TW201833331A - 用於治療α-１抗胰蛋白酶缺乏症之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供在SERPINA1基因中造成雙鏈斷裂之組合物及方法。提供減少及消除α1-抗胰蛋白酶(AAT)之突變體形式(諸如患有α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)之個體中所見的突變體形式)之組合物及方法。

Description

用於治療α-1抗胰蛋白酶缺乏症之組合物及方法
α-1抗胰蛋白酶(AAT或A1AT)或血清胰蛋白酶抑制劑為一種類型之絲胺酸蛋白酶抑制劑(serine protease inhibitor) (亦稱為絲胺酸蛋白酶抑制劑(serpin))，其由SERPINA1 基因編碼。AAT主要由肝細胞合成且由肝細胞分泌，且用以抑制肺中的嗜中性白血球彈性蛋白酶之活性。缺少足夠量的起作用之AAT，肺中之嗜中性白血球彈性蛋白酶會不受控制且對肺泡造成損害。因此，引起AAT含量降低或正常起作用之AAT的含量降低的SERPINA1 突變會導致肺病變。此外，引起產生不會離開肝臟之變形AAT的SERPINA1 突變會歸因於肝細胞中AAT之積聚而導致肝臟病變。因此，由SERPINA1 突變所引起的不足及不恰當形成之AAT會導致肺及肝臟病變兩者。 已針對SERPINA1 基因描述出多於一百種對偶基因變異體。一般根據變異體對AAT之血清含量的作用對其進行分類。舉例而言，M對偶基因為與正常血清AAT含量相關聯之正常變異體，而Z及S對偶基因為與降低之AAT含量相關聯之突變變異體。Z及S對偶基因之存在與α1-抗胰蛋白酶缺乏症(AATD或A1AD)相關聯，該缺乏症為一種遺傳性病症，其特徵在於SERPINA1 基因發生突變，導致產生異常AAT。 AATD存在多種形式及程度。「Z-變異體」最常見，其會在肝臟及肺兩者中導致嚴重臨床疾病。Z-變異體的特徵在於第5外顯子之5'端處的單核苷酸發生變化，導致麩胺酸在胺基酸位置342 (E342K)處誤義突變成離胺酸。症狀出現於在Z對偶基因處均為同種接合(ZZ)及異種接合(MZ或SZ)之患者中。一或兩種Z對偶基因之存在會在肝臟肝細胞中導致SERPINA1 mRNA不穩定性及AAT蛋白質聚合及聚集。歸因於肝臟中聚集AAT蛋白質之積聚，具有至少一種Z對偶基因之患者的肝癌發病率會有所增加。除了肝臟病變以外，藉由至少一種Z對偶基因表徵之AATD的特徵亦在於因肺泡中AAT降低及所引起的嗜中性白血球彈性蛋白酶之抑制降低而導致肺病。嚴重ZZ形式(亦即Z-變異體之同種接合表現)在北歐人群中之發病率為1:2,000，且在美國發病率為1:4,500。 需要減輕AATD在肝臟及肺兩者中之消極影響。本發明提供使用CRISPR/Cas系統剔除SERPINA1 基因，藉此消除產生與患有AATD之患者中的肝臟症狀相關聯的AAT之突變形式的組合物及方法。
實施例01 一種誘發SERPINA1 基因中發生雙鏈斷裂(DSB)之方法，該方法包括向細胞遞送組合物，其中該組合物包含引導RNA，該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例02 一種修飾SERPINA1 基因之方法，該方法包括向細胞遞送組合物，其中該組合物包含(i)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸及(ii)引導RNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例03 一種治療α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)之方法，該方法包括向有需要之個體投與組合物，藉此治療AATD，其中該組合物包含(i)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸及(ii)引導RNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例04 一種用於減少或防止α-1抗胰蛋白酶(AAT)在個體之肝臟中積聚的方法，該方法包括向有需要之個體投與組合物，藉此減少AAT在肝臟中積聚，其中該組合物包含(i)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸及(ii)引導RNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例05 一種組合物，其包含引導RNA，該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例06 一種組合物，其包含編碼引導RNA之載體，其中該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例07 如實施例5或6之組合物，其供用於誘發細胞或個體中之SERPINA1 基因中發生雙鏈斷裂(DSB)。 實施例08 如實施例5或6之組合物，其供用於修飾細胞或個體中之SERPINA1 基因。 實施例09 如實施例5或6之組合物，其供用於治療個體中之α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。 實施例10 如實施例5或6之組合物，其供用於降低個體中之血清或肝臟AAT濃度。 實施例11 如實施例5或6之組合物，其供用於減少或防止α-1抗胰蛋白酶(AAT)在個體之肝臟中積聚。 實施例12 如實施例1至4中任一項之方法或如實施例5至11中任一項所使用之組合物，其中組合物會降低血清及/或肝臟AAT含量。 實施例13 如實施例12所使用之方法或組合物，其中相較於投與組合物之前的血清及/或AAT含量，血清及/或肝臟AAT含量降低至少50%。 實施例14 如實施例12所使用之方法或組合物，其中相較於投與組合物之前的血清及/或AAT含量，血清及/或AAT含量降低50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%、90%至95%、95%至98%、98%至99%或99%至100%。 實施例15 如實施例1至4或7至14中任一項所使用之方法或組合物，其中組合物引起編輯SERPINA1 基因。 實施例16 如實施例15所使用之方法或組合物，其中編輯計算為經編輯的基因群之百分比(編輯百分比)。 實施例17 如實施例16所使用之方法或組合物，其中編輯百分比在30%與99%之間。 實施例18 如實施例17所使用之方法或組合物，其中編輯百分比在30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。 實施例19 如實施例1至4或7至18中任一項所使用之方法或組合物，其中投與或遞送組合物至少兩次。 實施例20 如實施例19所使用之方法或組合物，其中投與或遞送組合物至少三次。 實施例21 如實施例19所使用之方法或組合物，其中投與或遞送組合物至少四次。 實施例22 如實施例19所使用之方法或組合物，其中投與或遞送組合物至多五、六、七、八、九或十次。 實施例23 如實施例19至22中任一項所使用之方法或組合物，其中投與或遞送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天之間隔進行。 實施例24 如實施例19至22中任一項所使用之方法或組合物，其中投與或遞送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週之間隔進行。 實施例25 如實施例19至22中任一項所使用之方法或組合物，其中投與或遞送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個月之間隔進行。 實施例26 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中引導序列係選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129。 實施例27 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中引導RNA與人類SERPINA1 基因中所存在之靶序列至少部分互補。 實施例28 如實施例27之方法或組合物，其中靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子2、3、4或5中。 實施例29 如實施例27之方法或組合物，其中靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子2中。 實施例30 如實施例27之方法或組合物，其中靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子3中。 實施例31 如實施例27之方法或組合物，其中靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子4中。 實施例32 如實施例27之方法或組合物，其中靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子5中。 實施例33 如實施例1至32中任一項之方法或組合物，其中引導序列與SERPINA1 之正鏈中的靶序列互補。 實施例34 如實施例1至32中任一項之方法或組合物，其中引導序列與SERPINA1 之負鏈中的靶序列互補。 實施例35 如實施例1至32中任一項之方法或組合物，其進一步包含第二引導序列，其中第一引導序列與SERPINA1 基因之正鏈中的第一靶序列互補，且其中第二引導序列與SERPINA1 基因之負鏈中的第二靶序列互補。 實施例36 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中引導RNA包含crRNA，其包含引導序列且進一步包含SEQ ID NO:140之核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140之核苷酸在引導序列之3'端後。 實施例37 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中引導RNA為雙引導(dgRNA)。 實施例38 如實施例37之方法或組合物，其中雙引導RNA包含crRNA及trRNA，該crRNA包含SEQ ID NO:140之核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140之核苷酸在引導序列之3'端後。 實施例39 如實施例1至36中任一項之方法或組合物，其中引導RNA為單引導(sgRNA)。 實施例40 如實施例39之方法或組合物，其中sgRNA包含具有SEQ ID NO:130之模式的引導序列。 實施例41 如實施例39之方法或組合物，其中sgRNA包含SEQ ID NO:130之序列。 實施例42 如實施例40或41之方法或組合物，其中SEQ ID NO:130中之各N為任何天然或非天然核苷酸，其中該等N形成引導序列，且引導序列使經RNA引導之DNA結合劑靶向SERPINA1 基因。 實施例43 如實施例39至42中任一項之方法或組合物，其中sgRNA包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列及SEQ ID NO:140之核苷酸中之任一者。 實施例44 如實施例39至43中任一項之方法或組合物，其中sgRNA包含與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 實施例45 如實施例42之方法或組合物，其中SEQ ID NO:130中之各N經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列置換。 實施例46 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中引導RNA包含至少一種修飾。 實施例47 如實施例46之方法或組合物，其中至少一種修飾包括經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。 實施例48 如實施例46或47之方法或組合物，其中至少一種修飾包括處於各核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 實施例49 如實施例46至48中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括經2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。 實施例50 如實施例46至49中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括在5’端前五個核苷酸中之一或多處進行修飾。 實施例51 如實施例46至50中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括在3’端最後五個核苷酸中之一或多處進行修飾。 實施例52 如實施例46至51中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括處於前四個核苷酸之間的PS鍵。 實施例53 如實施例46至52中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括處於最後四個核苷酸之間的PS鍵。 實施例54 如實施例46至53中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括在5’端前三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例55 如實施例46至54中任一項之方法或組合物，其中至少一種修飾包括在3’端最後三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。 實施例56 如實施例46至55中任一項之方法或組合物，其中引導RNA包含SEQ ID NO:130之經修飾核苷酸。 實施例57 如實施例1至56中任一項之方法或組合物，其中組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。 實施例58 如實施例1至57中任一項之方法或組合物，其中引導RNA及視情況選用之經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸與脂質奈米粒子(LNP)締合。 實施例59 如實施例58之方法或組合物，其中LNP包含CCD脂質。 實施例60 如實施例59之方法或組合物，其中CCD脂質為脂質A。 實施例61 如實施例58至60之方法或組合物，其中LNP包含中性脂質。 實施例62 如實施例61之方法或組合物，其中中性脂質為DSPC。 實施例63 如實施例58至62中任一項之方法或組合物，其中LNP包含輔助脂質。 實施例64 如實施例63之方法或組合物，其中輔助脂質為膽固醇。 實施例65 如實施例58至64中任一項之方法或組合物，其中LNP包含隱形脂質(stealth lipid)。 實施例66 如實施例58至65之方法或組合物，其中隱形脂質為PEG2k-DMG。 實施例67 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中組合物進一步包含經RNA引導之DNA結合劑。 實施例68 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中組合物進一步包含編碼經RNA引導之DNA結合劑的mRNA。 實施例69 如實施例67或68之方法或組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑為Cas裂解酶。 實施例70 如實施例69之方法或組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。 實施例71 如實施例67至70中任一項之方法或組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑經修飾。 實施例72 如實施例67至71中任一項之方法或組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑為切口酶(nickase)。 實施例73 如實施例71或72之方法或組合物，其中經修飾的經RNA引導之DNA結合劑包含核定位信號(NLS)。 實施例74 如實施例67至73中任一項之方法或組合物，其中經RNA引導之DNA結合劑為來自II型CRISPR/Cas系統之Cas。 實施例75 如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中組合物為醫藥調配物且進一步包含醫藥學上可接受之載劑。 實施例76 如實施例1至4或7至75中任一項所使用之方法或組合物，其中組合物會減少或防止α-1抗胰蛋白酶(AAT)在肝臟中積聚。 實施例77 如實施例76所使用之方法或組合物，其中AAT為變形的。 實施例78 如實施例1至4或7至77中任一項所使用之方法或組合物，其中非同源末端連接(non-homologous ending joining；NHEJ)在修復SERPINA1 基因中之DSB期間引起突變。 實施例79 如實施例78所使用之方法或組合物，其中NHEJ在修復SERPINA1 基因中之DSB期間引起核苷酸缺失或插入。 實施例80 如實施例80所使用之方法或組合物，其中核苷酸之缺失或插入誘發SERPINA1 基因中發生框移或無意義突變。 實施例81 如實施例80所使用之方法或組合物，其中在至少50%之肝臟細胞的SERPINA1 基因中誘發框移或無意義突變。 實施例82 如實施例81所使用之方法或組合物，其中在50%至60%、60%至70%、70%或80%、80%至90%、90%至95%、95%至99%或99%至100%之肝臟細胞的SERPINA1 基因中誘發框移或無意義突變。 實施例83 如實施例79至82中任一項所使用之方法或組合物，其中發生在SERPINA1 基因中的核苷酸缺失或插入為在脫靶位點處的至少50倍或大於50倍。 實施例84 如實施例83所使用之方法或組合物，其中發生在SERPINA1 基因中的核苷酸之缺失或插入比在脫靶位點處多50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。 實施例85 如實施例1至4或7至84中任一項所使用之方法或組合物，其中投與組合物會降低個體中之AAT含量。 實施例86 如實施例85所使用之方法或組合物，其中AAT含量降低至少40%。 實施例87 如實施例86所使用之方法或組合物，其中AAT含量降低40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%或80%、80%至90%、90%至95%、95%至99%或99%至100%。 實施例88 如實施例86或87所使用之方法或組合物，其中在血清、血漿、血液、大腦脊髓液或痰中量測AAT含量。 實施例89 如實施例86或87所使用之方法或組合物，其中在肝臟及/或血清中量測AAT含量。 實施例90 如實施例85至89中任一項所使用之方法或組合物，其中經由酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)量測AAT含量。 實施例91 如實施例1至4或7至90中任一項所使用之方法或組合物，其中個體患有AATD。 實施例92 如實施例1至4或7至91中任一項所使用之方法或組合物，其中個體為人類。 實施例93 如實施例91或92所使用之方法或組合物，其中個體患有AATD。 實施例94 如實施例91或92所使用之方法或組合物，其中個體患有遺傳性AATD。 實施例95 如實施例1至4、7至92或94中任一項所使用之方法或組合物，其中個體具有AATD家族病史。 實施例96 如實施例1至4或7至95中任一項所使用之方法或組合物，其中個體僅具有或主要具有AATD之肝臟症狀。 實施例97 如實施例1至4或7至96中任一項所使用之方法或組合物，其中個體在SERPINA1基因座之Z對偶基因為異種接合。 實施例98 如實施例97之方法，其中個體在SERPINA1基因座處具有一個Z對偶基因及一個S對偶基因。 實施例99 如實施例1至4或7至98中任一項所使用之方法或組合物，其中個體在AAT之胺基酸序列處不具有E342K突變，但具有降低含量之野生型AAT。 實施例100 如實施例1至4或7至99中任一項所使用之方法或組合物，其中個體之水腫、腹水或黃疸有所改善、穩定或減緩，或延緩對肝臟移植之需要。 實施例101 如實施例1至4或7至99中任一項所使用之方法或組合物，其中如藉由成像方法或肝酶含量所量測，個體由於投藥而具有改善、穩定或減緩變化。 實施例102 如實施例1至4或7至101中任一項所使用之方法或組合物，其中組合物或醫藥調配物經由病毒載體投與。 實施例103 如實施例1至4或7至102中任一項所使用之方法或組合物，其中組合物或醫藥調配物經由脂質奈米粒子投與。 實施例104 如實施例1至4或7至103中任一項所使用之方法或組合物，其中在投與組合物或調配物之前針對SERPINA1 基因中之特定突變測試個體。 實施例105 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:5。 實施例106 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:6。 實施例107 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:7。 實施例108 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:8。 實施例109 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:9。 實施例110 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:10。 實施例111 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:11。 實施例112 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:12。 實施例113 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:13。 實施例114 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:14。 實施例115 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:15。 實施例116 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:16。 實施例117 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:17。 實施例118 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:18。 實施例119 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:19。 實施例120 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:20。 實施例121 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:21。 實施例122 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:22。 實施例123 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:23。 實施例124 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:24。 實施例125 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:25。 實施例126 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:26。 實施例127 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:27。 實施例128 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:28。 實施例129 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:29。 實施例130 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:30。 實施例131 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:31。 實施例132 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:32。 實施例133 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:33。 實施例134 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:34。 實施例135 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:35。 實施例136 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:36。 實施例137 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:37。 實施例138 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:38。 實施例139 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:39。 實施例140 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:40。 實施例141 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:41。 實施例142 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:42。 實施例143 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:43。 實施例144 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:44。 實施例145 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:45。 實施例146 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:46。 實施例147 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:47。 實施例148 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:48。 實施例149 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:49。 實施例150 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:50。 實施例151 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:51。 實施例152 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:52。 實施例153 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:53。 實施例154 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:54。 實施例155 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:55。 實施例156 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:56。 實施例157 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:57。 實施例158 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:58。 實施例159 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:59。 實施例160 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:60。 實施例161 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:61。 實施例162 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:62。 實施例163 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:63。 實施例164 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:64。 實施例165 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:65。 實施例166 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:66。 實施例167 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:67。 實施例168 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:68。 實施例169 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:69。 實施例170 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:70。 實施例171 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:71。 實施例172 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:72。 實施例173 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:73。 實施例174 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:74。 實施例175 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:75。 實施例176 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:76。 實施例177 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:77。 實施例178 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:78。 實施例179 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:79。 實施例180 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:80。 實施例181 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:81。 實施例182 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:82。 實施例183 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:83。 實施例184 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:84。 實施例185 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:85。 實施例186 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:86。 實施例187 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:87。 實施例188 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:88。 實施例189 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:89。 實施例190 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:90。 實施例191 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:91。 實施例192 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:92。 實施例193 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:93。 實施例194 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:94。 實施例195 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:95。 實施例196 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:96。 實施例197 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:97。 實施例198 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:98。 實施例199 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:99。 實施例200 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:100。 實施例201 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:101。 實施例202 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:102。 實施例203 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:103。 實施例204 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:104。 實施例205 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:105。 實施例206 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:106。 實施例207 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:107。 實施例208 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:108。 實施例209 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:109。 實施例210 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:110。 實施例211 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:111。 實施例212 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:112。 實施例213 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:113。 實施例214 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:114。 實施例215 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:115。 實施例216 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:116。 實施例217 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:117。 實施例218 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:118。 實施例219 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:119。 實施例220 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:120。 實施例221 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:121。 實施例222 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:122。 實施例223 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:123。 實施例224 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:124。 實施例225 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:125。 實施例226 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:126。 實施例227 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:127。 實施例228 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:128。 實施例229 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列為SEQ ID NO:129。 實施例230 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其進一步包含SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141之序列。 實施例231 如實施例230之方法或組合物，其包含SEQ ID NO:130之修飾模式。 實施例232 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中序列係選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139。 實施例233 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:131。 實施例234 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:132。 實施例235 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:133。 實施例236 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:134。 實施例237 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:135。 實施例238 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:136。 實施例239 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:137。 實施例240 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:138。 實施例241 如實施例1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列為SEQ ID NO:139。 實施例242 如技術方案232至241中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之序列包含表2中之相應序列所示之修飾。 實施例243 一種如實施例5至241中任一項之組合物或調配物之用途，其用於製備供用於治療患有AATD之人類個體的藥劑。
本申請案主張2016年12月22日申請的美國臨時申請案第62/438,219號之優先權權益，且該臨時申請案以全文引用之方式併入本文中。 本申請案含有序列表，該序列表已以ASCII格式、以電子方式提交且以全文引用之方式併入本文中。於2017年12月20日創建的該ASCII複本稱為2017-12-20_01155-0005-00PCT_ST25_ v2.txt且大小為92,165個位元組。 本文提供在CRISPR/Cas9系統中適用於編輯SERPINA1 基因之引導RNA組合物。可向具有非野生型SERPINA1 基因序列之個體，諸如患有α-1抗胰蛋白酶缺乏症(「AATD」或「A1AD」)之個體投與呈雙或單引導RNA形式之引導RNA，及經RNA引導之DNA結合劑，例如Cas9，或編碼經RNA引導之DNA結合劑的mRNA，例如編碼Cas9之mRNA。靶向SERPINA1 基因之引導序列展示於表1中之SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129處。本文所述之實驗中所用的對照引導物顯示於SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4處。表 1 ： 所靶向 之 SERPINA1 及對照引導序列命名法、染色體座標及序列 以上引導序列中之每一者可進一步包含其他核苷酸以形成crRNA，例如在引導序列之3'端後具有以下例示性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO:140)。在sgRNA之情況下，以上引導序列可進一步包含其他核苷酸以形成sgRNA，例如在引導序列之3'端後具有以下例示性核苷酸序列：呈5'至3'定位之GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO:141)。 在一些實施例中，sgRNA經修飾。在一些實施例中，經修飾之sgRNA包含表2中所列舉之序列(SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:408及SEQ ID NO:410至SEQ ID NO:421)中之任一者。在表2中，「N」可為任何天然或非天然核苷酸。在一些實施例中，包含SEQ ID NO:130之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:130中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:130中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:410之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:410中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:410中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:411之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:411中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:411中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:412之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:412中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:412中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:413之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:413中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:413中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:414之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:414中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:414中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:415之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:415中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:415中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:416之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:416中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:416中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:417之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:417中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:417中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:418之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:418中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:418中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:419之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:419中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:419中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:420之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:420中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:420中所示之修飾模式。 在一些實施例中，包含SEQ ID NO:421之組合物涵蓋在內，其中SEQ ID NO:421中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換，其中保留SEQ ID NO:421中所示之修飾模式。表 2 ： 經 SERPINA1 靶向之 sgRNA * = PS鍵；'m' = 2'-O-Me核苷酸 除非另外說明，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義： 「聚核苷酸」及「核酸」在本文中意指包含核苷或具有沿主鏈連接在一起的含氮雜環鹼基或鹼基類似物之核苷類似物的多聚化合物，其包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及為其類似物之聚合物。核酸「主鏈」可由多個鍵組成，其包括糖-磷酸二酯鍵、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵、膦酸甲酯鍵或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代，例如2'甲氧基或2'鹵基取代之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)；其類似物(例如經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或其他)；肌核苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如N4-甲基脫氧鳥苷、脫氮或氮雜嘌呤、脫氮或氮雜嘧啶、在5或6位處具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位處具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲胺基嘌呤、O6-甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4-烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般論述，參見The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams等人編, 第11版, 1992。核酸可包括一或多種「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵，或可包括習知組分及取代兩者(例如具有2'甲氧基鍵之習知鹼基或含有習知鹼基及一或多個鹼基類似物兩者的聚合物)。核酸包括「鎖定核酸」(LNA)、含有一或多種LNA核苷酸單體之類似物，該等單體具有模擬糖構形之鎖定於RNA中的雙環呋喃醣單元，其會增強對互補RNA及DNA序列之雜交親和性(Vester及Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且可藉由在RNA中存在尿嘧啶或其類似物及在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物而有所不同。 「引導RNA」、「gRNA」及簡稱「引導物」在本文中互換使用來意指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)或crRNA與trRNA (亦稱為tracrRNA)之組合任一者。crRNA及trRNA可以單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或以兩個獨立RNA分子(雙引導RNA，dgRNA)形式締合。「引導RNA」或「gRNA」或「引導物」係指各類型。trRNA可為天然存在之序列或與天然存在之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。 如本文所用，「引導序列」係指引導RNA中與靶序列互補且用以藉由經RNA引導之DNA結合劑將引導RNA導引至靶序列以供結合或修飾(例如裂解)的序列。「引導序列」亦可稱為「靶序列」或「間隔序列」。引導序列之長度可為20個鹼基對，例如，在針對釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes ) Cas9 (亦即Spy Cas9)及相關Cas9同源物/直系同源物之引導RNA的情況下。較短或較長序列亦可用作引導物，例如長度為15、16、17、18、19、21、22、23、24或25個核苷酸。在一些實施例中，靶序列處於例如基因中或染色體上，且與引導序列互補。在一些實施例中，引導序列與其相應靶序列之間的互補性或一致性之程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，引導序列與標靶區可為100%互補或一致的。在其他實施例中，引導序列與標靶區可含有至少一個錯配。舉例而言，引導序列及靶序列可含有1、2、3或4個錯配，其中靶序列之總長度為至少17、18、19、20或大於20個鹼基對。在一些實施例中，引導序列及標靶區可含有1至4個錯配，其中引導序列包含至少17、18、19、20或大於20個核苷酸。在一些實施例中，引導序列及標靶區可含有1、2、3或4個錯配，其中引導序列包含20個核苷酸。 針對Cas蛋白質之靶序列包括染色體組DNA之正鏈及負鏈兩者(亦即給定序列及該序列之反向互補序列)，因為Cas蛋白質之核酸受質為雙鏈核酸。因此，在論述引導序列「與靶序列互補」之情況下，應理解，引導序列可導引引導RNA結合至靶序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，在引導序列結合靶序列之反向互補序列之情況下，引導序列與靶序列(例如不包括PAM之靶序列)之某些核苷酸相同，不同之處在於引導序列中U取代T。 如本文所用，「經RNA引導之DNA結合劑」意謂具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或此類複合物之DNA結合次單位，其中DNA結合活性具有序列特異性且視RNA之序列而定。經RNA引導之DNA結合劑包括Cas蛋白質(例如Cas9蛋白質)，諸如Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)。如本文所用，「Cas核酸酶」亦稱作「Cas蛋白質」，其涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。Cas蛋白質進一步涵蓋III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單位、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單位及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」為具有經RNA引導之DNA結合活性的單鏈多肽，諸如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如H840A、D10A或N863A變異體)，其進一步具有經RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性，及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性未活化。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A/R661A/Q695A/Q926A變異體)、HypaCas9 (例如N692A/M694A/Q695A/H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A/K1003A/R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A/K1003A/R1060A變異體)蛋白質及其變體。Cpf1蛋白質(Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源且含有RuvC樣核酸酶域。Zetsche等人之Cpf1序列以全文引用之方式併入。參見例如，Zetsche等人，表S1及表S3。「Cas9」涵蓋Spy Cas9、本文中所列的Cas9之變異體及其等效物。參見例如，Makarova等人, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。 如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多之位置與第一序列相匹配，則該第一序列視為「包含與第二序列具有至少X%一致性的序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，因為與第二序列之全部三個位置均出現匹配，所以比對結果為100%一致性。RNA與DNA之間的差異(通常而言，尿苷更換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)的存在不會造成聚核苷酸之間一致性或互補性的差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同互補序列(例如針對胸苷、尿苷或經修飾之尿苷均為腺苷；另一實例為胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，這兩者均以鳥苷或經修飾之鳥苷作為互補序列)即可。因此，舉例而言，序列5'-AXG (其中X為任何經修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)視為與AUG具有100%一致性，因為兩者與同一序列(5'-CAU)完全互補。比對演算法實例為Smith-Waterman及Needleman-Wunsch演算法，其係此項技術中熟知者。熟習此項技術者應理解選擇何種演算法及參數設置才適合所要比對之一對指定序列；對於具有一般類似長度及預期胺基酸有＞50%一致性或核苷酸有＞75%一致性的序列而言，由EBI於www.ebi.ac.uk網站伺服器提供的Needleman-Wunsch演算法介面之具有默認設置(default settings)的Needleman-Wunsch演算法通常為合適的。 「mRNA」在本文中意指非DNA且包含可轉譯成多肽之開放閱讀框架的聚核苷酸(亦即可作為由核糖體及胺基醯化tRNA進行轉譯之受質)。mRNA可包含包括核糖殘基或其類似物，例如2'-甲氧基核糖殘基之磷酸酯-糖主鏈。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。通常而言，mRNA不含大量胸苷殘基(例如0個殘基或小於30、20、10、5、4、3或2個胸苷殘基；或小於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%的胸苷含量)。mRNA可在其一些或全部尿苷位置處含有經修飾之尿苷。 如本文所用，「AAT」或「A1AT」係指α-1抗胰蛋白酶，其為SERPINA1 基因之基因產物。 如本文所用，「AATD」或「A1AD」係指α-1抗胰蛋白酶缺乏症。AATD包含由SERPINA1 中之多種不同遺傳性突變所引起的疾病及病症。AATD可意指表現降低之AAT含量、不表現AAT或表現突變或非功能性AAT之疾病。 適用於本文所述之引導RNA組合物及方法中的引導序列展示於表1中。 如本文所用，「 indel」係指由許多核苷酸組成之插入/缺失突變，該等核苷酸在核酸中之雙鏈斷裂(DSB)位點處進行插入或缺失。 如本文所用，「基因減弱(knockdown)」係指特定基因產物(例如蛋白質、mRNA或兩者)之表現降低。可藉由偵測由組織或細胞群(例如在血清或細胞培養基中)分泌之蛋白質或藉由偵測來自相關組織或細胞群的蛋白質之總細胞量，來量測蛋白質之基因減弱。用於量測mRNA之基因減弱的方法為已知者，且包括對自相關組織或細胞群分離之mRNA進行定序。在一些實施例中，「基因減弱」意指特定基因產物表現有一些損失，例如經轉錄之mRNA的量下降或由細胞群(包括活體內細胞群，諸如彼等出現在組織中者)表現或分泌的蛋白質之量下降。 如本文所用，「基因剔除」係指喪失細胞中特定蛋白質之表現。可藉由偵測由組織或細胞群(例如在血清或細胞培養基中)分泌的蛋白質之量或藉由偵測來自組織或細胞群的蛋白質之總細胞量來量測基因剔除。在一些實施例中，本發明方法在一或多種細胞中(例如在細胞群，包括活體內細胞群，諸如彼等出現在組織中者)「基因剔除」AAT。在一些實施例中，基因剔除並非例如藉由indel導致形成突變AAT蛋白質，而是細胞中完全喪失AAT蛋白質之表現。 如本文所用，「突變AAT」係指與SERPINA1 之野生型胺基酸序列(NCBI基因ID：5265；Ensembl：ENSG00000197249)相比，AAT之胺基酸序列發生變化的SERPINA1 之基因產物(亦即AAT蛋白質)。 如本文所用，「突變SERPINA1 」或「突變SERPINA1 對偶基因」係指與野生型序列(NCBI基因ID：5265；Ensembl：ENSG00000197249)相比，SERPINA1 之核苷酸序列發生變化的SERPINA1 序列。 如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質。在一些實施例中，引導RNA將經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9引導至靶序列，且與經RNA引導之DNA結合劑雜交之引導RNA會裂解該靶序列。 如本文所用，「靶序列」係指靶基因中與gRNA之引導序列互補的核酸序列。靶序列與引導序列之相互作用導引經RNA引導之DNA結合劑結合，且在靶序列中潛在地鏈裂或裂解(視試劑活性而定)。 如本文所用，「治療」係指用於個體之疾病或病症的治療劑的任何投與或施用，且包括抑制疾病、遏制其發展、緩解疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀的復發。舉例而言，AATD之治療可包含緩解AATD之症狀。 如本文所用，AAT之「Z突變體」、「Z型突變體」、「Z變異體」、「PiZ變異體」或「ZZ形式」係指SERPINA1 基因序列中之突變，其導致麩胺酸在AAT之胺基酸序列中誤義突變成離胺酸(E342K突變)。 術語「約」或「大約」意謂如由一般熟習此項技術者所測定的特定值之可接受誤差，其部分視如何量測或測定該值而定。I. 組合物 A. 引導 RNA (gRNA) 在一些實施例中，本發明包含一種包含一或多種引導RNA(gRNA)之組合物，該gRNA包含將經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)導引至SERPINA1 中之DNA靶序列的引導序列。gRNA可包含表1中所示的引導序列中之一或多者。表1之引導序列可進一步包含crRNA及/或trRNA。在本文所述之各組合物及方法實施例中，crRNA及trRNA可在一個RNA (sgRNA)上或可在獨立RNA (dgRNA)上締合。 在本文所述之組合物及方法實施例中之每一者中，引導RNA可包含呈「雙引導RNA」或「dgRNA」形式之兩個RNA分子。dgRNA包含含有引導序列之第一RNA分子(例如crRNA)及含有trRNA之第二RNA分子，該引導序列包含表1中所述之引導序列中之任一者。第一和第二RNA分子並非共價連接，但可經由crRNA與trRNA之各部分之間的鹼基配對形成RNA雙螺旋體。 在本文所述之組合物及方法實施例中之每一者中，引導RNA可包含呈「單引導RNA」或「sgRNA」形式之單一RNA分子。sgRNA包含與trRNA (或其部分)共價連接之crRNA (或其部分)，其包含表1中所述之引導序列中之任一者。在一些實施例中，crRNA與trRNA經由連接子共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA與trRNA之各部分之間的鹼基配對形成莖環結構。 在一些實施例中，trRNA可包含來自天然存在之CRISPR/Cas系統的野生型trRNA序列之全部或一部分。在一些實施例中，trRNA包含經截短或經修飾之野生型trRNA。trRNA之長度視所用CRISPR/Cas系統而定。在一些實施例中，trRNA包含以下或由以下組成：5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或大於100個核苷酸。在一些實施例中，trRNA可包含特定二級結構，諸如一或多種髮夾結構或莖環結構或一或多種隆突結構。 在一些實施例中，本發明包含一或多個引導RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129中之任一者之引導序列。 在一個態樣中，本發明包含gRNA，其包含與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 在其他實施例中，組合物包含至少兩個gRNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任何兩者或大於兩者之引導序列。在一些實施例中，組合物包含至少兩個gRNA，各gRNA與SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之核酸中之任一者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性。 在一些實施例中，gRNA為包含表2中所示之序列(SEQ ID NO 130至SEQ ID NO 139、SEQ ID NO 408及SEQ ID NO 410至SEQ ID NO 421)中之任一者的sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含與SEQ ID NO 130至SEQ ID NO 139及SEQ ID NO 408之核酸中之任一者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的序列。在一些實施例中，在存在或不存在修飾下，sgRNA包含表1中所示之引導序列中之任一者而不是表2之SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:408及SEQ ID NO:410至SEQ ID NO:421處之sgRNA序列中所示之引導序列。 包含表2中所示的序列中之任一者的修飾的引導RNA涵蓋在內且藉由SEQ ID No在其中加以鑑別。亦即，核苷酸可以相同或不同，但所示修飾模式可與表2之gRNA的修飾模式相同或類似。修飾模式包括gRNA或gRNA之區的修飾的相對位置及一致性。在一些實施例中，修飾模式為與表2之序列欄中所示的序列中之任一者之修飾模式具有至少50%、55%、60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%及99%一致性。在一些實施例中，修飾模式在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處與表2之序列或此類序列之區的修飾模式不同。在一些實施例中，gRNA包含在0、1、2、3、4、5或6個核苷酸處不同於表2之序列之修飾的修飾。 本發明之引導RNA組合物設計成識別SERPINA1 基因中之靶序列。舉例而言，可藉由所提供的經RNA引導之DNA結合劑識別且裂解SERPINA1 靶序列。在一些實施例中，可藉由引導RNA將Cas蛋白質導引至SERPINA1 基因之靶序列，其中引導RNA之引導序列與靶序列雜交且Cas蛋白質裂解該靶序列。 在一些實施例中，一或多種引導RNA之選擇係基於SERPINA1 基因中之靶序列而判定。 在不受特定理論束縛之情況下，基因之關鍵區處的突變可能要比基因之非關鍵區處的突變更不可容許，因此DSB之位置在可引起之蛋白質基因減弱或基因剔除的量或類型方面是重要因素。在一些實施例中，使用與SERPINA1 中之靶序列互補或具有互補性的gRNA來將Cas蛋白質導引至SERPINA1 基因中之特定位置。在一些實施例中，gRNA設計成具有與SERPINA1 之外顯子2、3、4或5中之靶序列互補或具有互補性的引導序列。 在一些實施例中，gRNA設計成與編碼AAT之N端區的SERPINA1 之外顯子中的靶序列互補或具有互補性。B. 經化學修飾之 gRNA 在一些實施例中，本發明包含含有一或多種修飾之gRNA。在一些實施例中，修飾包含經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含處於各核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。 咸信經修飾之糖控制核苷酸糖環之起皺，該起皺為影響寡核苷酸對於互補鏈之結合親和力、雙螺旋體形成及與核酸酶之相互作用的物理特性。糖環上之取代可因此改變此等糖之確認及起皺。舉例而言，2'-O -甲基(2'-O-Me)修飾可增加寡核苷酸之結合親和力及核酸酶穩定性，但給定位置處之任何修飾在寡核苷酸中之作用需要憑經驗判定。 術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示經2'-O-Me修飾之核苷酸。 2'-O -甲基之修飾可如下描繪：已顯示影響核苷酸糖環之另一化學修飾為鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2'-氟基(2'-F)取代可增加寡核苷酸結合親和力及核酸酶穩定性。 在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示經2'-F取代之核苷酸。 2'-F之取代可如下描繪：在一些實施例中，修飾可為2'-O-(2-甲氧基乙基) (2'-O-moe)。2'-O-moe核糖核苷酸形式之核糖核苷酸之修飾可如下描繪：術語「moeA」、「moeC」、「moeU」或「moeG」可用於表示經2'-O-moe修飾之核苷酸。 硫代磷酸酯(PS)鍵(linkage/bond)係指硫取代磷酸二酯鍵，例如核苷酸鹼基之間的鍵中之一個非橋聯磷酸酯氧(nonbridging phosphate oxygen)的鍵。當硫代磷酸酯用於產生寡核苷酸時，經修飾之寡核苷酸亦可稱為S-寡核苷酸。 「*」可用於描繪PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示經PS鍵連接至後續(例如3')核苷酸之核苷酸。 在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於表示經2'-O-Me取代且經PS鍵連接至後續(例如3')核苷酸之核苷酸。 下圖顯示將S-取代為非橋聯磷酸酯氧，產生PS鍵來替代磷酸二酯鍵：無鹼基核苷酸係指不具有含氮鹼基之彼等核苷酸。下圖描繪具有缺乏鹼基之無鹼基(亦稱為無嘌呤核酸)位點的寡核苷酸：倒轉鹼基係指具有自正常5'至3'鍵倒轉之鍵(亦即5'至5'鍵或3'至3'鍵)之彼等鹼基。例如：無鹼基核苷酸可附接有倒轉鍵。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5'至5'鍵附接至末端5'核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3'至3'鍵附接至末端3'核苷酸。末端5'或3'核苷酸任一者處之倒轉無鹼基核苷酸亦可稱作倒轉無鹼基端帽。 在一些實施例中，對5'末端之5'端處的前三個、四個或五個核苷酸中之一或多者及3'末端之3'端處的最後三個、四個或五個核苷酸中之一或多者進行修飾。在一些實施例中，修飾為2'-O-Me、2'-F、2'-O-moe、倒轉無鹼基核苷酸、PS鍵或此項技術中熟知的其他核苷酸修飾以增加穩定性及/或效能。 在一些實施例中，5'末端之5'端處的前四個核苷酸及3'末端之3'端處的最後四個核苷酸與硫代磷酸酯(PS)鍵連接。 在一些實施例中，5'末端之5'端處的前三個核苷酸及3'末端之3'端處的最後三個核苷酸包含經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端之5'端處的前三個核苷酸及3'末端之3'端處的最後三個核苷酸包含經2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端之5'端處的前三個核苷酸及3'末端之3'端處的最後三個核苷酸包含倒轉無鹼基核苷酸。 在一些實施例中，引導RNA包含經修飾之sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO:130中所示之修飾模式，其中N為任何天然或非天然核苷酸，且其中全部N均包含將經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)導引至靶序列之引導序列。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID NO:410至SEQ ID NO:421中之任一者中所示的修飾模式，其中N為任何天然或非天然核苷酸，且其中全部N均包含將經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)導引至靶序列之引導序列。在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139中之任一者中所示的sgRNA。在一些實施例中，引導RNA包含含有SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者及SEQ ID NO:408之核苷酸的sgRNA，其中SEQ ID NO:408之核苷酸處於引導序列之3'端上，且其中引導序列可如SEQ ID NO:130中所示加以修飾。在一些實施例中，引導RNA包含含有SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者及SEQ ID NO:141之核苷酸的sgRNA，其中SEQ ID NO:141之核苷酸處於引導序列之3'端上，且其中引導序列可如SEQ ID NO:130中所示加以修飾。 在一些實施例中，本文所揭示之引導RNA包含2016年12月8日申請之US 62/431,756及2017年12月8日申請的標題為「經化學修飾之引導RNA(Chemically Modified Guide RNAs)」之PCT/US17/65306中所揭示之修飾模式中之一者，其內容以全文引用之方式併入本文中。C. 載體 在某些實施例中，本發明包含DNA載體，其包含含有本文所述之引導序列中之任一者或多者的引導RNA中之任一者。在一些實施例中，除了引導RNA序列以外，載體進一步包含不編碼引導RNA之核酸。不編碼引導RNA之核酸包括(但不限於)啟動子、強化子、調節序列及編碼經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)之核酸。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA之核苷酸序列及編碼Cas蛋白質，諸如Cas9之mRNA。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA之核苷酸序列及編碼Cas蛋白質，諸如Cas9之mRNA。在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA之核苷酸序列及編碼Cas蛋白質，諸如Cas9之mRNA。在一個實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即Spy Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列包含或由以下組成：藉由來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分側接的引導序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA組成的核酸可進一步構成載體序列，其中該載體序列包含或由以下組成：不會與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起經天然發現的核酸。 在一些實施例中，crRNA及trRNA由一個載體中之非連續核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由連續核酸編碼。在一些實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相對鏈編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相同鏈編碼。D. 核糖核蛋白複合物 在一些實施例中，包含一或多個gRNA之組合物涵蓋在內，該等gRNA包含來自表1或表2之一或多個引導序列及經RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)。在一些實施例中，gRNA連同諸如Cas9之DNA結合劑稱作核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，經RNA引導之DNA結合劑為Cas蛋白質。在一些實施例中，gRNA連同Cas蛋白質稱作Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含I型、II型或III型組分。在一些實施例中，Cas蛋白質係來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質係來自II型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質係來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質為Cas9。在一些實施例中，Cas蛋白質為Cpf1。在一些實施例中，Cas蛋白質為來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白質。在一些實施例中，gRNA連同Cas9稱作Cas9 RNP。 在涵蓋Cas核酸酶之實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。可衍生出Cas核酸酶或其他RNP組分的非限制性例示性物種包括釀膿鏈球菌、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、鏈球菌屬(Streptococcus sp. )、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、無害李氏菌(Listeria innocua )、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri )、新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida )、產琥珀酸沃廉菌(Wolinella succinogenes )、華德薩特菌(Sutterella wadsworthensis )、γ-變形菌(Gammaproteobacterium )、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis )、空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida )、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogene )、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum )、達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei )、始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis )、產綠色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes )、產綠色鏈黴菌、玫瑰鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum )、玫瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius )、假蕈狀芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides )、砷還原芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens )、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum )、戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii )、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius )、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri )、齒垢密螺旋體(Treponema denticola )、海洋微顫菌(Microscilla marina )、伯克霍爾德氏細菌(Burkholderiales bacterium )、食萘極單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans )、極單胞菌屬(Polaromonas sp. )、瓦氏鱷球藻(Crocosphaera watsonii )、藍絲菌屬(Cyanothece sp. )、綠膿微囊藻(Microcystis aeruginosa )、聚球藻屬(Synechococcus sp. )、阿拉伯糖醋桿菌(Acetohalobium arabaticum )、丹氏製氨菌(Ammonifex degensii )、熱解纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii )、金礦菌候選種(Candidatus Desulforudis )、肉毒梭菌(Clostridium botulinum )、艱難梭菌(Clostridium difficile )、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna )、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus )、熱丙酸鹽暗色厭氧香腸狀菌(Pelotomaculum thermopropionicum )、喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus )、氧化亞鐵嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans )、酒色異著色菌(Allochromatium vinosum )、海桿菌屬(Marinobacter sp. )、嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus )、瓦氏亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni )、遊海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis )、消旋纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer )、調查甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum )、多變念珠藻(Anabaena variabilis )、泡沫節球藻(Nodularia spumigena )、念珠藻屬(Nostoc sp. )、極大節旋藻(Arthrospira maxima )、鈍頂節旋藻(Arthrospira platensis )、節旋藻屬(Arthrospira sp. )、鞘絲藻屬(Lyngbya sp. )、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes )、顫藻屬(Oscillatoria sp. )、運動石袍菌(Petrotoga mobilis )、非洲高熱桿菌(Thermosipho africanus )、巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus )、灰色奈瑟氏菌(Neisseria cinerea )、紅嘴鷗曲桿菌(Campylobacter lari )、食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans )、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria )、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp. )、毛螺科菌 ND2006 (Lachnospiraceae bacterium ND2006)及海洋藻青菌(Acaryochloris marina )。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自釀膿鏈球菌之Cas9蛋白質。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自嗜熱鏈球菌之Cas9蛋白質。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自腦膜炎奈瑟氏菌之Cas9蛋白質。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自金黃色葡萄球菌之Cas9蛋白質。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1蛋白質。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自胺基酸球菌屬之Cpf1蛋白質。在一些實施例中，Cas核酸酶為來自毛螺科菌ND2006之Cpf1蛋白質。 野生型Cas9具有兩個核酸酶域：RuvC及HNH。RuvC域裂解非靶DNA鏈，且HNH域裂解靶DNA鏈。在一些實施例中，Cas9蛋白質包含多於一個RuvC域及/或多於一個HNH域。在一些實施例中，Cas9蛋白質為野生型Cas9。在組合物及方法實施例中之每一者中，Cas誘發靶DNA中發生雙鏈斷裂。 具有一個非活性催化域(RuvC或HNH任一者)之Cas9之經修飾形式被稱為「切口酶(nickase)」。切口酶僅切割靶DNA上之一個鏈，因此產生單鏈斷裂。單鏈斷裂亦可稱為「鏈裂」。在一些實施例中，組合物及方法包括切口酶。在一些實施例中，組合物及方法包括在靶DNA中誘發鏈裂而非雙鏈斷裂之切口酶Cas9。 在一些實施例中，Cas蛋白質可經修飾以僅含有一個功能核酸酶域。舉例而言，Cas蛋白質可經修飾以使得核酸酶域中之一者經突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性RuvC域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH域之切口酶Cas。在一些實施例中，使用具有非活性HNH域之切口酶Cas。 在一些實施例中，Cas蛋白質核酸酶域中之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas蛋白質可在RuvC或RuvC樣核酸酶域中包含胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白質)。參見例如，Zetsche等人 (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas蛋白質可在HNH或HNH樣核酸酶域中包含胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶域中之例示性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A(基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白質)。參見例如，Zetsche等人 (2015)。 在一些實施例中，本文所述之RNP複合物包含切口酶及一對分別與靶序列之有義股及反義股互補之引導RNA。在此實施例中，引導RNA將切口酶導引至靶序列且藉由在靶序列之相對鏈上產生鏈裂而引入DSB(亦即雙鏈裂)。在一些實施例中，使用雙鏈裂可改良特異性且減少脫靶效應。在一些實施例中，連同靶向DNA之相對鏈之兩個獨立引導RNA使用切口酶Cas以在靶DNA中產生雙鏈裂。在一些實施例中，連同經選擇以非常接近之兩個獨立引導RNA使用切口酶Cas以在靶DNA中產生雙鏈裂。 在一些實施例中，使用嵌合Cas蛋白質，其中該蛋白質之一個域或區經不同蛋白質之一部分替代。在一些實施例中，Cas核酸酶域可經來自諸如Fok1之不同核酸酶的域替代。在一些實施例中，Cas蛋白質可為經修飾之核酸酶。 在其他實施例中，Cas蛋白質可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas蛋白質可為Cas3蛋白質。在一些實施例中，Cas蛋白質可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas蛋白質可具有RNA裂解活性。E. gRNA 功效之測定 在一些實施例中，當與RNP之其他組分一起表現時，測定gRNA之功效。在一些實施例中，gRNA與Cas一起表現。在一些實施例中，gRNA在已穩定地表現Cas之細胞株中表現。 使用Cas RNP系統可引起DNA中發生雙鏈斷裂。非同源末端連接(NHEJ)為一種以下方法，藉由該方法，DNA中之雙鏈斷裂(DSB)經由重新連接斷裂末端而得到修補，其可能會產生呈插入/缺失(indel)突變形式之錯誤。在重新連接末端之前，DSB之DNA末端常常已經歷酶處理，其引起在一或兩個鏈處添加或移除核苷酸。重新連接之前的此等添加或移除引起DNA序列中NHEJ修復位點處存在插入或缺失(indel)突變。歸因於indel之多種突變會改變閱讀框架或過早地引入終止密碼子，且因此產生非功能性蛋白質。 在一些實施例中，特定gRNA之功效係基於活體外模型而判定。在一些實施例中，活體外模型為穩定地表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，活體外模型為HUH7人類肝癌細胞。在一些實施例中，活體外模型為sk-Hep人類肝腺癌細胞。在一些實施例中，活體外模型為原生人類肝細胞。在一些實施例中，活體外模型為HepG2細胞。 在一些實施例中，在針對gRNA選擇過程的多個活體外細胞模型中測定特定引導序列之功效。在一些實施例中，進行具有所選gRNA之資料的細胞株比較。在一些實施例中，在多個細胞模型中進行交叉篩選。 在一些實施例中，藉由SERPINA1 之編輯百分比量測引導RNA之功效。在一些實施例中，對SERPINA1 之編輯百分比與對照基因(例如gRNA不靶向之基因)之編輯百分比進行比較。在一些實施例中，對照基因為如表1中所示之對照物1、2、3或4。在一些實施例中，編輯百分率(例如「編輯效率」或「編輯百分比」)定義為相對於序列讀段總數(包括野生型)之具有插入/缺失(「indel」)或取代的序列讀段之總數。在一些實施例中，引導RNA具有為約100%之編輯百分比。在一些實施例中，編輯百分比為在例如5%與10%之間、10%與15%之間、15%與20%之間、20%與25%之間、30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。 在一些實施例中，本文所述之方法及組合物包含脫靶裂解有所降低之引導RNA。在一些實施例中，不存在可偵測之脫靶裂解。在一些實施例中，在SERPINA1 基因中，核苷酸之缺失或插入的發生要比在脫靶位點處多至少50倍或大於50倍。在一些實施例中，在SERPINA1 基因中，核苷酸之缺失或插入的發生要比在脫靶位點處多50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。 在一些實施例中，引導RNA之功效係藉由AAT之分泌量測。在一些實施例中，使用具有培養基之酶聯免疫吸附分析法(ELISA)分析來量測AAT之分泌。在一些實施例中，在用於測量編輯之同一活體外系統中量測AAT之分泌。在一些實施例中，在原生人類肝細胞中量測AAT之分泌。在一些實施例中，在HUH7細胞中量測AAT之分泌。 在一些實施例中，細胞中的AAT之量量測出gRNA之功效。在一些實施例中，使用西方墨點法來量測細胞中的AAT之量。在一些實施例中，所用細胞為HUH7細胞。在一些實施例中，對AAT之量與甘油醛3-磷酸脫氫酶GAPDH(管家基因)之量進行比較以控制細胞數目變化。II. AATD 之治療 在一些實施例中，提供一種誘發SERPINA1 基因中發生雙鏈斷裂(DSB)之方法，該方法包括投與引導RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之任一或多個引導序列，或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者的gRNA以誘發SERPINA1 基因中發生DSB。引導RNA可與經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質，諸如Cas9，或編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質，諸如Cas9的mRNA或載體一起投與。在一些實施例中，所投與之引導RNA為本文所述之引導RNA組合物中之一或多者。 在一些實施例中，提供一種修飾SERPINA1 基因之方法，該方法包括投與引導RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者，或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者的gRNA或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者以修飾SERPINA1 基因。引導RNA可與Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質，諸如Cas9之mRNA或載體一起投與。 在一些實施例中，提供一種治療AATD之方法，該方法包括投與引導RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者，或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者的gRNA或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者以治療AATD。引導RNA可與Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質，諸如Cas9之mRNA或載體一起投與。 在一些實施例中，提供一種減少或防止AAT在個體之血清、肝臟、肝臟組織、肝臟細胞及/或肝細胞中積聚的方法，該方法包括投與引導RNA，其包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者，或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者或多者的gRNA或SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139之sgRNA中之任一者或多者以減少或防止AAT在肝臟、肝臟組織、肝臟細胞及/或肝細胞中積聚。gRNA可與經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質，或編碼Cas蛋白質，諸如Cas9之mRNA或載體一起投與。 在一些實施例中，包含表1或表2之引導序列的gRNA與Cas蛋白質一起誘發DSB，且修復期間之非同源末端連接(NHEJ)會引起SERPINA1 基因中發生突變。在一些實施例中，NHEJ引起核苷酸缺失或插入，其誘發SERPINA1 基因中發生框移或無意義突變。 在一些實施例中，投與本發明之引導RNA(例如以本文所提供之組合物形式)會降低由個體產生的經突變α-1抗胰蛋白酶(AAT)之含量，且因此防止AAT在肝臟中積聚及聚集。 在一些實施例中，個體為哺乳動物。在一些實施例中，個體為人類。在一些實施例中，個體為母牛、豬、猴、綿羊、狗、貓、魚或家禽。 在一些實施例中，提供使用包含表1或表2中之引導序列中之任一者或多者的引導RNA(例如以本文所提供之組合物形式)以用於製備供用於治療患有AATD之人類個體的藥劑。 在一些實施例中，靜脈內投與引導RNA、組合物及調配物。在一些實施例中，將引導RNA、組合物及調配物投與至肝循環中。 在一些實施例中，單次投與本發明之引導RNA(例如以本文所提供之組合物形式)對於突變蛋白質之基因減弱為足夠的。在一些實施例中，單次投與本發明之引導RNA(例如以本文所提供之組合物形式)對於突變蛋白質之基因減弱或剔除表現為足夠的。在其他實施例中，多於一次投與本發明之引導RNA(例如以本文所提供之組合物形式)對於經由累積作用使編輯最大化可為有益的。 在一些實施例中，在遞送之後1年、2年、3年、4年、5年或10年會看到使用本發明組合物之處理的功效。 在一些實施例中，治療會減緩或中斷肝病進展。在一些實施例中，治療會改良肝病量測結果。在一些實施例中，藉由個體中之肝臟結構變化、肝功能或症狀量測肝病。 在一些實施例中，藉由延遲或避免在個體中進行肝臟移植來量測治療功效。在一些實施例中，藉由增加個體之存活時間來量測治療功效。 在一些實施例中，藉由降低血液中之肝酶來量測治療功效。在一些實施例中，肝酶為丙胺酸轉胺酶(ALT)或天冬胺酸轉胺酶(AST)。 在一些實施例中，藉由基於活組織檢查結果減緩在肝臟中產生疤痕組織或減少疤痕組織來量測治療功效。 在一些實施例中，使用經患者報導之結果，諸如疲勞、無力、瘙癢、食慾不振、體重減輕、噁心或腹脹來量測治療功效。藉由減少水腫、腹水或黃疸來量測治療功效。在一些實施例中，藉由減少門靜脈高血壓來量測治療功效。在一些實施例中，藉由降低肝癌率來量測治療功效。 在一些實施例中，使用成像方法來量測治療功效。在一些實施例中，成像方法為超音波、電腦斷層攝影術、磁共振成像法或彈性成像。 在一些實施例中，相較於投與組合物之前的血清及/或肝臟AAT含量，血清及/或肝臟AAT含量降低40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%、90%至95%、95%至98%、98%至99%或99%至100%。 在一些實施例中，SERPINA1 基因之編輯百分比在30%與99%之間。在一些實施例中，編輯百分比在30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。A. 組合療法 在一些實施例中，本發明包含組合療法，其包含含有表1中所揭示之引導序列中之任一者或多者的gRNA中之任一者或表2中之sgRNA中之任一者或多者(例如呈本文所提供之組合物形式)及適用於緩解AATD之肺症狀的增強療法。在一些實施例中，針對肺病之增強療法為利用自人類血漿純化之AAT的靜脈內療法，如Turner, BioDrugs 2013 Dec;27(6):547-58 中所述。在一些實施例中，增強療法利用Prolastin® 、Zemaira® 、Aralast® 或Kamada® 。 在一些實施例中，組合療法包含含有表1中所揭示之引導序列中之任一者或多者的gRNA中之任一者或表2中之sgRNA中之任一者或多者(例如呈本文所提供之組合物形式)及靶向ATT或突變ATT之siRNA。在一些實施例中，siRNA為能夠進一步減少或消除野生型或突變AAT之表現的任何siRNA。在一些實施例中，在包含表1中所揭示之引導序列中之任一者或多者的gRNA中之任一者或表2中之sgRNA中之任一者或多者(例如呈本文所提供之組合物形式)之後投與siRNA。在一些實施例中，在用本文所提供之gRNA組合物中之任一者處理之後定期投與siRNA。B. gRNA 之遞送 單獨的或編碼於一或多種載體上的本文所述之引導RNA組合物調配於脂質奈米粒子中或經由脂質奈米粒子投與；參見例如2017年3月30日申請的標題為「CRISPR/CAS組分之脂質奈米粒子調配物(LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS)」之PCT/US2017/024973，其內容以全文引用之方式併入本文中。熟習此項技術者已知的能夠將核苷酸遞送至個體的任何脂質奈米粒子(LNP)調配物可與本文所述之引導RNA、以及編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas或Cas9的mRNA或經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas或Cas9蛋白質本身任一者一起利用。 在一些實施例中，本發明包含一種向個體遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法，其中gRNA與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP亦與經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9，或編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9的mRNA締合。 在一些實施例中，本發明包含一種包含所揭示之gRNA中之任一者及LNP之組合物。在一些實施例中，組合物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。 在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含脂質，諸如CCD脂質，諸如脂質A (十八-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，亦稱作(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯)、脂質B (((5-((二甲胺基)甲基)-l,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,l-二基)雙(癸酸酯)，亦稱作((5-((二甲胺基)甲基)-l,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,l-二基)雙(癸酸酯))、脂質C (2-((4-(((3-(二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六醯基)氧基)丙烷-l,3-二基(9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-雙(十八-9, 12-二烯酸酯))或脂質D (3-辛基十一烷酸-(((3-(二甲胺基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛醯氧基)十三烷酯)。在一些實施例中，LNP包含約4.5之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯之莫耳比(N:P)。 在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP供用於製備用於治療AATD之藥劑。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP供用於製備用於減少或防止AAT在患有AATD之個體中積聚及聚集的藥劑。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP供用於製備用於降低血清及/或肝臟AAT濃度之藥劑。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP供用於治療個體，諸如哺乳動物，例如靈長類動物(諸如人類)中之AATD。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP供用於減少或防止AAT在患有AATD之個體，諸如哺乳動物，例如靈長類動物(諸如人類)中積聚及聚集。在一些實施例中，與本文所揭示之gRNA締合的LNP供用於降低個體，諸如哺乳動物，例如靈長類動物(諸如人類)中之血清AAT濃度。 電致孔為遞送負荷之熟知手段，且任何電致孔方法可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者。在一些實施例中，電致孔可用於遞送本文所揭示之gRNA中之任一者及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9，或編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9之mRNA。 在一些實施例中，本發明包含一種向離體細胞遞送本文所揭示之gRNA中之任一者之方法，其中gRNA與LNP締合或不與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas9，或編碼經RNA引導之DNA劑，諸如Cas9的mRNA締合。 在某些實施例中，本發明包含DNA或RNA載體，其編碼包含本文所述之引導序列中之任一者或多者的引導RNA中之任一者。在某些實施例中，本發明包含編碼本文所述之引導序列中之任一者或多者的DNA或RNA載體。在一些實施例中，除了引導RNA序列以外，載體進一步包含不編碼引導RNA之核酸。不編碼引導RNA之核酸包括(但不限於)啟動子、強化子、調節序列及編碼經RNA引導之DNA結合劑(其可為核酸酶，諸如Cas9)之核酸。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼sgRNA之核苷酸序列及編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA，該經RNA引導之DNA結合劑可為Cas蛋白質，諸如Cas9或Cpf1。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA之核苷酸序列及編碼經RNA引導之DNA結合劑之mRNA，該經RNA引導之DNA結合劑可為Cas蛋白質，諸如Cas9或Cpf1。在一個實施例中，Cas9來自釀膿鏈球菌(亦即Spy Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA(其可為sgRNA)之核苷酸序列包含或由以下組成：藉由來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分側接的引導序列。包含或由crRNA、trRNA或crRNA及trRNA組成的核酸可進一步構成載體序列，其中該載體序列包含或由以下組成：不會與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起經天然發現的核酸。 在一些實施例中，crRNA及trRNA由一個載體中之非連續核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由連續核酸編碼。在一些實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相對鏈編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相同鏈編碼。 在一些實施例中，載體可為環狀。在其他實施例中，載體可為線性。在一些實施例中，載體可包封於脂質奈米粒子、脂質體非脂質奈米粒子或病毒衣殼中。非限制性例示性載體包括質體、噬質體、黏質體、人工染色體、袖珍染色體、轉座子、病毒載體及表現載體。 在一些實施例中，載體可為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體可由其野生型對應物遺傳修飾。舉例而言，病毒載體可包含一或多種核苷酸之插入、缺失或取代以促進選殖或使得載體之一或多個特性發生變化。此類特性可包括包裝容量、轉導效率、免疫原性、基因組整合、複製、轉錄及轉譯。在一些實施例中，病毒基因組之一部分可缺失以使得病毒能夠包裝具有較大尺寸之外源性序列。在一些實施例中，病毒載體可具有經增強之轉導效率。在一些實施例中，宿主中藉由病毒誘發之免疫反應可有所減少。在一些實施例中，促進將病毒序列整合至宿主基因組中的病毒基因(諸如整合酶)可經突變以使得病毒變成非整合性的。在一些實施例中，病毒載體可為複製缺陷型。在一些實施例中，病毒載體可包含外源性轉錄或轉譯控制序列以驅動載體上的編碼序列之表現。在一些實施例中，病毒可為輔助依賴型。舉例而言，病毒可需要一或多種輔助病毒來供給所需病毒組分(諸如病毒蛋白)以擴增載體且將載體包裝於病毒粒子中。在此情況下，可將一或多種輔助組分，包括一或多個編碼該等病毒組分之載體引入至宿主細胞以及本文所述之載體系統中。在其他實施例中，病毒可不含輔助病毒。舉例而言，病毒可能夠擴增及包裝載體而不需要任何輔助病毒。在一些實施例中，本文所述之載體系統亦可編碼病毒擴增及包裝所需的病毒組分。 非限制性例示性病毒載體包括腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、腺病毒載體、輔助依賴型腺病毒載體(HDAd)、單純疱疹病毒(HSV-1)載體、噬菌體T4、桿狀病毒載體及反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體可為AAV載體。在一些實施例中，病毒載體為AAV2、AAV3、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAVLK03。在其他實施例中，病毒載體可為慢病毒載體。 在一些實施例中，慢病毒可為非整合性的。在一些實施例中，病毒載體可為腺病毒載體。在一些實施例中，腺病毒可為高選殖容量或「無腸(gutless)」腺病毒，其中除5'及3'倒轉末端重複序列(ITR)及包裝信號(『I』)之外的所有病毒編碼區從病毒中被刪除以增加其包裝容量。在又其他實施例中，病毒載體可為HSV-1載體。在一些實施例中，HSV-1類載體為輔助依賴型，且在其他實施例中，其為非輔助依賴型。舉例而言，僅保留包裝序列之擴增子載體需要具有結構性組分之輔助病毒用於包裝，而移除非必需病毒功能的缺失30kb之HSV-1載體不需要輔助病毒。在其他實施例中，病毒載體可為噬菌體T4。在一些實施例中，當清空病毒頭時，噬菌體T4可能夠包裝任何直鏈或環狀DNA或RNA分子。在其他實施例中，病毒載體可為桿狀病毒載體。在又其他實施例中，病毒載體可為反轉錄病毒載體。在使用具有較小選殖容量之AAV或慢病毒載體之實施例中，可能需要使用多於一個載體以遞送如本文所揭示之載體系統的全部組分。舉例而言，一個AAV載體可含有編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質(例如Cas9)之序列，而第二AAV載體可含有一或多個引導序列。 在一些實施例中，載體可能夠驅動細胞中一或多個編碼序列之表現。在一些實施例中，細胞可為原核細胞，諸如細菌細胞。在一些實施例中，細胞可為真核細胞，諸如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞。在一些實施例中，真核細胞可為哺乳動物細胞。在一些實施例中，真核細胞可為嚙齒動物細胞。在一些實施例中，真核細胞可為人類細胞。驅動不同類型細胞中之表現的適合啟動子為此項技術中已知的。在一些實施例中，啟動子可為野生型。在其他實施例中，啟動子可經修飾以供較高效或較有效表現。在又其他實施例中，啟動子可經截短但仍保留其功能。舉例而言，啟動子可具有正常尺寸或適用於將載體適當包裝於病毒中的減小之尺寸。 在一些實施例中，載體可包含編碼本文所述之經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質(例如Cas9)的核苷酸序列。在一些實施例中，藉由載體編碼之核酸酶可為Cas蛋白質。在一些實施例中，載體系統可包含一個編碼核酸酶之核苷酸序列的複本。在其他實施例中，載體系統可包含多於一個編碼核酸酶之核苷酸序列的複本。在一些實施例中，編碼核酸酶之核苷酸序列可與至少一個轉錄或轉譯控制序列可操作地連接。在一些實施例中，編碼核酸酶之核苷酸序列可與至少一個啟動子可操作地連接。 在一些實施例中，啟動子可為組成性、誘導性或組織特異性的。在一些實施例中，啟動子可為組成性啟動子。非限制性例示性的組成性啟動子包括細胞巨大病毒即刻早期啟動子(CMV)、猴病毒(SV40)啟動子、腺病毒主要晚期啟動子(MLP)、勞斯肉瘤病毒(RSV)啟動子、小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子、磷酸甘油酸激酶(PGK)啟動子、延長因子-α (EF1a)啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、其功能性片段或前述中之任一者之組合。在一些實施例中，啟動子可為CMV啟動子。在一些實施例中，啟動子可為經截短之CMV啟動子。在其他實施例中，啟動子可為EF1a啟動子。在一些實施例中，啟動子可為誘導性啟動子。非限制性例示性的誘導性啟動子包括可藉由熱衝擊、光、化學物質、肽、金屬、類固醇、抗生素或醇誘導之誘導性啟動子。在一些實施例中，誘導性啟動子可為具有低基礎(非經誘導)表現程度之一種誘導性啟動子，諸如Tet-On® 啟動子(Clontech)。 在一些實施例中，啟動子可為組織特異性啟動子，例如對肝臟中之表現具有特異性的啟動子。 載體可進一步包含編碼本文所述之引導RNA的核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含引導RNA之一個複本。在其他實施例中，載體包含引導RNA之多於一個複本。在具有多於一個引導RNA之實施例中，引導RNA可不同使得其靶向不同靶序列，或可相同以便其靶向相同靶序列。在其中載體包含多於一個引導RNA之一些實施例中，各引導RNA可具有其他不同特性，諸如在與經RNA引導之DNA核酸酶的複合物，諸如Cas RNP複合物中的活性或穩定性。在一些實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可與至少一個轉錄或轉譯控制序列，諸如啟動子、3' UTR或5' UTR可操作地連接。在一個實施例中，啟動子可為tRNA啟動子，例如tRNALys3 ，或tRNA嵌合體。參見Mefferd等人,RNA . 2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res . 2007 35: 2620-2628。在一些實施例中，啟動子可藉由RNA聚合酶III (Pol III)識別。Pol III啟動子之非限制性實例包括U6及H1啟動子。在一些實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可與小鼠或人類U6啟動子可操作地連接。在其他實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可與小鼠或人類H1啟動子可操作地連接。在具有多於一個引導RNA之實施例中，用於驅動表現之啟動子可相同或不同。在一些實施例中，編碼引導RNA之crRNA的核苷酸及編碼引導RNA之trRNA的核苷酸可提供於相同載體上。在一些實施例中，編碼crRNA之核苷酸及編碼trRNA之核苷酸可藉由同一啟動子驅動。在一些實施例中，crRNA及trRNA可轉錄為單一轉錄物。舉例而言，crRNA及trRNA可由單一轉錄物進行處理以形成雙分子引導RNA。或者，crRNA及trRNA可轉錄為單分子引導RNA (sgRNA)。在其他實施例中，crRNA及trRNA可藉由其處於相同載體上之相應啟動子來驅動。在又其他實施例中，crRNA及trRNA可藉由不同載體編碼。 在一些實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可位於包含編碼經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質的核苷酸序列之相同載體上。在一些實施例中，引導RNA之表現及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質之表現可藉由其自身相應啟動子來驅動。在一些實施例中，引導RNA之表現可藉由驅動經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質之表現的相同啟動子來驅動。在一些實施例中，引導RNA及經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質轉錄物可包含於單一轉錄物中。舉例而言，引導RNA可處於經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質轉錄物之未轉譯區(UTR)中。在一些實施例中，引導RNA可處於轉錄物之5' UTR中。在一些實施例中，引導RNA可處於轉錄物之3' UTR中。在一些實施例中，轉錄物之胞內半衰期可藉由在其3' UTR中含有引導RNA且藉此縮短其3' UTR之長度而降低。在其他實施例中，引導RNA可處於轉錄物之內含子中。在一些實施例中，可在引導RNA所處之內含子處添加適合剪接位點以使得自轉錄物恰當地剪接掉引導RNA。在一些實施例中，時間上緊鄰的來自相同載體的經RNA引導之DNA結合劑，諸如Cas蛋白質及引導RNA之表現可促進較高效形成CRISPR RNP複合物。 在一些實施例中，組合物包含載體系統。在一些實施例中，載體系統可包含一個單一載體。在其他實施例中，載體系統可包含兩個載體。在其他實施例中，載體系統可包含三個載體。當將不同引導RNA用於多工(multiplexing)時或當使用引導RNA之多個複本時，載體系統可包含多於三個載體。 在一些實施例中，載體系統可包含誘導性啟動子以僅在其遞送至靶細胞之後開始表現。非限制性例示性的誘導性啟動子包括可藉由熱衝擊、光、化學物質、肽、金屬、類固醇、抗生素或醇誘導之誘導性啟動子。在一些實施例中，誘導性啟動子可為具有低基礎(非經誘導)表現程度之一種誘導性啟動子，諸如Tet-On®啟動子(Clontech)。 在其他實施例中，載體系統可包含組織特異性啟動子以僅在其遞送至特定組織中之後開始表現。 載體可藉由脂質體、奈米粒子、胞外體或微囊泡遞送。載體亦可藉由脂質奈米粒子(LNP)遞送。本文所述之LNP及LNP調配物中之任一者適用於遞送單獨的引導物或與Cas核酸酶或編碼Cas核酸酶之mRNA一起遞送。在一些實施例中，涵蓋一種包含以下之LNP組合物：RNA組分及脂質組分，其中脂質組分包含胺脂質、中性脂質、輔助脂質及隱形脂質；且其中N/P比為約1至10。 在一些情況下，脂質組分包含脂質A、膽固醇、DSPC及PEG-DMG；且其中N/P比為約1至10。在一些實施例中，脂質組分包含：約40至60 mol%胺脂質；約5至15 mol%中性脂質；及約1.5%至10 mol% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分為輔助脂質，且其中LNP組合物之N/P比為約3至10。在一些實施例中，脂質組分包含約50至60 mol%胺脂質；約8至10 mol%中性脂質；及約2.5%至4 mol% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分為輔助脂質，且其中LNP組合物之N/P比為約3至8。在一些情況下，脂質組分包含：約50至60 mol%胺脂質；約5至15 mol% DSPC；及約2.5%至4 mol% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分為膽固醇，且其中LNP組合物之N/P比為約3至8。在一些情況下，脂質組分包含：48至53 mol%脂質A；約8至10 mol% DSPC；及約1.5%至10 mol% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分為膽固醇，且其中LNP組合物之N/P比為3至8 ± 0.2。 在一些實施例中，可系統地遞送載體。在一些實施例中，載體可遞送於肝循環中。 在一些實施例中，可系統地遞送載體。在一些實施例中，載體可遞送於肝循環中。III. 特定實施例之敍述 在一些實施例中，本發明包含一種包含引導RNA之組合物，該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列。在一些情況下，提供一種包含引導RNA之組合物，該引導RNA包含與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 引導RNA可與人類SERPINA1 基因中所存在之靶序列至少部分互補。 引導RNA可將核酸酶導引至處於人類SERPINA1 基因之外顯子2、3、4或5中的靶序列。 在一些實施例中，引導RNA將核酸酶導引至處於人類SERPINA1 基因之外顯子2中的靶序列。在一些情況下，靶向外顯子2之引導RNA選自CR001370、CR001373、CR001374、CR001376、CR001379、CR001380、CR001386、CR001386、CR003196、CR001391、CR003198、CR001395、CR001397、CR001400、CR001404、CR001405、CR003208、CR001409、CR001413、CR001421、CR001422及CR001427。 在一些實施例中，引導RNA將核酸酶導引至處於人類SERPINA1 基因之外顯子3中的靶序列。在一些情況下，靶向外顯子3之引導RNA選自CR001450、CR003214、CR001453、CR001454及CR003217。 在一些實施例中，引導RNA將核酸酶導引至處於人類SERPINA1 基因之外顯子4中的靶序列。在一些情況下，靶向外顯子4之引導RNA選自CR003225及CR003226。 在一些實施例中，引導RNA將核酸酶導引至處於人類SERPINA1 基因之外顯子5中的靶序列。在一些情況下，靶向外顯子5之引導RNA選自CR001475及CR001476。 在一些情況下，引導RNA為雙引導(dgRNA)。引導亦可為單引導RNA(sgRNA)。 在一些實施例中，本發明包含含有本文所揭示之引導序列中之任一者的crRNA，且其進一步包含SEQ ID NO:140之核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140之核苷酸在引導序列之3'端後。在一些實施例中，雙引導RNA進一步包含trRNA。 在一些實施例中，本發明包含含有選自SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:408之序列的sgRNA。 在一些情況下，sgRNA包含與選自SEQ ID NO:130至SEQ ID NO:139或SEQ ID NO:408之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。 本發明包含含有SEQ ID NO:130之核苷酸的sgRNA，其中N為任何天然或非天然核苷酸，且其中各N共同地形成使Cas9靶向SERPINA1 基因之引導序列。 在一些實施例中，sgRNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129中之任一者的引導序列。 在一些實施例中，提供包含SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列中之任一者及SEQ ID NO:408之核苷酸的sgRNA。 在一些實施例中，在載體上編碼引導序列。在一些實施例中，引導RNA包含與SERPINA1 之正鏈中的靶序列互補的引導序列。在一些實施例中，引導RNA包含與SERPINA1 之負鏈中的靶序列互補的引導序列。 在一些實施例中，包含引導序列之引導RNA進一步包含第二引導序列，其中第一引導序列與SERPINA1 基因之正鏈中的第一靶序列互補，且第二引導序列與SERPINA1 基因之負鏈中的第二靶序列互補。 本發明之引導RNA可經修飾。在一些實施例中，修飾包含經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含處於各核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。在一些實施例中，修飾包含經2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包含倒轉無鹼基核苷酸。 在一些實施例中，在5’端前五個核苷酸中之一或多處進行修飾。在一些實施例中，在3’端最後五個核苷酸中之一或多處進行修飾。 在一些實施例中，修飾包含處於前四個核苷酸之間的PS鍵。在一些實施例中，修飾包含處於最後四個核苷酸之間的PS鍵。經PS修飾之引導物可進一步包含處於5’端前三個核苷酸處和3’端最後三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。 在一些實施例中，引導RNA包含經修飾之SEQ ID NO:408之核苷酸。 在一些實施例中，提供一種包含所述引導RNA中之任一者及醫藥學上可接受之賦形劑或載劑的組合物或調配物。 在一些實施例中，提供包含與脂質奈米粒子(LNP)締合的如本文所述之引導RNA的組合物。 組合物可進一步包含核酸酶蛋白質或編碼核酸酶之mRNA。 在一些實施例中，核酸酶為Cas。在一些實施例中，Cas為Cas9。在一些實施例中，Cas為Cpf1。在一些實施例中，核酸酶為切口酶。在一些實施例中，核酸酶經修飾。在一些實施例中，經修飾之核酸酶包含核定位信號(NLS)。 在一些實施例中，Cas係來自I型、II型或III型CRISPR/Cas系統。 在一些實施例中，提供一種誘發SERPINA1 基因中發生雙鏈斷裂(DSB)之方法，該包含投與本文所述之引導RNA、組合物或調配物中之任一者或多者。 在一些實施例中，提供一種修飾SERPINA1 基因之方法，該方法包括遞送Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質之核酸及本文所述之引導RNA、組合物或調配物中之任一者或多者。 在一些實施例中，提供一種治療AATD之方法，該方法包括投與Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質之核酸及本文所述之引導RNA、組合物或調配物中之任一者或多者，藉此治療AATD。 在一些實施例中，提供一種用於減少或防止AAT在個體之肝臟中積聚的方法，該方法包括投與Cas蛋白質或編碼Cas蛋白質之核酸及本文所述之引導RNA、組合物或調配物中之任一者或多者，藉此減少AAT在肝臟中積聚。 在一些實施例中，肝臟細胞中之ATT得到減少或阻止。在一些實施例中，肝臟細胞為肝細胞。 在一些方法及用途實施例中，個體患有AATD。 在一些實施例中，非同源末端連接(NHEJ)在修復SERPINA1 基因中之DSB期間引起突變。在一些情況下，NHEJ在修復SERPINA1 基因中之DSB期間引起核苷酸缺失或插入。在一些實施例中，核苷酸之缺失或插入誘發SERPINA1 基因中發生框移或無意義突變。 在一些實施例中，投與會降低α-1抗胰蛋白酶(AAT)之含量。可在血清、血漿、血液、大腦脊髓液或痰中量測AAT含量。可在肝臟組織中量測AAT之含量。 在一些方法及用途實施例中，個體為人類。人類個體可具有α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。個體可具有AATD家族病史。個體可具有AATD之肝臟及肺症狀。個體可僅具有或主要具有AATD之肝臟症狀。 在一些實施例中，個體表現具有E342K突變之AAT。在一些實施例中，個體在SERPINA1基因座處具有至少一個Z對偶基因。在一些實施例中，個體在SERPINA1基因座處具有至少一個S對偶基因。在一些實施例中，個體之Z對偶基因在SERPINA1基因座處為同種接合的。在一些實施例中，個體之Z對偶基因在SERPINA1基因座處為異種接合的。在一些實施例中，個體在SERPINA1基因座處具有一個Z對偶基因及一個S對偶基因。 個體在AAT之胺基酸序列處可不具有E342K突變，但仍具有降低含量之野生型AAT。 在一些實施例中，在投與之後，個體之水腫、腹水或黃疸有所改善、穩定或減緩或對肝臟移植之需要有所延遲。在一些實施例中，在投與之後，如藉由成像方法或肝酶含量所量測，個體由於投藥而具有改善、穩定或減緩變化。 可經由病毒載體投與本文所述之引導物、組合物或醫藥調配物中之任一者。 可經由脂質奈米粒子投與本文所述之引導物、組合物或醫藥調配物中之任一者。 在一些實施例中，在投與引導物、組合物或調配物之前針對SERPINA1 基因中之特定突變測試個體。 在一些實施例中，涵蓋本文所述之引導物、組合物或調配物中之任一者之用途，其用於製備供用於治療患有AATD之人類個體的藥劑。 本說明書及例示性實施例不應視為限制性的。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另外指示，否則表示量、百分比或比例，及說明書及申請專利範圍中所用之其他數值的所有數目均應理解為在所有情況下藉由術語「約」修飾，程度為其尚未如此修飾。因此，除非有相反指示，否則本說明書及所附申請專利範圍中所闡述之數值參數為可視設法獲得之所需特性而變化的近似值。至少，且不試圖將均等論之應用限於申請專利範圍之範疇，各數值參數至少應根據所報導之有效數位之個數且藉由應用普通捨入技術來解釋。 應注意，如在本說明書及申請專利範圍中所用，除非明確地且肯定地限於一個指示物，否則單數形式「一(a/an)」與「該」及任何字語之任何單數使用包括複數個指示物。如本文所用，術語「包括」及其語法變體意欲為非限制性的，使得清單中之項之列舉不排除可取代或添加至所列項之其他類似項。實例 提供以下實例以說明某些所揭示之實施例且不應理解為以任何方式限制本發明之範疇。實例 1- 材料及方法 1. 核酸酶 mRNA 之活體外轉錄 ( 「 IVT 」 ) 使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶藉由活體外轉錄產生含有N1-甲基假-U之加帽及聚腺苷酸化釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。藉由與XbaI利用以下條件在37℃下培育2小時來線性化含有T7啟動子及100 nt 聚(A/T)區之質體DNA：200 ng/µL質體、2 U/µL XbaI (NEB)及1×反應緩衝液。藉由在65℃下加熱反應20分鐘來滅活XbaI。使用二氧化矽最大自旋管柱(Epoch Life Sciences)自酶及緩衝鹽純化線性化質體且藉由瓊脂糖凝膠加以分析以證實線性化。用於產生經Cas9修飾之mRNA的IVT反應物在37℃下在以下條件下培育4小時：50 ng/µL線性化質體；2 mM之GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)中之每一者；10 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠RNA酶抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。在培育4小時之後，添加TURBO DNA酶(ThermoFisher)至0.01 U/µL之最終濃度，且再培育反應物30分鐘以移除DNA模板。使用MegaClear轉錄清除套組根據製造商方案(ThermoFisher)自酶及核苷酸純化Cas9 mRNA。藉由量測260 nm處之光吸收(Nanodrop)測定轉錄物濃度，且藉由以Bioanlayzer (Agilent)進行毛細電泳法而分析轉錄物。 對於實例2及實例3中所述之實驗，使用包含SEQ ID NO:422之質體DNA模板來產生IVT Cas9 mRNA。對於實例4及實例5中所述之實驗，使用包含SEQ ID NO:423之質體DNA模板來產生IVT Cas9 mRNA。 實例2及實例3中所用的用於產生IVT mRNA之DNA序列(SEQ ID NO:422)： 實例4及實例5中所用的用於產生IVT mRNA之DNA序列(SEQ ID NO:423)： 2. 人類 SERPINA1 引導設計和具有食蟹獼猴同源性之人類 SERPINA1 引導設計 使用人類參考基因組(例如，hg38)和使用者定義之相關基因組區(例如編碼外顯子之SERPINA1 蛋白質)經由計算機進行初始引導選擇以鑑別相關區中之PAM。對於各經鑑別之PAM，進行分析且報導統計資料。基於此項技術中已知的多種準則(例如GC含量、預測中靶活動和可能之脫靶活動)進一步選擇gRNA分子且進行等級排序。 針對靶向外顯子2和外顯子3中之蛋白質編碼區的SERPINA1 (ENSG00000197249.13)設計總共88個引導RNA。將此等88個引導物加上4個對照引導物置放於96孔格式中。同時，將靶向在食蟹獼猴中具有100%同源性的SERPINA1 之外顯子2至5的51個引導RNA加上4個對照引導物(一式兩份)置放於96孔格式中。引導RNA中之引導序列及相應基因組座標提供於下文中(表1)。 3. Cas9 mRNA 及引導 RNA 活體外遞送 在補充有10%胎牛血清及500 µg/ml G418之DMEM培養基中培養組成性表現Spy Cas9 (「HEK293_Cas9」)之人胎腎腺癌細胞株HEK293。在轉染之前20小時在96孔板中以10,000個細胞/孔之密度塗鋪細胞(在轉染時間時匯合~70%)。根據製造商方案用脂染胺RNAiMAX (Lipofectamine RNAiMAX) (ThermoFisher，目錄號13778150)轉染細胞。用含有獨立crRNA (25 nM)、trRNA (25 nM)、Lipofectamine RNAiMAX (0.3微升/孔)及OptiMem之脂複合體轉染細胞。 在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養人類肝細胞癌細胞株HUH7 (研究生物資源日本保藏細胞庫(Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank)，目錄號JCRB0403)。在轉染之前20小時在96孔板中以15,000個細胞/孔之密度塗鋪細胞(在轉染時間時匯合~70%)。根據製造商方案用脂染胺MessengerMAX (ThermoFisher，目錄號LMRNA003)轉染細胞。用含有Spy Cas9 mRNA (100 ng)、MessengerMAX (0.3微升/孔)及OptiMem之脂複合體，隨後用含有獨立crRNA (25 nM)、示蹤RNA (25 nM)、MessengerMAX (0.3微升/孔)及OptiMem之單獨脂複合體依序轉染細胞。 根據製造商(Invitrogen，方案11.28.2012)培養原代人類肝臟肝細胞(PHH) (Gibco，批號Hu8249)。簡言之，解凍細胞且再懸浮於具有補充劑(Gibco，目錄號CM7500)之肝細胞解凍培養基中，隨後加以離心。丟棄上清液且將經粒化之細胞再懸浮於肝細胞塗鋪培養基加上補充包(Invitrogen，目錄號A1217601及CM3000)中。對細胞進行計數且以33,000個細胞/孔之密度塗鋪於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔板(ThermoFisher，目錄號877272)上。使經塗鋪之細胞在處於37℃及5% CO2 氛圍下之組織培養恆溫箱中靜置且黏附持續5小時。在培育之後，針對單層形式檢查細胞且用具有無血清補充包(Invitrogen，目錄號A1217601及CM4000)之肝細胞培養基洗滌一次。同時，藉由混合等量之試劑且在95℃下培育2 min且冷卻至室溫來對獨立crRNA及trRNA進行預退火。將由經預退火之crRNA及trRNA組成之雙引導物(dgRNA)與Spy Cas9蛋白質一起培育以形成核糖核蛋白(RNP)複合物。根據製造商方案用脂染胺RNAiMAX (ThermoFisher，目錄號13778150)轉染細胞。用含有Spy Cas9 (10nM)、獨立crRNA (10 nM)、示蹤RNA (10 nM)、脂染胺 RNAiMAX (1.0微升/孔)及OptiMem之RNP轉染細胞。 在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養人類肝細胞癌細胞株HepG2 (美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection)，目錄號HB-8065)。對細胞進行計數且以96孔板中每個孔15,000個細胞之密度塗鋪於經Bio-coat膠原蛋白I塗佈之96孔板(ThermoFisher，目錄號877272)上，24小時之後與LNP一起培育，如實例4中進一步描述。 4. 基因組 DNA 分離 轉染後24或48小時時收集HEK293_Cas9、HUH7及PHH轉染細胞。根據製造商方案使用50微升/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目錄號QE09050)自96孔板之各孔取出gDNA。如本文所述，對所有DNA樣本進行PCR及後續NGS分析。 5. 針對中靶裂解 效率之下一代定序 ( 「 NGS 」 ) 及分析 為了定量地測定基因組中之目標位置處之編輯效率，使用深度定序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失的存在。 圍繞相關基因(例如SERPINA1 )中之靶位點設計PCR引子，且擴增相關基因組區。引子序列提供於表3中。 表 3 ： 針對所靶向 SERPINA1 及對照 crRNA 之 定序引子 根據製造商方案(Illumina)進行額外PCR以對於定序添加化學作用。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子定序。在消除具有低品質評分之讀段之後，將讀段與人類參考基因組(例如hg38)比對。將含有讀段之所得檔案映射至參考基因組(BAM檔案)，其中選擇與相關目標區重疊之讀段且計算野生型讀段的數目相對於含有插入、取代或缺失之讀段的數目。 編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯百分率」)定義為具有插入/缺失(「indel」)或取代之序列讀段的總數相對於包括野生型之序列讀段的總數。 6. α -1 抗胰蛋白酶 ( 「 AAT 」 ) ELISA 如先前所述用來自表1之所選引導物轉染肝細胞癌細胞株HUH7。轉染後六天，用PBS洗滌細胞一次且隨後用200 µL具有10% FBS之標準DMEM培養基替換。四小時後，收集培養基且儲存於-20℃下。根據製造商方案在黏附細胞上完成CellTiter-Glo (「CTG」)分析(Promega，目錄號G7570)。使用AAT ELISA套組(R&D Systems，目錄號DY1268)測定總AAT含量。使用製造商方案製備套組試劑及標準品。在運作ELISA之前，在室溫下解凍冷凍培養基且以1000 rpm離心1分鐘而成集結粒碎片且隨後置放於冰上。對於ELISA，用70 µL1×分析稀釋液稀釋30 µL培養基。根據製造商方案完成ELISA程序。在SpectraMax M5板讀取器上讀取板。使用脫離標準曲線之四參數邏輯曲線擬合藉由SoftMax Pro軟體版本6.4.2計算AAT含量。藉由基於獲自CTG分析之各值比較板平均值來估算各孔之細胞數。根據細胞數調節最終AAT含量(pg/ml)。 7. 藉由西方墨點法之 AAT 蛋白質分析 如先前所述用來自表1之所選引導物轉染肝細胞癌細胞株HUH7。轉染後六天，移除培養基且用50微升/孔RIPA緩衝液(Boston Bio Products，目錄號BP-115)加上新鮮添加的由complete蛋白酶抑制劑混合物(Sigma，目錄號11697498001)、1 mM DTT及250 U/ml核酸酶(EMD Millipore，目錄號71206-3)組成之蛋白酶抑制劑混合物溶解細胞。將細胞保存於冰上持續30分鐘，此時添加NaCl (1 M最終濃度)。充分混合細胞分解物且保留於冰上持續30分鐘。將全細胞提取物(「WCE」)轉移至PCR板且離心成集結粒碎片。使用Bradford分析(Bio-Rad，目錄號500-0001)來評定分解物之蛋白質含量。根據製造商方案完成Bradford分析程序。在使用之前將提取物儲存於-20℃下。進行西方墨點法以評定AAT蛋白質含量。將分解物與勒姆利緩衝液(Laemmli buffer)混合且在95℃下變性10分鐘。根據製造商方案使用NuPage系統於4%至12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher)上運作西方墨點法，之後濕轉移至0.45 µm硝化纖維素膜(Bio-Rad，目錄號1620115)上。轉移之後，用水徹底沖洗膜且用麗春紅S (Ponceau S)溶液(Boston Bio Products，目錄號ST-180)染色以確認完成及甚至轉移。在室溫下在實驗室搖臂上使用於TBS中之5%乳粉封閉墨點30分鐘。用TBST沖洗墨點且用家兔α-AAT多株抗體(Sigma，目錄號HPA001292)於TBST中以1:1000進行探測。於TBST中以1:2500使用GAPDH作為內參考物(ThermoFisher，目錄號NB600502)且同時與AAT初級抗體一起培育。將墨點密封在包中且在4℃下於實驗室搖臂上保持隔夜。培育之後，各自在TBST中沖洗墨點3次持續5分鐘且用小鼠及家兔之二級抗體(ThermoFisher，目錄號PI35518及PISA535571)各自在TBST中以1:25,000在室溫下探測持續30分鐘。培育之後，各自在TBST中沖洗墨點3次持續5分鐘且用PBS沖洗2次。觀測墨點且使用Licor Odyssey系統加以分析。 8. 脂質奈米粒 子 (LNP) 調配物 以4.5之N:P比(胺比RNA磷酸酯) (N:P)調配LNP。以以下莫耳比將脂質奈米粒子組分溶解於100%乙醇中：45 mol%陽離子脂質(脂質A)；44 mol%膽固醇；9 mol% DSPC；及2 mol% PEG2k-DMG。將RNA負荷(1:1 mRNA:sgRNA(wt/wt))溶解於pH 4.5下之25Mm緩衝液中，大約0.45 mg/mL之RNA負荷之濃度。LNP係藉由根據製造商方案，使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM台式儀器將脂質及RNA溶液微流體混合而形成。以3:1之比率於水中收集LNP。在室溫下培育LNP一小時。將剩餘緩衝液更換為pH 7.5下之50mM Tris (超過樣本體積100倍)，使用10 kDa Slide-a-LyzerTM G2透析卡(ThermoFisher Scientific)在4℃下在平緩攪拌下隔夜。次日，使用Amicon過濾器濃縮(以4000 g在4℃下) LNP兩次以達成所需濃度。隨後使其與2× TSS (50 mM Tris、90 mM氯化鈉、10% w/v蔗糖，pH 7.5下)1:1混合。隨後使用0.2 μM過濾器過濾所得混合物。將所得過濾物儲存於2℃至8℃下。實例 2 - 及引導物檢核 1. 多種細胞類型中的 SERPINA1 引導物之交叉 篩選 如實例1中所述將靶向人類SERPINA1 之引導物及在食蟹獼猴中具有同源性之彼等者轉染至HEK293_Cas9及HUH7細胞株以及原代人類肝細胞中。測定包含各細胞類型中各引導序列之crRNA的編輯百分比，且隨後基於最高編輯%對引導序列進行等級排序。全部三種細胞株中的表1中之引導序列的篩選資料列於下文(表4、表5及表6)。 表4顯示人類腎臟腺癌細胞株，HEK293_Cas9中SERPINA1 及對照crRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%的平均值及標準差，其組成性地過度表現Spy Cas9蛋白質。表 4 ： HEK293_Cas9 細胞中所表現的 crRNA 之 SERPINA1 編輯資料 表5顯示人類肝細胞癌細胞株，HUH7中所測試SERPINA1 及與Spy Cas9 mRNA共轉染之對照crRNA的編輯%平均值及標準差、插入(Ins)%及缺失(Del)%。表 5 ： HUH7 細胞中所表現的 crRNA 之 SERPINA1 編輯資料 表6顯示原生人類肝細胞中與Spy Cas9蛋白質共轉染之所測試SERPINA1 及對照crRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%的平均值及標準差。表 6 ： 原生人類肝細胞中所表現的 crRNA 之 SERPINA1 編輯資料 選自各細胞株之引導序列用於形成供用於進一步分析的30個crRNA之組(表7)。上覆有與外顯子2至外顯子5相關的所選SERPINA1 引導物的染色體位置之示意圖展示在圖1中。編輯百分比及AAT分泌量展示在圖2中。表 7 ： 靶向 HUH7 細胞中之 SERPINA1 的 crRNA 之 ELISA 及西方墨點法 (WB) 資料 2. SERPINA1 引導物之脫靶分析 使用基於寡核苷酸插入之分析(參見例如Tsai等人,Nature Biotechnology 33, 187-197; 2015)來測定藉由靶向SERPINA1 之 Cas9裂解的可能存在之脫靶染色體組位點。如上文所述在HEK293-Cas9細胞中篩選表7中之30個引導物(及具有已知脫靶特徵之兩個對照引導物)，且脫靶結果標繪於圖3中。分析鑑別crRNA中之一些的可能存在之脫靶位點且鑑別沒有可偵測脫靶之其他者。實例 3. 表型分析 1. 經分泌之 α -1 抗胰蛋白酶之 ELISA 分析 一式四份用來自表1之引導物如實例1中所述轉染肝細胞癌細胞株，HUH7。轉染後兩天，針對染色體組DNA及藉由NGS定序之分析收集一份。全部引導物，包括對照引導物，具有大於70%之編輯百分比，其中一些引導物達至95%。轉染後六天，為培養基採集準備一份以用於如先前所述藉由ELISA進行經分泌之AAT的分析。當與對照引導物相比時，全部AAT crRNA均會降低培養基中所分泌之AAT含量5至10倍。各引導物之編輯%及細胞外AAT之降低量的資料提供於表7中。 2. 胞內 α -1 抗胰蛋白酶之西方分析 用包含來自表1之引導物的crRNA如實例1中所述轉染肝細胞癌細胞株，HUH7。將經轉染之細胞池保留在組織培養物中且進行繼代以用於進一步分析。轉染後十一天，收集細胞且製備全細胞提取物(WCE)且如先前所述藉由西方墨點法進行分析。 當細胞繼代時，收集樣品且如本文所述針對NGS定序加以處理。隨時間推移針對編輯%比較自第2天、第23天、第32天及第40天選擇之樣品(表8)。此結果表明關於HUH7細胞生長不存在與AAT編輯相關聯之增殖性變化。表 8 ： HUH7 細胞中編輯 % 之時間過程 針對AAT蛋白質之降低量藉由西方墨點法分析WCE。全長AAT蛋白質具有418個胺基酸，但該蛋白質在經分泌之前已大量糖基化。未糖基化AAT具有46 kD之預測分子量且在西方墨點法中之對照道(lane)中觀測到此分子量下之帶以及對應於不同AAT蛋白質物種之52及56 kD下之帶(圖4)。 使用Licor Odyssey Image Studio 5.2版軟體計算AAT蛋白質之下降百分比。使用GAPDH作為內參考物且同時用AAT進行探測。與涵蓋全部三個針對AAT之帶的總區域相比，計算各樣品中GAPDH之密度測定法值的比率。在將比率標準化為對照道之後，測定AAT蛋白質之下降百分比。結果展示在表7中。 3. 針對選定引導物之合併活體外資料 藉由分析本文所述之資料來產生針對獨立引導物之集中資料包。經由經分泌之AAT的降低量(ELISA)、總AAT蛋白質之降低量相對於額外帶之產生(西方墨點法)及脫靶分析之對比表徵主要候選物且加以等級排序。亦展現與食蟹獼猴之同源性，包括任何序列錯配(mm)。參見圖5至圖10。實例 4. 將 脂質奈 米粒子 (LNP) 遞送至原生人類肝細胞 (PHH) 及 HepG2 細胞 在PHH及HepG2細胞上以劑量反應曲線測試Cas9 mRNA及靶向人類SERPINA1之經修飾sgRNA的脂質奈米粒子調配物。如實例1中所述塗鋪PHH及HepG2細胞(但以15,000個PHH細胞/孔，其與33,000個/孔形成對照)。在37℃，5% CO2 下培育細胞24小時，之後用LNP處理。實驗中所用之LNP如實例1中所述製備，各含有圖11及圖12中所指定之sgRNA及Cas9 mRNA。在37℃下在含有6%食蟹獼猴血清之肝細胞維持液中培育LNP持續5分鐘。培育後，以起始於100 ng mRNA之8點2倍劑量反應曲線將LNP添加於細胞上。如實例1中所述，處理後72小時裂解細胞以用於NGS分析。兩種細胞類型中的引導序列之劑量反應曲線資料展示在圖11及圖12中。資料顯示，調配物對編輯HepG2細胞以及原生人類肝細胞兩者有效，其為人類中之預期活體內細胞靶向物。實例 5. 脂質奈米粒 子 (LNP) 遞送及活體內人類 PiZ 變異體之編輯 向攜帶人類PiZ變異體之複本的轉殖基因小鼠投與實例4中所測試的六種LNP調配物中之五種及包含靶向鼠TTR基因之sgRNA的對照LNP。先前已描述PiZ轉殖基因小鼠(參見例如Carlson JA, Rogers BB, Sifers RN等人, Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest 1989;83:1183-1190)，且咸信其在串聯體異種接合之小鼠中攜載7至8個人類PiZ變異體之串聯複本(資料未示)。 在此研究中使用在15至39週齡範圍內的PiZ小鼠(雄性與雌性混合)。以0.2 mL之體積，以4 mg/kg (每公斤4 mg 總RNA含量)之劑量經由側尾靜脈向每隻動物(各群組n=5)投配LNP。投與LNP後兩週將動物安樂死。在LNP投與之前及屍體剖檢時收集血液用於血清分析。屍體剖檢時自各動物收集肝臟組織用於蛋白質及DNA提取，之後進行蛋白質定量(分別針對PiZ蛋白質之血清及組織含量進行ELISA及西方墨點分析)且使用實例1中所述之試劑及方法進行NGS分析。下表9顯示調配於所測試的各LNP中之sgRNA。表 9 G000282 (* = PS鍵；'m' = 2'-O-Me核苷酸)：mU*mU*mA*CAGCC ACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:424) 如圖13A中所示，在各群組中偵測到SERPINA1 (或關於小鼠對照物之TTR)之PiZ變異體的穩定編輯，而在媒劑對照物(TSS = Tris/氯化鈉/蔗糖緩衝液)中未偵測到編輯。在實驗群組中的一些動物中亦未偵測到編輯，且隨後之基因型分析(資料未示)顯示，此等動物對於PiZ轉殖基因為陰性的，且因此預期將不會產生可偵測編輯、PiZ蛋白質表現或血清中PiZ分泌之基因減弱。此藉由蛋白質表現分析(ELISA及西方墨點法；參見圖13B及圖13C)得到進一步確認。 另外，PiZ變異體之編輯與經處理小鼠中血清含量方面的基因減弱相關。此外，如西方墨點法(圖13C)所示，編輯亦與肝臟組織中PiZ蛋白質之基因減弱相關。此等資料說明調配物對活體內人類PiZ對偶基因之基因減弱及分泌有效。
圖1顯示具有由表7中所提供之引導序列靶向的SERPINA1 基因之區的染色體14之示意圖。 圖2顯示在投與x軸上所提供之引導序列後的AAT之編輯百分比(編輯%)及經分泌之AAT的含量。CTG = CellTiter-Glo。 圖3顯示靶向SERPINA1 之某些引導RNA的脫靶分析。在該圖式中，三角形表示中靶切割位點之標識，而圓圈表示可能存在之脫靶位點的標識。 圖4顯示HUH7細胞中經AAT靶向之引導物的西方墨點分析。 圖5A至圖5C顯示關於CR003208及對照引導物CR001263之ELISA資料，其顯示HUH7細胞中AAT分泌的下降百分比(5A)、HUH7細胞中AAT下降百分比的西方墨點(WB)分析(5B)及脫靶分析(5C)。在圖5C中，在相關基因SERPINA2中鑑別到可能存在之單一脫靶位點，如由箭頭表示(亦參見圖3)。人類引導序列及食蟹獼猴中與相應靶序列互補之序列均為CR003208 (SEQ ID NO:107)。應注意，與人類引導序列互補的靶序列之染色體位置列於表1中。 圖6A至圖6C顯示CR001413及對照引導物CR001262之ELISA資料，其顯示HUH7細胞中AAT分泌的下降百分比(6A)、HUH7細胞中AAT下降百分比的西方墨點(WB)分析(6B)及脫靶分析(6C)。人類引導序列及食蟹獼猴中與相應靶序列互補之序列分別為CR001413 (SEQ ID NO:51)及GUUGAGGAACAGGCCGUUGC (SEQ ID NO:271)。應注意，與人類引導序列互補的靶序列之染色體位置列於表1中。 圖7A至圖7C顯示CR001400及對照引導物CR001261之ELISA資料，其顯示HUH7細胞中AAT分泌的下降百分比(7A)、HUH7細胞中AAT下降百分比的西方墨點(WB)分析(7B)及脫靶分析(7C)。人類引導序列及食蟹獼猴中與相應靶序列互補之序列分別為SEQ ID NO:38及ACUCACAGUGAAAUCCUGGA (SEQ ID NO:272)。應注意，與人類引導序列互補的靶序列之染色體位置列於表1中。 圖8A至圖8C顯示CR001427及對照引導物CR001262之ELISA資料，其顯示HUH7細胞中AAT分泌的下降百分比(8A)、HUH7細胞中AAT下降百分比的西方墨點(WB)分析(8B)及脫靶分析(8C)。人類引導序列及食蟹獼猴中與相應靶序列互補之序列均為CR001427(SEQ ID NO:65)。應注意，與人類引導序列互補的靶序列之染色體位置列於表1中。 圖9A至圖9C顯示CR001386及對照引導物CR001261之ELISA資料，其顯示HUH7細胞中AAT分泌的下降百分比(9A)、HUH7細胞中AAT下降百分比的西方墨點(WB)分析(9B)及脫靶分析(9C)。人類引導序列及食蟹獼猴中與相應靶序列互補之序列分別為CR001386 (SEQ ID NO:24)及GAAGCCGAACUCAGCCAGGC (SEQ ID NO:273)。應注意，與人類引導序列互補的靶序列之染色體位置列於表1中。 圖10A至圖10C顯示CR001404及對照引導物CR001261之ELISA資料，其顯示HUH7細胞中AAT分泌的下降百分比(10A)、HUH7細胞中AAT下降百分比的西方墨點(WB)分析(10B)及脫靶分析(10C)。在圖10C中，鑑別出單一脫靶位點，如由箭頭表示(亦參見圖3)。人類引導序列及食蟹獼猴中與相應靶序列互補之序列分別為CR001404 (SEQ ID NO:42)及CAACGUCACGGAGAUUCCGG (SEQ ID NO:274)。應注意，與人類引導序列互補的靶序列之染色體位置列於表1中。 圖11顯示在劑量反應曲線(「DRC」)中多種濃度下針對不同引導物的HepG2細胞中的AAT之編輯百分比。 圖12顯示在劑量反應曲線(「DRC」)中多種濃度下針對不同引導物的原生人類肝細胞(PHH)中的AAT之編輯百分比。 圖13A至圖13C顯示攜帶SERPINA1 之人類PiZ變異體之複本的轉殖基因小鼠中的活體內實驗結果。圖13A顯示各組中SERPINA1 之PiZ變異體的穩定編輯，其中在媒劑對照(TSS)中未偵測到編輯。圖13B顯示來自此同一實驗之ELISA資料，而圖13C顯示來自此同一實驗之西方墨點法資料。

Claims (243)

  1. 一種誘發SERPINA1 基因中之雙鏈斷裂(DSB)之方法，該方法包括向細胞遞送組合物，其中該組合物包含引導RNA，該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  2. 一種修飾SERPINA1 基因之方法，該方法包括向細胞遞送組合物，其中該組合物包含(i)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸及(ii)引導RNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  3. 一種治療α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)之方法，該方法包括向有需要之個體投與組合物，藉此治療AATD，其中該組合物包含(i)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸及(ii)引導RNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  4. 一種減少或防止α-1抗胰蛋白酶(AAT)在個體之肝臟中積聚的方法，該方法包括向有需要之個體投與組合物，藉此減少AAT在肝臟中積聚，其中該組合物包含(i)經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑的核酸及(ii)引導RNA，其包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  5. 一種組合物，其包含引導RNA，該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  6. 一種組合物，其包含編碼引導RNA之載體，其中該引導RNA包含選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列或與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  7. 如請求項5或6之組合物，其用於誘發細胞或個體之SERPINA1 基因中之雙鏈斷裂(DSB)。
  8. 如請求項5或6之組合物，其用於修飾細胞或個體中之SERPINA1 基因。
  9. 如請求項5或6之組合物，其用於治療個體中之α-1抗胰蛋白酶缺乏症(AATD)。
  10. 如請求項5或6之組合物，其用於降低個體中之血清或肝臟AAT濃度。
  11. 如請求項5或6之組合物，其用於減少或防止α-1抗胰蛋白酶(AAT)在個體之肝臟中積聚。
  12. 如請求項1至4中任一項之方法或如請求項5至11中任一項所使用之組合物，其中該組合物會降低血清及/或肝臟AAT含量。
  13. 如請求項12所使用之方法或組合物，其中相較於投與該組合物之前的血清及/或AAT含量，該等血清及/或肝臟AAT含量降低至少40%。
  14. 如請求項12所使用之方法或組合物，其中相較於投與該組合物之前的血清及/或AAT含量，該等血清及/或肝臟AAT含量降低40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%至80%、80%至90%、90%至95%、95%至98%、98%至99%或99%至100%。
  15. 如請求項1至4或7至14中任一項所使用之方法或組合物，其中該組合物引起編輯SERPINA1 基因。
  16. 如請求項15所使用之方法或組合物，其中該編輯係計算所編輯的基因群之百分比(編輯百分比)。
  17. 如請求項16所使用之方法或組合物，其中該編輯百分比在30%與99%之間。
  18. 如請求項17所使用之方法或組合物，其中該編輯百分比在30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
  19. 如請求項1至4或7至18中任一項所使用之方法或組合物，其中投與或遞送該組合物至少兩次。
  20. 如請求項19所使用之方法或組合物，其中投與或遞送該組合物至少三次。
  21. 如請求項19所使用之方法或組合物，其中投與或遞送該組合物至少四次。
  22. 如請求項19所使用之方法或組合物，其中投與或遞送該組合物至多五、六、七、八、九或十次。
  23. 如請求項19至22中任一項所使用之方法或組合物，其中該投與或遞送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天之間隔進行。
  24. 如請求項19至22中任一項所使用之方法或組合物，其中該投與或遞送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週之間隔進行。
  25. 如請求項19至22中任一項所使用之方法或組合物，其中該投與或遞送以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個月之間隔進行。
  26. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導序列係選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129。
  27. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA與人類SERPINA1 基因中所存在之靶序列至少部分互補。
  28. 如請求項27之方法或組合物，其中該靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子2、3、4或5中。
  29. 如請求項27之方法或組合物，其中該靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子2中。
  30. 如請求項27之方法或組合物，其中該靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子3中。
  31. 如請求項27之方法或組合物，其中該靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子4中。
  32. 如請求項27之方法或組合物，其中該靶序列處於人類SERPINA1 基因之外顯子5中。
  33. 如請求項1至32中任一項之方法或組合物，其中該引導序列與SERPINA1 之正鏈中的靶序列互補。
  34. 如請求項1至32中任一項之方法或組合物，其中該引導序列與SERPINA1 之負鏈中的靶序列互補。
  35. 如請求項1至32中任一項之方法或組合物，其進一步包含第二引導序列，其中第一引導序列與SERPINA1 基因之正鏈中的第一靶序列互補，且其中該第二引導序列與SERPINA1 基因之負鏈中的第二靶序列互補。
  36. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA包含crRNA，其包含該引導序列且進一步包含SEQ ID NO:140之核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140之核苷酸在該引導序列之3'端後。
  37. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA為雙引導(dgRNA)。
  38. 如請求項37之方法或組合物，其中該雙引導RNA包含crRNA及trRNA，該crRNA包含SEQ ID NO:140之核苷酸序列，其中SEQ ID NO:140之核苷酸在該引導序列之3'端後。
  39. 如請求項1至36中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA為單引導(sgRNA)。
  40. 如請求項39之方法或組合物，其中該sgRNA包含具有SEQ ID NO:130之修飾的引導序列。
  41. 如請求項39之方法或組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO:130。
  42. 如請求項40或41之方法或組合物，其中SEQ ID NO:130中之各N為任何天然或非天然核苷酸，其中該等N形成該引導序列，且該引導序列使經RNA引導之DNA結合劑靶向SERPINA1 基因。
  43. 如請求項39至42中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包含該等SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列及該等SEQ ID NO:140之核苷酸中之任一者。
  44. 如請求項39至43中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包含與選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列。
  45. 如請求項42之方法或組合物，其中SEQ ID NO:130中之各N共同地經選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之引導序列置換。
  46. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA包含至少一種修飾。
  47. 如請求項46之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。
  48. 如請求項46或47之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括各核苷酸之間的硫代磷酸酯(PS)鍵。
  49. 如請求項46至48中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括經2'-氟基(2'-F)修飾之核苷酸。
  50. 如請求項46至49中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括在5’端前五個核苷酸中之一或多處進行修飾。
  51. 如請求項46至50中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括在3’端最後五個核苷酸中之一或多處進行修飾。
  52. 如請求項46至51中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括在前四個核苷酸之間的PS鍵。
  53. 如請求項46至52中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括在最後四個核苷酸之間的PS鍵。
  54. 如請求項46至53中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括在5’端前三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。
  55. 如請求項46至54中任一項之方法或組合物，其中該至少一種修飾包括在3’端最後三個核苷酸處的經2'-O-Me修飾之核苷酸。
  56. 如請求項46至55中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA包含SEQ ID NO:130之經修飾核苷酸。
  57. 如請求項1至56中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包含醫藥學上可接受之賦形劑。
  58. 如請求項1至57中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA及視情況選用之該經RNA引導之DNA結合劑或編碼經RNA引導之DNA結合劑之核酸係與脂質奈米粒子(LNP)締合。
  59. 如請求項58之方法或組合物，其中該LNP包含CCD脂質。
  60. 如請求項59之方法或組合物，其中該CCD脂質為脂質A。
  61. 如請求項58至60之方法或組合物，其中該LNP包含中性脂質。
  62. 如請求項61之方法或組合物，其中該中性脂質為DSPC。
  63. 如請求項58至62中任一項之方法或組合物，其中該LNP包含輔助脂質。
  64. 如請求項63之方法或組合物，其中該輔助脂質為膽固醇。
  65. 如請求項58至64中任一項之方法或組合物，其中該LNP包含隱形脂質(stealth lipid)。
  66. 如請求項58至65之方法或組合物，其中該隱形脂質為PEG2k-DMG。
  67. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包含經RNA引導之DNA結合劑。
  68. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包含編碼經RNA引導之DNA結合劑的mRNA。
  69. 如請求項67或68之方法或組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑為Cas裂解酶。
  70. 如請求項69之方法或組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑為Cas9。
  71. 如請求項67至70中任一項之方法或組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑係經修飾。
  72. 如請求項67至71中任一項之方法或組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑為切口酶(nickase)。
  73. 如請求項71或72之方法或組合物，其中該經修飾的經RNA引導之DNA結合劑包含核定位信號(NLS)。
  74. 如請求項67至73中任一項之方法或組合物，其中該經RNA引導之DNA結合劑為來自II型CRISPR/Cas系統之Cas。
  75. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物為醫藥調配物且進一步包含醫藥學上可接受之載劑。
  76. 如請求項1至4或7至75中任一項所使用之方法或組合物，其中該組合物會減少或防止α-1抗胰蛋白酶(AAT)在肝臟中積聚。
  77. 如請求項76所使用之方法或組合物，其中該AAT為變形的。
  78. 如請求項1至4或7至77中任一項所使用之方法或組合物，其中非同源末端連接(non-homologous ending joining；NHEJ)在修復SERPINA1 基因中之DSB期間引起突變。
  79. 如請求項78所使用之方法或組合物，其中NHEJ在修復SERPINA1 基因中之DSB期間引起核苷酸缺失或插入。
  80. 如請求項79所使用之方法或組合物，其中核苷酸之該缺失或插入誘發SERPINA1 基因中發生框移或無意義突變。
  81. 如請求項80所使用之方法或組合物，其中在至少50%之肝臟細胞的SERPINA1 基因中誘發框移或無意義突變。
  82. 如請求項81所使用之方法或組合物，其中在50%至60%、60%至70%、70%或80%、80%至90%、90%至95%、95%至99%或99%至100%之肝臟細胞的SERPINA1 基因中誘發框移或無意義突變。
  83. 如請求項79至82中任一項所使用之方法或組合物，其中發生在SERPINA1 基因中的核苷酸缺失或插入為在脫靶位點處的至少50倍或大於50倍。
  84. 如請求項83所使用之方法或組合物，其中發生在SERPINA1 基因中的核苷酸缺失或插入比在脫靶位點處多50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。
  85. 如請求項1至4或7至84中任一項所使用之方法或組合物，其中投與該組合物會降低該個體中之AAT含量。
  86. 如請求項85所使用之方法或組合物，其中該等AAT含量降低至少40%。
  87. 如請求項86所使用之方法或組合物，其中該等AAT含量降低40%至50%、50%至60%、60%至70%、70%或80%、80%至90%、90%至95%、95%至99%或99%至100%。
  88. 如請求項86或87所使用之方法或組合物，其中在血清、血漿、血液、大腦脊髓液或痰中量測該等AAT含量。
  89. 如請求項86或87所使用之方法或組合物，其中在肝臟及/或血清中量測該等AAT含量。
  90. 如請求項85至89中任一項所使用之方法或組合物，其中經由酶聯免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA)量測該等AAT含量。
  91. 如請求項1至4或7至90中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體患有AATD。
  92. 如請求項1至4或7至91中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體為人類。
  93. 如請求項91或92所使用之方法或組合物，其中該個體患有AATD。
  94. 如請求項91或92所使用之方法或組合物，其中該個體患有遺傳性AATD。
  95. 如請求項1至4、7至92或94中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體具有AATD家族病史。
  96. 如請求項1至4或7至95中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體僅具有或主要具有AATD之肝臟症狀。
  97. 如請求項1至4或7至96中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體在SERPINA1基因座的Z對偶基因為異種接合的。
  98. 如請求項97之方法，其中該個體在SERPINA1基因座處具有一個Z對偶基因及一個S對偶基因。
  99. 如請求項1至4或7至98中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體在AAT之胺基酸序列處不具有E342K突變，但具有降低含量之野生型AAT。
  100. 如請求項1至4或7至99中任一項所使用之方法或組合物，其中該個體之水腫、腹水或黃疸有所改善、穩定或減緩，或已延緩對肝臟移植之需要。
  101. 如請求項1至4或7至99中任一項所使用之方法或組合物，其中如藉由成像方法或肝酶含量所量測，個體由於投藥而具有改善、穩定或減緩變化。
  102. 如請求項1至4或7至101中任一項所使用之方法或組合物，其中該組合物或醫藥調配物經由病毒載體投與。
  103. 如請求項1至4或7至102中任一項所使用之方法或組合物，其中該組合物或醫藥調配物經由脂質奈米粒子投與。
  104. 如請求項1至4或7至103中任一項所使用之方法或組合物，其中在投與該組合物或調配物之前，測試該個體之SERPINA1 基因中之特定突變。
  105. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:5。
  106. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:6。
  107. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:7。
  108. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:8。
  109. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:9。
  110. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:10。
  111. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:11。
  112. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:12。
  113. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:13。
  114. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:14。
  115. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:15。
  116. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:16。
  117. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:17。
  118. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:18。
  119. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:19。
  120. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:20。
  121. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:21。
  122. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:22。
  123. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:23。
  124. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:24。
  125. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:25。
  126. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:26。
  127. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:27。
  128. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:28。
  129. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:29。
  130. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:30。
  131. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:31。
  132. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:32。
  133. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:33。
  134. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:34。
  135. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:35。
  136. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:36。
  137. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:37。
  138. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:38。
  139. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:39。
  140. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:40。
  141. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:41。
  142. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:42。
  143. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:43。
  144. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:44。
  145. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:45。
  146. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:46。
  147. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:47。
  148. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:48。
  149. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:49。
  150. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:50。
  151. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:51。
  152. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:52。
  153. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:53。
  154. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:54。
  155. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:55。
  156. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:56。
  157. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:57。
  158. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:58。
  159. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:59。
  160. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:60。
  161. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:61。
  162. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:62。
  163. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:63。
  164. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:64。
  165. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:65。
  166. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:66。
  167. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:67。
  168. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:68。
  169. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:69。
  170. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:70。
  171. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:71。
  172. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:72。
  173. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:73。
  174. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:74。
  175. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:75。
  176. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:76。
  177. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:77。
  178. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:78。
  179. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:79。
  180. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:80。
  181. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:81。
  182. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:82。
  183. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:83。
  184. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:84。
  185. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:85。
  186. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:86。
  187. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:87。
  188. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:88。
  189. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:89。
  190. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:90。
  191. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:91。
  192. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:92。
  193. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:93。
  194. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:94。
  195. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:95。
  196. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:96。
  197. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:97。
  198. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:98。
  199. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:99。
  200. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:100。
  201. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:101。
  202. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:102。
  203. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:103。
  204. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:104。
  205. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:105。
  206. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:106。
  207. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:107。
  208. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:108。
  209. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:109。
  210. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:110。
  211. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:111。
  212. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:112。
  213. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:113。
  214. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:114。
  215. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:115。
  216. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:116。
  217. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:117。
  218. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:118。
  219. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:119。
  220. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:120。
  221. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:121。
  222. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:122。
  223. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:123。
  224. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:124。
  225. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:125。
  226. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:126。
  227. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:127。
  228. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:128。
  229. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:5至SEQ ID NO:129之該序列為SEQ ID NO:129。
  230. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其進一步包含SEQ ID NO:140或SEQ ID NO:141之序列。
  231. 如請求項230之方法或組合物，其包含SEQ ID NO:130之修改模式。
  232. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中該序列係選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139。
  233. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:131。
  234. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:132。
  235. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:133。
  236. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:134。
  237. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:135。
  238. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:136。
  239. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:137。
  240. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:138。
  241. 如請求項1至104中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列為SEQ ID NO:139。
  242. 如請求項232至241中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO:131至SEQ ID NO:139之該序列包含表2中之相應序列所示之修飾。
  243. 一種如請求項5至242中任一項之組合物或調配物之用途，其用於製備供治療患有AATD之人類個體的藥劑。
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