA数据，其显示HUH7细胞中AAT分泌的下降百分比(10A)、HUH7细胞中AAT下降百分比的西方印迹(WB)分析(10B)及脱靶分析(10C)。在图10C中，鉴别出单一脱靶位点，如由箭头表示(也参见图3)。人类指导序列及食蟹猴中与相应靶序列互补的序列分别为CR001404(SEQ ID NO:42)及CAACGUCACGGAGAUUCCGG(SEQ ID NO:274)。应注意，与人类指导序列互补的靶序列的染色体位置列于表1中。
图11显示在剂量反应曲线(“DRC”)中多种浓度下针对不同指导物的HepG2细胞中的AAT的编辑百分比。
图12显示在剂量反应曲线(“DRC”)中多种浓度下针对不同指导物的原代人类肝细胞(PHH)中的AAT的编辑百分比。
图13A至图13C显示携带SERPINA1的人类PiZ变体拷贝的转基因小鼠中的体内实验结果。图13A显示各组中SERPINA1的PiZ变体的稳定编辑，其中在载体对照(TSS)中未检测到编辑。图13B显示来自此同一实验的ELISA资料，而图13C显示来自此同一实验的western印迹资料。
发明详述
本文提供在CRISPR/Cas9系统中适用于编辑SERPINA1基因的指导RNA组合物。可向具有非野生型SERPINA1基因序列的个体，诸如患有α-1抗胰蛋白酶缺乏症(“AATD”或“A1AD”)的个体施用呈双或单指导RNA形式的指导RNA，及RNA指导的DNA结合剂，例如Cas9，或编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA，例如编码Cas9的mRNA。靶向SERPINA1基因的指导序列展示于表1中的SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129处。本文所述的实验中所用的对照指导物显示于SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:4处。
表1：所靶向的SERPINA1及对照指导序列命名法、染色体坐标及序列
以上指导序列中的每一个可进一步包含其他核苷酸以形成crRNA，例如在指导序列的3’端后具有以下例示性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG(SEQ ID NO:140)。在sgRNA的情况下，以上指导序列可进一步包含其他核苷酸以形成sgRNA，例如在指导序列的3’端后具有以下例示性核苷酸序列：呈5’至3’方向的GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(SEQ ID NO:141)。
在一些实施方案中，sgRNA经修饰。在一些实施方案中，经修饰的sgRNA包含表2中所列举的序列(SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:408及SEQ ID NO:410至SEQ IDNO:421)中任一个。在表2中，“N”可为任何天然或非天然核苷酸。在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:130的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:130中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:130中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:410的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:410中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:410中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:411的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:411中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:411中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:412的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:412中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:412中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:413的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:413中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:413中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:414的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:414中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:414中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:415的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:415中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:415中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:416的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:416中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:416中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:417的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:417中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:417中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:418的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:418中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:418中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:419的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:419中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:419中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:420的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:420中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:420中所示的修饰模式。
在一些实施方案中，包含SEQ ID NO:421的组合物涵盖在内，其中SEQ ID NO:421中的各N共同地经选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代，其中保留SEQ ID NO:421中所示的修饰模式。
表2：经SERPINA1靶向的sgRNA
*＝PS键；’m’＝2’-O-Me核苷酸
除非另外说明，否则本文使用的以下术语和短语旨在具有以下含义：
“聚核苷酸”及“核酸”在本文中意指包含核苷或具有沿主链连接在一起的含氮杂环碱基或碱基类似物的核苷类似物的多聚化合物，其包括已知RNA、DNA、混合RNA-DNA及为其类似物的聚合物。核酸“主链”可由多个键组成，其包括糖-磷酸二酯键、肽-核酸键(“肽核酸”或PNA；PCT第WO 95/32305号)、硫代磷酸酯键、甲基膦酸酯键或其组合中的一个或多个。核酸的糖部分可为核糖、脱氧核糖或具有取代，例如2’甲氧基或2’卤基取代的类似化合物。含氮碱基可为已知碱基(A、G、C、T、U)；其类似物(例如经修饰的尿苷，诸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他)；肌苷；嘌呤或嘧啶的衍生物(例如N4-甲基脱氧鸟苷、脱氮或氮杂嘌呤、脱氮或氮杂嘧啶、在5或6位处具有取代基的嘧啶碱基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位处具有取代基的嘌呤碱基、2-氨基-6-甲基氨基嘌呤、O6-甲基鸟嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-氨基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶；美国专利第5,378,825号及PCT第WO 93/13121号)。对于一般论述，参见The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36,Adams等人编辑,第11版,1992。核酸可包括一种或多种“无碱基”残基，其中主链不包括针对聚合物位置的含氮碱基(美国专利第5,585,481号)。核酸可仅包含已知RNA或DNA糖、碱基及键，或可包括已知组分及取代两者(例如具有2’甲氧基键的已知碱基或含有已知碱基及一个或多个碱基类似物两者的聚合物)。核酸包括“锁定核酸”(LNA)、含有一种或多种LNA核苷酸单体的类似物，该单体具有模拟糖构形的锁定于RNA中的双环呋喃糖单元，其会增强对互补RNA及DNA序列的杂交亲和性(Vester及Wengel,2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且可通过在RNA中存在尿嘧啶或其类似物及在DNA中存在胸腺嘧啶或其类似物而有所不同。
“指导RNA”、“gRNA”及简称“指导物”在本文中互换使用来意指crRNA(也称为CRISPRRNA)或crRNA与trRNA(也称为tracrRNA)的组合。crRNA及trRNA可以单一RNA分子(单指导RNA，sgRNA)或以两个独立RNA分子(双指导RNA，dgRNA)形式结合。“指导RNA”或“gRNA”或“指导物”是指各类型。trRNA可为天然存在的序列或与天然存在的序列相比具有修饰或变化的trRNA序列。
如本文所用，“指导序列”是指指导RNA中与靶序列互补且用以通过RNA指导的DNA结合剂将指导RNA指导至靶序列以供结合或修饰(例如切割)的序列。“指导序列”也可称为“靶序列”或“间隔序列”。指导序列的长度可为20个碱基对，例如，在针对酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9(也即Spy Cas9)及目的Cas9同源物/直向同源物的指导RNA的情况下。较短或较长序列也可用作指导物，例如长度为15、16、17、18、19、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中，靶序列处于例如基因中或染色体上，且与指导序列互补。在一些实施方案中，指导序列与其相应靶序列之间的互补性或同一性的程度可为约75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，指导序列与标靶区可为100％互补或同一的。在其他实施方案中，指导序列与标靶区可含有至少一个错配。举例而言，指导序列及靶序列可含有1、2、3或4个错配，其命中序列的总长度为至少17、18、19、20或大于20个碱基对。在一些实施方案中，指导序列及标靶区可含有1至4个错配，其中指导序列包含至少17、18、19、20或大于20个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列及标靶区可含有1、2、3或4个错配，其中指导序列包含20个核苷酸。
针对Cas蛋白质的靶序列包括染色体组DNA的正链及负链两者(也即给测序列及该序列的反向互补序列)，因为Cas蛋白质的核酸底物为双链核酸。因此，在论述指导序列“与靶序列互补”的情况下，应理解，指导序列可指导指导RNA结合至靶序列的反向互补序列。因此，在一些实施方案中，在指导序列结合靶序列的反向互补序列的情况下，指导序列与靶序列(例如不包括PAM的靶序列)的某些核苷酸相同，不同的处在于指导序列中U取代T。
如本文所用，“RNA指导的DNA结合剂”意指具有RNA及DNA结合活性的多肽或多肽复合物，或此类复合物的DNA结合亚单位，其中DNA结合活性具有序列特异性且视RNA的序列而定。RNA指导的DNA结合剂包括Cas蛋白质(例如Cas9蛋白质)，诸如Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)。如本文所用，“Cas核酸酶”也称作“Cas蛋白质”，其涵盖Cas切割酶、Cas切口酶及其不活化形式(“dCas DNA结合剂”)。Cas蛋白质进一步涵盖III型CRISPR系统的Csm或Cmr复合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亚单位、I型CRISPR系统的级联复合物、其Cas3亚单位及2类Cas核酸酶。如本文所用，“2类Cas核酸酶”为具有RNA指导的DNA结合活性的单链多肽，诸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。2类Cas核酸酶包括2类Cas切割酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A变体)，其进一步具有RNA指导的DNA切割酶或切口酶活性，及2类dCas DNA结合剂，其中切割酶/切口酶活性未活化。2类Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如N497A/R661A/Q695A/Q926A变体)、HypaCas9(例如N692A/M694A/Q695A/H698A变体)、eSPCas9(1.0)(例如K810A/K1003A/R1060A变体)及eSPCas9(1.1)(例如K848A/K1003A/R1060A变体)蛋白质及其变体。Cpf1蛋白质(Zetsche等人,Cell,163:1-13(2015))与Cas9同源且含有RuvC样核酸酶结构域。Zetsche等人的Cpf1序列以全文引用的方式并入。参见例如，Zetsche等人，表S1及表S3。“Cas9”涵盖Spy Cas9、本文中所列的Cas9的变体及其等效物。参见例如，Makarova等人,Nat Rev Microbiol,13(11):722-36(2015)；Shmakov等人,Molecular Cell,60:385-397(2015)。
如本文所用，若第一序列与第二序列的比对显示整个第二序列的X％或更多的位置与第一序列相匹配，则该第一序列视为“包含与第二序列具有至少X％同一性的序列”。举例而言，序列AAGA包含与序列AAG具有100％同一性的序列，因为与第二序列的全部三个位置均出现匹配，所以比对结果为100％同一性。RNA与DNA之间的差异(通常而言，尿苷更换为胸苷或反之亦然)及核苷类似物(诸如经修饰的尿苷)的存在不会造成聚核苷酸之间同一性或互补性的差异，只要目的核苷酸(诸如胸苷、尿苷或经修饰的尿苷)具有相同互补物(例如针对胸苷、尿苷或经修饰的尿苷均为腺苷；另一实例为胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，这两者均以鸟苷或经修饰的鸟苷作为互补物)即可。因此，举例而言，序列5’-AXG(其中X为任何经修饰的尿苷，诸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)视为与AUG具有100％同一性，因为两者与同一序列(5’-CAU)完全互补。比对算法实例为Smith-Waterman及Needleman-Wunsch算法，其是此项技术中熟知的。本领域技术人员应理解选择何种算法及参数设置才适合所要比对的一对指测序列；对于具有一般类似长度及预期氨基酸有>50％同一性或核苷酸有>75％同一性的序列而言，由EBI于www.ebi.ac.uk网站服务器提供的Needleman-Wunsch算法接口的具有默认设置(default settings)的Needleman-Wunsch算法通常为合适的。
“mRNA”在本文中意指非DNA且包含可翻译成多肽的可读框的聚核苷酸(也即可作为由核糖体及氨基酰化tRNA进行翻译的底物)。mRNA可包含包括核糖残基或其类似物，例如2’-甲氧基核糖残基的磷酸酯-糖主链。在一些实施方案中，mRNA磷酸酯-糖主链的糖基本上由核糖残基、2’-甲氧基核糖残基或其组合组成。通常而言，mRNA不含大量胸苷残基(例如0个残基或小于30、20、10、5、4、3或2个胸苷残基；或小于10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％或0.1％的胸苷水平)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置处含有经修饰的尿苷。
如本文所用，“AAT”或“A1AT”是指α-1抗胰蛋白酶，其为SERPINA1基因的基因产物。
如本文所用，“AATD”或“A1AD”是指α-1抗胰蛋白酶缺乏症。AATD包含由SERPINA1中的多种不同遗传性突变所引起的疾病及病症。AATD可意指表达降低的AAT水平、不表达AAT或表达突变或非功能性AAT的疾病。
适用于本文所述的指导RNA组合物及方法中的指导序列展示于表1中。
如本文所用，“indel”是指由许多核苷酸组成的插入/缺失突变，该核苷酸在核酸中的双链断裂(DSB)位点处进行插入或缺失。
如本文所用，“敲减(knockdown)”是指特定基因产物(例如蛋白质、mRNA或两者)的表达降低。可通过检测由组织或细胞群(例如在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质或通过检测来自目的组织或细胞群的蛋白质的总细胞量，来测量蛋白质的敲减。用于测量mRNA的敲减的方法为已知的，且包括对从目的组织或细胞群分离的mRNA进行测序。在一些实施方案中，“敲减”意指特定基因产物表达有一些损失，例如经转录的mRNA的量下降或由细胞群(包括体内细胞群，诸如那些出现在组织中者)表达或分泌的蛋白质的量下降。
如本文所用，“敲除”是指丧失细胞中特定蛋白质的表达。可通过检测由组织或细胞群(例如在血清或细胞培养基中)分泌的蛋白质的量或通过检测来自组织或细胞群的蛋白质的总细胞量来测量敲除。在一些实施方案中，本发明方法在一种或多种细胞中(例如在细胞群，包括体内细胞群，诸如那些出现在组织中的)“敲除”AAT。在一些实施方案中，敲除并非例如通过indel导致形成突变AAT蛋白质，而是细胞中完全丧失AAT蛋白质的表达。
如本文所用，“突变AAT”是指与SERPINA1的野生型氨基酸序列(NCBI基因ID：5265；Ensembl：ENSG00000197249)相比，AAT的氨基酸序列发生变化的SERPINA1的基因产物(也即AAT蛋白质)。
如本文所用，“突变SERPINA1”或“突变SERPINA1等位基因”是指与野生型序列(NCBI基因ID：5265；Ensembl：ENSG00000197249)相比，SERPINA1的核苷酸序列发生变化的SERPINA1序列。
如本文所用，“核糖核蛋白”(RNP)或“RNP复合物”是指指导RNA及RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质。在一些实施方案中，指导RNA将RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas9指导至靶序列，且与RNA指导的DNA结合剂杂交的指导RNA会切割该靶序列。
如本文所用，“靶序列”是指靶基因中与gRNA的指导序列互补的核酸序列。靶序列与指导序列的相互作用指导RNA指导的DNA结合剂结合，且在靶序列中潜在地切口(nick)或切割(视试剂活性而定)。
如本文所用，“治疗”是指用于个体的疾病或病症的治疗剂的任何施用或施用，且包括抑制疾病、遏制其发展、缓解疾病的一种或多种症状、治愈疾病或预防疾病的一种或多种症状的复发。举例而言，AATD的治疗可包含缓解AATD的症状。
如本文所用，AAT的“Z突变体”、“Z型突变体”、“Z变体”、“PiZ变体”或“ZZ形式”是指SERPINA1基因序列中的突变，其导致谷氨酸在AAT的氨基酸序列中错义突变成赖氨酸(E342K突变)。
术语“约”或“大约”意指如由本领域技术人员所测定的特定值的可接受误差，其部分视如何测量或测定该值而定。
I.组合物
A.指导RNA(gRNA)
在一些实施方案中，本发明包含一种包含一种或多种指导RNA(gRNA)的组合物，该gRNA包含将RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9)指导至SERPINA1中的DNA靶序列的指导序列。gRNA可包含表1中所示的指导序列中的一个或多个。表1的指导序列可进一步包含crRNA及/或trRNA。在本文所述的各组合物及方法实施方案中，crRNA及trRNA可在一个RNA(sgRNA)上或可在独立RNA(dgRNA)上结合。
在本文所述的组合物及方法实施方案中的每一个中，指导RNA可包含呈“双指导RNA”或“dgRNA”形式的两个RNA分子。dgRNA包含含有指导序列的第一RNA分子(例如crRNA)及含有trRNA的第二RNA分子，该指导序列包含表1中所述的指导序列中任一个。第一和第二RNA分子并非共价连接，但可通过crRNA与trRNA的各部分之间的碱基配对形成RNA双螺旋体。
在本文所述的组合物及方法实施方案中的每一个中，指导RNA可包含呈“单指导RNA”或“sgRNA”形式的单一RNA分子。sgRNA包含与trRNA(或其部分)共价连接的crRNA(或其部分)，其包含表1中所述的指导序列中任一个。在一些实施方案中，crRNA与trRNA通过接头共价连接。在一些实施方案中，sgRNA通过crRNA与trRNA的各部分之间的碱基配对形成茎环结构。
在一些实施方案中，trRNA可包含来自天然存在的CRISPR/Cas系统的野生型trRNA序列的全部或一部分。在一些实施方案中，trRNA包含经截短或经修饰的野生型trRNA。trRNA的长度视所用CRISPR/Cas系统而定。在一些实施方案中，trRNA包含以下或由以下组成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或大于100个核苷酸。在一些实施方案中，trRNA可包含特定二级结构，诸如一种或多种发夹结构或茎环结构或一种或多种隆突结构。
在一些实施方案中，本发明包含一个或多个指导RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129中任一个的指导序列。
在一个方面中，本发明包含gRNA，其包含与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
在其他实施方案中，组合物包含至少两个gRNA，其包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中的任何两者或大于两者的指导序列。在一些实施方案中，组合物包含至少两个gRNA，各gRNA与SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的核酸中任一个具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性。
在一些实施方案中，gRNA为包含表2中所示的序列(SEQ ID NO 130至SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 408及SEQ ID NO 410至SEQ ID NO 421)中任一个的sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA包含与SEQ ID NO 130至SEQ ID NO 139及SEQ ID NO 408的核酸中任一个具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的序列。在一些实施方案中，在存在或不存在修饰下，sgRNA包含表1中所示的指导序列中任一个而不是表2的SEQ IDNO:130至SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:408及SEQ ID NO:410至SEQ ID NO:421处的sgRNA序列中所示的指导序列。
包含表2中所示的序列中任一个的修饰的指导RNA涵盖在内且通过SEQ ID No在其中加以鉴别。也即，核苷酸可以相同或不同，但所示修饰模式可与表2的gRNA的修饰模式相同或类似。修饰模式包括gRNA或gRNA的区的修饰的相对位置及同一性。在一些实施方案中，修饰模式为与表2的序列栏中所示的序列中任一个的修饰模式具有至少50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％及99％同一性。在一些实施方案中，修饰模式在0、1、2、3、4、5或6个核苷酸处与表2的序列或此类序列的区的修饰模式不同。在一些实施方案中，gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6个核苷酸处不同于表2的序列的修饰的修饰。
本发明的指导RNA组合物设计成识别SERPINA1基因中的靶序列。举例而言，可通过所提供的RNA指导的DNA结合剂识别且切割SERPINA1靶序列。在一些实施方案中，可通过指导RNA将Cas蛋白质指导至SERPINA1基因的靶序列，其中指导RNA的指导序列与靶序列杂交且Cas蛋白质切割该靶序列。
在一些实施方案中，一种或多种指导RNA的选择是基于SERPINA1基因中的靶序列而判定。
在不受特定理论束缚的情况下，基因的关键区处的突变可能要比基因的非关键区处的突变更不可容许，因此DSB的位置在可引起的蛋白质敲减或敲除的量或类型方面是重要因素。在一些实施方案中，使用与SERPINA1中的靶序列互补或具有互补性的gRNA来将Cas蛋白质指导至SERPINA1基因中的特定位置。在一些实施方案中，gRNA设计成具有与SERPINA1的外显子2、3、4或5中的靶序列互补或具有互补性的指导序列。
在一些实施方案中，gRNA设计成与编码AAT的N端区的SERPINA1的外显子中的靶序列互补或具有互补性。
B.经化学修饰的gRNA
在一些实施方案中，本发明包含含有一种或多种修饰的gRNA。在一些实施方案中，修饰包含经2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含处于各核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
相信经修饰的糖控制核苷酸糖环的皱褶，该皱褶为影响寡核苷酸对于互补链的结合亲和力、双螺旋形成及与核酸酶的相互作用的物理特性。糖环上的取代可因此改变这些糖的确认及皱褶。举例而言，2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰可增加寡核苷酸的结合亲和力及核酸酶稳定性，寡核苷酸中的给定位置处的任何修饰的作用需要凭经验确定。
术语“mA”、“mC”、“mU”或“mG”是用于表示已经2’-O-Me修饰核苷酸。
2’-O-甲基的修饰可如下描绘：
已显示影响核苷酸糖环的另一化学修饰为卤素取代。举例而言，核苷酸糖环上的2’-氟(2’-F)取代可增加寡核苷酸结合亲和力及核酸酶稳定性。
在本申请中，术语“fA”、“fC”、“fU”或“fG”是用于表示经2’-F取代的核苷酸。
2’-F的取代可如下描绘：
在一些实施方案中，修饰可为2’-O-(2-甲氧基乙基)(2’-O-moe)。2’-O-moe核糖核苷酸形式的核糖核苷酸的修饰可如下描绘：
术语“moeA”、“moeC”、“moeU”或“moeG”可用于表示经2’-O-moe修饰的核苷酸。
硫代磷酸酯(PS)连接或键(linkage/bond)是指硫取代磷酸二酯键，例如核苷酸碱基之间的键中的一个非桥联磷酸酯氧(nonbridging phosphateoxygen)的键。当硫代磷酸酯用于产生寡核苷酸时，经修饰的寡核苷酸也可称为S-寡核苷酸。
“*”可用于描绘PS修饰。在本申请中，术语A*、C*、U*或G*可用于表示经PS键连接至后续(例如3’)核苷酸的核苷酸。
在本申请中，术语“mA*”、“mC*”、“mU*”或“mG*”可用于表示经2’-O-Me取代且经PS键连接至后续(例如3’)核苷酸的核苷酸。
下图显示将S-取代为非桥联磷酸酯氧，产生PS键来替代磷酸二酯键：
无碱基核苷酸是指缺乏含氮碱基的那些核苷酸。下图描绘具有缺乏碱基的无碱基(也称为脱嘌呤)位点的寡核苷酸：
反向碱基是指具有自正常5’至3’键反向的键(也即5’至5’键或3’至3’键)的那些碱基。举例而言：
无碱基核苷酸可连接有反向键。举例而言，无碱基核苷酸可通过5’至5’键连接至末端5’核苷酸，或无碱基核苷酸可通过3’至3’键连接至末端3’核苷酸。末端5’或3’核苷酸任一个处的反向无碱基核苷酸也可称作反向无碱基端帽。
在一些实施方案中，对5’末端的5’端处之前三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个及3’末端的3’端处的最后三个、四个或五个核苷酸中的一个或多个进行修饰。在一些实施方案中，修饰为2’-O-Me、2’-F、2’-O-moe、反向无碱基核苷酸、PS键或此本领域中已知的其他核苷酸修饰，以增加稳定性及/或效能。
在一些实施方案中，5’末端的5’端处之前四个核苷酸及3’末端的3’端处的最后四个核苷酸与硫代磷酸酯(PS)键连接。
在一些实施方案中，5’末端的5’端处之前三个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个核苷酸包含经2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5’末端的5’端处之前三个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个核苷酸包含经2’-氟(2’-F)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，5’末端的5’端处之前三个核苷酸及3’末端的3’端处的最后三个核苷酸包含反向无碱基核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA包含经修饰的sgRNA。在一些实施方案中，sgRNA包含SEQID NO:130中所示的修饰模式，其中N为任何天然或非天然核苷酸，且其中全部N均包含将RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9)指导至靶序列的指导序列。在一些实施方案中，sgRNA包含SEQ ID NO:410至SEQ ID NO:421中任一个中所示的修饰模式，其中N为任何天然或非天然核苷酸，且其中全部N均包含将RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9)指导至靶序列的指导序列。在一些实施方案中，指导RNA包含SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139中任一个中所示的sgRNA。在一些实施方案中，指导RNA包含含有SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个及SEQ ID NO:408的核苷酸的sgRNA，其中SEQ ID NO:408的核苷酸处于指导序列的3’端上，且其中指导序列可如SEQ ID NO:130中所示加以修饰。在一些实施方案中，指导RNA包含含有SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个及SEQ ID NO:141的核苷酸的sgRNA，其中SEQ ID NO:141的核苷酸处于指导序列的3’端上，且其中指导序列可如SEQ IDNO:130中所示加以修饰。
在一些实施方案中，本文所公开的指导RNA包含2016年12月8日申请的US 62/431,756及2017年12月8日申请的标题为“经化学修饰的指导RNA(Chemically Modified GuideRNAs)”的PCT/US17/65306中所公开的修饰模式中的一个，其内容以全文引用的方式并入本文中。
C.载体
在某些实施方案中，本发明包含DNA载体，其包含含有本文所述的指导序列中任一个或多个的指导RNA中任一个。在一些实施方案中，除了指导RNA序列以外，载体进一步包含不编码指导RNA的核酸。不编码指导RNA的核酸包括(但不限于)启动子、增强子、调节序列及编码RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9)的核酸。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA或crRNA及trRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码sgRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA的核苷酸序列及编码Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA。在一些实施方案中，载体包含编码crRNA、trRNA的核苷酸序列及编码Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA。在一些实施方案中，载体包含编码sgRNA的核苷酸序列及编码Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA。在一个实施方案中，Cas9来自酿脓链球菌(也即Spy Cas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA及trRNA的核苷酸序列包含或由以下组成：通过来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的指导序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA组成的核酸可进一步构成(comprise)载体序列，其中该载体序列包含或由以下组成：不会与crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起经天然发现的核酸。
在一些实施方案中，crRNA及trRNA由一个载体中的非连续核酸编码。在其他实施方案中，crRNA及trRNA可由连续核酸编码。在一些实施方案中，crRNA及trRNA由单一核酸的相对链编码。在其他实施方案中，crRNA及trRNA由单一核酸的相同链编码。
D.核糖核蛋白复合物
在一些实施方案中，包含一个或多个gRNA的组合物涵盖在内，该gRNA包含来自表1或表2的一个或多个指导序列及RNA指导的DNA结合剂(例如Cas9)。在一些实施方案中，gRNA连同诸如Cas9的DNA结合剂称作核糖核蛋白复合物(RNP)。在一些实施方案中，RNA指导的DNA结合剂为Cas蛋白质。在一些实施方案中，gRNA连同Cas蛋白质称作Cas RNP。在一些实施方案中，RNP包含I型、II型或III型组分。在一些实施方案中，Cas蛋白质是来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质是来自II型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质是来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质为Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白质为Cpf1。在一些实施方案中，Cas蛋白质为来自II型CRISPR/Cas系统的Cas9蛋白质。在一些实施方案中，gRNA连同Cas9称作Cas9RNP。
在涵盖Cas核酸酶的实施方案中，Cas核酸酶可来自IIA型、IIB型或IIC型系统。可衍生出Cas核酸酶或其他RNP组分的非限制例示性物种包括酿脓链球菌、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、链球菌属物种(Streptococcus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无害利斯特氏菌(Listeria innocua)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、新凶手弗朗西丝氏菌(Francisella novicida)、产琥珀酸沃林氏菌(Wolinellasuccinogenes)、华德萨特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-变形菌(Gammaproteobacterium)、脑膜炎奈氏球菌(Neisseria meningitidis)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、多杀巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogene)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、达松维尔盘状菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋链霉菌(Streptomyces pristinaespiralis)、绿色产色链霉菌(Streptomycesviridochromogenes)、绿色产色链霉菌、玫瑰链孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰链孢囊菌、酸热脂环酸杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)、假蕈状芽孢杆菌(Bacillus pseudomycoides)、砷还原芽孢杆菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亚微小杆菌(Exiguobacterium sibiricum)、戴白氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳杆菌(Lactobacillus buchneri)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、海洋微颤菌(Microscilla marina)、伯克霍尔德氏细菌(Burkholderiales bacterium)、食萘极单胞菌(Polaromonasnaphthalenivorans)、极单胞菌属物种(Polaromonas sp.)、瓦氏鳄球藻(Crocosphaera watsonii)、蓝丝菌属物种(Cyanothece sp.)、绿脓微囊藻(Microcystisaeruginosa)、聚球藻属物种(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋杆菌(Acetohalobiumarabaticum)、丹氏制氨菌(Ammonifex degensii)、热解纤维素菌(Caldicelulosiruptorbecscii)、金矿菌候选种(Candidatus Desulforudis)、肉毒梭菌(Clostridiumbotulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈尔德菌(Finegoldia magna)、嗜热盐碱厌氧菌(Natranaerobius thermophilus)、热丙酸盐暗色厌氧香肠状菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus)、氧化亚铁嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色异着色菌(Allochromatiumvinosum)、海杆菌属物种(Marinobacter sp.)、嗜盐亚硝化球菌(Nitrosococcushalophilus)、瓦氏亚硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、游海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纤线杆菌(Ktedonobacter racemifer)、调查甲烷盐菌(Methanohalobium evestigatum)、多变念珠藻(Anabaena variabilis)、泡沫节球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻属物种(Nostoc sp.)、极大节旋藻(Arthrospiramaxima)、钝顶节旋藻(Arthrospira platensis)、节旋藻属物种(Arthrospira sp.)、鞘丝藻属物种(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、颤藻属物种(Oscillatoria sp.)、运动石袍菌(Petrotoga mobilis)、非洲高热杆菌(Thermosiphoafricanus)、巴氏链球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟氏菌(Neisseriacinerea)、红嘴鸥曲杆菌(Campylobacter lari)、食清洁剂细小棒菌(Parvibaculumlavamentivorans)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、氨基酸球菌属物种(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)及海洋藻青菌(Acaryochloris marina)。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自酿脓链球菌的Cas9蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自嗜热链球菌的Cas9蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自脑膜炎奈氏球菌的Cas9蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自金黄色葡萄球菌的Cas9蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自新凶手弗朗西丝氏菌的Cpf1蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自氨基酸球菌属物种的Cpf1蛋白质。在一些实施方案中，Cas核酸酶为来自毛螺科菌ND2006的Cpf1蛋白质。
野生型Cas9具有两个核酸酶结构域：RuvC及HNH。RuvC结构域切割非靶DNA链，且HNH结构域切割靶DNA链。在一些实施方案中，Cas9蛋白质包含多于一个RuvC结构域及/或多于一个HNH结构域。在一些实施方案中，Cas9蛋白质为野生型Cas9。在组合物及方法实施方案中的每一个中，Cas诱导靶DNA中发生双链断裂。
具有一个非活性催化结构域(RuvC或HNH)的Cas9的经修饰形式被称为“切口酶(nickase)”。切口酶仅切割靶DNA上的一条链，因此产生单链断裂。单链断裂也可称为“切口”。在一些实施方案中，组合物及方法包括切口酶。在一些实施方案中，组合物及方法包括在靶DNA中诱导切口而非双链断裂的切口酶Cas9。
在一些实施方案中，Cas蛋白质可经修饰以仅含有一个功能核酸酶结构域。举例而言，Cas蛋白质可经修饰以使得核酸酶结构域中的一个经突变或完全或部分缺失以降低其核酸切割活性。在一些实施方案中，使用具有活性降低的RuvC结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，使用具有非活性RuvC结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，使用具有活性降低的HNH结构域的切口酶Cas。在一些实施方案中，使用具有非活性HNH结构域的切口酶Cas。
在一些实施方案中，Cas蛋白质核酸酶结构域中的保守氨基酸经取代以降低或改变核酸酶活性。在一些实施方案中，Cas蛋白质可在RuvC或RuvC样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。RuvC或RuvC样核酸酶结构域中的例示性氨基酸取代包括D10A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如，Zetsche等人(2015)Cell Oct 22:163(3):759-771。在一些实施方案中，Cas蛋白质可在HNH或HNH样核酸酶结构域中包含氨基酸取代。HNH或HNH样核酸酶结构域中的例示性氨基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A(基于酿脓链球菌Cas9蛋白质)。参见例如，Zetsche等人(2015)。
在一些实施方案中，本文所述的RNP复合物包含切口酶及一对分别与靶序列的有义链及反义链互补的指导RNA。在此实施方案中，指导RNA将切口酶指导至靶序列且通过在靶序列的相对链上产生切口而引入DSB(也即双切口)。在一些实施方案中，使用双切口可改良特异性且减少脱靶效应。在一些实施方案中，连同靶向DNA的相对链的两个独立指导RNA使用切口酶Cas以在靶DNA中产生双切口。在一些实施方案中，连同经选择以非常接近的两个独立指导RNA使用切口酶Cas以在靶DNA中产生双切口。
在一些实施方案中，使用嵌合Cas蛋白质，其中该蛋白质的一个结构域或区经不同蛋白质的一部分替代。在一些实施方案中，Cas核酸酶结构域可经来自诸如Fok1的不同核酸酶的结构域替代。在一些实施方案中，Cas蛋白质可为经修饰的核酸酶。
在其他实施方案中，Cas蛋白质可来自I型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可为I型CRISPR/Cas系统的级联复合物的组分。在一些实施方案中，Cas蛋白质可为Cas3蛋白质。在一些实施方案中，Cas蛋白质可来自III型CRISPR/Cas系统。在一些实施方案中，Cas蛋白质可具有RNA切割活性。
E.gRNA功效的测定
在一些实施方案中，当与RNP的其他组分一起表达时，测定gRNA的功效。在一些实施方案中，gRNA与Cas一起表达。在一些实施方案中，gRNA在已稳定地表达Cas的细胞株中表达。
使用Cas RNP系统可引起DNA中发生双链断裂。非同源末端连接(NHEJ)为一种以下方法，通过该方法，DNA中的双链断裂(DSB)通过重新连接断裂末端而得到修补，其可能会产生呈插入/缺失(indel)突变形式的错误。在重新连接末端之前，DSB的DNA末端常常已经历酶处理，其引起在一或两条链处添加或移除核苷酸。重新连接之前的这些添加或移除引起DNA序列中NHEJ修复位点处存在插入或缺失(indel)突变。归因于indel的多种突变会改变阅读框架或过早地引入终止密码子，且因此产生非功能性蛋白质。
在一些实施方案中，特定gRNA的功效是基于体外模型而判定。在一些实施方案中，体外模型为稳定地表达Cas9的HEK293细胞(HEK293_Cas9)。在一些实施方案中，体外模型为HUH7人类肝癌细胞。在一些实施方案中，体外模型为sk-Hep人类肝腺癌细胞。在一些实施方案中，体外模型为原代人类肝细胞。在一些实施方案中，体外模型为HepG2细胞。
在一些实施方案中，在针对gRNA选择过程的多个体外细胞模型中测定特定指导序列的功效。在一些实施方案中，进行具有所选gRNA的数据的细胞株比较。在一些实施方案中，在多个细胞模型中进行交叉筛选。
在一些实施方案中，通过SERPINA1的编辑百分比测量指导RNA的功效。在一些实施方案中，对SERPINA1的编辑百分比与对照基因(例如gRNA不靶向的基因)的编辑百分比进行比较。在一些实施方案中，对照基因为如表1中所示的对照物1、2、3或4。在一些实施方案中，编辑百分率(例如“编辑效率”或“编辑百分比”)定义为相对于序列读段总数(包括野生型)的具有插入/缺失(“indel”)或取代的序列读段的总数。在一些实施方案中，指导RNA具有为约100％的编辑百分比。在一些实施方案中，编辑百分比为在例如5％与10％之间、10％与15％之间、15％与20％之间、20％与25％之间、30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间或95％与99％之间。
在一些实施方案中，本文所述的方法及组合物包含脱靶切割有所降低的指导RNA。在一些实施方案中，不存在可检测的脱靶切割。在一些实施方案中，在SERPINA1基因中，核苷酸的缺失或插入的发生要比在脱靶位点处多至少50倍或大于50倍。在一些实施方案中，在SERPINA1基因中，核苷酸的缺失或插入的发生要比在脱靶位点处多50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。
在一些实施方案中，指导RNA的功效是通过AAT的分泌测量。在一些实施方案中，使用具有培养基的酶联免疫吸附分析法(ELISA)分析来测量AAT的分泌。在一些实施方案中，在用于测量编辑的同一体外系统中测量AAT的分泌。在一些实施方案中，在原代人类肝细胞中测量AAT的分泌。在一些实施方案中，在HUH7细胞中测量AAT的分泌。
在一些实施方案中，细胞中的AAT的量测量出gRNA的功效。在一些实施方案中，使用western印迹来测量细胞中的AAT的量。在一些实施方案中，所用细胞为HUH7细胞。在一些实施方案中，对AAT的量与甘油醛3-磷酸脱氢酶GAPDH(持家基因)的量进行比较以控制细胞数目变化。
II.AATD的治疗
在一些实施方案中，提供一种在SERPINA1基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，该方法包括施用指导RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的任一个或多个指导序列，或SEQ IDNO:130至SEQ ID NO:139的sgRNA中任一个或多个。在一些实施方案中，施用包含SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个或多个的gRNA以在SERPINA1基因内诱导DSB。指导RNA可与RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质，诸如Cas9，或编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA或载体一起施用。在一些实施方案中，所施用的指导RNA为本文所述的指导RNA组合物中的一个或多个。
在一些实施方案中，提供一种修饰SERPINA1基因的方法，该方法包括施用指导RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个或多个，或SEQ ID NO:130至SEQID NO:139的sgRNA中任一个或多个。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的指导序列中任一个或多个的gRNA或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139的sgRNA中任一个或多个以修饰SERPINA1基因。指导RNA可与Cas蛋白质或编码Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA或载体一起施用。
在一些实施方案中，提供一种治疗AATD的方法，该方法包括施用指导RNA，其包含SEQID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个或多个，或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139的sgRNA中任一个或多个。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个或多个的gRNA或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139的sgRNA中任一个或多个以治疗AATD。指导RNA可与Cas蛋白质或编码Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA或载体一起施用。
在一些实施方案中，提供一种减少或预防AAT在个体的血清、肝脏、肝脏组织、肝脏细胞及/或肝细胞中累积的方法，该方法包括施用指导RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个或多个，或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139的sgRNA中任一个或多个。在一些实施方案中，施用包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个或多个的gRNA或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139的sgRNA中任一个或多个以减少或预防AAT在肝脏、肝脏组织、肝脏细胞及/或肝细胞中累积。gRNA可与RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质，或编码Cas蛋白质，诸如Cas9的mRNA或载体一起施用。
在一些实施方案中，包含表1或表2的指导序列的gRNA与Cas蛋白质一起诱导DSB，且修复期间的非同源末端连接(NHEJ)会引起SERPINA1基因中发生突变。在一些实施方案中，NHEJ引起核苷酸缺失或插入，其在SERPINA1基因内诱导移码或无义突变。
在一些实施方案中，施用本发明的指导RNA(例如以本文所提供的组合物形式)会降低由个体产生的经突变α-1抗胰蛋白酶(AAT)的水平，且因此预防AAT在肝脏中累积及聚集。
在一些实施方案中，个体为哺乳动物。在一些实施方案中，个体为人类。在一些实施方案中，个体为母牛、猪、猴、绵羊、狗、猫、鱼或家禽。
在一些实施方案中，提供使用包含表1或表2中的指导序列中任一个或多个的指导RNA(例如以本文所提供的组合物形式)以用于制备用于治疗患有AATD的人类个体的药物。
在一些实施方案中，静脉内施用指导RNA、组合物及配制物。在一些实施方案中，将指导RNA、组合物及配制物施用至肝循环中。
在一些实施方案中，单次施用本发明的指导RNA(例如以本文所提供的组合物形式)对于突变蛋白质的敲减为足够的。在一些实施方案中，单次施用本发明的指导RNA(例如以本文所提供的组合物形式)对于突变蛋白质的敲减或剔除表达为足够的。在其他实施方案中，多于一次施用本发明的指导RNA(例如以本文所提供的组合物形式)对于通过累积作用使编辑最大化可为有益的。
在一些实施方案中，在递送之后1年、2年、3年、4年、5年或10年会看到使用本发明组合物的处理功效。
在一些实施方案中，治疗会减缓或中断肝病进展。在一些实施方案中，治疗会改良肝病测量结果。在一些实施方案中，通过个体中的肝脏结构变化、肝功能或症状测量肝病。
在一些实施方案中，通过延迟或避免在个体中进行肝脏移植来测量治疗功效。在一些实施方案中，通过增加个体的存活时间来测量治疗功效。
在一些实施方案中，通过降低血液中的肝酶来测量治疗功效。在一些实施方案中，肝酶为丙氨酸转氨酶(ALT)或天冬氨酸转氨酶(AST)。
在一些实施方案中，通过基于活组织检查结果减缓在肝脏中产生疤痕组织或减少疤痕组织来测量治疗功效。
在一些实施方案中，使用经患者报导的结果，诸如疲劳、无力、瘙痒、食欲不振、食欲不振、体重减轻、恶心或腹胀来测量治疗功效。通过减少水肿、腹水或黄疸来测量治疗功效。在一些实施方案中，通过减少门静脉高血压来测量治疗功效。在一些实施方案中，通过降低肝癌率来测量治疗功效。
在一些实施方案中，使用成像方法来测量治疗功效。在一些实施方案中，成像方法为超音波、计算机断层摄影术、磁共振成像法或弹性成像。
在一些实施方案中，相较于施用组合物之前的血清及/或肝脏AAT水平，血清及/或肝脏AAT水平降低40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至95％、95％至98％、98％至99％或99％至100％。
在一些实施方案中，SERPINA1基因的编辑百分比在30％与99％之间。在一些实施方案中，编辑百分比在30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间或95％与99％之间。
A.组合疗法
在一些实施方案中，本发明包含组合疗法，其包含含有表1中所公开的指导序列中任一个或多个的gRNA中任一个或表2中的sgRNA中任一个或多个(例如呈本文所提供的组合物形式)及适用于缓解AATD的肺症状的增强疗法。在一些实施方案中，针对肺病的增强疗法为利用自人类血浆纯化的AAT的静脉内疗法，如Turner,BioDrugs 2013Dec；27(6):547-58中所述。在一些实施方案中，增强疗法利用或
在一些实施方案中，组合疗法包含含有表1中所公开的指导序列中任一个或多个的gRNA中任一个或表2中的sgRNA中任一个或多个(例如呈本文所提供的组合物形式)及靶向ATT或突变ATT的siRNA。在一些实施方案中，siRNA为能够进一步减少或消除野生型或突变AAT的表达的任何siRNA。在一些实施方案中，在包含表1中所公开的指导序列中任一个或多个的gRNA中任一个或表2中的sgRNA中任一个或多个(例如呈本文所提供的组合物形式)之后施用siRNA。在一些实施方案中，在用本文所提供的gRNA组合物中任一个处理之后定期施用siRNA。
B.gRNA的递送
在一些实施方案中，单独的或编码于一种或多种载体上的本文所述的指导RNA组合物配制于脂质纳米颗粒中或通过脂质纳米颗粒施用；参见例如2017年3月30日申请的标题为“CRISPR/CAS组分的脂质纳米颗粒配制物(LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FORCRISPR/CAS COMPONENTS)”的PCT/US2017/024973，其内容以全文引用的方式并入本文中。本领域技术人员已知的能够将核苷酸递送至个体的任何脂质纳米颗粒(LNP)配制物可与本文所述的指导RNA、以及编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas或Cas9的mRNA或RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas或Cas9蛋白质本身任一个一起利用。
在一些实施方案中，本发明包含一种向个体递送本文所公开的gRNA中任一个的方法，其中gRNA与LNP结合。在一些实施方案中，gRNA/LNP也与RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas9，或编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas9的mRNA结合。
在一些实施方案中，本发明包含一种包含所公开的gRNA中任一个及LNP的组合物。在一些实施方案中，组合物进一步包含Cas9或编码Cas9的mRNA。
在一些实施方案中，LNP包含阳离子脂质。在一些实施方案中，LNP包含脂质，诸如CCD脂质，诸如脂质A(十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称作(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-双(辛氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、脂质B(((5-((二甲氨基)甲基)-l,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,l-二基)双(癸酸酯)，也称作((5-((二甲氨基)甲基)-l,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,l-二基)双(癸酸酯))、脂质C(2-((4-(((3-(二甲氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-l,3-二基(9Z,9’Z,12Z,12’Z)-双(十八-9,12-二烯酸酯))或脂质D(3-辛基十一烷酸-(((3-(二甲氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰氧基)十三烷酯)。在一些实施方案中，LNP包含约4.5的阳离子脂质胺与RNA磷酸酯的摩尔比(N:P)。
在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA结合的LNP用于制备用于治疗AATD的药物。在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA结合的LNP用于制备用于减少或预防AAT在患有AATD的个体中累积及聚集的药物。在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA结合的LNP用于制备用于降低血清及/或肝脏AAT浓度的药物。在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA结合的LNP用于治疗个体，诸如哺乳动物，例如灵长类动物(诸如人类)中的AATD。在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA结合的LNP用于减少或预防AAT在患有AATD的个体，诸如哺乳动物，例如灵长类动物(诸如人类)中累积及聚集。在一些实施方案中，与本文所公开的gRNA结合的LNP用于降低个体，诸如哺乳动物，例如灵长类动物(诸如人类)中的血清AAT浓度。
电穿孔为递送货物的熟知手段，且任何电穿孔方法可用于递送本文所公开的gRNA中任一个。在一些实施方案中，电穿孔可用于递送本文所公开的gRNA中任一个及RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas9，或编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas9的mRNA。
在一些实施方案中，本发明包含一种向离体细胞递送本文所公开的gRNA中任一个的方法，其中gRNA与LNP结合或不与LNP结合。在一些实施方案中，gRNA/LNP或gRNA也与RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas9，或编码RNA指导的DNA剂，诸如Cas9的mRNA结合。
在某些实施方案中，本发明包含DNA或RNA载体，其编码包含本文所述的指导序列中任一个或多个的指导RNA中任一个。在某些实施方案中，本发明包含编码本文所述的指导序列中任一个或多个的DNA或RNA载体。在一些实施方案中，除了指导RNA序列以外，载体进一步包含不编码指导RNA的核酸。不编码指导RNA的核酸包括(但不限于)启动子、增强子、调节序列及编码RNA指导的DNA结合剂(其可为核酸酶，诸如Cas9)的核酸。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码crRNA、trRNA或crRNA及trRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码sgRNA的核苷酸序列及编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA，该RNA指导的DNA结合剂可为Cas蛋白质，诸如Cas9或Cpf1。在一些实施方案中，载体包含一个或多个编码crRNA、trRNA的核苷酸序列及编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA，该RNA指导的DNA结合剂可为Cas蛋白质，诸如Cas9或Cpf1。在一个实施方案中，Cas9来自酿脓链球菌(也即Spy Cas9)。在一些实施方案中，编码crRNA、trRNA或crRNA及trRNA(其可为sgRNA)的核苷酸序列包含或由以下组成：通过来自天然存在的CRISPR/Cas系统的重复序列的全部或一部分侧接的指导序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA组成的核酸可进一步构成载体序列，其中该载体序列包含或由以下组成：不会与crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起经天然发现的核酸。
在一些实施方案中，crRNA及trRNA由一个载体中的非连续核酸编码。在其他实施方案中，crRNA及trRNA可由连续核酸编码。在一些实施方案中，crRNA及trRNA由单一核酸的相对链编码。在其他实施方案中，crRNA及trRNA由单一核酸的相同链编码。
在一些实施方案中，载体可为环状。在其他实施方案中，载体可为线性。在一些实施方案中，载体可包封于脂质纳米颗粒、脂质体、非脂质纳米颗粒或病毒衣壳中。非限制例示性载体包括质粒、噬菌粒、黏粒、人工染色体、微型染色体、转座子、病毒载体及表达载体。
在一些实施方案中，载体可为病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可由其野生型对应物遗传修饰。举例而言，病毒载体可包含一种或多种核苷酸的插入、缺失或取代以促进克隆或使得载体的一个或多个特性发生变化。此类特性可包括包装容量、转导效率、免疫原性、基因组整合、复制、转录及翻译。在一些实施方案中，病毒基因组的一部分可缺失以使得病毒能够包装具有较大尺寸的外源性序列。在一些实施方案中，病毒载体可具有经增强的转导效率。在一些实施方案中，宿主中通过病毒诱导的免疫反应可有所减少。在一些实施方案中，促进将病毒序列整合至宿主基因组中的病毒基因(诸如整合酶)可经突变以使得病毒变成非整合性的。在一些实施方案中，病毒载体可为复制缺陷型。在一些实施方案中，病毒载体可包含外源性转录或翻译控制序列以驱动载体上的编码序列的表达。在一些实施方案中，病毒可为辅助依赖型。举例而言，病毒可需要一种或多种辅助病毒来供给所需病毒组分(诸如病毒蛋白)以扩增载体且将载体包装于病毒粒子中。在此情况下，可将一种或多种辅助组分，包括一个或多个编码该病毒组分的载体引入至宿主细胞以及本文所述的载体系统中。在其他实施方案中，病毒可不含辅助病毒。举例而言，病毒可能够扩增及包装载体而不需要任何辅助病毒。在一些实施方案中，本文所述的载体系统也可编码病毒扩增及包装所需的病毒组分。
非限制例示性病毒载体包括腺目的病毒(AAV)载体、慢病毒载体、腺病毒载体、辅助依赖型腺病毒载体(HDAd)、单纯疱疹病毒(HSV-1)载体、噬菌体T4、杆状病毒载体及反转录病毒载体。在一些实施方案中，病毒载体可为AAV载体。在一些实施方案中，病毒载体为AAV2、AAV3、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAVLK03。在其他实施方案中，病毒载体可为慢病毒载体。
在一些实施方案中，慢病毒可为非整合性的。在一些实施方案中，病毒载体可为腺病毒载体。在一些实施方案中，腺病毒可为高克隆容量或“无肠(gutless)”腺病毒，其中除5’及3’反向末端重复序列(ITR)及包装信号(『I』)之外的所有病毒编码区从病毒中被删除以增加其包装容量。在其他实施方案中，病毒载体可为HSV-1载体。在一些实施方案中，HSV-1类载体为辅助依赖型，且在其他实施方案中，其为非辅助依赖型。举例而言，仅保留包装序列的扩增子载体需要具有结构性组分的辅助病毒用于包装，而移除非必需病毒功能的缺失30kb的HSV-1载体不需要辅助病毒。在其他实施方案中，病毒载体可为噬菌体T4。在一些实施方案中，当清空病毒头时，噬菌体T4可能够包装任何直链或环状DNA或RNA分子。在其他实施方案中，病毒载体可为杆状病毒载体。在其他实施方案中，病毒载体可为反转录病毒载体。在使用具有较小克隆容量的AAV或慢病毒载体的实施方案中，可能需要使用多于一个载体以递送如本文所公开的载体系统的全部组分。举例而言，一个AAV载体可含有编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质(例如Cas9)的序列，而第二AAV载体可含有一个或多个指导序列。
在一些实施方案中，载体可能够驱动细胞中一个或多个编码序列的表达。在一些实施方案中，细胞可为原核细胞，诸如细菌细胞。在一些实施方案中，细胞可为真核细胞，诸如酵母、植物、昆虫或哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可为哺乳动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可为啮齿动物细胞。在一些实施方案中，真核细胞可为人类细胞。驱动不同类型细胞中的表达的适合启动子为此项技术中已知的。在一些实施方案中，启动子可为野生型。在其他实施方案中，启动子可经修饰以供较高效或较有效表达。在其他实施方案中，启动子可经截短但仍保留其功能。举例而言，启动子可具有正常尺寸或适用于将载体适当包装于病毒中的减小的尺寸。
在一些实施方案中，载体可包含编码本文所述的RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质(例如Cas9)的核苷酸序列。在一些实施方案中，通过载体编码的核酸酶可为Cas蛋白质。在一些实施方案中，载体系统可包含一个编码核酸酶的核苷酸序列的拷贝。在其他实施方案中，载体系统可包含多于一个编码核酸酶的核苷酸序列的拷贝。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可与至少一个转录或翻译控制序列有效连接。在一些实施方案中，编码核酸酶的核苷酸序列可与至少一个启动子有效连接。
在一些实施方案中，启动子可为组成性、诱导性或组织特异性的。在一些实施方案中，启动子可为组成性启动子。非限制例示性的组成性启动子包括细胞巨大病毒即刻早期启动子(CMV)、猴病毒(SV40)启动子、腺病毒主要晚期启动子(MLP)、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、延长因子-α(EF1a)启动子、泛素启动子、肌动蛋白启动子、微管蛋白启动子、免疫球蛋白启动子、其功能性片段或前述中任一个的组合。在一些实施方案中，启动子可为CMV启动子。在一些实施方案中，启动子可为经截短的CMV启动子。在其他实施方案中，启动子可为EF1a启动子。在一些实施方案中，启动子可为诱导性启动子。非限制例示性的诱导性启动子包括可通过热冲击、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的诱导性启动子。在一些实施方案中，诱导性启动子可为具有低基础(非经诱导)表达程度的一种诱导性启动子，诸如启动子(Clontech)。
在一些实施方案中，启动子可为组织特异性启动子，例如对肝脏中的表达具有特异性的启动子。
载体可进一步包含编码本文所述的指导RNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含指导RNA的一个拷贝。在其他实施方案中，载体包含指导RNA的多于一个拷贝。在具有多于一个指导RNA的实施方案中，指导RNA可不同，使得其靶向不同靶序列，或可相同以便其靶向相同靶序列。在其中载体包含多于一个指导RNA的一些实施方案中，各指导RNA可具有其他不同特性，诸如在与RNA指导的DNA核酸酶的复合物，诸如Cas RNP复合物中的活性或稳定性。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可与至少一个转录或翻译控制序列，诸如启动子、3’UTR或5’UTR有效连接。在一个实施方案中，启动子可为tRNA启动子，例如tRNALys3，或tRNA嵌合体。参见Mefferd等人,RNA.2015 21:1683-9；Scherer等人,NucleicAcids Res.2007 35:2620-2628。在一些实施方案中，启动子可通过RNA聚合酶III(PolIII)识别。Pol III启动子的非限制性实例包括U6及H1启动子。在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可与小鼠或人类U6启动子有效连接。在其他实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可与小鼠或人类H1启动子有效连接。在具有多于一个指导RNA的实施方案中，用于驱动表达的启动子可相同或不同。在一些实施方案中，编码指导RNA的crRNA的核苷酸及编码指导RNA的trRNA的核苷酸可提供于相同载体上。在一些实施方案中，编码crRNA的核苷酸及编码trRNA的核苷酸可通过同一启动子驱动。在一些实施方案中，crRNA及trRNA可转录为单一转录物。举例而言，crRNA及trRNA可由单一转录物进行处理以形成双分子指导RNA。或者，crRNA及trRNA可转录为单分子指导RNA(sgRNA)。在其他实施方案中，crRNA及trRNA可通过其处于相同载体上的相应启动子来驱动。在其他实施方案中，crRNA及trRNA可通过不同载体编码。
在一些实施方案中，编码指导RNA的核苷酸序列可位于包含编码RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质的核苷酸序列的相同载体上。在一些实施方案中，指导RNA的表达及RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质的表达可通过其自身相应启动子来驱动。在一些实施方案中，指导RNA的表达可通过驱动RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质的表达的相同启动子来驱动。在一些实施方案中，指导RNA及RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质转录物可包含于单一转录物中。举例而言，指导RNA可处于RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质转录物的未翻译区(UTR)中。在一些实施方案中，指导RNA可处于转录物的5’UTR中。在一些实施方案中，指导RNA可处于转录物的3’UTR中。在一些实施方案中，转录物的胞内半衰期可通过在其3’UTR中含有指导RNA且由此缩短其3’UTR的长度而降低。在其他实施方案中，指导RNA可处于转录物的内含子中。在一些实施方案中，可在指导RNA所处的内含子处添加适合剪接位点以使得自转录物恰当地剪接掉指导RNA。在一些实施方案中，时间上紧邻的来自相同载体的RNA指导的DNA结合剂，诸如Cas蛋白质及指导RNA的表达可促进较高效形成CRISPR RNP复合物。
在一些实施方案中，组合物包含载体系统。在一些实施方案中，载体系统可包含一个单一载体。在其他实施方案中，载体系统可包含两个载体。在其他实施方案中，载体系统可包含三个载体。当将不同指导RNA用于多任务(multiplexing)时或当使用指导RNA的多个拷贝时，载体系统可包含多于三个载体。
在一些实施方案中，载体系统可包含诱导性启动子以仅在其递送至靶细胞之后开始表达。非限制例示性的诱导性启动子包括可通过热休克、光、化学物质、肽、金属、类固醇、抗生素或醇诱导的诱导性启动子。在一些实施方案中，诱导性启动子可为具有低基础(非经诱导)表达程度的一种诱导性启动子，诸如启动子(Clontech)。
在其他实施方案中，载体系统可包含组织特异性启动子以仅在其递送至特定组织中之后开始表达。
载体可通过脂质体、纳米颗粒、外来体或微泡递送。载体也可通过脂质纳米颗粒(LNP)递送。本文所述的LNP及LNP配制物中任一个适用于递送单独的指导物或与Cas核酸酶或编码Cas核酸酶的mRNA一起递送。在一些实施方案中，涵盖一种包含以下的LNP组合物：RNA组分及脂质组分，其中脂质组分包含胺脂质、中性脂质、辅助脂质及隐形脂质；且其中N/P比为约1至10。
在一些情况下，脂质组分包含脂质A、胆固醇、DSPC及PEG-DMG；且其中N/P比为约1至10。在一些实施方案中，脂质组分包含：约40至60mol％胺脂质；约5至15mol％中性脂质；及约1.5％至10mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为辅助脂质，且其中LNP组合物的N/P比为约3至10。在一些实施方案中，脂质组分包含约50至60mol％胺脂质；约8至10mol％中性脂质；及约2.5％至4mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为辅助脂质，且其中LNP组合物的N/P比为约3至8。在一些情况下，脂质组分包含：约50至60mol％胺脂质；约5至15mol％DSPC；及约2.5％至4mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为胆固醇，且其中LNP组合物的N/P比为约3至8。在一些情况下，脂质组分包含：48至53mol％脂质A；约8至10mol％DSPC；及约1.5％至10mol％PEG脂质，其中脂质组分的其余部分为胆固醇，且其中LNP组合物的N/P比为3至8±0.2。
在一些实施方案中，可系统地递送载体。在一些实施方案中，载体可递送于肝循环中。
在一些实施方案中，可系统地递送载体。在一些实施方案中，载体可递送于肝循环中。
III.特定实施方案的叙述
在一些实施方案中，本发明包含含有指导RNA的组合物，该指导RNA包含选自SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:129的指导序列。在一些情况下，提供包含指导RNA的组合物，该指导RNA包含与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
指导RNA可与人类SERPINA1基因中所存在的靶序列至少部分互补。
指导RNA可将核酸酶指导至处于人类SERPINA1基因的外显子2、3、4或5中的靶序列。
在一些实施方案中，指导RNA将核酸酶指导至处于人类SERPINA1基因的外显子2中的靶序列。在一些情况下，靶向外显子2的指导RNA选自CR001370、CR001373、CR001374、CR001376、CR001379、CR001380、CR001386、CR001386、CR003196、CR001391、CR003198、CR001395、CR001397、CR001400、CR001404、CR001405、CR003208、CR001409、CR001413、CR001421、CR001422及CR001427。
在一些实施方案中，指导RNA将核酸酶指导至处于人类SERPINA1基因的外显子3中的靶序列。在一些情况下，靶向外显子3的指导RNA选自CR001450、CR003214、CR001453、CR001454及CR003217。
在一些实施方案中，指导RNA将核酸酶指导至处于人类SERPINA1基因的外显子4中的靶序列。在一些情况下，靶向外显子4的指导RNA选自CR003225及CR003226。
在一些实施方案中，指导RNA将核酸酶指导至处于人类SERPINA1基因的外显子5中的靶序列。在一些情况下，靶向外显子5的指导RNA选自CR001475及CR001476。
在一些情况下，指导RNA为双指导(dgRNA)。指导也可为单指导RNA(sgRNA)。
在一些实施方案中，本发明包含含有本文所公开的指导序列中任一个的crRNA，且其进一步包含SEQ ID NO:140的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140的核苷酸在指导序列的3’端后。在一些实施方案中，双指导RNA进一步包含trRNA。
在一些实施方案中，本发明包含含有选自SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139或SEQ IDNO:408的序列的sgRNA。
在一些情况下，sgRNA包含与选自SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:408的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
本发明包含含有SEQ ID NO:130的核苷酸的sgRNA，其中N为任何天然或非天然核苷酸，且其中各N共同地形成使Cas9靶向SERPINA1基因的指导序列。
在一些实施方案中，sgRNA包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129中任一个的指导序列。
在一些实施方案中，提供包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列中任一个及SEQ ID NO:408的核苷酸的sgRNA。
在一些实施方案中，在载体上编码指导序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与SERPINA1的正链中的靶序列互补的指导序列。在一些实施方案中，指导RNA包含与SERPINA1的负链中的靶序列互补的指导序列。
在一些实施方案中，包含指导序列的指导RNA进一步包含第二指导序列，其中第一指导序列与SERPINA1基因的正链中的第一靶序列互补，且第二指导序列与SERPINA1基因的负链中的第二靶序列互补。
本发明的指导RNA可经修饰。在一些实施方案中，修饰包含经2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含处于各核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。在一些实施方案中，修饰包含经2’-氟(2’-F)修饰的核苷酸。在一些实施方案中，修饰包含反向无碱基核苷酸。
在一些实施方案中，在5’端前五个核苷酸中的一处或多处的修饰。在一些实施方案中，在3’端最后五个核苷酸中的一处或多处的修饰。
在一些实施方案中，修饰包含处于前四个核苷酸之间的PS键。在一些实施方案中，修饰包含处于最后四个核苷酸之间的PS键。经PS修饰的指导物可进一步包含处于5’端前三个核苷酸处和3’端最后三个核苷酸处的经2’-O-Me修饰的核苷酸。
在一些实施方案中，指导RNA包含经修饰的SEQ ID NO:408的核苷酸。
在一些实施方案中，提供包含所述指导RNA中任一个及可药用赋形剂或载体的组合物或配制物。
在一些实施方案中，提供包含与脂质纳米颗粒(LNP)结合的如本文所述的指导RNA的组合物。
组合物可进一步包含核酸酶蛋白质或编码核酸酶的mRNA。
在一些实施方案中，核酸酶为Cas。在一些实施方案中，Cas为Cas9。在一些实施方案中，Cas为Cpf1。在一些实施方案中，核酸酶为切口酶。在一些实施方案中，核酸酶经修饰。在一些实施方案中，经修饰的核酸酶包含核定位信号(NLS)。
在一些实施方案中，Cas来自I型、II型或III型CRISPR/Cas系统。
在一些实施方案中，提供在SERPINA1基因内诱导双链断裂(DSB)的方法，该方法包含施用本文所述的指导RNA、组合物或配制物中任一个或多个。
在一些实施方案中，提供修饰SERPINA1基因的方法，该方法包括递送Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的核酸及本文所述的指导RNA、组合物或配制物中任一个或多个。
在一些实施方案中，提供治疗AATD的方法，该方法包括施用Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的核酸及本文所述的指导RNA、组合物或配制物中任一个或多个，由此治疗AATD。
在一些实施方案中，提供用于减少或预防AAT在个体肝脏中累积的方法，该方法包括施用Cas蛋白质或编码Cas蛋白质的核酸及本文所述的指导RNA、组合物或配制物中任一个或多个，由此减少AAT在肝脏中累积。
在一些实施方案中，肝脏细胞中的ATT得到减少或阻止。在一些实施方案中，肝脏细胞为肝细胞。
在一些方法及用途实施方案中，个体患有AATD。
在一些实施方案中，非同源末端连接(NHEJ)在修复SERPINA1基因中的DSB期间引起突变。在一些情况下，NHEJ在修复SERPINA1基因中的DSB期间引起核苷酸缺失或插入。在一些实施方案中，核苷酸的缺失或插入在SERPINA1基因内诱导移码或无义突变。
在一些实施方案中，施用会降低α-1抗胰蛋白酶(AAT)的水平。可在血清、血浆、血液、脑脊液或痰中测量AAT水平。可在肝脏组织中测量AAT的水平。
在一些方法及用途实施方案中，个体为人类。人类个体可具有α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。个体可具有AATD家族病史。个体可具有AATD的肝脏及肺症状。个体可仅具有或主要具有AATD的肝脏症状。
在一些实施方案中，个体表达具有E342K突变的AAT。在一些实施方案中，个体在SERPINA1基因座处具有至少一个Z等位基因。在一些实施方案中，个体在SERPINA1基因座处具有至少一个S等位基因。在一些实施方案中，个体的Z等位基因在SERPINA1基因座处为纯合的。在一些实施方案中，个体的Z等位基因在SERPINA1基因座处为杂合的。在一些实施方案中，个体在SERPINA1基因座处具有一个Z等位基因及一个S等位基因。
个体在AAT的氨基酸序列处可不具有E342K突变，但仍具有降低水平的野生型AAT。
在一些实施方案中，在施用之后，个体的水肿、腹水或黄疸有所改善、稳定或减缓，或对肝脏移植的需要有所延迟。在一些实施方案中，在施用之后，如通过成像方法或肝酶水平所测量，个体由于施用而具有改善、稳定或减缓变化。
可通过病毒载体施用本文所述的指导物、组合物或药物制剂中任一个。
可通过脂质纳米颗粒施用本文所述的指导物、组合物或药物制剂中任一个。
在一些实施方案中，在施用指导物、组合物或配制物之前针对SERPINA1基因中的特定突变测试个体。
在一些实施方案中，涵盖本文所述的指导物、组合物或配制物中任一个的用途，其用于制备用于治疗患有AATD的人类个体的药物。
本说明书及例示性实施方案不应视为限制性的。出于本说明书及所附权利要求的目的，除非另外指示，否则表示量、百分比或比例，及说明书及权利要求中所用的其他数值的所有数目均应理解为在所有情况下通过术语“约”修饰，程度为其尚未如此修饰。因此，除非有相反指示，否则本说明书及所附权利要求中所阐述的数值参数为可视设法获得的所需特性而变化的近似值。至少，且不试图将均等论的应用限于权利要求的范畴，各数值参数至少应根据所报导的有效数字的个数且通过应用普通舍入技术来解释。
应注意，如在本说明书及权利要求中所用，除非明确地且肯定地限于一个指示物，否则单数形式“一(一个)”与“该”及任何字语的任何单数使用包括复数个指示物。如本文所用，术语“包括”及其语法变体意欲为非限制性的，使得清单中的项目的列举不排除可取代或添加至所列项目的其他类似项。
实施例
提供以下实施例以说明某些所公开的实施方案且不应理解为以任何方式限制本发明的范畴。
实施例1-材料及方法
1.核酸酶mRNA的体外转录(“IVT”)
使用线性化质粒DNA模板及T7RNA聚合酶通过体外转录产生含有N1-甲基假-U的加帽及聚腺苷酸化酿脓链球菌(“Spy”)Cas9mRNA。通过与XbaI利用以下条件在37℃下孵育2小时来线性化含有T7启动子及100nt聚(A/T)区的质粒DNA：200ng/μL质粒、2U/μL XbaI(NEB)及1×反应缓冲液。通过在65℃下加热反应20分钟来灭活XbaI。使用二氧化硅最大自旋柱(EpochLife Sciences)自酶及缓冲盐纯化线性化质粒且通过琼脂糖凝胶加以分析以证实线性化。用于产生经Cas9修饰的mRNA的IVT反应物在37℃下在以下条件下孵育4小时：50ng/μL线性化质粒；2mM的GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP(Trilink)中的每一个；10mM ARCA(Trilink)；5U/μL T7RNA聚合酶(NEB)；1U/μL鼠RNA酶抑制剂(NEB)；0.004U/μL无机大肠杆菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反应缓冲液。在孵育4小时之后，添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01U/μL的最终浓度，且再孵育反应物30分钟以移除DNA模板。使用MegaClear转录清除试剂盒根据制造商方案(ThermoFisher)自酶及核苷酸纯化Cas9mRNA。通过测量260nm处的光吸收(Nanodrop)测定转录物浓度，且通过以Bioanlayzer(Agilent)进行毛细电泳法而分析转录物。
对于实施例2及实施例3中所述的实验，使用包含SEQ ID NO:422的质粒DNA模板来产生IVT Cas9mRNA。对于实施例4及实施例5中所述的实验，使用包含SEQ ID NO:423的质粒DNA模板来产生IVT Cas9mRNA。
实施例2及实施例3中所用的用于产生IVT mRNA的DNA序列(SEQ ID NO:422)：
实施例4及实施例5中所用的用于产生IVT mRNA的DNA序列(SEQ ID NO：423)：
2.人类SERPINA1指导设计和具有食蟹猴同源性的人类SERPINA1指导设计
使用人类参考基因组(例如，hg38)和使用者定义的目的基因组区(例如编码外显子的SERPINA1蛋白质)通过计算器进行初始指导选择以鉴别目的区中的PAM。对于各经鉴别的PAM，进行分析且报导统计资料。基于此项技术中已知的多种准则(例如GC水平、预测命中活动和可能的脱靶活动)进一步选择gRNA分子且进行等级排序。
针对靶向外显子2和外显子3中的蛋白质编码区的SERPINA1(ENSG00000197249.13)设计总共88个指导RNA。将这些88个指导物加上4个对照指导物置放于96孔格式中。同时，将靶向在食蟹猴中具有100％同源性的SERPINA1的外显子2至5的51个指导RNA加上4个对照指导物(一式两份)置放于96孔格式中。指导RNA中的指导序列及相应基因组坐标提供于下文中(表1)。
3.Cas9mRNA及指导RNA体外递送
在补充有10％小牛血清及500μg/ml G418的DMEM培养基中培养组成性表达Spy Cas9(“HEK293_Cas9”)的人胎肾腺癌细胞株HEK293。在转染之前20小时在96孔板中以10,000个细胞/孔的密度铺板细胞(在转染时间时汇合～70％)。根据制造商方案用脂转染胺RNAiMAX(Lipofectamine RNAiMAX)(ThermoFisher，目录号13778150)转染细胞。用含有独立crRNA(25nM)、trRNA(25nM)、Lipofectamine RNAiMAX(0.3微升/孔)及OptiMem的脂复合体转染细胞。
在补充有10％小牛血清的DMEM培养基中培养人类肝细胞癌细胞株HUH7(研究生物资源日本保藏细胞库(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)，保藏号JCRB0403)。在转染之前20小时在96孔板中以15,000个细胞/孔的密度铺板细胞(在转染时间时汇合～70％)。根据制造商方案用脂转染胺MessengerMAX(ThermoFisher，目录号LMRNA003)转染细胞。用含有Spy Cas9mRNA(100ng)、MessengerMAX(0.3微升/孔)及OptiMem的脂复合体，随后用含有独立crRNA(25nM)、示踪RNA(25nM)、MessengerMAX(0.3微升/孔)及OptiMem的单独脂复合体依序转染细胞。
根据制造商(Invitrogen，方案11.28.2012)培养原代人类肝脏肝细胞(PHH)(Gibco，批号Hu8249)。简言之，解冻细胞且再悬浮于具有补充剂(Gibco，目录号CM7500)的肝细胞解冻培养基中，随后加以离心。弃去上清液且将经沉淀的细胞再悬浮于肝细胞铺板培养基加上补充包(Invitrogen，目录号A1217601及CM3000)中。对细胞进行计数且以33,000个细胞/孔的密度铺板于经Bio-coat胶原蛋白I涂布的96孔板(ThermoFisher，目录号877272)上。使经铺板的细胞在处于37℃及5％CO2氛围下的组织培养恒温箱中静置且黏附持续5小时。在孵育之后，针对单层形式检查细胞且用具有无血清补充包(Invitrogen，目录号A1217601及CM4000)的肝细胞培养基洗涤一次。同时，通过混合等量的试剂且在95℃下孵育2min且冷却至室温来对独立crRNA及trRNA进行预退火。将由经预退火的crRNA及trRNA组成的双指导物(dgRNA)与Spy Cas9蛋白质一起孵育以形成核糖核蛋白(RNP)复合物。根据制造商方案用脂转染胺RNAiMAX(ThermoFisher，目录号13778150)转染细胞。用含有Spy Cas9(10nM)、独立crRNA(10nM)、示踪RNA(10nM)、脂转染胺RNAiMAX(1.0微升/孔)及OptiMem的RNP转染细胞。
在补充有10％小牛血清的DMEM培养基中培养人类肝细胞癌细胞株HepG2(美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，保藏号HB-8065)。对细胞进行计数且以96孔板中每个孔15,000个细胞的密度铺板于经Bio-coat胶原蛋白I涂布的96孔板(ThermoFisher，目录号877272)上，24小时之后与LNP一起孵育，如实施例4中进一步描述。
4.基因组DNA分离
转染后24或48小时时收集HEK293_Cas9、HUH7及PHH转染细胞。根据制造商方案使用50微升/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目录号QE09050)自96孔板的各孔提取gDNA。如本文所述，对所有DNA样本进行PCR及后续NGS分析。
5.针对命中切割效率的第二代测序(“NGS”)及分析
为了定量地测定基因组中的目标位置处的编辑效率，使用深度测序来鉴别通过基因编辑引入的插入及缺失的存在。
围绕目的基因(例如SERPINA1)中的靶位点设计PCR引物，且扩增目的基因组区。引物序列提供于表3中。
表3：针对所靶向SERPINA1及对照crRNA的测序引物
根据制造商方案(Illumina)进行额外PCR以对于测序添加化学品。在Illumina MiSeq仪器上对扩增子测序。在消除具有低质量评分的读段之后，将读段与人类参考基因组(例如hg38)比对。将含有读段的所得档案映像至参考基因组(BAM档案)，其中选择与目的靶区结构域重叠的读段且计算野生型读段的数目相对于含有插入、取代或缺失的读段的数目。
编辑百分比(例如“编辑效率”或“编辑百分率”)定义为具有插入/缺失(“indel”)或取代的序列读段的总数相对于包括野生型的序列读段的总数。
6.α-1抗胰蛋白酶(“AAT”)ELISA
如先前所述用来自表1的所选指导物转染肝细胞癌细胞株HUH7。转染后六天，用PBS洗涤细胞一次且随后用200μL具有10％FBS的标准DMEM培养基替换。四小时后，收集培养基且储存于-20℃下。根据制造商方案在贴壁细胞上完成CellTiter-Glo(“CTG”)分析(Promega，目录号G7570)。使用AAT ELISA试剂盒(R&D Systems，目录号DY1268)测定总AAT水平。使用制造商方案制备试剂盒试剂及标准品。在运行ELISA之前，在室温下解冻冷冻培养基且以1000rpm离心1分钟而沉淀碎片且随后置放于冰上。对于ELISA，用70μL1×分析稀释液稀释30μL培养基。根据制造商方案完成ELISA方案。在SpectraMax M5板读取器上读取板。使用脱离标准曲线的四参数逻辑曲线拟合通过SoftMax Pro软件版本6.4.2计算AAT水平。通过基于获自CTG分析的各值比较板平均值来估算各孔的细胞数。根据细胞数调节最终AAT水平(pg/ml)。
7.通过western印迹的AAT蛋白质分析
如先前所述用来自表1的所选指导物转染肝细胞癌细胞株HUH7。转染后六天，移除培养基且用50微升/孔RIPA缓冲液(Boston Bio Products，目录号BP-115)加上新鲜添加的由complete蛋白酶抑制剂混合物(Sigma，目录号11697498001)、1mM DTT及250U/ml核酸酶(EMD Millipore，目录号71206-3)组成的蛋白酶抑制剂混合物裂解细胞。将细胞保存于冰上持续30分钟，此时添加NaCl(1M最终浓度)。充分混合细胞裂解物且保留于冰上持续30分钟。将全细胞提取物(“WCE”)转移至PCR板且离心沉淀碎片。使用Bradford分析(Bio-Rad，目录号500-0001)来评定裂解物的蛋白质水平。根据制造商方案完成Bradford分析方案。在使用之前将提取物储存于-20℃下。进行western印迹以评定AAT蛋白质水平。将裂解物与勒姆利缓冲液(Laemmli buffer)混合且在95℃下变性10分钟。根据制造商方案使用NuPage系统于4％至12％Bis-Tris凝胶(ThermoFisher)上运行western印迹，之后湿转移至0.45μm硝化纤维素膜(Bio-Rad，目录号1620115)上。转移之后，用水彻底冲洗膜且用丽春红S(PonceauS)溶液(Boston Bio Products，目录号ST-180)染色以确认完成及甚至转移。在室温下在实验室摇床(rocker)上使用于TBS中的5％乳粉封闭印迹30分钟。用TBST冲洗印迹且用兔α-AAT多株抗体(Sigma，目录号HPA001292)于TBST中以1:1000进行探测。于TBST中以1:2500使用GAPDH作为负荷对照(ThermoFisher，目录号NB600502)且同时与AAT初次抗体一起孵育。将印迹密封在包中且在4℃下于实验室摇床上保持过夜。孵育之后，各自在TBST中冲洗印迹3次持续5分钟且用小鼠及兔的二次抗体(ThermoFisher，目录号PI35518及PISA535571)各自在TBST中以1:25,000在室温下探测持续30分钟。孵育之后，各自在TBST中冲洗印迹3次持续5分钟且用PBS冲洗2次。观测印迹且使用Licor Odyssey系统加以分析。
8.脂质纳米颗粒(LNP)配制物
以4.5的N:P比(胺比RNA磷酸酯)(N:P)配制LNP。以以下摩尔比将脂质纳米颗粒组分溶解于100％乙醇中：45mol％阳离子脂质(脂质A)；44mol％胆固醇；9mol％DSPC；及2mol％PEG2k-DMG。将RNA货物(1:1 mRNA:sgRNA(wt/wt))溶解于pH 4.5下的25Mm乙酸钠缓冲液中，得到大约0.45mg/mL的RNA货物的浓度。LNP是通过根据制造商方案，使用PrecisionNanosystems NanoAssemblrTM台式仪器将脂质及RNA溶液微流体混合而形成。以3:1的比率于水中收集LNP。在室温下孵育LNP一小时。将剩余缓冲液更换为pH 7.5下的50mM Tris(超过样本体积100倍)，使用10kDa Slide-a-LyzerTM G2透析盒(ThermoFisher Scientific)在4℃下在温和搅拌下过夜。次日，使用Amicon过滤器浓缩(以4000g在4℃下)LNP两次以达成所需浓度。随后使其与2×TSS(50mM Tris、90mM氯化钠、10％w/v蔗糖，pH 7.5下)1:1混合。随后使用0.2μM过滤器过滤所得混合物。将所得过滤物储存于2℃至8℃下。
实施例2-筛选及指导物质检
1.多种细胞类型中的SERPINA1指导物的交叉筛选
如实施例1中所述将靶向人类SERPINA1的指导物及在食蟹猴中具有同源性的那些转染至HEK293_Cas9及HUH7细胞株以及原代人类肝细胞中。测定包含各细胞类型中各指导序列的crRNA的编辑百分比，且随后基于最高编辑％对指导序列进行等级排序。全部三种细胞株中的表1中的指导序列的筛选数据列于下文(表4、表5及表6)。
表4显示人类肾脏腺癌细胞株，HEK293_Cas9中SERPINA1及对照crRNA的编辑％、插入(Ins)％及缺失(Del)％的平均值及标准差，其组成性地过度表达Spy Cas9蛋白质。
表4：HEK293_Cas9细胞中所表达的crRNA的SERPINA1编辑数据
表5显示人类肝细胞癌细胞株，HUH7中所测试SERPINA1及与SpyCas9mRNA共转染的对照crRNA的编辑％平均值及标准差、插入(Ins)％及缺失(Del)％。
表5：HUH7细胞中所表达的crRNA的SERPINA1编辑数据
表6显示原代人类肝细胞中与Spy Cas9蛋白质共转染的所测试SERPINA1及对照crRNA的编辑％、插入(Ins)％及缺失(Del)％的平均值及标准差。
表6：原代人类肝细胞中所表达的crRNA的SERPINA1编辑数据
选自各细胞株的指导序列用于形成用于进一步分析的30个crRNA组(表7)。上覆有与外显子2至外显子5目的的所选SERPINA1指导物的染色体位置的示意图示于图1中。编辑百分比及AAT分泌水平示于图2中。表7：靶向HUH7细胞中的SERPINA1的crRNA的ELISA及western印迹(WB)资料
2.SERPINA1指导物的脱靶分析
基于寡核苷酸插入的测定(参见例如Tsai等人,Nature Biotechnology33,187-197；2015)用于确定Cas9靶向SERPINA1切割的潜在脱靶基因组位点。如上文所述在HEK293-Cas9细胞中筛选表7中的30个指导物(及具有已知脱靶特征的两个对照指导物)，且脱靶结果绘制在图3中。该测定鉴定了一些crRNA的潜在脱靶位点，并鉴定了其他没有可检测的脱靶位点。
实施例3.表型分析
1.经分泌的α-1抗胰蛋白酶的ELISA分析
一式四份用来自表1的指导物如实施例1中所述转染肝细胞癌细胞株，HUH7。转染后两天，针对染色体组DNA及通过NGS测序的分析收集一份。全部指导物，包括对照指导物，具有大于70％的编辑百分比，其中一些指导物达至95％。转染后六天，为培养基采集准备一份以用于如先前所述通过ELISA进行分泌的AAT的分析。当与对照指导物相比时，全部AATcrRNA均会降低培养基中所分泌的AAT水平5至10倍。各指导物的编辑％及细胞外AAT的降低的数据提供于表7中。
2.胞内α-1抗胰蛋白酶的western分析
用包含来自表1的指导物的crRNA如实施例1中所述转染肝细胞癌细胞株，HUH7。将经转染的细胞池保留在组织培养物中且进行传代以用于进一步分析。转染后十一天，收集细胞且制备全细胞提取物(WCE)且如先前所述通过western印迹进行分析。
当细胞传代时，收集样品且如本文所述针对NGS测序加以处理。随时间推移针对编辑％比较自第2天、第23天、第32天及第40天选择的样品(表8)。此结果表明关于HUH7细胞生长不存在与AAT编辑目的联的增殖性变化。
表8：HUH7细胞中编辑％的时间过程
针对AAT蛋白质的降低通过western印迹分析WCE。全长AAT蛋白质具有418个氨基酸，但该蛋白质在经分泌之前已大量糖基化。未糖基化AAT具有46kD的预测分子量且在western印迹中的对照泳道(lane)中观测到此分子量的条带以及对应于不同AAT蛋白质种类(species)的52kD及56kD的条带(图4)。
使用Licor Odyssey Image Studio 5.2版软件计算AAT蛋白质的下降百分比。使用GAPDH作为负荷对照且同时用AAT进行探测。与涵盖全部三条针对AAT的条带的总区相比，计算各样品中GAPDH的密度测定值的比率。在将比率标准化为对照泳道之后，测定AAT蛋白质的下降百分比。结果示于表7中。
3.针对选定指导物的合并体外数据
通过分析本文所述的数据来产生针对各个指导物的集中数据包。通过经分泌的AAT的降低(ELISA)、总AAT蛋白质的降低相对于额外条带的产生(western印迹)及脱靶分析的对比，表征主要候选物且加以等级排序。也展现与食蟹猴的同源性，包括任何序列错配(mm)。参见图5至图10。
实施例4.将脂质纳米颗粒(LNP)递送至原代人类肝细胞(PHH)及HepG2细胞
在PHH及HepG2细胞上以剂量反应曲线测试Cas9mRNA及靶向人类SERPINA1的经修饰sgRNA的脂质纳米颗粒配制物。如实施例1中所述铺板PHH及HepG2细胞(但以15,000个PHH细胞/孔，其与33,000个/孔形成对照)。在37℃，5％CO2下孵育细胞24小时，之后用LNP处理。实验中所用的LNP如实施例1中所述制备，各含有图11及图12中所指定的sgRNA及Cas9mRNA。在37℃下在含有6％食蟹猴血清的肝细胞维持液中孵育LNP持续5分钟。孵育后，以起始于100ng mRNA的8点2倍剂量反应曲线将LNP添加于细胞上。如实施例1中所述，处理后72小时裂解细胞以用于NGS分析。两种细胞类型中的指导序列的剂量反应曲线数据示于图11及图12中。数据显示，配制物对编辑HepG2细胞以及原代人类肝细胞均有效，其为人类中的预期体内细胞靶向物。
实施例5.脂质纳米颗粒(LNP)递送及体内人类PiZ变体的编辑
向携带人类PiZ变体的拷贝的转基因小鼠施用实施例4中所测试的六种LNP配制物中的五种及包含靶向鼠TTR基因的sgRNA的对照LNP。先前已描述PiZ转基因小鼠(参见例如Carlson JA,Rogers BB,Sifers RN等人,Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsincauses liver damage in transgenic mice.J Clin Invest 1989；83:1183-1190)，且相信其在多联体(concatemer)杂合的小鼠中携载7至8个人类PiZ变体的多联拷贝(数据未示)。
在此研究中使用在15至39周龄范围内的PiZ小鼠(雄性与雌性混合)。以0.2mL的体积，以4mg/kg(每公斤4mg总RNA水平)的剂量通过侧尾静脉向每只动物(各群组n＝5)施用LNP。施用LNP后两周将动物安乐死。在LNP施用之前及尸体剖检时收集血液用于血清分析。尸体剖检时自各动物收集肝脏组织用于蛋白质及DNA提取，之后进行蛋白质定量(分别针对PiZ蛋白质的血清及组织水平进行ELISA及western印迹)且使用实施例1中所述的试剂及方法进行NGS分析。下表9显示配制于所测试的各LNP中的sgRNA。
表9
G000282(*＝PS键；’m’＝2’-O-Me核苷酸)：
如图13A中所示，在各组中检测到SERPINA1(或关于小鼠对照物的TTR)的PiZ变体的强编辑，而在载体对照物(TSS＝Tris/氯化钠/蔗糖缓冲液)中未检测到编辑。在实验组中的一些动物中也未检测到编辑，且随后的基因型分析(数据未示)显示，这些动物对于PiZ转基因为阴性的，且因此预期将不会产生可检测编辑、PiZ蛋白质表达或血清中PiZ分泌的基因敲低。此通过蛋白质表达分析(ELISA及western印迹；参见图13B及图13C)得到进一步确认。
另外，PiZ变体的编辑与经处理小鼠中血清水平方面的敲低相关。此外，如western印迹(图13C)所示，编辑还与肝脏组织中PiZ蛋白质的敲低相关。这些数据表明该配制物对体内敲低人类PiZ等位基因的表达及分泌有效。

Claims (243)

1.诱导SERPINA1基因中的双链断裂(DSB)的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包含指导RNA，所述指导RNA包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
2.修饰SERPINA1基因的方法，所述方法包括向细胞递送组合物，其中所述组合物包含(i)RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸及(ii)指导RNA，其包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
3.治疗α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)的方法，所述方法包括向有需要的个体施用组合物，由此治疗AATD，其中所述组合物包含(i)RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸及(ii)指导RNA，其包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
4.减少或预防α-1抗胰蛋白酶(AAT)在个体的肝脏中累积的方法，所述方法包括向有需要的个体施用组合物，由此减少AAT在肝脏中累积，其中所述组合物包含(i)RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸及(ii)指导RNA，其包含选自SEQ ID NO:5至SEQID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
5.组合物，其包含指导RNA，所述指导RNA包含选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
6.组合物，其包含编码指导RNA的载体，其中所述指导RNA包含选自SEQ ID NO:5至SEQID NO:129的指导序列或与选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
7.如权利要求5或6的组合物，其用于诱导细胞或个体的SERPINA1基因中的双链断裂(DSB)。
8.如权利要求5或6的组合物，其用于修饰细胞或个体中的SERPINA1基因。
9.如权利要求5或6的组合物，其用于治疗个体中的α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。
10.如权利要求5或6的组合物，其用于降低个体中的血清或肝脏AAT浓度。
11.如权利要求5或6的组合物，其用于减少或预防α-1抗胰蛋白酶(AAT)在个体的肝脏中累积。
12.如权利要求1至4中任一项的方法或如权利要求5至11中任一项所使用的组合物，其中所述组合物会降低血清及/或肝脏AAT水平。
13.如权利要求12所使用的方法或组合物，其中相较于施用所述组合物之前的血清及/或AAT水平，所述血清及/或肝脏AAT水平降低至少40％。
14.如权利要求12所使用的方法或组合物，其中相较于施用所述组合物之前的血清及/或AAT水平，所述血清及/或肝脏AAT水平降低40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％至80％、80％至90％、90％至95％、95％至98％、98％至99％或99％至100％。
15.如权利要求1至4或7至14中任一项所使用的方法或组合物，其中所述组合物引起编辑SERPINA1基因。
16.如权利要求15所使用的方法或组合物，其中所述编辑是计算所编辑的群组的百分比(编辑百分比)。
17.如权利要求16所使用的方法或组合物，其中所述编辑百分比在30％与99％之间。
18.如权利要求17所使用的方法或组合物，其中所述编辑百分比在30％与35％之间、35％与40％之间、40％与45％之间、45％与50％之间、50％与55％之间、55％与60％之间、60％与65％之间、65％与70％之间、70％与75％之间、75％与80％之间、80％与85％之间、85％与90％之间、90％与95％之间或95％与99％之间。
19.如权利要求1至4或7至18中任一项所使用的方法或组合物，其中施用或递送所述组合物至少两次。
20.如权利要求19所使用的方法或组合物，其中施用或递送所述组合物至少三次。
21.如权利要求19所使用的方法或组合物，其中施用或递送所述组合物至少四次。
22.如权利要求19所使用的方法或组合物，其中施用或递送所述组合物至多五、六、七、八、九或十次。
23.如权利要求19至22中任一项所使用的方法或组合物，其中所述施用或递送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天的间隔进行。
24.如权利要求19至22中任一项所使用的方法或组合物，其中所述施用或递送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15周的间隔进行。
25.如权利要求19至22中任一项所使用的方法或组合物，其中所述施用或递送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个月的间隔进行。
26.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述指导序列选自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129。
27.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA与人类SERPINA1基因中所存在的靶序列至少部分互补。
28.如权利要求27的方法或组合物，其中所述靶序列处于人类SERPINA1基因的外显子2、3、4或5中。
29.如权利要求27的方法或组合物，其中所述靶序列处于人类SERPINA1基因的外显子2中。
30.如权利要求27的方法或组合物，其中所述靶序列处于人类SERPINA1基因的外显子3中。
31.如权利要求27的方法或组合物，其中所述靶序列处于人类SERPINA1基因的外显子4中。
32.如权利要求27的方法或组合物，其中所述靶序列处于人类SERPINA1基因的外显子5中。
33.如权利要求1至32中任一项的方法或组合物，其中所述指导序列与SERPINA1的正链中的靶序列互补。
34.如权利要求1至32中任一项的方法或组合物，其中所述指导序列与SERPINA1的负链中的靶序列互补。
35.如权利要求1至32中任一项的方法或组合物，其进一步包含第二指导序列，其中第一指导序列与SERPINA1基因的正链中的第一靶序列互补，且其中所述第二指导序列与SERPINA1基因的负链中的第二靶序列互补。
36.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA包含crRNA，其包含所述指导序列且进一步包含SEQ ID NO:140的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140的核苷酸在所述指导序列的3’端后。
37.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA为双指导(dgRNA)。
38.如权利要求37的方法或组合物，其中所述双指导RNA包含crRNA及trRNA，所述crRNA包含SEQ ID NO:140的核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140的核苷酸在所述指导序列的3’端后。
39.如权利要求1至36中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA为单指导(sgRNA)。
40.如权利要求39的方法或组合物，其中所述sgRNA包含具有SEQ ID NO:130的修饰的指导序列。
41.如权利要求39的方法或组合物，其中所述sgRNA包含SEQ ID NO:130。
42.如权利要求40或41的方法或组合物，其中SEQ ID NO:130中的各N为任何天然或非天然核苷酸，其中所述N形成所述指导序列，且所述指导序列使RNA指导的DNA结合剂靶向SERPINA1基因。
43.如权利要求39至42中任一项的方法或组合物，其中所述sgRNA包含所述SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129的指导序列及所述SEQ ID NO:140的核苷酸中任一个。
44.如权利要求39至43中任一项的方法或组合物，其中所述sgRNA包含与选自SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:129的序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％或90％同一性的指导序列。
45.如权利要求42的方法或组合物，其中SEQ ID NO:130中的各N共同地经选自SEQ IDNO:5至SEQ ID NO:129的指导序列取代。
46.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA包含至少一种修饰。
47.如权利要求46的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括经2’-O-甲基(2’-O-Me)修饰的核苷酸。
48.如权利要求46或47的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括各核苷酸之间的硫代磷酸酯(PS)键。
49.如权利要求46至48中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括经2’-氟(2’-F)修饰的核苷酸。
50.如权利要求46至49中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括在5’端前五个核苷酸中的一处或多处的修饰。
51.如权利要求46至50中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括在3’端最后五个核苷酸中的一处或多处的修饰。
52.如权利要求46至51中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括在前四个核苷酸之间的PS键。
53.如权利要求46至52中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括在最后四个核苷酸之间的PS键。
54.如权利要求46至53中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括在5’端前三个核苷酸处的经2’-O-Me修饰的核苷酸。
55.如权利要求46至54中任一项的方法或组合物，其中所述至少一种修饰包括在3’端最后三个核苷酸处的经2’-O-Me修饰的核苷酸。
56.如权利要求46至55中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:130的经修饰核苷酸。
57.如权利要求1至56中任一项的方法或组合物，其中所述组合物进一步包含可药用赋形剂。
58.如权利要求1至57中任一项的方法或组合物，其中所述指导RNA及任选的所述RNA指导的DNA结合剂或编码RNA指导的DNA结合剂的核酸是与脂质纳米颗粒(LNP)结合。
59.如权利要求58的方法或组合物，其中所述LNP包含CCD脂质。
60.如权利要求59的方法或组合物，其中所述CCD脂质为脂质A。
61.如权利要求58至60的方法或组合物，其中所述LNP包含中性脂质。
62.如权利要求61的方法或组合物，其中所述中性脂质为DSPC。
63.如权利要求58至62中任一项的方法或组合物，其中所述LNP包含辅助脂质。
64.如权利要求63的方法或组合物，其中所述辅助脂质为胆固醇。
65.如权利要求58至64中任一项的方法或组合物，其中所述LNP包含隐形脂质。
66.如权利要求58至65的方法或组合物，其中所述隐形脂质为PEG2k-DMG。
67.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述组合物进一步包含RNA指导的DNA结合剂。
68.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述组合物进一步包含编码RNA指导的DNA结合剂的mRNA。
69.如权利要求67或68的方法或组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为Cas切割酶。
70.如权利要求69的方法或组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为Cas9。
71.如权利要求67至70中任一项的方法或组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂经修饰。
72.如权利要求67至71中任一项的方法或组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为切口酶(nickase)。
73.如权利要求71或72的方法或组合物，其中所述经修饰的RNA指导的DNA结合剂包含核定位信号(NLS)。
74.如权利要求67至73中任一项的方法或组合物，其中所述RNA指导的DNA结合剂为来自II型CRISPR/Cas系统的Cas。
75.如前述权利要求中任一项的方法或组合物，其中所述组合物为药物制剂且进一步包含可药用载体。
76.如权利要求1至4或7至75中任一项所使用的方法或组合物，其中所述组合物会减少或预防α-1抗胰蛋白酶(AAT)在肝脏中累积。
77.如权利要求76所使用的方法或组合物，其中所述AAT为变形的。
78.如权利要求1至4或7至77中任一项所使用的方法或组合物，其中非同源末端连接(non-homologous ending joining；NHEJ)在修复SERPINA1基因中的DSB期间引起突变。
79.如权利要求78所使用的方法或组合物，其中NHEJ在修复SERPINA1基因中的DSB期间引起核苷酸缺失或插入。
80.如权利要求79所使用的方法或组合物，其中核苷酸的所述缺失或插入在SERPINA1基因内诱导移码或无义突变。
81.如权利要求80所使用的方法或组合物，其中在至少50％的肝脏细胞的SERPINA1基因中诱导移码或无义突变。
82.如权利要求81所使用的方法或组合物，其中在50％至60％、60％至70％、70％或80％、80％至90％、90％至95％、95％至99％或99％至100％的肝脏细胞的SERPINA1基因中诱导移码或无义突变。
83.如权利要求79至82中任一项所使用的方法或组合物，其中发生在SERPINA1基因中的核苷酸缺失或插入为在脱靶位点处的的核苷酸缺失或插入的至少50倍或大于50倍。
84.如权利要求83所使用的方法或组合物，其中发生在SERPINA1基因中的核苷酸缺失或插入比在脱靶位点处的核苷酸缺失或插入多50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。
85.如权利要求1至4或7至84中任一项所使用的方法或组合物，其中施用所述组合物会降低所述个体中的AAT水平。
86.如权利要求85所使用的方法或组合物，其中所述AAT水平降低至少40％。
87.如权利要求86所使用的方法或组合物，其中所述AAT水平降低40％至50％、50％至60％、60％至70％、70％或80％、80％至90％、90％至95％、95％至99％或99％至100％。
88.如权利要求86或87所使用的方法或组合物，其中在血清、血浆、血液、脑脊液或痰中测量所述AAT水平。
89.如权利要求86或87所使用的方法或组合物，其中在肝脏及/或血清中测量所述AAT水平。
90.如权利要求85至89中任一项所使用的方法或组合物，其中通过酶联免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)测量所述AAT水平。
91.如权利要求1至4或7至90中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体患有AATD。
92.如权利要求1至4或7至91中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体为人类。
93.如权利要求91或92所使用的方法或组合物，其中所述个体患有AATD。
94.如权利要求91或92所使用的方法或组合物，其中所述个体患有遗传性AATD。
95.如权利要求1至4、7至92或94中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体具有AATD家族病史。
96.如权利要求1至4或7至95中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体仅具有或主要具有AATD的肝脏症状。
97.如权利要求1至4或7至96中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体在SERPINA1基因座的Z等位基因为杂合的。
98.如权利要求97的方法，其中所述个体在SERPINA1基因座处具有一个Z等位基因及一个S等位基因。
99.如权利要求1至4或7至98中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体在AAT的氨基酸序列处不具有E342K突变，但具有降低水平的野生型AAT。
100.如权利要求1至4或7至99中任一项所使用的方法或组合物，其中所述个体的水肿、腹水或黄疸有所改善、稳定或减缓，或已推迟对肝脏移植的需要。
101.如权利要求1至4或7至99中任一项所使用的方法或组合物，其中如通过成像方法或肝酶水平所测量，个体由于施用而具有改善、稳定或减缓变化。
102.如权利要求1至4或7至101中任一项所使用的方法或组合物，其中所述组合物或药物制剂通过病毒载体施用。
103.如权利要求1至4或7至102中任一项所使用的方法或组合物，其中所述组合物或药物制剂通过脂质纳米颗粒施用。
104.如权利要求1至4或7至103中任一项所使用的方法或组合物，其中在施用所述组合物或配制物之前，测试所述个体的SERPINA1基因中的特定突变。
105.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:5。
106.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:6。
107.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:7。
108.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:8。
109.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:9。
110.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:10。
111.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:11。
112.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:12。
113.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:13。
114.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:14。
115.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:15。
116.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:16。
117.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:17。
118.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:18。
119.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:19。
120.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:20。
121.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:21。
122.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:22。
123.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:23。
124.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:24。
125.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:25。
126.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:26。
127.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:27。
128.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:28。
129.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:29。
130.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:30。
131.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:31。
132.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:32。
133.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:33。
134.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:34。
135.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:35。
136.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:36。
137.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:37。
138.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:38。
139.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:39。
140.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:40。
141.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:41。
142.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:42。
143.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:43。
144.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:44。
145.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:45。
146.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:46。
147.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:47。
148.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:48。
149.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:49。
150.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:50。
151.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:51。
152.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:52。
153.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:53。
154.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:54。
155.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:55。
156.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:56。
157.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:57。
158.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:58。
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229.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:129的所述序列为SEQ ID NO:129。
230.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其进一步包含SEQ ID NO:140或SEQID NO:141的序列。
231.如权利要求230的方法或组合物，其包含SEQ ID NO:130的修改模式。
232.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中所述序列选自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139。
233.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:131。
234.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:132。
235.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:133。
236.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:134。
237.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:135。
238.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:136。
239.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:137。
240.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:138。
241.如权利要求1至104中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQ IDNO:139的所述序列为SEQ ID NO:139。
242.如权利要求232至241中任一项的方法或组合物，其中选自SEQ ID NO:131至SEQID NO:139的所述序列包含表2中的相应序列所示的修饰。
243.如权利要求5至242中任一项的组合物或配制物的用途，其用于制备治疗患有AATD的人类个体的药物。
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