KR20190100943A - 알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

SERPINA1 유전자 내에서의 이중 가닥 절단을 도입하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. α1-항트립신 결핍 (AATD)을 갖는 대상체에서 보여지는 바와 같은 α1-항트립신 (AAT)의 돌연변이 형태를 감소시키고 근절시키기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.

Description

알파-1 항트립신 결핍을 치료하기 위한 조성물 및 방법
본 출원은 2016년 12월 22일에 출원된 미국 가출원 번호 62/438,219에 대한 우선권의 이점을 주장하며, 이는 그 전문이 참조로 편입되어 있다.
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 그 전문이 참조로 본원에 편입되어 있다. 2017년 12월 20일에 생성된 상기 ASCII 사본은 2017-12-20_01155-0005-00PCT_ST25_v2.txt로 명명되며, 크기는 92,165 바이트이다.
알파-1 항트립신 (AAT 또는 A1AT) 또는 혈청 트립신 억제제는 SERPINA1 유전자에 의해 인코딩된 일 유형의 세린 프로테아제 억제제 (또한 세르핀으로 명명됨)이다. AAT는 주로 간세포에 의해 합성되어 분비되고, 폐에서 호중구 엘라스타제의 활성을 억제하는 역할을 한다. AAT의 충분한 양의 작용화 없이, 호중구 엘라스타제는 미조절되고, 폐에서의 폐포를 손상시킨다. 감소된 수준의 AAT, 또는 감소된 수준의 적절하게 작용화된 ATT를 야기하는 SERPINA1에서의 돌연변이는 폐 병리를 유발한다. 또한, 간에서 배출되지 않은 기형된 AAT의 생성을 유발하는 SERPINA1에서의 돌연변이는 간세포에서의 AAT의 축적으로 인해 간 병리를 유발한다. SERPINA1 돌연변이에 의해 야기된 불충분하게 그리고 부적절하게 형성된 ATT는 폐 및 간 병리를 유발한다.
100개 초과의 대립유전자 변이체는 SERPINA1 유전자에 대해 기재되어 있다. 변이체는 AAT의 혈청 수준에 대한 그의 효과에 따라 유전자로 분류된다. 예를 들어, M 대립유전자는 정상 혈청 AAT 수준과 관련된 정상 변이체이고, 반면 Z 및 S 대립유전자는 감소된 AAT 수준과 관련된 돌연변이 변이체이다. Z 및 S 대립유전자의 존재는 비정상 AAT의 생성을 야기하는 SERPINA1 유전자에서의 돌연변이를 특징으로 하는 유전자 장애인 α1-항트립신 결핍 (AATD 또는 A1AD)와 관련된다.
AATD의 수많은 형태 및 정도가 존재한다. "Z-변이체"가 가장 일반적으로, 이는 간 및 폐 모두에서 중증의 임상적 질환을 야기한다. Z-변이체는 아미노산 위치 342 (E342K)에서 라이신에 대한 글루탐산의 미스센스 돌연변이를 야기하는 5번째 엑손의 5' 말단에서의 단일 뉴클레오타이드 변화를 특징으로 한다. Z 대립유전자에서 동종접합성 (ZZ)이면서도 이종접합성 (MZ 또는 SZ)인 환자에서 증상이 일어난다. 1 또는 2개의 Z 대립유전자의 존재는 SERPINA1 mRNA 불안정, 간세포에서의 AAT 단백질 중합 및 응집을 야기한다. 적어도 하나의 Z 대립유전자를 갖는 환자는 간에서의 응집된 AAT 단백질의 축적으로 인하여 간암의 증가된 발병률을 가진다. 간 병리 이외에, 적어도 하나의 Z 대립유전자를 특징으로 하는 AATD는 또한 폐포에서의 AAT의 감소 및 호중구 엘라스타제의 억제의 생성된 감소로 인한 폐 질환을 특징으로 한다. 중증 ZZ-형태의 유병률 (즉, Z-변이체의 동종접합성 발현)은 북유럽 인구에서 1:2,000이고, 미국에서 1:4,500이다.
간 및 폐 모두에서의 AATD의 부정적 효과를 개선하기 위한 필요성이 존재한다. 본 발명은 SERPINA1 유전자를 녹아웃시키고 AATD를 가진 환자에서의 간 증상과 관련된 AAT의 돌연변이체 형태의 생성을 근절하기 위한 CRISPR/Cas 시스템을 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다.
요약
구현예 01: 세포에 조성물을 전달하는 것을 포함하는 SERPINA1 유전자 내에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는 방법으로서, 상기 조성물은 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
구현예 02: 세포에 조성물을 전달하는 것을 포함하는 SERPINA1 유전자를 변이시키는 방법으로서, 상기 조성물은 (i) RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 및 (ii) 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
구현예 03: 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하고, 이에 의해 AATD를 치료하는 것을 포함하는 알파-1 항트립신 결핍 (AATD)을 치료하는 방법으로서, 상기 조성물은 (i) RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 및 (ii) 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
구현예 04: 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하고, 이에 의해 간에서의 AAT의 축적을 감소시키는 것을 포함하는 대상체의 간에서 알파-1 항트립신 (AAT)의 축적을 감소시키거나 또는 예방하는 방법으로서, 상기 조성물은 (i) RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 및 (ii) 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
구현예 05: 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 조성물.
구현예 06: 가이드 RNA를 인코딩한 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 가이드 RNA는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 조성물.
구현예 07: 구현예 5 또는 6에 있어서, 세포 또는 대상체에서의 SERPINA1 유전자 내에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는데 사용하기 위한 조성물.
구현예 08: 구현예 5 또는 6에 있어서, 세포 또는 대상체에서의 SERPINA1 유전자를 변이시키는데 사용하기 위한 조성물.
구현예 09: 구현예 5 또는 6에 있어서, 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍 (AATD)을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
구현예 10: 구현예 5 또는 6에 있어서, 대상체에서 AAT 혈청 또는 간 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물.
구현예 11: 구현예 5 또는 6에 있어서, 대상체의 간에서의 알파-1 항트립신 (AAT)의 축적을 감소시키거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물.
구현예 12: 구현예 1-4 중 어느 하나 또는 구현예 5-11 중 어느 하나에 있어서, 조성물이 혈청 및/또는 간 AAT 수준을 감소시키는, 방법 또는 사용하기 위한 조성물.
구현예 13: 구현예 12에 있어서, 혈청 및/또는 간 AAT 수준이 조성물의 투여 이전의 혈청 및/또는 AAT 수준과 비교하여 적어도 50%까지 감소되는 방법 또는 조성물.
구현예 14: 구현예 12에 있어서, 혈청 및/또는 AAT 수준이 조성물의 투여 이전에 혈청 및/또는 AAT 수준과 비교하여 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-98%, 98-99%, 또는 99-100%까지 감소되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 15: 구현예 1-4 또는 7-14 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 SERPINA1 유전자의 편집을 야기하는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 16: 구현예 15에 있어서, 상기 편집이 편집되는 집단의 백분율 (편집 백분율)로서 계산되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 17: 구현예 16에 있어서, 상기 편집 백분율이 30 내지 99%인, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 18: 구현예 17에 있어서, 상기 편집 백분율이 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%인, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 19: 구현예 1-4 또는 7-18 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 적어도 2배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 20: 구현예 19에 있어서, 상기 조성물이 적어도 3배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 21: 구현예 19에 있어서, 상기 조성물이 적어도 4배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 22: 구현예 19에 있어서, 상기 조성물이 최대 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 23: 구현예 19-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 또는 전달이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 일의 간격으로 실시되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 24: 구현예 19-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 또는 전달이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 주의 간격으로 실시되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 25: 구현예 19-22 중 어느 하나에 있어서, 상기 투여 또는 전달이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 개월의 간격으로 실시되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
구현예 26: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열이 식별 번호: 5-129로부터 선택되는 방법 또는 조성물.
구현예 27: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA가 인간 SERPINA1 유전자에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 방법 또는 조성물.
구현예 28: 구현예 27에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2, 3, 4, 또는 5에 존재하는 방법 또는 조성물.
구현예 29: 구현예 27에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2에 존재하는 방법 또는 조성물.
구현예 30: 구현예 27에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 3에 존재하는 방법 또는 조성물.
구현예 31: 구현예 27에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 4에 존재하는 방법 또는 조성물.
구현예 32: 구현예 27에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 5에 존재하는 방법 또는 조성물.
구현예 33: 구현예 1-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열이 SERPINA1의 양성 가닥에서의 표적 서열에 상보적인 방법 또는 조성물.
구현예 34: 구현예 1-32 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열이 SERPINA1의 음성 가닥에서의 표적 서열에 상보적인 방법 또는 조성물.
구현예 35: 구현예 1-32 중 어느 하나에 있어서, 제2 가이드 서열을 더 포함하며, 여기서 제1 가이드 서열이 SERPINA1 유전자의 양성 가닥에서의 제1 표적 서열에 상보적이고, 제2 가이드 서열이 SERPINA1 유전자의 음성 가닥에서의 제2 표적 서열에 상보적인 방법 또는 조성물.
구현예 36: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 가이드 RNA는 가이드 서열을 포함하고, 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 crRNA를 포함하고, 여기서 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드는 그것의 3' 말단에서의 가이드 서열에 후속되는 방법 또는 조성물.
구현예 37: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA가 이중 가이드 (dgRNA)인 방법 또는 조성물.
구현예 38: 구현예 37에 있어서, 상기 이중 가이드 RNA는 그것의 3' 말단에서의 가이드 서열에 후속되는 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA, 및 trRNA를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 39: 구현예 1-36 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA가 단일 가이드 (sgRNA)인 방법 또는 조성물.
구현예 40: 구현예 39에 있어서, sgRNA가 식별 번호: 130의 패턴을 갖는 가이드 서열을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 41: 구현예 39에 있어서, sgRNA가 식별 번호: 130의 서열을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 42: 구현예 40 또는 41에 있어서, 식별 번호: 130에서의 각각의 N이 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, N은 가이드 서열을 형성하고, 가이드 서열은 RNA-유도된 DNA 결합제를 SERPINA1 유전자에 대해 표적화하는 방법 또는 조성물.
구현예 43: 구현예 39-42 중 어느 하나에 있어서, sgRNA는 식별 번호: 5- 129의 가이드 서열 및 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 중 어느 하나를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 44: 구현예 39-43 중 어느 하나에 있어서, sgRNA는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 45: 구현예 42에 있어서, 식별 번호: 130에서의 각각의 N은 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열로 대체되는 방법 또는 조성물.
구현예 46: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA가 적어도 하나의 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 47: 구현예 46에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 2'-0-메틸 (2'-0-Me) 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 48: 구현예 46 또는 47에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 49: 구현예 46-48 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 2'-플루오로 (2'-F) 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 50: 구현예 46-49 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 5' 말단에서의 최초 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 51: 구현예 46-50 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 3' 말단에서의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 52: 구현예 46-51 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 최초 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 53: 구현예 46-52 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 54: 구현예 46-53 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 5' 말단에서의 최초 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-0-Me 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 55: 구현예 46-54 중 어느 하나에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-0-Me 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 56: 구현예 46-55 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 식별 번호: 130의 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 57: 구현예 1-56 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 58: 구현예 1-57 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산이 지질 나노입자 (LNP)와 연관되는 방법 또는 조성물.
구현예 59: 구현예 58에 있어서, 상기 LNP가 CCD 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 60: 구현예 59에 있어서, 상기 CCD 지질이 지질 A인 방법 또는 조성물.
구현예 61: 구현예 58-60 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 중성 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 62: 구현예 61에 있어서, 상기 중성 지질이 DSPC인 방법 또는 조성물.
구현예 63: 구현예 58-62 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 헬퍼 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 64: 구현예 63에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 콜레스테롤인 방법 또는 조성물.
구현예 65: 구현예 58-64 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP가 스텔스 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 66: 구현예 58-65 중 어느 하나에 있어서, 상기 스텔스 지질이 PEG2k-DMG인 방법 또는 조성물.
구현예 67: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 RNA-유도된 DNA 결합제를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 68: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물이 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 mRNA를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 69: 구현예 67 또는 68에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 Cas 클리비지(Cas cleavase)인 방법 또는 조성물.
구현예 70: 구현예 69에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 Cas9인 방법 또는 조성물.
구현예 71: 구현예 67-70 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 변이된 것인 방법 또는 조성물.
구현예 72: 구현예 67-71 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 닉카아제(nickage)인 방법 또는 조성물.
구현예 73: 구현예 71 또는 72에 있어서, 상기 변이된 RNA-유도된 DNA 결합제는 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 74: 구현예 67-73 중 어느 하나에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제는 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas인 방법 또는 조성물.
구현예 75: 이전의 구현예 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 76: 구현예 1-4 또는 7-75 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 간에서의 알파-1 항트립신 (AAT)의 축적을 감소하거나 또는 예방하는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 77: 구현예 76에 있어서, AAT는 기형된 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 78: 구현예 1-4 또는 7-77 중 어느 하나에 있어서, 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)은 SERPINA1 유전자에서의 DSB의 복구 과정에서 돌연변이를 유발하는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 79: 구현예 78에 있어서, 상기 NHEJ는 SERPINA1 유전자에서의 DSB의 복구 과정에서 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발시키는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 80: 구현예 80에 있어서, 상기 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 SERPINA1 유전자에서의 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도하는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 81: 구현예 80에 있어서, 상기 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 적어도 50%의 SERPINA1 유전자에서 유도되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 82: 구현예 81에 있어서, 상기 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 50%-60%, 60%-70%, 70% 또는 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, 또는 99%-100%의 SERPINA1 유전자에서 유도되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 83: 구현예 79-82 중 어느 하나에 있어서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 비표적 부위에서 보다 적어도 50-배 이상으로 SERPINA1 유전자에서 일어나는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 84: 구현예 83에 있어서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 비표적 부위에서 보다 50-배 내지 150-배, 150-배 내지 500-배, 500-배 내지 1500-배, 1500-배 내지 5000-배, 5000-배 내지 15000-배, 15000-배 내지 30000-배, 또는 30000-배 내지 60000-배 초과로 SERPINA1 유전자에서 일어나는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 85: 구현예 1-4 또는 7-84 중 어느 하나에 있어서, 조성물을 투여하는 것은 대상체에게 AAT의 수준을 감소시키는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 86: 구현예 85에 있어서, 상기 AAT의 수준은 적어도 40%까지 감소되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 87: 구현예 86에 있어서, 상기 AAT의 수준은 40-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70% 또는 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, 또는 99%- 100%까지 감소되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 88: 구현예 86 또는 87에 있어서, 상기 AAT의 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 뇌 척수액, 또는 가래에서 측정되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 89: 구현예 86 또는 87에 있어서, 상기 AAT의 수준은 간 및/또는 혈청에서 측정되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 90: 구현예 85-89 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAT의 수준은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)을 통해 측정되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 91: 구현예 1-4 또는 7-90 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 AATD를 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 92: 구현예 1-4 또는 7-91 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 93: 구현예 91 또는 92에 있어서, 상기 대상체는 AATD wt를 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 94: 구현예 91 또는 92에 있어서, 상기 대상체는 선천성 AATD를 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 95: 구현예 1-4, 7-92, 또는 94 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 AATD의 가족력을 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 96: 구현예 1-4 또는 7-95 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 유일하게 또는 주로 AATD의 간 증상을 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 97: 구현예 1-4 또는 7-96 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서의 Z 대립유전자에 대해 이종접합성인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 98: 구현예 97에 있어서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 하나의 Z 대립유전자 및 하나의 S 대립유전자를 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 99: 구현예 1-4 또는 7-98 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 AAT의 아미노산 서열에서 E342K 돌연변이를 가지지 않으나, 감소된 수준의 야생형 AAT을 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 100: 구현예 1-4 또는 7-99 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 부종, 복수, 또는 황달의 개선, 안정화, 또는 지체를 가지거나, 또는 간 이식에 대한 필요성의 지연을 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 101: 구현예 1-4 또는 7-99 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 영상화 방법 또는 간 효소 수준에 의해 측정된 변화의 개선, 안정화, 또는 지체를 갖는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 102: 구현예 1-4 또는 7-101 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제형은 바이러스 벡터를 통해 투여되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 103: 구현예 1-4 또는 7-102 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제형은 지질 나노입자를 통해 투여되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 104: 구현예 1-4 또는 7-103 중 어느 하나에 있어서, 상기 대상체는 조성물 또는 제형을 투여하기 이전에 SERPINA1 유전자에서 특이적 돌연변이에 대해 시험되는, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
구현예 105: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 5인 방법 또는 조성물.
구현예 106: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 6인 방법 또는 조성물.
구현예 107: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 7인 방법 또는 조성물.
구현예 108: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 8인 방법 또는 조성물.
구현예 109: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 9인 방법 또는 조성물.
구현예 110: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 10인 방법 또는 조성물.
구현예 111: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 11인 방법 또는 조성물.
구현예 112: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 12인 방법 또는 조성물.
구현예 113: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 13인 방법 또는 조성물.
구현예 114: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 14인 방법 또는 조성물.
구현예 115: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 15인 방법 또는 조성물.
구현예 116: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 16인 방법 또는 조성물.
구현예 117: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 17인 방법 또는 조성물.
구현예 118: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 18인 방법 또는 조성물.
구현예 119: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 19인 방법 또는 조성물.
구현예 120: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 20인 방법 또는 조성물.
구현예 121: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 21인 방법 또는 조성물.
구현예 122: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 22인 방법 또는 조성물.
구현예 123: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 23인 방법 또는 조성물.
구현예 124: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 24인 방법 또는 조성물.
구현예 125: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 25인 방법 또는 조성물.
구현예 126: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 26인 방법 또는 조성물.
구현예 127: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 27인 방법 또는 조성물.
구현예 128: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 28인 방법 또는 조성물.
구현예 129: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 29인 방법 또는 조성물.
구현예 130: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 30인 방법 또는 조성물.
구현예 131: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 31인 방법 또는 조성물.
구현예 132: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 32인 방법 또는 조성물.
구현예 133: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 33인 방법 또는 조성물.
구현예 134: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 34인 방법 또는 조성물.
구현예 135: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 35인 방법 또는 조성물.
구현예 136: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 36인 방법 또는 조성물.
구현예 137: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 37인 방법 또는 조성물.
구현예 138: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 38인 방법 또는 조성물.
구현예 139: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 39인 방법 또는 조성물.
구현예 140: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 40인 방법 또는 조성물.
구현예 141: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 41인 방법 또는 조성물.
구현예 142: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 42인 방법 또는 조성물.
구현예 143: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 43인 방법 또는 조성물.
구현예 144: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 44인 방법 또는 조성물.
구현예 145: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 45인 방법 또는 조성물.
구현예 146: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 46인 방법 또는 조성물.
구현예 147: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 47인 방법 또는 조성물.
구현예 148: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 48인 방법 또는 조성물.
구현예 149: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 49인 방법 또는 조성물.
구현예 150: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 50인 방법 또는 조성물.
구현예 151: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 51인 방법 또는 조성물.
구현예 152: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 52인 방법 또는 조성물.
구현예 153: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 53인 방법 또는 조성물.
구현예 154: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 54인 방법 또는 조성물.
구현예 155: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 55인 방법 또는 조성물.
구현예 156: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 56인 방법 또는 조성물.
구현예 157: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 57인 방법 또는 조성물.
구현예 158: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 58인 방법 또는 조성물.
구현예 159: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 59인 방법 또는 조성물.
구현예 160: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 60인 방법 또는 조성물.
구현예 161: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 61인 방법 또는 조성물.
구현예 162: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 62인 방법 또는 조성물.
구현예 163: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 63인 방법 또는 조성물.
구현예 164: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 64인 방법 또는 조성물.
구현예 165: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 65인 방법 또는 조성물.
구현예 166: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 66인 방법 또는 조성물.
구현예 167: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 67인 방법 또는 조성물.
구현예 168: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 68인 방법 또는 조성물.
구현예 169: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 69인 방법 또는 조성물.
구현예 170: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 70인 방법 또는 조성물.
구현예 171: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 71인 방법 또는 조성물.
구현예 172: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 72인 방법 또는 조성물.
구현예 173: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 73인 방법 또는 조성물.
구현예 174: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 74인 방법 또는 조성물.
구현예 175: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 75인 방법 또는 조성물.
구현예 176: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 76인 방법 또는 조성물.
구현예 177: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 77인 방법 또는 조성물.
구현예 178: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 78인 방법 또는 조성물.
구현예 179: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 79인 방법 또는 조성물.
구현예 180: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 80인 방법 또는 조성물.
구현예 181: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 81인 방법 또는 조성물.
구현예 182: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 82인 방법 또는 조성물.
구현예 183: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 83인 방법 또는 조성물.
구현예 184: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 84인 방법 또는 조성물.
구현예 185: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 85인 방법 또는 조성물.
구현예 186: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 86인 방법 또는 조성물.
구현예 187: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 87인 방법 또는 조성물.
구현예 188: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 88인 방법 또는 조성물.
구현예 189: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 89인 방법 또는 조성물.
구현예 190: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 90인 방법 또는 조성물.
구현예 191: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 91인 방법 또는 조성물.
구현예 192: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 92인 방법 또는 조성물.
구현예 193: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 93인 방법 또는 조성물.
구현예 194: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 94인 방법 또는 조성물.
구현예 195: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 95인 방법 또는 조성물.
구현예 196: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 96인 방법 또는 조성물.
구현예 197: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 97인 방법 또는 조성물.
구현예 198: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 98인 방법 또는 조성물.
구현예 199: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 99인 방법 또는 조성물.
구현예 200: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 100인 방법 또는 조성물.
구현예 201: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 101인 방법 또는 조성물.
구현예 202: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 102인 방법 또는 조성물.
구현예 203: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 103인 방법 또는 조성물.
구현예 204: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 104인 방법 또는 조성물.
구현예 205: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 105인 방법 또는 조성물.
구현예 206: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 106인 방법 또는 조성물.
구현예 207: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 107인 방법 또는 조성물.
구현예 208: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 108인 방법 또는 조성물.
구현예 209: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 109인 방법 또는 조성물.
구현예 210: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 110인 방법 또는 조성물.
구현예 211: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 111인 방법 또는 조성물.
구현예 212: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 112인 방법 또는 조성물.
구현예 213: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 113인 방법 또는 조성물.
구현예 214: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 114인 방법 또는 조성물.
구현예 215: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 115인 방법 또는 조성물.
구현예 216: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 116인 방법 또는 조성물.
구현예 217: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 117인 방법 또는 조성물.
구현예 218: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 118인 방법 또는 조성물.
구현예 219: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 119인 방법 또는 조성물.
구현예 220: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 120인 방법 또는 조성물.
구현예 221: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 121인 방법 또는 조성물.
구현예 222: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 122인 방법 또는 조성물.
구현예 223: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 123인 방법 또는 조성물.
구현예 224: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 124인 방법 또는 조성물.
구현예 225: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 125인 방법 또는 조성물.
구현예 226: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 126인 방법 또는 조성물.
구현예 227: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 127인 방법 또는 조성물.
구현예 228: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 128인 방법 또는 조성물.
구현예 229: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 129인 방법 또는 조성물.
구현예 230: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 140 또는 141의 서열을 더 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 231: 구현예 230에 있어서, 식별 번호: 130의 변이 패턴을 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 232: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 서열이 식별 번호: 131-139로부터 선택되는 방법 또는 조성물.
구현예 233: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 131인 방법 또는 조성물.
구현예 234: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 132인 방법 또는 조성물.
구현예 235: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 133인 방법 또는 조성물.
구현예 236: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 134인 방법 또는 조성물.
구현예 237: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 135인 방법 또는 조성물.
구현예 238: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 136인 방법 또는 조성물.
구현예 239: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 137인 방법 또는 조성물.
구현예 240: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 138인 방법 또는 조성물.
구현예 241: 구현예 1-104 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 139인 방법 또는 조성물.
구현예 242: 구현예 232-241 중 어느 하나에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 표 2에서의 각각의 서열에 대해 나타낸 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
구현예 243: AATD를 갖는 인간 대상체의 치료용 의약의 제조를 위한 구현예 5-241 중 어느 하나의 조성물 또는 제형의 용도.
도 1은 표 7에 제공된 가이드 서열에 의해 표적화된 SERPINA1 유전자의 영역을 갖는 염색체 14의 개략도를 나타낸다.
도 2는 x-축 상에 제공된 가이드 서열의 투여 이후 AAT 편집 백분율(%편집) 및 분비된 AAT의 수준을 나타낸다. CTG = 셀라이터-글로(CellTiter- Glo).
도 3은 SERPINA1을 표적화하는 특정 가이드 RNA의 비표적 분석을 나타낸다. 그래프에서, 삼각형은 표적 절단 부위의 식별기호를 나타내고, 한편 원은 잠재적 비표적 부위의 식별기호를 나타낸다.
도 4는 HUH7 세포에서의 AAT-표적화된 가이드의 웨스턴 블랏 분석을 나타낸다.
5A-5C는 HUH7 세포에서의 AAT 분비의 감소 백분율 (5A), HUH7 세포에서의 AAT의 감소 백분율의 웨스턴 블랏 (WB) 분석 (5B), 및 비표적 분석 (5C)을 나타내는 CR003208 및 대조군 가이드 CR001263에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 도 5C에서는, 단일 잠재적 비표적 부위는 화살표로 나타낸 바와 같이 관련된 유전자 SERPINA2에서 확인된다 (또한, 도 3을 참조한다). 인간 가이드 서열 및 사이노몰구스 원숭이에서의 상응하는 표적 서열에 상보적인 서열은 모두 CR003208 (식별 번호: 107)이다. 인간 가이드 서열에 상보적인 표적 서열의 염색체 위치는 표 1에 열거되어 있음을 주지한다.
도 6A-6C는 HUH7 세포에서의 AAT 분비의 감소 백분율 (6A), HUH7 세포에서의 AAT의 감소 백분율의 웨스턴 블랏 (WB) 분석 (6B), 및 비표적 분석 (6C)을 나타내는 CR001413 및 대조군 가이드 CR001262에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 인간 가이드 서열 및 사이노몰구스 원숭이에서의 상응하는 표적 서열에 대해 상보적인 서열은 각각 CR001413 (식별 번호: 51), 및 GUUGAGGAACAGGCCGUUGC (식별 번호: 271)이다. 인간 가이드 서열에 대해 상보적인 표적 서열의 염색체 위치는 표 1에 열거되어 있음을 주지한다.
도 7A-7C는 HUH7 세포에서의 AAT 분비의 감소 백분율 (7A), HUH7 세포에서의 AAT의 감소 백분율의 웨스턴 블랏 (WB) 분석 (7B), 및 비표적 분석 (7C)을 나타내는 CR001400 및 대조군 가이드 CR001261에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 인간 가이드 서열 및 사이노몰구스 원숭이에서의 상응하는 표적 서열에 상보적인 서열은 각각 식별 번호: 38, 및 ACUCACAGUGAAAUCCUGGA (식별 번호: 272)이다. 인간 가이드 서열에 대해 상보적인 표적 서열의 염색체 위치는 표 1에 열거되어 있음을 주지한다.
도 8A-8C는 HUH7 세포에서의 AAT 분비의 감소 백분율 (8A), HUH7 세포에서의 AAT의 감소 백분율의 웨스턴 블랏 (WB) 분석 (8B), 및 비표적 분석 (8C)을 나타내는 CR001427 및 대조군 가이드 CR001262에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 인간 가이드 서열 및 사이노몰구스 원숭이에서의 상응하는 표적 서열에 상보적인 서열은 둘 모두 CR001427 (식별 번호: 65)이다. 인간 가이드 서열에 대해 상보적인 표적 서열의 염색체 위치는 표 1에 열거되어 있음을 주지한다.
도 9A-9C는 HUH7 세포에서의 AAT 분비의 감소 백분율 (9A), HUH7 세포에서의 AAT의 감소 백분율의 웨스턴 블랏 (WB) 분석 (9B), 및 비표적 분석 (9C)을 나타내는 CR001386 및 대조군 가이드 CR001261에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 인간 가이드 서열 및 사이노몰구스 원숭이에서의 상응하는 표적 서열에 상보적인 서열은 각각 CR001386 (식별 번호: 24), 및 GAAGCCGAACUCAGCCAGGC (식별 번호: 273)이다. 인간 가이드 서열에 대해 상보적인 표적 서열의 염색체 위치는 표 1에 열거되어 있음을 주지한다.
도 10A-10C는 HUH7 세포에서의 AAT 분비의 감소 백분율 (10A), HUH7 세포에서의 AAT의 감소 백분율의 웨스턴 블랏 (WB) 분석 (10B), 및 비표적 분석 (10C)을 나타내는 CR001404 및 대조군 가이드 CR001261에 대한 ELISA 데이터를 나타낸다. 도 10C에서, 단일 비표적 부위는 화살표로 표시된 바와 같이 확인되었다 (또한 도 3 참조). 인간 가이드 서열 및 사이노몰구스 원숭이에서의 상응하는 표적 서열에 상보적인 서열은 각각 CR001404 (식별 번호: 42), 및 CAACGUCACGGAGAUUCCGG (식별 번호: 274)이다. 인간 가이드 서열에 대해 상보적인 표적 서열의 염색체 위치는 표 1에 열거되어 있음을 주지한다.
도 11은 용량 반응 곡선 ("DRC")에서의 다양한 농도에서 다양한 가이드에 대한 HepG2 세포에서의 AAT의 편집 백분율을 나타낸다.
도 12는 용량 반응 곡선 ("DRC")에서의 다양한 농도에서 다양한 가이드에 대한 원발성 인간 간세포(PHH)에서의 AAT의 편집 백분율을 나타낸다.
도 13a-c는 SERPINA1의 인간 PiZ 변이체의 복제가 잠복된 형질전환 마우스에서의 생체내 실험의 결과를 나타낸다. 도 13a는 각각의 그룹에 걸쳐 SERPINA1의 PiZ 변이체의 강력한 편집을 나타내고, 비히클 대조군 (TSS)에서 검출된 편집은 존재하지 않았다. 도 13b는 이러한 동일한 실험으로부터의 ELISA 데이터를 나타내고, 한편 도 13c는 동일한 실험으로부터의 웨스턴 블랏 데이터를 나타낸다.
SERPINA1 유전자를 편집하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템에서 유용한 가이드 RNA 조성물이 본원에 제공된다. RNA-유도된 DNA 결합제, 예를 들어, Cas9 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 mRNA, 예를 들어, Cas9를 인코딩한 mRNA와 함께 이중 또는 단일 가이드 RNA 형태로의 가이드 RNA는 비-야생형 SERPINA1 유전자 서열을 갖는 대상체, 예를 들어 알파-1 항트립신 결핍 ("AATD" 또는 "A1AD")를 갖는 대상체로 투여될 수 있다. SERPINA1 유전자를 표적화하는 가이드 서열은 식별 번호: 5-129로 표 1에 나타나 있다. 본원에 기재된 실험에서 사용된 대조군 가이드는 식별 번호: 1-4로 본원에 나타나 있다.
[표 1] 표적화된 SERPINA1 및 대조군 가이드 서열 명명법, 염색체 좌표, 및 서열
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상기 각각의 가이드 서열은 예를 들어 그것의 3' 말단에서의 가이드 서열: GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (식별 번호: 140)에 후속되는 하기 예시적인 뉴클레오타이드 서열과 함께 crRNA를 형성하기 위한 추가의 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다. sgRNA의 경우에서, 상기 가이드 서열은 예를 들어, 가이드 서열의 3' 말단에 후속되는 하기 예시적인 뉴클레오타이드 서열: 5'에서 3' 방향으로의 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (식별 번호: 141)와 함께 sgRNA를 형성하기 위한 추가의 뉴클레오타이드를 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, sgRNA가 변이된다. 일부 구현예에서, 변이된 sgRNA는 표 2에서 인용된 어느 하나의 서열 (식별 번호: 130-139, 408, 및 410-421)을 포함한다. 표 2에서, "N"은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구현예에서, 식별 번호: 130을 포함하는 조성물이 포함되며, 여기서 식별 번호: 130에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 130에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 410을 포함하는 조성물이 포함되며, 여기서 식별 번호: 140에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 140에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 411을 포함하는 조성물이 포함되며, 여기서 식별 번호: 411에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 411에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 412를 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 412에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 412에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 413을 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 413에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 413에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 414를 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 414에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 414에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 415를 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 415에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 415에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 416을 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 416에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 416에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 417를 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 417에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 417에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 418을 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 418에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 418에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 419를 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 419에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 419에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 420을 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 420에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 420에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 421을 포함하는 조성물이 포괄되며, 여기서 식별 번호: 421에서의 각각의 N은 집학적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되고, 식별 번호: 421에 나타난 변이 패턴을 유지된다.
[표 2] SERPINA1 표적화된 sgRNA
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Figure pct00008
Figure pct00009
* = PS 연결; 'm' = 2'-0-Me 뉴클레오타이드
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용되는 하기 용어들 및 어구는 하기 의미를 가지는 것으로 의도된다:
"폴리뉴클레오타이드" 및 "핵산"은 종래의 RNA, DNA, 혼합된 RNA-DNA, 및 이와 유사한 폴리머를 포함하는 골격과 함께 연결된 질소성 복소환형 염기 또는 염기 유사체를 가지는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본원에 사용된다. 핵산 "골격"은 당-포스포디에스테르 결합, 펩타이드-핵산 결합 ("펩타이드 핵산" 또는 PNA; PCT 번호 WO 95/32305), 포스포로티오에이트 연결기, 메틸포스포네이트 연결기, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 다양한 연결기로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보오스, 데옥시리보스, 또는 치환, 예를 들어, 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 질소성 염기는 종래의 염기 (A, G, C, T, U), 그것의 유사체 (예를 들어, 변이된 우리딘 예컨대 5-메톡시우리딘, 슈도우리딘, 또는 N1-메틸슈도우리딘, 또는 기타); 이노신; 퓨린 또는 피리미딘의 유도체 (예를 들어, N4-메틸 데옥시구아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자- 또는 아자-피리미딘, 5 또는 6 위치에서의 치환기를 갖는 피리미딘 염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 2, 6, 또는 8 위치에서 치환기를 갖는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸하이드라진-피리미딘, 및 O4-알킬-피리미딘; 미국 특허 번호 5,378,825 및 PCT 번호 WO 93/13121)일 수 있다. 일반적 논의를 위해, 문헌 [The Biochemistry of Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 1 1th ed., 1992)]을 참조한다. 핵산은 하나 이상의 "무염기성" 잔기를 포함할 수 있고, 여기서 백본은 폴리머의 위치(들)에 대한 질소성 염기를 포함하지 않는다 (미국 특허 번호 5,585,481). 핵산은 종래의 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 연결기만을 포함할 수 있거나, 또는 종래의 성분 및 치환 (예를 들어, 2' 메톡시 연결기를 갖는 종래의 염기, 또는 종래의 염기 및 하나 이상의 염기 유사체 모두를 함유하는 폴리머) 모두를 포함할 수 있다. 핵산은 "잠금 핵산" (LNA), RNA 모사 당 형태에 잠겨진 이환형 푸라노스 단위를 갖는 하나 이상의 LNA 뉴클레오타이드 단량체를 함유하는 유사체를 포함하며, 이는 상보적 RNA 및 DNA 서열에 대한 하이브리드화 친화성을 향상시킨다 (Vester and Wengel, 2004, Biochemistry 43(42): 13233-41). RNA 및 DNA는 상이한 당 모이어티를 가질 수 있고, RNA에서의 우라실 또는 그것의 유사체 또는 DNA에서의 티민 또는 그것의 유사체의 존재가 상이할 수 있다.
"가이드 RNA", "gRNA", 및 간단하게는 "가이드"는 crRNA (CRISPR RNA로서 알려짐), 또는 crRNA 및 trRNA (tracrRNA로서 알려짐)의 조합을 지칭하기 위해 상호교환적으로 본원에 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자 (단일 가이드 RNA, sgRNA)로서, 또는 2개의 별개의 RNA 분자 (이중 가이드 RNA, dgRNA)에서 연관될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA" 또는 "가이드"는 각각의 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 비교되는 변이 또는 변형을 갖는 trRNA 서열일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "가이드 서열"은 표적 서열에 대해 상보적인 가이드 RNA 내의 서열을 지칭하고, RNA-유도된 DNA 결합제에 의해 결합 또는 변이 (예를 들어, 절단)에 대한 표적 서열에 가이드 RNA를 유도하는 역할을 한다. "가이드 서열"은 또한 "표적화 서열," 또는 "스페이서 서열"로서 지칭될 수 있다. 가이드 서열은 예를 들어 스트렙토코커스 피오제네스 Cas9 (즉, Spy Cas9) 및 관련된 Cas9 동족체/오쏘로그에 대한 가이드 RNA의 경우 길이가 20개의 염기쌍일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열, 예를 들어 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24-, 또는 25 -개의 뉴클레오타이드가 또한 가이드로서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 표적 서열은 유전자 내에 또는 염색체 상에 존재하고, 예를 들어, 가이드 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 그것의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 불일치를 함유할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 상기 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있고, 여기서 상기 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 염기쌍이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1-4개의 불일치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 함유할 수 있고, 여기서 가이드 서열은 20개의 뉴클레오타이드를 함유한다.
Cas 단백질에 대한 표적 서열은 Cas 단백질에 대한 핵산 기질이 이중가닥 핵산이기 때문에, 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥 모두 (즉, 주어진 서열 및 서열의 역 보체)를 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 대해 상보적"인 것으로 언급되는 경우, 가이드 서열이 표적 서열의 역 보체에 결합하는 가이드 RNA를 유도할 수 있는 것으로 이해하여야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 보체에 결합되는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T에 대한 U의 치환에 대한 것을 제외하고 표적 서열 (예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오타이드와 동일하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "RNA-유도된 DNA 결합제"는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩타이드의 폴리펩타이드 또는 복합체, 또는 그와 같은 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하고, 여기서 DNA 결합 활성은 서열-특이적이고, RNA의 서열에 좌우된다. RNA-유도된 DNA 결합제는 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9 단백질), 예컨대 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9 뉴클레아제)를 포함한다. 본원에 사용되는 바와 같은 "Cas 뉴클레아제", 또한 소위 "Cas 단백질"은 Cas 클리비지, Cas 닉카아제, 및 이의 불활성화된 형태 ("dCas DNA 결합제")를 포함한다. Cas 단백질은 추가로 유형 III CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, 이의 Cas10 Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛, 유형 I CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛, 및 부류 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "부류 2 Cas 뉴클레아제"는 RNA-유도된 DNA 결합 활성을 갖는 단일-사슬 폴리펩타이드, 예컨대 Cas9 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제이다. 부류 2 Cas 뉴클레아제는 부류 2 Cas 클리비지/닉카아제 (예를 들어, H840A, D10A, 또는 N863A 변이체)를 포함하고, 이는 추가로 RNA-유도된 DNA 클리비지 또는 닉카아제 활성, 및 부류 2 dCas DNA 결합제 (이에서 클리비지/닉카아제 활성은 불활성화됨)를 가진다. 부류 2 Cas 뉴클레아제는 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2cl, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예를 들어, N497A/R661A/Q695A/Q926A 변이체), HypaCas9 (예를 들어, N692A/M694A/Q695A/H698A 변이체), eSPCas9(1.0) (예를 들어, K810A/K1003A/R1060A 변이체), 및 eSPCas9(l.l) (예를 들어, K848A/K1003A/R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변이를 포함한다. Cpfl 단백질 (문헌[Zetsche et al., Cell, 163 : 1-13 (2015)])은 Cas9에 대해 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 함유한다. Zetsche 등의 Cpfl 서열은 그 전문이 본원에 참조로 편입되어 있다. 예를 들어, 표 S1 및 S3에서 Zetsche 등을 참조한다. "Cas9"는 Spy Cas9, 본원에 열거된 Cas9의 변이체, 및 이의 등가물을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Makarova et al , Nat Rev Microbiol, 13(1 1): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015)]을 참조한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 제1 서열은 제2 서열에 대한 제1 서열의 정렬이 제2 서열의 위치들 중 X% 이상이 전체적으로 제1 서열과 일치되는 것을 나타내는 경우에 제2 서열 "에 대한 적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함하는" 것으로 고려된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 정렬이 제2 서열의 모든 3개의 위치에 대한 일치가 존재하는 100% 동일성을 생성할 것이기 때문에 서열 AAG에 대한 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. RNA와 DNA 사이의 차이 (일반적으로 티미딘에 대한 우리딘의 교환 또는 그 반대) 및 뉴클레오사이드 유사체 예컨대 변이된 우리딘의 존재는 관련된 뉴클레오타이드 (예컨대 티미딘, 우리딘, 또는 변이된 우리딘)가 동일한 보체 (예를 들어, 티미딘, 우리딘, 또는 변이된 우리딘 모두에 대해 아데노신; 또 다른 예는 시토신 및 5-메틸시토신이고, 이 둘 모두는 보체로서 구아노신 또는 변이된 구아노신을 가짐)를 갖는 한, 폴리뉴클레오타이드 중에서 동일성 또는 상보성의 차이에 기여하지 않는다. 따라서, 예를 들어, X가 임의의 변이된 우리딘, 예컨대 슈도우리딘, N1-메틸 슈도우리딘, 또는 5-메톡시우리딘인 서열 5'-AXG는 둘 모두가 동일한 서열 (5'-CAU)에 대해 완전하게 상보적인 AUG와 100% 동일한 것으로 간주된다. 예시적인 정렬 알고리즘은 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 및 니들맨-운쉬(Needleman-Wunsch) 알고리즘이고, 이는 당업계에 잘 알려져 있다. 당해 분야의 숙련가는 알고리즘 및 파라미터 설정의 어떠한 선택이 정렬되는 주어진 쌍의 서열에 대해 적절한지 이해할 것이고; 일반적으로 유사한 길이의 서열의 경우 아미노산에 대해 >50%의 동일성 또는 뉴클레오타이드에 대해 >75%의 동일성이 예상되며, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI에 의해 제공된 니들맨-운쉬 알고리즘 인터페이스의 디폴트 설정을 갖는 니들맨-운쉬 알고리즘이 일반적으로 적절하다.
"mRNA"는 DNA가 아닌, 폴리펩타이드로 번역될 수 있는 (즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 번역을 위한 기질로서 역할을 할 수 있는) 열린 해독틀을 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 지칭하기 위해 본원에 사용된다. mRNA는 리보오스 잔기 또는 그것의 유사체, 예를 들어, 2'-메톡시 리보오스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 백본을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 포스페이트-당 백본의 당류는 본질적으로 리보오스 잔기, 2'-메톡시 리보오스 잔기, 또는 이들의 조합으로 이루어진다. 일반적으로, mRNA는 실질적인 양의 티미딘 잔기 (예를 들어, 0개의 잔기 또는 30, 20, 10, 5, 4, 3, 또는 2개 미만의 티미딘 잔기; 또는 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0.5%, 0.2%, 또는 0.1% 미만의 티미딘 함량)를 함유하지 않는다. mRNA는 그것의 우리딘 위치의 일부 또는 모두에서 변이된 우리딘을 함유할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "AAT" 또는 "A1AT"는 알파-1 항트립신을 지칭하고, 이는 SERPINA1 유전자의 유전자 생성물이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "AATD" 또는 "A1AD"는 알파-1 항트립신 결핍을 지칭한다. AATD는 SERPINA1에서의 다양한 상이한 유전자 돌연변이에 의해 야기된 질환 및 장애를 포함한다. AATD는 줄어든 수준의 AAT가 발현된 질환을 지칭하고, AAT는 발현되지 않거나, 또는 돌연변이체 또는 비-기능적 AAT가 발현된다.
본원에 기재된 가이드 RNA 조성물 및 방법에 유용한 가이드 서열은 표 1에 나타나 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "인델(indel)"은 핵산 중의 이중-가닥 절단 (DSB)의 부위에서 삽입되거나 또는 결실된 수많은 뉴클레오타이드로 이루어진 삽입/결실 돌연변이를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "녹다운"은 특정 유전자 생성물 (예를 들어, 단백질, mRNA, 또는 둘 모두)의 발현의 감소를 지칭한다. 단백질의 녹다운은 (예를 들어, 혈청 또는 세포 배지 중의) 조직 또는 세포의 모집단에 의해 분비된 단백질을 검출하거나 또는 관심대상의 조직 또는 세포 모집단으로부터 단백질의 총 세포양을 검출함으로써 측정될 수 있다. mRNA의 녹다운을 측정하기 위한 방법은 알려져 있고, 관심대상의 조직 또는 세포 모집단으로부터 단리된 mRNA의 서열분석을 포함한다. 일부 구현예에서, "녹다운"은 특정 유전자 생성물의 발현의 일부 손실을 지칭할 수 있고, 예를 들어 전사된 mRNA의 양을 감소시키거나 또는 (생체내 모집단 예컨대 조직에서 발견된 것을 포함하는) 세포의 모집단에 의해 발현되거나 또는 분비되는 단백질의 양을 감소시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "녹아웃"은 세포에서의 특정 단백질의 발현의 손실을 지칭한다. 녹아웃은 (예를 들어, 혈청 또는 세포 배지에서) 조직 또는 세포의 모집단으로부터 단백질 분비의 양을 검출함으로써 또는 조직 또는 세포의 모집단으로부터 단백질의 총 세포양을 검출함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 (예를 들어, 생체내 모집단 예컨대 조직에서 발견된 것을 포함하는 세포의 모집단에서) 하나 이상의 세포 중의 AAT를 "녹아웃시킨다". 일부 구현예에서, 녹아웃은 예를 들어, 인델에 의해 생성된 돌연변이체 AAT 단백질의 형성이 아닌 세포에서의 AAT 단백질의 발현의 완전한 소실이다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "돌연변이체 AAT"는 SERPINA1의 야생형 아미노산 서열 (NCBI 유전자 ID: 5265; Ensembl: Ensembl :ENSG00000197249)과 비교하여 AAT의 아미노산 서열에서의 변화를 갖는 SERPINA1 (즉, AAT 단백질)의 유전자 생성물을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "돌연변이체 SERPINA1" 또는 "돌연변이체 SERPINA1 대립유전자"는 야생형 서열 (NCBI 유전자 ID: 5265; Ensembl: Ensembl :ENSG00000197249)와 비교하여 SERPINA1의 뉴클레오타이드 서열에서의 변화를 갖는 SERPINA1 서열을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "리보핵단백질" (RNP) 또는 "RNP 복합체"는 RNA-유도된 DNA 결합제, 예컨대 Cas 단백질을 갖는 가이드 RNA를 지칭한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas9를 표적 서열에 유도하고, 가이드 RNA는 표적 서열로 혼성화되고, RNA-유도된 DNA 결합제는 표적 서열을 절단한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "표적 서열"은 gRNA의 가이드 서열에 대한 상보성을 갖는 표적 유전자에서의 핵산의 서열을 지칭한다. 상기 표적 서열 및 가이드 서열의 상호작용은 RNA-유도된 DNA 결합제를 결합하도록 유도하고, 잠재적으로 표적 서열 내에서 (제제의 활성에 따라) 닉킹되거나 절단되게 한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "치료"는 대상체에서의 질환 또는 장애에 대한 치료의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하고, 질환의 억제, 질환의 하나 이상의 증상의 완화, 질환의 치유, 또는 질환의 하나 이상의 증상의 재발 방지를 포함한다. 예를 들어, AATD의 치료는 AATD의 증상을 경감하는 것을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, AAT의 "Z 돌연변이체", "Z 형태 돌연변이체", "Z 변이체", "PiZ 변이체", 또는 "ZZ-형태"는 AAT의 아미노산 서열에서 라이신 (E342K 돌연변이)으로의 글루탐산의 미스센스 돌연변이를 유발하는 SERPINA1 유전자 서열에서의 돌연변이를 지칭한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정되거나 또는 결정되는 방식에 부분적으로 좌우되는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차를 의미한다.
I. 조성물
A. 가이드 RNA (gRNA)
일부 구현예에서, 본 발명은 SERPINA1에서의 표적 DNA 서열에 RNA-유도된 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)를 유도하는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 포함한다. gRNA는 표 1에 나타낸 하나 이상의 가이드 서열을 포함할 수 있다. 표 1의 가이드 서열은 crRNA 및/또는 trRNA를 더 포함할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 조성물 및 방법 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 RNA (sgRNA)에 연관될 수 있거나, 또는 별개의 RNA (dgRNA)에 연관될 수 있다.
본원에 기재된 각각의 조성물 및 방법 구현예에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA는 표 1에 기재된 가이드 서열 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열을 포함하는 제1 RNA 분자 (예를 들어 crRNA), 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함할 수 있다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유결합되지 않으나, crRNA의 일부와 trRNA 사이의 염기 페어링를 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
본원에 기재된 각각의 조성물 및 방법 구현예에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA (또는 이의 일부)에 공유결합된 표 1에 기재된 가이드 서열 중 어느 하나를 포함하는 crRNA (또는 이의 일부)를 포함한다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 링커에 의해 공유결합된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 crRNA의 일부와 trRNA 사이의 염기 페어링을 통해 스템-루프 구조(stem-loop structure)를 형성한다.
일부 구현예에서, trRNA는 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 야생형 trRNA 서열의 모두 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, trRNA는 절단된 또는 변이된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용되는 CRISPR/Cas 시스템에 좌우된다. 일부 구현예에서, trRNA는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100개 이상의 뉴클레오타이드를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 구현예에서, trRNA는 특정 이차 구조, 예컨대, 예를 들어, 하나 이상의 헤어핀 또는 스템-루프 구조, 또는 하나 이상의 돌출 구조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 식별 번호: 5-129 중 어느 하나의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함한다.
일 양태에서, 본 발명은 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 포함한다.
다른 구현예에서, 조성물은 식별 번호: 5-129 중 임의의 2개 이상 가이드 서열로부터 선택된 가이드 서열을 포함하는 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 각각이 식별 번호: 5-129의 핵산 중 임의의 것과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 표 2에 나타낸 서열 중 어느 하나 (식별 번호 130-139, 408, 및 410-421)를 포함하는 sgRNA이다. 일부 구현예에서, sgRNA는 식별 번호 130-139, 및 408의 핵산 중 어느 하나와 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 변이를 가지거나 가지지 않는 식별 번호: 130-139, 408, 및 410-421로의 표 2의 sgRNA 서열에 나타난 가이드 서열 대신에 표 1에 나타난 가이드 서열 중 어느 하나를 포함한다.
가이드 RNA는 식별 번호로 그에서 확인된 표 2에 나타난 서열 중 어느 하나의 변이를 포함한다. 즉, 뉴클레오타이드는 동일하거나 상이할 수 있으나, 변이 패턴은 표 2의 gRNA의 변이 패턴과 동일하거나 상이할 수 있다. 변이 패턴은 gRNA의 상대적 위치 및 동일성 또는 gRNA의 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이 패턴은 표 2의 서열의 열에 나타난 서열 중 어느 하나의 변이 패턴과 적어도 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 및 99% 동일하다. 일부 구현예에서, 변이 패턴은 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 뉴클레오타이드로 표 2의 서열의 변이 패턴, 또는 이러한 서열의 영역과 상이하다. 일부 구현예에서, gRNA는 0, 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개의 뉴클레오타이드로 표 2의 서열의 변이와 상이한 변이를 포함한다.
본 발명의 가이드 RNA 조성물은 SERPINA1 유전자에서의 표적 서열을 인식하기 위해 설계된다. 예를 들어, SERPINA1 표적 서열은 제공된 RNA-유도된 DNA 결합제에 의해 인식되고, 이에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 SERPINA1 유전자의 표적 서열에 대해 가이드 RNA에 의해 유도될 수 있고, 여기서 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화되고, Cas 단백질은 표적 서열을 절단한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 SERPINA1 유전자 내의 표적 서열에 기초하여 결정된다.
임의의 특정 이론에 구속됨 없이, 유전자의 임계 영역에서의 돌연변이는 유전자의 비-임계 영역에서의 돌연변이보다 덜 허용될 수 있고, 이에 따라 DSB의 위치는 일어날 수 있는 단백질 녹다운 또는 녹아웃의 양 또는 유형에 있어서 중요한 인자이다. 일부 구현예에서, SERPINA1 내의 표적 서열에 대해 상보적이거나 상보성을 갖는 gRNA는 Cas 단백질을 SERPINA1 유전자의 특정 위치로 유도하기 위해 사용된다. 일부 구현예에서, gRNA는 SERPINA1의 엑손 2, 3, 4, 또는 5에서 표적 서열에 대해 상보적이거나 또는 상보성을 갖는 가이드 서열을 갖도록 설계된다.
일부 구현예에서, gRNA는 AAT의 N-말단 영역에 대해 코딩되는 SERPINA1의 엑손 중의 표적 서열에 대해 상보적이거나 또는 상보성을 갖도록 설계된다.
B. 화학적으로 변이된 gRNA
일부 구현예에서, 본 발명은 하나 이상의 변이를 포함하는 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이는 2'-0-메틸 (2'-0-Me) 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이는 뉴클레오타이드들 사이의 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함한다.
변이된 당류는 뉴클레오타이드 당 고리의 퍼커링(puckering), 상보적 가닥에 대한 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도에 영향을 미치는 물리적 특성, 듀플렉스 형성, 및 뉴클레아제와의 상호작용을 조절하는 것으로 여겨진다. 당 고리 상의 치환은 이에 따라 이들 당류의 동일성 및 퍼커링을 변경한다. 예를 들어, 2'-(9-메틸 (2'-0-Me) 변이는 올리고뉴클레오타이드의 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있고, 한편 올리고뉴클레오타이드에서의 주어진 위치에서의 임의의 변이의 효과는 실험적으로 결정될 필요가 있다.
용어 "mA," "mC," "mU," 또는 "mG"는 2'-0-Me로 변이된 뉴클레오타이드를 의미하기 위해 사용될 수 있다.
2'-O-메틸의 변이는 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00010
뉴클레오타이드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 다른 화학적 변이는 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오타이드 당 고리 상의 2'-플루오로 (2'-F) 치환은 올리고뉴클레오타이드 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "fA," "fC," "fU," 또는 "fG"는 2'-F로 치환된 뉴클레오타이드를 의미하도록 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00011
일부 구현예에서, 변이는 2'-0-(2-메톡시에틸) (2'-0-moe)일 수 있다. 2'-0-moe 리보뉴클레오타이드와 같은 리보뉴클레오타이드의 변이는 하기와 같이 도시될 수 있다:
Figure pct00012
용어 "moeA," "moeC," "moeU," 또는 "moeG"는 2'-0-moe로 변이된 뉴클레오타이드를 나타내도록 사용될 수 있다.
포스포로티오에이트 (PS) 연결 또는 결합은 황이 포스포디에스테르 결합에서의, 예를 들어 뉴클레오타이드 염기들 사이의 결합에서 하나의 비가교된 포스페이트 산소에 대해 치환되는 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오타이드를 생성하기 위해 사용되는 경우, 변이된 올리고뉴클레오타이드는 또한 S-올리고로 지칭될 수 있다.
"*"는 PS 변이를 도시하기 위해 사용될 수 있다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U*, 또는 G*는 PS 결합으로 그 다음의 (예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결하는 뉴클레오타이드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "mA*," "mC*," "mU*," 또는 "mG*"는 PS 결합으로 그 다음의 (예를 들어, 3') 뉴클레오타이드에 연결하는 2'-0-Me로 치환되는 뉴클레오타이드를 나타내도록 사용될 수 있다.
하기 다이어그램은 포스포디에스테르 결합 대신에 PS 결합을 생성하는 비가교된 포스페이트 산소로의 S-의 치환을 나타낸다:
Figure pct00013
무염기성 뉴클레오타이드는 질소성 염기가 결여된 것을 지칭한다. 하기 도식은 염기가 결여된 무염기성 (또한 아퓨린산으로 지칭됨) 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 도시한다:
Figure pct00014
역전된 염기는 정상적인 5'에서 3' 연결 (즉, 5'에서 5' 연결 또는 3'에서 3 ' 연결)로부터 역전된 연결기를 갖는 것을 지칭한다. 예를 들어:
Figure pct00015
무염기성 뉴클레오타이드는 역전된 연결에 부착될 수 있다. 예를 들어, 무염기성 뉴클레오타이드는 5'에서 5' 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있거나, 또는 무염기성 뉴클레오타이드는 3'에서 3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오타이드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3 ' 뉴클레오타이드에서의 역전된 무염기성 뉴클레오타이드는 또한 역전된 무염기성 말단 캡으로 지칭될 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 단부 중의 5' 말단에서의 최초 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오타이드 중의 하나 이상, 및 3' 단부의 3' 말단에서의 마지막 3, 4, 또는 5개의 뉴클레오타이드 중의 하나 이상이 변이된다. 일부 구현예에서, 변이는 안정성 및/또는 성능을 증가시키는 것으로 당해 분야에서 잘 알려진 2'-0-Me, 2'-F, 2'-0-moe, 역전된 무염기성 뉴클레오타이드, PS 결합, 또는 다른 뉴클레오타이드 변이이다.
일부 구현예에서, 5' 단부 중의 5' 말단에서의 최초 4개의 뉴클레오타이드, 및 3' 단부의 3' 말단에서의 마지막 4개의 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 (PS) 결합으로 연결된다.
일부 구현예에서, 5' 단부 중의 5' 말단에서의 최초 3개의 뉴클레오타이드, 및 3' 단부의 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-0-메틸 (2'-0-Me) 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부 중의 5' 말단에서의 최초 3개의 뉴클레오타이드, 및 3' 단부의 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 2'-플루오로 (2'-F) 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 단부 중의 5' 말단에서의 최초 3개의 뉴클레오타이드, 및 3' 단부의 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드는 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 변이된 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 식별 번호: 130에 나타낸 변이 패턴을 포함하고, 여기서 N은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, 여기서 모든 N은 표적 서열에 RNA-유도된 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)를 유도하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 식별 번호: 410-421 중 어느 하나에 나타낸 변이 패턴을 포함하고, 여기서 N은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, 모든 N은 표적 서열에 RNA-유도된 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)를 유도하는 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA은 식별 번호: 131-139 중의 어느 하나에 나타낸 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 및 식별 번호: 408의 뉴클레오타이드 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA를 포함하고, 여기서 식별 번호: 408의 뉴클레오타이드는 가이드 서열의 3' 말단 상에 있고, 가이드 서열은 식별 번호: 130에 나타난 바와 같이 변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 및 식별 번호: 141의 뉴클레오타이드 중 어느 하나를 포함하는 sgRNA를 포함하고, 여기서 식별 번호: 141의 뉴클레오타이드는 가이드 서열의 3' 말단 상에 있고, 가이드 서열은 식별 번호: 130에 나타난 바와 같이 변이될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 2016년 12월 8일에 출원된 US 62/431,756 및 2017년 12월 8일에 출원된 PCT/US17/65306 ("화학적으로 변이된 가이드 RNA" 제목) 중 하나를 포함하고, 이의 내용은 그 전문이 본원에 참조로 편입되어 있다.
C. 벡터
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 가이드 서열 중 어느 하나 이상을 포함하는 임의의 가이드 RNA를 포함하는 DNA 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열 이외에, 벡터는 추가로 가이드 RNA를 인코딩하지 않는 핵산을 포함한다. 가이드 RNA를 인코딩하지 않는 핵산은 비제한적으로, 프로모터, 인핸서, 조절 서열, 및 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 (예를 들어, Cas9)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대, Cas9를 인코딩하는 crRNA 및 mRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대, Cas9를 인코딩하는 crRNA, trRNA, 및 mRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대, Cas9를 인코딩하는 sgRNA 및 mRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, Cas9는 스트렙토코커스 피오제네스 (즉, Spy Cas9)으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생 CRISPR Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 모두 또는 일부에 의해 측접된 가이드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 또는 이로 이루어지는 핵산은 벡터 서열을 더 포함하고, 여기서 벡터 서열은 crRNA, trR A, 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않은 핵산을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 벡터 내의 비-인접 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 인접 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 반대편 가닥에 의해 인코딩된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 인코딩된다.
D. 리보핵단백질 복합체
일부 구현예에서, 표 1 또는 표 2로부터의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 gRNA 및 RNA-유도된 DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)을 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, DNA 결합제 예컨대 Cas9를 갖는 gRNA는 리보핵단백질 복합체 (RNP)로 지칭된다. 일부 구현예에서, RNA-유도된 DNA 결합제는 Cas 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질을 갖는 gRNA는 Cas RNP를 지칭한다. 일부 구현예에서, RNP는 유형-I, 유형-II, 또는 유형-III 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-I CRISPR/Cas 시스템으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-III CRISPR/Cas 시스템으로부터의 것이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cpfl이다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9를 갖는 gRNA는 Cas9 RNP를 지칭한다.
Cas 뉴클레아제를 포함하는 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 유형-IIA, 유형-IIB, 또는 유형-IIC 시스템으로부터의 것일 수 있다. Cas 뉴클레아제 또는 다른 RNP 성분이 유래될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피오제네스(Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필루스(Streptococcus thermophilus), 스트렙토코커스 속(Streptococcus sp.), 스타필로코쿠스 아우레스(Staphylococcus aureus), 리스테리아 인노쿠아(Listeria innocua), 락토바실러스 가쎄리(Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다(Francisella novicida), 울리넬라 숙시노제네스(Wolinella succinogenes), 수테렐라 와드스워텐시스(Sutterlla wadsworthensis), 감마프로테오박테리움(Gammaproteobacterium), 나이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 캄필로박터 제주니(Campylobacter jejuni), 파스튜렐라 멀토시다(Pasteurella multocida), 파이브로박터 숙시노진(Fibrobacter succinogene), 로도스피릴룸 루브럼(Rhodospirillum rubrum), 노르카르디옵시스 닷손빌레이(Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티나에스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리디크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리디크로모제네스(Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 스트렙토스포란지움 로세움(Streptosporangium roseum), 알리사이클로바실러스 악시도칼다리우스(Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스(Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스(Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테리움 시비리쿰(Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루엑키이(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스(Lactobacillus salivarius), 락토바실러스 부크네리(Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라(Treponema denticola), 마이크로스실라 마리나(Microscilla marina), 버크홀데리아레스 박테리움(Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스(Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 속(Polar omonas sp.), 크로코스피라 와트소니(Crocosphaera watsonii), 시아노테스 속(Cyanothece sp.), 마이크로사이스티스 에어루기노사(Microcystis aeruginosa), 사이네초코쿠스 속(Synechococcus sp.), 아세토할로비움 아라박티쿰(Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시(Ammonifex degensii), 칼디셀룰로시럽터 베스시(Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데설포루디스(Candidatus Desulforudis), 클로스트리듐 보툴리눔(Clostridium botulinum), 클로스트리듐 디피실레(Clostridium difficile), 피네골디아 마그나(Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필루스(Natranaerobius thermophilus), 펠로토마컬럼 써모프로피오니쿰(Pelotomaculum thermopropionicum), 악시디티오바실러스 칼두스(Acidithiobacillus caldus), 악시디티오바실러스 페로옥시단스(Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노섬(Allochromatium vinosum), 마리노박터 속(Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필루스(Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니(Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로프랜크티스(Pseudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미퍼(Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼(Methanohalobium evestigatum), 아나바에나 바리아빌리스(Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나(Nodularia spumigena), 노스톡 속(Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마(Arthrospira maxima), 아르트로스피라 플라텐시스(Arthrospira platensis), 아르트로스피라 속(Arthrospira sp.), 링비아 속(Lyngbya sp.), 마이크로코레우스 크토노플라스테스(Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 속(Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스(Petrotoga mobilis), 레르모시포 아프리카누스(Thermosipho africanus), 스트렙토코쿠스 파스퇴리아누스(Streptococcus pasteurianus), 나이세리아 시네레아(Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리(Campylobacter lari), 파비바큘럼 라바멘티보란스(Parvibaculum lavamentivorans), 코라이네박테리움 디프테리아(Corynebacterium diphtheria), 악시다미노코쿠스 속(Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 D2006(Lachnospiraceae bacterium D2006), 및 아카리오클로리스 마리나(Acaryochloris marina)를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피오제네스로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 써모필루스로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 나이세리아 메닌기티디스로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스타필로코쿠스 아우레스로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 악시다미노코쿠스 속으로부터의 Cpf1 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006로부터의 Cpf1 단백질이다.
야생형 Cas9는 2개의 뉴클레아제 도메인: RuvC 및 HNH를 가진다. RuvC 도메인 비-표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 분리한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 1개 초과의 RuvC 도메인 및/또는 1개 초과의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 각각의 조성물 및 방법 구현예에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 중단을 유도한다.
불활성인 하나의 촉매 도메인, RuvC 또는 HNH를 갖는 Cas9의 변이된 형태는 "닉카아제"로 명명된다. 닉카아제는 표적 DNA 상의 단지 하나의 가닥을 절단하고, 이에 따라 단일-가닥 절단을 생성한다. 또한, 단일-가닥 절단은 "닉(nick)"으로 알려져 있다. 일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 닉카아제를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물 및 방법은 표적 DNA 내의 이중 가닥 절단 이외에 닉을 유도하는 닉카아제 Cas9를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 단백질은 단 하나의 작용성 뉴클레아제 도메인을 함유하도록 변이될 수 있다. 예를 들어, Cas 단백질은 하나의 뉴클레아제 도메인이 돌연변이되거나 또는 완전하게 또는 부분적으로 결실되어 그것의 핵산 절단 활성을 감소시키도록 변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 감소된 활성을 갖는 RuvC 도메인을 갖는 닉카아제 Cas가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 닉카아제 Cas가 사용된다. 일부 구현예에서, 감소된 활성을 갖는 HNH 도메인을 갖는 닉카아제 Cas가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 닉카아제 Cas가 사용된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산이 치환되어 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 또는 변경한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 내의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인 내의 예시적인 아미노산 치환은 D10A (S. 피오제네스 Cas9 단백질에 기초함)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22: 163(3): 759-771]을 참조한다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서의 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A (S. 피오제네스 Cas9 단백질에 기초함)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Zetsche et al (2015)]을 참조한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 RNP 복합체는 각각 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 상보적인 한 쌍의 가이드 RNA 및 닉카아제를 포함한다. 이러한 구현예에서, 가이드 RNA는 표적 서열에 닉카아제를 유도하고, 표적 서열의 반대편 스트랜드 상에 닉을 생성함으로써 (즉, 이중 닉킹) DSB를 주입한다. 일부 구현예에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선할 수 있고, 비표적 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 닉카아제 Cas는 DNA의 반대편 가닥을 표적화하는 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용되어 표적 DNA에서의 이중 닉을 생성한다. 일부 구현예에서, 닉카아제 Cas는 밀접하게 근접되도록 선택된 2개의 별개의 가이드 RNA와 함께 사용되어 표적 DNA에서의 이중 닉을 생성한다.
일부 구현예에서, 키메라 Cas 단백질이 사용되며, 여기서 단백질의 하나의 도메인 또는 영역은 상이한 단백질의 부분으로 대체된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 상이한 뉴클레아제 예컨대 Fok1으로부터의 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 변이된 뉴클레아제일 수 있다.
다른 구현예에서, Cas 단백질은 유형-I CRISPR/Cas 시스템으로부터의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-I CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 성분일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 유형-III CRISPR Cas 시스템으로부터의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 단백질은 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
E. gRNA의 효능의 결정
일부 구현예에서, gRNA의 효능은 RNP의 다른 성분과 함께 발현되는 경우에 결정된다. 일부 구현예에서, gRNA는 Cas와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, gRNA는 미리 안정하게 Cas를 발현한 세포주에서 발현된다.
Cas RNP 시스템의 사용은 DNA에서 이중-가닥 절단을 야기할 수 있다. 비상동성 말단 연결 (NHEJ)은 DNA에서의 이중-가닥 절단 (DSB)이 삽입/결실 (인델) 돌연변이의 형태로의 오류를 일으킬 수 있는 절단 말단의 재결찰을 통해 복구되는 공정이다. DSB의 DNA 말단은 빈번하게 효소 과정에 가해지고, 이는 말단의 재연결 이전에 1 또는 2개의 가닥에서 뉴클레오타이드의 첨가 또는 제거를 야기한다. 재연결 이전의 이러한 첨가 또는 제거는 NHEJ 복구의 부위의 DNA 서열에서 삽입 또는 결실 (인델) 돌연변이의 존재를 야기한다. 인델로 인한 수많은 돌연변이는 해독틀을 변경하거나 또는 미성숙한 정지 코돈을 도입하고, 이에 따라 비-작용성 단백질을 생성한다.
일부 구현예에서, 특정 gRNA의 효능은 시험관내 모델에 기초하여 결정된다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 Cas9 (HEK293_Cas9)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 HUH7 인간 간암종 세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 sk-Hep 인간 간 선암종 세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 원발성 인간 간세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 HepG2 세포이다.
일부 구현예에서, 특정 가이드 서열의 효능은 gRNA 선택 공정에 대한 다중 시험관내 세포 모델에 걸쳐 결정된다. 일부 구현예에서, 선택된 gRNA를 사용한 데이터의 세포주 비교를 수행한다. 일부 구현예에서, 다중 세포 모델에서의 크로스 스크리닝이 수행된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 SERPINA1의 편집 백분율에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, SERPINA1의 편집 백분율은 대조군 유전자 (예를 들어, gRNA가 표적화되지 않는 유전자)의 편집 백분율과 비교된다. 일부 구현예에서, 대조군 유전자는 표 1에 나타난 바와 같은 대조군 1, 2, 3, 또는 4이다. 일부 구현예에서, 편집 백분율 (예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 백분율")은 삽입/결실 ("인델")로의 서열 판독의 총수 또는 야생형을 포함하는 서열 판독의 총수에 대한 치환으로서 정의된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 약 100%인 편집 백분율을 가진다. 일부 구현예에서, 편집 백분율은 예를 들어 5 내지 10%, 10 내지 15%, 15 내지 20%, 20 내지 25%, 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%이다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 방법 및 조성물은 비표적 절단의 감소를 갖는 가이드 RNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 검출가능한 비표적 절단이 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 비표적 부위에서보다도 적어도 50-배 이상으로 SERPINA1 유전자에서 일어난다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 비표적 부위에서보다도 50-배 내지 150-배, 150-배 내지 500-배, 500-배 내지 1500-배, 1500-배 내지 5000-배, 5000-배 내지 15000-배, 15000-배 내지 30000-배, 또는 30000-배 내지 60000-배 초과로 ERPINA1 유전자에서 일어난다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 AAT의 분비에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, AAT의 분비는 배양 배지를 사용한 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 검정을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, AAT의 분비는 편집을 측정하기 위해 사용된 동일한 시험관내 시스템에서 측정된다. 일부 구현예에서, AAT의 분비는 원발성 인간 간세포에서 측정된다. 일부 구현예에서, AAT의 분비는 HUH7 세포에서 측정된다.
일부 구현예에서, 세포에서의 AAT의 양은 gRNA의 효능을 측정한다. 일부 구현예에서, 세포에서의 AAT의 양은 웨스턴 블랏을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 사용된 세포는 HUH7 세포이다. 일부 구현예에서, AAT의 양은 세포 수의 변화를 조절하기 위해 대조군에 대해 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 GAPDH (하우스키핑 유전자)에 대한 양을 비교한다.
II. AATD의 치료
일부 구현예에서, SERPINA1 유전자 내의 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는 방법이 제공되며, 이는 식별 번호: 5-129의 임의의 하나 이상의 가이드 서열, 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA의 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA는 SERPINA1 유전자에서의 DSB를 유도하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질, 예컨대, 예를 들어, Cas9, 또는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질, 예컨대, 예를 들어, Cas9를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여되는 가이드 RNA는 본원에 기재된 가이드 RNA 조성물 중 하나 이상이다.
일부 구현예에서, SERPINA1 유전자의 변이 방법이 제공되며, 이는 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상, 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA 중 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상, 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA는 SERPINA1 유전자를 변이시키도록 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질, 예컨대, 예를 들어, Cas9를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, AATD의 치료 방법이 제공되며, 이는 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상, 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상, 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA는 AATD를 치료하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 단백질 또는 Cas 단백질, 예컨대, 예를 들어, Cas9를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체의 혈청, 간, 간 조직, 간 세포, 및/또는 간세포에서의 AAT의 축적을 감소시키거나 또는 예방하는 방법이 제공되며, 이는 식별 번호 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상, 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA 중 임의의 1개 이상을 포함하는 가이드 RNA를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상 또는 식별 번호: 130-139의 sgRNA 중 하나 이상을 포함하는 gRNA는 간, 간 조직, 간 세포, 및/또는 간세포에서의 AAT의 축적을 감소시키거나 또는 예방하기 위해 투여된다. gRNA는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질 또는 Cas 단백질, 예컨대, 예를 들어, Cas9를 인코딩하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 단백질과 함께 표 1 또는 표 2의 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 DSB를 유도하고, 복구 과정에서 비-상동성 말단 연결(NHEJ)이 SERPINA1 유전자에서의 돌연변이를 유발한다. 일부 구현예에서, NHEJ는 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발하고, 이는 SERPINA1 유전자에서의 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서의) 본 발명의 가이드 RNA를 투여하는 것은 대상체에 의해 생산된 돌연변이된 알파-1 항트립신 (AAT)의 수준을 감소시키고, 따라서 간에서의 AAT의 축적 및 응집을 예방한다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 포유동물이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 소, 돼지, 원숭이, 양, 개, 고양이, 어류, 또는 가금이다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 표 1 또는 표 2에서의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA의 사용은 AATD를 갖는 인간 대상체의 치료를 위한 의약의 제조를 위해 제공된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA, 조성물, 및 제형은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA, 조성물, 및 제형은 간 순환으로 투여된다.
일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 본 발명의 가이드 RNA의 단일 투여는 돌연변이체 단백질의 발현을 녹다운시키기에 충분하다. 일부 구현예에서, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 본 발명의 가이드 RNA의 단일 투여는 돌연변이체 단백질의 발현을 녹다운시키기에 충분하다. 다른 구현예에서, (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 본 발명의 가이드 RNA의 1회 초과의 투여는 누적 효과를 통한 편집을 최대화하는데 유리할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명의 조성물로의 치료의 효능은 전달하고 1 년, 2 년, 3 년, 4 년, 5 년, 또는 10 년 차에 보여진다.
일부 구현예에서, 치료는 간 질환 진행을 느리게 하고 중지시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 간 질환 측정을 개선한다. 일부 구현예에서, 간 질환은 대상체에서의 간 구조, 간 기능, 또는 증상의 변화에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 치료의 효능은 대상체에서 간 이식을 지연시키거나 회피하는 능력에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 치료의 효능은 대상체의 증가된 생존 시간에 의해 측정된다.
일부 구현예에서, 치료의 효능은 혈액에서의 간 효소의 감소에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 간 효소는 알라닌 아미노전이효소 (ALT) 또는 아스파르테이트 아미노전이효소 (AST)이다.
일부 구현예에서, 치료의 효능은 생검 결과에 기초한 간에서의 반흔 조직의 감소 또는 반흔 조직의 발달을 늦춤으로써 측정된다.
일부 구현예에서, 치료의 효능은 환자-보고된 결과 예컨대 피로, 약화, 가려움, 식욕 상실, 식욕 상실, 체중 감소, 메스꺼움, 또는 복부팽만을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 치료의 효능은 부종, 복수, 또는 황달의 감소로 측정된다. 일부 구현예에서, 치료의 효능은 관문 고혈압의 감소로 측정된다. 일부 구현예에서, 치료의 효능은 간암의 속도의 감소로 측정된다.
일부 구현예에서, 치료의 효능은 이미지형성 방법을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 이미지형성 방법은 초음파, 컴퓨터화된 단층촬영, 자기 공명 형상화, 또는 탄성측정이다.
일부 구현예에서, 혈청 및/또는 간 AAT 수준은 조성물의 투여 이전에 혈청 및/또는 간 AAT 수준과 비교하여 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-98%, 98-99%, 또는 99-100%까지 감소된다.
일부 구현예에서, SERPINA1 유전자의 편집 백분율은 30 내지 99%이다. 일부 구현예에서, 편집 백분율은 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%이다.
A. 병용 요법
일부 구현예에서, 본 발명은 AATD의 폐 증상을 경감하기 위해 적합한 확대 요법과 함께 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상 또는 표 2에서의 sgRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 중 어느 하나를 포함하는 병용 요법을 포함한다. 일부 구현예에서, 폐 질환에 대한 확대 요법은 문헌 [Turner, BioDrugs 2013 Dec;27(6):547-58]에 기재된 바와 같이 인간 혈장으로부터 정제된 AAT로의 정맥내 요법이다. 일부 구현예에서, 확대 요법은 Prolastin®, Zemaira®, Aralast®, 또는 Kamada®를 사용한다.
일부 구현예에서, 병용 요법은 ATT 또는 돌연변이체 ATT를 표적화하는 siRNA와 함께 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상 또는 표 2의 sgRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 중 임의의 하나를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 야생형 또는 돌연변이체 AAT의 발현을 추가로 감소시키거나 또는 근절시킬 수 있는 임의의 siRNA이다. 일부 구현예에서, siRNA는 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물로의) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상 또는 표 2에서의 sgRNA 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 중 어느 하나 이후에 투여된다. 일부 구현예에서, siRNA는 본원에 제공된 임의의 gRNA 조성물로의 치료 이후에 규칙적 기준으로 투여된다.
B. gRNA의 전달
일부 구현예에서, 단독 또는 하나 이상의 벡터 상에 인코딩된 본원에 기재된 가이드 RNA 조성물은 지질 나노입자에 제형화되거나 또는 이를 통해 투여되고; 예를 들어 "CRISPR/CAS 성분을 위한 지질 나노입자 제형"의 명칭의 2017년 3월 30일에 출원된 PCT/US2017/024973을 참조하며, 이의 내용은 그 전문이 참조로 편입되어 있다. 대상체에 뉴클레오타이드를 전달할 수 있는 당해 분야의 숙련가에게 알려진 임의의 지질 나노입자 (LNP) 제형은 본원에 기재된 가이드 RNA뿐만 아니라 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 또는 Cas9, 또는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 또는 Cas9 단백질 그 자체를 인코딩한 mRNA와 함께 이용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 대상체에게 본원에 개시된 gRNA 중 임의의 하나를 전달하는 방법을 포함하며, 여기서 gRNA는 LNP와 연관된다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas9 또는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas9를 인코딩한 mRNA와 연관된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개시된 gRNA 중 어느 하나 및 LNP를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 추가로 Cas9 또는 Cas9를 인코딩한 mRNA를 더 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 지질 예컨대 CCD 지질 예컨대 지질 ((9Z, 12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9, 12-디에노에이트, 또한 소위 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디에노에이트)), 지질 B (((5-((디메틸아미노)메틸)-l,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,l-디일)비스(데카노에이트), 또한 소위 ((5-((디메틸아미노)메틸)-l,3-페닐렌)비스(옥시))비스(옥탄-8,l-디일) 비스(데카노에이트)), 지질 C (2-((4-(((3-(디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)헥사데카노일)옥시)프로판-l,3-디일(9Z,9'Z, 12Z, 12'Z)-비스(옥타데카-9, 12-디에노에이트)), 또는 지질 D (-(((3- (디메틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)-13-(옥타노일옥시)트리데실 3-옥틸운데카노에이트)를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 약 4.5의 RNA 포스페이트에 대한 양이온성 지질 아민의 몰비(N:P)를 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 AATD를 치료하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 AATD를 갖는 대상체에서 AAT의 축적 및 응집을 감소시키거나 또는 예방하기 위해 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 혈청 및/또는 간 AAT 농도를 감소시키기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 대상체, 예컨대 포유동물, 예를 들어, 영장류 예컨대 인간에서 AATD를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 AATD를 갖는 대상체, 예컨대 포유동물, 예를 들어, 영장류 예컨대 인간에서 AAT의 축적 및 응집을 감소시키거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 연관된 LNP는 대상체, 예컨대 포유동물, 예를 들어, 영장류 예컨대 인간에서의 혈청 AAT 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 것이다.
전기천공은 또한 카고(cargo)의 전달을 위해 잘 알려진 수단이고, 임의의 전기천공 방법은 본원에 개시된 gRNA 중 임의의 하나의 전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전기천공은 본원에 개시된 gRNA 중 임의의 하나 및 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas9 또는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas9를 인코딩한 mRNA를 전달하기 위해 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 생체외 세포에 대해 본원에 개시된 gRNA 중 임의의 하나를 전달하기 위한 방법을 포함하며, 여기서 gRNA는 LNP와 연관되거나 또는 LNP와 연관되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP 또는 gRNA는 또한 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas9 또는 RNA-유도된 DNA 제제 예컨대 Cas9를 인코딩한 mRNA와 연관된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 가이드 RNA를 인코딩한 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 인코딩한 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열 이외에, 벡터는 가이드 RNA를 인코딩하지 않는 핵산을 더 포함한다. 가이드 RNA를 인코딩하지 않은 핵산은 비제한적으로, 프로모터, 인핸서, 조절 서열, 및 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산을 포함하고, 이는 뉴클레아제 예컨대 Cas9일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 인코딩한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대 Cas9 또는 Cpf1일 수 있는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 sgRNA 및 mRNA를 인코딩한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 Cas 단백질, 예컨대, Cas9 또는 Cpf1일 수 있는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 crRNA, trRNA, 및 mRNA를 인코딩한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열(들)을 포함한다. 하나의 구현예에서, Cas9는 스트렙토코쿠스 피오제네스 (즉, Spy Cas9)로부터의 것이다. 일부 구현예에서, (sgRNA일 수 있는) crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 인코딩한 뉴클레오타이드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 모두 또는 일부에 의해 측접된 가이드 서열을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 또는 이로 이루어진 핵산은 벡터 서열을 더 포함할 수 있고, 여기서 벡터 서열은 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 또는 이로 이루어진다.
일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 하나의 벡터 내의 비-인접 핵산에 의해 인코딩된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 인접 핵산에 의해 인코딩될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 반대편 가닥에 의해 인코딩된다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 핵산의 동일한 가닥에 의해 인코딩된다.
일부 구현예에서, 벡터는 원형일 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터는 선형일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 지질 나노입자, 리포좀, 비-지질 나노입자, 또는 바이러스 캡시드에 봉입될 수 있다. 비제한적인 예시적인 벡터는 플라스미드, 파아지미드, 코스미드, 인공 염색체, 미니염색체, 트랜스포존, 바이러스 벡터, 및 발현 벡터를 포함한다.
일부 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 그것의 야생형 대응물로부터 유전자적으로 변이될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 클로닝을 촉진하기 위해 또는 벡터의 하나 이상의 특성이 변화되도록 하나 이상의 뉴클레오타이드의 삽입, 결실, 또는 치환을 포함할 수 있다. 이와 같은 특성은 패키징 수용력, 형질도입 효율, 면역원성, 게놈 통합, 복제, 전사, 및 번역을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 게놈의 일부는 바이러스가 더 큰 크기를 갖는 외인성 서열을 패키징할 수 있도록 결실될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 향상된 형질도입 효율을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 호스트에서의 바이러스에 의해 유도된 면역 반응은 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 호스트 게놈으로의 바이러스 서열의 통합을 촉진하는 바이러스 유전자 (예컨대, 예를 들어, 인테그라제)는 바이러스가 통합되지 않도록 돌연변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 벡터 상의 코딩 서열의 발현을 유도하기 위한 외인성 전사 또는 번역 조절 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스는 헬퍼-의존적일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 바이러스 입자로 벡터를 증폭시키고 패키징하기 위해 요구되는 바이러스 성분 (예컨대, 예를 들어, 바이러스 단백질)을 공급하기 위해 하나 이상의 헬퍼 바이러스를 필요로 할 수 있다. 그와 같은 경우에, 바이러스 성분을 인코딩한 하나 이상의 벡터를 포함하는 하나 이상의 헬퍼 성분은 본원에 기재된 벡터 시스템과 함께 숙주 세포로 도입될 수 있다. 다른 구현예에서, 바이러스는 헬퍼-무함유일 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 임의의 헬퍼 바이러스 없이 벡터를 증폭시키고 패키징할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 벡터 시스템은 또한 바이러스 증폭 및 패키징을 위해 필요한 바이러스 성분을 인코딩할 수 있다.
비제한적인 예시적인 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터, 렌티바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 헬퍼 의존적 아데노바이러스 벡터 (HDAd), 단순 포진 바이러스 (HSV-1) 벡터, 박테리오파아지 T4, 배큘로바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 바이러스 벡터는 AAV2, AAV3, AAV3B, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAVrh.64R1, AAVhu.37, AAVrh.8, AAVrh.32.33, AAV8, AAV9, AAVrhlO, 또는 AAVLK03이다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
일부 구현예에서, 렌티바이러스는 비통합(non-integrating)될 수 있다. 일부 구현예, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스는 고-클로닝 능력 또는 "게놈제거된(gutless)" 아데노바이러스일 수 있고, 여기서 5'에서 3'으로의 역전된 말단 반복 (ITR) 및 패키징 신호 (T)와 떨어져 있는 모든 코딩 바이러스 영역은 바이러스로부터 결실되어 그것의 패키징 능력을 증가시킨다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 HSV-1 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서, HSV-l-기반 벡터는 헬퍼 의존적이고, 다른 구현예에서, 이는 헬퍼 독립적이다. 예를 들어, 패키징 서열만을 보유하는 앰플리콘 벡터는 패키징을 위한 구조 성분과 함께 헬퍼 바이러스를 요구하고, 한편 비필수적인 바이러스 기능을 제거한 30kb-결실된 HSV-1 벡터는 헬퍼 바이러스를 요구하지 않는다. 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터는 박테리오파아지 T4일 수 있다. 일부 구현예에서, 박테리오파아지 T4는 바이러스의 헤드가 비어지는 경우에 임의의 선형 또는 원형 DNA 또는 RNA 분자를 패키징할 수 있다. 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터는 배큘로바이러스 벡터일 수 있다. 다른 추가의 구현예에서, 바이러스 벡터는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 더 작은 클로닝 능력을 갖는 AAV 또는 렌티바이러스 벡터를 사용하는 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같이 벡터 시스템의 모든 성분을 전달하기 위해 1개 초과의 벡터를 사용하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 하나의 AAV 벡터는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)을 인코딩하는 서열을 함유할 수 있고, 한편 제2 AAV 벡터는 하나 이상의 가이드 서열을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 세포에서의 하나 이상의 코딩 서열의 발현을 유도할 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 원핵 세포, 예컨대, 예를 들어, 박테리아 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 진핵 세포, 예컨대, 예를 들어, 효모, 식물, 곤충, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 포유동물 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 설치류 세포일 수 있다. 일부 구현예에서, 진핵 세포는 인간 세포일 수 있다. 상이한 유형의 세포에서의 발현을 유도하기 위한 적합한 프로모터는 당해 기술분야에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 야생형일 수 있다. 다른 구현예에서, 프로모터는 보다 효율적인 또는 유효한 발현을 위해 변이될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 프로모터는 절단되어 그것의 기능을 여전히 보유한다. 예를 들어, 프로모터는 바이러스로의 벡터의 적절한 패키징을 위해 적합한 정상 크기 또는 감소된 크기를 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 본원에 기재된 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질 (예를 들어, Cas9)을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터에 의해 인코딩된 뉴클레아제는 Cas 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 하나의 복제를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터 시스템은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열의 1개 초과의 복제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 구성적, 유도성, 또는 조직-특이적일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 항시성 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 항시성 프로모터는 사이토메갈로바이러스 즉각적인 초기 프로모터 (CMV), 유인원 바이러스 (SV40) 프로모터, 아데노바이러스 주 말기 (MLP) 프로모터, 루 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나제 (PGK) 프로모터, 연신 인자-알파 (EF1a) 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, 액틴 프로모터, 튜불린 프로모터, 면역글로불린 프로모터, 이의 기능적 단편, 또는 전술한 것 중 임의의 것의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 CMV 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 절단된 CMV 프로모터일 수 있다. 다른 구현예에서, 프로모터는 EF1a 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 유도성 프로모터일 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열충격, 빛, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의해 유도성인 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 낮은 기저 (비-유도된) 발현 수준을 갖는 것, 예컨대, 예를 들어, Tet-On® 프로모터 (Clontech)일 수 있다.
일부 구현예에서, 프로모터는 간에서의 발현에 특이적인 조직-특이적 프로모터, 예를 들어, 프로모터일 수 있다.
벡터는 본원에 기재된 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 가이드 RNA의 하나의 복제를 포함한다. 다른 구현예에서, 벡터는 가이드 RNA의 1개 초과의 복제를 포함한다. 1개 초과의 가이드 RNA를 사용하는 구현예에서, 가이드 RNA는 이들이 상이한 표적 서열을 표적화하도록 동일하지 않을 수 있거나, 또는 이들이 동일한 표적 서열을 표적화하도록 동일할 수 있다. 벡터가 1개 초과의 가이드 RNA를 포함하는 일부 구현예에서, 각각의 가이드 RNA는 예컨대 RNA-유도된 DNA 뉴클레아제를 갖는 복합체, 예컨대 Cas RNP 복합체 내의 다른 상이한 특성, 예컨대 활성 또는 안정성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 적어도 하나의 전사 또는 번역 조절 서열, 예컨대 프로모터, 3' UTR, 또는 5' UTR에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일 구현예에서, 프로모터는 tRNA 프로모터, 예를 들어, tRNALys3, 또는 tRNA 키메라일 수 있다. 문헌 [Mefferd et al., RNA. 2015 21 : 1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35 : 2620-2628]을 참조한다. 일부 구현예에서, 프로모터는 RNA 중합효소 III (Pol III)에 의해 인식될 수 있다. Pol III 프로모터의 비-제한적인 예는 U6 및 H1 프로모터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 마우스 또는 인간 U6 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 1개 초과의 가이드 RNA를 사용하는 구현예에서, 발현을 유도하도록 사용되는 프로모터는 동일하거나 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 crRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 및 가이드 RNA의 trRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드는 동일한 벡터 상에 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 및 trRNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드는 동일한 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 전사체로 전사될 수 있다. 예를 들어, crRNA 및 trRNA는 단일 전사체로부터 처리되어 이중-분자 가이드 RNA를 형성할 수 있다. 대안적으로, crRNA 및 trRNA는 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)로 전사될 수 있다. 다른 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 동일한 벡터 상에서 그것의 상응하는 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 또 다른 구현에에서, crRNA 및 trRNA는 상이한 벡터에 의해 인코딩될 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA를 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 동일한 벡터 상에 위치할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질의 가이드 RNA의 발현은 그들 자신의 상응하는 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 발현은 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질의 발현을 유도하는 동일한 프로모터에 의해 유도될 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 및 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질 전사체는 단일 전사체 내에 함유될 수 있다. 예를 들어, 가이드 RNA는 RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질 전사체의 미번역된 영역 (UTR) 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 전사체의 5' UTR 내에 존재할 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 RNA는 전사체의 3' UTR 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 전사체의 세포내 반감기는 그것의 3' UTR 내에 가이드 RNA를 함유시켜 감소시킴으로써 그것의 3' UTR의 길이를 단축시킨다. 추가의 구현예에서, 가이드 RNA는 전사체의 인트론 내에 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 스플라이스 부위는 가이드 RNA가 전사체의 외부에서 적절하게 스플라이싱되도록 위치하는 인트론에 첨가될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-유도된 DNA 결합제 예컨대 Cas 단백질 및 밀접하게 일시적으로 근접된 동일한 벡터로부터의 가이드 RNA의 발현은 CRISPR RNP 복합체의 보다 효율적인 형성을 촉진할 수 있다.
일부 구현예에서, 조성물은 벡터 시스템을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터 시스템은 하나의 단일 벡터를 포함할 수 있다. 다른 구현예에서, 벡터 시스템은 2개의 벡터를 포함할 수 있다. 추가의 구현예에서, 벡터 시스템은 3개의 벡터를 포함할 수 있다. 상이한 가이드 RNA가 다중화를 위해 사용되는 경우, 또는 가이드 RNA의 복수개의 복제가 사용되는 경우, 벡터 시스템은 3개 초과의 벡터를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터 시스템은 이것이 표적 세포에 전달된 이후에만 발현을 시작하는 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 비제한적인 예시적인 유도성 프로모터는 열충격, 빛, 화학물질, 펩타이드, 금속, 스테로이드, 항생제, 또는 알코올에 의해 유도성인 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 유도성 프로모터는 낮은 기저 (비-유도된) 발현 수준을 갖는 것, 예컨대, 예를 들어, Tet-On® 프로모터 (Clontech)일 수 있다.
추가의 구현예에서, 벡터 시스템은 이것이 특이적 조적에 전달된 이후에만 발현을 시작하는 조직-특이적 프로모터를 포함할 수 있다.
벡터는 리포좀, 나노입자, 엑소좀, 또는 미세소포에 의해 전달될 수 있다. 벡터는 또한 지질 나노입자 (LNP)에 의해 전달될 수 있다. 본원에 기재된 임의의 LNP 및 LNP 제형은 가이드 단독 또는 cas 뉴클레아제 또는 cas 뉴클레아제를 인코딩하는 mRNA와 함께의 전달을 위해 적합하다. 일부 구현예에서, RNA 성분 및 지질 성분을 포함하는 LNP 조성물이 포함되고, 여기서 지질 성분은 아민 지질, 중성 지질, 헬퍼 지질, 및 스텔스 지질을 포함하고; 여기서 N/P 비는 약 1-10이다.
일부 경우에서, 지질 성분은 지질 A, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG-DMG를 포함하고; 여기서 N/P 비는 약 1-10이다. 일부 구현예에서, 지질 성분은 하기를 포함한다: 약 40-60 mol-% 아민 지질; 약 5-15 mol-% 중성 지질; 및 약 1.5-10 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3-10이다. 일부 구현예에서, 지질 성분은 약 50-60 mol-% 아민 지질; 약 8-10 mol-% 중성 지질; 및 약 2.5-4 mol-% PEG 지질을 포함하고, 여기서 지질 성분의 나머지는 헬퍼 지질이고, LNP 조성물의 N/P 비는 약 3-8이다. 일부 경우에서, 지질 성분은 하기를 포함한다: 약 50-60 mol-% 아민 지질; 약 5-15 mol-% DSPC; 및 약 2.5-4 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 콜레스테롤이고, 여기서 LNP 조성물의 N/P는 약 3-8이다. 일부 경우에서, 지질 성분은 하기를 포함한다: 48-53 mol-% 지질 A; 약 8-10 mol-% DSPC; 및 1.5-10 mol-% PEG 지질, 여기서 지질 성분의 나머지는 콜레스테롤이고, LNP 조성물의 N/P 비는 3-8 ±0.2이다.
일부 구현예에서, 벡터는 전신으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 간 순환으로 전달될 수 있다.
일부 구현예에서, 벡터는 전신으로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 벡터는 간 순환으로 전달될 수 있다.
III. 특정 구현예의 인용
일부 구현예에서, 본 발명은 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 경우에서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다.
가이드 RNA는 인간 SERPINA1 유전자에 존재하는 표적 서열에 대해 적어도 부분적으로 상보적일 수 있다.
가이드 RNA는 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2, 3, 4, 또는 5에 존재하는 표적 서열에 뉴클레아제를 유도할 수 있다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2에 존재하는 표적 서열에 뉴클레아제를 유도한다. 일부 경우에서, 엑손 2를 표적화하는 가이드 RNA는 CR001370, CR001373, CR001374, CR001376, CR001379, CR001380, CR001386, CR001386, CR003196, CR001391, CR003198, CR001395, CR001397, CR001400, CR001404, CR001405, CR003208, CR001409, CR001413, CR001421, CR001422, 및 CR001427로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 3에 존재하는 표적 서열에 뉴클레아제를 유도한다. 일부 경우에서, 엑손 3을 표적화하는 가이드 RNA는 CR001450, CR003214, CR001453, CR001454, 및 CR003217로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 4에 존재하는 표적 서열에 뉴클레아제를 유도한다. 일부 경우에서, 엑손 4를 표적화하는 가이드 RNA는 CR003225 및 CR003226으로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 5에 존재하는 표적 서열에 뉴클레아제를 유도한다. 일부 경우에서, 엑손 5를 표적화하는 가이드 RNA는 CR001475 및 CR001476으로부터 선택된다.
일부 경우에서, 가이드 RNA는 이중 가이드 (dgRNA)이다. 또한 가이드는 단일 가이드 RNA (sgRNA)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 가이드 서열 중 어느 하나를 포함하고, 추가로 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하고, 여기서 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드는 그것의 3' 말단에서 가이드 서열에 후속된다. 일부 구현예에서, 이중 가이드 RNA는 trRNA를 더 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 식별 번호: 130-139, 또는 408로부터 선택된 서열을 포함하는 sgRNA를 포함한다.
일부 경우에서, sgRNA는 식별 번호: 130-139, 또는 408로부터 선택된 서열에 대해 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함한다.
본 발명은 식별 번호: 130의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA를 포함하고, 여기서 N은 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, N은 집합적으로 SERPINA1 유전자에 Cas9를 표적화하는 가이드 서열을 형성한다.
일부 구현예에서, sgRNA는 식별 번호: 5-129 중 어느 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 식별 번호: 5-129의 가이드 서열 중 어느 하나 및 식별 번호: 408의 뉴클레오타이드를 포함하는 sgRNA가 제공된다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 벡터 상에서 인코딩된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 SERPINA1의 양성 가닥에서의 표적 서열에 대해 상보적인 가이드 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 SERPINA1의 음성 가닥에서의 표적 서열에 대해 상보적인 가이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제2 가이드 서열을 더 포함하는 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA로서, 여기서 제1 가이드 서열은 SERPINA1 유전자의 양성 가닥에서의 제1 표적 서열에 대해 상보적이고, 제2 가이드 서열은 SERPINA1 유전자의 음성 가닥에서의 제2 표적 서열에 대해 상보적이다.
본 발명의 가이드 RNA는 변이될 수 있다. 일부 구현예에서, 변이는 2'-0-메틸 (2'-0-Me) 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이는 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이는 2'-플루오로 (2'-F) 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 변이는 역전된 무염기성 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 변이는 5' 말단에서의 최초 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 것이다. 일부 구현예에서, 변이는 3' 말단에서의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 것이다.
일부 구현예에서, 변이는 최초 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 변이는 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함한다. PS-변이된 가이드는 5' 말단에서의 최초 3개의 뉴클레오타이드에서 그리고 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-0-Me 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 식별 번호: 408의 변이된 뉴클레오타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 임의의 기재된 가이드 RNA 및 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 조성물 또는 제형이 제공된다.
일부 구현예에서, 지질 나노입자 (LNP)와 연관된 본원에 기재된 가이드 RNA를 포함하는 조성물이 제공된다.
조성물은 뉴클레아제를 인코딩하는 뉴클레아제 단백질 또는 mRNA를 더 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 뉴클레아제는 Cas이다. 일부 구현예에서, Cas는 Cas9이다. 일부 구현예에서, Cas는 Cpfl이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 닉카아제이다. 일부 구현예에서, 뉴클레아제는 변이된다. 일부 구현예에서, 변이된 뉴클레아제는 핵 국재화 신호 (NLS)을 포함한다.
일부 구현예에서, Cas는 유형-I, 유형-II, 또는 유형- III CRISPR/Cas 시스템으로부터의 것이다.
일부 구현예에서, SERPINA1 유전자 내에서의 이중-가닥 절단 (DSB)의 유도 방법이 제공되며, 이는 본원에 기재된 가이드 RNA 중 임의의 하나 이상, 조성물, 또는 제형을 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, SERPINA1 유전자의 변이 방법이 제공되며, 이는 Cas 단백질 또는 핵산 인코딩된 Cas 단백질, 및 본원에 기재된 가이드 RNA, 조성물, 또는 제형 중 임의의 하나 이상을 전달하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, AATD를 치료하는 방법이 제공되며, 이는 Cas 단백질 또는 핵산 인코딩된 Cas 단백질, 및 본원에 기재된 가이드 RNA, 조성물, 또는 제형 중 임의의 하나 이상을 투여하고, 그것에 의해 AATD를 치료하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 대상체의 간에서의 AAT의 축적을 감소시키거나 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이는 Cas 단백질 또는 핵산 인코딩된 Cas 단백질, 및 본원에 기재된 가이드 RNA, 조성물, 또는 제형 중 임의의 하나 이상을 투여하고, 그것에 의해 간에서의 AAT의 축적을 감소시키는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, ATT는 간 세포에서 감소되거나 또는 예방된다. 일부 구현예에서, 간 세포(liver cell)는 간세포(hepatocyte)이다.
일부 방법 및 용도 구현예에서, 상기 대상체는 AATD를 가진다.
일부 구현예에서, 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)은 SERPINA1 유전자에서의 DSB의 복구 과정에서 돌연변이를 유발한다. 일부 경우에서, NHEJ는 SERPINA1 유전자에서의 DSB의 복구 과정에서 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발한다. 일부 구현예에서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 SERPINA1 유전자에서 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이를 유발한다.
일부 구현예에서, 투여는 알파-1 항트립신 (AAT)의 수준을 감소시킨다. AAT의 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 뇌 척수액, 또는 가래에서 측정될 수 있다. AAT의 수준은 간 조직에서 측정될 수 있다.
일부 방법 및 용도 구현예에서, 상기 대상체는 인간이다. 인간 대상체는 알파-1 항트립신 결핍 (AATD)을 가질 수 있다. 상기 대상체는 AATD의 가족력을 가질 수 있다. 상기 대상체는 AATD의 간 및 폐 증상 모두를 가질 수 있다. 상기 대상체는 유일하게 또는 우세하게 AATD의 간 증상을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 E342K 돌연변이를 갖는 AAT를 발현한다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 적어도 하나의 Z 대립유전자를 가진다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 적어도 하나의 S 대립유전자를 가진다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 Z 대립유전자에 대해 동종접합성이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 Z 대립유전자에 대해 이종접합성이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 하나의 Z 대립유전자 및 하나의 S 대립유전자를 가진다.
상기 대상체는 AAT의 아미노산 서열에서 E342K 돌연변이를 가질 수 있으나, 여전히 감소 수준의 야생형 AAT를 가진다.
일부 구현예에서, 투여 이후, 상기 대상체는 부종, 복수, 또는 황달의 개선, 안정화, 또는 지체, 또는 간 이식의 필요성을 지연을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 투여 이후, 상기 대상체는 투여의 결과로서 이미지형성 방법 또는 간 효소 수준에 의해 측정된 변화의 개선, 안정화, 또는 지체를 가진다.
본원에 기재된 임의의 가이드, 조성물 또는 약제학적 제형은 바이러스 벡터를 통해 투여될 수 있다.
본원에 기재된 임의의 가이드, 조성물 또는 약제학적 제형은 지질 나노입자를 통해 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 상기 대상체는 가이드, 조성물, 또는 제형의 투여 이전에 SERPINA1 유전자에서의 특이적 돌연변이에 대해 시험된다.
일부 구현예에서, AATD를 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 의약의 제조를 위한 본원에 기재된 임의의 가이드, 조성물, 또는 제형의 용도가 포함된다.
이러한 설명 및 예시적인 구현예는 제한적인 것으로 채택되지 않아야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항의 목적을 위해, 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에 사용된 모든 수치 표현된 양, 백분율, 또는 비율이 미리 이와 같이 수정되지 않는 범위에서 용어 "약"에 의해 모든 경우에서 수정되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구항에 제시된 수치적 파라미터는 얻기 위해 추구되는 원하는 특성에 따라 변화될 수 있는 근사값이다. 적어도, 청구항의 범위에 대한 균등론의 적용을 제한하기 위한 시도로서가 아닌, 각각의 대수적 파라미터는 보고된 유효숫자의 수와 관련하여 통상적인 반올림 기법을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구항들에서 사용된 바와 같이, 단수 형태("a," "an," 및 "the,") 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은 하나의 지시대상으로 명시적으로 명백하게 제한하지 않는 한, 복수개의 지시대상을 포함하는 것으로 주지한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는" 및 그것의 문법적 변형어는 목록에서의 항목의 인용이 열거된 항목에 대해 치환되거나 첨가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않도록 비제한적인 것으로 의도되지 않는다.
실시예
하기 실시예는 특정 개시된 구현예를 예시하도록 제공되며, 임의의 방식으로 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 - 물질 및 방법
1. 뉴클레아제 mRNA의 시험관내 전사 ("IVT")
N1-메틸 슈도-U를 함유하는 캡핑된 및 폴리아데닐레이트화된 스트렙토코쿠스 피오제네스 ("Spy") Cas9 mRNA는 선형화된 플라스미드 DNA 템플레이트 및 T7 RNA 중합효소를 사용하는 시험관내 전사에 의해 생성되었다. T7 프로모터 및 100 nt 폴리 (A/T) 영역을 함유하는 플라스미드 DNA는 하기 조건으로 XbaI와 함께 2시간 동안 37℃에서 배양함으로써 선형화되었다: 200 ng/μL 플라스미드, 2 U/μL XbaI (NEB), 및 1x 반응 버퍼. XbaI는 20분 동안 65℃에서 반응물을 가열함으로써 불활성화되었다. 선형화된 플라스미드를 실리카 맥시 스핀 칼럼 (Epoch Life Sciences)을 사용하여 효소 및 버퍼 염으로부터 정제되었고, 아가로스 겔에 의해 분석하여 선형화를 확인하였다. Cas9 변이된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응물을 하기 조건에서 4시간 동안 37℃에서 배향하였다: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; 각각 2 mM의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP (Trilink); 10 mM ARCA (Trilink); 5 U/μL T7 RNA 중합효소 (NEB); 1 U/μL 쥣과 RNase 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 E. 콜리 파이로포스파타제 (NEB); 및 lx 반응 버퍼. 4-시간 배양 이후, TURBO DNase (ThermoFisher)을 0.01 U/μL의 최종 농도로 첨가하였고, 반응물을 추가의 30분 동안 배양하여 DNA 템플레이트를 제거하였다. Cas9 mRNA를 제조자의 프로토콜 (ThermoFisher)에 따라 메가클리어 트랜스크립션 클린-업 키트(MegaClear Transcription Clean-up kit)를 사용하여 효소 및 뉴클레오타이드로부터 정제하였다. 전사체 농도를 260 nm에서 흡광도를 측정하여 결정하였고 (Nanodrop), 및 전사체를 바이오애널라이저(Bioanlayzer) (Agilent)에 의해 모세관 전기영동에 의해 분석하였다.
실시예 2 및 3에 기재된 실험을 위해, 식별 번호:422를 포함하는 플라스미드 DNA 템플레이트를 사용하여 IVT Cas9 mRNA를 생성하였다. 실시예 4 및 5에 기재된 실험을 위해, 식별 번호: 423을 포함하는 플라스미드 DNA 템플레이트를 사용하여 IVT Cas9 mRNA를 생성하였다.
실시예 2 및 3에 사용된 IVT mRNA를 생성하기 위해 사용된 DNA 서열 (식별 번호: 422):
Figure pct00016
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
실시예 4 및 5에 사용된 IVT mRNA를 생성하기 위해 사용된 DNA 서열 (식별 번호: 423):
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
Figure pct00023
2. 사이노몰구스 상동성 가이드 디자인과의 인간 SERPINA1 가이드 디자인 및 인간 SERPINA1
초기 가이드 선택을 관심대상의 영역에서 PAM을 확인하기 위해 인간 참조 게놈 (예를 들어, hg38) 및 관심대상의 사용자 정의된 게놈 영역을 사용하여 인실리코에서 수행하였다. 각각의 확인된 PAM에 대해 분석을 수행하고, 통계를 기록하였다. gRNA 분자는 추가로 선택되어, 다수의 당업계에 알려진 기준 (예를 들어, GC 함량, 표적 활성에 기초함, 및 잠재적 비표적 활성)에 기초하여 순위-정렬된다.
총 88개의 가이드 RNA는 엑손 2 및 3 내의 단백질 코딩 영역을 표적화하는 SERPINA1 (ENSG00000197249.13)에 대해 설계되었다. 이러한 88개의 가이드에 추가 4개의 대조군 가이드 (복제)를 96 웰 형태에 배치되었다. 병행하여, 사이노몰구스 원숭이와 100% 상동성인 SERPINA1의 엑손 2 내지 5와 추가의 4개의 대조군 가이드 (복제)를 표적화하는 51개의 가이드 RNA를 96 웰 형태에 배치되었다. 가이드 RNA에서의 가이드 서열 및 상응하는 게놈 좌표는 하기에 제공된다 (표 1).
3. 시험관내 Cas9 mRNA 및 가이드 RNA 전달
Spy Cas9 ("HEK293_Cas9")을 구성적으로 발현하는 인간 배아 신장 선암종 세포주 HEK293을 10% 우태 혈청 및 500 μg/mL G418이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포는 형질감염 (형질감염의 시점에 ~70% 융합성)의 20시간 전에 96-웰 플레이트에서 10,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150)로 세포를 형질감염되었다. 별개의 crRNA (25 nM), trRNA (25 nM), 리포펙타민 RNAiMAX (0.3 μL/웰) 및 OptiMem을 함유하는 리포플렉스로 세포를 형질감염시켰다.
인간 간세포 암종 세포주 HUH7 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, Cat. JCRB0403)를 10% 우태 혈청이 보충된 DMEM 배지에 배양하였다. 세포는 형질감염 (형질감염의 시점에 ~70% 융합성)의 20시간 전에 96-웰 플레이트에서 15,000 세포/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 세포는 제조자의 프로토콜에 따라 리포펙타민 MessengerMAX (ThermoFisher, Cat. LMRNA003)로 형질감염되었다. Spy Cas9 mRNA (100 ng), MessengerMAX (0.3 μL/웰) 및 OptiMem을 함유하는 리포플렉스 이후 별개의 crRNA (25 nM), 추적자 RNA (25 nM), MessengerMAX (0.3 μL/웰) 및 OptiMem을 함유하는 리포플렉스로 세포를 순차적으로 형질감염시켰다.
원발성 인간 간 간세포 (PHH) (Gibco, Lot# Hu8249)을 제조자의 프로토콜 (Invitrogen, 프로토콜 11.28.2012)에 따라 배양하였다. 간단히 말해서, 세포를 해동하였고, 보충물 (Gibco, Cat. CM7500)을 가진 간세포 해동 배지에 재현탁시켰고, 이후 원심분리하였다. 상청액을 폐기하였고, 펠릿화된 세포를 보충물 팩 (Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM3000)이 추가된 간세포 플레이팅 배지에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, 33,000 세포/웰의 밀도로 바이오-코트 콜라겐 I가 코팅된 96-웰 플레이트 (ThermoFisher, Cat. 877272) 상에 플레이팅하였다. 플레이팅된 세포를 침강시켰고, 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 조직 배양 인큐베이터에서 5시간 동안 부착되었다. 인큐베이션 세포를 단일층 형성에 대해 확인한 이후, 무혈청 보충물 팩 (Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM4000)을 가진 간세포 배양 배지로 1회 세정하였다. 병행하여, 별개의 crRNA 및 trRNA를 동등량의 시약을 혼합하여 예비-어닐링시켰고, 2분 동안 95℃에서 배양하였고, 실온으로 냉각시켰다. 예비-어닐링된 crRNA 및 trRNA로 이루어진 이중 가이드 (dgRNA)를 Spy Cas9 단백질로 배양하여 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 세포를 리포펙타민 RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150)로 형질감염시켰다. Spy Cas9 (10nM), 별개의 crRNA (10 nM), 추적자 RNA (10 nM), 리포펙타민 RNAiMAX (1.0 μL/웰) 및 OptiMem을 함유하는 RNP로 세포를 형질감염시켰다.
인간 간세포 암종 세포주 HepG2 (미국 종균 협회, Cat. HB-8065)을 10% 우태 혈청이 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 세포를 계수하고, 실시예 4에 추가로 기재된 LNP로의 배양하기 24시간 전에 96-웰 플레이트에서 15,000 세포/웰의 밀도로 바이오-코트 콜라겐 I가 코팅된 96-웰 플레이트 (ThermoFisher, Cat. 877272) 상에 플레이팅하였다.
4. 게놈 DNA 단리
HEK293_Cas9, HUH7 및 PHH 형질감염된 세포를 24 또는 48 시간 시점에 형질감염후 수확하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 50 μL/웰 BuccalAmp DNA 추출 용액 (Epicentre, Cat. QE09050)을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰로부터 gDNA를 추출하였다. 모든 DNA 샘플을 본원에 기재된 바와 같이 PCR 및 후속적인 NGS 분석에 가하였다.
5. 차세대 서열분석 ("NGS") 및 표적 분리 효율에 대한 분석
게놈 중의 표적 위치에서의 편집의 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 심화 서열분석을 이용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 결실의 존재를 확인하였다.
PCR 프라이머는 관심대상의 유전자 (예를 들어 SERPINA1) 내의 표적 부위 주변에 설계되었고, 관심대상의 게놈 면적을 증폭시켰다. 프라이머 서열은 표 3에 제공되어 있다.
[표 3] SERPINA1 표적화된 및 대조군 crRNA에 대한 서열분석 프라이머
Figure pct00024
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
Figure pct00028
Figure pct00029
서열분석을 위한 화학을 부가하기 위해 제조자의 프로토콜 (Ulumina)에 따라 추가의 PCR을 수행하였다. 앰플리콘을 Illumina MiSeq 기기 상에 서열화하였다. 낮은 품질 평점을 갖는 것을 제거한 이후 인간 참조 게놈 (예를 들어, hg38)에 대해 판독을 정렬하였다. 판독을 함유하는 생성된 파일을 참조 게놈 (BAM 파일)에 대해 맵핑되고, 여기서 관심대상의 표적 영역이 중복된 판독은 선택되어, 야생형 판독의 수 대 삽입, 치환, 또는 결실이 함유된 판독의 수를 계산하였다.
편집 백분율 (예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 백분율")은 야생형을 포함하는 서열 판독의 총수에 대한 삽입/결실 ("인델") 또는 치환을 가진 서열 판독의 총수로서 정의된다.
6. 알파-1 항트립신 ("AAT") ELISA
간세포 암종 세포주, HUH7은 표 1로부터의 선택된 가이드와 함께 상술된 바와 같이 형질감염되었다. 형질감염후 6일차에 세포를 PBS로 1회 세정하였고, 10% FBS를 갖는 200 μL의 표준 DMEM 배지로 이후 대체하였다. 4시간 이후, 배지를 수확하였고, -20℃에서 저장하였다. 셀타이터-글로 ("CTG") 검정 (Promega, Cat. G7570)을 제조자의 프로토콜에 따라 부착 세포 상에서 완료하였다. 총 AAT 수준을 AAT ELISA 키트 (R & D 시스템, Cat. DY1268)를 사용하여 결정하였다. 키트 시약 및 표준을 제조자의 프로토콜에 따라 제조하였다. ELISA를 실시하기 이전에, 냉동된 배지를 실온에서 해동시키고, 1분 동안 1000 rpm으로 원심분리하여 잔해를 펠릿화하고 이후 얼음 상에 배치하였다. ELISA의 경우, 30 μL의 배지는 70 μL의 lx 검정 희석제로 희석하였다. ELISA 절차를 제조자의 프로토콜에 따라 완료하였다. 플레이트를 SpectraMax M5 플레이트 리더 상에서 판독하였다. AAT 수준을 표준 곡선의 4개의 파라미터 로지스틱 곡선 핏트를 사용하는 SoftMax Pro 소프트웨어 ver. 6.4.2에 의해 계산하였다. 각각의 웰에 대한 세포수는 CTG 검정으로부터 수득된 값에 기초한 플레이트 평균에 대한 비교하여 추정하였다. 최종 AAT 수준 (pg/ml)을 세포수에 대해 조정하였다.
7. 웨스턴 블랏에 의한 AAT 단백질 분석
간세포 암종 세포주, HUH7은 표 1로부터의 선택된 가이드와 함께 이전에 기술된 바와 같이 형질감염되었다. 형질감염후 6일차에, 배지를 제거하였고, 완전한 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma, Cat. 1 1697498001), 1 mM DTT, 및 250 U/ml 벤조나제 (EMD Millipore, Cat. 71206-3)로 이루어진 새롭게 첨가된 프로테아제 억제제 혼합물이 첨가된 50 μL/웰 RIPA 버퍼 (Boston Bio Products, Cat. BP-1 15)에 세포를 용해시켰다. 세포를 30분 동안 얼음 상에서 유지하였고, 이 시점에 NaCl (1 M 최종 농도)이 첨가되었다. 세포 용해물을 철저하게 혼합하였고, 30분 동안 얼음 상에서 유지하였다. 전체의 세포 추출물 ("WCE")을 PCR 플레이트로 수송하였고, 펠릿 잔해로 원심분리하였다. 브라드포드 검정 (Bio-Rad, Cat. 500-0001)을 사용하여 용해물의 단백질 함량을 평가하였다. 브라드포드 검정 절차를 제조자의 프로토콜에 따라 완료하였다. 추출물을 사용하기 이전에 -20℃에서 저장하였다. 웨스턴 블랏을 수행하여 AAT 단백질 수준을 평가하였다. 용해물을 Laemmli 버퍼와 혼합하였고, 10분 동안 95℃에서 변성시켰다. 웨스턴 블랏을 제조자의 프로토콜에 따라 4-12% 비스-트리스 겔 (ThermoFisher) 상의 NuPage 시스템을 사용하여 실시하였고, 이후 0.45 μm 니트로셀룰로오스 막 (Bio-Rad, Cat. 1620115) 상으로 습윤 수송되었다. 수송막을 물로 철저하게 세정하였고, Ponceau S 용액 (Boston Bio 생성물, Cat. ST-180)으로 염색하여 완정하게 일정한 수송을 확인하였다. 블랏을 랩 로커(lab rocker) 상에서 실온에서 30분 동안 TBS 중의 5% 건조 밀크를 사용하여 차단하였다. 블랏을 TBST로 세정하였고, TBST 중의 1:1000로의 토끼 α-AAT 다클론성 항체 (Sigma, Cat. HPA001292)로 탐색되었다. GAPDH를 TBST 중의 1:2500로 장입 대조군 (ThermoFisher, Cat. NB600502)으로서 사용하였고, AAT 일차 항체와 동시에 배양하였다. 블랏을 백에 밀봉하였고, 랩 로커 상에서 4℃에서 밤새 유지하였다. 배양 이후, 블랏을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 세정하였고, 각각 TBST 중의 1:25,000로의 마우스 및 토끼에 대한 이차 항체 (ThermoFisher, Cat. PI35518 및 PISA535571)을 실온에서 30분 동안 탐색하였다. 배양 이후, 블랏을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 세정하였고, PBS로 2회 세정하였다. 블랏을 시각화하였고, Licor Odyssey 시스템을 사용하여 분석하였다.
8. 지질 나노입자 (LNP) 제형
LNP는 4.5의 N:P 비 (아민 대 RNA 포스페이트) (N:P)로 제형화하였다. 지질 나노입자 성분을 하기 몰비를 갖는 100% 에탄올에 용해시켰다: 45 mol-% 양이온성 지질 (지질 A); 44 mol-% 콜레스테롤; 9 mol-% DSPC; 및 2 mol-% PEG2k-DMG. RNA 카고 (1:1 mRNA:sgRNA (wt/wt))를 pH 4.5로의 25Mm 아세트산나트륨 버퍼에 용해시켜, 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카고의 농도를 야기하였다. 제조자의 프로토콜에 따라 Precision Nanosystems NanoAssemblrTM Benchtop 기기를 사용하여 지질 및 RNA 용액의 미세유체 혼합에 의해 LNP를 형성하였다. 3:1의 비로 물에서 LNP를 수집하였다. LNP를 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 나머지 버퍼를 10 kDa Slide-a-LyzerTM G2 투석 카셋트 (ThermoFisher Scientific)을 사용하여 온건한 교반 하에 4℃에서 밤새 pH 7.5에서 (샘플 용적의 100-배 과량으로) 50mM 트리스에서 교환하였다. 다음날, LNP를 (4C에서 4000g으로) Amicon 필터를 사용하여 2배의 원하는 농도로 농축하였다. 이를 이후 2X TSS (50mM 트리스, 90mM 염화나트륨, 10% w/v 수크로스, pH 7.5)와 함께 1:1로 혼합하였다. 수득한 혼합물을 이후 0.2 μM 필터를 사용하여 여과하였다. 생성된 여과물을 2-8℃에서 저장하였다.
실시예 2 - 스크리닝 및 가이드 조건
1. 복수개의 세포 유형에서의 SERPINA1 가이드의 교차 스크리닝
인간 SERPINA1을 표적화한 가이드 및 사이노몰구스 원숭이에서 상동성을 갖는 것을 실시예 1에 기재된 바와 같이 HEK293_Cas9 및 HUH7 세포주뿐만 아니라 원발성 인간 간세포로 형질감염시켰다. 편집 백분율을 각각의 세포 유형에 걸쳐 각각의 가이드 서열을 포함하는 crRNA에 대해 결정하였고, 가이드 서열은 이후 최고 % 편집에 기초하여 순위-정렬하였다. 모든 3개의 세포주에서의 표 1의 가이드 서열에 대한 스크리닝 데이터는 하기에 열거되어 있다 (표 4, 5, 및 6).
표 4는 SERPINA1 및 인간 신장 선암종 세포주, HEK293_Cas9 (이는 구성적으로 Spy Cas9 단백질을 과발현함)에서의 대조군 crRNA에 대한 %편집, %삽입 (Ins), 및 %결실 (Del)의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
[표 4] HEK293_Cas9 세포에서 발현된 crRNA에 대한 SERPINA1 편집 데이터
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
Figure pct00034
Figure pct00035
표 5는 시험된 SERPINA1 및 인간 간세포 선압종 세포주, HUH7에서의 Spy Cas9 mRNA로 공동-형질감염된 대조군 crRNA에 대한 %편집, %삽입 (Ins), 및 %결실 (Del)의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
[표 5] HUH7 세포에서 발현된 crRNA에 대한 SERPINA1 편집 데이터
Figure pct00036
Figure pct00037
Figure pct00038
Figure pct00039
Figure pct00040
Figure pct00041
표 6은 시험된 SERPINA1 및 원발성 인간 간세포에서의 Spy Cas9 단백질로 공동-형질감염된 대조군 crRNA에 대한 %편집, %삽입 (Ins), 및 %결실 (Del)의 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
[표 6] 원발성 인간 간세포에서 발현된 crRNA에 대한 SERPINA1 편집 데이터
Figure pct00042
Figure pct00043
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
각각의 세포주로부터의 선택된 가이드 서열을 사용하여 추가의 분석에 대한 30개의 crRNA의 패널을 생성하였다 (표 7). 엑손 2-5에 대한 선택된 SERPINA1 가이드의 염색체 위치가 중첩되는 개략도가 도 1에 제시되어 있다. 편집 백분율 및 AAT 분비 수준은 도 2에 나타나 있다.
[표 7] HUH7 세포에서의 SERPINA1을 표적화하는 crRNA에 대한 ELISA 및 웨스턴 블랏 (WB) 데이터
Figure pct00048
Figure pct00049
2. SERPINA1 가이드의 비표적 분석
올리고 삽입 기반 검정 (예를 들어, 문헌 [Tsai et al., Nature Biotechnology 33, 187-197; 2015] 참조)을 사용하여 SERPINA1을 표적화하는 Cas9에 의해 절단된 잠재적 비표적 게놈 부위를 결정한다. 표 7에서의 30개의 가이드 (및 알려진 비표적 프로파일을 갖는 2개의 대조군 가이드)를 상기 기재된 바와 같이 HEK293-Cas9 세포에서 스크리닝되었고, 비표적 결과는 도 3에 플롯팅되어 있다. 상기 검정은 일부 crRNA에 대한 잠재적 비표적 부위를 확인하였고, 검출가능한 비표적을 가지지 않는 다른 것을 확인하였다.
실시예 3. 표현형 분석
1. 분비된 알파-1 항트립신의 ELISA 분석
간세포 암종 세포주, HUH7은 표 1로부터의 가이드를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 4회로 형질감염시켰다. 형질감염후 2일차에, 하나의 복제물은 게놈 DNA에 대해 수확되었고, NGS 서열분석에 의해 분석하였다. 대조군 가이드를 포함하는 모든 가이드는 70%초과의 편집 백분율을 가졌고, 일부 가이드는 95%에 도달하였다. 형질감염후 6일차에, 하나의 복제물은 상기 기재된 바와 같이 ELISA에 의해 분비된 AAT의 분석을 위한 배지 수확을 위해 준비하였다. 모든 AAT crRNA은 대조군 가이드와 비교하는 경우에 5 내지 10배까지 배지에 분비된 AAT의 수준을 감소시켰다. 세포외 AAT의 감소 및 각각의 가이드에 대한 %편집에 대한 데이터가 표 7에 제공되어 있다.
2. 세포내 알파-1 항트립신의 웨스턴 분석
간세포 암종 세포주, HUH7을 표 1로부터의 가이드를 포함하는 crRNA를 사용하여 실시예 1에 기재된 바와 같이 형질감염시켰다. 세포의 형질감염된 집단을 조직 배양에서 유지시켰고, 추가의 분석을 위해 계대배양시켰다. 형질감염후 11일차에, 세포를 수확하였고, 전체 세포 추출물 (WCE)을 준비하였고, 상기 기재된 바와 같이 웨스턴 블랏에 의한 분석에 가해졌다.
세포가 계대배양됨에 따라, 샘플을 수집하였고, 본원에 기재된 바와 같이 NGS 서열분석을 위해 처리하였다. 2, 23, 32 및 40일차로부터의 선택된 샘플을 시간에 따라 %편집에 대해 비교하였다 (표 8). 이러한 결과는 HUH7 세포 성장과 관련된 AAT 편집과 연관된 증식성 변화가 존재하지 않음을 시사한다.
[표 8] HUH7 세포에서의 %편집의 시간 경과
Figure pct00050
WCE는 AAT 단백질의 감소에 대해 웨스턴 블랏에 의해 분석하였다. 전장 AAT 단백질은 418개의 아미노산을 가졌고, 한편 단백질은 분비되기 이전에 중질 당화된다. 비-당화된 AAT는 46 kD의 예상된 분자량을 가졌고, 이러한 분자량에서의 밴드는 다양한 AAT 단백질 종에 상응하는 52 및 56 kD에서의 밴드와 함께 웨스턴 블랏에서 대조군 레인에서 관측되었다 (도 4).
AAT 단백질의 감소 백분율은 Licor Odyssey Image Studio Ver 5.2 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. GAPDH는 장입 대조군으로서 사용되었고, AAT와 동시에 탐색되었다. AAT에 대한 모든 3개의 밴드를 포괄하는 총 영역과 비교되는 각 샘플 내의 GAPDH에 대한 밀도 측정값에 대해 비율을 계산하였다. AAT 단백질의 감소 백분율은 상기 비율이 대조군 레인에 대해 정규화된 이후에 결정되었다. 결과는 표 7에 나타나 있다.
3. 선택된 가이드에 대한 통합된 시험관내 데이터
개개의 가이드에 대한 집중된 데이터 패키지는 본원에 기재된 데이터를 분석함으로써 생성되었다. 선도 후보들을 특성규명하였고, 분비된 AAT의 감소 (ELISA), 총 AAT 단백질의 감소 대 이질적인 밴드의 생산 (웨스턴 블랏), 및 비표적 분석의 비교를 통해 순위정렬하였다. 사이노몰구스 원숭이에 대한 서열에서의 임의의 불일치 (mm)를 포함하는 상동성이 또한 나타나 있다. 도 5 내지 10을 참조한다.
실시예 4. 원발성 인간 간세포 (PHH) 및 HepG2 세포로의 지질 나노입자 (LNP) 전달
인간 SERPINA1을 표적화하는 Cas9 mRNA 및 변이된 sgRNA의 지질 나노입자 제형은 용량 반응 곡선에서의 PHH 및 HepG2 세포에 대해 시험하였다. PHH 및 HepG2 세포는 실시예 1 (33,000/웰에 대조적으로 15,000 PHH 세포/웰의 경우)에 기재된 바와 같이 플레이팅되었다. 세포는 LNP로의 처리 이전에 24시간 동안 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 실험에서 사용된 LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되었고, 이는 각각 도 11 및 12에 명시된 sgRNA 및 Cas9 mRNA를 함유하였다. LNP는 5분 동안 37℃에서 6% 시노(cyno) 혈청을 함유하는 간세포 유지 배지에서 배양하였다. 배양후 LNP는 100 ng mRNA에서 시작하는 8 포인트 2배 용량 반응 곡선에서 세포 상에 첨가하였다. 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위해 처리후 72시점에 용해되었다. 두 세포 유형에서의 가이드 서열에 대한 용량 반응 곡선 데이터는 도 11 및 12에 나타나 있다. 데이터는 제형이 두 HepG2 세포뿐만 아니라 원발성 인간 간세포 (이는 생체내 인간에서의 세포 표적인 것으로 의도됨)를 편집하기 위해 효과적인 것을 나타낸다.
실시예 5. 지질 나노입자 (LNP) 전달 및 생체내 인간 PiZ 변이체의 편집
실시예 4에서 시험된 6개의 LNP 제형 중 5개 및 쥣과 TTR 유전자를 표적화하는 sgRNA를 포함하는 대조군 LNP는 인간 PiZ 변이체의 복제가 잠복된 형질전환 마우스로 투여하였다. PiZ 형질전환 마우스는 앞서 기재되어 있고 (예를 들어, 문헌 [Carlson JA, Rogers BB, Sifers RN, et al. Accumulation of PiZ alpha 1-antitrypsin causes liver damage in transgenic mice. J Clin Invest 1989;83: 1183―1190]을 참조한다), 콘카터머 (데이터를 나타내지 않음)에 대한 이종접합성 마우스로 인간 PiZ 변이체의 7-8개의 콘카터머화된 복제를 수송하는 것으로 여겨진다.
15-39 주령의 범위의 PiZ 마우스 (숫컷 및 암컷의 혼합)를 본 연구에서 사용하였다. 동물 (각 그룹에 대해 n=5) 마다 0.2 mL의 용적에서 4 mg/kg (4 mg의 총 RNA 함량/kg)의 용량으로 측면 꼬리 정맥을 통해 LNP를 투약하혔다. 동물을 LNP의 투여후 2주차에 안락사시켰다. 혈액을 LNP 투여 이전에 그리고 검시시에 혈청 분석을 위해 수집하였다. 단백질 및 DNA 추출 이어서 단백질 정량화 (각각 PiZ 단백질의 조직 수준 및 혈청에 대한 ELISA 및 웨스턴 블랏 분석) 및 실시예 1에 기재된 시약 및 방법을 사용한 NGS 분석을 위해 검시시 각 동물로부터 간 조직을 수집하였다. 표 9는 하기에 시험된 각각의 LNP에서 제형화된 sgRNA를 나타낸다.
[표 9]
Figure pct00051
G000282 (* = PS 연결; 'm' = 2'-0-Me 뉴클레오타이드):
Figure pct00052
(식별 번호:424)
도 13a에 나타난 바와 같이, SERPINA1 (또는 쥣과 대조군과 관련된 TTR)의 PiZ 변이체의 강력한 편집을 각 그룹에 대해 검출하였고, 한편 비히클 대조군 (TSS = 트리스/염화나트륨/수크로스 버퍼)에서 편집이 검출되지 않았다. 또한, 실험 그룹에서의 일부 동물에서 편집이 검출되지 않았고, 후속 유전형분석 분석 (데이터를 나타내지 않음)은 이러한 동물이 PiZ 이식유전자에 대해 음성적이고, 이에 따라 검출가능한 편집, PiZ 단백질 발현, 또는 혈청으로의 PiZ 분비의 녹다운을 생성할 것으로 예상되지 않았다. 이는 단백질 발현 분석 (ELISA 및 웨스턴 블랏; 도 13b 및 13c를 참조함)에 의해 추가로 확인되었다.
추가로, PiZ 변이체의 편집은 처리된 마우스에서의 혈청 수준에서의 녹다운과 상관되었다. 게다가, 편집은 또한 웨스턴 블랏 (도 13c)에서 나타난 바와 같이 간 조직에서의 PiZ 단백질의 녹다운과 상관되었다. 이러한 데이터는 제형이 생체내 인간 PiZ 대립유전자의 발현 및 분비를 녹다운시키는데 효과적임을 실증한다.
SEQUENCE LISTING <110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC. ODATE, Shobu STRAPPS, Walter LESCARBEAU, Reynald <120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR TREATING ALPHA-1 ANTITRYPSIN DEFICIENCY <130> 01155-0005-00PCT <150> US 62/438,219 <151> 2016-12-22 <160> 424 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 gccagacucc aaguucugcc 20 <210> 2 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 uaaggccagu ggaaagaauu 20 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 3 ggcagcgagg aguccacagu 20 <210> 4 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 4 ucuuuccacu ggccuuaacc 20 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 5 caaugccguc uucugucucg 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 6 aaugccgucu ucugucucgu 20 <210> 7 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 7 augccgucuu cugucucgug 20 <210> 8 <211> 20 <212> 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tcgagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 4560 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 4615 <210> 424 <211> 100 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 424 uuacagccac gucuacagca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60 cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100

Claims (243)

  1. 세포에 조성물을 전달하는 것을 포함하는 SERPINA1 유전자 내에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는 방법으로서, 상기 조성물은 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
  2. 세포에 조성물을 전달하는 것을 포함하는 SERPINA1 유전자를 변이시키는 방법으로서, 상기 조성물은 (i) RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 및 (ii) 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
  3. 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하고, 이에 의해 AATD를 치료하는 것을 포함하는 알파-1 항트립신 결핍 (AATD)을 치료하는 방법으로서, 상기 조성물은 (i) RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 및 (ii) 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
  4. 조성물을 그것을 필요로 하는 대상체에게 투여하고, 이에 의해 간에서의 AAT의 축적을 감소시키는 것을 포함하는 대상체의 간에서 알파-1 항트립신 (AAT)의 축적을 감소시키거나 또는 예방하는 방법으로서, 상기 조성물은 (i) RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산 및 (ii) 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 방법.
  5. 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA를 포함하는 조성물.
  6. 가이드 RNA를 인코딩한 벡터를 포함하는 조성물로서, 상기 가이드 RNA는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열 또는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 조성물.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 세포 또는 대상체에서의 SERPINA1 유전자 내에서 이중-가닥 절단 (DSB)을 유도하는데 사용하기 위한 조성물.
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서, 세포 또는 대상체에서의 SERPINA1 유전자를 변이시키는데 사용하기 위한 조성물.
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서, 대상체에서 알파-1 항트립신 결핍 (AATD)을 치료하는데 사용하기 위한 조성물.
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서, 대상체에서 AAT 혈청 또는 간 농도를 감소시키는데 사용하기 위한 조성물.
  11. 제5항 또는 제6항에 있어서, 대상체의 간에서의 알파-1 항트립신 (AAT)의축적을 감소시키거나 또는 예방하는데 사용하기 위한 조성물.
  12. 제1항 내지 제4항 또는 제5항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 혈청 및/또는 간 AAT 수준을 감소시키는, 방법 또는 사용하기 위한 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 혈청 및/또는 간 AAT 수준이 조성물을 투여하기 이전의 혈청 및/또는 AAT 수준과 비교하여 적어도 40%까지 감소되는 방법 또는 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 혈청 및/또는 AAT 수준이 조성물의 투여 이전에 혈청 및/또는 AAT 수준과 비교하여 40-50%, 50-60%, 60-70%, 70-80%, 80-90%, 90-95%, 95-98%, 98-99%, 또는 99-100%까지 감소되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  15. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 SERPINA1 유전자의 편집을 야기하는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 편집이 편집되는 집단의 백분율 (편집 백분율)로서 계산되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 편집 백분율이 30 내지 99%인, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  18. 제17항에 있어서, 상기 편집 백분율이 30 내지 35%, 35 내지 40%, 40 내지 45%, 45 내지 50%, 50 내지 55%, 55 내지 60%, 60 내지 65%, 65 내지 70%, 70 내지 75%, 75 내지 80%, 80 내지 85%, 85 내지 90%, 90 내지 95%, 또는 95 내지 99%인, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  19. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 2배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 3배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 조성물이 적어도 4배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 조성물이 최대 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10배로 투여되거나 또는 전달되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 또는 전달이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 일의 간격으로 실시되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  24. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 또는 전달이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 주의 간격으로 실시되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  25. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 투여 또는 전달이 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15 개월의 간격으로 실시되는, 사용을 위한 방법 또는 조성물.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열이 식별 번호: 5-129로부터 선택되는 방법 또는 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 인간 SERPINA1 유전자에 존재하는 표적 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 방법 또는 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2, 3, 4, 또는 5에 존재하는 방법 또는 조성물.
  29. 제27항에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 2에 존재하는 방법 또는 조성물.
  30. 제27항에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 3에 존재하는 방법 또는 조성물.
  31. 제27항에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 4에 존재하는 방법 또는 조성물.
  32. 제27항에 있어서, 상기 표적 서열이 인간 SERPINA1 유전자의 엑손 5에 존재하는 방법 또는 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열이 SERPINA1의 양성 가닥에서의 표적 서열에 상보적인 방법 또는 조성물.
  34. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열이 SERPINA1의 음성 가닥에서의 표적 서열에 상보적인 방법 또는 조성물.
  35. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 가이드 서열을 더 포함하며, 여기서 제1 가이드 서열이 SERPINA1 유전자의 양성 가닥에서의 제1 표적 서열에 상보적이고, 제2 가이드 서열이 SERPINA1 유전자의 음성 가닥에서의 제2 표적 서열에 상보적인 방법 또는 조성물.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 가이드 서열을 포함하고, 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 서열을 더 포함하는 crRNA를 포함하고, 여기서 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드는 그것의 3' 말단에서의 가이드 서열에 후속되는 방법 또는 조성물.
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 이중 가이드 (dgRNA)인 방법 또는 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 상기 이중 가이드 RNA는 그것의 3' 말단에서의 가이드 서열에 후속되는 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 crRNA, 및 trRNA를 포함하는 방법 또는 조성물.
  39. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 단일 가이드 (sgRNA)인 방법 또는 조성물.
  40. 제39항에 있어서, sgRNA가 식별 번호: 130의 변이를 갖는 가이드 서열을 포함하는 방법 또는 조성물.
  41. 제39항에 있어서, sgRNA가 식별 번호: 130을 포함하는 방법 또는 조성물.
  42. 제40항 또는 제41항에 있어서,식별 번호: 130에서의 각각의 N이 임의의 천연 또는 비-천연 뉴클레오타이드이고, 상기 N은 가이드 서열을 형성하고, 가이드 서열은 RNA-유도된 DNA 결합제를 SERPINA1 유전자에 대해 표적화하는 방법 또는 조성물.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, sgRNA는 식별 번호: 5- 129의 가이드 서열 및 식별 번호: 140의 뉴클레오타이드 중 어느 하나를 포함하는 방법 또는 조성물.
  44. 제39항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, sgRNA는 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 방법 또는 조성물.
  45. 제42항에 있어서, 식별 번호: 130에서의 각각의 N은 집합적으로 식별 번호: 5-129로부터 선택된 가이드 서열로 대체되는 방법 또는 조성물.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA가 적어도 하나의 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 2'-0-메틸 (2'-0-Me) 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
  48. 제46항 또는 제47항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 뉴클레오타이드 사이의 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함하는 방법 또는 조성물.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 2'-플루오로 (2'-F) 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 5' 말단에서의 최초 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
  51. 제46항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 3' 말단에서의 마지막 5개의 뉴클레오타이드 중 하나 이상에서의 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
  52. 제46항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 최초 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함하는 방법 또는 조성물.
  53. 제46항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 마지막 4개의 뉴클레오타이드 사이의 PS 결합을 포함하는 방법 또는 조성물.
  54. 제46항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 5' 말단에서의 최초 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-0-Me 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
  55. 제46항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변이는 3' 말단에서의 마지막 3개의 뉴클레오타이드에서 2'-0-Me 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
  56. 제46항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 식별 번호: 130의 변이된 뉴클레오타이드를 포함하는 방법 또는 조성물.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA 및 선택적으로 RNA-유도된 DNA 결합제 또는 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 핵산이 지질 나노입자 (LNP)와 연관되는 방법 또는 조성물.
  59. 제58항에 있어서, 상기 LNP가 CCD 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
  60. 제59항에 있어서, 상기 CCD 지질이 지질 A인 방법 또는 조성물.
  61. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 중성 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
  62. 제61항에 있어서, 상기 중성 지질이 DSPC인 방법 또는 조성물.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 헬퍼 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
  64. 제63항에 있어서, 상기 헬퍼 지질이 콜레스테롤인 방법 또는 조성물.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP가 스텔스 지질을 포함하는 방법 또는 조성물.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스텔스 지질이 PEG2k-DMG인 방법 또는 조성물.
  67. 제1항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 RNA-유도된 DNA 결합제를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
  68. 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 RNA-유도된 DNA 결합제를 인코딩한 mRNA를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
  69. 제67항 또는 제68항에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 Cas 클리비지인 방법 또는 조성물.
  70. 제69항에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 Cas9인 방법 또는 조성물.
  71. 제67항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 변이된 것인 방법 또는 조성물.
  72. 제67항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제가 닉카아제인 방법 또는 조성물.
  73. 제71항 또는 제72항에 있어서, 상기 변이된 RNA-유도된 DNA 결합제는 핵 국재화 신호 (NLS)를 포함하는 방법 또는 조성물.
  74. 제67항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RNA-유도된 DNA 결합제는 유형-II CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas인 방법 또는 조성물.
  75. 제1항 내지 제74항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이고, 약제학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는 방법 또는 조성물.
  76. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 간에서의 알파-1 항트립신 (AAT)의 축적을 감소하거나 또는 예방하는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  77. 제76항에 있어서, AAT는 기형된 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  78. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제77항 중 어느 한 항에 있어서, 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)은 SERPINA1 유전자에서의 DSB의 복구 과정에서 돌연변이를 유발하는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  79. 제78항에 있어서, 상기 NHEJ는 SERPINA1 유전자에서의 DSB의 복구 과정에서 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입을 유발시키는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  80. 제79항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 SERPINA1 유전자에서의 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도하는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  81. 제80항에 있어서, 상기 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 적어도 50%의 SERPINA1 유전자에서 유도되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  82. 제81항에 있어서, 상기 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이는 간 세포의 50%-60%, 60%-70%, 70% 또는 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, 또는 99%-100%의 SERPINA1 유전자에서 유도되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  83. 제79항 내지 제82항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 비표적 부위에서 보다 적어도 50-배 이상으로 SERPINA1 유전자에서 일어나는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  84. 제83항에 있어서, 뉴클레오타이드(들)의 결실 또는 삽입은 비표적 부위에서 보다 50-배 내지 150-배, 150-배 내지 500-배, 500-배 내지 1500-배, 1500-배 내지 5000-배, 5000-배 내지 15000-배, 15000-배 내지 30000-배, 또는 30000-배 내지 60000-배 초과로 SERPINA1 유전자에서 일어나는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  85. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제84항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물을 투여하는 것은 대상체에게 AAT의 수준을 감소시키는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  86. 제85항에 있어서, 상기 AAT의 수준은 적어도 40%까지 감소되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  87. 제86항에 있어서, 상기 AAT의 수준은 40-50%, 50%-60%, 60%-70%, 70% 또는 80%, 80%-90%, 90-95%, 95%-99%, 또는 99%-100%까지 감소되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  88. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 AAT의 수준은 혈청, 혈장, 혈액, 뇌 척수액, 또는 가래에서 측정되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  89. 제86항 또는 제87항에 있어서, 상기 AAT의 수준은 간 및/또는 혈청에서 측정되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  90. 제85항 내지 제89항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAT의 수준은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA)에 의해 측정되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  91. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 AATD를 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  92. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제91항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  93. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 대상체는 AATD wt를 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  94. 제91항 또는 제92항에 있어서, 상기 대상체는 선천성 AATD를 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  95. 제1항 내지 제4항, 제7항 내지 제92항, 또는 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 AATD의 가족력을 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  96. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제95항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 유일하게 또는 주로 AATD의 간 증상을 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  97. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서의 Z 대립유전자에 대해 이종접합성인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  98. 제97항에 있어서, 상기 대상체는 SERPINA1 유전자좌에서 하나의 Z 대립유전자 및 하나의 S 대립유전자를 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  99. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제98항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 AAT의 아미노산 서열에서 E342K 돌연변이를 가지지 않으나, 감소된 수준의 야생형 AAT을 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  100. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 부종, 복수, 또는 황달의 개선, 안정화, 또는 지체를 가지거나, 또는 간 이식에 대한 필요성의 지연을 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  101. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 투여의 결과로서 영상화 방법 또는 간 효소 수준에 의해 측정된 변화의 개선, 안정화, 또는 지체를 갖는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  102. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제101항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제형은 바이러스 벡터를 통해 투여되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  103. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물 또는 약제학적 제형은 지질 나노입자를 통해 투여되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  104. 제1항 내지 제4항 또는 제7항 내지 제103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 조성물 또는 제형을 투여하기 이전에 SERPINA1 유전자에서 특이적 돌연변이에 대해 시험되는 것인, 사용하기 위한 방법 또는 조성물.
  105. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 5인 방법 또는 조성물.
  106. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 6인 방법 또는 조성물.
  107. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 7인 방법 또는 조성물.
  108. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 8인 방법 또는 조성물.
  109. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 9인 방법 또는 조성물.
  110. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 10인 방법 또는 조성물.
  111. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 11인 방법 또는 조성물.
  112. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 12인 방법 또는 조성물.
  113. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 13인 방법 또는 조성물.
  114. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 14인 방법 또는 조성물.
  115. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 15인 방법 또는 조성물.
  116. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 16인 방법 또는 조성물.
  117. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 17인 방법 또는 조성물.
  118. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 18인 방법 또는 조성물.
  119. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 19인 방법 또는 조성물.
  120. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 20인 방법 또는 조성물.
  121. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 21인 방법 또는 조성물.
  122. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 22인 방법 또는 조성물.
  123. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 23인 방법 또는 조성물.
  124. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 24인 방법 또는 조성물.
  125. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 25인 방법 또는 조성물.
  126. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 26인 방법 또는 조성물.
  127. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 27인 방법 또는 조성물.
  128. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 28인 방법 또는 조성물.
  129. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 29인 방법 또는 조성물.
  130. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 30인 방법 또는 조성물.
  131. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 31인 방법 또는 조성물.
  132. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 32인 방법 또는 조성물.
  133. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 33인 방법 또는 조성물.
  134. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 34인 방법 또는 조성물.
  135. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 35인 방법 또는 조성물.
  136. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 36인 방법 또는 조성물.
  137. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 37인 방법 또는 조성물.
  138. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 38인 방법 또는 조성물.
  139. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 39인 방법 또는 조성물.
  140. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 40인 방법 또는 조성물.
  141. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 41인 방법 또는 조성물.
  142. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 42인 방법 또는 조성물.
  143. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 43인 방법 또는 조성물.
  144. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 44인 방법 또는 조성물.
  145. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 45인 방법 또는 조성물.
  146. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 46인 방법 또는 조성물.
  147. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 47인 방법 또는 조성물.
  148. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 48인 방법 또는 조성물.
  149. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 49인 방법 또는 조성물.
  150. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 50인 방법 또는 조성물.
  151. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 51인 방법 또는 조성물.
  152. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 52인 방법 또는 조성물.
  153. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 53인 방법 또는 조성물.
  154. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 54인 방법 또는 조성물.
  155. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 55인 방법 또는 조성물.
  156. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 56인 방법 또는 조성물.
  157. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 57인 방법 또는 조성물.
  158. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 58인 방법 또는 조성물.
  159. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 59인 방법 또는 조성물.
  160. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 60인 방법 또는 조성물.
  161. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 61인 방법 또는 조성물.
  162. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 62인 방법 또는 조성물.
  163. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 63인 방법 또는 조성물.
  164. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 64인 방법 또는 조성물.
  165. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 65인 방법 또는 조성물.
  166. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 66인 방법 또는 조성물.
  167. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 67인 방법 또는 조성물.
  168. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 68인 방법 또는 조성물.
  169. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 69인 방법 또는 조성물.
  170. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 70인 방법 또는 조성물.
  171. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 71인 방법 또는 조성물.
  172. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 72인 방법 또는 조성물.
  173. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 73인 방법 또는 조성물.
  174. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 74인 방법 또는 조성물.
  175. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 75인 방법 또는 조성물.
  176. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 76인 방법 또는 조성물.
  177. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 77인 방법 또는 조성물.
  178. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 78인 방법 또는 조성물.
  179. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 79인 방법 또는 조성물.
  180. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 80인 방법 또는 조성물.
  181. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 81인 방법 또는 조성물.
  182. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 82인 방법 또는 조성물.
  183. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 83인 방법 또는 조성물.
  184. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 84인 방법 또는 조성물.
  185. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 85인 방법 또는 조성물.
  186. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 86인 방법 또는 조성물.
  187. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 87인 방법 또는 조성물.
  188. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 88인 방법 또는 조성물.
  189. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 89인 방법 또는 조성물.
  190. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 90인 방법 또는 조성물.
  191. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 91인 방법 또는 조성물.
  192. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 92인 방법 또는 조성물.
  193. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 93인 방법 또는 조성물.
  194. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 94인 방법 또는 조성물.
  195. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 95인 방법 또는 조성물.
  196. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 96인 방법 또는 조성물.
  197. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 97인 방법 또는 조성물.
  198. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 98인 방법 또는 조성물.
  199. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 99인 방법 또는 조성물.
  200. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 100인 방법 또는 조성물.
  201. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 101인 방법 또는 조성물.
  202. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 102인 방법 또는 조성물.
  203. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 103인 방법 또는 조성물.
  204. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 104인 방법 또는 조성물.
  205. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 105인 방법 또는 조성물.
  206. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 106인 방법 또는 조성물.
  207. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 107인 방법 또는 조성물.
  208. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 108인 방법 또는 조성물.
  209. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 109인 방법 또는 조성물.
  210. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 110인 방법 또는 조성물.
  211. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 111인 방법 또는 조성물.
  212. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 112인 방법 또는 조성물.
  213. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 113인 방법 또는 조성물.
  214. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 114인 방법 또는 조성물.
  215. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 115인 방법 또는 조성물.
  216. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 116인 방법 또는 조성물.
  217. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 117인 방법 또는 조성물.
  218. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 118인 방법 또는 조성물.
  219. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 119인 방법 또는 조성물.
  220. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 120인 방법 또는 조성물.
  221. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 121인 방법 또는 조성물.
  222. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 122인 방법 또는 조성물.
  223. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 123인 방법 또는 조성물.
  224. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 124인 방법 또는 조성물.
  225. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 125인 방법 또는 조성물.
  226. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 126인 방법 또는 조성물.
  227. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 127인 방법 또는 조성물.
  228. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 128인 방법 또는 조성물.
  229. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 5-129로부터 선택된 서열이 식별 번호: 129인 방법 또는 조성물.
  230. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 140 또는 141의 서열을 더 포함하는 방법 또는 조성물.
  231. 제230항에 있어서, 식별 번호: 130의 변이 패턴을 포함하는 방법 또는 조성물.
  232. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 서열이 식별 번호: 131-139로부터 선택되는 방법 또는 조성물.
  233. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 131인 방법 또는 조성물.
  234. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 132인 방법 또는 조성물.
  235. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 133인 방법 또는 조성물.
  236. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 134인 방법 또는 조성물.
  237. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 135인 방법 또는 조성물.
  238. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 136인 방법 또는 조성물.
  239. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 137인 방법 또는 조성물.
  240. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 138인 방법 또는 조성물.
  241. 제1항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 식별 번호: 139인 방법 또는 조성물.
  242. 제232항 내지 제241항 중 어느 한 항에 있어서, 식별 번호: 131-139로부터 선택된 서열이 표 2에서의 각각의 서열에 대해 나타낸 변이를 포함하는 방법 또는 조성물.
  243. AATD를 갖는 인간 대상체의 치료용 의약의 제조를 위한 제5항 내지 제242항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제형의 용도.
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