JP2020501582A - アルファ1アンチトリプシン欠乏症を治療するための組成物および方法 - Google Patents
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Abstract
Description
SERPINA1遺伝子内の2本鎖切断(DSB)を誘発する方法であって、細胞に、配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAを含む組成物を送達することを含む、方法。
実施形態02
SERPINA1遺伝子を修飾する方法であって、細胞に、(i)RNAガイドされたDNA結合剤、またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸と、(ii)配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAと、を含む組成物を送達することを含む、方法。
実施形態03
アルファ1アンチトリプシン欠乏症(AATD)を治療する方法であって、当該治療を必要とする対象に、(i)RNAガイドされたDNA結合剤、またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸と、(ii)配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAと、を含む組成物を投与することを含み、それによってAATDを治療する、方法。
実施形態04
対象における肝臓内のアルファ1アンチトリプシン(AAT)蓄積を低減または防止する方法であって、当該低減または防止を必要とする対象に、(i)RNAガイドされたDNA結合剤、またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸と、(ii)配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAと、を含む組成物を投与することを含み、それによって肝臓内のAAT蓄積を低減する、方法。
実施形態05
配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%同一であるガイド配列を含むガイドRNAを含む、組成物。
実施形態06
配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%同一であるガイド配列を含むガイドRNAをコードするベクターを含む、組成物。
実施形態07
細胞または対象におけるSERPINA1遺伝子内の2本鎖切断(DSB)の誘発における使用のための、実施形態5または6に記載の組成物。
実施形態08
細胞または対象におけるSERPINA1遺伝子内の修飾における使用のための、実施形態5または6に記載の組成物。
実施形態09
対象におけるアルファ1アンチトリプシン欠乏症(AATD)の治療における使用のための、実施形態5または6に記載の組成物。
実施形態10
対象におけるAATの血清中濃度または肝臓中濃度の低減における使用のための、実施形態5または6に記載の組成物。
実施形態11
対象における肝臓内のアルファ1アンチトリプシン(AAT)蓄積の低減または防止における使用のための、実施形態5または6に記載の組成物。
実施形態12
当該組成物が、血清および/または肝臓のAATレベルを低減する、実施形態1〜4のいずれか1つに記載の方法、または実施形態5〜11のいずれか1つに記載の使用のための組成物。
実施形態13
血清および/または肝臓のAATレベルが、当該組成物を投与する前の血清中および/またはAATレベルと比較して、少なくとも50%低減される、実施形態12に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態14
血清および/またはAATレベルが、当該組成物を投与する前の血清および/またはAATレベルと比較して、50〜60%、60〜70%、70〜80%、80〜90%、90〜95%、95〜98%、98〜99%、または99〜100%低減される、実施形態12に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態15
当該組成物がSERPINA1遺伝子の編集をもたらす、実施形態1〜4または7〜14のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態16
当該編集が、編集される集団のパーセンテージ(編集パーセント)として計算される、実施形態15に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態17
当該編集パーセントが30から99%の間である、実施形態16に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態18
当該編集パーセントが、30から35%の間、35から40%の間、40から45%の間、45から50%の間、50から55%の間、55から60%の間、60から65%の間、65から70%の間、70から75%の間、75から80%の間、80から85%の間、85から90%の間、90から95%の間、または95から99%の間である、実施形態17に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態19
当該組成物が少なくとも2回投与または送達される、実施形態1〜4または7〜18のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態20
当該組成物が少なくとも3回投与または送達される、実施形態19に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態21
当該組成物が少なくとも4回投与または送達される、実施形態19に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態22
当該組成物が5回、6回、7回、8回、9回、または10回まで投与または送達される、実施形態19に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態23
当該投与または送達が、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、または15日の間隔で発生する、実施形態19〜22のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態24
当該投与または送達が、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、または15週の間隔で発生する、実施形態19〜22のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態25
当該投与または送達が、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月、4ヵ月、5ヵ月、6ヵ月、7ヵ月、8ヵ月、9ヵ月、10ヵ月、11ヵ月、12ヵ月、13ヵ月、14ヵ月、または15ヵ月の間隔で発生する、実施形態19〜22のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態26
当該ガイド配列が配列番号5〜129から選択される、実施形態1〜25のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態27
当該ガイドRNAが、ヒトSERPINA1遺伝子内に存在する標的配列に対し少なくとも部分的に相補的である、実施形態1〜26のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態28
当該標的配列がヒトSERPINA1遺伝子のエクソン2、3、4、または5内にある、実施形態27に記載の方法または組成物。
実施形態29
当該標的配列がヒトSERPINA1遺伝子のエクソン2内にある、実施形態27に記載の方法または組成物。
実施形態30
当該標的配列がヒトSERPINA1遺伝子のエクソン3内にある、実施形態27に記載の方法または組成物。
実施形態31
当該標的配列がヒトSERPINA1遺伝子のエクソン4内にある、実施形態27に記載の方法または組成物。
実施形態32
当該標的配列がヒトSERPINA1遺伝子のエクソン5内にある、実施形態27に記載の方法または組成物。
実施形態33
当該ガイド配列が、SERPINA1のプラス鎖内の標的配列に対し相補的である、実施形態1〜32のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態34
当該ガイド配列が、SERPINA1のマイナス鎖内の標的配列に対し相補的である、実施形態1〜32のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態35
第2のガイド配列をさらに含み、当該第1のガイド配列が、SERPINA1遺伝子のプラス鎖内の第1の標的配列に対し相補的であり、当該第2のガイド配列が、SERPINA1のマイナス鎖内の第2の標的配列に対し相補的である、実施形態1〜32のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態36
当該ガイドRNAが、当該ガイド配列を含みかつ配列番号140のヌクレオチド配列をさらに含むcrRNAを含み、当該配列番号140のヌクレオチドがその3’末端においてガイド配列の次に続く、実施形態1〜35のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態37
当該ガイドRNAがデュアルガイド(dgRNA)である、実施形態1〜36のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態38
当該デュアルガイドRNAが、配列番号140のヌクレオチド配列を含むcrRNAであって、当該配列番号140のヌクレオチドがその3’末端において当該ガイド配列の次に続く、crRNAと、trRNAと、を含む、実施形態37に記載の方法または組成物。
実施形態39
当該ガイドRNAがシングルガイド(sgRNA)である、実施形態1〜36のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態40
当該sgRNAが、配列番号130のパターンを有するガイド配列を含む、実施形態39に記載の方法または組成物。
実施形態41
当該sgRNAが配列番号130の配列を含む、実施形態39に記載の方法または組成物。
実施形態42
配列番号130における各Nが、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、当該Nが当該ガイド配列を形成し、当該ガイド配列がRNAガイドされたDNA結合剤をSERPINA1遺伝子へと標的化させる、実施形態40または41に記載の方法または組成物。
実施形態43
当該sgRNAが、配列番号5〜129のガイド配列のいずれか1つおよび配列番号140のヌクレオチドを含む、実施形態39〜42のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態44
当該sgRNAが、配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%同一であるガイド配列を含む、実施形態39〜43のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態45
配列番号130における各Nが、配列番号5〜129から選択される配列で置き換えられる、実施形態42に記載の方法または組成物。
実施形態46
当該ガイドRNAが少なくとも1つの修飾を含む、実施形態1〜45のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態47
当該少なくとも1つの修飾が、2’−O−メチル(2’−O−Me)修飾ヌクレオチドを含む、実施形態46に記載の方法または組成物。
実施形態48
当該少なくとも1つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート(PS)結合を含む、実施形態46または47に記載の方法または組成物。
実施形態49
当該少なくとも1つの修飾が、2’−フルオロ(2’−F)修飾ヌクレオチドを含む、実施形態46〜48のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態50
当該少なくとも1つの修飾が、5’末端における最初の5個のヌクレオチドのうちの1つ以上において修飾を含む、実施形態46〜49のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態51
当該少なくとも1つの修飾が、3’末端における最後の5個のヌクレオチドのうちの1つ以上において修飾を含む、実施形態46〜50のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態52
当該少なくとも1つの修飾が、最初の4つのヌクレオチド間のPS結合を含む、実施形態46〜51のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態53
当該少なくとも1つの修飾が、最後の4つのヌクレオチド間のPS結合を含む、実施形態46〜52のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態54
当該少なくとも1つの修飾が、5’末端における最初の3個のヌクレオチドにおいて2’−O−Me修飾ヌクレオチドを含む、実施形態46〜53のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態55
当該少なくとも1つの修飾が、3’末端における最後の3個のヌクレオチドにおいて2’−O−Me修飾ヌクレオチドを含む、実施形態46〜54のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態56
当該ガイドRNAが、配列番号130の当該修飾ヌクレオチドを含む、実施形態46〜55のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態57
当該組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、実施形態1〜56のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態58
当該ガイドRNAと、任意選択でRNAガイドされたDNA結合剤またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸とが、脂質ナノ粒子(LNP)と会合している、実施形態1〜57のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態59
当該LNPがCCD脂質を含む、実施形態58に記載の方法または組成物。
実施形態60
当該CCD脂質が脂質Aである、実施形態59に記載の方法または組成物。
実施形態61
当該LNPが中性脂質を含む、実施形態58〜60に記載の方法または組成物。
実施形態62
当該中性脂質がDSPCである、実施形態61に記載の方法または組成物。
実施形態63
当該LNPがヘルパー脂質を含む、実施形態58〜62のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態64
当該ヘルパー脂質がコレステロールである、実施形態63に記載の方法または組成物。
実施形態65
当該LNPがステルス脂質を含む、実施形態58〜64のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態66
当該ステルス脂質がPEG2k−DMGである、実施形態58〜65に記載の方法または組成物。
実施形態67
当該組成物がRNAガイドされたDNA結合剤をさらに含む、実施形態1〜66のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態68
当該組成物がRNAガイドされたDNA結合剤をコードするmRNAをさらに含む、実施形態1〜67のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態69
当該RNAガイドされたDNA結合剤がCasクリベースである、実施形態67または68に記載の方法または組成物。
実施形態70
当該RNAガイドされたDNA結合剤がCas9である、実施形態69に記載の方法または組成物。
実施形態71
当該RNAガイドされたDNA結合剤が修飾されている、実施形態67〜70のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態72
当該RNAガイドされたDNA結合剤がニッカーゼである、実施形態67〜71のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態73
当該修飾されたRNAガイドされたDNA結合剤が核局在化シグナル(NLS)を含む、実施形態71または72に記載の方法または組成物。
実施形態74
当該RNAガイドされたDNA結合剤が、II型CRISPR/CasシステムからのCasである、実施形態67〜73のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態75
当該組成物が薬学的製剤であり、かつ薬学的に許容される担体をさらに含む、実施形態1〜74のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態76
当該組成物が肝臓内のアルファ1アンチトリプシン(AAT)の蓄積を低減または防止する、実施形態1〜4または7〜75のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態77
当該AATが誤形成されている、実施形態76に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態78
非相同末端結合(NHEJ)が、SERPINA1遺伝子内のDSBの修復中に変異をもたらす、実施形態1〜4または7〜77のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態79
NHEJが、SERPINA1遺伝子内のDSBの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす、実施形態78に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態80
当該ヌクレオチドの欠失または挿入が、SERPINA1遺伝子内のフレームシフトまたはナンセンス突然変異を誘発する、実施形態80に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態81
フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の少なくとも50%のSERPINA1遺伝子内で誘発される、実施形態80に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態82
フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の50%〜60%、60%〜70%、70%もしくは80%、80%〜90%、90〜95%、95%〜99%、または99%〜100%のSERPINA1遺伝子内で誘発される、実施形態81に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態83
当該ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも少なくとも50倍以上SERPINA1遺伝子内で発生する、実施形態79〜82のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態84
当該ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも50倍から150倍、150倍から500倍、500倍から1500倍、1500倍から5000倍、5000倍から15000倍、15000倍から30000倍、または30000倍から60000倍、SERPINA1遺伝子内で発生する、実施形態83に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態85
当該組成物の投与が対象内のAATレベルを低減する、実施形態1〜4または7〜84のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態86
当該AATレベルが少なくとも40%低減される、実施形態85に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態87
当該AATレベルが、40%〜50%、50%〜60%、60%〜70%、70%もしくは80%、80%〜90%、90〜95%、95%〜99%、または99%〜100%低減される、実施形態86に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態88
当該AATレベルが、血清中、血漿中、血液中、脳脊髄液中、または痰中で測定される、実施形態86または87に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態89
当該AATレベルが、肝臓中及び/または血清中で測定される、実施形態86または87に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態90
当該AATレベルが、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を介して測定される、実施形態85〜89のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態91
当該対象がAATDを有する、実施形態1〜4または7〜90のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態92
当該対象がヒトである、実施形態1〜4または7〜91のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態93
当該対象がAATD野生型を有する、実施形態91または92に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態94
当該対象が遺伝性AATDを有する、実施形態91または92に記載の方法または使用のための組成物。
実施形態95
当該対象がAATDの家族歴を有する、実施形態1〜4、7〜92、または94のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態96
当該対象がAATDの肝臓症状のみを有する、または主としてAATDの肝臓症状を有する、実施形態1〜4または7〜95のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態97
当該対象が、SERPINA1座位におけるZアレルについてヘテロ接合性である、実施形態1〜4または7〜96のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態98
当該対象が、SERPINA1座位において1つのZアレルおよび1つのSアレルを有する、実施形態97に記載の方法。
実施形態99
当該対象が、AATのアミノ酸配列中にE342K突然変異を有しないが、野生型AATの低減したレベルを有する、実施形態1〜4または7〜98のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態100
当該対象の浮腫、腹水、もしくは黄疸が改善、安定化、もしくは緩徐化する、または肝臓移植の必要性が遅延する、実施形態1〜4または7〜99のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態101
当該対象が、投与の結果として、イメージング法または肝臓酵素レベルにより測定されるように、変化の改善、安定化、もしくは緩徐化を有する、実施形態1〜4または7〜99のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態102
当該組成物または薬学的製剤がウイルスベクターを介して投与される、実施形態1〜4または7〜101のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態103
当該組成物または薬学的製剤が脂質ナノ粒子を介して投与される、実施形態1〜4または7〜102のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態104
当該対象が、当該組成物または製剤を投与する前に、SERPINA1遺伝子内の特定の突然変異について試験される、実施形態1〜4または7〜103のいずれか1つに記載の方法または使用のための組成物。
実施形態105
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号5である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態106
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号6である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態107
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号7である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態108
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号8である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態109
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号9である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態110
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号10である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態111
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号11である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態112
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号12である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態113
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号13である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態114
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号14である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態115
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号15である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態116
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号16である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態117
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号17である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態118
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号18である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態119
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号19である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態120
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号20である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態121
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号21である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態122
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号22である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態123
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号23である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態124
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号24である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態125
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号25である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態126
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号26である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態127
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号27である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態128
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号28である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態129
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号29である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態130
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号30である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態131
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号31である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態132
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号32である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態133
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号33である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態134
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号34である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態135
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号35である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態136
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号36である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態137
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号37である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態138
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号38である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態139
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号39である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態140
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号40である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態141
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号41である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態142
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号42である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態143
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号43である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態144
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号44である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態145
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号45である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態146
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号46である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態147
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号47である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態148
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号48である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態149
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号49である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態150
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号50である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態151
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号51である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態152
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号52である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態153
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号53である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態154
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号54である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態155
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号55である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態156
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号56である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態157
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号57である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態158
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号58である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態159
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号59である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態160
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号60である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態161
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号61である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態162
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号62である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態163
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号63である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態164
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号64である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態165
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号65である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態166
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号66である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態167
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号67である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態168
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号68である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態169
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号69である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態170
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号70である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態171
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号71である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態172
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号72である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態173
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号73である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態174
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号74である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態175
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号75である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態176
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号76である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態177
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号77である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態178
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号78である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態179
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号79である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態180
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号80である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態181
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号81である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態182
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号82である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態183
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号83である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態184
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号84である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態185
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号85である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態186
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号86である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態187
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号87である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態188
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号88である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態189
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号89である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態190
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号90である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態191
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号91である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態192
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号92である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態193
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号93である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態194
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号94である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態195
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号95である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態196
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号96である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態197
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号97である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態198
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号98である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態199
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号99である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態200
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号100である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態201
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号101である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態202
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号102である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態203
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号103である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態204
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号104である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態205
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号105である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態206
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号106である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態207
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号107である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態208
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号108である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態209
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号109である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態210
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号110である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態211
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号111である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態212
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号112である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態213
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号113である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態214
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号114である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態215
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号115である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態216
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号116である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態217
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号117である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態218
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号118である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態219
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号119である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態220
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号120である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態221
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号121である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態222
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号122である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態223
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号123である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態224
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号124である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態225
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号125である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態226
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号126である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態227
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号127である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態228
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号128である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態229
配列番号5〜129から選択される当該配列が配列番号129である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態230
配列番号140または141の配列をさらに含む、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態231
配列番号130の修飾パターンを含む、実施形態230に記載の方法または組成物。
実施形態232
当該配列が配列番号131〜139から選択される、実施形態項1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態233
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号131である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態234
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号132である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態235
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号133である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態236
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号134である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態237
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号135である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態238
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号136である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態239
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号137である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態240
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号138である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態241
配列番号131〜139から選択される当該配列が配列番号139である、実施形態1〜104のいずれか1つに記載の方法または組成物。
実施形態242
配列番号131〜139から選択される前記配列が、表2内のそれぞれの配列について示されている修飾を含む、請求項232〜241のいずれか1項に記載の方法または組成物。
実施形態243
AATDを有するヒト対象を治療するための薬剤の調製のための、実施形態5〜241のいずれかに記載の組成物または製剤の使用。
GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU(配列番号141)を5’から3’の方向に有する。
A.ガイドRNA(gRNA)
一部の実施形態において、本発明は、1つ以上のガイドRNA(gRNA)を含む組成物であって、当該ガイドRNAが、RNAガイドされたDNA結合剤(例えば、Cas9)をSERPINA1内の標的DNA配列に誘導するガイド配列を含む、組成物を含む。gRNAは、表1に示すガイド配列のうちの1つ以上を含んでもよい。表1のガイド配列は、crRNAおよび/またはtrRNAをさらに含んでもよい。本明細書に記載の各組成物および方法実施形態において、crRNAおよびtrRNAは、1つのRNA(sgRNA)上で会合していてもよく、または別々のRNA(dgRNA)上にあってもよい。
B.化学修飾gRNA
ある特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のガイド配列のうちのいずれか1つ以上を含むガイドRNAのうちのいずれかを含む、DNAベクターを含む。一部の実施形態において、ベクターは、ガイドRNA配列に加えて、ガイドRNAをコードしない核酸をさらに含む。ガイドRNAをコードしない核酸としては、以下に限定されないが、プロモーター、エンハンサー、調節配列、およびRNAガイドされたDNA結合剤(例えば、Cas9)をコードする核酸が挙げられる。一部の実施形態において、ベクターは、crRNA、trRNA、またはcrRNAおよびtrRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、sgRNAをコードするヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、ベクターは、crRNAをコードするヌクレオチド配列と、Casタンパク質(例えば、Cas9)をコードするmRNAとを含む。一部の実施形態において、ベクターは、crRNAをコードするヌクレオチド配列と、trRNAと、Casタンパク質(例えば、Cas9)をコードするmRNAとを含む。一部の実施形態において、ベクターは、sgRNAをコードするヌクレオチド配列と、Casタンパク質(例えば、Cas9)をコードするmRNAとを含む。一実施形態において、Cas9は、Streptococcus pyogenesからのもの(すなわち、Spy Cas9)である。一部の実施形態において、crRNA、trRNA、またはcrRNAおよびtrRNAをコードするヌクレオチド配列は、天然に存在するCRISPR/Casシステムからのリピート配列の全てまたは一部分と隣接しているガイド配列を含む、またはそれからなる。crRNA、trRNA、またはcrRNAおよびtrRNAを含む、またはそれからなる核酸は、天然には見いだされない核酸をcrRNA、trRNA、またはcrRNAおよびtrRNAと共に含む、またはそれからなるベクター配列をさらに含んでもよい。
一部の実施形態において、表1または表2からの1つ以上のガイド配列を含む1つ以上のgRNAと、RNAガイドされたDNA結合剤(例えば、Cas9)とを含む組成物が包含される。一部の実施形態において、Cas9などのDNA結合剤と一緒のgRNAは、リボ核タンパク質複合体(RNP)と呼ばれる。一部の実施形態において、RNAガイドされたDNA結合剤はCasタンパク質である。一部の実施形態において、Casタンパク質と一緒のgRNAは、Cas RNPと呼ばれる。一部の実施形態において、RNPは、I型、II型、またはIII型の構成要素を含む。一部の実施形態において、Casタンパク質は、I型CRISPR/Casシステムからのものである。一部の実施形態において、Casタンパク質は、II型CRISPR/Casシステムからのものである。一部の実施形態において、Casタンパク質は、III型CRISPR/Casシステムからのものである。一部の実施形態において、Casタンパク質はCas9である。一部の実施形態において、Casタンパク質はCpf1である。一部の実施形態において、Casタンパク質は、II型CRISPR/CasシステムからのCas9タンパク質である。一部の実施形態において、Cas9と一緒のgRNAは、Cas9 RNPと呼ばれる。
一部の実施形態において、RNPの他の構成要素と共に発現したときのgRNAの効力が決定される。一部の実施形態において、gRNAは、Casと共に発現される。一部の実施形態において、gRNAは、既に安定的にCasを発現する細胞株中で発現される。
一部の実施形態において、SERPINA1遺伝子内の2本鎖切断(DSB)を誘発する方法であって、配列番号5〜129のうちのいずれか1つ以上のガイド配列を含むガイドRNA、または配列番号130〜139のsgRNAのうちのいずれか1つ以上を投与することを含む、方法が提供される。一部の実施形態において、配列番号5〜129のガイド配列のうちのいずれか1つ以上を含むgRNAが、SERPINA1遺伝子内のDSBを誘発するために投与される。ガイドRNAは、Casタンパク質(例えば、Cas9など)などのRNAガイドされたDNA結合剤、またはCasタンパク質(例えば、Cas9など)RNAガイドされたDNA結合剤をコードするmRNAもしくはベクターと共に投与されてもよい。一部の実施形態において、投与されるガイドRNAは、本明細書に記載のガイドRNA組成物のうちの1つ以上である。
一部の実施形態において、本発明は、(例えば、本明細書で提供される組成物中にある)表1に開示されているガイド配列のうちのいずれか1つ以上を含むgRNAのうちのいずれか1つ、または表2におけるsgRNAのうちのいずれか1つ以上を、AATDの肺の症状を緩和するのに好適な増強療法と共に含む、併用療法を含む。一部の実施形態において、肺疾患のための増強療法は、Turner,BioDrugs 2013 Dec;27(6):547−58に記載のような、ヒト血漿から精製されたAATを用いた静脈内の療法である。一部の実施形態において、増強療法は、Prolastin(登録商標)、Zemaira(登録商標)、Aralast(登録商標)、またはKamada(登録商標)を用いた療法である。
一部の実施形態において、(単独の、または1つ以上のベクター上でコードされた)本明細書に記載のガイドRNA組成物は、脂質ナノ粒子中に製剤される、または脂質ナノ粒子を介して投与される。例えば、2017年3月30日に出願された「LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS」という表題の国際特許PCT/US2017/024973号を参照(その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。対象にヌクレオチドを送達する能力を有することが当業者に公知である任意の脂質ナノ粒子(LNP)製剤は、本明細書に記載のガイドRNAと共に、さらにCasもしくはCas9などのRNAガイドされたDNA結合剤をコードするmRNA、またはCasもしくはCas9タンパク質それ自体のようなRNAガイドされたDNA結合剤と共に、利用されてもよい。
III.ある特定の実施形態の列挙
実施例1−材料および方法
1.ヌクレアーゼmRNAのin vitro転写(「IVT」)
TAATACGACTCACTATAGGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGC
TTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGATAAGAAGTACT
CAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATG
AATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACA
GCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAG
AAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATC
GCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACA
GCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATG
AACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGT
ACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCG
ACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTT
CCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATT
CAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGC
GGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCG
AAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACT
TGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGC
CGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAAT
TTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACC
TTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAA
AGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCT
CACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGAT
CTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAG
CCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAAC
CGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAAC
CTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATC
TTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATC
GAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCA
ATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGA
ATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAA
TGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCC
TCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTAC
TGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGT
CGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGA
CTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGA
CAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGAC
AAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTG
ACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTAC
GCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTG
GTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCG
GTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCAT
GCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACA
AGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTC
GCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGT
GAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGA
AAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGA
TCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTG
GAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGA
CGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGAC
GTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGG
TGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGG
AGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGA
TTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAG
AGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTA
CCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGA
ACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGT
CGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACC
ATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAA
AGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGT
GAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAAT
ACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAAT
GGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAAT
CGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCG
CAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAA
TCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGG
GACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCG
TGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAG
CTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATT
TCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCC
CCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGC
CGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTT
CCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGA
ACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGA
ACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAA
GTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAG
AACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGT
ACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGA
CGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCT
GTCGCAGCTGGGTGGCGATGGCGGTGGATCTCCGAAAAAGAAGAGAAAGGTGTA
ATGAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAA
AGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGC
CAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGT
GCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
TAATACGACTCACTATAGGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGC
TTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGATAAGAAGTACT
CAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATG
AATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACA
GCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAG
AAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATC
GCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACA
GCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATG
AACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGT
ACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCG
ACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTT
CCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATT
CAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGC
GGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCG
AAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACT
TGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCC
GAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAAT
TTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACC
TTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAA
AGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCT
CACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGAT
CTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAG
CCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAAC
CGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAAC
CTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATC
TTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATC
GAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCA
ATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGA
ATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAA
TGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCC
TCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTAC
TGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGT
CGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGA
CTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGA
CAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGAC
AAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTG
ACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTAC
GCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTG
GTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCG
GTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCAT
GCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACA
AGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTC
GCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGT
GAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGA
AAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGA
TCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTG
GAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGA
CGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGAC
GTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGG
TGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGG
AGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGA
TTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAG
AGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTA
CCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGA
ACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGT
CGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACC
ATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAA
AGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGT
GAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAAT
ACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAAT
GGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAAT
CGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCG
CAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAA
TCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGG
GACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCG
TGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAG
CTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATT
TCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCC
CCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGC
CGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTT
CCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGA
ACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGA
ACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAA
GTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAG
AACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGT
ACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGA
CGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCT
GTCGCAGCTGGGTGGCGATGGCTCGGCTTACCCATACGACGTGCCTGACTACGCC
TCGCTCGGATCGGGCTCCCCCAAAAAGAAACGGAAGGTGGACGGATCCCCGAAA
AAGAAGAGAAAGGTGGACTCCGGATGAGAATTATGCAGTCTAGCCATCACATTT
AAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGC
TTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAAC
ATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATG
GAAAGAACCTCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAA
目的の領域内でPAMを同定するために、ヒト参照ゲノム(例えば、hg38)および目的のユーザー定義ゲノム領域(例えば、SERPINA1タンパク質コードエクソン)を用いて、最初のガイド選択をin silicoで実施した。同定した各PANに対し、解析を実施し統計値を報告した。当技術分野で公知である、ある数の基準(例えば、GC含量、予測オン標的活性、および潜在的オフターゲット活性)に基づいて、gRNA分子をさらに選択および順位付けした。
Spy Cas9を構成的に発現するヒト胚腎臓腺癌細胞株HEK293(「HEK293_Cas9」)を、10%のウシ胎児血清および500μg/mlのG418を追加したDMEM培地中で培養した。トランスフェクションの20時間前に、細胞を10,000細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートにプレーティングした(トランスフェクション時70%コンフルエント)。製造業者のプロトコルに従って、リポフェクタミンRNAiMAX(ThermoFisher、Cat.13778150)を用いて細胞をトランスフェクションした。個別のcrRNA(25nM)、trRNA(25nM)、リポフェクタミンRNAiMAX(0.3μL/ウェル)、およびOptiMemを含有するリポプレックスを用いて細胞にトランスフェクションした。
HEK293_Cas9、HUH7、およびPHHトランスフェクション細胞をトランスフェクション後24時間または48時間時に採取した。製造業者のプロトコルに従って、50μL/ウェルのBuccalAmp DNA抽出溶液(Epicentre、Cat.QE09050)を使用して、gDNAを96ウェルプレートの各ウェルから抽出した。本明細書に記載のように、全てのDNA試料をPCRにかけ、続いてNGS解析にかけた。
ゲノム内の標的位置における編集の効率を定量的に決定するため、ディープシークエンシングを利用して、遺伝子編集により導入された挿入および欠失の存在を同定した。
肝細胞癌細胞株HUH7を、先に説明したように、表1からの選択ガイドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから6日後、細胞をPBSで1回洗浄し、次に、10%のFBSを含む200μLの標準DMEM培地で置き換えた。4時間後、培地を採取し、−20℃にて保管した。製造業者のプロトコルに従って、接着細胞上でCellTiter−Glo(「CTG」)アッセイ(Promega、Cat.G7570)を完了した。AAT ELISAキット(R&D Systems、Cat.DY1268)を用いて総AATレベルを決定した。製造業者のプロトコルに従って、キット試薬および標準物質を調製した。ELISAを実行する前に、凍結培地を室温にて解凍し、1000rpmにて1分間遠心処理してペレット状デブリにし、次に氷上に定置した。ELISAに対して、30μLの培地を70μLの1×アッセイ希釈剤で希釈した。製造業者のプロトコルに従ってELISA手順を完了した。SpectraMax M5プレートリーダー上でプレートを読み取った。SoftMax Proソフトウェアver.6.4.2により、標準曲線から作製された4パラメーターロジスティック曲線適合を用いてAATレベルを計算した。各ウェルに対する細胞数を、CTGアッセイから得られた値に基づいたプレート平均との比較により推定した。最終AATレベル(pg/ml)を細胞数に対して調整した。
肝細胞癌細胞株HUH7を、先に説明したように、表1からの選択ガイドを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションから6日後、培地を除去し、細胞を50μL/ウェルのRIPAバッファー(Boston Bio Products、Cat.BP−115)および新たに加えたプロテアーゼ阻害剤混合物(完全プロテアーゼ阻害剤カクテル(Sigma、Cat.11697498001)、1mMのDTT、および250U/mlのベンゾナーゼ(EMD Millipore、Cat.71206−3)からなる)で溶解した。細胞を氷の上に30分間保ち、このときにNaCl(1Mの最終濃度)を添加した。細胞溶解物を十分に混合し、氷の上で30分間保持した。全細胞抽出物(「WCE」)をPCRプレートに移し、遠心処理してペレット状デブリにした。Bradfordアッセイ(Bio−Rad、Cat.500−0001)を使用してライセートのタンパク質含量を評価した。製造業者のプロトコルに従ってBradfordアッセイ手順を完了した。使用前に抽出物を−20℃にて保管した。ウェスタンブロットを実施してAATタンパク質レベルを評価した。溶解物をレムリーバッファーと混合し、95℃にて10分間変性させた。製造業者のプロトコルに従って、4〜12%のビス−トリスゲル(ThermoFisher)上のNuPageシステムを用いてウェスタンブロットを実行し、次に0.45μmのニトロセルロース膜(Bio−Rad、Cat.1620115)の上へと湿式で移行させた。移行後、膜を水で十分にすすぎ、ポンソーS溶液(Boston Bio Products、Cat.ST−180)で染色して、完全かつ一様な移行を確認した。室温にてラボロッカー上でTBS中5%のドライミルクを30分間用いて、ブロットをブロックした。ブロットをTBSTですすぎ、ウサギα−AATポリクローナル抗体(Sigma、Cat.HPA001292)をTBST中1:1000にて用いてプローブした。ローディング対照としてのGAPDH(ThermoFisher,Cat.NB600502)をTBST中1:2500にて使用し、同時にAAT一次抗体と共にインキュベートした。ブロットをバッグ内に密閉し、4℃にて一晩ラボロッカー上に保った。インキュベート後、ブロットをTBST中で3回、各5分間すすぎ、マウスおよびウサギに対する二次抗体(ThermoFisher、Cat.PI35518およびPISA535571)でプローブした(それぞれTBST中1:25,000で室温にて30分間)。インキュベート後、ブロットをTBST中で3回、各5分間すすぎ、PBSを用いて2回すすいだ。Licor Odysseyシステムを用いてブロットを視覚化および解析した。
4.5のN:P比率(アミン:RNAリン酸)(N:P)でLNPを製剤した。以下のモル比で、脂質ナノ粒子構成要素を100%のエタノールに溶解した:45mol%のカチオン性脂質(脂質A);44mol%のコレステロール;9mol%のDSPC;および2mol%のPEG2k−DMG。RNAカーゴ(mRNA:sgRNA(重量/重量)が1:1)をpH4.5にて25Mmの酢酸ナトリウムバッファー内で溶解し、およそ0.45mg/mLの濃度のRNAカーゴを得た。製造業者のプロトコルに従ってPrecision NanosystemsのNanoAssemblr(商標)Benchtop装置を用いた脂質およびRNAの溶液のマイクロ流体混合を行うことにより、LNPを形成した。水中でLNPを3:1の比率にて収集した。LNPを室温にて1時間インキュベートした。残りのバッファーを、4℃にて一晩、10kDaのSlide−a−Lyzer(商標)G2透析カセット(ThermoFisher Scientific)を用いて穏やかに撹拌しながら、pH7.5の50mMのトリス(試料体積の100倍過剰)へと交換した。翌日、Amiconフィルター(4000g、4℃)を用いてLNPを濃縮し、所望の濃度の2倍にした。次に、2X TSS(50mMのトリス、90mMの塩化ナトリウム、10% w/vのスクロース、pH7.5)を用いてLNPを1:1混合した。次に、0.2μMのフィルターを用いて得られた混合物を濾過した。得られた濾液を2〜8℃にて保管した。
1.複数の細胞タイプにおけるSERPINA1ガイドのクロススクリーニング
ヒトSERPINA1およびカニクイザルにおいて相同性を有するものを標的とするガイドを、実施例1に記載のようにHEK293_Cas9およびHUH7の細胞株、さらにヒト初代肝細胞の中へとトランスフェクションした。各細胞タイプにわたって、各ガイド配列を含むcrRNAに対し編集パーセントを決定し、次にガイド配列を最高編集%に基づいて順位付けした。3種の細胞株全てにおける表1のガイド配列に対するスクリーニングデータを以下に挙げる(表4、5、および6)。
オリゴ挿入ベースアッセイ(例えば、Tsai et al.,Nature Biotechnology 33,187−197;2015を参照)を使用して、SERPINA1を標的とするCas9により
切断される潜在的可能性があるオフターゲットゲノム部位を決定した。表7の30種のガイド(および既知のオフターゲットプロファイルを有する2種の対照ガイド)を、上述のようにHEK293−Cas9細胞においてスクリーニングし、オフターゲット結果を図3にプロットした。当該アッセイは、crRNAのいくつかに対する潜在的なオフターゲット部位を同定し、検出可能なオフターゲットを有しない他のものを同定した。
1.分泌アルファ1アンチトリプシンのELISA解析
実施例1に記載のように、肝細胞癌細胞株HUH7を表1からの選択ガイドを用いて四連でトランスフェクションした。トランスフェクションから2日後、四連のうちの1つをゲノムDNAおよびNGSシークエンシングによる解析のために採取した。対照ガイドを含めた全てのガイドは、70%を超える編集パーセントを有し、いくつかは95%に達した。トランスフェクションから6日後、先述のようなELISAによる分泌AATの解析のための培地採取向けに四連のうちの1つを用意した。全てのAAT crRNAは、培地へと分泌されるAATのレベルを、対照ガイドとの比較で5〜10倍の因数によって低減した。各ガイドに対する編集%および細胞外AATの低減についてのデータを表7に示す。
実施例1に記載のように、肝細胞癌細胞株HUH7を、表1からのガイドを含むcrRNAを用いてトランスフェクションした。トランスフェクションした細胞のプールを、さらなる解析のために組織培養で保持し継代させた。トランスフェクションから11日後、細胞を採取し、全細胞抽出物(WCE)を調製し、先述のようにウェスタンブロットによる解析にかけた。
3.選択ガイドに対するin vitroデータの統合
本明細書に記載のデータを解析することにより、個々のガイドに対して焦点を合わせたデータパッケージを創出した。分泌AAT(ELISA)の低減の比較、外来バンドの産生に対する総AATタンパク質の低減(ウェスタンブロット)、およびオフターゲット解析を通じてリード候補を特徴付け、かつ順位付けした。カニクイザルに対する相同性(配列中の任意のミスマッチ(mm)を含む)も表した。図5から図10を参照。
ヒトSERPINA1を標的とするCas9 mRNAおよび修飾sgRNAの脂質ナノ粒子製剤を、PHHおよびHepG2細胞に対し用量反応曲線において試験した。実施例1に記載のように(ただし、33,000細胞/ウェルのところを15,000PHH細胞/ウェルにて)、PHHおよびHepG2細胞をプレーティングした。LNPを用いた処置の前に、細胞を37℃、5%CO2にて24時間インキュベートした。実施例1に記載のように、当該実験で使用するLNPを調製した。各LNPは、図11および図12で指定されているsgRNAと、Cas9 mRNAとを含有した。LNPを、6%のカニクイザル血清を含有する肝細胞維持培地中で37℃にて5分間インキュベートした。インキュベート後、100ngのmRNAにて開始する2倍用量反応曲線においてLNPを細胞に8ポイントにおいて添加した。実施例1に記載のように、NGS解析のために治療から72時間後に細胞を溶解した。両方の細胞タイプにおけるガイド配列に対する用量反応曲線データを図11および図12に示す。これらのデータは、製剤が、両方のHepG2細胞の編集に加えて、ヒトにおけるin vivo標的として意図されているヒト初代肝細胞の編集にも有効であることを示すものである。
ヒトPiZバリアントに対する脂質ナノ粒子(LNP)の送達および編集
実施例4で試験した6種のLNP製剤のうちの5種と、マウスTTR遺伝子を標的とするsgRNAを含む対照LNPとを、ヒトPiZバリアントのコピーを有するトランスジェニックマウスに投与した。PiZトランスジェニックマウスについては以前に説明されており(例えば、Carlson JA,Rogers BB,Sifers RN,et al.Accumulation of PiZ alpha 1−antitrypsin causes liver damage in transgenic mice.J Clin Invest 1989;83:1183−1190を参照)、ヒトPiZバリアントのコンカテマー化されたコピーを7つ〜8つを、当該コンカテマーに対しヘテロ接合性のマウスにおいて保有すると考えられている(データは示さず)。
mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmU
mAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm
AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(配列番号424)
Claims (243)
- SERPINA1遺伝子内の2本鎖切断(DSB)を誘発する方法であって、細胞に、配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAを含む組成物を送達することを含む、方法。
- SERPINA1遺伝子を修飾する方法であって、細胞に、(i)RNAガイドされたDNA結合剤、またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸と、(ii)配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAと、を含む組成物を送達することを含む、方法。
- アルファ1アンチトリプシン欠乏症(AATD)を治療する方法であって、前記治療を必要とする対象に、(i)RNAガイドされたDNA結合剤、またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸と、(ii)配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含むガイドRNAと、を含む組成物を投与することを含み、それによってAATDを治療する、方法。
- 対象における肝臓内のアルファ1アンチトリプシン(AAT)蓄積を低減または防止する方法であって、前記低減または防止を必要とする対象に、(i)RNAガイドされたDNA結合剤、またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸と、(ii)配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、もしくは90%同一であるガイド配列を含む、ガイドRNAと、を含む組成物を投与することを含み、それによって肝臓内のAAT蓄積を低減する、方法。
- 配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%同一であるガイド配列を含むガイドRNAを含む、組成物。
- 配列番号5〜129から選択されるガイド配列、または配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%同一であるガイド配列を含むガイドRNAをコードするベクターを含む、組成物。
- 細胞または対象におけるSERPINA1遺伝子内の2本鎖切断(DSB)の誘発における使用のための、請求項5または6に記載の組成物。
- 細胞または対象におけるSERPINA1遺伝子内の修飾における使用のための、請求項5または6に記載の組成物。
- 対象におけるアルファ1アンチトリプシン欠乏症(AATD)の治療における使用のための、請求項5または6に記載の組成物。
- 対象におけるAATの血清中濃度または肝臓中濃度の低減における使用のための、請求項5または6に記載の組成物。
- 対象における肝臓内のアルファ1アンチトリプシン(AAT)蓄積の低減または防止における使用のための、請求項5または6に記載の組成物。
- 前記組成物が、血清および/または肝臓のAATレベルを低減する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法、または請求項5〜11のいずれか1項に記載の使用のための組成物。
- 前記血清および/または肝臓のAATレベルが、前記組成物を投与する前の血清中および/またはAATレベルと比較して、少なくとも40%低減される、請求項12に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記血清および/または肝臓のAATレベルが、前記組成物を投与する前の血清中および/またはAATレベルと比較して、40〜50%、50〜60%、60〜70%、70〜80%、80〜90%、90〜95%、95〜98%、98〜99%、または99〜100%低減される、請求項12に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物が前記SERPINA1遺伝子の編集をもたらす、請求項1〜4または7〜14のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記編集が、編集された集団のパーセンテージ(編集パーセント)として計算される、請求項15に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記編集パーセントが30から90%の間である、請求項16に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記編集パーセントが、30から35%の間、35から40%の間、40から45%の間、45から50%の間、50から55%の間、55から60%の間、60から65%の間、65から70%の間、70から75%の間、75から80%の間、80から85%の間、85から90%の間、90から95%の間、または95から99%の間である、請求項17に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物が少なくとも2回投与または送達される、請求項1〜4または7〜18のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物が少なくとも3回投与または送達される、請求項19に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物が少なくとも4回投与または送達される、請求項19に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物が最高5回、6回、7回、8回、9回、または10回投与または送達される、請求項19に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記投与または送達が、1日、2日、3日、4日、5日、6日、7日、8日、9日、10日、11日、12日、13日、14日、または15日の間隔で発生する、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記投与または送達が、1週、2週、3週、4週、5週、6週、7週、8週、9週、10週、11週、12週、13週、14週、または15週の間隔で発生する、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記投与または送達が、1ヵ月、2ヵ月、3ヵ月、4ヵ月、5ヵ月、6ヵ月、7ヵ月、8ヵ月、9ヵ月、10ヵ月、11ヵ月、12ヵ月、13ヵ月、14ヵ月、または15ヵ月の間隔で発生する、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ガイド配列が配列番号5〜129から選択される、請求項1〜25のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAが、ヒトSERPINA1遺伝子内に存在する標的配列に対し少なくとも部分的に相補的である、請求項1〜26のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記標的配列が前記ヒトSERPINA1遺伝子のエクソン2、3、4、または5内にある、請求項27に記載の方法または組成物。
- 前記標的配列が前記ヒトSERPINA1遺伝子のエクソン2内にある、請求項27に記載の方法または組成物。
- 前記標的配列が前記ヒトSERPINA1遺伝子のエクソン3内にある、請求項27に記載の方法または組成物。
- 前記標的配列が前記ヒトSERPINA1遺伝子のエクソン4内にある、請求項27に記載の方法または組成物。
- 前記標的配列が前記ヒトSERPINA1遺伝子のエクソン5内にある、請求項27に記載の方法または組成物。
- 前記ガイド配列が、SERPINA1のプラス鎖内の標的配列に対し相補的である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ガイド配列が、SERPINA1のマイナス鎖内の標的配列に対し相補的である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 第2のガイド配列をさらに含み、前記第1のガイド配列が、SERPINA1遺伝子のプラス鎖内の第1の標的配列に対し相補的であり、前記第2のガイド配列が、SERPINA1遺伝子のマイナス鎖内の第2の標的配列に対し相補的である、請求項1〜32のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAが、前記ガイド配列を含みかつ配列番号140のヌクレオチド配列をさらに含むcrRNAを含み、前記配列番号140のヌクレオチドがその3’末端において前記ガイド配列に続く、請求項1〜35のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAがデュアルガイド(dgRNA)である、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記デュアルガイドRNAが、配列番号140のヌクレオチド配列を含むcrRNAであって、前記配列番号140のヌクレオチドがその3’末端において前記ガイド配列に続く、crRNAと、trRNAとを含む、請求項37に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAがシングルガイド(sgRNA)である、請求項1〜36のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記sgRNAが、配列番号130の修飾を有するガイド配列を含む、請求項39に記載の方法または組成物。
- 前記sgRNAが配列番号130を含む、請求項39に記載の方法または組成物。
- 配列番号130における各Nが、任意の天然または非天然のヌクレオチドであり、前記Nが前記ガイド配列を形成し、かつ前記ガイド配列がRNAガイドされたDNA結合剤をSERPINA1遺伝子へと標的化させる、請求項40または41に記載の方法または組成物。
- 前記sgRNAが、配列番号5〜129のガイド配列のうちのいずれか1つおよび配列番号140のヌクレオチドを含む、請求項39〜42のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記sgRNAが、配列番号5〜129から選択される配列と少なくとも99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%、または90%同一であるガイド配列を含む、請求項39〜43のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号130における各Nが、配列番号5〜129から選択されるガイド配列で集合的に置き換えられる、請求項42に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAが少なくとも1つの修飾を含む、請求項1〜45のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、2’−O−メチル(2’−O−Me)修飾ヌクレオチドを含む、請求項46に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、ヌクレオチド間のホスホロチオエート(PS)結合を含む、請求項46または47に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、2’−フルオロ(2’−F)修飾ヌクレオチドを含む、請求項46〜48のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、5’末端における最初の5個のヌクレオチドのうちの1つ以上において修飾を含む、請求項46〜49のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、3’末端における最後の5個のヌクレオチドのうちの1つ以上において修飾を含む、請求項46〜50のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、最初の4つのヌクレオチド間のPS結合を含む、請求項46〜51のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、最後の4つのヌクレオチド間のPS結合を含む、請求項46〜52のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、5’末端における最初の3個のヌクレオチドにおいて2’−O−Me修飾ヌクレオチドを含む、請求項46〜53のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記少なくとも1つの修飾が、3’末端における最後の3個のヌクレオチドにおいて2’−O−Me修飾ヌクレオチドを含む、請求項46〜54のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAが、配列番号130の前記修飾ヌクレオチドを含む、請求項46〜55のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記組成物が、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項1〜56のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ガイドRNAと、任意選択でRNAガイドされたDNA結合剤またはRNAガイドされたDNA結合剤をコードする核酸とが、脂質ナノ粒子(LNP)と会合している、請求項1〜57のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記LNPがCCD脂質を含む、請求項58に記載の方法または組成物。
- 前記CCD脂質が脂質Aである、請求項59に記載の方法または組成物。
- 前記LNPが中性脂質を含む、請求項58〜60に記載の方法または組成物。
- 前記中性脂質がDSPCである、請求項61に記載の方法または組成物。
- 前記LNPがヘルパー脂質を含む、請求項58〜62のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ヘルパー脂質がコレステロールである、請求項63に記載の方法または組成物。
- 前記LNPがステルス脂質を含む、請求項58〜64のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記ステルス脂質がPEG2k−DMGである、請求項58〜65に記載の方法または組成物。
- 前記組成物がRNAガイドされたDNA結合剤をさらに含む、請求項1〜66のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記組成物がRNAガイドされたDNA結合剤をコードするmRNAをさらに含む、請求項1〜67のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記RNAガイドされたDNA結合剤がCasクリベースである、請求項67または68に記載の方法または組成物。
- 前記RNAガイドされたDNA結合剤がCas9である、請求項69に記載の方法または組成物。
- 前記RNAガイドされたDNA結合剤が修飾されている、請求項67〜70のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記RNAガイドされたDNA結合剤がニッカーゼである、請求項67〜71のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記修飾されたRNAガイドされたDNA結合剤が核局在化シグナル(NLS)を含む、請求項71または72に記載の方法または組成物。
- 前記RNAガイドされたDNA結合剤が、II型CRISPR/CasシステムからのCasである、請求項67〜73のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記組成物が薬学的製剤であり、かつ薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜74のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 前記組成物が肝臓内のアルファ1アンチトリプシン(AAT)の蓄積を低減または防止する、請求項1〜4または7〜75のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記AATが誤形成されている、請求項76に記載の方法または使用のための組成物。
- 非相同末端結合(NHEJ)が、SERPINA1遺伝子内のDSBの修復中に突然変異をもたらす、請求項1〜4または7〜77のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- NHEJが、SERPINA1遺伝子内のDSBの修復中にヌクレオチドの欠失または挿入をもたらす、請求項78に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、SERPINA1遺伝子内のフレームシフトまたはナンセンス突然変異を誘発する、請求項79に記載の方法または使用のための組成物。
- フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の少なくとも50%のSERPINA1遺伝子内で誘発される、請求項80に記載の方法または使用のための組成物。
- フレームシフトまたはナンセンス突然変異が、肝細胞の50%〜60%、60%〜70%、70%もしくは80%、80%〜90%、90〜95%、95%〜99%、または99%〜100%のSERFINA1遺伝子内で誘発される、請求項81に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも少なくとも50倍以上SERPINA1遺伝子内で発生する、請求項79〜82のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記ヌクレオチドの欠失または挿入が、オフターゲット部位内よりも50倍から150倍、150倍から500倍、500倍から1500倍、1500倍から5000倍、5000倍から15000倍、15000倍から30000倍、または30000倍から60000倍、SERPINA1遺伝子内で発生する、請求項83に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物の投与が前記対象におけるAATレベルを低減する、請求項1〜4または7〜84のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記AATレベルが少なくとも40%低減される、請求項85に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記AATレベルが、40%〜50%、50%〜60%、60%〜70%、70%もしくは80%、80%〜90%、90〜95%、95%〜99%、または99%〜100%低減される、請求項86に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記AATレベルが、血清中、血漿中、血液中、脳脊髄液中、または痰中で測定される、請求項86または87に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記AATレベルが、肝臓中及び/または血清中で測定される、請求項86または87に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記AATレベルが、酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)を介して測定される、請求項85〜89のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象がAATDを有する、請求項1〜4または7〜90のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象がヒトである、請求項1〜4または7〜91のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象がAATD野生型を有する、請求項91または92に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象が遺伝性AATDを有する、請求項91または92に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象がAATDの家族歴を有する、請求項1〜4または7〜92、または94のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象がAATDの肝臓症状のみを有する、または主としてAATDの肝臓症状を有する、請求項1〜4または7〜95のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象が、SERPINA1座位におけるZアレルについてヘテロ接合性である、請求項1〜4または7〜96のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象が、前記SERPINA1座位において1つのZアレルおよび1つのSアレルを有する、請求項97に記載の方法。
- 前記対象が、AATのアミノ酸配列中にE342K変異を有しないが、野生型AATのレベル低減を有する、請求項1〜4または7〜98のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象が浮腫、腹水、もしくは黄疸の改善、安定化、もしくは緩徐化を有し、または肝臓移植の必要性が遅延する、請求項1〜4または7〜99のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象が、投与の結果として、イメージング法または肝臓酵素レベルにより測定されるように、変化の改善、安定化、もしくは緩徐を有する、請求項1〜4または7〜99のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物または薬学的製剤がウイルスベクターを介して投与される、請求項1〜4または7〜101のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記組成物または薬学的製剤が脂質ナノ粒子を介して投与される、請求項1〜4または7〜102のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 前記対象が、前記組成物または製剤を投与する前に、SERPINA1遺伝子内の特定の突然変異について試験される、請求項1〜4または7〜103のいずれか1項に記載の方法または使用のための組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号5である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号6である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号7である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号8である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号9である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号10である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号11である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号12である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号13である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号14である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号15である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号16である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号17である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号18である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号19である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号20である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号21である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号22である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号23である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号24である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号25である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号26である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号27である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号28である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号29である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号30である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号31である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号32である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号33である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号34である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号35である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号36である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号37である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号38である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号39である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号40である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号41である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号42である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号43である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号44である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号45である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号46である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号47である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
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- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号57である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
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- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号59である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号60である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号61である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号62である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号63である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号64である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号65である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号66である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号67である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号68である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号69である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号70である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
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- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号89である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号90である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号91である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号92である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号93である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号94である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号95である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号96である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号97である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号98である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号99である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号100である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号101である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号102である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号103である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号104である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号105である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号106である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号107である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号108である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号109である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号110である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号111である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号112である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号113である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号114である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号115である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号116である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号117である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号118である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号119である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号120である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号121である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号122である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号123である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号124である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号125である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号126である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号127である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号128である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号5〜129から選択される前記配列が配列番号129である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号140または141の配列をさらに含む、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号130の修飾パターンを含む、請求項230に記載の方法または組成物。
- 前記配列が配列番号131〜139から選択される、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号131である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号132である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号133である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号134である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号135である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号136である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号137である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号138である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が配列番号139である、請求項1〜104のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- 配列番号131〜139から選択される前記配列が、表2内の前記それぞれの配列について示されている前記修飾を含む、請求項232〜241のいずれか1項に記載の方法または組成物。
- AATDを有するヒト対象を治療するための医薬の前記調製のための、請求項5〜242のいずれかに記載の組成物または製剤の使用。
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