BR112019012825A2 - composições e métodos para tratar deficiência de alfa-1 antitripsina - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a composições e métodos para introdução quebras de fita dupla dentro do gene serpina1. composições e métodos para reduzir e eliminar formas mutantes de a1-antitripsina (aat), tal como observado em sujeitos tendo deficiência de a1-antitripsina (aatd), são fornecidos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para COMPOSIÇÕES E MÉTODOS PARA TRATAR DEFICIÊNCIA DE ALFA-1 ANTITRIPSINA.

CAMPO [0001] Este pedido reivindica o benefício de prioridade para o Pedido Provisório dos Estados Unidos n° 62/438.219, que foi depositado em 22 de dezembro de 2016, e que é incorporado por referência em sua totalidade.

[0002] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 20 de dezembro de 2017, é denominada 2017-12-20_011550005-00PCT_ST25_v2.txt e tem 92,165 bytes de tamanho.

[0003] A alfa-1 antitripsina (AAT ou A1AT) ou o inibidor da tripsina sérica é um tipo de inibidor da serina protease (também denominado serpina) codificado pelo gene SERPINA1. AAT é principalmente sintetizada e secretada pelos hepatócitos e funciona para inibir a atividade da elastase neutrofílica no pulmão. Sem quantidades suficientes de AAT funcional, a elastase neutrofílica é descontrolada e danifica alvéolos no pulmão. Assim, as mutações no SERPINA1 que resultam em níveis diminuídos de AAT, ou diminuição dos níveis de AAT funcionando corretamente, levam à patologia pulmonar. Além disso, as mutações em SERPINA1 que levam à produção de AAT malformada que não sai do fígado leva à patologia hepática devido ao acúmulo de AAT nos hepatócitos. Assim, a AAT insuficiente e indevidamente formada causada pela mutação de SERPINA1 leva à patologia do pulmão e do fígado.

[0004] Mais de cem variantes alélicas foram descritas para o gene SERPINA1. As variantes são geralmente classificadas de acordo com o seu efeito nos níveis séricos de AAT. Por exemplo, os alelos M são

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2/156 variantes normais associadas a níveis séricos normais de AAT, enquanto os alelos Z e S são variantes mutantes associadas a níveis diminuídos de AAT. A presença dos alelos Z e S está associada à deficiência de alfa 1-antitripsina (AATD ou AIAD), um distúrbio genético caracterizado por mutações no gene SERPINA1 que leva à produção de AAT anormal.

[0005] Existem muitas formas e graus de AATD. A 'Variante Z”é a mais comum, causando doença clínica grave tanto no fígado quanto no pulmão. A variante Z é caracterizada por uma única alteração nucleotídica na extremidade 5 do 5°éxon que resul ta em uma mutação missense (com troca de sentido) do ácido glutâmico em lisina na posição de aminoácido 342 (E342K). Os sintomas surgem em pacientes que são homozigotos (ZZ) e heterozigotos (MZ ou SZ) no alelo Z. A presença de um ou dois alelos Z resulta na instabilidade do mRNA de SERPINA1 e na polimerização e agregação da proteína AAT nos hepatócitos do fígado. Pacientes com pelo menos um alelo Z têm uma incidência aumentada de câncer de fígado devido ao acúmulo de proteína AAT agregada no fígado. Além da patologia hepática, a AATD caracterizada por pelo menos um alelo Z é também caracterizada por doença pulmonar devido à diminuição da AAT nos alvéolos e à consequente diminuição da inibição da elastase neutrofílica. A prevalência da forma ZZ grave (isto é, expressão homozigótica da variante Z) é 1:2.000 em populações do norte da Europa, e 1: 4.500 nos Estados Unidos.

[0006] Existe uma necessidade de melhorar os efeitos negativos da AATD no fígado e no pulmão. A presente invenção fornece composições e métodos usando o sistema CRISPR/Cas para inativa o gene SERPINA1, eliminando assim a produção de formas mutantes de AAT que estão associadas aos sintomas do fígado em pacientes com AATD. SUMÁRIO

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3/156 [0007] Modalidade 01 Um método para induzir uma quebra de fita dupla (DSB) dentro do gene SERPINA1, compreendendo distribuir uma composição para uma célula, em que a composição compreende um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.

[0008] Modalidade 02 Um método para modificar gene SERPINA1, compreendendo distribuir uma composição para uma célula, em que a composição compreende (i) um agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA e (ii) um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.

[0009] Modalidade 03 Um método para tratar deficiência de alfa-1 antitripsina (AATD), compreendendo administrar uma composição a um sujeito em necessidade da mesma, em que a composição compreende (i) um agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA e (ii) um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, desse modo tratando AATD.

[0010] Modalidade 04 Um método para reduzir ou prevenir acumulação de alfa-1 antitripsina (AAT) no fígado em um sujeito, compreendendo administrar uma composição a um sujeito em necessidade da mesma, em que a composição compreende (i) um agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA e (ii) um RNA

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4/156 guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, desse modo reduzindo acumulação de AAT no fígado.

[0011] Modalidade 05 Uma composição compreendendo um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.

[0012] Modalidade 06 Uma composição compreendendo um vetor codificando um RNA guia, em que o RNA guia compreende uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-

129.

[0013] Modalidade 07 A composição da modalidade 5 ou 6 para uso na indução de uma quebra de fita dupla (DSB) dentro do gene SERPINA1 em uma célula ou sujeito.

[0014] Modalidade 08 A composição da modalidade 5 ou 6, para uso na modificação do gene SERPINA1 em uma célula ou sujeito.

[0015] Modalidade 09 A composição da modalidade 5 ou 6 para uso no tratamento de deficiência de alfa-1 antitripsina (AATD) em um sujeito. [0016] Modalidade 10 A composição da modalidade 5 ou 6, para uso na redução de concentração no soro ou fígado de AAT em um sujeito.

[0017] Modalidade 11 A composição da modalidade 5 ou 6, para uso na redução ou prevenção da cumulação de alfa-1 antitripsina (AAT) no fígado em um sujeito.

[0018] Modalidade 12 O método de acordo com qualquer uma das

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5/156 modalidades 1-4 ou a composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 5-11, em que a composição reduz níveis de AAT no soro e/ou fígado.

[0019] Modalidade 13 O método ou composição para uso da modalidade 12, em que os níveis de AAT no soro e/ou do fígado são reduzidos em pelo menos 50% em comparação com níveis de AAT no soro e/ou antes da administração da composição.

[0020] Modalidade 14 O método ou composição para uso de acordo com a modalidade 12, em que os níveis de soro e/ou AAT são reduzidos em 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95- 98%), 98-99% ou 99-100% em comparação com níveis de AAT no soro e/ou antes da administração da composição.

[0021 ] Modalidade 15 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 14, em que a composição resulta na edição do gene SERPINA1.

[0022] Modalidade16 O método ou composição para uso da modalidade 15, em que a edição é calculada como uma porcentagem da população que é editado (por cento de edição).

[0023] Modalidade 17 O método ou composição para uso da modalidade 16, em que a edição percentual está entre 30 e 99%.

[0024] Modalidade 18 O método ou composição para uso da modalidade 17, em que a edição percentual está entre 30 e 35%, 35 e 40%, 40 e 45%, 45 e 50%, 50 e 55%, 55 e 60%, 60 e 65%, 65 e 70%, 70 e 75%, 75 e 80%, 80 e 85%, 85 e 90%, 90 e 95%, ou 95 e 99%.

[0025] Modalidade 19 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 18, em que a composição é administrada ou distribuída pelo menos duas vezes.

[0026] Modalidade 20 O método ou composição para uso da modalidade 19, em que a composição é administrada ou distribuída pelo menos três vezes.

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6/156 [0027] Modalidade 21 O método ou composição para uso da modalidade 19, em que a composição é administrada ou distribuída pelo menos quatro vezes.

[0028] Modalidade 22 O método ou composição para uso da modalidade 19, em que a composição é administrada ou distribuída até cinco, seis, sete, oito, nove ou dez vezes.

[0029] Modalidade 23 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que a administração ou distribuição ocorre em um intervalo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 dias.

[0030] Modalidade 24 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que a administração ou distribuição ocorre em um intervalo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 semanas.

[0031 ] Modalidade 25 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 19 a 22, em que a administração ou distribuição ocorre em um intervalo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 meses.

[0032] Modalidade 26 O método ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a sequência guia é selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.

[0033] Modalidade 27 O método ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o RNA guia é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência alvo presente no gene SERPINA1 humano.

[0034] Modalidade 28 O método ou composição, de acordo com a modalidade 27, em que a sequência alvo está no éxon 2, 3, 4, ou 5 do gene SERPINA1 humano.

[0035] Modalidade 29 O método ou composição da modalidade 27, em que a sequência alvo está no éxon 2 do gene SERPINA1 humano.

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7/156 [0036] Modalidade 30 O método ou composição da modalidade 27, em que a sequência alvo está no éxon 3 do gene SERPINA1 humano.

[0037] Modalidade 31 O método ou composição da modalidade 27, em que a sequência alvo está no éxon 4 do gene SERPINA1 humano.

[0038] Modalidade 32 O método ou composição da modalidade 27, em que a sequência alvo está no éxon 5 do gene SERPINA1 humano.

[0039] Modalidade 33 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 32, em que a sequência guia é complementar a uma sequência alvo na fita positiva de SERPINA1.

[0040] Modalidade 34 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 32, em que a sequência guia é complementar a uma sequência alvo na fita negativa de SERPINA1.

[0041] Modalidade 35 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 32, compreendendo ainda uma segunda sequência guia, em que a primeira sequência guia é complementar a uma primeira sequência alvo na fita positiva do gene SERPINA1 e em que a segunda sequência guia é complementar a uma segunda sequência alvo na fita negativa do gene SERPINA1.

[0042] Modalidade 36 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o RNA compreende um crRNA que compreende a sequência guia e compreende ainda uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 140, em que os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140 seguem a sequência guia na sua extremidade 3.

[0043] Modalidade 37 O método ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o RNA guia é uma guia dupla (dgRNA).

[0044] Modalidade 38 O método ou composição, de acordo com a reivindicação 37, em que o RNA de dupla guia compreende um crRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 140, em que os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140 seguem a sequência guia

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8/156 na sua extremidade 3 e um trRNA.

[0045] Modalidade 39 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 36, em que o RNA guia é uma única guia (sgRNA).

[0046] Modalidade 40 O método ou composição, de acordo com a reivindicação 39, em que o sgRNA compreende uma sequência guia que tem as modificações de SEQ ID NO: 130.

[0047] Modalidade 41 O método ou composição, de acordo com a modalidade 39, em que o sgRNA compreende a SEQ ID NO: 130.

[0048] Modalidade 42 O método ou composição, de acordo com a modalidade 40 ou 41, em que cada N em SEQ ID NO: 130 é qualquer nucleotídeo natural ou não natural, em que os Ns formam a sequência guia e a sequência guia tem como alvo um agente de ligação de DNA guiado por RNA para o gene SERPINA1.

[0049] Modalidade 43 O método ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 39 a 42, em que o sgRNA compreende qualquer uma das sequências guia de SEQ ID NOs: 5-129 e os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140.

[0050] Modalidade 44 O método ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades 39 a 43, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID Nos: 5-129.

[0051] Modalidade 45 O método ou composição, de acordo com a modalidade 42, em que cada N em SEQ ID NO: 130 é substituído por uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.

[0052] Modalidade 46 O método ou composição, de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que o RNA guia compreende pelo menos uma modificação.

[0053] Modalidade 47 O método ou composição, de acordo com a

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9/156 modalidade 46, em que a pelo menos uma modificação inclui um nucleotídeo modificado com 2-O-metil (2-O-Me).

[0054] Modalidade 48 O método ou composição da modalidade 46 ou 47, em que a pelo menos uma modificação inclui uma ligação fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.

[0055] Modalidade 49 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 48, em que a pelo menos uma modificação inclui um nucleotídeo modificado com 2-fluoro (2-F).

[0056] Modalidade 50 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 49, em que a pelo menos uma modificação inclui uma modificação em um ou mais dos primeiros cinco nucleotídeos na extremidade 5.

[0057] Modalidade 51 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 50, em que a pelo menos uma modificação inclui uma modificação em um ou mais dos últimos cinco nucleotídeos na extremidade 3.

[0058] Modalidade 52 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 51, em que a pelo menos uma modificação inclui ligações PS entre os primeiros quatro nucleotídeos.

[0059] Modalidade 53 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 52, em que a pelo menos uma modificação inclui ligações PS entre os últimos quatro nucleotídeos.

[0060] Modalidade 54 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 53, em que a pelo menos uma modificação inclui nucleotídeos modificados com 2-O-Me nos primeiros três nucleotídeos na extremidade 5.

[0061] Modalidade 55 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 54, em que a pelo menos uma modificação inclui nucleotídeos modificados com 2-O-Me nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3.

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10/156 [0062] Modalidade 56 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 46 a 55, em que o RNA guia compreende os nucleotídeos modificados de SEQ ID NO: 130.

[0063] Modalidade 57 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 56, em que a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.

[0064] Modalidade 58 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 57, em que o RNA guia e, opcionalmente, o agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA está/estão associados com uma nanopartícula de lipídeo (LNP).

[0065] Modalidade 59 O método ou composição, de acordo com a modalidade 58, em que a LNP compreende um lipídeo CCD.

[0066] Modalidade 60 O método ou composição, de acordo com a modalidade 59, em que o lipídeo CCD é Lipídeo A.

[0067] Modalidade 61 O método ou composição, de acordo com a modalidade 58 a 60, em que a LNP compreende um lipídeo neutro.

[0068] Modalidade 62 O método ou composição, de acordo com a modalidade 61, caracterizado pelo fato de que o lipídeo neutro é DSPC. [0069] Modalidade 63 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 58 a 62, em que a LNP compreende um lipídeo auxiliar.

[0070] Modalidade 64 O método ou composição da modalidade 63, em que o lipídeo auxiliar é colesterol.

[0071] Modalidade 65 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 58 a 64, em que o LNP compreende um lipídeo furtivo.

[0072] Modalidade 66 O método ou composição das modalidades 58 a 65, em que o lipídeo furtivo é PEG2k-DMG.

[0073] Modalidade 67 O método ou composição de acordo com

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11/156 qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição compreende ainda um agente de ligação de DNA guiado por RNA. [0074] Modalidade 68 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição compreende ainda um mRNA que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA.

[0075] Modalidade 69 O método ou composição da modalidade 67 ou 68, em que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é uma clivase Cas.

[0076] Modalidade 70 O método ou composição da modalidade 69, em que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é Cas9.

[0077] Modalidade 71 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 67 a 70, em que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é modificado.

[0078] Modalidade 72 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 67 a 71, em que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é uma nickase.

[0079] Modalidade 73 O método ou composição da modalidade 71 ou 72, em que o agente de ligação de DNA guiado por RNA modificado compreende um sinal de localização nuclear (NLS).

[0080] Modalidade 74 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 67 a 73, em que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é um Cas de um sistema CRISPR/Cas Tipo-II.

[0081] Modalidade 75 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, em que a composição é uma formulação farmacêutica e compreende ainda um transportador farmaceuticamente aceitável.

[0082] Modalidade 76 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 75, em que a composição reduz ou impede acumulação de alfa-1 antitripsina (AAT)

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12/156 no fígado.

[0083] Modalidade 77 O método ou composição para uso da modalidade 76, em que a AAT é malformada.

[0084] Modalidade 78 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 77, em que a junção terminal não homóloga (NHEJ) leva uma mutação durante reparo de uma DSB no gene SERPINA1.

[0085] Modalidade 79 O método ou composição para uso da modalidade 78, em que NHEJ leva a uma deleção ou inserção de um nucleotídeo durante reparo de uma DSB no gene SERPINA1.

[0086] Modalidade 80 O método ou composição para uso, de acordo com a modalidade 80, em que a deleção ou inserção de um nucleotídeo induz um desvio de estrutura ou mutação nonsense no gene SERPINA1.

[0087] Modalidade 81 O método ou composição para uso, de acordo com a modalidade 80, em que um desvio de estrutura ou mutação nonsense é induzida no gene SERPINA1 de pelo menos 50% das células do fígado.

[0088] Modalidade 82 O método ou composição para uso, de acordo com a modalidade 81, em que um desvio de estrutura ou mutação nonsense é induzido no gene SERPINA1 de 50%-60%, 60%70%, 70% ou 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, ou 99%-100% das células do fígado.

[0089] Modalidade 83 O método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 79 a 82, em que uma deleção ou inserção de um nucleotídeo ocorre no gene SERPINA1 pelo menos 50 vezes ou mais do que em sítios fora do alvo.

[0090] Modalidade 84 O método ou composição para uso da modalidade 83, em que a deleção ou inserção de um nucleotídeo ocorre no gene SERPINA1 50 vezes a 150 vezes, 150 vezes a 500 vezes, 500

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13/156 vezes a 1.500 vezes, 1.500 vezes a 5.000 vezes, 5.000 vezes a 15.000 vezes, 15.000 vezes a 30.000 vezes, ou 30.000 vezes a 60.000 vezes mais do que em sítios fora do alvo.

[0091 ] Modalidade 85 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 84, em que a administração da composição reduz os níveis de AAT no sujeito.

[0092] Modalidade 86 O método ou composição para uso da modalidade 85, em que os níveis de AAT são reduzidos em pelo menos 40%.

[0093] Modalidade 87 O método ou composição para uso da modalidade 86, em que os níveis de AAT são reduzidas em 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70% ou 80%, 80%-90%, 9095%, 95%-99%, ou 99%-100%.

[0094] Modalidade 88 O método ou composição para uso da modalidade 86 ou 87, em que os níveis de AAT são medidos em soro, plasma, sangue, fluido cérebro-espinhal, ou escarro.

[0095] Modalidade 89 O método ou composição para uso da modalidade 86 ou 87, em que os níveis de AAT são medidos no fígado e/ou soro.

[0096] Modalidade 90 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 85 a 89, em que os níveis de AAT são medidos através de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).

[0097] Modalidade 91 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 90, em que o sujeito tem AATD.

[0098] Modalidade 92 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 91, em que o sujeito é humano.

[0099] Modalidade 93 O método ou composição para uso da

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14/156 modalidade 91 ou 92, em que o sujeito tem AATD wt.

[00100] Modalidade 94 O método ou composição para uso da modalidade 91 ou 92, em que o sujeito tem AATD hereditária.

[00101] Modalidade 95 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4, 7 a 92 ou 94, em que o sujeito tem um histórico familiar de AATD.

[00102] Modalidade 96 O método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 95, em que o sujeito tem apenas ou predominantemente sintomas de fígado de AATD.

[00103] Modalidade 97 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 96, em que o sujeito é heterozigótico para alelo Z no lócus de SERPINA1.

[00104] Modalidade 98 O método da modalidade 97, em que o sujeito tem um alelo Z e um alelo S no lócus de SERPINA1.

[00105] Modalidade 99 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 98, em que o sujeito não tem uma mutação E342K na sequência de aminoácido de AAT, mas tem níveis reduzidos de AAT do tipo selvagem.

[00106] Modalidade 100 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 99, em que o sujeito tem uma melhoria, estabilização ou abrandamento de edema, ascite ou icterícia, ou um retardo na necessidade de transplante de fígado.

[00107] Modalidade 101 O método ou composição para uso de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 99, em que o sujeito tem uma melhoria, estabilização ou abrandamento de mudança como medida por métodos de imageamento ou níveis de enzima no fígado como resultado da administração.

[00108] Modalidade 102 O método ou composição para uso, de

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15/156 acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 101, em que a composição ou a formulação farmacêutica é administrada através de um vetor viral.

[00109] Modalidade 103 O método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 102, em que a composição ou a formulação farmacêutica é administrada através de nanopartículas de lipídeo.

[00110] Modalidade 104 O método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 4 ou 7 a 103, em que o sujeito é testado para mutações específicas no gene SERPINA1 antes da administração da composição ou formulação.

[00111] Modalidade 105 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 5.

[00112] Modalidade 106 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 6.

[00113] Modalidade 107 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 7.

[00114] Modalidade 108 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 8.

[00115] Modalidade 109 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 9.

[00116] Modalidade 110 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 10.

[00117] Modalidade 1110 método ou composição de acordo com

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16/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 11.

[00118] Modalidade 112 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 12.

[00119] Modalidade 113 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 13.

[00120] Modalidade 114 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 14.

[00121] Modalidade 115 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 15 [00122] Modalidade 116 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 16.

[00123] Modalidade 117 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 17.

[00124] Modalidade 118 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 18.

[00125] Modalidade 119 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 19.

[00126] Modalidade 120 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 20.

[00127] Modalidade 121 O método ou composição de acordo com

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17/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 21.

[00128] Modalidade 122 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 22.

[00129] Modalidade 123 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 23.

[00130] Modalidade 124 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 24.

[00131] Modalidade 125 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 25.

[00132] Modalidade 126 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 26.

[00133] Modalidade 127 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 27.

[00134] Modalidade 128 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 28.

[00135] Modalidade 129 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 29.

[00136] Modalidade 130 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 30.

[00137] Modalidade 131 O método ou composição de acordo com

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18/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 31.

[00138] Modalidade 132 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 32 [00139] Modalidade 133 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 33.

[00140] Modalidade 134 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 34.

[00141] Modalidade 135 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 35.

[00142] Modalidade 136 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 36.

[00143] Modalidade 137 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 37.

[00144] Modalidade 138 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 38.

[00145] Modalidade 139 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 39.

[00146] Modalidade 140 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 40.

[00147] Modalidade 141 O método ou composição de acordo com

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19/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 41.

[00148] Modalidade 142 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 42.

[00149] Modalidade 143 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 43.

[00150] Modalidade 144 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 44.

[00151] Modalidade 145 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 45.

[00152] Modalidade 146 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 46.

[00153] Modalidade 147 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 47.

[00154] Modalidade 148 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 48.

[00155] Modalidade 149 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 49 [00156] Modalidade 150 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 50.

[00157] Modalidade 151 O método ou composição de acordo com

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20/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 51.

[00158] Modalidade 152 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 52.

[00159] Modalidade 153 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 53.

[00160] Modalidade 154 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 54.

[00161] Modalidade 155 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 55.

[00162] Modalidade 156 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 56.

[00163] Modalidade 157 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 57.

[00164] Modalidade 158 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 58.

[00165] Modalidade 159 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 59.

[00166] Modalidade 160 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 60.

[00167] Modalidade 161 O método ou composição de acordo com

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21/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 61.

[00168] Modalidade 162 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 62.

[00169] Modalidade 163 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 63.

[00170] Modalidade 164 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 64.

[00171] Modalidade 165 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 65.

[00172] Modalidade 166 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 66 [00173] Modalidade 167 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 67.

[00174] Modalidade 168 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 68.

[00175] Modalidade 169 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 69.

[00176] Modalidade 170 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 70.

[00177] Modalidade 171 O método ou composição de acordo com

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22/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 71.

[00178] Modalidade 172 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 72.

[00179] Modalidade 173 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 73.

[00180] Modalidade 174 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 74.

[00181] Modalidade 175 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 75.

[00182] Modalidade 176 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 76.

[00183] Modalidade 177 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 77.

[00184] Modalidade 178 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 78.

[00185] Modalidade 179 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 79.

[00186] Modalidade 180 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 80.

[00187] Modalidade 181 O método ou composição de acordo com

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23/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 81.

[00188] Modalidade 182 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 82.

[00189] Modalidade 183 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 83 [00190] Modalidade 184 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 84.

[00191] Modalidade 185 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 85.

[00192] Modalidade 186 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 86.

[00193] Modalidade 187 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 87.

[00194] Modalidade 188 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 88.

[00195] Modalidade 189 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 89.

[00196] Modalidade 190 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 90.

[00197] Modalidade 191 O método ou composição de acordo com

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24/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 91.

[00198] Modalidade 192 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 92.

[00199] Modalidade 193 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 93.

[00200] Modalidade 194 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 94.

[00201] Modalidade 195 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 95.

[00202] Modalidade 196 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 96.

[00203] Modalidade 197 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 97.

[00204] Modalidade 198 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 98.

[00205] Modalidade 199 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 99.

[00206] Modalidade 200 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 100.

[00207] Modalidade 201 O método ou composição de acordo com

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25/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 101.

[00208] Modalidade 202 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 102.

[00209] Modalidade 203 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 103.

[00210] Modalidade 204 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 104.

[00211] Modalidade 205 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 105.

[00212] Modalidade 206 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 106.

[00213] Modalidade 207 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 107.

[00214] Modalidade 208 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 108.

[00215] Modalidade 209 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 109.

[00216] Modalidade 210 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 110.

[00217] Modalidade 211 O método ou composição de acordo com

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26/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 111.

[00218] Modalidade 212 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 112.

[00219] Modalidade 213 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 113.

[00220] Modalidade 214 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 114.

[00221] Modalidade 215 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 115.

[00222] Modalidade 216 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 116.

[00223] Modalidade 217 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 117.

[00224] Modalidade 218 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 118.

[00225] Modalidade 219 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 119.

[00226] Modalidade 220 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 120.

[00227] Modalidade 221 O método ou composição de acordo com

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27/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 121.

[00228] Modalidade 222 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 122.

[00229] Modalidade 223 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 123.

[00230] Modalidade 224 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 124.

[00231] Modalidade 225 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 125.

[00232] Modalidade 226 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 126.

[00233] Modalidade 227 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 127.

[00234] Modalidade 228 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 128.

[00235] Modalidade 229 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 129.

[00236] Modalidade 230 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, compreendendo ainda a sequência de SEQ ID NO: 140 ou 141.

[00237] Modalidade 231 O método ou composição, de acordo com a

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28/156 modalidade 230, que compreende o padrão de modificação de SEQ ID NO: 130.

[00238] Modalidade 232 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência é selecionada de SEQ ID NOs: 131-139.

[00239] Modalidade 233 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 -139 é SEQ ID NO: 131.

[00240] Modalidade 234 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 132.

[00241] Modalidade 235 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 133.

[00242] Modalidade 236 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 134.

[00243] Modalidade 237 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 135.

[00244] Modalidade 238 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 136.

[00245] Modalidade 239 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 137.

[00246] Modalidade 240 O método ou composição de acordo com qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 138.

[00247] Modalidade 241 O método ou composição de acordo com

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29/156 qualquer uma das modalidades 1 a 104, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131-139 é SEQ ID NO: 139.

[00248] Modalidade 242 O método ou composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 232-241, em que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 compreende as modificações mostradas para respectiva sequência na Tabela 2.

[00249] Modalidade 243 Uso de uma composição ou formulação de acordo com qualquer uma das modalidades 5 a 241, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento de um sujeito humano tendo AATD.

LEGENDAS DAS FIGURAS [00250] A FIGURA 1 mostra um esquema do cromossoma 14 com as regiões do gene SERPINA1 que são alvos das sequências guia fornecidas na Tabela 7.

[00251] A FIGURA 2 mostra a edição percentual (% de edição) de AAT e os níveis de AAT segregada após a administração das sequências guia fornecidas no eixo x. CTG = CelITiter-Glo.

[00252] A FIGURA 3 mostra a análise alvo de certos RNAs guia direcionados a SERPINA1. No gráfico, os triângulos representam a identificação do local de corte no alvo, enquanto os círculos representam a identificação de potenciais locais fora do alvo.

[00253] A FIGURA 4 mostra a análise de western blot de guias alvos de AAT em células HUH7.

[00254] As FIGURAS 5A-5C mostram dados de ELISA para CR003208 e guia de controle CR001263 mostrando a redução percentual na secreção de AAT em células HUH7 (5A), análise de Western blot (WB) de redução percentual em AAT em células HUH7 (5B) e análise fora do alvo (5C). Na FIGURA 5C, um único local fora do alvo potencial foi identificado no gene SERPINA2 relacionado, como denotado pela seta (ver também, FIGURA 3). As sequências guia

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30/156 humanas e a sequência complementar à sequência alvo correspondente no macaco cinomolgo são ambas CR003208 (SEQ ID No: 107). Observe que as posições dos cromossomos da sequência alvo complementares à sequência guia humana estão listadas na Tabela 1.

[00255] As FIGURAS 6A-6C mostram dados de ELISA para CR001413 e guia de controle CR001262 mostrando a redução percentual na secreção de AAT em células HUH7 (6A), análise de Western blot (WB) de redução percentual em AAT em células HUH7 (6B) e análise fora do alvo (6C). As sequências guia humanas e a sequência complementar à sequência alvo correspondente no macaco cinomolgo são CR001413 (SEQ ID No: 51), e GUUGAGGAACAGGCCGUUGC (SEQ ID No: 271), respectivamente. Observe que as posições dos cromossomos da sequência alvo complementares à sequência guia humana estão listadas na Tabela 1.

[00256] As FIGURAS 7A-7C mostram dados de ELISA para CR001400 e guia de controle CR001261 mostrando a redução percentual na secreção de AAT em células HUH7 (7 A), análise de Western blot (WB) de redução percentual em AAT em células HUH7 (7B) e análise fora do alvo (7C). As sequências guia humanas e a sequência complementar à sequência alvo correspondente no macaco cinomolgo são SEQ ID No: 38, e ACUCACAGUGAAAUCCUGGA (SEQ ID No: 272), respectivamente. Observe que as posições dos cromossomos da sequência alvo complementares à sequência guia humana estão listadas na Tabela 1.

[00257] As FIGURAS 8A-8C mostram dados de ELISA para CR001427 e guia de controle CR001262 mostrando a redução percentual na secreção de AAT em células HUH7 (8A), análise de Western blot (WB) de redução percentual em AAT em células HUH7 (8B) e análise fora do alvo (8C). As sequências guia humanas e a

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31/156 sequência complementar à sequência alvo correspondente no macaco cinomolgo são ambas CR001427 (SEQ ID No: 65). Observe que as posições dos cromossomos da sequência alvo complementares à sequência guia humana estão listadas na Tabela 1.

[00258] As FIGURAS 9A-9C mostram dados de ELISA para CR001386 e guia de controle CR001261 mostrando a redução percentual na secreção de AAT em células HUH7 (9 A), análise de Western blot (WB) de redução percentual em AAT em células HUH7 (9B) e análise fora do alvo (9C). As sequências guia humanas e a sequência complementar à sequência alvo correspondente no macaco cinomolgo são CR001386 (SEQ ID No: 24), e GAAGCCGAACUCAGCCAGGC (SEQ ID No: 273), respectivamente. Observe que as posições dos cromossomos da sequência alvo complementares à sequência guia humana estão listadas na Tabela 1. [00259] As FIGURAS 10A-10C mostram dados de ELISA para CR001404 e guia de controle CR001261 mostrando a redução percentual na secreção de AAT em células HUH7 (10A), análise de Western blot (WB) de redução percentual em AAT em células HUH7 (10B) e análise fora do alvo (10C). Na FIGURA 10C, um único local fora do alvo foi identificado, como indicado pela seta (ver também FIGURA 3). As sequências guia humanas e a sequência complementar à sequência alvo correspondente no macaco cinomolgo são CR001404 (SEQ ID No: 42), e CAACGUCACGGAGAUUCCGG (SEQ ID No: 274), respectivamente. Observe que as posições dos cromossomos da sequência alvo complementares à sequência guia humana estão listadas na Tabela 1.

[00260] A FIGURA 11 mostra a edição percentual de AAT em células HepG2 para várias guias a várias concentrações em uma curva de resposta à dose (DRC’).

[00261 ] A FIGURA 12 mostra a edição percentual de AAT em células

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32/156 primárias de hepatócitos humanos (ΡΗΉ) para vários guias a várias concentrações em uma curva de resposta à dose (DRC’).

[00262] As FIGURAS 13A-C mostram os resultados de um experimento in vivo em camundongos transgênicos contendo cópias da variante PiZ humana de SERPINA1. A FIGURA 13A mostra uma edição robusta da variante PiZ de SERPINA1 em cada grupo, sem edição detectada no controle de veículo (TSS). A FIGURA 13B mostra dados de ELISA deste mesmo experimento, enquanto a FIGURA 13C mostra dados de Western Blot deste mesmo experimento.

DESCRIÇÃO DETALHADA [00263] São fornecidas na presente invenção composições de RNA guia úteis nos sistemas CRISPR/Cas9 para editar o gene SERPINA1. Os RNAs guia, em formatos de RNA guia simples ou duplo, com agentes de ligação de DNA guiados por RNA, por exemplo, agente de ligação de DNA guiado por RNA que codifica Cas9 ou mRNA, por exemplo, Cas9 que codifica mRNA, podem ser administrados a sujeitos com sequências de gene SERPINA1 do tipo não selvagem, como, por exemplo, sujeitos com deficiência de alfa-1 antitripsina (AATD” ou A1AD’). As sequências guia que têm como alvo o gene SERPINA1 são mostradas na Tabela 1 nas SEQ ID Nos: 5-129. Os guias de controle usados nos experimentos descritos na presente invenção são mostrados nas SEQ ID Nos: 1-4.

Tabela 1: Nomenclatura de sequência guia de controle e alvo de SERPINA1, coordenadas cromossômicas e sequência.

SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
1	CR001261	Controle 1	Chr1:55039269- 55039291	GCCAGACUCCAAGUUCUG CC
2	CR001262	Controle 2	Chrl :55039155- 55039177	UAAGGCCAGUGGAAAGAAU u

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
3	CR001263	Controle 3	Chrl :55039180- 55039202	GGCAGCGAGGAGUCCACA GU
4	CR001264	Controle 4	Chrl :55039149- 55039171	UCUUUCCACUGGCCUUAAC C
5	CR001367	Éxon 2	Chrl4:94383211- 94383233	CAAUGCCGUCUUCUGUCU CG
6	CR001368	Éxon 2	Chrl4:94383210- 94383232	AAUGCCGUCUUCUGUCUC GU
7	CR001369	Éxon 2	Chrl4:94383209- 94383231	AUGCCGUCUUCUGUCUCG UG
8	CR001370	Éxon 2	Chr14:94383206- 94383228	AUGCCCCACGAGACAGAAG A
9	CR001371	Éxon 2	Chrl4:94383195- 94383217	CUCGUGGGGCAUCCUCCU GC
10	CR001372	Éxon 2	Chrl4:94383152- 94383174	GGAUCCUCAGCCAGGGAG AC
11	CR001373	Éxon 2	Chrl4:94383146- 94383168	UCCCUGGCUGAGGAUCCC CA
12	CR001374	Éxon 2	Chrl4:94383145- 94383167	UCCCUGGGGAUCCUCAGC CA
13	CR001375	Éxon 2	Chrl 4:94383144- 94383166	CUCCCUGGGGAUCCUCAG CC
14	CR001376	Éxon 2	Chrl4:94383115- 94383137	GUGGGAUGUAUCUGUCUU CU
15	CR001377	Éxon 2	Chrl4:94383114- 94383136	GGUGGGAUGUAUCUGUCU UC
16	CR001378	Éxon 2	Chrl4:94383105- 94383127	AGAUACAUCCCACCAUGAU C
17	CR001379	Éxon 2	Chrl4:94383097- 94383119	UGGGUGAUCCUGAUCAUG GU
18	CR001380	Éxon 2	Chrl4:94383096- 94383118	UUGGGUGAUCCUGAUCAU GG

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
19	CR001381	Éxon 2	Chrl4:94383093- 94383115	AGGUUGGGUGAUCCUGAU CA

SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
20	CR00I382	Éxon 2	Chrl4:94383078- 94383100	GGGUGAUCUUGUUGAAGG UU
21	CR001383	Éxon 2	Chrl4:94383077- 94383099	GGGGUGAUCUUGUUGAAG GU
22	CR001384	Éxon 2	Chrl4:94383069- 94383091	CAACAAGAUCACCCCCAAC C
23	CR001385	Éxon 2	Chrl4:94383057- 94383079	AGGCGAACUCAGCCAGGU UG
24	CR001386	Éxon 2	Chrl4:94383055- 94383077	GAAGGCGAACUCAGCCAG GU
25	CR001387	Éxon 2	Chrl4:94383051- 94383073	GGCUGAAGGCGAACUCAG CC
26	CR001388	Éxon 2	Chrl4:94383037- 94383059	CAGCUGGCGGUAUAGGCU GA
27	CR001389	Éxon 2	Chrl4:94383036- 94383058	CUUCAGCCUAUACCGCCAG C
28	CR001390	Éxon 2	Chrl4:94383030- 94383052	GGUGUGCCAGCUGGCGGU AU
29	CR001391	Éxon 2	Chrl4:94383021- 94383043	UGUUGGACUGGUGUGCCA GC
30	CR001392	Éxon 2	Chrl4:94383009- 94383031	AGAUAUUGGUGCUGUUGG AC
31	CR001393	Éxon 2	Chrl4:94383004- 94383026	GAAGAAGAUAUUGGUGCU GU
32	CR001394	Éxon 2	Chr14:94382995- 94383017	CACUGGGGAGAAGAAGAUA U

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
33	CR001395	Éxon 2	Chrl4:94382980- 94383002	GGCUGUAGCGAUGCUCAC UG
34	CR001396	Éxon 2	Chrl4:94382979- 94383001	AGGCUGUAGCGAUGCUCA CU
35	CR001397	Éxon 2	Chrl4:94382978- 94383000	AAGGCUGUAGCGAUGCUC AC
36	CR001398	Éxon 2	Chrl4:94382928- 94382950	UGACACUCACGAUGAAAUC C
37	CR001399	Éxon 2	Chrl4:94382925- 94382947	CACUCACGAUGAAAUCCUG G
38	CR001400	Éxon 2	Chrl4:94382924- 94382946	ACUCACGAUGAAAUCCUGG A
39	CR001401	Éxon 2	Chrl4:94382910- 94382932	GGUUGAAAUUCAGGCCCU CC
40	CR001402	Éxon 2	Chrl4:94382904- 94382926	GGGCCUGAAUUUCAACCU CA
41	CR001403	Éxon 2	Chrl4:94382895- 94382917	UUUCAACCUCACGGAGAUU C
42	CR001404	Éxon 2	Chrl4:94382892- 94382914	CAACCUCACGGAGAUUCCG G

SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
43	CR00I405	Éxon 2	Chrl 4:94382889- 94382911	GAGCCUCCGGAAUCUCCG UG
44	CR00I406	Éxon 2	Chrl4:94382876- 94382898	CCGGAGGCUCAGAUCCAU GA
45	CR00I407	Éxon 2	Chrl4:94382850- 94382872	UGAGGGUACGGAGGAGUU CC
46	CR00I408	Éxon 2	Chrl 4:94382841- 94382863	CUGGCUGGUUGAGGGUAC GG

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
47	CR00I409	Éxon 2	Chrl4:94382833- 94382855	CUGGCUGUCUGGCUGGUU GA
48	CR00I410	Éxon 2	Chrl4:94382810- 94382832	CUCCAGCUGACCACCGGC AA
49	CR00I411	Éxon 2	Chrl4:94382808- 94382830	GGCCAUUGCCGGUGGUCA GC
50	CR001412	Éxon 2	Chrl4:94382800- 94382822	GAGGAACAGGCCAUUGCC GG
51	CR001413	Éxon 2	Chrl4:94382797- 94382819	GCUGAGGAACAGGCCAUU GC
52	CR001414	Éxon 2	Chrl4:94382793- 94382815	CAAUGGCCUGUUCCUCAG CG
53	CR001415	Éxon 2	Chrl4:94382792- 94382814	AAUGGCCUGUUCCUCAGC GA
54	CR001416	Éxon 2	Chrl4:94382787- 94382809	UCAGGCCCUCGCUGAGGA AC
55	CR001417	Éxon 2	Chr14:94382781- 94382803	CUAGCUUCAGGCCCUCGC UG
56	CR001418	Éxon 2	Chrl4:94382778- 94382800	CAGCGAGGGCCUGAAGCU AG
57	CR001419	Éxon 2	Chrl4:94382769- 94382791	AAAACUUAUCCACUAGCUU C
58	CR001420	Éxon 2	Chrl4:94382766- 94382788	GAAGCUAGUGGAUAAGUU UU
59	CR001421	Éxon 2	Chrl4:94382763- 94382785	GCUAGUGGAUAAGUUUUU GG
60	CR001422	Éxon 2	Chrl4:94382724- 94382746	UGACAGUGAAGGCUUCUG AG
61	CR001423	Éxon 2	Chrl4:94382716- 94382738	AAGCCUUCACUGUCAACUU C
62	CR001424	Éxon 2	Chrl4:94382715- 94382737	AGCCUUCACUGUCAACUUC G

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
63	CR001425	Éxon 2	Chrl4:94382713- 94382735	GUCCCCGAAGUUGACAGU GA
64	CR001426	Éxon 2	Chrl4:94382703- 94382725	CAACUUCGGGGACACCGAA G
65	CR001427	Éxon 2	Chrl4:94382689- 94382711	GAUCUGUUUCUUGGCCUC UU

SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
66	CR00I428	Éxon 2	Chrl4:94382680- 94382702	GUAAUCGUUGAUCUGUUU CU
67	CR00I429	Éxon 2	Chrl4:94382676- 94382698	GAAACAGAUCAACGAUUAC G
68	CR00I430	Éxon 2	Chrl 4:94382670- 94382692	GAUCAACGAUUACGUGGA GA
69	CR00I431	Éxon 2	Chrl4:94382669- 94382691	AUCAACGAUUACGUGGAGA A
70	CR00I432	Éxon 2	Chrl4:94382660- 94382682	UACGUGGAGAAGGGUACU CA
71	CR001433	Éxon 2	Chrl4:94382659- 94382681	ACGUGGAGAAGGGUACUC AA
72	CR00I434	Éxon 2	Chrl4:94382643- 94382665	UCAAGGGAAAAUUGUGGAU U
73	CR001435	Éxon 2	Chrl4:94382637- 94382659	GAAAAUUGUGGAUUUGGU CA
74	CR001436	Éxon 2	Chrl4:94382607- 94382629	CAGAGACACAG UUUUUGCU C
75	CR001437	Éxon 3	Chrl4:94381127- 94381149	UCCCCUCUCUCCAGGCAAA U
76	CR001438	Éxon 3	Chrl4:94381098- 94381120	CUCGGUGUCCUUGACUUC AA

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
77	CR001439	Éxon 3	Chrl4:94381097- 94381119	CUUUGAAGUCAAGGACACC G
78	CR001440	Éxon 3	Chr14:94381080- 94381102	CACGUGGAAGUCCUCUUC CU
79	CR001441	Éxon 3	Chrl4:94381079- 94381101	CGAGGAAGAGGACUUCCA CG
80	CR001442	Éxon 3	Chrl4:94381073- 94381095	AGAGGACUUCCACGUGGA CC
81	CR001443	Éxon 3	Chrl4:94381064- 94381086	CGGUGGUCACCUGGUCCA CG
82	CR001444	Éxon 3	Chrl4:94381058- 94381080	GGACCAGGUGACCACCGU GA
83	CR001445	Éxon 3	Chrl4:94381055- 94381077	GCACCUUCACGGUGGUCA CC
84	CR001446	Éxon 3	Chrl 4:94381047- 94381069	CAUCAUAGGCACCUUCACG G
85	CR001447	Éxon 3	Chrl4:94381036- 94381058	GUGCCUAUGAUGAAGCGU UU
86	CR001448	Éxon 3	Chrl4:94381033- 94381055	AUGCCUAAACGCUUCAUCA U
87	CR001449	Éxon 3	Chrl4:94381001- 94381023	UGGACAGCUUCUUACAGU GC
88	CR001450	Éxon 3	Chrl4:94380995- 94381017	CUGUAAGAAGCUGUCCAG CU
SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
89	CR00I451	Éxon 3	Chrl4:94380974- 94380996	GGUGCUGCUGAUGAAAUA CC
90	CR00I452	Éxon 3	Chrl4:94380973- 94380995	GUGCUGCUGAUGAAAUAC CU
91	CR001453	Éxon 3	Chrl 4:94380956-	AGAUGGCGGUGGCAUUGC

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
			94380978	CC
92	CR001454	Éxon 3	Chrl 4:94380945- 94380967	AGGCAGGAAGAAGAUGGC GG
93	CR001474	Éxon 5	Chrl4:94378611- 94378633	GGUCAGCACAGCCUUAUG CA
94	CR001475	Éxon 5	Chrl4:94378581- 94378603	AGAAAGGGACUGAAGCUG CU
95	CR00I476	Éxon 5	Chrl4:94378580- 94378602	GAAAGGGACUGAAGCUGC UG
96	CR001477	Éxon 5	Chrl4:94378565- 94378587	UGCUGGGGCCAUGUUUUU AG
97	CR001478	Éxon 5	Chrl4:94378557- 94378579	GGGUAUGGCCUCUAAAAAC A
98	CR001483	Éxon 5	Chrl4:94378526- 94378548	UGUUGAACUUGACCUCGG GG
99	CR001484	Éxon 5	Chrl4:94378521- 94378543	GGGUUUGUUGAACUUGAC CU
100	CR003190	Éxon 2	Chrl4:94383131- 94383153	UUCUGGGCAGCAUCUCCC UG
101	CR003191	Éxon 2	Chr14:94383129- 94383151	UCUUCUGGGCAGCAUCUC CC
102	CR003196	Éxon 2	Chrl4:94383024- 94383046	UGGACUGGUGUGCCAGCU GG
103	CR003204	Éxon 2	Chrl4:94382961- 94382983	AGCCUUUGCAAUGCUCUC CC
104	CR003205	Éxon 2	Chrl4:94382935- 94382957	UUCAUCGUGAGUGUCAGC CU
105	CR003206	Éxon 2	Chrl4:94382901- 94382923	UCUCCGUGAGGUUGAAAU UC
106	CR003207	Éxon 2	Chrl4:94382822- 94382844	GUCAGCUGGAGCUGGCUG UC

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 44/210

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
107	CR003208	Éxon 2	Chrl4:94382816- 94382838	AGCCAGCUCCAGCUGACCA C
108	CR003217	Éxon 3	Chrl4:94380942- 94380964	AUCAGGCAGGAAGAAGAUG G
109	CR003218	Éxon 3	Chrl4:94380938- 94380960	CAUCUUCUUCCUGCCUGA UG
110	CR003219	Éxon 3	Chrl4:94380937- 94380959	AUCUUCUUCCUGCCUGAU GA
111	CR003220	Éxon 3	Chrl4:94380881- 94380903	CGAUAUCAUCACCAAGUUC C

SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
112	CR003221	Éxon 4	Chrl4:94379554- 94379576	CAGAUCAUAGGUUCCAGUA A
113	CR003222	Éxon 4	Chrl4:94379507- 94379529	AUCACUAAGGUCUUCAGCA A
114	CR003223	Éxon 4	Chrl4:94379506- 94379528	UCACUAAGGUCUUCAGCAA U
115	CR003224	Éxon 4	Chrl4:94379505- 94379527	CACUAAGGUCUUCAGCAAU G
116	CR003225	Éxon 4	Chrl4:94379453- 94379475	CUCACCUUGGAGAGCUUCA G
117	CR003226	Éxon 4	Chrl 4:94379452- 94379474	UCUCACCUUGGAGAGCUUC A
118	CR003227	Éxon 4	Chrl4:94379451- 94379473	AUCUCACCUUGGAGAGCUU C
119	CR003235	Éxon 5	Chrl4:94378525- 94378547	UUGUUGAACUUGACCUCGG G
120	CR003236	Éxon 5	Chrl4:94378524- 94378546	UUUGUUGAACUUGACCUCG G

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 45/210

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SEQ ID No	ID de Guia	Descrição	Coordenadas Cromossômicas	Sequências Guia
121	CR003237	Éxon 5	Chrl4:94378523- 94378545	GUUUGUUGAACUUGACCUC G
122	CR003238	Éxon 5	Chrl4:94378522- 94378544	GGUUUGUUGAACUUGACCU C
123	CR003240	Éxon 5	Chrl4:94378501- 94378523	UCAAUCAUUAAGAAGACAA A
124	CR003241	Éxon 5	Chr14:94378500- 94378522	UUCAAUCAUUAAGAAGACA A
125	CR003242	Éxon 5	Chrl4:94378472- 94378494	UACCAAGUCUCCCCUCUUC A
126	CR003243	Éxon 5	Chrl4:94378471- 94378493	ACCAAGUCUCCCCUCUUCA U
127	CR003244	Éxon 5	Chrl4:94378463- 94378485	UCCCCUCUUCAUGGGAAAA G
128	CR003245	Éxon 5	Chrl4:94378461- 94378483	CACCACUUUUCCCAUGAAG A
129	CR003246	Éxon 5	Chrl4:94378460- 94378482	UCACCACUUUUCCCAUGAA G

[00264] Cada uma das Sequências Guia acima pode ainda compreender nucleotídeos adicionais para formar um crRNA, por exemplo, com a seguinte sequência de nucleotídeos exemplificativa seguindo a Sequência Guia em sua extremidade 3': GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 140). No caso de um sgRNA, as Sequências guia acima podem ainda compreender nucleotídeos adicionais para formar um sgRNA, por exemplo, com a seguinte sequência de nucleotídeos exemplificativa após a extremidade 3 da Sequência guia:

GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID

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NO: 141) na orientação de 5 para 3'.

[00265] Em algumas modalidades, o sgRNA é modificado. Em algumas modalidades, o sgRNA modificado compreende qualquer uma das sequências citadas na Tabela 2 (SEQ ID Nos: 130-139, 408 e 410421). Na Tabela 2, N”pode ser qualquer nucleotídeo natural ou não natural. Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 130 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO: 130 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 130 permanece.

[00266] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 410 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

410 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 410 permanece.

[00267] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 411 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

411 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 411 permanece.

[00268] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 412 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

412 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 412 permanece.

[00269] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 413 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

413 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 413 permanece.

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43/156 [00270] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 414 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

414 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 414 permanece.

[00271] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 415 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

415 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 415 permanece.

[00272] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 416 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

416 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 416 permanece.

[00273] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 417 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

417 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 417 permanece.

[00274] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 418 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

418 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 418 permanece.

[00275] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 419 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

419 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 419 permanece.

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44/156 [00276] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 420 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

420 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 420 permanece.

[00277] Em algumas modalidades, as composições compreendendo a SEQ ID NO: 421 estão englobadas em que cada N na SEQ ID NO:

421 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, em que o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 421 permanece.

Tabela 2: sgRNAs alvos de SERPINA1

SEQ ID	ID de sgRNA	Descrição	Sequência
130	Apenas Mod-N	Sequência modificada sgRNA	mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmArnCmCmGmAmGmUmCmGrnGmUmG mCmU*mU*mU*mU
408	Apenas mod	sequência modificada sgRNA	GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAG UUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
131	G000407	sequência modificada sgRNA	mA*mG*mC*CAGCUCCAGCUGACCACGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCrnU*mU*mU*mU

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SEQ ID	ID de sg:RNA	Descrição	Sequência
132	G000408	Sequência modificada por sgRNA	mG*mC*mU*GAGGAACAGGCCAUUGCGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmU*mU*mU*mU
133	G000409	sequência modificada sgRNA	mA*mC*mU*CACGAUGAAAUCCUGGAGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmU*mU*mU*mU
134	G000410	sequência modificada sgRNA	mU*mU*mG*GGUGAUCCUGAUCAUGGGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmA mGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUm GmCmU*mU*mU*mU
135	G000411	Sequência modificada sgRNA	mU*mG*mG*GUGAUCCUGAUCAUGGUGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmA mGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUm GmCmU*mU*mU*mU
136	G000412	Sequência modificada sgRNA	mG*mA*mU*CUGUUUCUUGGCCUCUUGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmU*mU*mU*mU
137	G000413	sequência modificada sgRNA	mG*mA*mA*GGCGAACUCAGCCAGGUGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmU*mU*mU*mU
138	G000414	Sequência modificada sgRNA	mC*mA*mA*CCUCACGGAGAUUCCGGGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmU*mU*mU*mU

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46/156

SEQ ID	ID de sg:RNA	Descrição	Sequência
139	G000415	Sequência modificada sgRNA	mU*mG*mU*UGGACUGGUGUGCCAGCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmA mGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUm GmCmU*mU*mU*mU
410	G000537/G 211-33 (Apenas mod)	extremidade 5' 3xOMePS	mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmG mCmUmUmUmU
411	G000538/G 211-34 (Apenas mod)	extremidade 3' 3xOMePS	mNmNmNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmC mUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmG mUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGm CmU*mU*mU*mU
412	G000539/G 211-35 (mod apenas)	5xOMePS	mN*mN*mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGm UmG*mC*mU*mU*mU*mU
413	G000541/G 211-37 (Apenas mod)	3xOMePS+2 PS	mN*mN*mN*N*N*NNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmA mGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUm G*mC*mU*mU*mU*mU
414	G000542/G 211-38 (mod apenas)	3xOMePS+7 PS	mN*mN*mN*N*N*N*N*N*N*N*NNNNNNNNNNGUUUUAG AmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU*mC*mG*m G*mU*mG*mC*mU*mU*mU*mU

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SEQ ID	ID de sg:RNA	Descrição	Sequência
415	G000543/ G 211-39 (Apenas mod)	invd abásico	(invd) NNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmU mAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGG CUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmUmUmUmU (invd)
416	G000544/ G 211-40 (Apenas mod)	invd abásico + 3xOMePS	(invd)mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNGUUUUA GAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAm GmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(invd)
417	G000564/ G 211-42 (Apenas mod)	3xMOE-PS	moeN*moeN*moeN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUU UUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUm UmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG mAmGmUmCmGmGmUmGmCmoeU*moeU*moeU* mU
418	G000545/ G 211-43 (Apenas mod)	US loopPS	mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA mGmCmUmA*mG*mA*mA*mA*mUmAmGmCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmG mAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAm GmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
419	G000546/ G 211-44 (Apenas mod)	H1 loopPS	mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU*mG*m A*mA*mA*mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA mGmUmCmGmGmUmGmCmUWmlTmU
420	G000547/ G 211-45 (Apenas mod)	H2loopPS	mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG*mA*mG *mU*mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU

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SEQ ID	ID de sg:RNA	Descrição	Sequência
421	G000548/ G 211-46 (Apenas mod)	todos os loops PS	mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGA mGmCmUmA*mG*mA*mA*mA*mUmAmGmCAAGUU AAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU*m G*mA*mA*mA*mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG *mA*mG*mU*mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU

* = Ligação de PS; 'm' = nucleotideo 2'-0-Me [00278] Salvo indicação em contrário, os seguintes termos e frases, como usados aqui, pretendem ter os seguintes significados:

[00279] Polinucleotídeo”e ácido nucleico”são usados na presente invenção para se referir um composto multimérico compreendendo nucleosídeos ou análogos de nucleosídeos que têm bases heterocíclicas nitrogenadas ou análogos de bases ligados entre si ao longo de uma cadeia principal, incluindo RNA convencional, DNA, DNARNA misto e polímeros que são análogos dos mesmos. Uma cadeia principal”de ácido nucleico pode ser composta de uma variedade de ligações, incluindo uma ou mais ligações de açúcar-fosfodiéster, ligações de ácido nucleico peptídico (ácidos nucleicos peptídicos”ou PNA; PCT n° WO 95/32305), ligações de fosforotioato, ligações de metilfosfonato ou combinações dos mesmos. As porções de açúcar de um ácido nucleico podem ser ribose, desoxirribose ou compostos semelhantes com substituições, por exemplo, substituições 2 metóxi ou 2 haleto. As bases nitrogenadas podem ser bases convencionais (A, G, C, T, U), seus análogos (por exemplo, uridinas modificadas como 5metoxiuridina, pseudouridina ou N1-metilpseudouridina, ou outras), inosina; derivados de purinas ou pirimidinas (por exemplo, N4-metil desoxiguanosina, deaza- ou aza-purinas, deaza- ou aza-pirimidinas, bases de pirimidina com grupos substituintes na posição 5 ou 6 (por exemplo, 5-metilcitosina), bases de purina com um substituinte nas posições 2, 6 ou 8, 2-amino-6-metilaminopurina, 6-metilguanina, 4-tio

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49/156 pirimidinas, 4-amino-pirimidinas, 4-dimetil-hidrazina-pirimidinas e 4alquil-pirimidinas; Patente US 5.378.825 e PCT WO 93/13121). Para uma discussão geral, veja Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11°ed., 1992). Os ácidos nuclei cos podem incluir um ou mais resíduos 'básicos” em que o cadeia principal não inclui base nitrogenada para a(s) posição(s) do polímero (Patente US n°. 5.585.481). Um ácido nucleico pode compreender apenas açúcares, bases e ligações convencionais de RNA ou DNA, ou pode incluir tanto componentes convencionais como substituições (por exemplo, bases convencionais com ligações 2 metóxi, ou polímeros contendo ambas as bases convencionais e um ou mais análogos de base). O ácido nucleico inclui ácido nucleico bloqueado”(LNA), um análogo contendo um ou mais monômeros de nucleotídeo LNA com uma unidade de furanose bicíclica bloqueada em uma conformação de açúcar mimetizadora de RNA, que aumenta a afinidade de hibridação para sequências complementares de RNA e DNA (Vester e Wengel, 2004, Biochemistry 43(42): 13233-41). O RNA e o DNA possuem partes de açúcar diferentes e podem diferir pela presença de uracila ou análogos dos mesmos no RNA e timina ou análogos dos mesmos no DNA.

[00280] 'RNA Guia”, gRNA”, e simplesmente guia são usados aqui de forma intercambiável para se referir a um crRNA (também conhecido como CRISPR RNA), ou a combinação de um crRNA e um trRNA (também conhecido como tracrRNA). O crRNA e o trRNA podem estar associados como uma única molécula de RNA (RNA guia único, sgRNA) ou em duas moléculas de RNA separadas (RNA guia duplo, dgRNA). 'RNA guia”ou gRNA”ou guia”se refere a cada tipo. O trRNA pode ser uma sequência de ocorrência natural ou uma sequência de trRNA com modificações ou variações em comparação com sequências de ocorrência natural.

[00281] Como usado na presente invenção, uma sequência guia”se

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50/156 refere a uma sequência dentro de um RNA guia que é complementar a uma sequência alvo e funciona para dirigir um RNA guia a uma sequência alvo para ligação ou modificação (por exemplo, divagem) por um agente de ligação de DNA guiado por RNA. Uma sequência guia” também pode ser referida como sequência alvo” ou sequência espaçadora”. Uma sequência guia pode ter 20 pares de bases de comprimento, por exemplo, no caso de um RNA guia para um Streptococcus pyogenes Cas9 (isto é, Spy Cas9) e homólogos/ortólogos Cas9 relacionados. Sequências mais curtas ou mais longas podem também ser usadas como guias, por exemplo, 15, 16, 17, 18, 19, 21,22, 23, 24 ou 25 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência alvo está em um gene ou em um cromossoma, por exemplo, e é complementar à sequência guia. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade ou identidade entre uma sequência guia e a sua sequência alvo correspondente pode ser cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a sequência guia e a região alvo podem ser 100% complementares ou idênticas. Em outras modalidades, a sequência guia e a região alvo podem conter pelo menos um desemparelhamento. Por exemplo, a sequência guia e a sequência alvo podem conter 1,2, 3 ou 4 desemparelhamentos, em que o comprimento total da sequência alvo é de pelo menos 17, 18, 19, 20 ou mais pares de bases. Em algumas modalidades, a sequência guia e a região alvo podem conter 1 a 4 desemparelhamentos em que a sequência guia compreende pelo menos 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência guia e a região alvo podem conter 1, 2, 3 ou 4 desemparelhamentos em que a sequência guia compreende 20 nucleotídeos.

[00282] As sequências alvos para as proteínas Cas incluem ambas as fitas positiva e negativa do DNA genômico (isto é, a sequência dada

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51/156 e o complemento reverso da sequência), já que um substrato de ácido nucleico para uma proteína Cas é um ácido nucleico de fita dupla. Por conseguinte, quando se diz que uma sequência guia é complementar a uma sequência alvo”, deve-se entender que a sequência guia pode dirigir um RNA guia para se ligar ao complemento reverso de uma sequência alvo. Assim, em algumas modalidades, quando a sequência guia se liga ao complemento reverso de uma sequência alvo, a sequência guia é idêntica a certos nucleotídeos da sequência alvo (por exemplo, a sequência alvo não incluindo o PAM), exceto pela substituição de U por T na sequência guia.

[00283] Como usado na presente invenção, um agente de ligação de DNA guiado por RNA” significa um polipeptídeo ou complexo de polipeptídeos tendo atividade de ligação de RNA e DNA, ou uma subunidade de ligação a DNA desse complexo, em que a atividade de ligação ao DNA é específica de sequência e depende da sequência de RNA. Os agentes de ligação ao DNA guiado por RNA incluem proteínas Cas (por exemplo, proteínas Cas9), tais como nucleases de Cas (por exemplo, nucleases de Cas9). Cas nuclease”, também chamada de proteína Cas”, como usado na presente invenção, engloba clivagens de Cas, Cas nickases, e suas formas inativadas (agentes de ligação de dCas DNA’). As proteínas Cas abrangem ainda um complexo Csm ou Cmr de um sistema CRISPR do tipo III, a subunidade CaslO, Csml ou Cmr2 do mesmo, um complexo em Cascata de um sistema CRISPR de tipo I, a subunidade Cas3 do mesmo e nucleases Cas de Classe 2. Como usado na presente invenção, uma nuclease de Cas de Classe 2” é um polipeptídeo de fita simples com atividade de ligação ao DNA guiado por RNA, tal como uma nuclease de Cas9 ou uma nuclease de Cpf 1. As nucleases Cas de Classe 2 incluem clivases/nickases de Cas de Classe 2 (por exemplo, variantes H840A, D10A ou N863A), que também têm clivase ou atividade de nickase de DNA guiada por RNA e

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52/156 agentes de ligação de DNA de dCas de Classe 2, em que a atividade de clivase/nickase é inativada. As nucleases de Cas de Classe 2 incluem, por exemplo, Cas9, Cpfl, C2cl, C2c2, C2c3, HF Cas9 (por exemplo, Cas9, Cpfl, C2cl, C2c2, C2c3, HF Cas9 (por exemplo, variantes N497A/R661A/Q695A/Q926A ), HypaCas9 (por exemplo, variantes N692A/M694A/Q695A/H698A), eSPCas9(1.0) (por exemplo, variantes K810A/K1003A/R1060A), e eSPCas9(l.l) (por exemplo, variantes K848A/K1003A/R1060A) e modificações dos mesmos. A proteína Cpfl, Zetsche et al., Cell, 163:1-13 (2015), é homóloga a Cas9 e contém um domínio de nuclease semelhante a RuvC. As sequências de Cpfl de Zetsche et al. são incorporadas por referência na sua totalidade. Veja, por exemplo, Zetsche et al. nas Tabelas S1 e S3. Cas9” engloba o Spy Cas9, as variantes de Cas9 listadas aqui e equivalentes dos mesmos. Veja, por exemplo, Makarova et al , Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).

[00284] Como usado na presente invenção, uma primeira sequência é considerada como compreendendo uma sequência com pelo menos X% de identidade com”uma segunda sequência se um alinhamento da primeira sequência com a segunda sequência mostrar que X% ou mais das posições da segunda sequência em sua totalidade são correspondentes à primeira sequência. Por exemplo, a sequência AAGA compreende uma sequência com 100% de identidade com a sequência AAG porque um alinhamento daria 100% de identidade na medida em que existem correspondências para todas as três posições da segunda sequência. As diferenças entre RNA e DNA (geralmente a troca de uridina por timidina ou vice-versa) e a presença de análogos nucleosídeos como uridinas modificadas não contribuem para diferenças na identidade ou complementaridade entre os polinucleotídeos, já que que os nucleotídeos relevantes (como a

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53/156 timidina, uridina, ou uridina modificada) têm o mesmo complemento (por exemplo, adenosina para todas dentre a timidina, uridina ou uridina modificada; outro exemplo é a citosina e a 5-metilcitosina, ambas com guanosina ou guanosina modificada como complemento). Assim, por exemplo, a sequência 5'-AXG em que X é qualquer uridina modificada, tal como pseudouridina, N1-metil pseudouridina ou 5-metóxi-uridina, é considerada 100% idêntica à AUG em que ambas são perfeitamente complementares à mesma sequência (5'-CAU). Algoritmos de alinhamento exemplificativos são os algoritmos de Smith-Waterman e Needleman-Wunsch, que são bem conhecidos na técnica. Um versado na técnica irá compreender qual escolha de conFigurações de algoritmo e parâmetro são apropriadas para um dado par de sequências a serem alinhadas; para sequências de comprimento geralmente semelhante e identidade esperada > 50% para aminoácidos ou > 75% para nucleotídeos, o algoritmo Needleman-Wunsch com conFigurações padrões da interface de algoritmo de Needleman-Wunsch fornecido por EBI no servidor www.ebi.ac.uk web é geralmente apropriado.

[00285] O mRNA”é usado na presente invenção para se referir a um polinucleotídeo que não é DNA e compreende uma estrutura de leitura aberta que pode ser traduzida em um polipeptídeo (isto é, pode servir como um substrato para a tradução de um tRNA acilado por amino e ribossomo). O mRNA pode compreender uma cadeia principal de açúcar-fosfato incluindo resíduos de ribose ou análogos dos mesmos, por exemplo, resíduos 2'-metóxi ribose. Em algumas modalidades, os açúcares de uma cadeia principal de açúcar-fosfato de mRNA consistem essencialmente em resíduos de ribose, resíduos de 2'-metóxi ribose ou uma combinação dos mesmos. Em geral, os mRNA não contêm uma quantidade substancial de resíduos de timidina (por exemplo, 0 resíduos ou menos de 30, 20, 10, 5, 4, 3 ou 2 resíduos de timidina; ou menos de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%,

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1%, 0,5%, 0,2%, ou 0,1% de teor de timidina). Um mRNA pode conter uridinas modificadas em algumas ou em todas as suas posições de uridina.

[00286] Como usado na presente invenção, AAT” ou AlAT” se refere a alfa-1 antitripsina, que é o produto gênico do gene SERPINA1. [00287] Como usado na presente invenção, AATD”ou AIAD”se refere a deficiência de alfa-1 antitripsina. AATD compreende doenças e distúrbios causados por uma variedade de mutações genéticas diferentes em SERPINA1. AATD pode se referir a uma doença em que os níveis diminuídos de AAT são expressos, AAT não é expressa, ou uma AAT mutante ou não funcional é expressa.

[00288] As sequências guia úteis nas composições e métodos de RNA guia descritos na presente invenção são mostradas na Tabela 1.

[00289] Como usado na presente invenção, 'Indels” se refere a mutações de inserção/deleção consistindo em um número de nucleotídeos que são inseridos ou deletados no local das rupturas de fita dupla (DSBs) no ácido nucleico.

[00290] Como usado na presente invenção, 'knockdown”se refere a uma diminuição na expressão de um produto gênico particular (por exemplo, proteína, mRNA, ou ambos). O knockdown de uma proteína pode ser medido por detecção de proteína segregada por tecido ou por população de células (por exemplo, em meio de soro ou células) ou por detecção da quantidade celular total da proteína de um tecido ou população celular de interesse. Os métodos para medir o knockdown de mRNA são conhecidos e incluem a sequenciamento de mRNA isolado de um tecido ou população celular de interesse. Em algumas modalidades, o 'knockdown” pode se referir a alguma perda de expressão de um produto de gene particular, por exemplo, uma diminuição na quantidade de mRNA transcrito ou uma diminuição na quantidade de proteína expressa ou segregada por uma população de

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55/156 células (incluindo populações in vivo como as encontradas nos tecidos). [00291] Como usado na presente invenção, 'knockout” se refere a uma perda de expressão de uma proteína particular em uma célula. O Knockout pode ser medido detectando a quantidade de secreção de proteína de um tecido ou uma população de células (por exemplo, no meio sérico ou celular) ou detectando a quantidade celular total de uma proteína em um tecido ou uma população de células. Em algumas modalidades, os métodos da invenção fazem o 'knockout”de AAT em uma ou mais células (por exemplo, em uma população de células, incluindo populações in vivo, tais como os encontrados em tecidos). Em algumas modalidades, um knockout não é a formação de proteína AAT mutante, por exemplo, criada por indels, mas sim a perda completa da expressão da proteína AAT em uma célula.

[00292] Como usado na presente invenção, AAT mutante”se refere a um produto de gene de SERPINA1 (isto, a proteína de AAT) tendo uma alteração na sequência de aminoácidos de AAT em comparação com a sequência de aminoácidos do tipo selvagem de SERPINA1 (NCBI Gene ID: 5265; Ensembl: Ensembl :ENSG00000197249).

[00293] Como usado na presente invenção, SERPINA1 mutante”ou alelo de SERPINA 1 mutante”se refere a uma sequência de SERPINA 1 tendo uma alteração na sequência de nucleotídeos de SERPINA1 comparada com a sequência do tipo selvagem (NCBI Gene ID: 5265; Ensembl: Ensembl :ENSG00000197249).

[00294] Como usado na presente invenção, ribonucleoproteína” (RNP) ou complexo de RNP”se refere a um RNA guia juntamente com um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o RNA guia orienta um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas9, a uma sequência alvo, e o RNA guia se hibridiza com, e um agente de ligação de DNA guiado por RNA diva, a sequência alvo.

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56/156 [00295] Como usado na presente invenção, uma sequência alvo”se refere a uma sequência de ácido nucleico em um gene alvo que tem complementaridade com a sequência guia do gRNA. A interação da sequência alvo e da sequência guia dirige um agente de ligação de DNA guiado por RNA para se ligar e potencialmente cortar ou clivar (dependendo da atividade do agente), dentro da sequência alvo.

[00296] Como usado na presente invenção, tratamento”se refere a qualquer administração ou aplicação de um terapêutico para doença ou distúrbio em um sujeito, e inclui inibição da doença, impedindo seu desenvolvimento, aliviando um ou mais sintomas da doença, curando a doença ou prevenindo a recorrência de um ou mais sintomas da doença. Por exemplo, o tratamento de AATD pode compreender aliviar os sintomas de AATD.

[00297] Como usado na presente invenção, o 'Z mutante”, forma Z mutante”, 'Z variante”, PiZ variante”, ou a forma ZZ”deAAT se referem a uma mutação na sequência do gene SERPINA1 que leva a uma mutação missense de ácido glutâmico a lisina (mutação E342K) na sequência de aminoácidos de AAT.

[00298] O termo cerca de”ou aproximadamente”significa um erro aceitável para um valor particular, conforme determinado por um versado na técnica, que depende em parte de como o valor é medido ou determinado.

I. Composições

A. RNA guia (gRNAs) [00299] Em algumas modalidades, a invenção compreende uma composição compreendendo um ou mais RNAs guia (gRNA) compreendendo sequências guia que dirigem um agente de ligação de DNA guiado por RNA (por exemplo, Cas9) para uma sequência de DNA alvo em SERPINA1. O gRNA pode compreender uma ou mais das sequências guia mostradas na Tabela 1. As sequências guia da Tabela

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57/156 podem ainda compreender um crRNA e/ou um trRNA. Em cada composição e modalidade do método descrito na presente invenção, o crRNA e o trRNA podem estar associados a um RNA (sgRNA), ou podem estar em RNAs separados (dgRNA).

[00300] Em cada uma das modalidades da composição e método descritos na presente invenção, o RNA guia pode compreender duas moléculas de RNA como um RNA guia duplo”ou dgRNA”. O dgRNA compreende uma primeira molécula de RNA (por exemplo, um crRNA) compreendendo uma sequência guia compreendendo qualquer uma das sequências guia descritas na Tabela 1, e uma segunda molécula de RNA compreendendo um trRNA. A primeira e segunda moléculas de RNA não estão ligadas covalentemente, mas podem formar um duplexo de RNA através do empareihamento de bases entre as porções do crRNA e o trRNA.

[00301] Em cada uma das modalidades da composição e método descritos na presente invenção, o RNA guia pode compreender uma única molécula de RNA como um 'RNA guia único” ou dgRNA”. O sgRNA compreende um crRNA (ou uma porção do mesmo) compreendendo qualquer uma das sequências guia descritas na Tabela 1, ligadas covalentemente a um trRNA (ou uma porção do mesmo). Em algumas modalidades, o crRNA e o trRNA são ligados covalentemente através de um ligante. Em algumas modalidades, o sgRNA forma uma estrutura de haste-alça através do emparelhamento de bases entre as porções do crRNA e do trRNA.

[00302] Em algumas modalidades, o trRNA pode compreender toda ou uma porção de uma sequência de trRNA do tipo selvagem a partir de um sistema CRISPR/Cas de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o trRNA compreende um trRNA do tipo selvagem truncado ou modificado. O comprimento do trRNA depende do sistema CRISPR/Cas usado. Em algumas modalidades, o trRNA compreende

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58/156 ou consiste em 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou mais de 100 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o trRNA pode compreender certas estruturas secundárias, tais como, por exemplo, uma ou mais estruturas em forma de grampo ou estrutura em haste-laço, ou uma ou mais estruturas salientes.

[00303] Em algumas modalidades, a invenção compreende um ou mais RNAs guia compreendendo uma sequência guia de qualquer uma das SEQ ID NOs: 5-129.

[00304] Em um aspecto, a invenção compreende um gRNA que compreende uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% idêntica à uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.

[00305] Em outras modalidades, a composição compreende pelo menos dois gRNAs que compreende sequências guia selecionadas de quaisquer duas ou mais sequências guia de SEQ ID NOs: 5-129. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos dois gRNAs que são, cada uma, pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% idênticas a qualquer um dos os ácidos nucleicos de SEQ ID NOs: 5-129.

[00306] Em algumas modalidades, o gRNA é um sgRNA que compreende qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 2 (SEQ ID Nos. 130-139, 408 e 410-421). Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma sequência que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91% ou 90% idêntica a qualquer um dos ácidos nucleicos de SEQ ID Nos. 130-139 e 408. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende qualquer uma das sequências guia mostradas na Tabela 1 em vez das sequências guia mostradas nas sequências de sgRNA da Tabela 2 em SEQ ID Nos: 130-139, 408 e 410421 com ou sem as modificações.

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59/156 [00307] Os RNAs guia são englobados os quais compreendem as modificações de qualquer uma das sequências mostradas na Tabela 2, e identificadas na mesma por SEQ ID No. Ou seja, os nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes, mas o padrão de modificação mostrado pode ser o mesmo ou semelhante a um padrão de modificação de um gRNA da Tabela 2. Um padrão de modificação inclui a posição relativa e a identidade das modificações do gRNA ou de uma região do gRNA. Em algumas modalidades, o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico ao padrão de modificação de qualquer uma das sequências mostradas na coluna de sequência da Tabela 2. Em algumas modalidades, o padrão de modificação difere do padrão de modificação de uma sequência da Tabela 2, ou uma região dessa sequência, a 0, 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o gRNA compreende modificações que diferem das modificações de uma sequência da Tabela 2, em 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos.

[00308] As composições de RNA guia da presente invenção são projetadas para reconhecer uma sequência alvo no gene SERPINA1. Por exemplo, a sequência alvo de SERPINA1 pode ser reconhecida e clivada pelo agente de ligação de DNA guiado por RNA fornecido. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode ser dirigida por um RNA guia para uma sequência alvo do gene SERPINA1, onde a sequência guia do RNA guia se hibridiza com a sequência alvo e a proteína Cas diva a sequência alvo.

[00309] Em algumas modalidades, a seleção de um ou mais RNAs guia é determinada com base nas sequências alvos dentro do gene SERPINA1.

[00310] Sem se ater a qualquer teoria em particular, mutações em regiões críticas do gene podem ser menos toleráveis do que mutações em regiões não críticas do gene, assim, a localização de um DSB é um

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60/156 fator importante na quantidade ou tipo de knockdown ou knockout de proteína que pode resultar. Em algumas modalidades, um gRNA complementar ou tendo complementaridade com uma sequência alvo dentro de SERPINA1 é usado para dirigir a proteína Cas para uma localização particular no gene SERPINA1. Em algumas modalidades, os gRNAs são projetados para terem sequências guia que sejam complementares ou tenham complementaridade com sequências alvos nos éxons 2, 3, 4 ou 5 da SERPINA1.

[00311] Em algumas modalidades, os gRNA são projetados para serem complementares ou ter complementaridade com sequências alvos em éxons de SERPINA1 que codificam a região N-terminal de AAT.

B. gRNAs quimicamente modificados [00312] Em algumas modalidades, a invenção compreende um gRNA compreendendo uma ou mais modificações. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado por 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre os nucleotídeos.

[00313] Acredita-se que os açúcares modificados controlam o enrugamento de anéis de açúcar de nucleotídeo, uma propriedade física que influencia a afinidade de ligação de oligonucleotídeo por fitas complementares, formação de duplexe e interação com nucleases. As substituições nos anéis de açúcar podem, portanto, alterar a confirmação e o enrugamento desses açúcares. Por exemplo, as modificações 2'- O-metil (2'-O-Me) podem aumentar a afinidade de ligação e estabilidade de nuclease de oligonucleotídeos, embora o efeito de qualquer modificação em uma dada posição em um oligonucleotídeo necessite de ser determinado empiricamente.

[00314] Os termos mA”, mC”, mU”ou mG” podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido modificado com 2'-O-Me.

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61/156 [00315] A modificação de 2'- O-metil) pode ser descrita da seguinte forma:

O OH $

[00316] Outra modificação química que demonstrou influenciar os anéis de açúcar de nucleotídeo é a substituição de halogênio. Por exemplo, a substituição de 2'-fluoro (2'-F) em anéis de açúcar nucleotídicos pode aumentar a afinidade de ligação ao oligonucleotídeo e a estabilidade da nuclease.

[00317] Neste pedido de patente, os termos ÍA”, fC”, fU”ou fG” podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido substituído por 2'-F.

[00318] A substituição de 2'-F pode ser representada da seguinte forma:

Composição natural de RNA Substituição de 2'F [00319] Em algumas modalidades, a modificação pode ser 2'-O-(2metóxi-etil) (2'-O- moe). A modificação de um ribonucleotídeo como um ribonucleotídeo 2'-O-moe pode ser descrita como se segue:

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[00320] Os termos moeA”, moeC”, moeU”ou moeG” podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido modificado com 2'O-moe.

[00321] Ligação ou vinculação de fosforotioato (PS) se refere a uma ligação em que um enxofre é substituído por um oxigênio de fosfato não em ponte em uma ligação de fosfodiéster, por exemplo, nas ligações entre bases nucleotídicas. Quando os fosforotioatos são usados para gerar oligonucleotídeos, os oligonucleotídeos modificados podem também ser referidos como S-oligos.

[00322] Um *”pode ser usado para descrever uma modificação de PS. Neste pedido de patente, os termos A*, C*, U*, ou G* podem ser usados para denotar um nucleotídeo que está ligado ao nucleotídeo seguinte (por exemplo, 3') com uma ligação de PS.

[00323] Neste pedido de patente, os termos mA*”, mC*”, mU*”, ou mG*” podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido substituído por 2'-O-Me e que esteja ligado ao próximo (por exemplo, 3') nucleotídeo com uma ligação de PS.

[00324] O diagrama abaixo mostra a substituição de S- em um oxigênio do fosfato não em ponte, gerando uma ligação de PS em vez de uma ligação de fosfodiéster:

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Fosfodiéster

Fosforotioato (PS)

Ligação de fosfodiéster Ligação de fosforotioato modificada (PS) natural de RNA [00325] Os nucleotídeos básicos se referem àqueles que não possuem bases nitrogenadas. A Figura abaixo mostra um oligonucleotídeo com um sítio abásico (também conhecido como apurínico) sem uma base:

[00326] Bases invertidas se referem àquelas com ligações que são invertidas da ligação normal de 5 para 3' (isto é, uma ligação de 5 para 5 ou uma ligação de 3 para 3). Por exemplo:

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Ligação normal de Ligação invertida de 3 invertido oligonucleotídeos oligonucleotídeos abásico [00327] Um nucleotídeo abásico pode ser fixo com uma ligação invertida. Por exemplo, um nucleotídeo abásico pode ser ligado ao nucleotídeo do terminal 5 através de uma ligação 5 a 5, ou um nucleotídeo abásico pode ser ligado ao nucleotídeo do terminal 3 através de uma ligação 3 a 3. Um nucleotídeo abásico invertido no nucleotídeo terminal 5 ou 3 pode também ser designado por uma terminação de extremidade invertida.

[00328] Em algumas modalidades, um ou mais dos primeiros três, quatro ou cinco nucleotídeos na extremidade 5 do terminal 5, e um ou mais dos últimos três, quatro ou cinco nucleotídeos na extremidade 3 do terminal 3 são modificados. Em algumas modalidades, a modificação é um 2'-O-Me, 2'-F, 2'-O-moe, nucleotídeo abásico invertido, ligação de PS ou outra modificação de nucleotídeo bem conhecida na técnica para aumentar a estabilidade e/ou desempenho .

[00329] Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5 do terminal 5 e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3 do terminal 3 estão ligados com ligações de fosforotioato (PS).

[00330] Em algumas modalidades, os três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' da extremidade 3' compreendem um 2'-O-metil (2'-O-Me) nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, os três primeiros

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65/156 nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os três últimos nucleotídeos na extremidade 3' da extremidade 3' compreendem um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e os três últimos nucleotídeos na extremidade 3' da extremidade 3' compreendem um nucleotídeo abásico invertido.

[00331] Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um sgRNA modificado. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende o padrão de modificação mostrado na SEQ ID No: 130, em que N é qualquer nucleotídeo natural ou não natural e em que a totalidade dos N's compreende uma sequência guia que dirige um agente de ligação de DNA guiado por RNA (por exemplo, Cas9) para uma sequência alvo. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende o padrão de modificação mostrado em qualquer uma das SEQ ID No: 410-421, em que N é qualquer nucleotídeo natural ou não natural, e onde a totalidade dos N's compreende uma sequência guia que dirige um agente de ligação de DNA guiado por RNA (por exemplo, Cas9) para uma sequência alvo. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um sgRNA mostrado em qualquer uma das SEQ ID No: 131-139. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um sgRNA compreendendo qualquer uma das sequências guia da SEQ ID No: 5129 e os nucleotídeos de SEQ ID No: 408, em que os nucleotídeos de SEQ ID No: 408 estão na extremidade 3' da sequência guia e em que a sequência guia pode ser modificada como mostrado na SEQ ID No: 130. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um sgRNA compreendendo qualquer uma das sequências guia da SEQ ID No: 5129 e os nucleotídeos de SEQ ID No: 141, em que os nucleotídeos de SEQ ID No: 141 estão na extremidade 3' da sequência guia e em que a sequência guia pode ser modificada como mostrado na SEQ ID No: 130. [00332] Em algumas modalidades, os RNAs guia divulgados na

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66/156 presente invenção compreendem um dos padrões de modificação divulgados em US 62/431.756, depositado em 8 de dezembro de 2016, e PCT/US 17/65306, depositado em 8 de dezembro de 2017, intitulado Chemically Modified Guide RNAs”cujo conteúdo é aqui incorporado por referência na sua totalidade.

C. Vetores [00333] Em certas modalidades, a invenção compreende vetores de DNA compreendendo qualquer um dos RNAs guia compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia descritas na presente invenção. Em algumas modalidades, além de guiar as sequências de RNA, os vetores compreendem ainda ácidos nucleicos que não codificam RNAs guia. Os ácidos nucleicos que não codificam o RNA guia incluem, mas não estão limitados a, promotores, intensificadores, sequências reguladoras e ácidos nucleicos que codificam um agente de ligação de DNA guiado por RNA (por exemplo, Cas9). Em algumas modalidades, o vetor compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um crRNA, um trRNA, ou um crRNA e trRNA. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um sgRNA. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um crRNA e um mRNA que codifica uma proteína Cas, tal como Cas9. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um crRNA, um trRNA e um mRNA que codifica uma proteína Cas, tal como Cas9. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um sgRNA e um mRNA codificando uma proteína Cas, tal como Cas9. Em uma modalidade, o Cas9 é de Streptococcus pyogenes (isto é, Spy Cas9). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o crRNA, trRNA, ou crRNA e trRNA compreende ou consiste em uma sequência guia flanqueada por toda ou uma porção de uma sequência de repetição de um sistema

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CRISPR Cas de ocorrência natural. O ácido nucleico compreendendo ou consistindo em crRNA, trRNA, ou crRNA e trRNA pode compreender ainda uma sequência de vetor em que a sequência de vetor compreende ou consiste em ácidos nucleicos que não são encontrados naturalmente em conjunto com o crRNA, trR A ou crRNA e trRNA. [00334] Em algumas modalidades, o crRNA e o trRNA são codificados por ácidos nucleicos não contíguos dentro de um vetor. Em outras modalidades, o crRNA e o trRNA podem ser codificados por um ácido nucleico contíguo. Em algumas modalidades, o crRNA e o trRNA são codificados por cadeias opostas de um único ácido nucleico. Em outras modalidades, o crRNA e o trRNA são codificados pela mesma cadeia de um único ácido nucleico.

D. Complexo de ribonucleoproteína [00335] Em algumas modalidades, uma composição é englobada compreendendo um ou mais gRNAs compreendendo uma ou mais sequências guia da Tabela 1 ou Tabela 2 e um agente de ligação de DNA guiado por RNA (por exemplo, Cas9). Em algumas modalidades, o gRNA juntamente com o agente de ligação de DNA, tal como um Cas9 é chamado de complexo de ribonucleoproteína (RNP). Em algumas modalidades, o agente de ligação de DNA guiado por RNA é uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o gRNA juntamente com uma proteína Cas é chamado de Cas RNP. Em algumas modalidades, o RNP compreende os componentes Tipo-I, Tipo-ll ou Tipo-ΙΠ. Em algumas modalidades, a proteína Cas é do sistema CRISPR/Cas Tipo-I. Em algumas modalidades, a proteína Cas é do sistema CRISPR/Cas Tipoll. Em algumas modalidades, a proteína Cas é do sistema CRISPR/Cas Tipo-III. Em algumas modalidades, a proteína Cas é Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas é Cpfl. Em algumas modalidades, a proteína Cas é a proteína Cas9 do sistema CRISPR/Cas Tipo-ll. Em algumas modalidades, o gRNA junto com Cas9 é chamado de Cas9

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RNP.

[00336] Em modalidades abrangendo uma nuclease de Cas, a nuclease de Cas pode ser de um sistema Tipo-ΠΑ, Tipo-IIB, ou TipoIIC. Espécies exemplificativas não limitantes das quais a nuclease de Cas ou outros componentes RNP podem ser derivados incluem Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Listeria innocua, Lactobacillus gasseri, Francisella novicida, Wolinella succinogenes, Sutter Ila wadsworthensis, Gammaproteobacterium, Neisseria meningitidis, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Fibrobacter succinogene, Rhodospirillum rubrum, Nocardiopsis dassonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromogenes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus buchneri, Treponema denticola, Microscilla marina, Burkholderiales bacterium, Polar omonas naphthalenivorans, Polar omonas sp., Crocosphaera watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelulosiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithiobacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Nitrosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalter omonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilis, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcoleus chthonoplastes, Oscillator ia sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Streptococcus pasteurianus, Neisseria cinerea,

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Campylobacter lari, Parvibaculum lavamentivorans, Corynebacterium diphtheria, Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium ND2006, e Acaryochloris marina. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cas9 de Streptococcus thermophilus. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cas9 da Neisseria meningitidis. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cas9 é de Staphylococcus aureus. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cpf1 de Francisella novicida. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cpf 1 de Acidaminococcus sp. Em algumas modalidades, a nuclease de Cas é a proteína Cpf 1 da bactéria Lachnospiraceae ND2006.

[00337] A Cas9 do tipo selvagem tem dois domínios de nuclease: RuvC e HNH. O domínio RuvC cliva a fita de DNA não alvo, e o domínio HNH cliva a fita de DNA alvo. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 compreende mais do que um domínio RuvC e/ou mais do que um domínio HNH. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é uma Cas9 do tipo selvagem. Em cada uma das modalidades da composição e do método, a Cas induz uma ruptura da fita dupla no DNA alvo.

[00338] As versões modificadas de Cas9 tendo um domínio catalítico, ou RuvC ou HNH, que é inativo são denominadas nickases”. As nickases cortam apenas uma fita no DNA alvo, criando assim uma quebra de fita simples. Uma quebra de fita simples também pode ser conhecida como nick”. Em algumas modalidades, as composições e métodos compreendem nickases. Em algumas modalidades, as composições e métodos compreendem uma nickase Cas9 que induz um corte em vez de uma quebra de fita dupla no DNA alvo.

[00339] Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ser modificada para conter apenas um domínio de nuclease funcional. Por exemplo, a proteína Cas pode ser modificada de tal modo que um dos

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70/156 domínios de nuclease seja mutado ou totalmente ou parcialmente deletado para reduzir a sua atividade de divagem de ácido nucleico. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada com um domínio RuvC com atividade reduzida. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada com um domínio RuvC inativo. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada com um domínio HNH com atividade reduzida. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada com um domínio HNH inativo.

[00340] Em algumas modalidades, um aminoácido conservado dentro de um domínio de nuclease da proteína Cas é substituído para reduzir ou alterar a atividade de nuclease. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode compreender uma substituição de aminoácido no domínio de nuclease semelhante a RuvC ou RuvC. Substituições de aminoácidos exemplificativas no domínio de nuclease tipo RuvC ou RuvC incluem D10A (com base na proteína Cas9 de S. pyogenes). Veja, por exemplo, Zetsche et al. (2015) Cell 22 de Out: 163 (3): 759-771. Em algumas modalidades, a proteína Cas pode compreender uma substituição de aminoácido no domínio de nuclease do tipo HNH ou semelhante a HNH. Exemplos de substituições de aminoácidos no domínio da nuclease semelhante a HNH ou HNH incluem E762A, H840A, N863A, H983A e D986A (com base na proteína Cas9 de S. pyogenes). Veja, por exemplo, Zetsche et al. (2015).

[00341] Em algumas modalidades, o complexo de RNP descrito na presente invenção compreende uma nickase e um par de RNAs guia que são complementares às fitas com senso e antissenso da sequência alvo, respetivamente. Nesta modalidade, os RNAs guia dirigem a nickase para uma sequência alvo e introduzem um DSB gerando um corte nas fitas opostas da sequência alvo (isto é, duplo corte). Em algumas modalidades, o uso de duplo corte pode melhorar a especificidade e reduzir os efeitos indesejados. Em algumas

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71/156 modalidades, uma nickase Cas é usada em conjunto com dois RNAs guia separados direcionados a fitas opostas de DNA para produzir um duplo corte no DNA alvo. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada em conjunto com dois RNAs guia separados que são selecionados para estarem próximos para produzir um duplo corte no DNA alvo.

[00342] Em algumas modalidades, as proteínas Cas quiméricas são usadas, em que um domínio ou região da proteína é substituído por uma porção de uma proteína diferente. Em algumas modalidades, um domínio de nuclease de Cas pode ser substituído por um domínio de uma nuclease diferente, tal como Fokl. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode ser uma nuclease modificada.

[00343] Em outras modalidades, a proteína Cas pode ser de um sistema CRISPR/Cas Tipo-I. Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ser um componente do complexo Cascade de um sistema CRISPR/Cas Tipo-I. Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ser uma proteína Cas3. Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ser de um sistema CRISPR/Cas Tipo-lll. Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ter uma atividade de divagem de RNA.

E. Determinação da eficácia de gRNAs [00344] Em algumas modalidades, a eficácia de um gRNA é determinada quando expressa em conjunto com outros componentes de um RNP. Em algumas modalidades, o gRNA é expresso em conjunto com um Cas. Em algumas modalidades, o gRNA é expresso em uma linhagem celular que já expressa estavelmente Cas.

[00345] O uso do sistema Cas RNP pode levar a quebras de fita dupla no DNA. A junção de extremidade não homóloga (NHEJ) é um processo pelo qual as quebras de fita dupla (DSBs) no DNA são reparadas via religação das extremidades de quebra, o que pode produzir erros na forma de mutações de inserção/deleção (indel). As

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72/156 extremidades de DNA de DSB frequentemente foram submetidas a processamento enzimático, resultando na adição ou remoção de nucleotídeos em uma ou ambas as fitas antes da junção das extremidades. Estas adições ou remoções antes da junção resultam na presença de mutações de inserção ou deleção (indel) na sequência de DNA no local da reparação de NHEJ. Muitas mutações devido a indels alteram a estrutura de leitura ou introduzem códons de parada prematuros e, portanto, produzem uma proteína não funcional.

[00346] Em algumas modalidades, a eficácia de determinados gRNAs é determinada com base em modelos in vitro. Em algumas modalidades, o modelo in vitro é de células HEK293 expressando estavelmente Cas9 (HEK293_Cas9). Em algumas modalidades, o modelo in vitro é de células de hepatocarcinoma humano HUH7. Em algumas modalidades, o modelo in vitro é de células de adenocarcinoma hepático humano sk-Hep. Em algumas modalidades, o modelo in vitro é de hepatócitos humanos primários. Em algumas modalidades, o modelo in vitro é de células HepG2.

[00347] Em algumas modalidades, a eficácia de sequências guia particulares é determinada através de múltiplos modelos celulares in vitro para um processo de seleção de gRNA. Em algumas modalidades, uma comparação de linhagem de células de dados com gRNAs selecionados é realizada. Em algumas modalidades, o rastreio cruzado em múltiplos modelos celulares é realizado.

[00348] Em algumas modalidades, a eficácia de um RNA guia é medida pela edição percentual de SERPINA1. Em algumas modalidades, a edição percentual de SERPINA1 é comparada com a edição percentual de um gene de controle (por exemplo, um gene para o qual o gRNA não é alvo). Em algumas modalidades, o gene de controle é o Controle 1, 2, 3 ou 4, como mostrado na Tabela 1. Em algumas modalidades, a edição percentual (por exemplo, a eficiência

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73/156 de edição”ou edição percentual’) é definida como o número total de leituras de sequência com inserções/deleções (indels’) ou substituições sobre o número total de leituras de sequência, incluindo o tipo selvagem. Em algumas modalidades, o RNA guia tem uma edição percentual que é de cerca de 100%. Em algumas modalidades, a edição percentual é, por exemplo, entre 5 e 10%, 10 e 15%, 15 e 20%, 20 e 25%, 30 e 35%, 35 e 40%, 40 e 45%, 45 e 50%, 50 e 55%, 55 e 60%, 60 e 65%, 65 e 70%, 70 e 75%, 75 e 80%, 80 e 85%, 85 e 90%, 90 e 95%, ou 95 e 99% [00349] Em algumas modalidades, os métodos e composições descritos na presente invenção compreendem RNA guia tendo uma redução na divagem fora do alvo. Em algumas modalidades, não existem clivagens detectáveis fora do alvo. Em algumas modalidades, uma deleção ou inserção de um nucleotídeo ocorre no gene SERPINA1 pelo menos 50 vezes ou mais do que em sítios fora do alvo. Em algumas modalidades, a deleção ou inserção de um nucleotídeo ocorre no gene SERPINA1 50 vezes a 150 vezes, 150 vezes a 500 vezes, 500 vezes a 1.500 vezes, 1.500 vezes a 5.000 vezes, 5.000 vezes a 15.000 vezes, 15.000 vezes a 30.000 vezes, ou 30.000 vezes a 60.000 vezes mais do que em sítios fora do alvo.

[00350] Em algumas modalidades, a eficácia de um RNA guia é medida pela secreção de AAT. Em algumas modalidades, a secreção de AAT é medida com o uso de um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) com meio de cultura. Em algumas modalidades, a secreção de AAT é medida nos mesmos sistemas in vitro usados para medir a edição. Em algumas modalidades, a secreção de AAT é medida em hepatócitos humanos primários. Em algumas modalidades, a secreção de AAT é medida em células HUH7.

[00351] Em algumas modalidades, a quantidade de AAT nas células mede a eficácia de um gRNA. Em algumas modalidades, a quantidade

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74/156 de AAT nas células é medida usando western blot. Em algumas modalidades, a célula usada é células HUH7. Em algumas modalidades, a quantidade de AAT é comparada com a quantidade de gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase GAPDH (um gene de manutenção) para controlar as alterações no número de células.

II. Tratamento de AATD [00352] Em algumas modalidades, é fornecido um método para induzir uma quebra de fita dupla (DSB) dentro do gene SERPINA1 compreendendo a administração de um RNA guia compreendendo qualquer uma ou mais sequências guia de SEQ ID Nos: 5-129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130-139. Em algumas modalidades, os gRNAs compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia de SEQ ID Nos: 5-129 são administrados para induzir um DSB no gene SERPINA1. Os RNAs guia podem ser administrados juntamente com um agente de ligação de DNA guiado por RNA, como uma proteína Cas, como, por exemplo, Cas9, ou um mRNA ou vetor que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA, como uma proteína Cas, como por exemplo, Cas9. Em algumas modalidades, o RNA guia administrado é uma ou mais das composições de RNA guia descritas na presente invenção.

[00353] Em algumas modalidades, um método de modificação do gene SERPINA1 é fornecido compreendendo a administração de um RNA guia compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia de SEQ ID Nos: 5-129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130-139. Em algumas modalidades, os gRNAs compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia de SEQ ID Nos: 5129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130-139, são administrados para modificar o gene SERPINA1. Os RNAs guia podem ser administrados em conjunto com uma proteína Cas ou um mRNA ou vetor que codifica uma proteína Cas, como, por exemplo, Cas9.

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75/156 [00354] Em algumas modalidades, um método de tratamento de AATD é fornecido compreendendo a administração de um RNA guia compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia de SEQ ID Nos: 5-129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130139. Em algumas modalidades, os RNAg compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia de SEQ ID Nos: 5129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130-139 são administrados para tratar AATD. Os RNAs guia podem ser administrados em conjunto com uma proteína Cas ou um mRNA ou vetor que codifica uma proteína Cas, como, por exemplo, Cas9.

[00355] Em algumas modalidades, um método de redução ou prevenção da acumulação de AAT no soro, fígado, tecido hepático, células hepáticas e/ou hepatócitos de um sujeito é fornecido compreendendo a administração de um RNA guia compreendendo qualquer uma ou mais SEQ ID Nos 5-129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130-139. Em algumas modalidades, os gRNAs compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia de SEQ ID Nos: 5-129, ou qualquer um ou mais dos sgRNAs de SEQ ID Nos: 130139 são administrados para reduzir ou prevenir a acumulação de AAT no fígado, tecido do fígado, células do fígado e/ou hepatócitos. Os gRNAs podem ser administrados juntamente com um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína Cas ou um mRNA ou vetor que codifica uma proteína Cas, como, por exemplo, Cas9.

[00356] Em algumas modalidades, os gRNAs compreendendo as sequências guia da Tabela 1 ou Tabela 2 juntamente com uma proteína Cas induzem DSBs, e a junção de terminação não homóloga (NHEJ) durante o reparo conduz a uma mutação no gene SERPINA1. Em algumas modalidades, NHEJ leva a uma deleção ou inserção de um nucleotídeo(s), que induz uma mudança de estrutura ou mutação nonsense no gene SERPINA1.

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76/156 [00357] Em algumas modalidades, a administração dos RNAs guia da invenção (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) reduz os níveis de alfa-1 antitripsina (AAT) mutada produzida pelo sujeito e, consequentemente, impede a acumulação e agregação de AAT no fígado.

[00358] Em algumas modalidades, o sujeito é mamífero. Em algumas modalidades, o sujeito é humano. Em algumas modalidades, o sujeito é vaca, porco, macaco, ovelha, cão, gato, peixe ou aves de capoeira.

[00359] Em algumas modalidades, o uso de um RNA guia compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia na Tabela 1 ou Tabela 2 (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) é fornecido para a preparação de um medicamento para tratar um sujeito humano tendo AATD.

[00360] Em algumas modalidades, os RNAs guia, composições e formulações são administrados por via intravenosa. Em algumas modalidades, os RNAs guia, composições e formulações são administrados na circulação hepática.

[00361] Em algumas modalidades, uma única administração do RNA guia da invenção (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) é suficiente para o knockdown da expressão da proteína mutante. Em algumas modalidades, uma única administração de RNA guia da invenção (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) é suficiente para o knockdown ou knockout da expressão da proteína mutante. Em outras modalidades, mais de uma administração do RNA guia da invenção (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) pode ser benéfica para maximizar a edição através de efeitos cumulativos.

[00362] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento com as composições da invenção é observada em 1 ano, 2 anos, 3 anos, 4 anos, 5 anos ou 10 anos após a aplicação.

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77/156 [00363] Em algumas modalidades, o tratamento diminui ou interrompe a progressão da doença do fígado. Em algumas modalidades, o tratamento melhora as medições da doença do fígado. Em algumas modalidades, a doença do fígado é medida por alterações na estrutura do fígado, função hepática ou sintomas no sujeito.

[00364] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida pela capacidade de retardar ou evitar um transplante de fígado no sujeito. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida pelo aumento do tempo de sobrevivência do sujeito.

[00365] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida pela redução das enzimas hepáticas no sangue. Em algumas modalidades, as enzimas hepáticas são alanina transaminase (ALT) ou aspartato transaminase (AST).

[00366] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida pela redução do desenvolvimento do tecido cicatricial ou diminuição do tecido cicatricial no fígado com base nos resultados da biópsia.

[00367] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida usando resultados relatados pelo paciente, tais como fadiga, fraqueza, comichão, perda de apetite, perda de peso, náuseas ou inchaço. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida por diminuições no edema, ascite ou icterícia. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida por diminuições na hipertensão portal. Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida por diminuições nas taxas de câncer de fígado.

[00368] Em algumas modalidades, a eficácia do tratamento é medida usando métodos de imageamento. Em algumas modalidades, os métodos de imageamento são ultrassom, tomografia computadorizada, imagens de ressonância magnética ou elastografia.

[00369] Em algumas modalidades, os níveis de AAT no soro e/ou no fígado são reduzidos em 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%,

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90-95%, 95-98%, 98-99% ou 99-100% em comparação com os níveis de AAT no sore e/ou no fígado antes da administração da composição [00370] Em algumas modalidades, a edição percentual do gene SERPINA1 está entre 30 e 99%. Em algumas modalidades, a edição percentual é entre 30 e 35%, 35 e 40%, 40 e 45%, 45 e 50%, 50 e 55%, 55 e 60%, 60 e 65%, 65 e 70%, 70 e 75%, 75 e 80%, 80 e 85%, 85 e 90%, 90 e 95%, ou 95 e 99%.

A. Terapia de Combinação [00371] Em algumas modalidades, a invenção compreende terapias de combinação compreendendo qualquer um dos gRNAs compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia divulgadas na Tabela 1 ou qualquer um ou mais dos sgRNAs na Tabela 2 (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) juntamente com uma terapia de reposição adequada para aliviar os sintomas pulmonares de AATD. Em algumas modalidades, a terapia de reposição para doença pulmonar é a terapia intravenosa com AAT purificada a partir de plasma humano, como descrito em Turner, BioDrugs Dez 2013;27(6):547-58. Em algumas modalidades, a terapia de reposição é com Prolastin®Zemaira®Aralast®ou Kamada®.

[00372] Em algumas modalidades, a terapia de combinação compreende qualquer um dos gRNAs compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia descritas na Tabela 1 ou qualquer um ou mais dos sgRNAs na Tabela 2 (por exemplo, em uma composição fornecida na presente invenção) juntamente com um siRNA que tem como alvo ATT ou ATT mutante. Em algumas modalidades, o siRNA é qualquer siRNA capaz de reduzir ou eliminar adicionalmente a expressão de AAT do tipo selvagem ou mutante. Em algumas modalidades, o siRNA é administrado após qualquer um dos gRNAs compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia divulgadas na Tabela 1 ou qualquer um ou mais dos sgRNAs na Tabela 2 (por exemplo, em uma

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79/156 composição fornecida na presente invenção). Em algumas modalidades, o siRNA é administrado em uma base regular após tratamento com qualquer uma das composições de gRNA fornecidas na presente invenção.

B. Distribuição de gRNA [00373] Em algumas modalidades, as composições de RNA guia descritas na presente invenção, isoladamente ou codificadas em um ou mais vetores, são formuladas ou administradas por meio de uma nanopartícula lipídica; ver, por exemplo, PCT/US2017/024973, depositado em 30 de março de 2017, intitulado 'LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS”, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência em sua totalidade. Qualquer formulação de nanopartículas lipídicas (LNP) conhecida dos versados na técnica para ser capaz de distribuir nucleotídeos a sujeitos pode ser usada com os RNAs guia descritos na presente invenção, bem como com mRNA codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas ou Cas9, ou um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como a própria Cas ou Cas9.

[00374] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para distribuir qualquer um dos gRNAs aqui divulgados a um sujeito, em que o gRNA está associado a um LNP. Em algumas modalidades, o gRNA/LNP também é associado a um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas9, ou um mRNA codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas9.

[00375] Em algumas modalidades, a invenção compreende uma composição compreendendo qualquer um dos gRNAs divulgados e um LNP. Em algumas modalidades, a composição compreende ainda um Cas9 ou um mRNA codificando Cas9.

[00376] Em algumas modalidades, os LNPs compreendem lipídeos catiônicos. Em algumas modalidades, os LNPs compreendem um

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80/156 lipídeo tal como um lipídeo CCD tal como o Lipídeo A ((9Z,12Z)-3-((4,4bis(octilóxi)butanoil)óxi)-2-((((3(dietilamino)propóxi)carbonil)óxi)metil)propil octadeca-9, 12-dienoato, também chamado de 3-((4,4-bis(octilóxi)butanoil)óxi)-2-((((3(dietilamino)propóxi)carbonil)óxi)metil)propil (9Z, 12Z)-octadeca-9, 12dienoato)), Lipídeo B (((5-((dimetilamino)metil)-1,3fenileno)bis(óxi))bis(octane-8,1 -di-il)bis(decanoato), também chamado de ((5-((dimetilamino)metil)-1,3- fenileno)bis(óxi))bis(octano-8,1-di-il) bis(decanoato)), Lipídeo C (2-((4-(((3(dimetilamino)propóxi)carbonil)óxi)hexadecanoil)óxi)propano-l,3-diil(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-bis(octadeca-9, 12-dienoato)), ou Lipídeo D (-(((3(dimetilamino)propóxi)carbonil)óxi)-13-(octanoilóxi)tridecil 3octilundecanoato). Em algumas modalidades, os LNPs compreendem razões molares de uma amina lipídica catiônica para fosfato de RNA (N:P) de cerca de 4,5.

[00377] Em algumas modalidades, os LNPs associados aos gRNAs aqui divulgados são para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de AATD. Em algumas modalidades, os LNPs associados aos gRNAs aqui divulgados são para uso na preparação de um medicamento para reduzir ou impedir a acumulação e agregação de AAT em sujeitos com AATD. Em algumas modalidades, os LNPs associados aos gRNAs aqui divulgados são para uso na preparação de um medicamento para reduzir a concentração de AAT no soro e/ou fígado. Em algumas modalidades, os LNPs associados aos gRNAs aqui divulgados são para uso no tratamento de AATD em um sujeito, tal como um mamífero, por exemplo, um primata tal como um ser humano. Em algumas modalidades, os LNPs associados aos gRNAs aqui divulgados são para uso na redução ou prevenção da acumulação e agregação de AAT em sujeitos com AATD, tal como um mamífero, por exemplo, um primata tal como um humano. Em algumas modalidades,

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81/156 os LNPs associados aos gRNAs aqui divulgados são para uso na redução da concentração de AAT no soro em um sujeito, tal como um mamífero, por exemplo, um primata tal como um ser humano.

[00378] A eletroporação é também um meio bem conhecido para a distribuição de carga, e qualquer metodologia de eletroporação pode ser usada para a distribuição de qualquer um dos gRNAs aqui divulgados. Em algumas modalidades, a eletroporação pode ser usada para administrar qualquer um dos gRNAs aqui divulgados e um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas9 ou um mRNA codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas9.

[00379] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para distribuir qualquer um dos gRNAs aqui divulgados a uma célula ex vivo, em que o gRNA está associado a um LNP ou não está associado a um LNP. Em algumas modalidades, o gRNA/LNP ou gRNA também está associado a um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como Cas9, ou um mRNA que codifica um agente de DNA guiado por RNA, tal como Cas9.

[00380] Em certas modalidades, a invenção compreende vetores de DNA ou RNA codificando qualquer um dos RNAs guia compreendendo qualquer uma ou mais das sequências guia descritas na presente invenção. Em certas modalidades, a invenção compreende vetores de DNA ou RNA codificando qualquer uma ou mais das sequências guia descritas na presente invenção. Em algumas modalidades, além de guiar as sequências de RNA, os vetores compreendem ainda ácidos nucleicos que não codificam RNAs guia. Os ácidos nucleicos que não codificam o RNA guia incluem, mas não estão limitados a, promotores, intensificadores, sequências reguladoras e ácidos nucleicos que codificam um agente de ligação de DNA guiado por RNA (por exemplo, Cas9, que pode ser uma nuclease como Cas9. Em algumas

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82/156 modalidades, o vetor compreende uma ou mais sequência de nucleotídeos codificando um crRNA, um trRNA, ou um crRNA e trRNA. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um gRNA e um mRNA que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA, que pode ser uma proteína Cas, tal como Cas9 ou Cpfl. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um crRNA, um trRNA e um mRNA que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA, que pode ser uma proteína Cas, como Cas9 ou Cpfl. Em uma modalidade, o Cas9 é de Streptococcus pyogenes (isto é, Spy Cas9). Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o crRNA, trRNA, ou crRNA e trRNA (que pode ser um sgRNA) compreende ou consiste em uma sequência guia flanqueada por toda ou uma porção de uma sequência de repetição de um sistema CRISPR Cas de ocorrência natural. O ácido nucleico compreendendo ou consistindo em crRNA, trRNA, ou crRNA e trRNA pode compreender ainda uma sequência de vetor em que a sequência de vetor compreende ou consiste em ácidos nucleicos que não são encontrados naturalmente em conjunto com o crRNA, trRNA, ou crRNA e trRNA.

[00381] Em algumas modalidades, o crRNA e o trRNA são codificados por ácidos nucleicos não contíguos dentro de um vetor. Em outras modalidades, o crRNA e o trRNA podem ser codificados por um ácido nucleico contíguo. Em algumas modalidades, o crRNA e o trRNA são codificados por cadeias opostas de um único ácido nucleico. Em outras modalidades, o crRNA e o trRNA são codificados pela mesma cadeia de um único ácido nucleico.

[00382] Em algumas modalidades, o vetor pode ser circular. Em outras modalidades, o vetor pode ser linear. Em algumas modalidades, o vetor pode estar envolvido em uma nanopartícula lipídica, lipossoma,

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83/156 nanopartícula não lipídica ou capsídeo viral. Vetores exemplificativos não limitativos incluem plasmídeos, fagomídeos, cosmídeos, cromossomas artificiais, minicromossomas, transposons, vetores virais e vetores de expressão.

[00383] Em algumas modalidades, o vetor pode ser um vetor viral. Em algumas modalidades, o vetor viral pode ser geneticamente modificado a partir da sua contraparte do tipo selvagem. Por exemplo, o vetor viral pode compreender uma inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos para facilitar a clonagem ou tal que uma ou mais propriedades do vetor sejam alteradas. Tais propriedades podem incluir a capacidade de empacotamento, eficiência de transdução, imunogenicidade, integração do genoma, replicação, transcrição e tradução. Em algumas modalidades, uma porção do genoma viral pode ser eliminada de tal modo que o vírus é capaz de empacotar as sequências exógenas com um tamanho maior. Em algumas modalidades, o vetor viral pode ter uma eficiência de transdução potencializada. Em algumas modalidades, a resposta imune induzida pelo vírus em um hospedeiro pode ser reduzida. Em algumas modalidades, genes virais (tais como, por exemplo, integrase) que promovem a integração da sequência viral em um genoma do hospedeiro podem ser mutados de tal modo que o vírus se torne não integrante. Em algumas modalidades, o vetor viral pode ser replicação defeituosa. Em algumas modalidades, o vetor viral pode compreender sequências exógenas de controle da transcrição ou tradução para dirigir a expressão de sequências de codificação no vetor. Em algumas modalidades, o vírus pode ser dependente de auxiliar. Por exemplo, o vírus pode precisar de um ou mais vírus auxiliares para fornecer componentes virais (tais como, por exemplo, proteínas virais) necessários para amplificar e empacotar os vetores em partículas virais. Em tal caso, um ou mais componentes auxiliares, incluindo um ou mais

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84/156 vetores que codificam os componentes virais, podem ser introduzidos em uma célula hospedeira juntamente com o sistema de vetor descrito na presente invenção. Em outras modalidades, os vírus podem estar livres de auxiliares. Por exemplo, o vírus pode ser capaz de amplificar e empacotar os vetores sem qualquer vírus auxiliar. Em algumas modalidades, o sistema de vetores descrito na presente invenção também pode codificar os componentes virais requeridos para amplificação e empacotamento de vírus.

[00384] Vetores virais exemplificativos não limitativos incluem vetor de vírus adenoassociado (AAV), vetores de lentivírus, vetores de adenovirus, vetores de adenovirus dependentes de auxiliar (HDAd), vetores de herpes simplex (HSV-1), bacteriófagos T4, vetores de baculovírus e vetores retrovirus. Em algumas modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de AAV. Em algumas modalidades, o vetor viral é AAV2, AAV3, AAV3B, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64RI, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAVrhIO, ou AAVLK03. Em outras modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de lentivírus.

[00385] Em algumas modalidades, o lentivírus pode ser não integrante. Em algumas modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de adenovirus. Em algumas modalidades, o adenovirus pode ter uma alta capacidade de clonagem ou adenovirus sem borra”, onde todas as regiões virais codificadoras, além das repetições terminais invertidas de 5' e 3' (ITRs), e o sinal de empacotamento (T) são deletados do vírus para aumentar sua capacidade de empacotamento. Ainda em outras modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de HSV-1. Em algumas modalidades, o vetor baseado em HSV-I é dependente de auxiliar e, em outras modalidades, é independente de auxiliar. Por exemplo, um vetor de amplicon que retém apenas a sequência de empacotamento requer um vírus auxiliar com componentes estruturais para empacotamento,

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85/156 enquanto um vetor HSV-1 com 30kb de deleção que remove funções virais não essenciais não requer vírus auxiliar. Em modalidades adicionais, o vetor viral pode ser o bacteriófago T4. Em algumas modalidades, o bacteriófago T4 pode ser capaz de empacotar quaisquer moléculas de DNA ou RNA lineares ou circulares quando a cabeça do vírus é esvaziada. Em outras modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de baculovírus. Ainda em outras modalidades, o vetor viral pode ser um vetor de retrovirus. Em modalidades usando vetores de AAV ou lentivirais, que possuem menor capacidade de clonagem, pode ser necessário o uso de mais do que um vetor para distribuir todos os componentes de um sistema de vetor como divulgado aqui. Por exemplo, um vetor de AAV pode conter sequências que codificam um agente de ligação de DNA guiado por RNA tal como uma proteína Cas (por exemplo, Cas9), enquanto um segundo vetor de AAV pode conter uma ou mais sequências guia.

[00386] Em algumas modalidades, o vetor pode ser capaz de dirigir a expressão de uma ou mais sequências codificantes em uma célula. Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula procariótica, tal como, por exemplo, uma célula bacteriana. Em algumas modalidades, a célula pode ser uma célula eucariótica, tal como, por exemplo, uma célula de levedura, planta, inseto ou mamífero. Em algumas modalidades, a célula eucariótica pode ser uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, a célula eucariótica pode ser uma célula de roedor. Em algumas modalidades, a célula eucariótica pode ser uma célula humana. Promotores adequados para dirigir a expressão em diferentes tipos de células são conhecidos na técnica. Em algumas modalidades, o promotor pode ser do tipo selvagem. Em outras modalidades, o promotor pode ser modificado para uma expressão mais eficiente ou eficaz. Ainda em outras modalidades, o promotor pode ser truncado, mantendo ainda a sua função. Por exemplo, o promotor pode

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86/156 ter um tamanho normal ou um tamanho reduzido que seja adequado para o empacotamento apropriado do vetor em um vírus.

[00387] Em algumas modalidades, o vetor pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína Cas (por exemplo, Cas9) descrita na presente invenção. Em algumas modalidades, a nuclease codificada pelo vetor pode ser uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o sistema de vetor pode compreender uma cópia da sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease. Em outras modalidades, o sistema de vetor pode compreender mais do que uma cópia da sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease pode estar operativamente ligada a pelo menos uma sequência de controle de transcrição ou tradução. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica a nuclease pode estar operativamente ligada a pelo menos um promotor.

[00388] Em algumas modalidades, o promotor pode ser constitutivo, induzível ou específico de tecido. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor constitutivo. Promotores constitutivos exemplares não limitativos incluem o promotor precoce imediato de citomegalovírus (CMV), promotor do vírus símio (SV40), promotor tardio principal de adenovirus (MLP), promotor do vírus sarcoma de Rous (RSV), promotor do vírus de tumor de mama de camundongo (MMTV), promotor de fosfoglicerato cinase (PGK), promotor de fator de alongamento alfa (EF1a), promotores de ubiquitina, promotores de actina, promotores de tubulina, promotores de imunoglobulina, um fragmento funcional dos mesmos, ou uma combinação de qualquer um dos anteriores. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor de CMV. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor de CMV truncado. Em outras modalidades, o promotor pode ser um promotor

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EF1a. Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor induzível. Promotores induzíveis exemplificativos não limitativos incluem os induzíveis por choque térmico, luz, produtos químicos, peptídeos, metais, esteroides, antibióticos ou álcool. Em algumas modalidades, o promotor induzível pode ser um que tenha um baixo nível de expressão basal (não induzida), tal como, por exemplo, o promotor Tet-On® (Clontech).

[00389] Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor específico de tecido, por exemplo, um promotor específico para expressão no fígado.

[00390] O vetor pode ainda compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica o RNA guia descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, o vetor compreende uma cópia do RNA guia. Em outras modalidades, o vetor compreende mais do que uma cópia do RNA guia. Em modalidades com mais do que um RNA guia, os RNA guia podem ser não idênticos de modo a terem como alvo diferentes sequências alvos, ou podem ser idênticos por terem como alvo a mesma sequência alvo. Em algumas modalidades em que os vetores compreendem mais de um RNA guia, cada RNA guia pode ter outras propriedades diferentes, tais como atividade ou estabilidade em um complexo com uma nuclease de DNA guiada por RNA, tal como um complexo de Cas RNP. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o RNA guia pode estar operativamente ligada a pelo menos uma sequência de controle transcricional ou translacional, tal como um promotor, uma UTR 3' ou uma UTR 5'. Em uma modalidade, o promotor pode ser um promotor de RNAt, por exemplo, RNAt^Lys3 ou uma quimera de RNAt. Veja Mefferd et ai., RNA. 2015 21: 1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628. Em algumas modalidades, o promotor pode ser reconhecido por RNA polimerase III (Pol III). Exemplos não limitantes de promotores Pol III

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88/156 incluem os promotores U6 e HI. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o RNA guia pode estar operativamente ligada a um promotor U6 de camundongo ou humano. Em outras modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o RNA guia pode estar operativamente ligada a um promotor H1 de camundongo ou humano. Em modalidades com mais do que um RNA guia, os promotores usados para dirigir a expressão podem ser iguais ou diferentes. Em algumas modalidades, o nucleotídeo que codifica o crRNA do RNA guia e o nucleotídeo que codifica o trRNA do RNA guia podem ser fornecidos no mesmo vetor. Em algumas modalidades, o nucleotídeo que codifica o crRNA e o nucleotídeo que codifica o trRNA podem ser dirigidos pelo mesmo promotor. Em algumas modalidades, o crRNA e o trRNA podem ser transcritos em um único transcrito. Por exemplo, o crRNA e trRNA podem ser processados a partir do transcrito único para formar um RNA guia de molécula dupla. Alternativamente, o crRNA e trRNA podem ser transcritos em um RNA guia de molécula única (sgRNA). Em outras modalidades, o crRNA e o trRNA podem ser dirigidos pelos seus promotores correspondentes no mesmo vetor. Ainda Em outras modalidades, o crRNA e o trRNA podem ser codificados por diferentes vetores.

[00391] Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o RNA guia pode estar localizada no mesmo vetor compreendendo a sequência de nucleotídeos que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA tal como uma proteína Cas. Em algumas modalidades, a expressão do RNA guia e do agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína Cas, pode ser conduzida pelos seus próprios promotores correspondentes. Em algumas modalidades, a expressão do RNA guia pode ser conduzida pelo mesmo promotor que dirige a expressão do agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína Cas. Em algumas

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89/156 modalidades, o RNA guia e o agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como um transcrito de proteína Cas, podem estar contidos em um único transcrito. Por exemplo, o RNA guia pode estar dentro de uma região não traduzida (UTR) do agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como um transcrito de proteína Cas. Em algumas modalidades, o RNA guia pode estar dentro de 5' UTR do transcrito. Em outras modalidades, o RNA guia pode estar dentro de 3' UTR do transcrito. Em algumas modalidades, a meia vida intracelular do transcrito pode ser reduzida por conter o RNA guia dentro de sua 3' UTR e, assim, encurtar o comprimento de sua 3' UTR. Em modalidades adicionais, o RNA guia pode estar dentro de um intron do transcrito. Em algumas modalidades, podem ser adicionados sítios de splicing adequados no íntron dentro do qual o RNA guia está localizado, de tal modo que o RNA guia seja adequadamente removido do transcrito. Em algumas modalidades, a expressão do agente de ligação de DNA guiado por RNA, tal como uma proteína Cas e o RNA guia do mesmo vetor, em uma proximidade temporal fechada, pode facilitar a formação mais eficiente do complexo de CRISPR RNP.

[00392] Em algumas modalidades, as composições compreendem um sistema de vetor. Em algumas modalidades, o sistema de vetor pode compreender um único vetor. Em outras modalidades, o sistema de vetor pode compreender dois vetores. Em modalidades adicionais, o sistema de vetores pode compreender três vetores. Quando são usados RNAs guia diferentes para multiplexagem, ou quando são usadas múltiplas cópias do RNA guia, o sistema de vetor pode compreender mais do que três vetores.

[00393] Em algumas modalidades, o sistema de vetor pode compreender promotores induzíveis para iniciar a expressão apenas depois de ser distribuído a uma célula alvo. Promotores induzíveis exemplificativos não limitativos incluem os induzíveis por choque

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90/156 térmico, luz, produtos químicos, peptídeos, metais, esteroides, antibióticos ou álcool. Em algumas modalidades, o promotor induzível pode ser um que tenha um baixo nível de expressão basal (não induzida), tal como, por exemplo, o promotor Tet-On® (Clontech). [00394] Em modalidades adicionais, o sistema de vetor pode compreender promotores específicos de tecido para iniciar a expressão apenas após serem distribuídos em um tecido específico.

[00395] O vetor pode ser distribuído por lipossoma, uma nanopartícula, um exossomo ou uma microvesícula. O vetor também pode ser distribuído por uma nanopartícula lipídica (LNP). Quaisquer das formulações de LNPs e LNP descritas na presente invenção são adequadas para a distribuição de guias isoladamente ou em conjunto de uma Cas nuclease ou um mRNA codificando uma Cas nuclease. Em algumas modalidades, uma composição de LNP é englobada compreendendo: um componente de RNA e um componente lipídico, em que o componente lipídico compreende um lipídeo de amina, um lipídeo neutro, um lipídeo auxiliar e um lipídeo furtivo; e em que a razão de N/P é de cerca de 1 -10.

[00396] Em alguns casos, o componente lipídico compreende Lipídeo A, colesterol, DSPC e PEG-DMG; e em que a razão de N/P é de cerca de 1-10. Em algumas modalidades, o componente lipídico compreende: cerca de 40-60% em mol de amina lipídica; cerca de 515% em mol de lipídeo neutro; e cerca de 1,5-10% em mol de lipídeo PEG, em que o restante do componente lipídico é o lipídeo auxiliar e em que a razão de N/P da composição de LNP é de cerca de 3-10. Em algumas modalidades, o componente lipídico compreende cerca de 50 a 60% em mol de amina lipídica; cerca de 8-10% em mol de lipídeo neutro; e cerca de 2,5-4% em mol de lipídeo PEG, em que o restante do componente lipídico é o lipídeo auxiliar e em que a razão de N/P da composição de LNP é de cerca de 3-8. Em alguns casos, o componente

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91/156 lipídico compreende: cerca de 50-60% em mol de amina lipídica; cerca de 5-15% em mol de DSPC; e cerca de 2,5-4% em mol de lipídeo PEG, em que o restante do componente lipídico é colesterol e em que a razão de N/P da composição de LNP é de cerca de 3-8. Em alguns casos, o componente lipídico compreende: 48-53% em mol de Lipídeo A; cerca de 8-10% em mol de DSPC; e 1,5-10% em mol de lipídeo PEG, em que o restante do componente lipídico é colesterol e em que a razão de N/P da composição de LNP é 3-8 ± 0,2.

[00397] Em algumas modalidades, o vetor pode ser distribuído sistemicamente. Em algumas modalidades, o vetor pode ser distribuído na circulação hepática.

[00398] Em algumas modalidades, o vetor pode ser distribuído sistemicamente. Em algumas modalidades, o vetor pode ser distribuído na circulação hepática.

III. Recitação de Certas Modalidades [00399] Em algumas modalidades, a invenção compreende uma composição compreendendo um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129. Em alguns casos, uma composição compreendendo um RNA guia compreendendo uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91 % ou 90% idêntica à uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é fornecida.

[00400] O RNA guia pode ser pelo menos parcialmente complementar a uma sequência alvo presente no gene SERPINA1 humano.

[00401] O RNA guia pode direcionar uma nuclease para uma sequência alvo que está no éxon 2, 3, 4 ou 5 do gene SERPINA1 humano.

[00402] Em algumas modalidades, o RNA guia dirige uma nuclease para uma sequência alvo que está no éxon 2 do gene SERPINA1

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92/156 humano. Em alguns casos, o RNA guia que tem como alvo o éxon 2 é selecionado de CR001370, CR001373, CR001374, CR001376, CR001379, CR001380, CR001386, CR001386, CR003196, CR001391, CR003198, CR001395, CR001397, CR001400, CR001404, CR001405, CR003208, CR001409, CR001413, CR001421, CR001422 e CR001427 [00403] Em algumas modalidades, o RNA guia dirige uma nuclease para uma sequência alvo que está no éxon 3 do gene SERPINA1 humano. Em alguns casos, o RNA guia que atua no éxon 3 é selecionado de CR001450, CR003214, CR001453, CR001454 e CR003217.

[00404] Em algumas modalidades, o RNA guia dirige uma nuclease para uma sequência alvo que está no éxon 4 do gene SERPINA1 humano. Em alguns casos, o RNA guia que atua no éxon 4 é selecionado de CR003225 e CR003226.

[00405] Em algumas modalidades, o RNA guia dirige uma nuclease para uma sequência alvo que está no éxon 5 do gene SERPINA1 humano. Em alguns casos, o RNA guia que atua no éxon 5 é selecionado de CR001475 e CR001476.

[00406] Em alguns casos, o RNA guia é um guia duplo (dgRNA). O guia também pode ser um RNA guia único (sgRNA).

[00407] Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA compreendendo qualquer uma das sequências guia descritas na presente invenção e compreendendo ainda uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 140, em que os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140 seguem a sequência guia na sua extremidade 3. Em algumas modalidades, um RNA guia duplo compreende ainda um trRNA.

[00408] Em algumas modalidades, a invenção compreende um sgRNA compreendendo uma sequência selecionada de SEQ ID Nos: 130-139, ou 408.

[00409] Em alguns casos, o sgRNA compreende uma sequência guia

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93/156 que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91 % ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID Nos: 130-139, ou 408.

[00410] A invenção compreende um sgRNA compreendendo os nucleotídeos de SEQ ID NO: 130, em que N é qualquer nucleotídeo natural ou não natural e em que os N's formam coletivamente uma sequência guia que tem como alvo Cas9 para o gene SERPINA1.

[00411] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma sequência guia selecionada de qualquer uma das SEQ ID Nos: 5-129.

[00412] Em algumas modalidades, um sgRNA compreendendo qualquer uma das sequências guia de SEQ ID Nos: 5-129 e os nucleotídeos de SEQ ID NO: 408 é fornecido.

[00413] Em algumas modalidades, a sequência guia é codificada em um vetor. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende uma sequência guia que é complementar a uma sequência alvo na fita positiva de SERPINA1. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende uma sequência guia que é complementar a uma sequência alvo na fita negativa de SERPINA1.

[00414] Em algumas modalidades, os RNAs guia compreendendo uma sequência guia compreendem ainda uma segunda sequência guia, em que a primeira sequência guia é complementar a uma primeira sequência alvo na fita positiva do gene SERPINA1 e a segunda sequência guia é complementar a uma segunda sequência alvo na fita negativa do gene de SERPINA1.

[00415] Os RNAs guia da invenção podem ser modificados. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado por 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre os nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades,

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94/156 a modificação compreende um nucleotídeo abásico invertido.

[00416] Em algumas modalidades, a modificação está em um ou mais dos primeiros cinco nucleotídeos na extremidade 5'. Em algumas modalidades, a modificação está em um ou mais dos últimos cinco nucleotídeos na extremidade 3'.

[00417] Em algumas modalidades, a modificação compreende ligações de PS entre os primeiros quatro nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação compreende ligações de PS entre os últimos quatro nucleotídeos. O guia modificado por PS pode compreender ainda nucleotídeos modificados em 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' e nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3'.

[00418] Em algumas modalidades, o RNA guia compreende os nucleotídeos modificados de SEQ ID NO: 408.

[00419] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição ou formulação compreendendo qualquer um dos RNAs guia descritos e um excipiente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

[00420] Em algumas modalidades, é fornecida uma composição compreendendo um RNA guia como descrito na presente invenção associado a uma nanopartícula lipídica (LNP).

[00421] A composição pode compreender ainda uma proteína nuclease ou um mRNA que codifica uma nuclease.

[00422] Em algumas modalidades, a nuclease é Cas. Em algumas modalidades, a Cas é Cas9. Em algumas modalidades, a Cas é Cpfl. Em algumas modalidades, a nuclease é nickase. Em algumas modalidades, a nuclease é modificada. Em algumas modalidades, a nuclease modificada compreende um sinal de localização nuclear (NLS).

[00423] Em algumas modalidades, o Cas é do sistema CRISPR/Cas Tipo-I, Tipo-ll ou Tipo III.

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95/156 [00424] Em algumas modalidades, um método de indução de uma quebra de fita dupla (DSB) dentro do gene SERPINA1 é fornecido compreendendo a administração de qualquer um ou mais dos RNAs guia, composições ou formulações descritas na presente invenção.

[00425] Em algumas modalidades, um método de modificação do gene SERPINA1 é fornecido compreendendo, distribuir uma proteína Cas ou um ácido nucleico codificando uma proteína Cas e qualquer um ou mais dos RNAs guia, composições ou formulações descritas na presente invenção.

[00426] Em algumas modalidades, é fornecido um método de tratamento de AATD compreendendo, administrar uma proteína Cas ou um ácido nucleico codificando uma proteína Cas e qualquer um ou mais dos RNAs guia, composições ou formulações descritas na presente invenção, tratando desse modo AATD.

[00427] Em algumas modalidades, um método para reduzir ou prevenir a acumulação de AAT no fígado de um sujeito é fornecido compreendendo, administrar uma proteína Cas ou um ácido nucleico codificando uma proteína Cas e qualquer um ou mais dos RNAs guia, composições ou formulações descritas na presente invenção, reduzindo desse modo a acumulação de AAT no fígado.

[00428] Em algumas modalidades, a ATT é reduzida ou evitada nas células do fígado. Em algumas modalidades, as células do fígado são hepatócitos.

[00429] Em alguns métodos e modalidades de uso, o sujeito tem AATD.

[00430] Em algumas modalidades, a junção de terminação não homóloga (NHEJ) conduz a uma mutação durante a reparação de um DSB no gene SERPINA1. Em alguns casos, a NHEJ leva a uma deleção ou inserção de um nucleotídeo(s) durante a reparação de um DSB no gene SERPINA1. Em algumas modalidades, a deleção ou inserção de

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96/156 um nucleotídeo(s) induz uma mudança de estrutura ou mutação nonsense no gene SERPINA1.

[00431] Em algumas modalidades, a administração reduz os níveis de alfa-1 antitripsina (AAT). Os níveis de AAT podem ser medidos no soro, plasma, sangue, líquido cefalorraquidiano ou escarro. Os níveis de AAT podem ser medidos no tecido hepático.

[00432] Em alguns métodos e usos, o sujeito é humano. O sujeito humano pode ter deficiência de alfa-1 antitripsina (AATD). O sujeito pode ter uma história familiar de AATD. O sujeito pode ter sintomas hepáticos e pulmonares de AATD. O sujeito pode ter apenas ou predominantemente sintomas hepáticos de AATD.

[00433] Em algumas modalidades, o sujeito expressa AAT tendo uma mutação E342K. Em algumas modalidades, o sujeito tem pelo menos um alelo Z no lócus de SERPINA1. Em algumas modalidades, o sujeito tem pelo menos um alelo S no lócus de SERPINA1. Em algumas modalidades, o sujeito é homozigótico para o alelo Z no lócus de SERPINA1. Em algumas modalidades, o sujeito é heterozigótico para o alelo Z no lócus de SERPINA1. Em algumas modalidades, o sujeito tem um alelo Z e um alelo S no lócus de SERPINA1.

[00434] O sujeito pode não ter uma mutação E342K na sequência de aminoácidos de AAT, mas ainda tem um nível reduzido de AAT do tipo selvagem.

[00435] Em algumas modalidades, após administração, o sujeito pode ter uma melhoria, estabilização ou abrandamento de edema, ascite ou icterícia, ou um atraso na necessidade de transplante de fígado. Em algumas modalidades, após administração o sujeito tem uma melhoria, estabilização ou abrandamento de mudança como medida por métodos de imageamento ou níveis de enzima no fígado como resultado da administração.

[00436] Qualquer um dos guias, composições ou formulações

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97/156 farmacêuticas descritos na presente invenção podem ser administrados através de um vetor viral [00437] Qualquer uma dos guias, composições ou formulações farmacêuticas descritos na presente invenção pode ser administrado via nanopartículas lipídicas.

[00438] Em algumas modalidades, o sujeito é testado quanto a mutações específicas no gene SERPINA1 antes de administrar o guia, a composição ou a formulação.

[00439] Em algumas modalidades, os usos de qualquer um dos guias, composições ou formulações descritas na presente invenção para a preparação de um medicamento para tratar um sujeito humano tendo AATD são abrangidos.

[00440] Esta descrição e modalidades exemplificativas não devem ser consideradas limitativas. Para os propósitos deste relatório descritivo e reivindicações anexas, salvo indicação em contrário, todos os números expressando quantidades, porcentagens ou proporções, e outros valores numéricos usados no relatório descritivo e reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todas as instâncias pelo termo cerca de”, na medida em que eles já não são tão modificados. Consequentemente, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados no seguinte relatório descritivo e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se pretende obter. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina dos equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve, pelo menos, ser interpretado à luz do número de dígitos significativos relatados e pela aplicação de técnicas comuns de arredondamento.

[00441] Nota-se que, tal como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares um”, uma” e o, a”, e

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98/156 qualquer uso singular de qualquer palavra, incluem referentes plurais a menos que expressamente e inequivocamente limitados a um referente. Como usado na presente invenção, o termo '1ncluir”e as suas variantes gramaticais pretendem ser não limitativos, de tal modo que a recitação de itens em uma lista não seja para exclusão de outros itens semelhantes que possam ser substituídos ou adicionados aos itens listados.

EXEMPLOS [00442] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar certas modalidades divulgadas e não devem ser interpretados como limitando o escopo desta descrição de qualquer forma.

Exemplo 1 - Materiais e Métodos

I. Transcrição in vitro (IVT) de RN Am de nuclease [00443] O Streptococcus pyogenes de terminação e poliadenilado ('Spy’) Cas9 mRNA contendo Nl-metil pseudo-U foi gerado por transcrição in vitro com o uso de um molde de DNA de plasmídeo linearizado e T7 RNA polimerase. O DNA de plasmídeo contendo um promotor de T7 e uma região de poli (A/T) de100 nt foi linearizado por incubação a 37Ό durante 2 horas com Xbal com as seguintes condições: 200 ng/pL de plasmídeo, 2 U/pL de Xbal (NEB) e tampão de reação I x. O Xbal foi inativado aquecendo a reação a 65^QC por 20 min. O plasmídeo linearizado foi purificado a partir de sais de enzima e tampão com o uso de uma coluna de rotação maxi de silica (Epoch Life Sciences) e analisado por gel de agarose para confirmar a linearização. A reação de IVT para gerar mRNA modificado com Cas9 foi incubada a 37Ό durante 4 horas nas seguintes condições: Plasm ideo linearizado a 50 ng/pL; 2 mM de cada um dentre GTP, ATP, CTP e Nl-metil-pseudoUTP (Trilink); 10 mM de ARCA (Trilink); 5 U/pL de T7 RNA Polimerase (NEB); 1 U/pL de inibidor da RNAase de Murino (NEB); 0,004 U/pL de pirofosfatase inorgânico de E. coli(NEB); e tampão de reação 1 x. Após

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99/156 a incubação de 4 horas, o TURBO DNase (ThermoFisher) foi adicionado a uma concentração final de 0,01 U/pL e a reação foi incubada por mais 30 minutos para remover o molde de DNA. O Cas9 mRNA foi purificado da enzima e nucleotídeos com o uso de um kit de limpeza de transcrição MegaClear de acordo com o protocolo do fabricante (ThermoFisher). A concentração do transcrito foi determinada medindo a absorbância da luz a 260 nm (Nanodrop) e o transcrito foi analisado por eletroforese capilar por Bioanlayzer (Agilent).

[00444] Para os experimentos descritos nos Exemplos 2 e 3, foi usado um molde de DNA de plasmídeo compreendendo SEQ ID NO: 422 para gerar o IVT Cas9 mRNA. Para os experimentos descritos nos Exemplos 4 e 5, um molde de DNA de plasmídeo compreendendo a SEQ ID NO: 423 foi usado para gerar o IVT Cas9 mRNA.

[00445] Sequência de DNA usada para gerar mRNA de IVT usado nos Exemplos 2 e 3 (SEQ ID NO: 422):

T A AT ACC. < AC 1C ACT AT ÀtKiCíTCCCGC. AGTC GGC'GTCC ACXXKK'TC' t t.sC

F IX» I ’ .1 '< 'ti 1 Ti K i ϊ ü I. ti Ft ts Γ .1 tit' AtMXX: TI AT Ft^: tMJ AICt.: A.Ft A iA. .1 ’ A At jAM»^: IAt' I

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CAAICX'XjGCTGGATATCGGAAC·^^^^

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101/156 acxxxagccxiwxgaggatcgcgagatgatcgaggagaggcttaagacctac CXTCAIXTCTTGGáGGATAACXíTCAIXjAAàCAACTCAAGCGGüGGGíXíTAGACTG ÍZl{XKAX:íXAXj/IVK::<XA:X':AÀ<Z7f/ArèAAÇ(XnAntXX)GArAÀACA«AíXAj GrAAAAÇTATÍXWGGAWHXiTÇAAAlXXXsAXXFGCnXXXXAAlX^GTAAÇFTÇAF GCÁATIGAT€CAGGACGACÀíXCXGACCTrTÀ.A<XA(XA.CAXeCAAAAA<XÀGA ÀGTGTC<XXFAjACAXWXX'lXXCTCjAT<XACACÁT(XXXsÁATÇTGG<XXsGTrc <ΚΧ:<ΧΧΑΑ1Ί;ΑΑ0ΑΑ<Κ:Κ>Α.ΑΤΊΧ:ΤίΚ::ΑΑΑ€πΐϊαΑΑ0^ΠΧΚΛ^:Τ<Χ:ϊΑ<ΧΛΑ0(:'ΑΧ:η GAAÍ.XrFCA1XAX3ÁCGGCA€.AAÀCCX.XMGAATATXXílXi.ÀTTGÀAÀTGGCCÍXSAGA AAAGGAGACTAfX;CAXsAAG(XX'GAGAAAAArTCCX'<K;GAAAGGAXXsAA.GfXXsA T<X5AAòÀÀ<?GAÂTjAAGGÁGjTGGGCX<X'€AGATGCTGÁ.AAGÁGCACCCXXf'FG GAAA.A<Á^<A;X:AG(rFCX:AG.AACGAGÁA<X?KrrAGeTGTACTAn^;WiAÁAATOGA CGFH^íACAIXFFáGGTFXIàíXFAAGAGCTGGAÜAIXFAATCGGTG+TGTGATTACGAC GK$GMX;ACA.I'<XVT'XCAGAGlW€'t'TTCTGA.AGGA:lGA€Ix:(M'KX'?A'IAA€AAGG TGTFGAC1XAA AGÍ GÁ(FAAGAAFFAGACXXiAAGTWAGA'rAAKGXXXAlX'GGAGG AGí:n<AirGAA<<AAGAXGAAGÀA'rXACOK'<OM.G(;i€(::TGAAKKX:rÁA(XTHU TTAtXGAGAGAAAGrrTGACAATCTCAGIAAACA'CGAGCCXXKXiXSACTCTCAG ACXTGGATAAGGCTGGAHC/ATCAAAGGGC AG€ rGGTCGAGAGlXXKXAGA ΠΆ ε(Χ.Α<ΧΑΓ(ΜΧΧΧΧ:Α«Α1Χ:·ΠΧΚΧΑϋΓ€<ΧΧΧΑ1ΧίΑΑ€Α€'ΤΑΑΑΤΑ€αΑ(:ΧΑ<ΪΑ àCCtATAAGCTGATíXGGGAAGTOaAGGTGATTACGCTGAAAAGCâAACTTGTGF CFAiACFri/'G^XAjAAtXMCJAICAG'riXl'AtXAAGKFAGAGAAATCAAiXACrACC ATCÁ<X(XXXTG.A<¹G<'^:AT:MC3X/XAj(X7'GT<KGXXKG'ÀC(XXCÇTGATCAAAA AG'fAXXX;l'AAAC;rrítÀAT«XK>ÀG-niGTGTA<XKíAGAC-rACAA<X?K'TACGACGl· GAGGAAGAIXXVrAGCCAAG'KXGAAGAiXiAAATajGGAAAGCAACXXGAAAr ACnVrmAC:XAAACAiXATGAA GGAGAAATCAGGAXGAGG<''€A€'rGATCGAAAC'rAACGGAGAAACGGG€GAAAr eGTG^:TGGGACAAGGG€AG<XXXTCGCAACTGTTCGCAAA.GrGOX:'T€TATG<X:Xj éAÁGTTAÀrA'ríG'rGAAGAAAA€€GAÀGTG€AAAC<MGCGGA'rrFKXAAGGÀA ΐΧΑΛΑΊΧΧΊΧΑ:χ:ΑΑΑβΑ0ΑΑΑ·ΓΑίΧ^:<^^(ΧΑ<Α::·χΑΊΊ<Χ WÇ/XAA.GAAAGAtMXi GAFXí CXACiAACAArGGACAiAlX GÁTWCAX GACÍÍX <A A ÍAf FO. GX( ί<:(> GMJTGWÜCÀAGGTÜGAGAÀtKXlAÀAGAGGAAÀAAGCTCAÀÂTCGGTÜÂAÀGAG X'lXXGKXKjlTl'A<X/A:rCMlXKXÁÀíXFA.r(:X:iXXFrTCGAGÀAÒÂAC(XGATTGAX-r r<x:FrF:GAG(XX:iAAiXXFr'rx:\AAG(^Àí:xFix:_!A.AGAAG(FA:iiGX:>A.FFW'i<;AAAí:ixx? C<ÁXÁ<n'AC'rCACTO'n'CGAA(rrGGAA.AA-rGGTCGGAAGajCATGCr(XXFI(XSOC eCKSÀGAACTCCAÀAAACXíAAATGAGGXAXXTTGCGTAGÜAAGTACGTCAACTT

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T. A AT.ACGACTG.ACIATAGGG ICCGGCAGTCGGCGrCCAGCGGClCTGG TTGTrCGTGTGT^TGTCGTTGGAGGCCTTATTÇGGÁTCCÀTGGÀTAACyAAGTACT ( ' AA' ΓίΧΚΚΧ ’ TGC .i A'F AT (XX ü A Aí' TA A' ΓIX X' G' G,sGGT Γ( X Ksí' AGT GAI CAG (X? A l'G .AATAGAAAGTGGGGTCÜAAGAAGTTCAAGGTGGXGGCXíÂAGAGCGATAGACAèA <X:ATCAÀ.GÀAAÀÀTC7rCATCGGÀ<KX:CTGCT(3TTTGAGTCCGG€'KiAA.À.CCGCAG A AGCGA CÇÇGGÇTÇ A A A(X j T ÁÇCÍ.XX} AGGCG ACGO A C ACXXXKX'GG A AG AATC GCAlX'IXX/FAlGl^GCAAGAGAlTTA'l'IGGAAGGAAATGGCAAAGGtCGACXiACA (XXiryrCGAGCGCXMXAAGAATCnTGGTGG'FGGAGGAGGAGAAGAAGCATG AACG(X:AITX'rATGrrKXiAAACA'TCGKX(A<X/AAG'rGG(:GT:À('CA(XMAAAGT A€XXXiA(X'A.TCTA€<HATCTG<XK}AAGAAG^>n'G(íTrGA€K:AA€TGÁCA.AGG<-ÍXi ACGT'GAGATTKIAT€rAenXXX:XX'K:G(XX:.ATA'lXsXKjAÀA'rWCGéGGÀCACTr (:x;iGAKXíAAGGGGA'rClGAA(X('GXjA'FAA('.'r(X:GA<XHGGA.IAAGCT'rriIX'IT (XACTGGT<XAGAC<:TACAA(XAA(''TGirCGÀAGAAAA€€C<^Al'CAAlG€TA(X· (X í CGTCG A Ϊ í .XUA A Gí .?(X' AT£X?TGTCC £. X(XX?G( A GTG GA AGTGGCGCKXXÇTÇG .VAAÀ(X:'r(íA'iX'G(:A(. AG(.:'rG(X.GGGÀ(íA(i/\AAAAtsÀA(,XX3;X..:r Γ( í(.'(ΧΚ, ΑΑΤ'Γ IGArCGtXí/IUK'ACTGQGAFK Acrccc A ΑΠΊΤ AAGTCCAArrnGAGG TGGCC GAGGAC'GC<3AAGCtGCAA€TCTCAAAGGA.CAXCT.ACGACGACGA€TTGGACAA'T

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TTCXWK'ACAAAXTGC;XXATC.AG'FAC<KXX:AK:TGT'FCC;:TTGCUGCTA.AGAACC 'rn'C(XiA(XX'^:A>XFCTKiC'FGKXXsA'FATCC'.F<KXXXiTGAACACCGAAATAACCAA A GC XsCX'G UTT AC XX X X ,'X O>AT€s ATTA AGC GC J FAC XI At X > AGU A' tCACX i AGÇ AIC : T CAtXK'TCXXCAAAWGCX'CGKsAClACAGCAAC'KsCCTGAAAAGTAUAACKJAUAT CTTCTFCGACX/ACFÚCAAGÁATGGGTs^CGCÁGFXíTXCATCGArGGAGtsCGCTAG CX'AtX:UÂGAGT'GTFATAAGlKCÀ'K'AAGCCAÂlÇtXGÇAAAAGAnKtACGGAÂÇ CG A AG A ACTGC7GGTC A AGCTGAAC A GGG AGG A'FCTGC Ft'C GG A A AC AGAG A. AC (/rTXX.íAt'AA(:^:CXÍAl<X.A^>í'lC;CtX:ÀCUAC>AFCt:AÍX:lWCs7'tCAGt_FTGC;A<XXX2A^:Í'C TTGCGGCGCC ACsG AUG ACTTTTA.CCÇ ATFCCTC A AGG AC A ACXXKsG A A A A GATC gagaaaaxiytgaccxfixxxx;atccccjTattacgtgxkxx'::cact(xk:(Kxaxxx:a A I.' I i.X f(.X iCX' s t.XX .X jr ,1'GG A 1t i At: 1 AG A A.AAT(. AG AGG A A AtA' A FC AC i. iX ΓIGG A Al IXCGaGGAAG S IG IGGA S AAUGGACX I FCtXXACAAAGC ΓΓΟ.Α 1CGAACGAA T G ACC A ACTTCC s AC A AG A ATUTCCC A A AC Xs AGA ÀGGTGC TTCC T AAGC AC'AC >CU Xt.xrrrTXCGAATACinXXCTGirXÁ.CAAíXsAAClK/ACXÀAAGTGAAATACGVrAC;

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TTACXCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTC'TCAG AGC'RKfXr'AA(KXTGGxrX:ATCAAACGGCAGC'l'GGrCGAGACTCG(X'AGAT'FA CÇA.AtX:^!AÇ€/r<KKXKYGÀTürT<X/A.C'rC( iXXCAFGAArAC ΓΑAATÀtXMCGAGA ACGATâAGCTÇATCCGCXíAàGTGaáGÇTGáTTAÍXCIGAAàAKXíAAAÇTTGTÇT CXXsACTTTCGG A AGGá CTTTC AGTTTT AC A A AGTG AGAGa. A ATC A A CAACT ACC ATC àCGCCYàTÜACCa : ATACCTC A ACGCTGI GGn/GG'r ACCÒCCCIOATC A A A A AGTAÇCCTAÀACFrGAAAXXX-íAGnMGXGAÇGGAGAÇTACAÀGGTCTACX^CGT GAGGAAGAT<tATA<.KX.'AAGT<XXiAA€AmX\AATCGGGAAAGCAACT<KXU.AAT ACTrCT'm\ÀCrCAAA€AlTÁTGAAÇTTlTTCAAGACTGAAATrA€üCTàGCCÀÀT GGAGAAAK.X.GGAAGAG(XX'AC'rGAlX?GAA.ACTAAÜ<K'íAGAAACGG<KX7AAAT C/tlGlXAXGrAACKXK Α<ΧΗ}ΑΧΊΤ(ΧΧ ΧΑ(ΠϊΓΠ( <Η;AAA(GXA KACIA KKAÜ 0ΑΑ<.?Τ€ΑΑΤΑΪΤ<ΠΧΜΑ<1ΑΑΑΑίΧΧ1ΑΑ0Τ<ΚζΑΑΑ<ΧΧ.Κ.ΚΧΚ1ΑΤΓΠΧ'ΑΑΑ<ΚΜΑ 'WGAT'C€'XCCAAAGAG.AAATAGCGAC.AA<X'1X:AT'F(XAC<X-AAGA.AAGAC1'GG GACa:GAAaAAGWXKM<K»A1XaMTn;<KXXMOiaXXKXVrA(?T(XXH'a?T(?G XGG tGC A.; O A A< K í K X < AG A AúGG A A A( ? Aà A; A A A A A< A.; TC A A AIX X ..X r K IA.A AG AG CKK;T<AXK:íATTÀ<XATÇÂT€KjAÀ<XkATCTCXHTCXíAGAAGAACXXX?ATTGàTT IXXTXGAGtKGAAGGGITACAACKmXG'GAAGAAGGAn/TX/AWATCAAACTCC CCiAAÕTAClCAClOrrCGAACTGGAAAAKA^írCGGAAGCGXAIGCrGCX/rRXCX (:XX/AÍUA<:T<X/AAAAAWAAA^>r<M<XXTXXX:”nGCCTAÇCAAGr.ACGT<:AA.CrT CX:'rÇl'ATC1TXAynXX?CAÇilACXÍÀAAAAClX/^:VÀAGGG1X\AÇC<XJÀAGAlAACÇA ACAGAAG€A<XTrTrCàIWXGCAG€A(/XAGCArTAKIXXUTGAAAlXA.KGA ACAAA.TCKXXXXGTrriXAAÀiG€XTCTGA.TCXrr(XXCXMCGCX’ÀACCTCGACAÁ.A çiXx;xTrfC:GG<x;TAC.AAfA.ÁG<yTAGAÇATAAÇç(:x:iÁi'CÀGÀGA.AC'AÇÇc<::GAÇ AACAmTOACTOrrGMXXTGACFAACCT^GACKXCCAGCXiGCCm'AAGT ÁCriXYATACTAÇrAltX}À7Ç<X'A.AAAGATAÇACÒTCÇACCAAÇÇÁAGrrCT'GÇA cg<xiac(X;tgxtcx:a(x:aaa<a:xtca€t<xxwtctxcgaaá€taggat('õatct (Η(:<Α/Αί}(?|(ΚΚ/|{ΧΚΤ3ΑΤ<ΑΛ<:ΓΧ(ΧΚ'ΓΓΑ(:<ΧΧΐΑ(:<^<Τ}Τ<4Χ1(?Α<^:1ΑΓί:ΑΧ' IXXKTIXGGATCCXGCKXCXXAAAAAAGAAACGGAACXGGGACCKlATCeCCGAAA .AAGAAGAGAAAGGrGGAÇ/ÇCGGAlXAGAAIXAlXXAGlXrAGCÇAlCACAFri' AAAAG€AíCXX?AG(XX'ACCATGàÕAAI'A.AGA.GAAAGAA.A.AXGA.AGàTCAAX.AGC I'rArixxxxrcTix/ixcix^rrixxrriGGRG'AAAGCCAACACcccrGicrAAAAAAC .ATÁAATrrÇTTTAATCArrrKXÇTÇTrrrÇTÇTGrGÇTKAATrAATAAAAAATG G AA Aü:A AtXGXX .j AU A A A A A AAA A A.A A A A A A A A A A AÀ A.A A A A A A A AAA A A A A A

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2. Modelo de guia de SERPINA1 humano e SERPINA1 humano com modelo de guia de homologia de cinomolgos [00447] A seleção inicial do guia foi realizada in silico com o uso de um genoma de referência humano (por exemplo, hg38) e regiões genômicas de interesse definidas pelo usuário (por exemplo, éxons de codificação de proteínas SERPINA1), para identificar PAMs nas regiões de interesse. Para cada PAM identificado, as análises foram realizadas e as estatísticas relatadas. As moléculas de RNAr foram ainda selecionadas e classificadas com base em vários critérios conhecidos na técnica (por exemplo, teor de GC, atividade prevista no alvo e potencial atividade fora alvo negativa).

[00448] Um total de 88 RNAs guia foi projetado para SERPINA1 (ENSG00000197249.13) tendo como alvo as regiões de codificação de proteínas dentro dos Éxons 2 e 3. Estes 88 guias mais 4 guias de controle (em duplicata) foram colocados em formato de 96 poços. Paralelamente, 51 RNAs guia tendo como alvo os Éxons 2 até 5 de SERPINA1 com 100% de homologia em macaco cinomolgos mais os 4 guias de controle (em duplicata) foram colocados em formato de 96 poços. As sequências guia nos RNAs guia e coordenadas genômicas correspondentes são fornecidas abaixo (Tabela 1).

3. Cas9 mRNA e distribuição de RNA guia in vitro [00449] A linhagem de células de adenocarcinoma de rim embrionário humano HEK293 expressando constitutivamente Spy Cas9 (ΉΕΚ293 _Cas9’) foi cultivada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino e 500 pg/ml de G418. As células foram plaqueadas a uma densidade de 10000 células/poço em uma placa de 96 poços 20 horas antes da transfecção (-70% confluentes na altura da transfecção). As células foram transfectadas com Lipofectamine

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RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram transfectadas com um crRNA individual contendo lipoplex (25 nM), trRNA (25 nM), Lipofectamina RNAiMAX (0,3 pL/poço) e OptiMem.

[00450] A linhagem de células de carcinoma hepatocelular humano HUH7 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, Cat. JCRB0403) foi cultivada em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino. As células foram plaqueadas a uma densidade de 15.000 células/poço em uma placa de 96 poços 20 horas antes da transfecção (-70% confluente no momento da transfecção). As células foram transfectadas com Lipofectamine MessengerMAX (ThermoFisher, Cat. LMRNA003) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram sequencialmente transfectadas com um lipoplex contendo o Spy Cas9 mRNA (100 ng), MessengerMAX (0,3 pL/poço) e OptiMem seguido por um lipoplex individual contendo crRNA individual (25 nM), RNAtraçador (25 nM), MessengerMAX (0,3 pL/poço) e OptiMem.

[00451] Os hepatócitos primários do fígado humano (PHH) (Gibco, Lote # Hu8249) foram cultivados de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, protocolo 11.28.2012). Resumidamente, as células foram descongeladas e ressuspensas em meio de descongelação de hepatócitos com suplementos (Gibco, Cat. CM7500) seguido de centrifugação. O sobrenadante foi descartado e as células peletizadas ressuspensas em meio de plaqueamento de hepatócitos mais pacote de suplemento (Invitrogen, Cat. A1217601 e CM3000). As células foram contadas e plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com revestidas com colágeno I Bio-coat (ThermoFisher, Cat. 877272) a uma densidade de 33.000 células/poço. As células plaqueadas foram deixadas assentar e aderir durante 5 horas em uma incubadora de cultura de tecidos a 37Ό e 5% de atmosfera de CO 2. Após incubação,

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107/156 as células foram verificadas quanto à formação de monocamada e foram lavadas uma vez com meio de cultura de hepatócitos com pacote de suplemento isento de soro (Invitrogen, Cat. A1217601 e CM4000). Em paralelo, o crRNA individual e o trRNA foram pré-recozidos por mistura de quantidades equivalentes de reagente e incubação a 95Ό durante 2 min e resfriamento até a temperatura ambiente. O guia duplo (dgRNA) consistindo em crRNA pré-recozido e trRNA, foi incubado com a proteína Spy Cas9 para formar um complexo de ribonucleoproteína (RNP). As células foram transfectadas com Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram transfectadas com um RNP contendo Spy Cas9 (10 nM), crRNA individual (10 nM), RNA rastreador (10 nM), Lipofectamina RNAiMAX (1,0 pL/poço) e OptiMem.

[00452] A linhagem de células de carcinoma hepatocelular humano HepG2 (American Type Culture Collection, Cat. HB-8065) foi cultivada em meio DMEM suplementado com 10% de sore fetal bovine. As células foram contadas e plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com revestidas com colágeno I Bio-coat (ThermoFisher, Cat. 877272) a uma densidade de 15.000 células/poço em uma placa de 96 poços 24 horas antes da incubação com LNPs, como descrito adicionalmente no Exemplo 4.

4. Isolamento de DNA genômico [00453] As células transfectadas com HEK293_Cas9, HUH7 e PHH foram colhidas após transfecção a 24 ou 48 horas. O DNAg foi extraído de cada poço de uma placa de 96 poços usando solução de extração de DNA BuccalAmp de 50 pL/poço (Epicenter, Cat. QE09050) de acordo com o protocolo do fabricante. Todas as amostras de DNA foram submetidas a PCR e subsequente análise de NGS, como descrito na presente invenção.

5. Sequenciamento de próxima geração (NGS” e análise para

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108/156 eficiência de divagem no alvo [00454] Para determinar quantitativamente a eficiência de edição no local alvo no genoma, foi usado o sequenciamento profundo para identificar a presença de inserções e deleções introduzidas pela edição genética.

[00455] Iniciadores de PCR foram projetados em torno do sítio alvo dentro do gene de interesse (por exemplo, SERPINA1), e a área genômica de interesse foi amplificada. As sequências de iniciador são fornecidas na Tabela 3

Tabela 3: Sequenciamento de Primers para SERPINA1 alvos e controle de crRNAs

Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênci a direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênci a reversa	Sequência Reversa
Controle	CR001261	142	GAGGAGTCCACA GTAGGATTGATT	280	CCATCGGACGATC CTATCTGATTA
Control2	CR001262	143	AGCTAGTTGGTA AGGTCAGTGTG	281	AAATCCTAACTGG GCTGGAAGG
Controls	CR001263	144	AGCTAGTTGGTA AGGTCAGTGTG	282	AAATCCTAACTGG GCTGGAAGG
Control4	CR001264	145	AGCTAGTTGGTA AGGTCAGTGTG	283	AAATCCTAACTGG GCTGGAAGG
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênci a direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênci a reversa	Sequência Reversa
SERPINA1	CR001367	146	TCATGGTGGGAT GTATCTGTCTTC	284	CTTGGCACAGGCT GGTTTAATAAT
SERPINA1	CR001368	147	TCATGGTGGGAT GTATCTGTCTTC	285	CTTGGCACAGGCT GGTTTAATAAT
SERPINA1	CR001369	148	TCATGGTGGGAT GTATCTGTCTTC	286	CTTGGCACAGGCT GGTTTAATAAT

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Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênci a direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênci a reversa	Sequência Reversa
SERPINA1	CR001370	149	GATCCTGATCATG GTGGGATGTAT	287	TTCTTTCAGTGTTA CTGATGTCGG
SERPINA1	CR001371	150	TCATGGTGGGAT GTATCTGTCTTC	288	CTTGGCACAGGCT GGTTTAATAAT
SERPINA1	CR001372	151	GATATTGGTGCTG TTGGACTGGTG	289	GTGTCAATCCCTG ATCACTGGG
SERPINA1	CR001373	152	ATGCTCACTGGG GAGAAGAAGATA	290	TCATCATGTGCCTT GACTCGG
SERPINA1	CR001374	153	ATGCTCACTGGG GAGAAGAAGATA	291	TCATCATGTGCCTT GACTCGG
SERPINA1	CR001375	154	ATGCTCACTGGG GAGAAGAAGATA	292	TCATCATGTGCCTT GACTCGG
SERPINA1	CR001376	155	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	293	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC
SERPINA1	CR001377	156	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	294	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC
SERPINA1	CR001378	157	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	295	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC
SERPINA1	CR001379	158	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	296	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC
SERPINA1	CR001380	159	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	297	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênci a direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênci a reversa	Sequência Reversa
SERPINA1	CR001381	160	GATATTGGTGCTG TTGGACTGGTG	298	GTGTCAATCCCTG ATCACTGGG
SERPINA1	CR001382	161	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	299	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC
SERPINA1	CR001383	162	GGGAGAAGAAGA TATTGGTGCTGT	300	GATCACTGGGAGT CATCATGTGC

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Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênci a direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênci a reversa	Sequência Reversa
SERPINA1	CR001384	163	ATTGCAAAGGCT GTAGCGATGCTC	301	GTCTTGCAGGACA ATGCCGTC
SERPINA1	CR001385	164	ATTGCAAAGGC TGTAGCGATGC TC	302	GTCTTGCAGGAC AATGCCGTC
SERPINA1	CR001386	165	ATTGCAAAGGC TGTAGCGATGC TC	303	GTCTTGCAGGAC AATGCCGTC
SERPINA1	CR001387	166	ATTGCAAAGGC TGTAGCGATGC TC	304	GTCTTGCAGGAC AATGCCGTC
SERPINA1	CR001388	167	ATTTCATCGTGA G TGTCAGCCTT	305	AATGCCGTCTTC TGTCTCGTG
SERPINA1	CR001389	168	ATTTCATCGTGA G TGTCAGCCTT	306	AATGCCGTCTTC TGTCTCGTG
SERPINA1	CR001390	169	ATTTCATCGTGA G TGTCAGCCTT	307	AATGCCGTCTTC TGTCTCGTG
SERPINA1	CR001391	170	ATTTCATCGTGA GTGTCAGCCTT	308	AATGCCGTCTTC TGTCTCGTG
SERPINA1	CR001392	171	CCAGGATTTCAT CGTGAGTGTCA G	309	GAGATGCTGCCC A GAAGACAGATA
SERPINA1	CR001393	172	CTCCAGGATTTC ATCGTGAGTGT C	310	CCAGAAGACAGA TACATCCCACC
SERPINA1	CR001394	173	CGGAATCTCCG TGAGGTTGAAAT	311	CTGCCCAGAAGA C AGATACATCC
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia	Sequência Reversa

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	para)			reversa
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001395	174	CGGAATCTCCG TGAGGTTGAAAT	312	ATGATCAGGATC ACCCAACCTTC
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001396	175	CGGAATCTCCG T GAGGTTGAAAT	313	ATGATCAGGATC ACCCAACCTTC
SEPPI NA1	CR001397	176	TTCATGGATCTG AGCCTCCGGAA T	314	CACCATGATCAG GATCACCCAAC
SEPPI NA1	CR001398	177	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	315	CTGAGTTCGCCT TCAGCCTATAC
SEPPI NA1	CR001399	178	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	316	CTGAGTTCGCCT TCAGCCTATAC
SEPPI NA1	CR001400	179	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	317	CTGAGTTCGCCT TCAGCCTATAC
SEPPI NA1	CR001401	180	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	318	CTGAGTTCGCCT TCAGCCTATAC
SEPPI NA1	CR001402	181	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	319	CCAACAGCACCA ATATCTTCTTCT
SEPPI NA1	CR001403	182	TTATCCACTAGC T TCAGGCCCTC	320	CCAACAGCACCA ATATCTTCTTCT
SEPPI NA1	CR001404	183	AGGCTTCTGAG T GGTACAACTTTT	321	AGTCCAACAGCA CCAATATCTTCT
SEPPI NA1	CR001405	184	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	322	ACAGCACCAATA TCTTCTTCTCCC
SEPPI NA1	CR001406	185	AGGCTTCTGAG T	323	AGTCCAACAGCA CCAATATCTTCT

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			GGTACAACTTTT
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001407	186	AGGCTTCTGAG T GGTACAACTTTT	324	AGTCCAACAGCA CCAATATCTTCT
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001408	187	AGGCTTCTGAG T GGTACAACTTTT	325	AGTCCAACAGCA CAATATCTTCT
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SEPPI NA1	CR001409	188	AGGCTTCTGAG TGGTACAACTTT T	326	AGTCCAACAGCA CCAATATCTTCT
SEPPI NA1	CR001410	189	AI I I ICCCTTGA GTACCCTTCTCC	327	CTGACACTCACG ATGAAATCCTGG
SEPPI NA1	CR001411	190	AI I I ICCCTTGA GTACCCTTCTCC	328	CTGACACTCACG ATGAAATCCTGG
SEPPI NA1	CR001412	191	TTGAGTACCCTT CTCCACGTAATC	329	GATGAAATCCTG GAGGGCCTGAAT
SEPPI NA1	CR001413	192	AI I I ICCCTTGA G TACCCTTCTCC	330	CTGACACTCACG ATGAAATCCTGG
SEPPI NA1	CR001414	193	CCACAAI I I I CC C TTGAGTACCCT	331	ATCCTGGAGGGC C TGAATTTCAAC
SEPPI NA1	CR001415	194	TCTCCACGTAAT C GTTGATCTGTT	332	AAGGCTGACACT C ACGATGAAATC
SEPPI NA1	CR001416	195	TCTCCACGTAAT C GTTGATCTGTT	333	AAGGCTGACACT C ACGATGAAATC
SEPPI NA1	CR001417	196	TCTCCACGTAAT C	334	AAGGCTGACACT C ACGATGAAATC

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			GTTGATCTGTT
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001418	197	AI I I ICCCTTGA G TACCCTTCTCC	335	CTGACACTCACG A TGAAATCCTGG
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001419	198	TCTCCACGTAAT C GTTGATCTGTT	336	AAGGCTGACACT C ACGATGAAATC
SEPPI NA1	CR001420	199	TCTCCACGTAAT C GTTGATCTGTT	337	AAGGCTGACACT C ACGATGAAATC
SEPPI NA1	CR001421	200	AAAACTGTGTCT C TGTCAAGCTCC	338	GAGATTCCGGAG G CTCAGATCCAT
SEPPI NA1	CR001422	201	CCACAAI I I I CC C TTGAGTACCCT	339	GATGAAATCCTG G AGGGCCTGAAT
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SEPPI NA1	CR001423	202	GCAACCTTACCT TTAAAGAAGATG TAAT	340	GGAACTCCTCCG T ACCCTCAA
SEPPI NA1	CR001424	203	GCAACCTTACCT TTAAAGAAGATG TAAT	341	GGAACTCCTCCG T ACCCTCAA
SEPPI NA1	CR001425	204	ACCTTTAAAGAA GATGTAATTCAC C AGA	342	CTTCCAGGAACT C CTCCGTACC
SEPPI NA1	CR001426	205	ACCTTTAAAGAA GATGTAATTCAC C AGA	343	CTTCCAGGAACT CCTCCGTACC

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114/156

SEPPINA1	CR001427	206	ACCTTTAAAGAA GATGTAATTCAC C AGA	344	CTTCCAGGAACT CCTCCGTACC
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001428	207	ACCTTTAAAGAA GATGTAATTCAC C AGA	345	CTTCCAGGAACT CCTCCGTACC
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001429	208	GCAACCTTACCT TTAAAGAAGATG TAAT	346	GGAACTCCTCCG TACCCTCAA
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001430	209	CTTGTTTCTATG G GAACAGCTCAG	347	GGGCCTGAAGCT A GTGGATAAG
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001431	210	CTTGTTTCTATG G GAACAGCTCAG	348	GGGCCTGAAGCT A GTGGATAAG
SEPPI NA1	CR001432	211	CTTGTTTCTATG G GAACAGCTCAG	349	GGGCCTGAAGCT A GTGGATAAG
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SEPPI NA1	CR001433	212	CTTGTTTCTATG G GAACAGCTCAG	350	GGGCCTGAAGCT A GTGGATAAG
SEPPI NA1	CR001434	213	CTTGTTTCTATG G GAACAGCTCAG	351	GGGCCTGAAGCT A GTGGATAAG
SEPPI NA1	CR001435	214	CTTGTTTCTATG G GAACAGCTCAG	352	GGGCCTGAAGCT A GTGGATAAG
SEPPI NA1	CR001436	215	AACTGAAGAATC CACGCTGAAAA	353	TCAGAAGCCTTC A CTGTCAACTTC

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 119/210

115/156

			G
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001437	216	CATGCCTAAAC G CTTCATCATAGG	354	GATGGTCAGTTT C AGCACCI I I IA
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001438	217	GGCATTGCCCA G GTATTTCATC	355	GAGGGATGTGTG T CGTCAAGG
SEPPI NA1	CR001439	218	GGCATTGCCCA G GTATTTCATC	356	GAGGGATGTGTG T CGTCAAGG
SEPPI NA1	CR001440	219	CATTGCCCAGG T ATTTCATCAGC	357	GGAGGGGACTC AT GGTTTCTTTAT
SEPPI NA1	CR001441	220	GTTCAIlli CCA G GTGCTGTAGTT	358	TGGTTTCTTTATT C TGCTACACTCT
SEPPI NA1	CR001442	221	GAGTTCAI I I I C C AGGTGCTGTAG	359	ATTCTGCTACAC T CTTCCAAACCT
SEPPI NA1	CR001443	222	GAGTTCAI I I I C C AGGTGCTGTAG	360	ATTCTGCTACAC T CTTCCAAACCT
SEPPI NA1	CR001444	223	GAGTTCAI I I I C C AGGTGCTGTAG	361	ATTCTGCTACAC T CTTCCAAACCT
SEPPI NA1	CR001445	224	TATCGTGGGTG A GTTCAIlli CCA	362	TACACTCTTCCA A ACCTTCACTCA
SEPPI NA1	CR001446	225	TATCGTGGGTG A GTTCAIlli CCA	363	TACACTCTTCCA A ACCTTCACTCA
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SEPPI NA1	CR001447	226	GAGTTCAI I I I C	364	ATTCTGCTACAC

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 120/210

116/156

			C AGGTGCTGTAG		T CTTCCAAACCT
SE Fl PI ΝΑ 1	CR001448	227	GAGTTCAI I I I 0 C AGGTGCTGTAG	365	ATTCTGCTACAC T CTTCCAAACCT
SEPPI ΝΑ1	CR001449	228	TATCGTGGGTG A GTTCAIlli CCA	366	TACACTCTTCCA A ACCTTCACTCA
SEPPI ΝΑ1	CR001450	229	TATCGTGGGTG A GTTCAIlli CCA	367	TACACTCTTCCA A ACCTTCACTCA
SEPPI NA1	CR001451	230	AGGAACTTGGT G ATGATATCGTG G	368	AAATGGGAGAGA C CCTTTGAAGTC
SEPPI NA1	CR001452	231	CTTCAIlli CCA G GAACTTGGTGA	369	TTTGAAGTCAAG G ACACCGAGGAA
SEPPI NA1	CR001453	232	GGGAATCACCT T CTGTCTTCATTT T G	370	CCTTTGAAGTCA A GGACACCGAG
SEPPI NA1	CR001454	233	GGGAATCACCT T CTGTCTTCATTT TG	371	TTTGAAGTCAAG G ACACCGAGGAA
SEPPI NA1	CR001474	234	CAAAGGGTTTG TT GAACTTGACCT	372	CTATGTGACAGG G AGGGAGAGGAT
SEPPI NA1	CR001475	235	AGGGGAGACTT G GTAIlliGTTCA	373	CTATGTGACAGG G AGGGAGAGGAT
SEPPI NA1	CR001476	236	AGGGGAGACTT G	374	CTATGTGACAGG G

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 121/210

117/156

			GTAIlliGTTCA		AGGGAGAGGAT
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SEPPI NA1	CR001477	237	AGGGGAGACTT G GTAIlliGTTCA	375	CTATGTGACAGG G AGGGAGAGGAT
SEPPI NA1	CR001478	238	AGGGGAGACTT G GTAIlliGTTCA	376	CTATGTGACAGG G AGGGAGAGGAT
SEPPI NA1	CR001483	239	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	377	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
SEPPI NA1	CR001484	240	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	378	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
SEPPI NA1	CR003190	241	GATATTGGTGCT G TTGGACTGGTG	379	GTGTCAATCCCT G ATCACTGGG
SEPPI NA1	CR003191	242	GATATTGGTGCT G TTGGACTGGTG	380	GTGTCAATCCCT G ATCACTGGG
SEPPI NA1	CR003196	243	CAGGATTTCATC G TGAGTGTCAGC	381	CTTCTGTCTCGT GG GGCATCCTC
SEPPI NA1	CR003204	244	GTTGAGGGTAC G GAGGAGTTC	382	ATGATCAGGATC A CCCAACCTTC
SEPPI NA1	CR003205	245	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	383	CTGAGTTCGCCT T CAGCCTATAC
SEPPI NA1	CR003206	246	AAAACTTATCCA CTAGCTTCAGG C	384	CTGAGTTCGCCT T CAGCCTATAC

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 122/210

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SERPINA1	CR003207	247	AGGCTTCTGAG T GGTACAACTTTT	385	AGTCCAACAGCA C CAATATCTTCT
SERPINA1	CR003208	248	AI I I ICCCTTGA G TACCCTTCTCC	386	CTGACACTCACG A TGAAATCCTGG
SERPINA1	CR003217	249	TCACCTTCTGTC T TCAI I I I CCAG	387	GAGAGACCCTTT G AAGTCAAGGAC
SERPINA1	CR003218	250	GTCCCAACATG G CTAAGAGGTG	388	GAAGGTGCCTAT G ATGAAGCGT
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SERPINA1	CR003219	251	GTCCCAACATG G CTAAGAGGTG	389	GAAGGTGCCTAT G ATGAAGCGT
SERPINA1	CR003220	252	TATACAGAGTAG CAGTGACCCAG G	390	TTAACATCCAGC A CTGTAAGAAGC
SERPINA1	CR003221	253	TACAGATACCA G GGTGCAACAAG	391	AGGAGTAAGTGG C AGAAATAATCAG A
SERPINA1	CR003222	254	ATACCAGGGTG C AACAAGGTCG	392	GACACAGGAGTA A GTGGCAGAAAT
SERPINA1	CR003223	255	CCCACACATTCT T CCCTACAGATA	393	CAGAAGAACAAG AGGAATGCTGTG
SERPINA1	CR003224	256	CCCACACATTCT T CCCTACAGATA	394	CAGAAGAACAAG AGGAATGCTGTG
SERPINA1	CR003225	257	TCAGTGAATCAC GGGCATCTTC	395	TCTGCCAGCTTA C ATTTACCCAAA

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 123/210

119/156

SEPPINA1	CR003226	258	GAATCACGGGC A TCTTCAGGAG	396	ACAGGTCTGCCA G CTTACATTTAC
SE Fl PI ΝΑ 1	CR003227	259	TCAGTGAATCAC GGGCATCTTC	397	TCTGCCAGCTTA CATTTACCCAAA
SEPPI ΝΑ1	CR003235	260	GCTCAACCCTT CT TTAATGTCATCC	398	CCTTACAACGTG T CTCTGCTTCT
SEPPI ΝΑ1	CR003236	261	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	399	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
SEPPI NA1	CR003237	262	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	400	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
SEPPI NA1	CR003238	263	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	401	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
SEPPI NA1	CR003240	264	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	402	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
Descrição	ID de Guia (iniciador de sequência projetado para)	SEQ ID de sequênc ia direta	Sequência Direta	SEQ ID de sequênc ia reversa	Sequência Reversa
SEPPI NA1	CR003241	265	ACCCTTCTTTAA T GTCATCCAGGG	403	GATCAGCCTTAC A ACGTGTCTCT
SEPPI NA1	CR003242	266	GCTCAACCCTT CT TTAATGTCATCC	404	CCTTACAACGTG T CTCTGCTTCT
SEPPI NA1	CR003243	267	GCTCAACCCTT CT TTAATGTCATCC	405	CCTTACAACGTG T CTCTGCTTCT
SEPPI NA1	CR003244	268	AAACATGGGAG GGATTTACAGTC	406	CATCGACGAGAA A GGGACTGAAG

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 124/210

120/156

			A
SERPINA1	CR003245	269	GCTCAACCCTT CT TTAATGTCATCC	407	CCTTACAACGTG T CTCTGCTTCT
SERPINA1	CR003246	270	GCTCAACCCTT CT TTAATGTCATCC	409	CCTTACAACGTG T CTCTGCTTCT

[00456] PCR adicional foi realizada de acordo com os protocolos do fabricante (Ulumina) para adicionar química para o sequenciamento. Os amplicons foram sequenciados em um instrumento lllumina MiSeq. As leituras foram alinhadas ao genoma de referência humano (por exemplo, hg38) após a eliminação daqueles com pontuação de baixa qualidade. Os arquivos resultantes contendo as leituras foram mapeados para o genoma de referência (arquivos BAM), onde leituras que se sobrepunham com a região de interesse foram selecionadas e o número de leituras do tipo selvagem versus o número de leituras que contêm uma inserção, substituição ou deleção foi calculado.

[00457] A porcentagem de edição (por exemplo, eficiência de edição” ou edição percentual’) é definida como o número total de leituras de sequência com inserções/exclusões (indels’) ou substituições sobre o número total de leituras de sequência, incluindo o tipo selvagem.

6. ELISA de alfa-1 antitripsina (AAT”) [00458] A linhagem de células de carcinoma hepatocelular, HUH7, foi transfectada como previamente descrito com guias selecionados da Tabela 1. Seis dias após a transfecção, as células foram lavadas uma vez com PBS e depois substituídas por 200 pL de meio DMEM padrão com 10% de FBS. Quatro horas depois, o meio foi coletado e armazenado a -20Ό. Um ensaio CelITiter-GIo ( CTG’) (Promega, Cat. G7570) foi completado nas células aderentes de acordo com o protocolo

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121/156 do fabricante. Os níveis totais de AAT foram determinados com o uso de um kit AAT ELISA (R & D Systems, Cat. DY1268). Os reagentes e padrões do kit foram preparados usando o protocolo do fabricante. Antes de executar o ELISA, o meio congelado foi descongelado à temperatura ambiente e centrifugado a 1000 rpm durante 1 minuto para sedimentar os detritos e depois colocado em gelo. Para o ELISA, 30 pL do meio foram foi diluídos com 70 pL de diluente de análise 1 x. O procedimento de ELISA foi concluído de acordo com o protocolo do fabricante. A placa foi lida em um leitor de placas SpectraMax M5. Os níveis de AAT foram calculados pelo software SoftMax Pro software ver. 6.4.2 com o uso de uma curva logística de quatro parâmetros fora da curva padrão. Os números de células para cada poço foram estimados por comparação com a média da placa com base nos valores obtidos no ensaio de CTG. Os níveis finais de AAT (pg/ml) foram ajustados para o número de células.

7. Análise de proteína AATpor Western Blot [00459] A linhagem de células de carcinoma hepatocelular, HUH7, foi transfectada como previamente descrito com guias selecionados da Tabela 1. Seis dias após a transfecção, o meio foi removido e as células foram lisadas com 50pL/poço de tampão RIPA (Boston Bio Products, Cat. BP-115) mais mistura de inibidor de proteinase recentemente adicionada consistindo em um coquetel de inibidor de proteinase completo (Sigma, Cat. 11697498001), DTT 1 mM e Benzonase 250 U/ml (EMD Millipore, Cat. 71206-3). As células foram mantidas em gelo durante 30 minutos, altura em que foi adicionado NaCI (concentração final de 1 M). Os lisados celulares foram cuidadosamente misturados e retidos em gelo durante 30 minutos. Os extratos celulares inteiros ('WCE’) foram transferidos para uma placa de PCR e centrifugados para sedimentar os detritos. Um ensaio de Bradford (Bio-Rad, Cat. 5000001) foi usado para avaliar o teor de proteína dos lisados. O

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 126/210

122/156 procedimento do ensaio de Bradford foi concluído de acordo com o protocolo do fabricante. Os extratos foram armazenados a -20Ό antes do use. Western blots foram realizados para avaliar os níveis de proteína AAT. Os lisados foram misturados com tampão de Laemmli e desnaturados a 95Ό durante 10 minutes. Os Western Blot foram processados usando o sistema NuPage em géis Bis-Tris de 4 a 12% (Therm ofFisher) de acordo com o protocolo do fabricante seguido de transferência úmida para uma membrana de nitrocelulose de 0,45 pm (Bio-Rad, Cat. 1620115). Após transferência, as membranas foram lavadas cuidadosamente com água e coradas com solução de Ponceau S (Boston Bio Products, Cat. ST-180) para confirmar a transferência completa e uniforme. Blots foram bloqueados usando 5% de leite seco em TBS por 30 minutos em um oscilador de laboratório à temperatura ambiente. Os blots foram enxaguados com TBST e sondados com anticorpo policlonal de coelho α-AAT (Sigma, Cat. HPA001292) a 1: 1000 em TBST. O GAPDH foi usado como controle de carregamento (ThermoFisher, Cat. NB600502) a 1:2500 em TBST e incubou-se simultaneamente com o anticorpo primário de AAT. Os blots foram selados em um saco e mantidos de um dia para o outro a 4Ό em um oscilador de laboratório. Após a incubação, os blots foram lavados 3 vezes durante 5 minutos cada em TBST e sondados com anticorpos secundários para Camundongo e Coelho (ThermoFisher, Cat. PI35518 e PISA535571) a 1:25.000 cada um em TBST durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação, os blots foram lavados 3 vezes durante 5 minutos cada um em TBST e 2 vezes com PBS. Os blots foram visualizados e analisados com o uso de um sistema Licor Odyssey.

8. Formulação de Nanopartículas Lipídicas (LNP) [00460] As LNPs foram formuladas com uma razão de N:P (amina para RNA fosfato) (N:P) de 4,5. Os componentes das nanopartículas

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123/156 lipídicas foram dissolvidos em etanol a 100% com as seguintes razões molares: 45% em mol de lipídeo catiônico (Lipídeo A); 44% em mol de colesterol; 9% em mol de DSPC; e 2% em mol PEG2k-DMG. A carga de RNA (1: 1 mRNA:sgRNA (p/p) foi dissolvida em de tampão de acetato de sódio 25Mm a pH 4,5, resultando em uma concentração de carga de RNA de aproximadamente 0,45 mg/mL. As LNPs foram formadas por mistura microfluídica das soluções de lipídeo e RNA com o uso de um instrumento de bancada Precision Nanosystems NanoAssembl™, de acordo com o protocolo do fabricante. As LNPs foram coletadas em água na razão de 3: 1. As LNPs foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente. O tampão restante foi trocado em Tris 50 mM a pH 7,5 (excesso de 100 vezes do volume da amostra), de um dia para o outro a 4Ό sob agitação suave com o uso de um cassete de diálise Slide-a-LyzerTM G2 de 10 kDa (ThermoFisher Scientific). No dia seguinte, as LNPs foram concentradas com o uso de um filtro Amicon (a 4000g a 4Ό) para o dobro da co ncentração desejada. Elas foram então misturados 1: 1 com 2X TSS (Tris 50 mM, cloreto de sódio 90 mM, sacarose a 10% p/v em pH 7,5). A mistura resultante foi então filtrada com o uso de um filtro de 0,2 μΜ. O filtrado resultante foi armazenado a 2-8Ό.

Exemplo 2 - Triagem e Qualificação de Guia

1. Triagem cruzada de guias de SERPINA1 em vários tipos de células [00461] Guias tendo como alvo SERPINA1 humana e aqueles com homologia em macaco cinomolgos foram transfectados nas linhagens de células HEK293_Cas9e HUH7, bem como hepatócitos humanos primários como descrito no Exemplo 1. A edição percentual foi determinada para os crRNAs que compreendem cada sequência de guia em cada tipo de célula e as sequências guia foram ordenadas com base na maior % de edição. Os dados de triagem para as sequências

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124/156 guia na Tabela 1 em todas as três linhagens de células estão listados abaixo (Tabela 4, 5 e 6) [00462] A Tabela 4 mostra a média e o desvio-padrão para % de Edição,% de Inserção (Ins) e % Deleção (Del) para SERPINA1 e controle de crRNAs na linhagem de adenocarcinoma de rim humano, HEK293_Cas9, que constitutivamente superexpressa a proteína Spy Cas9.

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 129/210

125/156

Tabela 4: Dados de edição de SERPINA1 para os crRNAs expressos em células HEK293 Cas9

ID de Guia	% de Média de Edição	% de Desvio- Padrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de Desvio- Padrão de Deleção
CR00126 1 (Controle 1)	37,14	10,50	29,56	7,80	7,58	2,70
CR00126 2 (Controle 2)	61,12	6,39	6,27	1,02	54,85	5,37
CR00126 3 (Controle 2)	49,83	5,97	4,14	0,71	45,70	5,75
CR00126 4 (Controle 3)	63,96	2,58	12,77	1,85	51,19	2,62
CR00136 7	19,98	1,45	2,35	1,20	17,63	2,22
CR00136 8	33,11	4,48	6,16	2,34	26,95	4,20
CR00136 9	39,81	1,81	18,42	1,08	21,40	1,10
CR00137 0	57,97	6,52	7,76	1,07	50,21	5,61
CR00137 1	35,04	7,59	7,13	1,42	27,92	6,25
CR00137 2	15,72	3,21	8,30	1,95	7,42	1,27
CR00137	45,15	13,06	4,13	0,99	41,01	12,06

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126/156

3
CR00137 4	58,18	5,41	2,56	0,13	55,62	5,54
CR00137 5	7,50	2,34	2,23	0,51	5,28	1,85
CR00137 6	44,31	6,67	7,74	0,64	36,57	6,06
CR00137 7	20,40	4,28	1,27	0,29	19,13	3,99
ID de Guia	% de Média de Edição	% DesvioPadrão Edição	% de Média de Inserção	% DesvioPadrão Ins	% de Média de Deleção	% Desvio- Padrão Dei
CR00137 8	28,03	11,43	3,88	0,83	24,15	10,95
CR00137 9	53,08	2,61	16,18	0,22	36,90	2,39
CR00138 0	46,85	3,14	14,28	2,62	32,57	1,47
CR00138 1	36,58	17,60	8,97	3,66	27,62	14,60
CR00138 2	44,55	11,27	4,13	1,16	40,42	10,40
CR00138 3	30,09	2,46	6,47	6,04	23,62	3,58
CR00138 4	33,33	12,19	6,60	2,35	26,73	10,30
CR00138 5	17,84	2,09	2,90	1,09	14,93	1,01
CR00138 6	28,33	12,64	5,41	2,41	22,91	10,28
CR00138 7	131	0,11	0,31	0,06	1,00	0,05
CR00138 8	31,56	1,55	4,87	1,05	26,69	0,52

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127/156

CR00138 9	30,25	8,10	4,39	0,27	25,86	7,94
CR00139 0	38,70	7,27	2,41	1,21	36,30	6,14
CR00139 1	25,85	4,84	4,73	0,85	21,12	4,33
CR00139 2	38,90	1,94	4,31	0,40	34,59	2,11
CR00139 3	24,37	5,50	3,95	0,59	20,42	5,08
CR00139 4	27,59	7,94	3,81	1,16	23,77	7,03
CR00139 5	64,14	1,93	20,99	1,21	43,16	0,93
CR00139 6	48,47	0,51	4,67	0,25	43,81	0,35
CR00139 7	38,85	5,70	21,07	3,03	17,78	2,92
CR00139 8	50,87	7,83	8,89	2,03	41,98	5,80
CR00139 9	56,30	4,16	7,71	0,18	48,59	4,19
CR00140 0	67,59	1,70	51,60	2,79	15,99	1,64
CR00140 1	32,28	4,65	4,97	0,38	27,31	4,28
CR00140 2	31,10	5,94	5,84	0,66	25,26	5,31
D de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	7o de Média de Inserção	7o de desviopadrão de Inserção	7o de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00140 3	64,84	4,30	10,76	0,12	54,08	4,41
CR00140	73,28	1,88	2,66	0,78	70,63	1,72

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 132/210

128/156

4
CR00140 5	48,44	3,46	23,17	2,64	25,28	3,23
CR00140 6	3,96	5,13	0,07	0,06	3,89	5,06
CR00140 7	20,24	1,38	3,13	0,21	17,11	1,35
CR00140 8	47,19	1,45	5,09	0,84	42,09	0,67
CR00140 9	43,17	6,32	16,98	3,44	26,20	15,26
CR00141 0	32,14	0,53	3,19	0,33	28,95	0,73
CR00141 1	8,61	3,29	1,22	0,25	7,39	3,05
CR00141 2	37,33	7,35	7,38	3,13	29,95	8,09
CR00141 3	43,98	1,38	18,27	1,59	25,72	2,54
CR00141 4	11,37	1,85	7,04	UI	4,33	0,87
CR00141 5	16,17	5,14	1,38	0,34	14,79	4,80
CR00141 6	19,41	3,54	1,51	0,14	17,90	3,44
CR00141 7	24,59	3,79	1,69	0,51	22,91	3,44
CR00141 8	22,23	8,75	3,32	0,64	18,91	8,42
CR00141 9	7,16	2,43	1,96	0,59	5,20	1,84
CR00142 0	16,80	0,67	3,83	0,03	12,97	0,65
CR00142 1	50,60	5,30	16,44	1,91	34,16	3,68

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 133/210

129/156

CR00142 2	46,78	8,39	35,12	4,87	11,65	3,75
CR00142 3	5,71	2,24	3,85	1,72	1,86	0,67
CR00142 4	10,02	5,15	6,63	3,08	3,39	2,13
CR00142 5	11,80	2,11	2,71	0,73	9,09	2,60
CR00142 6	8,24	0,40	1,39	0,40	6,85	0,55
CR00142 7	44,65	2,98	7,44	0,41	37,21	2,59
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00142 8	19,94	6,39	2,17	0,33	17,77	6,07
CR00142 9	29,81	5,32	12,59	2,11	17,22	3,20
CR00143 0	20,87	8,25	2,13	0,44	18,74	7,84
CR00143 1	52,49	10,52	33,80	7,35	18,69	3,61
CR00143 2	21,92	5,22	5,70	0,94	16,22	4,66
CR00143 3	40,95	2,95	23,21	1,30	17,75	1,66
CR00143 4	5,60	1,90	0,72	0,47	4,88	1,44
CR00143 5	18,53	7,21	1,83	1,10	16,70	6,11
CR00143 6	14,88	2,43	1,37	0,16	13,51	7,96
CR00143	39,01	8,82	13,95	3,13	25,06	6,23

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 134/210

130/156

7
CR00143 8	3,68	1,14	0,15	0,05	3,53	1,09
CR00143 9	49,03	5,18	37,60	3,67	11,43	2,08
CR00144 0	34,54	4,15	1,56	0,15	32,97	4,03
CR00144 1	6,54	1,29	1,29	0,45	5,25	0,96
CR00144 2	25,65	3,34	2,78	0,34	22,87	3,09
CR00144 3	25,51	1,41	7,29	0,37	18,21	1,20
CR00144 4	40,41	12,61	15,09	4,07	25,32	8,73
CR00144 5	11,00	3,16	1,94	1,00	9,07	2,70
CR00144 6	53,02	4,58	22,96	2,46	30,06	2,57
CR00144 7	20,10	8,74	3,25	1,64	16,84	7,25
CR00144 8	15,52	3,15	3,20	0,75	12,32	2,45
CR00144 9	27,61	5,69	3,47	1,15	24,14	4,54
CR00145 0	56,61	8,41	28,80	5,02	27,81	3,43
CR00145 1	34,18	20,33	9,40	6,81	24,78	13,52
CR00145 2	51,84	13,15	1,82	0,19	50.Ü2	12,97
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 135/210

131/156

CR00145 3	15,91	6,86	0,69	0,37	15,22	6,49
CR00145 4	20,19	6,08	1,36	0,51	18,83	5,70
CR00147 4	25,96	6,20	12,86	3,64	13,11	2,58
CR00147 5	63,15	3,07	31,61	6,12	31,55	3,31
CR00147 6	54,31	7,67	2,67	1,04	51,64	6,65
CR00147 7	25,52	10,95	6,36	2,70	19,16	8,29
CR00147 8	26,52	8,90	5,60	1,66	20,92	7,24
CR00148 3	28,12	6,12	2,09	1,65	26,03	5,09
CR00148 4	19,76	4,36	3,18	1,25	16,58	3,53
CR00319 0	15,11	0,09	4,36	0,27	10,75	6,21
CR00319 1	25,88	7,98	7,44	2,32	18,45	5,69
CR00319 6	50,52	7,48	9,43	3,74	41,09	4,21
CR00320 4	36,91	7,35	12,61	1,50	24,30	7,38
CR00320 5	17,97	0,98	2,23	0,64	15,74	0,38
CR00320 6	2,46	0,27	0,25	0,40	2,21	0,15
CR00320 7	17,50	3,13	5,54	1,16	11,96	2,07
CR00320 8	55,48	6,45	9,94	1,08	45,54	5,58
CR00321	46,59	4,09	8,48	2,06	38,11	5,42

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 136/210

132/156

7
CR00321 8	26,03	4,39	3,34	1,29	22,70	3,93
CR00321 9	39,80	4,38	7,42	1,66	32,38	2,85
CR00322 0	12,14	1,54	2,24	0,75	9,90	5,94
CR00322 1	13,00	2,59	1,96	1,32	11,05	1,70
CR00322 2	37,01	7,33	2,90	0,98	34,11	20,55
CR00322 3	10,74	1,77	2,19	0,79	8,55	1,84
CR00322 4	26,86	1,86	11,22	0,84	15,64	1,02
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de DesvioPadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00322 5	34,08	7,08	15,46	6,18	18,61	2,36
CR00322 6	38,95	10,09	23,27	8,00	15,68	2,84
CR00322 7	10,78	0,60	3,67	2,38	7,11	1,97
CR00323 5	29,83	10,98	10,64	2,88	19,20	8,19
CR00323 6	38,33	1,77	12,20	2,58	26,13	1,67
CR00323 7	25,91	5,58	9,09	2,64	16,81	3,09
CR00323 8	34,15	4,88	4,18	0,67	29,96	5,16
CR00324 0	20,47	3,55	9,82	2,98	10,65	0,80

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 137/210

133/156

CR00324 1	18,30	4,42	8,32	1,74	9,98	3,67
CR00324 2	13,42	2,02	3,78	0,73	9,63	1,34
CR00324 3	12,14	6,02	1,59	1,14	10,55	4,88
CR00324 4	19,12	3,52	6,50	1,03	12,62	2,56
CR00324 5	12,70	5,33	2,63	I.64	10,06	3,69
CR00324 6	16,04	15,42	0,69	0,10	15,35	15,45

[00463] A Tabela 5 mostra a média e o desvio-padrão para % de Edição,% de Inserção (Ins) e % Deleção (Dei) para o SERPINA1 testado e controles de crRNAs co-transfectados com Spy Cas9 mRNA na linhagem de carcinoma hepatocelular humano, HUH7.

Tabela 5: Dados de edição de SERPINA1 para crRNAs expressos em células HUH7

ID de Guia	% Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00126 1 (Controle 1)	29,28	12,67	19,87	8,98	9,41	3,70
ID de Guia	% Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00I262 (Controle 2)	41,40	7,03	3,16	1,01	38,24	6,05

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 138/210

134/156

CR00126 3 (Controle 3)	26,98	1,18	2,24	0,35	24,73	1,52
CR00126 4 (Controle 4)	44,08	1,15	7,53	0,75	36,55	0,46
CR00136 7	5,47	5,69	0,24	0,31	5,23	5,40
CR00136 8	14,79	2,61	1,19	0,39	13,60	2,25
CR00136 9	17,25	5,72	6,70	I.98	10,56	3,75
CR00137 0	38,46	6,45	5,55	0,75	32,91	5,71
CR00137 1	14,63	4,57	I.63	0,56	12,99	4,14
CR00137 2	10,15	2,06	3,91	0,98	6,24	1,15
CR00137 3	34,70	4,03	1,42	0,33	33,27	3,71
CR00137 4	27,33	2,59	0,99	0,04	26,35	2,62
CR00137 5	4,11	0,21	1,04	0,15	3,07	0,24
CR00137 6	23,15	6,14	5,91	2,24	17,23	3,92
CR00137 7	6,47	1,96	0,45	0,28	6,02	1,69
CR00137 8	14,10	4,19	0,93	0,39	13,16	3,83
CR00137 9	21,90	8,09	7,45	2,73	14,45	5,41
CR00138	24,22	3,87	7,37	1,00	16,85	2,91

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135/156

0
CR00138 1	12,32	8,87	2,73	2,20	9,59	6,69
CR00138 2	17,13	8,79	2,24	1,58	14,89	7,21
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00138 3	7,42	3,28	1,53	0,44	5,89	2,98
CR00138 4	12,96	9,79	2,51	2,03	10,45	7,77
CR00138 5	7,53	4,30	0,78	0,56	6,74	3,75
CR00138 6	23,99	13,56	1,62	0,16	22,37	13,49
CR00138 7	0,90	0,31	0,09	0,07	0,80	0,24
CR00138 8	9,77	3,08	1,87	0,77	7,90	2,37
CR00138 9	16,05	2,28	3,20	0,35	12,85	1,93
CR00139 0	11,73	2,36	0,54	0,20	11,20	2,17
CR00139 1	21,81	6,84	5,36	1,48	16,45	5,41
CR00139 2	11,96	3,02	1,45	0,40	10,51	2,62
CR00139 3	7,00	2,17	0,93	0,44	6,07	1,89
CR00139 4	16,37	7,60	1,40	0,82	14,97	6,84
CR00139 5	30,98	4,33	11,11	0,93	19,87	3,40

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136/156

CR00139 6	14,50	1,19	1,16	0,11	13,34	1,10
CR00139 7	16,50	9,54	6,67	4,03	9,83	5,54
CR00139 8	26,04	3,41	3,41	1,02	22,64	2,69
CR00139 9	35,04	5,14	3,48	0,52	31,56	4,65
CR00140 0	35,61	1,04	24,34	0,65	11,26	0,95
CR00140 1	23,70	2,90	1,73	0,08	21,97	2,90
CR00140 2	19,71	3,39	3,93	0,71	15,78	2,69
CR00140 3	28,18	3,71	4,88	0,43	23,30	3,62
CR00140 4	35,07	2,36	1,02	0,40	34,05	2,03
CR00140 5	21,48	10,19	9,91	4,25	11,57	6,01
CR00140 6	1,66	0,55	0,12	0,05	1,53	0,58
CR00140 7	17,44	1,05	2,35	0,42	15,08	0,73
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00140 8	19,90	8,27	3,29	1,30	16,61	7,08
CR00140 9	26,27	7,85	12,99	4,28	13,28	3,59
CR00141 0	12,89	1,64	0,88	0,17	12,01	1,49
CR00141	4,14	1,05	0,47	0,21	3,68	0,84

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 141/210

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1
CR00141 2	18,60	1,72	3,00	0,15	15,60	1,80
CR00141 3	22,14	3,34	9,37	1,35	12,77	2,00
CR00141 4	5,48	2,42	2,53	1,06	2,95	1,37
CR00141 5	10,49	6,86	0,57	0,45	9,92	6,42
CR00141 6	5,33	4,64	0,35	0,30	4,98	4,35
CR00141 7	11,24	9,48	0,59	0,45	10,64	9,04
CR00141 8	8,53	4,51	1,53	0,78	7,00	3,74
CR00141 9	4,77	2,89	UI	0,65	3,66	2,24
CR00142 0	6,16	4,38	1,12	0,96	5,04	3,43
CR00142 1	18,49	1,49	6,85	0,70	11,64	0,81
CR00142 2	21,46	4,27	15,17	3,34	6,30	0,95
CR00142 3	3,81	1,50	0,94	0,30	2,87	1,22
CR00142 4	5,83	2,81	2,37	1,17	3,47	1,64
CR00142 5	11,32	0,84	0,53	0,05	10,79	0,86
CR00142 6	3,21	1,21	0,31	0,24	2,91	0,97
CR00142 7	35,32	7,09	3,54	1,13	31,78	5,96
CR00142 8	6,98	1,67	0,73	0,27	6,25	1,40

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138/156

CR00142 9	9,58	5,60	3,38	2,03	6,20	3,57
CR00143 0	3,23	1,18	0,27	0,17	2,96	1,02
CR00143 1	17,90	4,70	11,23	3,22	6,67	1,62
CR00143 2	5,57	1,26	1,22	0,52	4,35	0,74
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00143 3	19,93	5,08	6,78	2,31	13,15	2,99
CR00143 4	2,72	0,05	0,17	0,04	2,55	0,08
CR00143 5	12,35	2,33	1,24	0,15	11,10	2,21
CR00143 6	4,89	0,68	0,25	0,11	4,64	0,62
CR00143 7	13,47	6,01	4,01	1,94	9,46	4,11
CR00143 8	3,26	0,83	0,07	0,03	3,19	0,80
CR00143 9	38,53	4,67	27,41	2,79	11,12	1,99
CR00144 0	14,29	4,38	0,97	0,37	13,32	4,02
CR00144 1	5,04	0,88	0,86	0,04	4,18	0,87
CR00144 2	11,04	2,22	0,68	0,19	10,36	2,33
CR00144 3	10,38	0,63	2,83	0,20	7,55	0,74
CR00144	20,77	3,79	2,94	0,53	17,83	3,30

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4
CR00144 5	3,59	0,21	0,42	0,05	3,17	0,16
CR00144 6	14,52	2,62	5,36	1,04	9,16	1,59
CR00144 7	9,86	2,39	1,04	0,10	8,82	2,29
CR00144 8	6,67	0,41	1,64	0,05	5,02	0,37
CR00144 9	10,66	0,26	0,83	0,19	9,83	0,26
CR00145 0	12,69	2,95	6,73	1,61	5,96	1,40
CR00145 1	11,11	3,69	2,83	1,12	8,27	2,59
CR00145 2	19,02	4,47	0,45	0,18	18,57	4,29
CR00145 3	6,70	3,10	0,13	0,06	6,56	3,09
CR00145 4	6,93	3,29	0,19	0,10	6,73	3,19
CR00147 4	14,47	0,59	9,31	0,55	5,16	0,24
CR00147 5	43,17	2,46	13,96	0,38	29,22	2,18
CR00147 6	42,34	3,55	0,92	0,16	41,43	3,69
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00147 7	11,25	1,22	3,62	0,45	7,63	0,82
CR00147 8	12,03	1,27	1,61	0,20	10,41	1,17

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 144/210

140/156

CR00148 3	8,69	0,35	1,12	0,06	7,58	0,33
CR00148 4	11,22	1,44	1,38	0,49	9,83	0,96
CR00319 0	7,94	1,93	1,78	0,42	6,16	1,56
CR00319 1	11,92	0,19	2,62	0,12	9,31	0,29
CR00319 6	12,60	3,00	3,39	0,80	9,21	2,21
CR00320 4	9,27	0,75	3,20	0,35	6,08	0,41
CR00320 5	10,52	2,42	0,71	0,13	9,81	2,29
CR00320 6	1,82	0,33	0,06	0,03	1,77	0,31
CR00320 7	6,73	0,60	2,91	0,35	3,82	0,25
CR00320 8	19,01	0,99	4,05	0,39	14,96	0,62
CR00321 7	19,38	2,40	2,33	0,49	17,04	1,95
CR00321 8	8,49	0,87	0,67	0,14	7,82	0,75
CR00321 9	15,02	2,15	3,33	0,20	11,69	2,06
CR00322 0	4,42	1,05	0,52	0,02	3,90	1,03
CR00322 1	8,04	1,18	0,43	0,15	7,62	1,05
CR00322 2	6,01	1,09	0,38	0,08	5,63	1,02
CR00322 3	4,66	0,97	0,54	0,12	4,11	0,85
CR00322	5,16	1,47	2,22	0,84	2,94	0,63

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 145/210

141/156

4
CR00322 5	13,66	1,72	3,50	0,64	10,16	1,09
CR00322 6	12,33	5,09	4,46	1,99	7,87	3,20
CR00322 7	2,83	0,97	0,61	0,38	2,21	0,60
CR00323 5	12,45	0,76	4,56	0,47	7,90	0,43
CR00323 6	28,21	3,13	2,74	0,30	25,47	2,86
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00323 7	8,44	0,95	1,90	0,28	6,55	0,70
CR00323 8	9,29	1,35	1,53	0,44	7,76	1,02
CR00324 0	13,29	1,41	5,54	0,39	7,75	1,05
CR00324 1	9,17	4,27	3,34	1,98	5,83	2,29
CR00324 2	4,81	0,93	0,90	0,20	3,91	0,74
CR00324 3	6,14	0,75	0,60	0,10	5,54	0,68
CR00324 4	9,75	1,10	2,27	0,23	7,48	0,87
CR00324 5	4,08	1,73	0,50	0,17	3,58	1,58
CR00324 6	6,50	0,38	0,46	0,09	6,04	0,30

[00464] A Tabela 6 mostra a média e o desvio-padrão para % de

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Edição, % de Inserção (Ins) e % Deleção (Del) para SERPINA1 testado e controles de crRNAs co-transfectados com a proteína Spy Cas9 em hepatócitos humanos primários.

Tabela 6: Dados de edição de SERPINA1 para crRNAs expressos em hepatócitos humanos primários

ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de Desvio- Padrão de Deleção
CR00126 1 (Controle 1)	40,90	0,60	19,27	0,70	21,64	0,84
CR00126 2 (Controle 2)	51,93	5,15	3,78	1,65	48,15	3,60
CR00126 3 (Controle 3)	20,68	2,81	1,05	0,70	19,63	2,57
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00126 4 (Controle 4)	53,15	2,78	24,01	1,21	29,14	1,82
CR00136 7	16,20	1,54	0,49	0,07	15,71	1,47
CR00136 8	26,12	3,04	1,06	0,50	25,06	3,41
CR00136	16,05	0,57	2,04	0,27	14,01	0,60

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143/156

9
CR00137 0	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ	ΝΑ
CR00137 1	27,11	4,39	1,10	0,11	26,01	4,49
CR00137 2	10,72	1,40	1,81	0,46	8,91	1,30
CR00137 3	71,53	3,97	0,36	0,11	71,18	3,89
CR00137 4	53,75	6,02	0,87	0,30	52,87	5,91
CR00137 5	3,93	0,44	0,57	0,13	3,37	0,38
CR00137 6	25,88	0,80	7,04	1,20	18,84	0,42
CR00137 7	7,05	2,73	0,24	0,08	6,81	2,69
CR00137 8	23,42	1,52	0,45	0,21	22,97	1,60
CR00137 9	37,64	3,89	4,21	0,10	33,43	3,81
CR00138 0	30,46	7,98	5,22	1,32	25,24	7,02
CR00138 1	43,15	2,52	10,64	1,92	32,51	1,59
CR00138 2	24,10	3,15	1,03	0,36	23,08	3,45
CR00138 3	11,16	4,85	0,54	0,35	10,61	4,50
CR00138 4	25,99	5,70	3,88	0,44	22,11	5,43
CR00138 5	16,36	2,74	1,03	0,39	15,33	2,62
CR00138 6	20,42	1,44	0,96	0,10	19,46	1,45

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144/156

ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00138 7	0,88	0,15	0,06	0,03	0,82	0,12
CR00138 8	10,54	2,37	1,83	0,56	8,71	1,81
CR00138 9	29,43	11,67	1,08	0,77	28,35	10,93
CR00139 0	11,70	2,08	0,25	0,17	11,45	2,05
CR00139 1	36,78	12,41	1,96	1,01	34,82	11,56
CR00139 2	11,80	0,47	0,48	0,22	11,32	0,48
CR00139 3	12,28	1,22	1,16	0,07	11,12	1,15
CR00139 4	37,48	2,80	6,22	0,23	31,26	2,58
CR00139 5	45,91	0,19	12,56	0,92	33,36	0,83
CR00139 6	25,05	3,21	1,64	0,96	23,41	2,25
CR00139 7	37,76	0,32	5,62	0,22	32,14	0,29
CR00139 8	35,27	1,82	6,28	0,46	28,99	2,04
CR00139 9	71,45	1,71	1,67	0,45	69,79	1,33
CR00140 0	64,89	0,27	32,88	1,98	32,01	2,25
CR00140 1	31,26	5,01	1,71	0,54	29,56	5,45
CR00140	26,57	3,19	0,98	0,82	25,58	3,74

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 149/210

145/156

2
CR00140 3	24,34	3,84	10,35	4,25	13,99	0,41
CR00140 4	53,91	3,12	0,72	0,04	53,20	3,08
CR00140 5	24,19	5,35	2,28	1,12	21,91	4,32
CR00140 6	1,66	0,46	0,07	0,05	1,59	0,42
CR00140 7	27,19	2,85	3,42	0,54	23,78	2,54
CR00140 8	36,36	1,15	5,34	0,31	31,02	0,84
CR00140 9	26,69	2,03	15,78	1,89	10,91	0,67
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00141 0	12,88	1,12	0,40	0,10	12,47	1,03
CR00141 1	4,85	0,52	0,11	0,08	4,74	0,46
CR00141 2	23,60	1,98	0,94	0,07	22,66	2,01
CR00141 3	31,95	8,50	4,83	1,47	27,12	7,22
CR00141 4	4,05	0,64	1,42	0,26	2,63	0,55
CR00141 5	24,47	3,35	0,47	0,32	24,00	3,04
CR00141 6	16,10	4,60	0,09	0,07	16,01	4,54
CR00141 7	23,38	5,00	0,70	0,27	22,68	4,75

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 150/210

146/156

CR00141 8	13,00	2,18	1,92	0,47	11,08	2,23
CR00141 9	2,37	0,30	0,33	0,13	2,04	0,22
CR00142 0	2,44	0,52	0,28	0,19	2,16	0,42
CR00142 1	31,76	7,50	7,01	0,99	24,75	6,58
CR00142 2	23,24	5,45	14,63	2,09	8,61	5,36
CR00142 3	3,76	1,80	0,36	0,02	3,40	1,79
CR00142 4	11,27	2,71	1,36	0,55	9,91	2,17
CR00142 5	38,20	1,94	0,45	0,12	37,75	2,05
CR00142 6	8,90	0,45	0,28	0,07	8,63	0,38
CR00142 7	33,70	0,91	0,77	0,26	32,93	0,76
CR00142 8	5,41	0,66	0,68	0,26	4,74	0,88
CR00142 9	20,46	5,24	1,21	0,80	19,24	4,50
CR00143 0	4,53	0,30	0,23	0,15	4,30	0,37
CR00143 1	10,56	2,64	4,04	0,34	6,53	2,58
CR00143 2	7,20	1,54	1,35	0,09	5,85	1,46
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00143	42,38	4,26	4,77	0,54	37,61	3,88

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147/156

3
CR00143 4	1,65	0,46	0,10	0,04	1,56	0,43
CR00143 5	11,24	1,60	0,67	0,19	10,58	1,41
CR00143 6	7,02	0,29	0,22	0,15	6,80	0,24
CR00143 7	15,86	1,38	1,98	0,45	13,88	1,81
CR00143 8	12,27	0,91	0,12	0,12	12,16	0,96
CR00143 9	49,32	2,14	11,45	1,62	37,86	2,53
CR00144 0	12,73	2,81	0,67	0,19	12,06	2,75
CR00144 1	7,62	0,65	0,55	0,21	7,06	0,44
CR00144 2	10,28	1,71	0,44	0,22	9,84	1,90
CR00144 3	11,67	0,45	0,86	0,18	10,81	0,27
CR00144 4	69,19	1,49	7,18	0,17	62,02	1,38
CR00144 5	3,54	1,36	0,51	0,56	3,03	0,81
CR00144 6	33,58	3,50	13,36	3,73	20,21	3,54
CR00144 7	36,92	3,24	2,06	0,75	34,86	3,49
CR00144 8	17,57	1,15	1,61	0,18	15,96	1,25
CR00144 9	39,92	4,34	0,42	0,30	39,50	4,04
CR00145 0	29,49	4,02	11,36	1,31	18,12	4,58

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148/156

CR00145 1	36,02	6,92	3,93	0,78	32,09	6,14
CR00145 2	58,47	3,95	0,35	0,29	58,12	3,79
CR00145 3	12,20	0,67	0,18	0,05	12,02	0,63
CR00145 4	42,15	6,39	0,18	0,07	41,96	6,32
CR00147 4	3,50	0,55	1,10	0,15	2,40	0,44
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00147 5	39,50	5,84	12,54	1,80	26,96	7,64
CR00147 6	61,10	7,94	0,40	0,07	60,70	7,99
CR00147 7	20,94	2,91	3,45	0,64	17,49	2,34
CR00147 8	14,40	3,43	0,72	0,13	13,67	3,30
CR00148 3	16,05	2,18	0,88	0,28	15,17	2,14
CR00148 4	7,21	2,01	0,48	0,33	6,74	1,71
CR00319 0	5,33	0,84	0,39	0,17	4,94	0,85
CR00319 1	10,58	1,38	1,02	0,29	9,56	1,38
CR00319 6	13,42	3,85	1,00	0,81	12,42	3,07
CR00320 4	9,35	2,05	0,91	0,37	8,44	1,74
CR00320	9,17	1,25	0,19	0,12	8,98	1,14

Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 153/210

149/156

5
CR00320 6	1,85	0,04	0,07	0,03	1,78	0,02
CR00320 7	5,18	0,82	1,33	0,42	3,85	0,78
CR00320 8	25,18	6,59	2,17	0,88	23,01	5,82
CR00321 7	28,65	5,18	2,72	0,28	25,92	5,23
CR00321 8	19,42	2,62	0,61	0,32	18,80	2,80
CR00321 9	2305	3,77	6,65	1,74	16,41	2,02
CR00322 0	4,47	0,58	0,73	0,24	3,75	0,55
CR00322 1	27,28	6,03	0,34	0,12	26,95	6,00
CR00322 2	8,96	3,22	0,20	0,20	8,76	3,11
CR00322 3	2,34	0,63	0,08	0,05	2,25	0,58
CR00322 4	6,15	0,89	1,40	0,35	4,75	0,55
CR00322 5	37,34	5,44	2,36	0,26	34,98	5,45
CR00322 6	40,66	8,86	11,85	2,34	28,81	7,97
CR00322 7	4,49	0,87	0,37	0,30	4,12	1,17
ID de Guia	% de Média de Edição	% de DesvioPadrão de Edição	% de Média de Inserção	% de desviopadrão de Inserção	% de Média de Deleção	% de DesvioPadrão de Deleção
CR00323 5	14,85	3,18	0,89	0,55	13,96	2,78

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CR00323 6	49,76	2,18	0,67	0,34	49,09	1,84
CR00323 7	16,95	3,22	2,23	0,62	14,72	2,86
CR00323 8	8,94	1,34	0,52	0,10	8,42	1,26
CR00324 0	18,79	3,80	2,29	0,42	16,50	3,38
CR00324 1	9,49	1,91	1,62	0,50	7,88	1,43
CR00324 2	4,86	0,69	0,53	0,21	4,32	0,82
CR00324 3	4,02	1,43	0,22	0,17	3,80	1,27
CR00324 4	4,61	1,51	0,36	0,30	4,25	1,22
CR00324 5	6,01	3,48	0,44	0,11	5,56	3,41
CR00324 6	8,91	2,65	0,23	0,16	8,67	2,50

[00465] As sequências guia selecionadas de cada linhagem de células foram usadas para criar um painel de 30 crRNAs para análise posterior (Tabela 7). Um desenho esquemático sobrepondo a localização cromossômica dos guias de SERPINA1 selecionados em relação aos Éxons 2-5 é apresentado na Figura 1. A edição percentual e os níveis de secreção de AAT são mostrados na Figura 2.

Tabela 7: Dados de ELISA e Western blot (WB) para crRNAs que têm como alvo SERPINA1 em células HUH7

ID de GUIA	% de Edição	% de Redução de ELISA	% Redução de WB
CR001370	89	78	16
CR001373	86	90	37

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CR001374	84	86	28
CR001376	81	83	42
CR001379	87	78	58
ID de GUIA	% de Edição	% de Redução de ELISA	% de Redução de WB
CR001380	85	79	49
CR001386	74	74	43
CR001391	74	74	45
CR001392	64	71	37
CR001395	88	88	47
CR001397	82	75	40
CR001400	96	92	57
CR001404	97	82	47
CR001405	84	81	70
CR001409	91	84	70
CR001413	92	88	72
CR001421	78	84	55
CR001422	88	91	36
CR001427	87	60	66
CR001439	79	89	54
CR001450	90	84	68
CR001453	82	85	49
CR001475	94	75	0
CR001476	95	78	16
CR003196	70	74	50
CR003208	92	88	68
CR003214	ΝΑ	NA	59
CR003217	80	87	23
CR003225	75	78	25
CR003226	ΝΑ	NA	38

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2. Análise fora de alvo dos guias de SERPINA1 [00466] Um ensaio baseado em oligoinserção (Ver, por exemplo, Tsai et al., Nature Biotechnology 33, 187-197; 2015) foi usado para determinar potenciais locais genômicos fora do alvo clivados por Cas9 tendo como alvo o SERPINA1. As 30 guias na Tabela 7 (e dois guias de controle com perfis conhecidos fora do alvo) foram selecionados nas células HEK293-Cas9, conforme descrito acima, e os resultados fora do alvo foram plotados na Figura 3. O ensaio identificou potenciais locais fora do alvo para alguns dos crRNAs e identificou outros que não tinham alvos detectáveis.

Exemplo 3. Análise Fenotípica

1. Análise de ELISA de Alfa-1 Antitripsina Secretada [00467] A linhagem de células de carcinoma hepatocelular, HUH7, foi transfectada como descrito no Exemplo 1 com os guias da Tabela 1 em quadruplicata. Dois dias após a transfecção, recolheu-se uma réplica para DNA genômico e analisou-se por sequenciamento de NGS. Todos os guias, incluindo os guias de controle, tiveram edições percentuais maiores que 70%, com alguns guias alcançando 95%. Seis dias após transfecção, uma replicação foi preparada para coleta de meios para análise de AAT secretada por ELISA como previamente descrito. Todos os crRNAs AAT reduziram os níveis de AAT secretados no meio por um fator de 5 a 10 vezes quando comparados aos guias de controle. Os dados para % de edição para cada guia e redução de AAT extracelular são fornecidos na Tabela 7.

2. Análise de Western de alfa-1 antitripsina intracelular [00468] A linhagem de células de carcinoma hepatocelular, HUH7, foi transfectada como descrito no Exemplo 1 com crRNA compreendendo os guias da Tabela 1. Os conjuntos transfectados de células foram retidos em cultura de tecidos e passados para análise posterior. Aos onze dias após transfecção, as células foram coletadas e

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153/156 os extratos celulares completos (WCEs) foram preparados e submetidos a análise por Western Blot como previamente descrito. [00469] À medida que as células foram passadas, as amostras foram coletadas e processadas para sequenciamento de NGS como descrito na presente invenção. As amostras selecionadas do dia 2, 23, 32 e 40 foram comparadas (Tabela 8) para % de edição ao longo do tempo. Este resultado sugere que não houve uma alteração proliferativa associada à edição de AAT no que diz respeito ao crescimento de células HUH7.

Tabela 8: Curso de tempo de % de edição nas células HUH7

Guia	Dia 2	Dia 23	Dia 32	Dia 40
CR001261	95	96	97	96
CR001263	66	70	71	70
CR001373	86	NA	83	85
CR001391	85	87	90	91
CR001400	96	89	90	90
CR001422	88	86	88	87
CR001427	85	93	95	93
CR001439	79	78	79	79
CR003208	92	91	92	94

[00470] WCEs foram analisados por Western Blot para redução da proteína AAT. A proteína AAT de comprimento total tem 418 aminoácidos, embora a proteína seja fortemente glicosilada antes de ser secretada. A AAT não glicosilada tem um peso molecular previsto de 46 kD e uma banda neste peso molecular foi observada nas pistas de controle no Western Blot juntamente com bandas a 52 e 56 kD correspondendo a várias espécies de proteína AAT (Figura 4).

[00471] A redução percentual da proteína AAT foi calculada usando o software Licor Odyssey Image Studio Ver 5.2. O GAPDH foi usado como um controle de carregamento e sondado simultaneamente com a

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AAT. Uma razão foi calculada para os valores de densitometria para GAPDH dentro de cada amostra em comparação com a região total abrangendo todas as três bandas para AAT. A redução percentual da proteína AAT foi determinada após as razões serem normalizadas para controlar as pistas. Os resultados são mostrados na Tabela 7.

3. Dados consolidados in vitro para guias selecionados [00472] Os pacotes de dados focados para guias individuais foram criados analisando os dados descritos aqui. Os candidatos a líder foram caracterizados e ordenados por meio de uma comparação da redução de AAT secretada (ELISA), redução da proteína AAT total versus produção de bandas estranhas (Western Blot) e análise fora do alvo. A homologia, incluindo quaisquer desemparelhamentos (mm) em sequência, para o macaco cinomolgo também está representada. Ver, Figuras 5 a 10.

Exemplo 4. Distribuição de nanopartículas lipídicas (LNP) para hepatócitos humanos primários (PHH) e células HepG2 [00473] As formulações de nanopartículas lipídicas de mRNA Cas9 e sgRNAs modificadas para SERPINA1 humana foram testadas em células PHH e HepG2 em uma curva de dose-resposta. As células PHH e HepG2 foram plaqueadas como descrito no Exemplo 1 (mas a 15.000 células PHH/poço em oposição a 33.000/poço). As células foram incubadas a 370, 5% de CO 2 durante 24 horas antes do tratamento com LNPs. As LNPs usadas no experimento foram preparados como descrito no Exemplo 1, contendo cada um 0 sgRNA especificado nas FIGURAS 11 e 12 e 0 mRNA Cas9. As LNPs foram incubadas em meio de manutenção de hepatócitos contendo 6% de soro de cino, a 370 durante 5 minutos. Após a incubação, os LNPs foram adicionados às células em uma curva de dose-resposta de 2 vezes de 8 pontos, começando com 100 ng de mRNA. As células foram lisadas 72 horas após 0 tratamento para análise de NGS como descrito no Exemplo 1.

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Os dados da curva de dose-resposta para as sequências guia em ambos os tipos de células são apresentados nas FIGURAS 11 e 12. Os dados mostram que as formulações são eficazes para edição de ambas as células HepG2, bem como hepatócitos humanos primários, que são o alvo celular in vivo pretendido em humanos.

Exemplo 5. Distribuição de nanopartículas lipídicas (LNP) e edição da variante PiZ humana in vivo [00474] Cinco das seis formulações de LNP testadas no Exemplo 4 e uma LNP de controle compreendendo um sgRNA tendo como alvo o gene de TTR murino foram administradas a camundongos transgênicos contendo cópias da variante de PiZ humana. O camundongo transgênico PiZ foi descrito anteriormente (ver, por exemplo, Carlson JA, Rogers BB, Sifers RN, et al. O acúmulo de PiZ alfa 1-antitripsina causa dano hepático em camundongos transgênicos. J Clin Invest 1989;83: 1183—1190), e acredita-se conter 7-8 cópias concatemerizadas da variante de PiZ humana em camundongos heterozigóticos para o concatenador (dados não mostrados).

[00475] Os camundongos PiZ (mistura de macho e fêmea) variando de 15-39 semanas de idade foram usados neste estudo. As LNPs foram administradas através da veia lateral da cauda em um volume de 0,2 mL por animal (n = 5 para cada grupo), na dose de 4 mg/kg (4 mg de conteúdo total de RNA por kg). Os animais foram eutanasiados duas semanas após a administração de LNPs. O sangue foi coletado para análise do soro antes da administração de LNP e na necropsia. Tecido do fígado foi colhido na necropsia de cada animal para extração de proteína e DNA seguida de quantificação proteica (análises de ELISA e Western blot para os níveis no soro e tecido da proteína PiZ, respectivamente) e análise de NGS usando os reagentes e métodos descritos no Exemplo 1. A Tabela 9 abaixo mostra os sgRNAs formulados em cada LNP testada.

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Tabela 9.

sg: RNA	LNP	alvo
G000407	641	hAAT
G000408	642	hAAT
G000409	643	hAAT
G000413	644	hAAT
G000414	645	hAAT
G000282	647	mTTR

[00476] G000282 (*=ligação de PS; 'm' = 2'-O-Me nucleotídeo):

mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmG mAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAm AmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAm GmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:424) [00477] Como mostrado na Figura 13A, a edição robusta da variante PiZ de SERPINA1 (ou TTR em relação ao controle murino) foi detectada em cada grupo, enquanto nenhuma edição foi detectada no controle do veículo (TSS = Tris/cloreto de sódio/sacarose). Nenhuma edição foi também detectada em alguns animais dentro dos grupos experimentais, e a subsequente análise de genotipagem (dados não mostrados) revelou que estes animais eram negativos para o transgene PiZ, e assim não seria de esperar que dessem origem à edição detectável, expressão da proteína PiZ, ou knockdown da secreção de PiZ no soro. Isto foi ainda confirmado por análise de expressão proteica (ELISA e Western blot; ver Figuras 13B e 13C).

[00478] Além disso, a edição da variante PiZ correlacionou-se com o knockdown nos níveis séricos em camundongos tratados. Além disso, a edição também se correlacionou com um knockdown da proteína PiZ em tecidos do fígado, como mostrado por Western blot (Figura 13C). Estes dados demonstram que as formulações são eficazes para o knockdown da expressão e secreção de alelo de PiZ humano in vivo.

Claims (243)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método para induzir uma quebra de fita dupla (DSB) dentro do gene SERPINA1, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir uma composição para uma célula, em que a composição compreende um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
2. 2. Método para modificar gene SERPINA1, caracterizado pelo fato de que compreende distribuir uma composição para uma célula, em que a composição compreende (i) um agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA e (ii) um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
3. 3. Método para tratar deficiência de alfa-1 antitripsina (AATD), caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição a um sujeito em necessidade da mesma, em que a composição compreende (i) um agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA e (ii) um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129, desse modo tratando AATD.
4. 4. Método para reduzir ou prevenir acumulação de alfa-1 antitripsina (AAT) no fígado em um sujeito, caracterizado pelo fato de que compreende administrar uma composição a um sujeito em

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   2/28 necessidade da mesma, em que a composição compreende (i) um agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA e (ii) um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID nos: 5-129, desse modo reduzindo acumulação de AAT no fígado.
5. 5. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um RNA guia compreendendo uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
6. 6. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende um vetor codificando um RNA guia, em que o RNA guia compreende uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 ou uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
7. 7. Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na indução de uma quebra de fita dupla (DSB) dentro do gene SERPINA1 em uma célula ou sujeito.
8. 8. Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na modificação do gene SERPINA1 em uma célula ou sujeito.
9. 9. Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de deficiência de alfa-1 antitripsina (AATD) em um sujeito.
10. 10. Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na redução de concentração

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    3/28 no soro ou fígado de AAT em um sujeito.
11. 11. Composição, de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizada pelo fato de que é para uso na redução ou prevenção da cumulação de alfa-1 antitripsina (AAT) no fígado em um sujeito.
12. 12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou a composição para uso como definido em qualquer uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição reduz níveis de AAT no soro e/ou fígado.
13. 13. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT no soro e/ou do fígado são reduzidos em pelo menos 40% em comparação com níveis de AAT no soro e/ou antes da administração da composição.
14. 14. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT no soro e/ou fígado são reduzidos em 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-98%, 98-99%, ou 99-100% em comparação com níveis de AAT no soro e/ou antes da administração da composição.
15. 15. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 14, caracterizado pelo fato de que a composição resulta na edição do gene SERPINA1.
16. 16. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelo fato de que a edição é calculada como uma percentagem da população que é editado (por cento de edição).
17. 17. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que a edição percentual está entre 30 e 99%.
18. 18. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que a edição percentual está entre 30 e 35%, 35 e 40%, 40 e 45%, 45 e 50%, 50 e 55%, 55 e

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    60%, 60 e 65%, 65 e 70%, 70 e 75%, 75 e 80%, 80 e 85%, 85 e 90%, 90 e 95%, ou 95 e 99%.
19. 19. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 18, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ou distribuída pelo menos duas vezes.
20. 20. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ou distribuída pelo menos três vezes.
21. 21. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ou distribuída pelo menos quatro vezes.
22. 22. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que a composição é administrada ou distribuída até cinco, seis, sete, oito, nove ou dez vezes.
23. 23. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que a administração ou distribuição ocorre em um intervalo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15dias.
24. 24. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que a administração ou distribuição ocorre em um intervalo de 1,2, 3, 4, 5, 6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, ou 15 semanas.
25. 25. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 22, caracterizado pelo fato de que a administração ou distribuição ocorre em um intervalo de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 meses.
26. 26. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a

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    5/28 sequência guia é selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
27. 27. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RNA guia é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência alvo presente no gene SERPINA1 humano.
28. 28. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo está no éxon 2, 3, 4, ou 5 do gene SERPINA1 humano.
29. 29. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo está no éxon 2 do gene SERPINA1 humano.
30. 30. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo está no éxon 3 do gene SERPINA1 humano.
31. 31. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo está no éxon 4 do gene SERPINA1 humano.
32. 32. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que a sequência alvo está no éxon 5 do gene SERPINA1 humano.
33. 33. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a sequência guia é complementar a uma sequência alvo na fita positiva de SERPINA1.
34. 34. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que a sequência guia é complementar a uma sequência alvo na fita negativa de SERPINA1.
35. 35. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 32, caracterizado pelo fato de que compreende

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    6/28 ainda uma segunda sequência guia, em que a primeira sequência guia é complementar a uma primeira sequência alvo na fita positiva do gene SERPINA1 e em que a segunda sequência guia é complementar a uma segunda sequência alvo na fita negativa do gene SERPINA1.
36. 36. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RNA compreende um crRNA que compreende a sequência guia e compreende ainda uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 140, em que os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140 seguem a sequência guia na sua extremidade 3.
37. 37. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RNA guia é uma guia dupla (dgRNA).
38. 38. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 37, caracterizado pelo fato de que o RNA de dupla guia compreende um crRNA compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 140, em que os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140 seguem a sequência guia na sua extremidade 3 e um trRNA.
39. 39. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 36, caracterizado pelo fato de que o RNA guia é uma única guia (sgRNA).
40. 40. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma sequência guia que tem as modificações de SEQ ID NO: 130.
41. 41. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende a SEQ ID NO:

    130.
42. 42. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 40 ou 41, caracterizado pelo fato de que cada N em SEQ ID NO: 130 é qualquer nucleotídeo natural ou não natural, em que os Ns formam a

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    7/28 sequência guia e a sequência guia tem como alvo um agente de ligação de DNA guiado por RNA para o gene SERPINA1.
43. 43. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 42, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende qualquer uma das sequências guia de SEQ ID NO: 5-129 e os nucleotídeos de SEQ ID NO: 140.
44. 44. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 39 a 43, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma sequência guia que é pelo menos 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, ou 90% idêntica a uma sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
45. 45. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 42, caracterizado pelo fato de que cada N em SEQ ID NO: 130 é coletivamente substituído por uma sequência guia selecionada de SEQ ID NOs: 5-129.
46. 46. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que o RNA guia compreende pelo menos uma modificação.
47. 47. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 46, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui um nucleotídeo modificado com 2-O-metil (2-O-Me).
48. 48. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 46 ou 47, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui uma ligação fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
49. 49. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 48, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui um nucleotídeo modificado com 2-fluoro (2-F).
50. 50. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 49, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui uma modificação em um ou mais dos primeiros

    Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 168/210

    8/28 cinco nucleotídeos na extremidade 5.
51. 51. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 50, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui uma modificação em um ou mais dos últimos cinco nucleotídeos na extremidade 3.
52. 52. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 51, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui ligações PS entre os primeiros quatro nucleotídeos.
53. 53. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 52, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui ligações PS entre os últimos quatro nucleotídeos.
54. 54. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 53, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui nucleotídeos modificados com 2-O-Me nos primeiros três nucleotídeos na extremidade 5.
55. 55. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 54, caracterizado pelo fato de que a pelo menos uma modificação inclui nucleotídeos modificados com 2-O-Me nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3.
56. 56. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 46 a 55, caracterizado pelo fato de que o RNA guia compreende os nucleotídeos modificados de SEQ ID NO: 130.
57. 57. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 56, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um excipiente farmaceuticamente aceitável.
58. 58. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 57, caracterizado pelo fato de que o RNA guia e, opcionalmente, o agente de ligação de DNA guiado por RNA ou um

    Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 169/210

    9/28 ácido nucleico codificando um agente de ligação de DNA guiado por RNA está/estão associados com uma nanopartícula de lipídeo (LNP).
59. 59. Método ou composição, de acordo com a reivindicação

    58, caracterizado pelo fato de que a LNP compreende um lipídeo CCD.
60. 60. Método ou composição, de acordo com a reivindicação

    59, caracterizado pelo fato de que o lipídeo CCD é Lipídeo A.
61. 61. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 58 a 60, caracterizado pelo fato de que a LNP compreende um lipídeo neutro.
62. 62. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 61, caracterizado pelo fato de que o lipídeo neutro é DSPC.
63. 63. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 62, caracterizado pelo fato de que a LNP compreende um lipídeo auxiliar.
64. 64. Método ou composição, de acordo com a reivindicação

    63, caracterizado pelo fato de que o lipídeo auxiliar é colesterol.
65. 65. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 58 a 64, caracterizado pelo fato de que a LNP compreende um lipídeo furtivo.
66. 66. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 58 a 65, caracterizado pelo fato de que o lipídeo furtivo é PEG2k-DMG.
67. 67. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um agente de ligação de DNA guiado por RNA.
68. 68. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição compreende ainda um mRNA que codifica um agente de ligação de DNA guiado por RNA.
69. 69. Método ou composição, de acordo com a reivindicação

    Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 170/210

    10/28

    67 ou 68, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é uma clivase Cas.
70. 70. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 69, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é Cas9.
71. 71. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 70, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é modificado.
72. 72. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 71, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é uma nickase.
73. 73. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 71 ou 72, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de DNA guiado por RNA modificado compreende um sinal de localização nuclear (NLS).
74. 74. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 67 a 73, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação de DNA guiado por RNA é um Cas de um sistema CRISPR/Cas Tipo-ll.
75. 75. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição é uma formulação farmacêutica e compreende ainda um veículo farmaceuticamente aceitável.
76. 76. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 75, caracterizado pelo fato de que a composição reduz ou impede acumulação de alfa-1 antitripsina (AAT) no fígado.
77. 77. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 76, caracterizado pelo fato de que a AAT é malformada.
78. 78. Método ou composição para uso, de acordo com

    Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 171/210

    11/28 qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 77, caracterizado pelo fato de que junção terminal não homóloga (NHEJ) leva uma mutação durante reparo de uma DSB no gene SERPINA1.
79. 79. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 78, caracterizado pelo fato de que NHEJ leva a uma deleção ou inserção de um nucleotídeo durante reparo de uma DSB no gene SERPINA1.
80. 80. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que a deleção ou inserção de um nucleotídeo induz um desvio de estrutura ou mutação nonsense no gene SERPINA1.
81. 81. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que um desvio de estrutura ou mutação nonsense é induzida no gene SERPINA1 de pelo menos 50% das células do fígado.
82. 82. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que um desvio de estrutura ou mutação nonsense é induzida no gene SERPINA1 de 50%-60%, 60%-70%, 70% ou 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, ou 99%-100% das células do fígado.
83. 83. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 82, caracterizado pelo fato de que uma deleção ou inserção de um nucleotídeo ocorre no gene SERPINA1 pelo menos 50 vezes ou mais do que em sítios fora do alvo.
84. 84. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a deleção ou inserção de um nucleotídeo ocorre no gene SERPINA1 50 vezes a 150 vezes, 150 vezes a 500 vezes, 500 vezes a 1.500 vezes, 1.500 vezes a 5.000 vezes, 5.000 vezes a 15.000 vezes, 15.000 vezes a 30.000 vezes, ou 30.000 vezes a 60.000 vezes mais do que em sítios fora do alvo.

    Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 172/210

    12/28
85. 85. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 84, caracterizado pelo fato de que a administração da composição reduz os níveis de AAT no sujeito.
86. 86. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT são reduzidos em pelo menos 40%.
87. 87. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 86, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT são reduzidas em 40%-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70% ou 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, ou 99%-100%.
88. 88. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT são medidos em soro, plasma, sangue, fluido cérebro-espinhal, ou escarro.
89. 89. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 86 ou 87, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT são medidos no fígado e/ou soro.
90. 90. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 85 a 89, caracterizado pelo fato de que os níveis de AAT são medidos através de ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA).
91. 91. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 90, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem AATD.
92. 92. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 91, caracterizado pelo fato de que o sujeito é humano.
93. 93. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem

    Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 173/210

    13/28

    AATD wt.
94. 94. Método ou composição para uso, de acordo com a reivindicação 91 ou 92, caracterizado pelo fato de que o sujeito tern AATD hereditária.
95. 95. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, 7 a 92 ou 94, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem um histórico familiar de AATD.
96. 96. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 95, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem apenas ou predominantemente sintomas de fígado de AATD.
97. 97. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 96, caracterizado pelo fato de que o sujeito é heterozigótico para alelo Z no locus de SERPINAI.
98. 98. Método, de acordo com a reivindicação 97, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem um alelo Z e um alelo S no locus de SERPINAI.
99. 99. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 98, caracterizado pelo fato de que o sujeito não tem uma mutação E342K na sequência de aminoácido de AAT, mas tem níveis reduzidos de AAT do tipo selvagem.
100. 100. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 99, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma melhoria, estabilização ou abrandamento de edema, ascite ou icterícia, ou um retardo na necessidade de transplante de fígado.
101. 101. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 99, caracterizado pelo fato de que o sujeito tem uma melhoria, estabilização ou abrandamento de mudança como medida por métodos de imageamento ou níveis de

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 174/210

     14/28 enzima no fígado como resultado da administração.
102. 102. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 101, caracterizado pelo fato de que a composição ou a formulação farmacêutica é administrada através de um vetor viral.
103. 103. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 102, caracterizado pelo fato de que a composição ou a formulação farmacêutica é administrada através de nanopartículas de lipídeo.
104. 104. Método ou composição para uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 7 a 103, caracterizado pelo fato de que o sujeito é testado para mutações específicas no gene SERPINAI antes da administração da composição ou formulação.
105. 105. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 5.
106. 106. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 6.
107. 107. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 7.
108. 108. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 8.
109. 109. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 9.
110. 110. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 175/210

     15/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 10.
111. 111. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 11.
112. 112. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 12.
113. 113. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 13.
114. 114. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 14.
115. 115. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 15.
116. 116. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 16.
117. 117. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 17.
118. 118. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 18.
119. 119. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 19.
120. 120. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 176/210

     16/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 20.
121. 121. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 21.
122. 122. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 22.
123. 123. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 23.
124. 124. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 24.
125. 125. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 25.
126. 126. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 26.
127. 127. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 27.
128. 128. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 28.
129. 129. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 29.
130. 130. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 177/210

     17/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 30.
131. 131. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 31.
132. 132. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 32.
133. 133. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 33.
134. 134. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 34.
135. 135. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 35.
136. 136. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 36.
137. 137. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 37.
138. 138. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 38.
139. 139. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 39.
140. 140. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 178/210

     18/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 40.
141. 141. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 41.
142. 142. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 42.
143. 143. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 43.
144. 144. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 44.
145. 145. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 45.
146. 146. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 46.
147. 147. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 47.
148. 148. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 48.
149. 149. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 49.
150. 150. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 179/210

     19/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 50.
151. 151. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 51.
152. 152. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 52.
153. 153. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 53.
154. 154. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 54.
155. 155. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 55.
156. 156. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 56.
157. 157. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 57.
158. 158. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 58.
159. 159. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 59.
160. 160. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 180/210

     20/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 60.
161. 161. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 61.
162. 162. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 62.
163. 163. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 63.
164. 164. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 64.
165. 165. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 65.
166. 166. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 66.
167. 167. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 67.
168. 168. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 68.
169. 169. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 69.
170. 170. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 181/210

     21/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 70.
171. 171. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 71.
172. 172. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 72.
173. 173. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 73.
174. 174. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 74.
175. 175. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 75.
176. 176. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 76.
177. 177. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 77.
178. 178. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 78.
179. 179. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 79.
180. 180. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 182/210

     22/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 80.
181. 181. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 81.
182. 182. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 82.
183. 183. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 83.
184. 184. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 84.
185. 185. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 85.
186. 186. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 86.
187. 187. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 87.
188. 188. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 88.
189. 189. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 89.
190. 190. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 183/210

     23/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 90.
191. 191. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 91.
192. 192. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 92.
193. 193. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 93.
194. 194. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 94.
195. 195. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 95.
196. 196. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 96.
197. 197. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 97.
198. 198. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 98.
199. 199. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 99.
200. 200. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 184/210

     24/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 100.
201. 201. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 101.
202. 202. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 102.
203. 203. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 103.
204. 204. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 104.
205. 205. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 105.
206. 206. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 106.
207. 207. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 107.
208. 208. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 108.
209. 209. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 109.
210. 210. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 185/210

     25/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 110.
211. 211. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 111.
212. 212. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 112.
213. 213. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 113.
214. 214. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 114.
215. 215. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 115.
216. 216. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 116.
217. 217. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 117.
218. 218. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 118.
219. 219. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 119.
220. 220. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 186/210

     26/28 selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 120.
221. 221. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 121.
222. 222. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 122.
223. 223. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ TD NO: 5-129 é SEQ ID NO: 123.
224. 224. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 124.
225. 225. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 125.
226. 226. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ TD NO: 5-129 é SEQ ID NO: 126.
227. 227. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 127.
228. 228. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 5-129 é SEQ ID NO: 128.
229. 229. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ TD NO: 5-129 é SEQ ID NO: 129.
230. 230. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que compreende

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 187/210

     27/28 ainda sequência de SEQ ID NO: 140 ou 141.
231. 231. Método ou composição, de acordo com a reivindicação 230, caracterizado pelo fato de que compreende o padrão de modificação de SEQ ID NO: 130.
232. 232. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência é selecionada de SEQ ID NO: 131 a 139.
233. 233. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 131.
234. 234. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 132.
235. 235. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 133.
236. 236. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 134.
237. 237. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 135.
238. 238. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 136.
239. 239. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 137.
240. 240. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência

     Petição 870190068162, de 18/07/2019, pág. 188/210

     28/28 selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 138.
241. 241. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 104, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 é SEQ ID NO: 139.
242. 242. Método ou composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 232 a 241, caracterizado pelo fato de que a sequência selecionada de SEQ ID NOs: 131 a 139 compreende as modificações mostradas para respectiva sequência na Tabela 2.
243. 243. Uso de uma composição ou formulação como definida em qualquer uma das reivindicações 5 a 242, caracterizado pelo fato de que é para preparação de um medicamento para tratamento de um sujeito humano tendo AATD.