TW201932479A - 用於ttr基因編輯及治療attr澱粉樣變性之組合物及方法 - Google Patents

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書布 歐德
潔西卡 林 西賽
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Abstract

提供一種用於在TTR基因內進行編輯(例如引入雙鏈斷裂)的組合物及方法。提供一種用於治療患有與甲狀腺素運載蛋白相關之澱粉樣變性(ATTR)之個體的組合物及方法。

Description

用於TTR基因編輯及治療ATTR澱粉樣變性之組合物及方法
本發明係關於在TTR 基因內進行編輯、例如引入雙鏈斷裂之基因。
甲狀腺素運載蛋白(TTR)係由TTR 基因產生之蛋白質，其通常用於在整個身體內轉運視黃醇及甲狀腺素。TTR主要在肝中合成，在脈絡叢及視網膜中產生小部分。TTR通常在血液中作為可溶性四聚體蛋白循環。
可破壞四聚體穩定性之TTR之病原變體可由TTR 基因之突變等位基因編碼。突變TTR可導致錯誤摺疊之TTR，其可產生澱粉樣蛋白(亦即，錯誤摺疊之TTR蛋白之聚集物)。在一些情形下，TTR之病原變體可導致澱粉樣變性或由澱粉樣蛋白之累積引起之疾病。舉例而言，錯誤摺疊之TTR單體可在組織(例如周圍神經、心臟及胃腸道)內聚合成澱粉樣原纖維。澱粉樣斑塊亦可包含沈積於錯誤摺疊之TTR上之野生型TTR。
在60歲或以上之男性中亦觀察到野生型TTR之錯誤摺疊及沈積，且其與心律問題、心臟衰竭及腕管相關。
特徵在於TTR沈積之澱粉樣變性可稱作「ATTR」、「TTR相關之澱粉樣變性」、「TTR澱粉樣變性」或「ATTR澱粉樣變性」、「ATTR家族性澱粉樣變性」 (當與家族中之基因突變相關時)、或「ATTRwt」或「野生型ATTR」 (當由野生型TTR之錯誤摺疊及沈積產生時)。
ATTR可呈現廣譜症狀，且具有不同類別之ATTR之患者可具有不同特徵及預後。一些類別之ATTR包括家族性澱粉樣多神經病變(FAP)、家族性澱粉樣心肌病(FAC)及野生型TTR澱粉樣變性(wt-TTR澱粉樣變性)。FAP通常與感覺運動神經病變一起呈現，而FAC及wt-TTR澱粉樣變性通常與鬱血性心臟衰竭一起呈現。FAP及FAC通常與TTR 基因之遺傳突變相關，且TTR 基因之超過100種不同突變與ATTR相關。相比之下，wt-TTR澱粉樣變性與衰老相關，而與TTR之基因突變無關。據估計，世界範圍內約50,000名患者可能受到FAP及FAC之影響。
儘管TTR之超過100種突變與ATTR相關，但某些突變與神經病變及/或心肌病更緊密相關。舉例而言，TTR之T60之突變與心肌病及神經病變二者相關；V30之突變與神經病變相關性更大；且V122之突變與心肌病相關性更大。
已研究一系列用於治療ATTR之治療方法，但無批准之藥物可停止疾病進展並改善生活品質。儘管肝移植已被研究用於治療ATTR，但由於其涉及顯著風險且在移植後疾病進展有時繼續，其使用正在下降。小分子穩定劑(例如二氫尼柳(diflunisal)及他發米帝司(tafamidis))似乎減緩ATTR進展，但該等藥劑並未阻止疾病進展。
使用小干擾RNA (siRNA)減弱、反義減弱或單株抗體靶向澱粉樣原纖維進行破壞之方法目前亦正在研究中，但是儘管TTR表現之短期抑制結果顯示令人鼓舞的初步數據，但需要可產生長效TTR抑制之治療。
因此，提供以下實施例。在一些實施例中，本發明提供使用引導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)來顯著減少或剔除TTR 基因之表現從而顯著減少或消除與ATTR相關之TTR蛋白之產生的組合物及方法。經由改變TTR 基因顯著減少或消除與ATTR相關之TTR蛋白之產生可為長期減少或消除。
實施例1係誘導TTR 基因內之雙鏈斷裂(DSB)的方法，其包含向細胞遞送組合物，其中該組合物包含
a. 包含選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列之引導RNA；
b. 包含選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸的引導RNA；或
c. 包含與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列的引導RNA。
實施例2係修飾TTR 基因之方法，其包含向細胞遞送組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA：
a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列；
b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或
c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
實施例3係治療與TTR相關之澱粉樣變性(ATTR)之方法，其包含向有需要之個體投與組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA：
a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列；
b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或
c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列，
藉此治療ATTR。
實施例4係降低TTR血清濃度之方法，其包含向有需要之個體投與組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA：
a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列；
b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或
c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列，
藉此降低TTR血清濃度。
實施例5係減少或預防個體中包含TTR之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之累積之方法，其包含向有需要之個體投與組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA：
a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列；
b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或
c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列，
藉此減少澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之累積。
實施例6係包含引導RNA之組合物，該引導RNA包含：
a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列；
b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或
c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
實施例7係包含編碼引導RNA之載體的組合物，其中該引導RNA包含：
a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列；
b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或
c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
實施例8係實施例6或7之組合物，其用於誘導細胞或個體中之TTR 基因內之雙鏈斷裂(DSB)。
實施例9係實施例6或7之組合物，其用於修飾細胞或個體中之TTR 基因。
實施例10係實施例6或7之組合物，其用於治療個體之與TTR相關之澱粉樣變性(ATTR)。
實施例11係實施例6或7之組合物，其用於降低個體之TTR血清濃度。
實施例12係實施例6或7之組合物，其用於減少或預防個體中澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之累積。
實施例13係實施例1至5中任一實施例之方法或實施例8至12中任一實施例使用之組合物，其中該組合物降低血清TTR含量。
實施例14係實施例13之方法或使用之組合物，其中與投與該組合物之前之血清TTR含量相比，該等血清TTR含量降低至少50%。
實施例15係實施例13之方法或使用之組合物，其中與投與該組合物之前之血清TTR含量相比，該等血清TTR含量降低50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-98%、98-99%或99-100%。
實施例16係實施例1至5或8至15中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該組合物導致該TTR 基因之編輯。
實施例17係實施例16之方法或使用之組合物，其中該編輯計算為經編輯群體之百分比(編輯百分比)。
實施例18係實施例17之方法或使用之組合物，其中該編輯百分比介於群體之30%與99%之間。
實施例19係實施例17之方法或使用之組合物，其中該編輯百分比介於群體之30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
實施例20係實施例1至5中任一實施例之方法或實施例8至19中任一實施例使用之組合物，其中該組合物減少至少一種組織中之澱粉樣沈積。
實施例21係實施例20之方法或使用之組合物，其中該至少一種組織包含胃、結腸、坐骨神經或背根神經節中之一或多者。
實施例22係實施例20或21之方法或使用之組合物，其中在投與該組合物後8週量測澱粉樣沈積。
實施例23係實施例20至22中任一實施例之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積係與陰性對照或投與該組合物之前量測之含量進行比較。
實施例24係實施例20至23中任一實施例之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積係在生檢樣本中及/或藉由免疫染色量測。
實施例25係實施例20至24中任一實施例之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積之減少係介於陰性對照中所觀察到之澱粉樣沈積之30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
實施例26係實施例20至25中任一實施例之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積之減少係介於投與該組合物之前所觀察到之澱粉樣沈積之30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
實施例27係實施例1至5或8至26中任一實施例之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物至少兩次。
實施例28係實施例27之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物至少三次。
實施例29係實施例27之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物至少四次。
實施例30係實施例27之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物高達五次、六次、七次、八次、九次或十次。
實施例31係實施例27至30中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該投與或遞送係以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天之間隔發生。
實施例32係實施例27至30中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該投與或遞送係以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週之間隔發生。
實施例33係實施例27至30中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該投與或遞送係以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個月之間隔發生。
實施例34係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該引導序列係選自SEQ ID NO: 5-82。
實施例35係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA與人類TTR 基因中存在之靶序列至少部分互補。
實施例36係實施例35之方法或組合物，其中該靶序列在人類TTR 基因之外顯子1、2、3或4中。
實施例37係實施例35之方法或組合物，其中該靶序列在人類TTR 基因之外顯子1中。
實施例38係實施例35之方法或組合物，其中該靶序列在人類TTR 基因之外顯子2中。
實施例39係實施例35之方法或組合物，其中該靶序列在人類TTR 基因之外顯子3中。
實施例40係實施例35之方法或組合物，其中該靶序列在人類TTR 基因之外顯子4中。
實施例41係實施例1至40中任一實施例之方法或組合物，其中該引導序列與TTR之正鏈中之靶序列互補。
實施例42係實施例1至40中任一實施例之方法或組合物，其中該引導序列與TTR之負鏈中之靶序列互補。
實施例43係實施例1至40中任一實施例之方法或組合物，其中第一引導序列與該TTR 基因之該正鏈中之第一靶序列互補，且其中該組合物進一步包含與該TTR 基因之該負鏈中之第二靶序列互補的第二引導序列。
實施例44係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA包含含有該引導序列之crRNA且進一步包含SEQ ID NO: 126之核苷酸序列，其中SEQ ID NO: 126之核苷酸在其3’端引導序列之後。
實施例45係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA係雙重引導(dgRNA)。
實施例46係實施例45之方法或組合物，其中該雙重引導RNA包含含有SEQ ID NO: 126之核苷酸序列的crRNA及trRNA，其中SEQ ID NO: 126之核苷酸在其3’端引導序列之後。
實施例47係實施例1至43中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA係單引導(sgRNA)。
實施例48係實施例47之方法或組合物，其中該sgRNA包含具有SEQ ID NO: 3之型式之引導序列。
實施例49係實施例47之方法或組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 3之序列。
實施例50係實施例48或49之方法或組合物，其中SEQ ID NO: 3中之每一N係任何天然或非天然核苷酸，其中該等N形成該引導序列，且該引導序列使Cas9靶向該TTR 基因。
實施例51係實施例47至50中任一實施例之方法或組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 5-82之引導序列及SEQ ID NO: 126之核苷酸中之任一者。
實施例52係實施例47至51中任一實施例之方法或組合物，其中該sgRNA包含與選自SEQ ID No: 87-124之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
實施例53係實施例47之方法或組合物，其中該sgRNA包含選自SEQ ID No: 87-124之序列。
實施例54係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA包含至少一個修飾。
實施例55係實施例54之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。
實施例56係實施例54或55之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵。
實施例57係實施例54至56中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸。
實施例58係實施例54至57中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括5’端之前五個核苷酸中之一或多者的修飾。
實施例59係實施例54至58中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括3’端之最後五個核苷酸中之一或多者的修飾。
實施例60係實施例54至59中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括前四個核苷酸之間之PS鍵。
實施例61係實施例54至60中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括最後四個核苷酸之間之PS鍵。
實施例62係實施例54至61中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括在5’端之前三個核苷酸之2’-O-Me修飾之核苷酸。
實施例63係實施例54至62中任一實施例之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括在3’端之最後三個核苷酸之2’-O-Me修飾之核苷酸。
實施例64係實施例54至63中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA包含SEQ ID NO: 3之修飾之核苷酸。
實施例65係實施例1至64中任一實施例之方法或組合物，其中該組合物進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。
實施例66係實施例1至65中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA與脂質奈米粒子(LNP)相聯。
實施例67係實施例66之方法或組合物，其中該LNP包含CCD脂質。
實施例68係實施例67之方法或組合物，其中該CCD脂質係脂質a或脂質B。
實施例69係實施例66至68之方法或組合物，其中該LNP包含中性脂質。
實施例70係實施例69之方法或組合物，其中該中性脂質係DSPC。
實施例71係實施例66至70中任一實施例之方法或組合物，其中該LNP包含輔助脂質。
實施例72係實施例71之方法或組合物，其中該輔助脂質係膽固醇。
實施例73係實施例66至72中任一實施例之方法或組合物，其中該LNP包含隱密脂質(stealth lipid)。
實施例74係實施例73之方法或組合物，其中該隱密脂質係PEG2k-DMG。
實施例75係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該組合物進一步包含RNA引導之DNA結合劑。
實施例76係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該組合物進一步包含編碼RNA引導之DNA結合劑之mRNA。
實施例77係實施例75或76之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係Cas裂解酶。
實施例78係實施例77之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係Cas9。
實施例79係實施例75至78中任一實施例之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑經修飾。
實施例80係實施例75至79中任一實施例之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係切口酶。
實施例81係實施例79或80之方法或組合物，其中該經修飾之RNA引導之DNA結合劑包含核定位信號(NLS)。
實施例82係實施例75至81中任一實施例之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas。
實施例83係前述實施例中任一實施例之方法或組合物，其中該組合物係醫藥調配物且進一步包含醫藥上可接受之載劑。
實施例84係實施例1至5或8至83中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該組合物減少或防止包含TTR之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維。
實施例85係實施例84之方法或使用之組合物，其中該澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維係在神經、心臟或胃腸道中。
實施例86係實施例1至5或8至83中任一實施例之方法或使用之組合物，其中非同源末端接合(NHEJ)在該TTR 基因中之DSB修復期間導致突變。
實施例87係實施例86之方法或使用之組合物，其中NHEJ在該TTR 基因中之DSB修復期間導致核苷酸之缺失或插入。
實施例88係實施例87之方法或使用之組合物，其中核苷酸之缺失或插入誘導該TTR 基因中之框移或無義突變。
實施例89係實施例87之方法或使用之組合物，其中在至少50%之肝細胞之該TTR 基因中誘導框移或無義突變。
實施例90係實施例89之方法或使用之組合物，其中在50%-60%、60%-70%、70%或80%、80%-90%、90-95%、95%-99%或99%-100%之肝細胞之該TTR 基因中誘導框移或無義突變。
實施例91係實施例87至90中任一實施例之方法或使用之組合物，其中在該TTR 基因中出現之核苷酸之缺失或插入係脫靶位點中之至少50倍或更多。
實施例92係實施例91之方法或使用之組合物，其中在該TTR 基因中出現之核苷酸之缺失或插入係脫靶位點中之50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。
實施例93係實施例87至92中任一實施例之方法或使用之組合物，其中核苷酸之缺失或插入係在原代人類肝細胞中之少於或等於3、2、1或0個脫靶位點處出現，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
實施例94係實施例93之方法或使用之組合物，其中核苷酸之缺失或插入係在原代人類肝細胞中之一定數目脫靶位點處出現，該數目少於在Cas9過度表現細胞中出現核苷酸之缺失或插入之脫靶位點的數目，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
實施例95係實施例94之方法或使用之組合物，其中該等Cas9過度表現細胞係穩定表現Cas9之HEK293細胞。
實施例96係實施例93至95中任一實施例之方法或使用之組合物，其中藉由分析來自經Cas9 mRNA及該引導RNA活體外轉染之原代人類肝細胞的基因體DNA測定原代人類肝細胞中脫靶位點之數目，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
實施例97係實施例93至95中任一實施例之方法或使用之組合物，其中藉由包含以下之寡核苷酸插入分析測定原代人類肝細胞中脫靶位點之數目：分析來自經Cas9 mRNA、該引導RNA及供體寡核苷酸活體外轉染之原代人類肝細胞的基因體DNA，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
實施例98係實施例1至43或47至97中任一實施例之方法或組合物，其中該引導RNA之序列係：
a) SEQ ID NO: 92或104；
b) SEQ ID NO: 87、89、96或113；
c) SEQ ID NO: 100、102、106、111或112；或
d) SEQ ID NO: 88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109，
視情況其中該引導RNA在脫靶位點不產生插入或缺失(indel)，該(等)脫靶位點出現在原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
實施例99係實施例1至5或8至98中任一實施例之方法或使用之組合物，其中投與該組合物降低該個體中之TTR含量。
實施例100係實施例99之方法或使用之組合物，其中TTR之含量降低至少50%。
實施例101係實施例100之方法或使用之組合物，其中TTR之含量降低50%-60%、60%-70%、70%或80%、80%-90%、90-95%、95%-99%或99%-100%。
實施例102係實施例100或101之方法或使用之組合物，其中在血清、血漿、血液、腦脊液或痰中量測TTR之含量。
實施例103係實施例100或101之方法或使用之組合物，其中在肝、脈絡叢及/或視網膜中量測TTR之含量。
實施例104係實施例99至103中任一實施例之方法或使用之組合物，其中經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測TTR之含量。
實施例105係實施例1至5或8至104中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體患有ATTR。
實施例106係實施例1至5或8至105中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體係人類。
實施例107係實施例105或106之方法或使用之組合物，其中該個體患有ATTRwt。
實施例108係實施例105或106之方法或使用之組合物，其中該個體患有遺傳性ATTR。
實施例109係實施例1至5、8至106或108中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體具有ATTR家族史。
實施例110係實施例1至5、8至106或108至109中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體患有家族性澱粉樣多神經病變。
實施例111係實施例1至5或8至110中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體僅具有或主要具有ATTR之神經症狀。
實施例112係實施例1至5或8至110中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體患有家族性澱粉樣心肌病。
實施例113係實施例1至5、8至109或112中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體僅具有或主要具有ATTR之心臟症狀。
實施例114係實施例1至5或8至113中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體表現具有V30突變之TTR。
實施例115係實施例114之方法或使用之組合物，其中該V30突變係V30A、V30G、V30L或V30M。
實施例116係實施例1至5或8至113中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體表現具有T60突變之TTR。
實施例117係實施例116之方法或使用之組合物，其中該T60突變係T60A。
實施例118係實施例1至5或8至113中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體表現具有V122突變之TTR。
實施例119係實施例118之方法或使用之組合物，其中該V122突變係V122A、V122I或V122(-)。
實施例120係實施例1至5或8至119中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體表現野生型TTR。
實施例121係實施例1至5、8至107或120中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體不表現具有V30、T60或V122突變之TTR。
實施例122係實施例1至5、8至107或120至121中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體不表現具有病理突變之TTR。
實施例123係實施例121之方法或使用之組合物，其中該個體對於野生型TTR係同型接合的。
實施例124係實施例1至5或8至123中任一實施例之方法或使用之組合物，其中在投與後，該個體具有感覺運動神經病變之症狀之改善、穩定或減緩其變化。
實施例125係實施例124之方法或使用之組合物，其中使用肌電圖、神經傳導測試或患者報告之結果量測感覺神經病變之改善、穩定或減緩其變化。
實施例126係實施例1至5或8至125中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該個體具有鬱血性心臟衰竭之症狀之改善、穩定或減緩其變化。
實施例127係實施例126之方法或使用之組合物，其中使用心臟生物標記測試、肺功能測試、胸部x射線或心電圖量測鬱血性心臟衰竭之改善、穩定或減緩其變化。
實施例128係實施例1至5或8至127中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該組合物或醫藥調配物係經由病毒載體投與。
實施例129係實施例1至5或8至127中任一實施例之方法或使用之組合物，其中該組合物或醫藥調配物係經由脂質奈米粒子投與。
實施例130係實施例1至5或8至129中任一實施例之方法或使用之組合物，其中在投與該組合物或調配物之前測試該個體之該TTR 基因之特異性突變。
實施例131係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 5。
實施例132係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 6。
實施例133係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 7。
實施例134係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 8。
實施例135係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 9。
實施例136係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 10。
實施例137係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 11。
實施例138係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 12。
實施例139係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 13。
實施例140係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 14。
實施例141係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 15。
實施例142係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 16。
實施例143係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 17。
實施例144係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 18。
實施例145係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 19。
實施例146係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 20。
實施例147係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 21。
實施例148係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 22。
實施例149係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 23。
實施例150係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 24。
實施例151係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 25。
實施例152係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 26。
實施例153係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 27。
實施例154係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 28。
實施例155係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 29。
實施例156係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 30。
實施例157係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 31。
實施例158係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 32。
實施例159係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 33。
實施例160係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 34。
實施例161係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 35。
實施例162係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 36。
實施例163係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 37。
實施例164係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 38。
實施例165係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 39。
實施例166係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 40。
實施例167係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 41。
實施例168係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 42。
實施例169係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 43。
實施例170係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 44。
實施例171係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 45。
實施例172係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 46。
實施例173係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 47。
實施例174係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 48。
實施例175係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 49。
實施例176係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 50。
實施例177係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 51。
實施例178係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 52。
實施例179係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 53。
實施例180係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 54。
實施例181係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 55。
實施例182係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 56。
實施例183係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 57。
實施例184係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 58。
實施例185係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 59。
實施例186係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 60。
實施例187係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 61。
實施例188係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 62。
實施例189係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 63。
實施例190係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 64。
實施例191係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 65。
實施例192係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 66。
實施例193係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 67。
實施例194係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 68。
實施例195係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 69。
實施例196係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 70。
實施例197係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 71。
實施例198係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 72。
實施例199係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 73。
實施例200係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 74。
實施例201係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 75。
實施例202係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 76。
實施例203係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 77。
實施例204係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 78。
實施例205係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 79。
實施例206係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 80。
實施例207係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 81。
實施例208係實施例1至130中任一實施例之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之序列係SEQ ID NO: 82。
實施例209係實施例6至208中任一實施例之組合物或調配物的用途，其用於製備用於治療患有ATTR之人類個體之藥劑。
亦揭示上述實施例中任一實施例之組合物或調配物的用途，其用於製造用於治療患有ATTR之人類個體之藥劑。亦揭示上述組合物或調配物中之任一者，其用於治療ATTR或用於修飾TTR 基因(例如，在其中形成插入或缺失或形成框移或無義突變)。
本申請案主張於2017年9月29日提出申請之美國臨時申請案第62/556,236號及於2018年5月15日提出申請之美國臨時申請案第62/671,902號之優先權益，且其全部內容以引用方式併入。
本申請案含有以ASCII格式電子提交之序列表且其全部內容以引用方式併入本文中。於2018年9月27日創建之該ASCII拷貝命名為2018-09-27_01155-0013-PCT_ST25.txt且大小為417,471個字節。
現在將詳細參考本發明之某些實施例，在附圖中圖解說明該等實施例之實例。儘管將結合所闡釋實施例來闡述本發明，但應理解，該等實施例並不意欲將本發明限於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋可包括於隨附申請專利範圍所界定之本發明內之所有替代、修飾及等效形式。
在詳細闡述本教示之前，應理解，本揭示內容並不限於特定組合物或過程步驟，因此可變。應注意，除非上下文另外明確指定，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該」皆包括複數個指示物。因此，舉例而言，在提及「結合物」時包括複數個結合物且在提及「細胞」時包括複數個細胞及諸如此類。
數字範圍包括界定該範圍之數字。量測值及可量測值應理解為近似值，考慮有效數位及與量測相關之誤差。「包含(comprise、comprises、comprising)」、「含有(contain、contains、containing)」、「包括(include、includes及including)之使用亦不意欲具有限制性。應瞭解，前述一般說明及詳細說明二者僅為例示性及解釋性且並不限制教示內容。
除非在以上說明書中特別指出，否則說明書中列舉「包含」各種組分之實施例亦涵蓋「由所列舉組分組成」或「基本上由所列舉組分組成」；說明書中列舉「由各種組分組成」之實施例亦涵蓋「包含」所列舉組分或「基本上由所列舉組分組成」；且說明書中列舉「基本上由各種組分組成」之實施例亦涵蓋「由所列舉組分組成」或「包含」所列舉組分(此可互換性不適用於在申請專利範圍中使用該等術語)。除非上下文另有明確說明，否則術語「或」以包括性含義使用，亦即等同於「及/或」。
本文所用之各部分標題僅出於組織目的，而不能解釋為以任何方式限制所述標的物。倘若以引用方式併入之任何材料與本說明書中定義之任何術語或本說明書之任何其他明確表達內容相矛盾，則以本說明書為準。儘管連同各種實施例闡述本發明教示，但並不意欲將本發明教示限制於該等實施例。相反，本發明教示囊括各種替代、修改及等效形式，如所屬領域的技術人員將瞭解。
I. 定義
除非另外陳述，否則本文所用之下列術語及片語意欲具有下列含義：
「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，其具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習用RNA、DNA、混合RNA-DNA及係其類似物之聚合物。核酸「主鏈」可由多個鏈接構成，包括一或多個糖-磷酸二酯鏈接、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鏈接、甲基膦酸酯鏈接或其組合。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如，2’甲氧基或2’鹵化物取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習用鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如，經修飾尿苷，例如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷或者其他)；肌苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如，N4 -甲基去氧鳥苷、去氮雜-或氮雜-嘌呤、去氮雜-或氮雜-嘧啶、在5或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6、或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O6 -甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4 -烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。對於一般討論，參見The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams等人編輯，第11版，1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈對於聚合物之位置不包括含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習用RNA或DNA糖、鹼基及鏈接，或可包括習慣組分及取代(例如，具有2’甲氧基鏈接之習用鹼基、或含有習用鹼基及一或多種鹼基類似物之聚合物)。核酸包括「鎖核酸」(LNA)，一種含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，其中二環呋喃糖單元鎖定在模擬糖構形之RNA中，其增強對互補RNA及DNA序列之雜交親和性(Vester及Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同的糖部分，且可因RNA中存在尿嘧啶或其類似物及DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物而不同。
「引導RNA」、「gRNA」及「引導」在本文中可互換使用，指crRNA(亦稱為CRISPR RNA)或crRNA與trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。crRNA及trRNA可作為單一RNA分子(單引導RNA，sgRNA)或以兩個單獨RNA分子(雙重引導RNA，dgRNA)締合。「引導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然序列、或與天然序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。
如本文所用，「引導序列」係指引導RNA內之序列，其與靶序列互補且用於將引導RNA引導至靶序列以藉由RNA引導之DNA結合劑結合或修飾(例如，裂解)。「引導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔序列」。例如，在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes) (亦即，Spy Cas9) )及相關之Cas9同系物/直向同源物之情形下，引導序列之長度可為20個鹼基對。亦可使用更短或更長之序列作為引導，例如，長度為15、16、17、18、19、21、22、23、24或25個核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，引導序列包含選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸。在一些實施例中，例如，靶序列在基因中或在染色體上，且與引導序列互補。在一些實施例中，引導序列與其相應靶序列之間之互補或一致性程度可為約75%、80%、85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。舉例而言，在一些實施例中，引導序列包含與選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸具有約75%、80%、85%、88%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列。在一些實施例中，引導序列及靶區可為100%互補或一致。在其他實施例中，引導序列及靶區可含有至少一個失配。舉例而言，引導序列及靶序列可含有1、2、3或4個失配，其中靶序列之總長度為至少17、18、19、20或更多個鹼基對。在一些實施例中，引導序列及靶區可含有1-4個失配，其中引導序列包含至少17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些實施例中，引導序列及靶區可含有1、2、3或4個失配，其中引導序列包含20個核苷酸。
Cas蛋白之靶序列包括基因體DNA之正鏈及負鏈(亦即，給出之序列及序列之反向補體)，此乃因Cas蛋白之核酸受質係雙鏈核酸。因此，在據稱引導序列「與靶序列互補」之情況下，應理解，引導序列可引導引導RNA結合至靶序列之反向補體。因此，在引導序列結合靶序列之反向補體之情況下，引導序列與靶序列之某些核苷酸一致(例如，靶序列不包括PAM)，只是在導向序列中用U取代T。
如本文所用，「RNA引導之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽之複合物、或該複合物之DNA結合亞單位，其中DNA結合活性具有序列特異性且取決於RNA之序列。實例性RNA引導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其滅活形式(「dCas DNA結合劑」)。如本文所用，「Cas核酸酶」，亦稱為「Cas蛋白」，涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亞單位、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3亞單位及2類Cas核酸酶。如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA引導之DNA結合活性之單鏈多肽，例如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶及2類Cas切口酶(例如，H840A、D10A或N863A變體) (其進一步具有RNA引導之DNA裂解酶或切口酶活性)及2類dCas DNA結合劑(其中裂解酶/切口酶活性不活化)。2類Cas核酸酶包括(例如) Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變體)蛋白及其修飾形式。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell, 163: 1-13 (2015))與Cas9同源，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列以引用方式整體併入。參見，例如，Zetsche，表S1及S3。「Cas9」涵蓋Spy Cas9、本文列示之Cas9之變體及其等效物。參見(例如) Makarova等人, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
「經修飾尿苷」在本文中用於指除胸苷以外之核苷，其具有與尿苷相同之氫鍵受體及與尿苷之一或多個結構差異。在一些實施例中，經修飾尿苷係經取代尿苷，亦即其中一或多個非質子取代基(例如，烷氧基，例如甲氧基)代替質子之尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係經取代假尿苷，亦即其中一或多個非質子取代基(例如，烷基，例如甲基)代替質子之假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係任何經取代尿苷、假尿苷或經取代假尿苷。
如本文所用之「尿苷位置」係指由尿苷或經修飾尿苷佔據之多核苷酸中之位置。因此，例如，其中「100%之尿苷位置係經修飾尿苷」之多核苷酸在每個位置含有經修飾尿苷，其將為相同序列之習用RNA(其中所有鹼基皆係標準A、U、C或G鹼基)中的尿苷。除非另有說明，否則本揭示內容中或隨附之序列表格或序列表之多核苷酸序列中的U可為尿苷或經修飾尿苷。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示第二序列之X%或更多之位置整體與第一序列匹配，則認為第一序列「包含與第二序列具有至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性的序列，此乃因比對將給出100%之一致性，其中與第二序列之所有三個位置皆匹配。RNA與DNA之間之差異(通常將尿苷更換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(例如經修飾尿苷)之存在不會導致多核苷酸間之一致性或互補性之差異，只要相關核苷酸(例如胸苷、尿苷或經修飾尿苷)具有相同之補體(例如，對於所有胸苷、尿苷或經修飾尿苷皆為腺苷；另一實例係胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，二者皆具有鳥苷或經修飾鳥苷作為補體)。因此，例如，認為序列5’-AXG (其中X係任何經修飾尿苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)與AUG 100%一致，其中二者皆與相同序列(5’-CAU)完美互補。實例性比對算法係Smith-Waterman及Needleman-Wunsch算法，其為業內所熟知。熟習此項技術者將瞭解哪種算法選擇及參數設置適合於欲比對之給定序列對；對於通常類似長度及對於胺基酸預期一致性＞50%或對於核苷酸＞75%的序列，具有在www.ebi.ac.uk網站伺服器上由EBI提供之Needleman-Wunsch算法接口之默認設置的Needleman-Wunsch算法通常係合適的。
「mRNA」在本文中用於指多核苷酸，其不是DNA且包含可轉譯成多肽(亦即，可用作由核糖體及胺基-醯化tRNA轉譯之受質)之開放閱讀框。mRNA可包含磷酸酯-糖主鏈，包括核糖殘基或其類似物，例如2’-甲氧基核糖殘基。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2'-甲氧基核糖殘基或其組合組成。通常，mRNA不含有大量之胸苷殘基(例如0個殘基或少於30、20、10、5、4、3或2個胸苷殘基；或少於10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.2%或0.1%胸苷含量)。mRNA可在其一些或所有尿苷位置含有經修飾尿苷。
如本文所用，給定之開放閱讀框(ORF)之「最小尿苷含量」係如下ORF之尿苷含量：(a)在每個位置使用最小尿苷密碼子且(b)編碼與給定之ORF相同之胺基酸序列。給定胺基酸之最小尿苷密碼子係具有最少尿苷(通常0或1，其中最小尿苷密碼子具有2個尿苷酸之苯丙胺酸之密碼子除外)之密碼子。出於評估最小尿苷含量之目的，認為經修飾尿苷殘基等效於尿苷。
如本文所用，給定之開放閱讀框(ORF)之「最小尿苷二核苷酸含量」係如下ORF之最低可能之尿苷二核苷酸(UU)含量：(a)在每個位置使用最小尿苷密碼子(如上所論述)且(b)編碼與給定之ORF相同之胺基酸序列。尿苷二核苷酸(UU)含量可在絕對意義上表示為ORF中UU二核苷酸之列舉，或基於由尿苷二核苷酸之尿苷佔據之位置之百分比表示(例如，AUUAU之尿苷二核苷酸含量為40%，此乃因5個位置中之2個由尿苷二核苷酸之尿苷佔據)。出於評估最小尿苷二核苷酸含量之目的，認為經修飾尿苷殘基等效於尿苷。
如本文所用，「TTR」係指甲狀腺素運載蛋白，其係TTR 基因之基因產物。
如本文所用，「澱粉樣蛋白」係指通常可溶之蛋白質或肽之異常聚集物。澱粉樣蛋白不溶，且澱粉樣蛋白可在器官及組織中產生蛋白質性沈積。澱粉樣蛋白中之蛋白質或肽可被錯誤摺疊成容許蛋白質之許多拷貝黏在一起以形成原纖維的形式。儘管一些形式之澱粉樣蛋白可能在人類體中具有正常功能，但本文所用之「澱粉樣蛋白」係指蛋白質之異常或病理性聚集物。澱粉樣蛋白可包含單一蛋白質或肽，例如TTR，或其可包含多個蛋白質或肽，例如TTR及額外蛋白質。
如本文所用，「澱粉樣原纖維」係指抗降解之澱粉樣蛋白之不溶性纖維。澱粉樣原纖維可基於特定之蛋白質或肽以及其所聚集之組織及細胞類型產生症狀。
如本文所用，「澱粉樣變性」係指特徵在於由澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之沈積引起之症狀的疾病。澱粉樣變性可影響眾多器官，包括心臟、腎、肝、脾、神經系統及消化道。
如本文所用，「ATTR」、「TTR相關之澱粉樣變性」、「TTR澱粉樣變性」、「ATTR澱粉樣變性」或「與TTR相關之澱粉樣變性」係指與TTR之沈積相關之澱粉樣變性。
如本文所用，「家族性澱粉樣心肌病」或「FAC」係指特徵主要在於限制性心肌病之遺傳性甲狀腺素運載蛋白澱粉樣變性(ATTR)。鬱血性心臟衰竭在FAC中常見。平均發病年齡約為60-70歲，估計預期壽命為診斷後4-5年。
如本文所用，「家族性澱粉樣多神經病變」或「FAP」係指特徵主要在於感覺運動神經病變之遺傳性甲狀腺素運載蛋白澱粉樣變性(ATTR)。自主神經病變在FAP中常見。儘管神經病變係主要特徵，但FAP之症狀亦可包括惡病質、腎衰竭及心臟病。FAP之平均發病年齡約為30-50歲，估計預期壽命為診斷後5-15年。
如本文所用，「野生型ATTR」及「ATTRwt」係指與病理TTR突變(例如T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-))無關之ATTR。ATTRwt亦稱為老年全身性澱粉樣變性。發作通常發生在60歲或以上之男性中，其中最常見之症狀係鬱血性心臟衰竭及異常之心律，例如心房震顫。額外症狀包括心臟功能不良之後果，例如呼吸短促、疲勞、眩暈、腫脹(尤其係腿部)、噁心、心絞痛、睡眠中斷及體重減輕。腕隧道症候群之病史指示ATTRwt之風險增加，且在一些情況下可指示早期疾病。ATTRwt通常導致心臟功能隨著時間之推移而降低，但可具有比傳遺性ATTR更佳之預後，此乃因野生型TTR沈積物累積得更慢。現有之治療類似於其他形式之ATTR (肝移植除外)，且通常係關於支持或改善心臟功能(自利尿劑及有限之液體及鹽攝入至抗凝劑之範圍)且在嚴重情形下心臟移植。儘管如此，與FAC一樣，ATTRwt可導致有時在診斷後之3-5年內因心臟衰竭死亡。
可用於本文所述引導RNA組合物及方法中之引導序列示於表1及整個申請案中。
如本文所用，「遺傳性ATTR」係指與TTR 基因之序列之突變相關之ATTR。與ATTR相關之TTR 基因之已知突變包括導致TTR具有T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)取代之彼等。
如本文所用，「插入或缺失」係指由多個在靶核酸中之雙鏈斷裂(DSB)位點插入或缺失之核苷酸組成之插入/缺失突變。
如本文所用，「減弱」係指特定基因產物(例如，蛋白質、mRNA或二者)之表現降低。蛋白質之減弱可藉由檢測組織或細胞群體分泌之蛋白質(例如，在血清或細胞培養基中)或藉由檢測來自所關注組織或細胞群之蛋白質之總細胞量來量測。用於量測mRNA之減弱之方法係已知的，且包括自所關注組織或之細胞群體分離之mRNA之定序。在一些實施例中，「減弱」可指特定基因產物之表現之一些損失，例如，轉錄之mRNA之量減少或細胞群體(包括活體內群體，例如組織中發現之彼等)表現或分泌之蛋白質之量減少。
如本文所用，「剔除」係指細胞中特定蛋白質之表現損失。剔除可藉由檢測組織或細胞群體之蛋白質分泌量(例如，在血清或細胞培養基中)或藉由檢測組織或細胞群體之蛋白質之總細胞量來量測。在一些實施例中，本揭示內容之方法「剔除」一或多個細胞中(例如，細胞群體，包括活體內群體，例如在組織中發現之彼等中)的TTR。在一些實施例中，剔除不形成突變TTR蛋白，例如，由插入或缺失產生，而是在細胞中完全喪失TTR蛋白之表現。
如本文所用，「突變TTR」係指TTR之基因產物(亦即，TTR蛋白)，其與TTR之野生型胺基酸序列相比具有TTR之胺基酸序列之變化。人類野生型TTR序列可在NCBI Gene ID: 7276；Ensembl: Ensembl: ENSG00000118271獲得。例如人類中與ATTR相關之TTR之突變形式包括T60A、V30M、V30A、V30G、V30L、V122I、V122A或V122(-)。
如本文所用，「突變TTR」或「突變體TTR等位基因」係指與野生型序列相比具有TTR之核苷酸序列變化的TTR序列(NCBI Gene ID: 7276；Ensembl: ENSG00000118271)。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指引導RNA以及RNA引導之DNA結合劑，例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如，Cas9)。在一些實施例中，引導RNA引導RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)至靶序列，且引導RNA與靶序列雜交且試劑結合至靶序列；在試劑係裂解酶或切口酶之情形下，結合後可以切割或切口形成。
如本文所用，「靶序列」係指靶基因中與gRNA之引導序列具有互補性之核酸序列。靶序列及引導序列之相互作用引導RNA引導之DNA結合劑結合，且可能在靶序列內形成切口或切割(取決於試劑之活性)。
如本文所用，「治療」係指對個體中疾病或病症之治療劑之任何投與及施加，且包括抑制疾病、停止其發展、緩解疾病之一或多種症狀、治癒疾病或防止疾病之一或多種症狀再次出現。舉例而言，ATTR之治療可包含緩和ATTR之症狀。
「經修飾尿苷」在本文中用於指除胸苷以外之核苷，其具有與尿苷相同之氫鍵受體及與尿苷之一或多個結構差異。在一些實施例中，經修飾尿苷係經取代尿苷，亦即其中一或多個非質子取代基(例如，烷氧基，例如甲氧基)代替質子之尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係經取代假尿苷，亦即其中一或多個非質子取代基(例如，烷基，例如甲基)代替質子之假尿苷，例如N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係任何經取代尿苷、假尿苷或經取代假尿苷。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示第二序列之X%或更多之位置整體與第一序列匹配，則認為第一序列「包含與第二序列具有至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性的序列，此乃因比對將給出100%之一致性，其中與第二序列之所有三個位置皆匹配。RNA與DNA之間之差異(通常將尿苷更換為胸苷或反之亦然)及核苷類似物(例如經修飾尿苷)之存在不會導致多核苷酸間之一致性或互補性之差異，只要相關核苷酸(例如胸苷、尿苷或經修飾尿苷)具有相同之補體(例如，對於所有胸苷、尿苷或經修飾尿苷皆為腺苷；另一實例係胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，二者皆具有鳥苷作為補體)。因此，例如，認為序列5’-AXG (其中X係任何經修飾尿苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)與AUG 100%一致，其中二者皆與相同序列(5’-CAU)完美互補。實例性比對算法係Smith-Waterman及Needleman-Wunsch算法，其為業內所熟知。熟習此項技術者將瞭解哪種算法選擇及參數設置適合於欲比對之給定序列對；對於通常類似長度及對於胺基酸預期一致性＞50%或對於核苷酸＞75%的序列，具有在www.ebi.ac.uk網站伺服器上由EBI提供之Needleman-Wunsch算法接口之默認設置的Needleman-Wunsch算法通常係合適的。
術語「約」或「近似地」意指熟習此項技術者所測定之特定值的可接受誤差，其部分取決於該值之量測或測定方式。
II. 組合物
A. 包含引導 RNA (gRNA) 之組合物
本文提供(例如)使用引導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如，CRISPR/Cas系統)用於編輯TTR 基因之組合物。組合物可投與具有野生型或非野生型TTR 基因序列之個體，例如患有ATTR (其可為ATTR wt或遺傳性或家族性形式之ATTR)之個體。靶向TTR 基因之引導序列示於表1中之SEQ ID No: 5-82。
表 1 ： TTR 靶向引導序列、命名法、染色體座標及序列 .
上述引導序列中之每一者可進一步包含額外核苷酸以形成例如在其3'端之引導序列之後具有以下實例性核苷酸序列之crRNA：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 126)。在sgRNA之情形下，上述引導序列可以進一步包含額外核苷酸以形成例如在引導序列之3'端之後具有以下實例性核苷酸序列的sgRNA：在5’至3’方向上GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 125)。
在一些實施例中，sgRNA經修飾。在一些實施例中，sgRNA包含以下SEQ ID NO: 3中所示之修飾模式，其中N係任何天然或非天然核苷酸，且其中全體N包含如本文所述之引導序列且經修飾sgRNA包含以下序列：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 3)，其中「N」可為任何天然或非天然核苷酸。舉例而言，本文涵蓋SEQ ID NO: 3，其中N經本文揭示之引導序列中之任一者置換。儘管N取代了引導之核苷酸，但修飾仍然如SEQ ID NO: 3中所示。亦即，儘管引導之核苷酸置換了「N」，但前三個核苷酸經2’OMe修飾，且在第一核苷酸與第二核苷酸、第二核苷酸與第三核苷酸以及第三核苷酸與第四核苷酸之間存在硫代磷酸酯鏈接。
在一些實施例中，涵蓋表2中列舉之序列中之任一者。
表 2 ： TTR 靶向之 sgRNA 序列
* = PS鏈接；「m」 = 2'-O-Me核苷酸
在表3中提供引導ID與相應sgRNA ID之比對定位以及與食蟹猴基因體及食蟹猴匹配之引導ID的同源性。
表 3 ： TTR 靶向之引導序列 ID 定位及食蟹猴同源性
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個引導RNA (gRNA)之組合物，該引導RNA包含將RNA引導之DNA結合劑(其可為核酸酶(例如，Cas核酸酶，例如Cas9))引導至TTR中之靶DNA序列的引導序列。gRNA可包含含有表1中所示之引導序列之crRNA。gRNA可包含含有表1中所示之引導序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸的crRNA。在一些實施例中，gRNA包含含有與表1中所示之引導序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列之crRNA。在一些實施例中，gRNA包含含有與表1中所示之引導序列具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性的序列之crRNA。gRNA可進一步包含trRNA。在本文所述之每一組合物及方法實施例中，crRNA及trRNA可作為單一RNA (sgRNA)締合，或可在單獨RNA (dgRNA)上。在sgRNA之上下文中，crRNA及trRNA組分可經由(例如)磷酸二酯鍵或其他共價鍵共價連接。
在本文所述組合物、用途及方法實施例之每一者中，引導RNA可包含兩個RNA分子作為「雙重引導RNA」或「dgRNA」。dgRNA包含含有包含(例如)表1中所示之引導序列之crRNA的第一RNA分子及包含trRNA之第二RNA分子。第一及第二RNA分子可不共價連接，但可經由crRNA與trRNA之各部分之間之鹼基配對形成RNA雙鏈體。
在本文所述組合物、用途及方法實施例之每一者中，引導RNA可包含單一RNA分子作為「單引導RNA」或「sgRNA」。sgRNA可包含含有與trRNA共價連接之表1中所示之引導序列的crRNA(或其部分)。sgRNA可包含表1中所示之引導序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由連接體共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA與trRNA之各部分之間之鹼基配對形成莖環結構。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由一或多個不為磷酸二酯鍵之鍵共價連接。
在一些實施例中，trRNA可包含衍生自天然CRISPR/Cas系統之trRNA序列之全部或一部分。在一些實施例中，trRNA包含經截短或修飾之野生型trRNA。trRNA之長度取決於所用之CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，trRNA包含5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100或超過100個核苷酸或由其組成。在一些實施例中，trRNA可包含某些二級結構，例如一或多個髮夾或莖環結構或一或多個凸起結構。
在一些實施例中，本發明提供包含一或多個包含SEQ ID NO: 5-82中任一者之引導序列之引導RNA的組合物。
在一態樣中，本發明提供包含gRNA之組合物，該gRNA包含與SEQ ID NO: 5-82之核酸中之任一者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
在其他實施例中，組合物包含至少一個、例如至少兩個gRNA，該(等) gRNA包含選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列中之任兩者或更多者之引導序列。在一些實施例中，組合物包含至少兩個gRNA，其各自包含與SEQ ID NO: 5-82之核酸中之任一者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
在一些實施例中，gRNA係包含表2中所示之序列(SEQ ID No. 87-124)中之任一者的sgRNA。在一些實施例中，gRNA係包含表2中所示之序列(SEQ ID No. 87-124)中之任一者的sgRNA， 但無如所示修飾(亦即，未經修飾之SEQ ID No. 87-124)。在一些實施例中，sgRNA包含與SEQ ID No. 87-124之核酸中之任一者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的序列。在一些實施例中，sgRNA包含與SEQ ID No. 87-124之核酸中之任一者具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的序列， 但無如所示修飾(亦即，未經修飾之SEQ ID No. 87-124)。在一些實施例中，sgRNA包含表1中所示之引導序列中之任一者代替表2中SEQ ID No: 87-124之sgRNA序列中所示之引導序列，具有或無修飾。
本發明之引導RNA組合物經設計以識別(例如，雜交)TTR 基因中之靶序列。舉例而言，TTR靶序列可由提供之包含引導RNA之Cas裂解酶識別及切割。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)可由引導RNA引導至TTR 基因之靶序列，其中引導RNA之引導序列與靶序列雜交，且RNA引導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)切割靶序列。
在一些實施例中，基於TTR 基因內之靶序列確定一或多種引導RNA之選擇。
不受任何特定理論之限制，基因之某些區域之突變(例如，由於核酸酶介導之DSB而出現之插入或缺失所引起之框移突變)可能比基因之其他區域之突變更不可耐受，因此DSB之位置係可能導致之蛋白質減弱之量或類型的重要因素。在一些實施例中，與TTR內之靶序列互補或具有互補性之gRNA用於將RNA引導之DNA結合劑引導至TTR 基因中之特定位置。在一些實施例中，gRNA經設計以具有與TTR之外顯子1、外顯子2、外顯子3或外顯子4中之靶序列互補或具有互補性的引導序列。
在一些實施例中，引導序列與人類TTR 基因中存在之靶序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性。在一些實施例中，靶序列可與引導RNA之引導序列互補。在一些實施例中，引導RNA之引導序列與其相應靶序列之間之互補或一致性程度可為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，gRNA之靶序列及導向序列可100%互補或一致。在其他實施例中，gRNA之靶序列及引導序列可含有至少一個失配。舉例而言，gRNA之靶序列及引導序列可含有1、2、3或4個失配，其中引導序列之總長度為20。在一些實施例中，gRNA之靶序列及引導序列可含有1-4個失配，其中引導序列為20個核苷酸。
在一些實施例中，本文揭示之組合物或調配物包含含有編碼RNA引導之DNA結合劑(例如如本文所述之Cas核酸酶)之開放閱讀框(ORF)的mRNA。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)之ORF的mRNA。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑係2類Cas核酸酶。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱為雙鏈內核酸酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含Cas核酸酶，例如2類Cas核酸酶(其可為例如II、V或VI型Cas核酸酶)。2類Cas核酸酶包括(例如)Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2及C2c3蛋白及其修飾形式。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌(S. pyogenes)、金黃色葡萄球菌(S. aureus)及其他原核生物(例如，參見下一段中之清單)及其修飾(例如，工程化或突變體)型式之II型CRISPR系統的彼等。參見(例如) US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶之其他實例包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亞單位；及I型CRISPR系統之級聯複合物或其Cas3亞單位。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。關於各種CRISPR系統及Cas核酸酶之論述，參見(例如) Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL. 9:467-477 (2011)；Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL, 13: 722-36 (2015)；Shmakov等人, MOLECULAR CELL, 60:385-397 (2015)。
Cas核酸酶可源自之非限制實例性物種包括釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes )、 嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus )、 鏈球菌屬(Streptococcus sp. )、 金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus )、 無害李斯特菌(Listeria innocua )、 加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri )、 新兇手弗朗西斯氏菌(Francisella novicida )、 琥珀酸弧菌(Wolinella succinogenes )、 華德薩特菌(Sutterella wadsworthensis )、 Y-變形桿菌(Gammaproteobacterium )、 腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis )、 空腸彎曲桿菌(Campylobacter jejuni )、 多殺巴斯德菌(Pasteurella multocida )、 產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogene )、 紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum )、 達松維爾類諾卡菌(Nocardiopsis dassonvillei )、 始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis )、 產綠色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogenes )、 玫瑰鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum )、 酸熱脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius )、 假真菌樣芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides )、 還原硒酸鹽芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens )、 西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum )、 戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii )、 唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius )、 布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri )、 齒垢密螺旋體(Treponema denticola )、 海洋微顫菌(Microscilla marina )、 伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales bacterium )、 食萘極單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans )、 極單胞菌屬(Polaromonas sp. )、 海洋固氮菌(Crocosphaera watsonii )、 藍桿藻屬(Cyanothece sp. )、 銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa )、 聚球藻屬(Synechococcus sp. )、 阿拉伯糖醋桿菌(Acetohalobium arabaticum )、 製氨菌(Ammonifex degensii )、 熱角軍纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii )、 金礦菌(Candidatus Desulforudis )、 肉毒梭菌(Clostridium botulinum )、 難養芽胞梭菌(Clostridium difficile )、 大芬戈爾德菌(Finegoldia magna )、 嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus )、 丙酸互營細菌(Pelotomaculum thermopropionicum )、 喜溫嗜酸硫桿菌(Acidithiobacillus caldus )、 嗜酸氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans )、 紅色硫黃細菌(Allochromatium vinosum )、 海洋桿菌屬(Marinobacter sp. )、 嗜鹽亞硝化球菌(Nitrosococcus halophilus )、 瓦氏亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni )、 遊海假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis )、 消旋纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer )、 調查甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum )、 多變魚腥藻(Anabaena variabilis )、 泡沬節球藻(Nodularia spumigena )、 念珠藻屬(Nostoc sp. )、 極大節旋藻(Arthrospira maxima )、 純頂節旋藻(Arthrospira platensis )、 節旋藻屬(Arthrospira sp. )、 鞘絲藻屬(Lyngbya sp. )、 原形微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes )、 顫藻屬(Oscillatoria sp. )、 運動石袍菌(Petrotoga mobilis )、 非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus )、 巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus )、 灰色奈瑟菌(Neisseria cinerea )、 紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari )、 食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans )、 白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria )、 胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp. )、 毛螺科菌ND2006 (Lachnospiraceae bacterium ND2006 )及海洋無核綠藻( Acaryochloris marina ) 。
在一些實施例中，Cas核酸酶係來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas核酸酶係來自以下之Cpf1核酸酶：土倫病弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis )、 毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium )、 亨氏丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus )、 異域門菌(Peregrinibacteria bacterium )、 Parcubacteria菌、 密斯氏菌屬(Smithella )、 胺基酸球菌屬(Acidaminococcus )、 暫定白蟻產甲烷支原體(Candidatus Methanoplasma termitum )、 挑剔真桿菌(Eubacterium eligens )、 牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi )、 稻田氏鉤端螺旋體(Leptospira inadai )、 狗口腔紅棕色單胞菌(Porphyromonas crevioricanis )、 解糖腖普雷沃菌(Prevotella disiens )或獼猴卟啉單胞菌 ( Porphyromonas macacae )。在某些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬或毛螺菌科之Cpf1核酸酶。
野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域切割非靶DNA鏈，且HNH結構域切割DNA之靶鏈。在一些實施例中，Cas9核酸酶包含一個以上RuvC結構域及/或一個以上HNH結構域。在一些實施例中，Cas9核酸酶係野生型Cas9。在一些實施例中，Cas9能誘導靶DNA中之雙鏈斷裂。在某些實施例中，Cas核酸酶可切割dsDNA，其可切割dsDNA之一條鏈，或其可無DNA裂解酶或切口酶活性。實例性Cas9胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 203。包括起始及終止密碼子之實例性Cas9 mRNA ORF序列提供為SEQ ID NO: 204。適於包括於融合蛋白中之實例性Cas9 mRNA編碼序列提供為SEQ ID NO: 210。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白質之一個結構域或區域由不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶結構域可經來自不同核酸酶(例如Fok1)之結構域置換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有單鏈切口酶活性，亦即可切割一條DNA鏈以產生單鏈斷裂，亦稱為「切口」。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶係一種在dsDNA中產生切口、亦即切割DNA雙螺旋之一條鏈但非另一鏈的酶。在一些實施例中，Cas切口酶係Cas核酸酶之一種形式(例如，如上所論述之Cas核酸酶)，其中內核核溶解活性位點因(例如)催化結構域之一或多個變化(例如點突變)而不活化。關於Cas切口酶及實例性催化結構域變化之論述，參見(例如)美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶(例如Cas9切口酶)具有不活化之RuvC或HNH結構域。實例性Cas9切口酶胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 206。包括起始及終止密碼子之實例性Cas9切口酶mRNA ORF序列提供為SEQ ID NO: 207。適於包括於融合蛋白中之實例性Cas9切口酶mRNA編碼序列提供為SEQ ID NO: 211。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，試劑蛋白可經修飾，使得核酸酶結構域中之一者突變或完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH結構域之切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白核酸酶結構域內之保守胺基經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之實例性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如，參見Zetsche等人 (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶結構域中之實例性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如，參見Zetsche等人 (2015)。其他實例性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。
在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA與一對分別與靶序列之正義鏈及反義鏈互補之引導RNA組合提供。在此實施例中，引導RNA將切口酶引導至靶序列並藉由在靶序列之相對鏈上產生切口引入DSB (亦即，雙切口形成)。在一些實施例中，使用雙切口形成可提高特異性並減少脫靶效應。在一些實施例中，切口酶與兩個靶向DNA之相反鏈之單獨引導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶與經選擇以緊密靠近之兩個單獨之引導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑無裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上無催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽係dCas9多肽。在一些實施例中，無裂解酶及切口酶活性或dCas DNA結合多肽之RNA引導之DNA結合劑係Cas核酸酶之一種形式(例如，上文論述之Cas核酸酶)，其中其內核溶解活性位點因其催化結構域之一或多個變化(例如，點突變)不活化。例如，參見US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。實例係dCas9胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 208。包括起始及終止密碼子之實例性dCas9 mRNA ORF序列提供為SEQ ID NO: 209。適於包括於融合蛋白中之實例性dCas9 mRNA編碼序列提供為SEQ ID NO: 212。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含一或多個異源功能結構域(例如，係或包含融合多肽)。
在一些實施例中，異源功能結構域可促進RNA引導之DNA結合劑轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可在RNA引導之DNA結合劑序列之N-末端或C-末端連接。其亦可插入RNA引導之DNA結合劑序列中。在其他實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個以上NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下，兩個NLS可為相同的(例如，兩個SV40 NLS)或不同的。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑與在羧基末端連接之兩個SV40 NLS序列融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個在N-末端連接且一個在C-末端連接。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單分序列，例如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 274)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 275)。在一些實施例中，NLS可為二分序列，例如核胞漿素之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 276)。在具體實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 274) NLS可在RNA引導之DNA結合劑之C-末端連接。視情況在融合位點包括一或多個連接體。
在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠修改RNA引導之DNA結合劑之細胞內半衰期。在一些實施例中，可增加RNA引導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，可減少RNA引導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠增加RNA引導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠降低RNA引導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可用作蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶(例如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或卡配因蛋白酶)介導。在一些實施例中，異源功能結構域可包含PEST序列。在一些實施例中，可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣修飾劑(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15(ISG15))、泛素相關之修飾劑-1 (URM1)、神經元-前體-細胞表現之發育上調之蛋白-8(NEDD8，在啤酒酵母(S. cerevisiae)中亦稱為Rub1)、人類白血球抗原F相關(FAT10)、自體吞噬-8 (ATG8)及自體吞噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素倍數修飾劑-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能結構域可為標記結構域。標記結構域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、表位標識及報導基因序列。在一些實施例中，標記結構域可為螢光蛋白。適宜螢光蛋白之非限制性實例包括綠螢光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃螢光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍螢光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青螢光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅螢光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-單體、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他適宜螢光蛋白。在其他實施例中，標記結構域可為純化標籤及/或表位標識。非限制性實例性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和性純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚-His及攜鈣蛋白。非限制性實例性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在額外實施例中，異源功能結構域可將RNA引導之DNA結合劑靶向特定細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能結構域可將RNA引導之DNA結合劑靶向粒線體。
在其他實施例中，異源功能結構域可為效應結構域。當RNA引導之DNA結合劑引導至其靶序列時，例如當Cas核酸酶由gRNA引導至靶序列時，效應結構域可修飾或影響靶序列。在一些實施例中，效應結構域可選自核酸結合結構域、核酸酶結構域(例如，非Cas核酸酶結構域)、後生修飾結構域、轉錄活化結構域或轉錄阻遏結構域。在一些實施例中，異源功能結構域係核酸酶，例如FokI核酸酶。參見，例如，美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能結構域係轉錄活化劑或阻遏劑。參見(例如) Qi等人, 「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,」Cell 152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人, 「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,」Nat. Methods 10:973-6 (2013)；Mali等人, 「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,」Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013)；Gilbert等人, 「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,」Cell 154:442-51 (2013)。因此，RNA引導之DNA結合劑基本上變成轉錄因子，其可使用引導RNA引導至結合期望靶序列。
B . 經修飾 gRNA 及 mRNA
在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾」gRNA或「經化學修飾」gRNA，以產生一或多種代替典型A、G、C及U殘基使用或除典型A、G、C及U殘基之外使用之非天然及/或天然組分或構形的存在。在一些實施例中，利用非典型核苷或核苷酸合成經修飾gRNA，在此稱為「經修飾」。經修飾核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i) 改變、例如置換非連接磷酸酯氧中之一者或二者及/或磷酸二酯主鏈鏈接中之連接磷酸酯氧中之一或多者(實例性主鏈修飾)；(ii) 改變、例如置換核糖之成分，例如核糖上之2'羥基(實例性糖修飾)；(iii) 用「去磷酸化」連接體批量置換磷酸酯部分(實例性主鏈修飾)；(iv) 包括用非典型核鹼基修飾或置換天然核鹼基(實例性鹼基修飾)；(v) 修飾或置換核糖-磷酸酯主鏈(實例性主鏈修飾)；(vi) 修飾寡核苷酸之3'端或5'端，例如移除、修飾或置換末端磷酸酯基團或結合部分、帽或連接體(該等3'或5'帽修飾可包含糖及/或主鏈修飾)；及(vii) 修飾或置換糖(實例性糖修飾)。
如上所述，在一些實施例中，本文揭示之組合物或調配物包含含有編碼RNA引導之DNA結合劑(例如如本文所述Cas核酸酶)之開放閱讀框(ORF)的mRNA。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)之ORF的mRNA。在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA核酸酶之ORF係「經修飾RNA引導之DNA結合劑ORF」或簡稱為「經修飾ORF」，其用作速記以指示，ORF以下列方式中之一或多者經修飾：(1)經修飾ORF之尿苷含量範圍為自其最小尿苷含量至最小尿苷含量之150%；(2)經修飾ORF之尿苷二核苷酸含量範圍為自其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量之150%；(3)經修飾ORF與SEQ ID NO: 201、204、210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者具有至少90%一致性；(4)經修飾ORF由一組密碼子組成，其中至少75%之密碼子係最小尿苷密碼子之表3A中列出之密碼子；或(5)經修飾ORF包含至少一個經修飾尿苷。在一些實施例中，經修飾ORF以至少兩種、三種或四種前述方式經修飾。在一些實施例中，經修飾ORF包含至少一個經修飾尿苷且以上述(1)-(4)中之至少一者、二者、三者或全部經修飾。
最小尿苷密碼子之表 3A
在上述實施例之任一者中，經修飾ORF可由一組密碼子組成，其中至少75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%之密碼子係顯示最小尿苷密碼子之表3A中列出之密碼子。
在上述實施例之任一者中，經修飾ORF可包含與SEQ ID NO: 201、204、210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者具有至少90%、95%、98%、99%或100%一致性的序列。
在上述實施例之任一者中，經修飾ORF之尿苷含量可在其最小尿苷含量至最小尿苷含量之150%、145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%或101%之範圍內。
在上述實施例之任一者中，經修飾ORF之尿苷二核苷酸含量可在其最小尿苷二核苷酸含量至最小尿苷二核苷酸含量之150%、145%、140%、135%、130%、125%、120%、115%、110%、105%、104%、103%、102%或101%之範圍內。
在上述實施例之任一者中，經修飾ORF可包含至少在一個、複數個或全部尿苷位置之經修飾尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係在5位經(例如)鹵素、甲基或乙基修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係在1位經(例如)鹵素、甲基或乙基修飾之假尿苷。經修飾尿苷可為(例如)假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-甲氧基尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-碘尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係N1-甲基-假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷與N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係N1-甲基假尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-碘尿苷與N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷與5-碘尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-碘尿苷與5-甲氧基尿苷之組合。
在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%或100%的尿苷位置係經修飾尿苷。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係經修飾尿苷，例如5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷、N1-甲基假尿苷、假尿苷或其組合。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係5-甲氧基尿苷。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係假尿苷。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係5-碘尿苷。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係5-甲氧基尿苷，且其餘係N1-甲基假尿苷。在一些實施例中，根據本揭示內容之mRNA中之10%-25%、15-25%、25-35%、35-45%、45-55%、55-65%、65-75%、75-85%、85-95%或90-100%的尿苷位置係5-碘尿苷，且其餘係N1-甲基假尿苷。
在一些實施例中，mRNA包含來自表現之哺乳動物mRNA (例如組成型表現之mRNA)之一個UTR。若mRNA在健康成年哺乳動物之至少一個組織中連續轉錄，則認為該mRNA在哺乳動物中組成型表現。在一些實施例中，mRNA包含來自表現之哺乳動物RNA (例如組成型表現之哺乳動物mRNA)之5’ UTR、3’ UTR或5’及3’ UTR。肌動蛋白mRNA係組成型表現之mRNA之實例。
在一些實施例中，mRNA包含來自羥基類固醇17-β去氫酶4 (HSD17B4或HSD)之一個UTR (例如HSD之5’ UTR)。在一些實施例中，mRNA包含來自珠蛋白mRNA (例如人類α珠蛋白(HBA) mRNA、人類β珠蛋白(HBB) mRNA或非洲爪蟾β珠蛋白(XBG) mRNA)之至少一個UTR。在一些實施例中，mRNA包含來自珠蛋白mRNA (例如HBA、HBB或XBG)之5’ UTR、3’ UTR或5’及3’ UTR。在一些實施例中，mRNA包含來自牛生長激素、巨細胞病毒(CMV)、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG之5’ UTR。在一些實施例中，mRNA包含來自牛生長激素、巨細胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB或XBG之3’ UTR。在一些實施例中，mRNA包含來自牛生長激素、巨細胞病毒、小鼠Hba-a1、HSD、白蛋白基因、HBA、HBB、XBG、熱休克蛋白90 (Hsp90)、3-磷酸甘油醛去氫酶(GAPDH)、β-肌動蛋白、α-微管蛋白、腫瘤蛋白(p53)或表皮生長因子受體(EGFR)之5’及3’ UTR。
在一些實施例中，mRNA包含來自相同來源(例如，組成型表現之mRNA，例如肌動蛋白、白蛋白或諸如HBA、HBB或XBG等珠蛋白)之5’及3’ UTR。
在一些實施例中，mRNA不包含5’ UTR，例如，在5’帽與起始密碼子之間無額外核苷酸。在一些實施例中，mRNA在5’帽與起始密碼子之間包含Kozak序列(如下所述)，但不含任何額外5’ UTR。在一些實施例中，mRNA不包含3’ UTR，例如，在終止密碼子與多-A尾之間無額外核苷酸。
在一些實施例中，mRNA包含Kozak序列。Kozak序列可影響轉譯起始及自mRNA轉譯之多肽之總產率。Kozak序列包括可用作起始密碼子之甲硫胺酸密碼子。最小Kozak序列係NNNRUGN，其中以下中之至少一者為真：第一個N係A或G，且第二個N係G。在核苷酸序列之上下文中，R意指嘌呤(A或G)。在一些實施例中，Kozak序列係RNNRUGN、NNNRUGG、RNNRUGG、RNNAUGN、NNNAUGG或RNNAUGG。在一些實施例中，Kozak序列係與以小寫字母表示之位置具有零失配或最多一個或兩個失配的rccRUGg。在一些實施例中，Kozak序列係與以小寫字母表示之位置具有零失配或最多一個或兩個失配的rccAUGg。在一些實施例中，Kozak序列係與以小寫字母表示之位置具有零失配或最多一個、兩個或三個失配的gccRccAUGG (SEQ ID NO: 277)。在一些實施例中，Kozak序列係與以小寫字母表示之位置具有零失配或最多一個、兩個、三個或四個失配的gccAccAUG。在一些實施例中，Kozak序列係GCCACCAUG。在一些實施例中，Kozak序列係與以小寫字母表示之位置具有零失配或最多一個、兩個、三個或四個失配的gccgccRccAUGG (SEQ ID NO: 278)。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 1具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 1之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 244具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 244之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 256具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 256之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 257具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 257之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 257具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 258之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 259具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 259之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 260具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 260之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA結合劑之ORF的mRNA包含與SEQ ID NO: 261具有至少90%一致性的序列，視情況其中SEQ ID NO: 261之ORF (亦即，SEQ ID NO: 204)經SEQ ID NO: 210、214、215、223、224、250、252、254、265或266中之任一者之替代ORF取代。
在一些實施例中，與SEQ ID NO 243、244或256-261之視情況經取代之序列之一致性程度係95%。在一些實施例中，與SEQ ID NO 243、244或256-261之視情況經取代之序列之一致性程度係98%。在一些實施例中，與SEQ ID NO 243、244或256-261之視情況經取代之序列之一致性程度係99%。在一些實施例中，與SEQ ID NO 243、244或256-261之視情況經取代之序列之一致性程度係100%。
在一些實施例中，本文揭示之mRNA包含5’帽，例如Cap0、Cap1或Cap2。5’帽通常係經由5’-三磷酸酯至mRNA之5’-至-3’鏈之第一核苷酸(亦即，第一帽近端核苷酸)之5’部分連接的7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸(其可進一步經修飾，如下文所論述，例如關於ARCA)。在Cap0中，mRNA之第一及第二帽近端核苷酸之核糖二者皆包含2’-羥基。在Cap1中，mRNA之第一及第二轉錄之核苷酸之核糖分別包含2’-甲氧基及2’-羥基。在Cap2中，mRNA之第一及第二帽近端核苷酸之核糖二者皆包含2’-甲氧基。例如，參見Katibah等人 (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30；Abbas等人， (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大部分內源性高等真核mRNA (包括哺乳動物mRNA，例如人類mRNA)包含Cap1或Cap2。與Cap1及Cap2不同之Cap0及其他帽結構在哺乳動物(例如人類)中可能係免疫性的，此乃因被先天免疫系統之組分(例如IFIT-1及IFIT-5)被識別「非自我」，此可導致升高之細胞介素含量，包括I型干擾素。先天免疫系統之組分(例如IFIT-1及IFIT-5)亦可與eIF4E競爭mRNA與Cap1或Cap2以外之帽之結合，從而潛在地抑制mRNA之轉譯。
帽可包括共轉錄。舉例而言，ARCA (抗反轉帽類似物；Thermo Fisher Scientific目錄號AM8045)係包含與鳥嘌呤核糖核苷酸之5’位置連接之7-甲基鳥嘌呤3’-甲氧基-5’-三磷酸酯的帽類似物，該鳥嘌呤核糖核苷酸可在起始時活體外納入之轉錄物中。ARCA產生Cap0帽，其中第一帽近端核苷酸之2’位置係羥基。參見(例如) Stepinski等人，(2001)「Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 「anti-reverse」 cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG」，RNA 7: 1486-1495。ARCA結構如下所示。
CleanCapTM AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目錄號N-7113)或CleanCapTM GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目錄號N-7133)可用於提供共轉錄Cap1結構。CleanCapTM AG及CleanCapTM GG之3’-O-甲基化型式亦可分別以目錄號N-7413及N-7433自TriLink Biotechnologies獲得。CleanCapTM AG結構如下所示。
或者，可在轉錄後將RNA添加至RNA中。舉例而言，牛痘加帽酶有市售(New England Biolabs目錄號M2080S)具有其D1亞單位提供之RNA三磷酸酶及鳥苷醯基轉移酶活性以及由其D12亞單位提供之鳥嘌呤甲基轉移酶。因此，其可向RNA中添加7-甲基鳥嘌呤，以便在S-腺苷甲硫胺及GTP存在下產生Cap0。參見(例如) Guo, P.及Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027；Mao, X.及Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479。關於帽及加帽方法之其他論述，參見(例如) WO2017/053297及Ishikawa等人，Nucl. Acids. Symp. Ser. (2009)第53期，129-130。
在一些實施例中，mRNA進一步包含多腺苷酸化(多-A)尾。在一些實施例中，多-A尾包含至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個腺嘌呤，視情況最多300個腺嘌呤。在一些實施例中，多-A尾包含95、96、97、98、99或100個腺嘌呤核苷酸。在一些情況下，多-A尾在多-A尾內之一或多個位置「雜有」一或多個非腺嘌呤核苷酸「錨」。多-A尾可包含至少8個連續腺嘌呤核苷酸，但亦包含一或多個非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，「非腺嘌呤核苷酸」係指不包含腺嘌呤之任何天然或非天然核苷酸。鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸係實例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述mRNA上之多-A尾可包含連接腺嘌呤核苷酸，其位於編碼RNA引導之DNA結合劑或所關注序列之核苷酸的3’。在一些情況下，mRNA上之多-A尾包含位於編碼RNA引導之DNA結合劑或所關注序列之核苷酸的3’的非連續腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以規則或不規則間隔中斷腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，一或多個非嘌呤核苷酸經定位以中斷連續腺嘌呤核苷酸，使得多(A)結合蛋白可結合一段連續腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8、9、10、11或12個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8-50個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8-100個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係在一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個腺嘌呤核苷酸之後且之後係至少8個連續腺嘌呤核苷酸。
多-A尾可包含連續腺嘌呤核苷酸、之後一或多個非腺嘌呤核苷酸、視情況之後額外腺嘌呤核苷酸的一個序列。
在一些實施例中，多-A尾包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一段連續2-10個非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸位於至少8、9、10、11或12個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些情況下，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8-50個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續腺嘌呤核苷酸之後。
在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情況下，非腺嘌呤核苷酸係鳥嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係胞嘧啶核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係胸腺嘧啶核苷酸。在一些情況下，在存在一種以上非腺嘌呤核苷酸之情況下，非腺嘌呤核苷酸可選自：a)鳥嘌呤及胸腺嘧啶核苷酸；b)鳥嘌呤及胞嘧啶核苷酸； c)胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸；或d)鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸。包含非腺嘌呤核苷酸之實例性多-A尾提供為SEQ ID NO: 4。
在一些實施例中，mRNA進一步包含多腺苷酸化(多-A)尾。在一些情況下，多-A尾在多-A尾內之一或多個位置「雜有」一或多個非腺嘌呤核苷酸「錨」。多-A尾可包含至少8個連續腺嘌呤核苷酸，但亦包含一或多個非腺嘌呤核苷酸。如本文所用，「非腺嘌呤核苷酸」係指不包含腺嘌呤之任何天然或非天然核苷酸。鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸係實例性非腺嘌呤核苷酸。因此，本文所述mRNA上之多-A尾可包含連接腺嘌呤核苷酸，其位於編碼RNA引導之DNA結合劑或所關注序列之核苷酸的3’。在一些情況下，mRNA上之多-A尾包含位於編碼RNA引導之DNA結合劑或所關注序列之核苷酸的3’的非連續腺嘌呤核苷酸，其中非腺嘌呤核苷酸以規則或不規則間隔中斷腺嘌呤核苷酸。
在一些實施例中，一或多個非嘌呤核苷酸經定位以中斷連續腺嘌呤核苷酸，使得多(A)結合蛋白可結合一段連續腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8、9、10、11或12個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8-50個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8-100個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係在一個、兩個、三個、四個、五個、六個或七個腺嘌呤核苷酸之後且之後係至少8個連續腺嘌呤核苷酸。
本發明之多-A尾可包含連續腺嘌呤核苷酸、之後一或多個非腺嘌呤核苷酸、視情況之後額外腺嘌呤核苷酸的一個序列。
在一些實施例中，多-A尾包含或含有一個非腺嘌呤核苷酸或一段連續2-10個非腺嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸位於至少8、9、10、11或12個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些情況下，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8-50個連續腺嘌呤核苷酸之後。在一些實施例中，一或多個非腺嘌呤核苷酸位於至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50個連續腺嘌呤核苷酸之後。
在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係鳥嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。在一些情況下，非腺嘌呤核苷酸係鳥嘌呤核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係胞嘧啶核苷酸。在一些實施例中，非腺嘌呤核苷酸係胸腺嘧啶核苷酸。在一些情況下，在存在一種以上非腺嘌呤核苷酸之情況下，非腺嘌呤核苷酸可選自：a)鳥嘌呤及胸腺嘧啶核苷酸；b)鳥嘌呤及胞嘧啶核苷酸； c)胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸；或d)鳥嘌呤、胸腺嘧啶及胞嘧啶核苷酸。包含非腺嘌呤核苷酸之實例性多-A尾提供為SEQ ID NO: 4：AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA。
可組合化學修飾(例如如文所列示之彼等)以提供包含可具有兩個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)的經修飾gRNA及/或mRNA。舉例而言，經修飾殘基可具有經修飾糖及經修飾核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每個鹼基皆經修飾，例如，所有鹼基皆具有經修飾磷酸酯基團，例如硫代磷酸酯基團。在某些實施例中，gRNA分子之所有或實質上全部磷酸酯基團皆經硫代磷酸酯基團置換。在一些實施例中，經修飾gRNA包含至少一個在RNA之5'端或其附近之經修飾殘基。在一些實施例中，經修飾gRNA包含至少一個在RNA之3'端或其附近之經修飾殘基。
在一些實施例中，gRNA包含一個、兩個、三個或更多個經修飾殘基。在一些實施例中，經修飾gRNA中之至少5% (例如，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之位置係經修飾核苷或核苷酸。
未經修飾核酸可易於被(例如)細胞內核酸酶或血清中發現之彼等降解。舉例而言，核酸酶可水解核酸二酯鍵。因此，在一個態樣中，本文所述gRNA可含有一或多個經修飾核苷或核苷酸，例如，以引入對細胞內或基於血清之核酸酶之穩定性。在一些實施例中，當活體內及離體引入至細胞群體中時，本文所述之經修飾gRNA分子可展現降低之先天免疫反應。術語「先天免疫反應」包括對外源性核酸(包括單鏈核酸)之細胞反應，其包括細胞介素表現及釋放之誘導，特別是干擾素及細胞死亡。
在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾殘基之磷酸酯基團可藉由用不同取代基置換一或多個氧來修飾。此外，經修飾殘基(例如，經修飾核酸中存在之經修飾殘基)可包括用如本文所述之經修飾磷酸酯基團批量置換未經修飾磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾包括導致不帶電連接體或帶有不對稱電荷分佈之帶電連接體的改變。
經修飾磷酸酯基團之實例包括硫代磷酸酯、磷酸硒酸酯、硼烷基磷酸酯(borano phosphates、borano phosphate esters)、膦酸氫酯、磷醯胺酯、膦酸烷基酯或膦酸芳基酯及磷酸三酯。未經修飾磷酸酯基團中之磷原子係非手性的。然而，用上述原子或原子群中之一者置換非橋接氧中之一者可使磷原子具有手性。立體源磷原子可具有「R」構形(本文為Rp)或「S」構形(本文為Sp)。主鏈亦可藉由用氮(橋接磷醯胺酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)置換橋接氧(亦即，將磷酸酯連接至核苷之氧)來修飾。置換可在任一連接氧或兩個連接氧處發生。
在某些主鏈修飾中，磷酸酯基團可由不含磷之連接基團置換。在一些實施例中，帶電之磷酸酯基團可由天然部分置換。可置換磷酸酯基團之部分之實例可包括(但不限於)例如膦酸甲基酯、羥基胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧基甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接體、磺酸酯、磺醯胺、硫代甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基亞胺基。
可模擬核酸之支架亦可經構築，其中磷酸酯連接體及核糖由核酸酶抗性核苷或核苷酸代用品置換。該等修飾可包括主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可由代用品主鏈束縛。實例可包括(但不限於)嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷代用品。
經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括對糖基團之一或多種修飾，亦即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可由許多不同「氧基」或「去氧」取代基修飾，例如置換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，此乃因羥基不再被去質子化以形成2'-烷氧離子。
2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳基氧基(OR，其中「R」可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)、O(CH2 CH2 O)n CH2 CH2 OR，其中R可為例如H或視情況經取代烷基，且n可為0至20 (例如，0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)之整數。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其用氟化物置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖定」核酸(LNA)，其中2'羥基可藉由(例如) C1 -6 伸烷基或C1-6 伸雜烷基橋連接至相同核糖之4'碳，其中實例性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或多胺基)及胺基烷氧基、O(CH2 )n -胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或多胺基)。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環無C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE)、(OCH2 CH2 OCH3 ，例如，PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(亦即例如在部分dsRNA之懸突部分之去氧核糖)；鹵基(例如，溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為例如NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2 CH2 NH)n CH2CH2 -胺基(其中胺基可例如如本文所述)、-NHC(O)R (其中R可為例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經(例如)如本文所述之胺基取代。
糖修飾可包含糖基團，其亦可含有一或多個具有與核糖中相應碳相反之立體化學構形的碳。因此，經修飾核酸可包括含有例如阿拉伯糖作為糖之核苷酸。經修飾核酸亦可包括無鹼基糖。該等無鹼基糖亦可在一或多個構成糖原子進一步經修飾。經修飾核酸亦可包括一或多種呈L形式(例如L-核苷酸)之糖。
可納入經修飾核酸中之本文所述之經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括經修飾鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。該等核鹼基可經修飾或完全經置換，以提供可納入經修飾核酸中之經修飾殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如鹼基之天然及合成衍生物。
在採用雙重引導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者可含有修飾。該等修飾可在crRNA及/或tracr RNA之一端或兩端。在包含sgRNA之實施例中，可化學修飾sgRNA之一端或兩端之一或多個殘基，或可化學修飾整個sgRNA。某些實施例包含5'端修飾。某些實施例包含3'端修飾。在某些實施例中，引導RNA分子之單鏈懸突中之一或多個或全部核苷酸係去氧核苷酸。
在一些實施例中，本文揭示之引導RNA包含於2016年12月8日提出申請之標題為「Chemically Modified Guide RNAs」之US 62/431,756中揭示之修飾模式之一，其內容為以全文引用方式併入本文中。
在一些實施例中，本發明包含含有一或多個修飾之gRNA。在一些實施例中，修飾包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，修飾包括核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。
2’-O-甲基之修飾可繪示如下：
已顯示影響核苷酸糖環之另一化學修飾係鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2’-氟(2’-F)取代可增加寡核苷酸結合親和性及核酸酶穩定性。
在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示經2’-F取代之核苷酸。
2’-F之取代可繪示如下：

硫代磷酸酯(PS)鏈接或鍵係指其中將硫取代為磷酸二酯鏈接中(例如核苷酸鹼基之間之鍵中)的一個非橋接磷酸酯氧。當使用硫代磷酸酯以生成寡核苷酸時，經修飾寡核苷酸亦可稱為S-寡核苷酸。
「*」可用於繪示PS修飾。在本申請案中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示利用PS鍵連接至下一(例如，3’)核苷酸之核苷酸。
在本申請案中，術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於表示經2’-O-Me取代且利用PS鍵連接至下一(例如，3’)核苷酸之核苷酸。
下圖顯示S-取代成非橋接磷酸酯氧，從而生成PS鍵代替磷酸二酯鍵：
無鹼基核苷酸係指無含氮鹼基之彼等。下圖繪示具有缺乏鹼基之無鹼基(亦稱為無嘌呤)位點的寡核苷酸：
倒置鹼基係指具有自正常5’至3’鏈接倒置之鏈接(亦即，5’至5’鏈接或3’至3’鏈接)的彼等。舉例而言：
無鹼基核苷酸可利用倒置鏈接連接。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5’至5’鏈接連接至末端5’核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3’至3’鏈接連接至末端3’核苷酸。末端5’或3’核苷酸處之倒置無鹼基核苷酸亦可稱作倒置無鹼基端帽。
在一些實施例中，在5'末端之前三個、四個或五個核苷酸中之一或多者以及在3'末端之最後三個、四個或五個核苷酸中之一或多者經修飾。在一些實施例中，修飾係2’-O-Me、2’-F、倒置無鹼基核苷酸、PS鍵或業內眾所周知可增加穩定性及/或性能之其他核苷酸修飾。
在一些實施例中，在5'末端之前四個核苷酸以及在3'末端之最後四個核苷酸利用硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，在5'末端之前三個核苷酸以及在3'末端之最後三個核苷酸包含2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，在5'末端之前三個核苷酸以及在3'末端之最後三個核苷酸包含2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，在5'末端之前三個核苷酸以及在3'末端之最後三個核苷酸包含倒置無鹼基核苷酸。
在一些實施例中，引導RNA包含經修飾sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含SEQ ID No：3中所示之修飾模式，其中N係任何天然或非天然核苷酸，且其中全體N包含將核酸酶引導至靶序列之引導序列。
在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID No: 87-124之任一者中所示之sgRNA。在一些實施例中，引導RNA包含含有SEQ ID No: 5-82之引導序列及SEQ ID No: 125之核苷酸中之任一者的sgRNA，其中SEQ ID No: 125之核苷酸在引導序列之3’端上，且其中引導序列可如SEQ ID No: 3中所示經修飾。
C. 核糖核蛋白複合物
在一些實施例中，涵蓋包含表1之一或多個引導序列之一或多個gRNA或表2之一或多個sgRNA以及RNA引導之DNA結合劑(例如，核酸酶，例如Cas核酸酶，例如Cas9)的組合物。在一些實施例中，編碼之RNA引導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱為雙鏈內核酸酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包括釀膿鏈球菌、金黃色葡萄球菌及其他原核生物(例如，參見下一段中之清單)及其修飾(例如，工程化或突變體)型式之II型CRISPR系統的彼等。參見(例如) US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶之其他實例包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亞單位；及I型CRISPR系統之級聯複合物或其Cas3亞單位。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。關於各種CRISPR系統及Cas核酸酶之論述，參見(例如) Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL. 9:467-477 (2011)；Makarova等人, NAT. REV. MICROBIOL, 13: 722-36 (2015)；Shmakov等人, MOLECULAR CELL, 60:385-397 (2015)。
Cas核酸酶可源自之非限制實例性物種包括釀膿鏈球菌、嗜熱鏈球菌、鏈球菌屬、金黃色葡萄球菌、無害李斯特菌、加氏乳桿菌、新兇手弗朗西斯氏菌、琥珀酸弧菌、華德薩特菌、Y-變形桿菌、腦膜炎雙球菌、空腸彎曲桿菌、多殺巴斯德菌、產琥珀酸絲狀桿菌、紅紅螺菌、達松維爾類諾卡菌、始旋鏈黴菌、產綠色鏈黴菌、產綠色鏈黴菌、玫瑰鏈孢囊菌、玫瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環酸芽孢桿菌、假真菌樣芽孢桿菌、還原硒酸鹽芽孢桿菌、西伯利亞微小桿菌、戴白氏乳桿菌、唾液乳酸桿菌、布氏乳桿菌、齒垢密螺旋體、海洋微顫菌、伯克霍爾德氏菌、食萘極單胞菌、極單胞菌屬、海洋固氮菌、藍桿藻屬、銅綠微囊藻、聚球藻屬、阿拉伯糖醋桿菌、製氨菌、熱角軍纖維素菌、金礦菌、肉毒梭菌、難養芽胞梭菌、大芬戈爾德菌、嗜熱鹽鹼厭氧菌、丙酸互營細菌、喜溫嗜酸硫桿菌、嗜酸氧化亞鐵硫桿菌、紅色硫黃細菌、海洋桿菌屬、嗜鹽亞硝化球菌、瓦氏亞硝化球菌、遊海假交替單胞菌、消旋纖線桿菌、調查甲烷鹽菌、多變魚腥藻、泡沬節球藻、念珠藻屬、極大節旋藻、純頂節旋藻、節旋藻屬、鞘絲藻屬、原形微鞘藻、顫藻屬、運動石袍菌、非洲棲熱腔菌、巴氏鏈球菌、灰色奈瑟菌、紅嘴鷗彎曲桿菌、食清潔劑細小棒菌、白喉棒狀桿菌、胺基酸球菌屬、毛螺科菌ND2006及海洋無核綠藻。
在一些實施例中，Cas核酸酶係來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自新兇手弗朗西斯氏菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。在其他實施例中，Cas核酸酶係來自以下之Cpf1核酸酶：土倫病弗朗西斯氏菌、 毛螺科菌、 亨氏丁酸弧菌、 異域門菌、 Parcubacteria菌、 密斯氏菌屬、 胺基酸球菌屬、 產甲烷古菌念珠菌、 挑剔真桿菌、 牛眼莫拉氏菌、 稻田氏鉤端螺旋體、 狗口腔紅棕色單胞菌、 解糖腖普雷沃菌或獼猴卟啉單胞菌。在某些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬或毛螺菌科之Cpf1核酸酶。
在一些實施例中，gRNA與RNA引導之DNA結合劑一起稱作核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑係Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA與Cas核酸酶一起稱作Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含I型、II型或III型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白。在一些實施例中，gRNA與Cas9一起稱作Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域切割非靶DNA鏈，且HNH結構域切割DNA之靶鏈。在一些實施例中，Cas9蛋白包含一個以上RuvC結構域及/或一個以上HNH結構域。在一些實施例中，Cas9蛋白係野生型Cas9。在組合物、用途及方法實施例中之每一者中，Cas誘導靶DNA中之雙鏈斷裂。
野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域切割非靶DNA鏈，且HNH結構域切割DNA之靶鏈。在一些實施例中，Cas9核酸酶包含一個以上RuvC結構域及/或一個以上HNH結構域。在一些實施例中，Cas9核酸酶係野生型Cas9。在一些實施例中，Cas9能誘導靶DNA中之雙鏈斷裂。在某些實施例中，Cas核酸酶可切割dsDNA，其可切割dsDNA之一條鏈，或其可無DNA裂解酶或切口酶活性。實例性Cas9胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 203。包括起始及終止密碼子之實例性Cas9 mRNA ORF序列提供為SEQ ID NO: 204。適於包括於融合蛋白中之實例性Cas9 mRNA編碼序列提供為SEQ ID NO: 210。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白質之一個結構域或區域由不同蛋白質之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶結構域可經來自不同核酸酶(例如Fok1)之結構域置換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有單鏈切口酶活性，亦即可切割一條DNA鏈以產生單鏈斷裂，亦稱為「切口」。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶係一種在dsDNA中產生切口、亦即切割DNA雙螺旋之一條鏈但非另一鏈的酶。在一些實施例中，Cas切口酶係Cas核酸酶之一種形式(例如，如上所論述之Cas核酸酶)，其中內核核溶解活性位點因(例如)催化結構域之一或多個變化(例如點突變)而不活化。關於Cas切口酶及實例性催化結構域變化之論述，參見(例如)美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶(例如Cas9切口酶)具有不活化之RuvC或HNH結構域。實例性Cas9切口酶胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 206。包括起始及終止密碼子之實例性Cas9切口酶mRNA ORF序列提供為SEQ ID NO: 207。適於包括於融合蛋白中之實例性Cas9切口酶mRNA編碼序列提供為SEQ ID NO: 211。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，試劑蛋白可經修飾，使得核酸酶結構域中之一者突變或完全或部分缺失，以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH結構域之切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白核酸酶結構域內之保守胺基經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之實例性胺基酸取代包括D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如，參見Zetsche等人 (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含HNH或HNH樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶結構域中之實例性胺基酸取代包括E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如，參見Zetsche等人 (2015)。其他實例性胺基酸取代包括D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西斯氏菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列(UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。
在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA與一對分別與靶序列之正義鏈及反義鏈互補之引導RNA組合提供。在此實施例中，引導RNA將切口酶引導至靶序列並藉由在靶序列之相對鏈上產生切口引入DSB (亦即，雙切口形成)。在一些實施例中，使用雙切口形成可提高特異性並減少脫靶效應。在一些實施例中，切口酶與兩個靶向DNA之相反鏈之單獨引導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶與經選擇以緊密靠近之兩個單獨之引導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑無裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上無催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽係dCas9多肽。在一些實施例中，無裂解酶及切口酶活性或dCas DNA結合多肽之RNA引導之DNA結合劑係Cas核酸酶之一種形式(例如，上文論述之Cas核酸酶)，其中其內核溶解活性位點因其催化結構域之一或多個變化(例如，點突變)不活化。例如，參見US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。實例係dCas9胺基酸序列提供為SEQ ID NO: 208。包括起始及終止密碼子之實例性Cas9 mRNA ORF序列提供為SEQ ID NO: 209。適於包括於融合蛋白中之實例性Cas9 mRNA編碼序列提供為SEQ ID NO: 212。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包含一或多個異源功能結構域(例如，係或包含融合多肽)。
在一些實施例中，異源功能結構域可促進RNA引導之DNA結合劑轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情況下，NLS可在RNA引導之DNA結合劑序列之N-末端或C-末端連接。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS在C-末端融合。NLS亦可插入RNA引導之DNA結合劑序列中。在其他實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個以上NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下，兩個NLS可為相同的(例如，兩個SV40 NLS)或不同的。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑與在羧基末端連接之兩個SV40 NLS序列融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個在N-末端連接且一個在C-末端連接。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單分序列，例如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 274)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 275)。在一些實施例中，NLS可為二分序列，例如核胞漿素之NLS、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 276)。在具體實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 274) NLS可在RNA引導之DNA結合劑之C-末端連接。視情況在融合位點包括一或多個連接體。在一些實施例中，根據上述實施例之一或多個NLS與一或多個額外異源功能結構域(例如下文所述異源功能結構域中之任一者)組合存於RNA引導之DNA結合劑中。
在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠修改RNA引導之DNA結合劑之細胞內半衰期。在一些實施例中，可增加RNA引導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，可減少RNA引導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠增加RNA引導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠降低RNA引導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可用作蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶(例如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或卡配因蛋白酶)介導。在一些實施例中，異源功能結構域可包含PEST序列。在一些實施例中，可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣修飾劑(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15(ISG15))、泛素相關之修飾劑-1 (URM1)、神經元-前體-細胞表現之發育上調之蛋白-8(NEDD8，在啤酒酵母(S. cerevisiae)中亦稱為Rub1)、人類白血球抗原F相關(FAT10)、自體吞噬-8 (ATG8)及自體吞噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素倍數修飾劑-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能結構域可為標記結構域。標記結構域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、表位標識及報導基因序列。在一些實施例中，標記結構域可為螢光蛋白。適宜螢光蛋白之非限制性實例包括綠螢光蛋白(例如，GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃螢光蛋白(例如，YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍螢光蛋白(例如，EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青螢光蛋白(例如，ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅螢光蛋白(例如，mKate、mKate2、mPlum、DsRed單體、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-單體、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他適宜螢光蛋白。在其他實施例中，標記結構域可為純化標籤及/或表位標識。非限制性實例性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和性純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚-His及攜鈣蛋白。非限制性實例性報導基因包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在額外實施例中，異源功能結構域可將RNA引導之DNA結合劑靶向特定細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能結構域可將RNA引導之DNA結合劑靶向粒線體。
在其他實施例中，異源功能結構域可為效應結構域。當RNA引導之DNA結合劑引導至其靶序列時，例如當Cas核酸酶由gRNA引導至靶序列時，效應結構域可修飾或影響靶序列。在一些實施例中，效應結構域可選自核酸結合結構域、核酸酶結構域(例如，非Cas核酸酶結構域)、後生修飾結構域、轉錄活化結構域或轉錄阻遏結構域。在一些實施例中，異源功能結構域係核酸酶，例如FokI核酸酶。參見，例如，美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能結構域係轉錄活化劑或阻遏劑。參見(例如) Qi等人, 「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,」Cell 152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人, 「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,」Nat. Methods 10:973-6 (2013)；Mali等人, 「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,」Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013)；Gilbert等人, 「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,」Cell 154:442-51 (2013)。因此，RNA引導之DNA結合劑基本上變成轉錄因子，其可使用引導RNA引導至結合期望靶序列。
D. gRNA 之效能之測定
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，測定gRNA之效能。在一些實施例中，gRNA與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白)一起表現。在一些實施例中，gRNA遞送至細胞系或在細胞系中表現，該細胞系已經穩定地表現RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白)。在一些實施例中，gRNA作為RNP之一部分遞送至細胞。在一些實施例中，將gRNA與編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶)之mRNA一起遞送至細胞。
如本文所述，使用本文揭示之RNA引導之DNA核酸酶及引導RNA可導致DNA中之雙鏈斷裂，在藉由細胞機制修復時，其可以插入/缺失(插入或缺失)突變之形式產生誤差。由於插入或缺失導致之許多突變改變閱讀框或引入過早終止密碼子，且因此產生非功能性蛋白。
在一些實施例中，基於活體外模型測定特定gRNA之效能。在一些實施例中，活體外模型係穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，活體外模型係HUH7人類肝癌細胞。在一些實施例中，活體外模型係HepG2細胞。在一些實施例中，活體外模型係原代人類肝細胞。在一些實施例中，活體外模型係原代食蟹猴肝細胞。關於使用原代人類肝細胞，可使用市售原代人類肝細胞以提供實驗之間更大一致性。在一些實施例中，藉由(例如)分析經Cas9 mRNA及引導RNA活體外轉染之原代人類肝細胞的基因體DNA測定在活體外模型中(例如，在原代人類肝細胞中)發生缺失或插入之脫靶位點的數目。在一些實施例中，該測定包含分析經Cas9 mRNA、引導RNA及供體寡核苷酸活體外轉染之原代人類肝細胞的基因體DNA。該等測定之實例性程序提供於以下工作實例中。
在一些實施例中，針對gRNA選擇過程，跨多個活體外細胞模型測定特定gRNA之效能。在一些實施例中，實施具有所選gRNA之數據之細胞系比較。在一些實施例中，實施多個細胞模型之交叉篩選。
在一些實施例中，基於活體內模型測定特定gRNA之效能。在一些實施例中，活體內模型係齧齒動物模型。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類TTR 基因(其可為突變人類TTR 基因)之小鼠。在一些實施例中，活體內模型係非人類靈長類動物，例如食蟹猴。
在一些實施例中，藉由TTR之編輯百分比量測引導RNA之效能。在一個實施例中，將TTR之編輯百分比與(例如)在活體外模型之情形下在細胞培養基中或在活體內模型之情形下在血清或組織中實現TTR蛋白之減弱所必需之編輯百分比進行比較。
在一些實施例中，藉由在靶細胞類型之基因體內之脫靶序列處之插入或缺失之數目及/或頻率量測引導RNA之效能。在一些實施例中，提供有效引導RNA，其在細胞群體中及/或相對於靶位點處插入或缺失產生之頻率以極低頻率(例如，＜5%)在脫靶位點處產生插入或缺失。因此，本揭示內容提供引導RNA，其在靶細胞類型(例如，肝細胞)中不展現脫靶插入或缺失形成，或在細胞群體中及/或相對於靶位點處插入或缺失產生之頻率產生＜5%之脫靶插入或缺失頻率。在一些實施例中，本揭示內容提供引導RNA，其在靶細胞類型(例如，肝細胞)中不展現任何脫靶插入或缺失形成。在一些實施例中，提供引導RNA，其在小於5個脫靶位點產生插入或缺失，例如如藉由本文所述之一或多種方法所評估。在一些實施例中，提供引導RNA，其在小於或等於4、3、2或1個脫靶位點產生插入或缺失，例如如藉由本文所述之一或多種方法所評估。在一些實施例中，脫靶位點不出現在靶細胞(例如，肝細胞)基因體中之蛋白質編碼區中。
在一些實施例中，檢測基因編輯事件，例如在靶DNA中形成插入/缺失(「插入或缺失」)突變及同源性定向修復(HDR)事件利用帶有標記引子之線性擴增且分離標記之擴增產物(下文中稱為「LAM-PCR」或「線性擴增(LA)」方法)。
在一些實施例中，該方法包含自細胞分離細胞DNA，該細胞已經誘導以具有雙鏈斷裂(DSB)且視情況其已提供有HDR模板以修復DSB；實施帶有標記之引子之DNA之線性擴增的至少一個循環；分離包含標籤之線性擴增產物，藉此丟棄用未標記之引子擴增之任何擴增產物；視情況進一步擴增分離之產物；及分析線性擴增產物或進一步擴增之產物，以確定存在或不存在編輯事件，例如靶DNA中之雙鏈斷裂、插入、缺失或HDR模板序列。在一些情況下，編輯事件可量化。如本文所用之量化及諸如此類(包括在HDR及非HDR編輯事件(例如插入或缺失)之上下文中)包括檢測群體中之編輯事件之頻率及/或類型。
在一些實施例中，僅執行一個線性擴增循環。
在一些情況下，標記之引子包含分子條碼。在一些實施例中，標記之引子包含分子條碼，且僅執行一個線性擴增循環。
在一些實施例中，分析步驟包含對線性擴增產物或進一步擴增之產物進行定序。定序可包含熟習此項技術者已知之任何方法，包括將線性擴增產物或進一步擴增之產物次世代定序及選殖至質體中並對質體或質體之一部分進行定序。在其他態樣中，分析步驟包含對線性擴增產物或進一步擴增之產物實施數位PCR (dPCR)或液滴數位PCR (ddPCR)。在其他情況下，分析步驟包含使線性擴增產物或進一步擴增之產物與經設計以鑑別包含HDR模板序列之DNA之核酸探針接觸並檢測與線性擴增產物或進一步擴增之產物結合之探針。在一些實施例中，該方法進一步包含確定靶DNA中HDR模板之位置。
在某些實施例中，該方法進一步包括測定靶DNA中插入位點之序列，其中插入位點係HDR模板納入靶DNA中之位置，且其中插入位點可包括一些靶DNA序列及一些HDR模板序列。
在一些實施例中，實施帶有標記之引子之靶DNA之線性擴增1-50個循環、1-60個循環、1-70個循環、1-80個循環、1-90個循環或1-100個循環。
在一些實施例中，帶有標記之因子之靶DNA之線性擴增包含變性步驟以分離DNA雙鏈體、退火步驟以容許因子結合，及伸長步驟。在一些實施例中，線性擴增係等溫的(不需要溫度改變)。在一些實施例中，等溫線性擴增係環介導等溫擴增(LAMP)、鏈置換擴增(SDA)、解旋酶依賴性擴增或切口酶擴增反應。
在一些實施例中，標記之引子退火至靶DNA至少50、至少60、至少70、至少80、至少90、至少100、至少110、至少120、至少130、至少140、至少150、至少160、至少170、至少180、至少190、至少200、至少210、至少220、至少230、至少240、至少250、至少260、至少270、至少280、至少290、至少300、至少1,000、至少5,000或至少10,000個核苷酸遠離預計編輯事件位置(例如，插入、缺失或模板插入位點)。
在一些實施例中，標記之引子包含分子條碼。 在一些實施例中，分子條碼包含與靶DNA不互補之序列。在一些實施例中，分子條碼包含6、8、10或12個核苷酸。
在一些實施例中，引子上之標籤係生物素、鏈黴抗生物素蛋白、長葉毛地黃配質、DNA序列或螢光黃異硫氰酸鹽(FITC)。
在一些實施例中，使用對引子上之標籤具有特異性之捕獲試劑分離線性擴增產物。在一些實施例中，捕獲試劑係在珠粒、固體支持物、基質或管柱上。在一些實施例中，分離步驟包含使線性擴增產物與對引子上之標籤具有特異性之捕獲試劑接觸。在一些實施例中，捕獲試劑係生物素、鏈黴抗生物素蛋白、長葉毛地黃配質、DNA序列或螢光黃異硫氰酸鹽(FITC)。
在一些實施例中，標籤係生物素，且捕獲試劑係鏈黴抗生物素蛋白。在一些實施例中，標籤係鏈黴抗生物素蛋白，且捕獲試劑係生物素。在一些實施例中，標籤係在引子之5’末端、引子之3’末端或引子內部。在一些實施例中，在分離步驟之後移除標籤及/或捕獲試劑。在一些實施例中，不移除標籤及/或捕獲試劑，且在標籤及/或捕獲存在下實施進一步擴增及分析步驟。
在一些實施例中，進一步擴增係非線性的。 在一些實施例中，進一步擴增係數位PCR、qPCR或RT-PCR。在一些實施例中，定序係次世代定序(NGS)。
在一些實施例中，靶DNA係基因體或粒線體。在一些實施例中，靶DNA係原核或真核細胞之基因體DNA。在一些實施例中，靶DNA係哺乳動物。靶DNA可來自非分裂細胞或分裂細胞。在一些實施例中，靶DNA可來自原代細胞。在一些實施例中，靶DNA來自複製細胞。
在一些情況下，在線性擴增之前剪切細胞DNA。在一些實施例中，剪切之DNA之平均大小在0.5 kb與20 kb之間。在一些情況下，將細胞DNA剪切至平均大小為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.25、2.5、2.75、3.0、3.25、3.5、3.75、4.0、4.25、4.5、4.75、5.0、5.25、5.5、5.75、6.0、6.25、6.5、6.75、7.0、7.25、7.5、7.75、8.0、8.25、8.5、8.75、9.0、9.25、9.5、9.75、10.0、10.25、10.5、10.75、11.0、11.25、11.5、11.75、12.0、12.25、12.5、12.75、13.0、13.25、13.5、13.75、14.0、14.25、14.5、14.75、15.0、15.25、15.5、15.75、16.0、16.25、16.5、16.75、17.0、17.25、17.5、17.75、18.0、18.25、18.5、18.75、19.0、19.25、19.5、19.75或20.0 kb。在一些情況下，將細胞DNA剪切至平均大小為約1.5 kb。
在一些實施例中，藉由TTR之分泌量測引導RNA之效能。在一些實施例中，使用利用細胞培養基或血清之酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析量測TTR之分泌。在一些實施例中，在用於量測編輯之相同活體或活體內系統或模型中量測TTR之分泌。在一些實施例中，在原代人類肝細胞中量測TTR之分泌。在一些實施例中，在HUH7細胞中量測TTR之分泌。在一些實施例中，在HepG2細胞中量測TTR之分泌。
ELISA分析法通常為熟習此項技術者所知，且可設計用於測定血清TTR含量。在一個實例性實施例中，收集血液並分離血清。可使用小鼠前白蛋白(甲狀腺素運載蛋白) ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄OKIA00111)或用於量測人類TTR之類似套組測定總TTR血清含量。若沒有套組可用，則可使用預先塗佈有特定針對所量測TTR之捕獲抗體的分析盤發展成ELISA。隨後在洗滌之前，先讓分析盤於室溫下培育一段時間。添加酶-抗TTR抗體結合物並培育。移除未結合之抗體結合物，並在添加與酶反應之產色受質溶液之前先洗滌分析盤。在適當分析盤讀數儀上，在針對所用酶及受質特有之吸光度下讀取分析盤。
在一些實施例中，由細胞(包括彼等來自組織之細胞)中TTR之量量測gRNA之效能。在一些實施例中，使用西方墨點量測細胞中TTR之量。在一些實施例中，所用細胞係HUH7細胞。在一些實施例中，所用細胞係原代人類肝細胞。在一些實施例中，所用細胞係自動物獲得之原代細胞。在一些實施例中，將TTR之量與甘油醛3-磷酸酯去氫酶GAPDH (管家基因)之量進行比較，以控制細胞數之變化。
III. LNP 調配物及 ATTR 之治療
在一些實施例中，提供一種誘導TTR 基因內之雙鏈斷裂(DSB)之方法，其包括投與一種組合物，其包含含有SEQ ID No: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA的引導RNA。在一些實施例中，投與包含SEQ ID No: 5-82中任一種或多種引導序列的gRNA，以誘導TTR 基因中之DSB。引導RNA可與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))之mRNA或載體一起投與。
在一些實施例中，提供一種修飾TTR 基因之方法，其包括投與一種組合物，其包含含有SEQ ID No: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA之引導RNA。在一些實施例中，投與包含SEQ ID No: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA的gRNA，以修飾TTR 基因。引導RNA可與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))之mRNA或載體一起投與。
在一些實施例中，提供治療ATTR之方法，其包括投與包含含有SEQ ID NO: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA之引導RNA的組合物。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA的gRNA以治療ATTR。引導RNA可與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))之mRNA或載體一起投與。
在一些實施例中，提供減少TTR血清濃度之方法，其包含投與包含含有SEQ ID NO: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA之引導RNA的組合物。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA的gRNA以減少或預防TTR在澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中累積。gRNA可與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))之mRNA或載體一起投與。
在一些實施例中，提供減少或預防TTR在個體之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中之累積的方法，其包含投與包含含有SEQ ID NO: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA之引導RNA的組合物。在一些實施例中，提供減少或預防TTR在個體之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中累積的方法，其包含投與包含SEQ ID No: 87-113中任一種或多種sgRNA的組合物。在一些實施例中，投與包含SEQ ID NO: 5-82中任一種或多種引導序列或SEQ ID No: 87-124中任一種或多種sgRNA的gRNA以減少或預防TTR在澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中之累積。gRNA可與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶(例如Cas9))之mRNA或載體一起投與。
在一些實施例中，包含表1之引導序列之gRNA或來自表2之一或多個sgRNA與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶)一起誘導DSB，且修復期間之非同源末端接合(NHEJ)導致TTR 基因突變。在一些實施例中，NHEJ導致核苷酸之缺失或插入，其誘導TTR 基因中之框移或無義突變。
在一些實施例中，投與本發明之引導RNA (例如，在本文提供之組合物中)降低個體中TTR之含量(例如，血清含量)，且因此防止TTR在澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中之累積及聚集。
在一些實施例中，減少或預防TTR在個體之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中之累積包含減少或預防個體之一或多個組織(例如胃、結腸或神經組織)中之TTR沈積。在一些實施例中，神經組織包含坐骨神經或背根神經節。在一些實施例中，在胃、結腸、背根神經節及坐骨神經中之兩者、三者或四者中，TTR沈積減少。可使用生檢樣本、例如使用免疫染色測定給定組織中之沈積程度。在一些實施例中，減少或預防TTR在個體之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中之累積及/或減少或預防TTR沈積係基於降低血清TTR含量達一段時間來推斷。如實例中所論述，已發現，根據本文提供之方法及用途之減少血清TTR含量可導致自組織(例如上文及實例中論述之彼等)清除沈積之TTR，例如如投與組合物後8週所量測。
在一些實施例中，個體係哺乳動物。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體係牛、豬、猴、羊、狗、貓、魚或家禽。
在一些實施例中，提供包含表1中任一種或多種引導序列或表2之一或多種sgRNA的引導RNA(例如，在本文提供之組合物中)的用途，其用於製備用於治療患有ATTR之人類個體的藥劑。
在一些實施例中，靜脈內投與引導RNA、組合物及調配物。在一些實施例中，將引導RNA、組合物及調配物投與至肝循環中。
在一些實施例中，包含本文提供之引導RNA之組合物的單一投與足以敲低突變蛋白之表現。在一些實施例中，包含本文提供之引導RNA之組合物的單一投與足以剔除細胞群體中突變蛋白之表現。在其他實施例中，包含本文提供之引導RNA之組合物的一次以上投與可經由累積效應最大化編輯。舉例而言，本文提供之組合物可投與2、3、4、5或更多次，例如2次。投與可分開以下範圍內之時間段：例如1天至2年，例如1至7天、7至14天、14天至30天、30天至60天、60天至120天、120天至183天、183天至274天、274天至366天或366天至2年。
在一些實施例中，組合物係以如下範圍內之有效量投與：0.01至10 mg/kg (mpk)，例如0.01至0.1 mpk、0.1至0.3 mpk、0.3至0.5 mpk、0.5至1 mpk、1至2 mpk、2至3 mpk、3至5 mpk、5至10 mpk，或0.1、0.2、0.3、0.5、1、2、3、5或10 mpk。
在一些實施例中，在遞送後1年、2年、3年、4年、5年或10年觀察到本發明之組合物之治療效能。在一些實施例中，藉由量測治療之前及之後TTR之血清含量來評估本發明之組合物的治療效能。在1週、2週、3週、4週、2個月、3個月、4個月、5個月、6個月、7個月、8個月、9個月、10個月時或在11個月時觀察到經由TTR之血清含量降低評估之組合物的治療效能。
在一些實施例中，治療減慢或停止疾病進展。
在一些實施例中，治療減慢或停止FAP之進展。在一些實施例中，治療導致感覺運動神經病變或自主神經病變之症狀改良、穩定或減慢其變化。
在一些實施例中，治療導致FAC之症狀改良、穩定或減慢其變化。在一些實施例中，治療導致限制性心肌病或鬱血性心臟衰竭之症狀改良、穩定或減慢其變化。
在一些實施例中，藉由個體增加之存活時間來量測治療效能。
在一些實施例中，藉由感覺動作或自主神經病變之症狀之改良或減慢其進展來量測治療效能。在一些實施例中，藉由移動身體區域或在身體任何區域中有感覺之能力的增加或減慢該能力降低來量測治療效能。在一些實施例中，藉由吞嚥、呼吸、使用手臂、手、腿或腳或走路之能力的改良或減慢該能力降低來量測治療效能。在一些實施例中，藉由神經痛之改良或減慢其進展來量測治療效能。在一些實施例中，神經痛之特徵在於疼痛、灼熱、麻刺感或異常感覺。在一些實施例中，藉由體位性低血壓、眩暈、胃腸運動障礙、膀胱功能障礙或性功能障礙之改良或減慢其增加來量測治療效能。在一些實施例中，藉由虛弱之改良或減慢其進展來量測治療效能。在一些實施例中，使用肌電圖、神經傳導測試或患者報告之結果來量測治療效能。
在一些實施例中，藉由鬱血性心臟衰竭或CHF之改良或減慢其進展來量測治療效能。在一些實施例中，藉由呼吸短促、呼吸困難、疲勞或踝、足、腿、腹部或頸部靜脈腫脹之減少或減慢其增加來量測治療效能。在一些實施例中，藉由體內流體積聚之改良或減慢其進展來量測治療效能，該體內流體積聚可藉由諸如增重、尿頻或夜間咳嗽等量度來評估。在一些實施例中，使用心臟生物標記測試(例如B型利鈉肽[BNP]或N-末端前b型利鈉肽[NT-proBNP])、肺功能測試、胸部x射線或心電圖來量測治療效能。
A . 組合療法
在一些實施例中，本發明包含組合療法，該組合療法包含含有表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA之任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)以及適於緩和ATTR之症狀之額外療法。
在一些實施例中，ATTR之額外療法係感覺動作或自主神經病變之治療。在一些實施例中，感覺動作或自主神經病變之治療係非類固醇消炎藥、抗抑鬱藥、抗痙攣藥、抗心律失常藥或麻醉劑。在一些實施例中，抗抑鬱藥係三環劑或血清素-去甲腎上腺素再攝取抑制劑。在一些實施例中，抗抑鬱藥係阿米替林(amitriptyline)、度洛西汀(duloxetine)或萬拉法辛(venlafaxine)。在一些實施例中，抗痙攣劑係加巴噴丁(gabapentin)、普瑞巴林(pregabalin)、托吡酯(topiramate)或卡巴馬平(carbamazepine)。在一些實施例中，感覺運動神經病變之額外療法係透皮電神經刺激。
在一些實施例中，ATTR之額外療法係限制性心肌病或鬱血性心臟衰竭(CHF)之治療。在一些實施例中，CHF之治療係ACE抑制劑、醛固酮拮抗劑、血管收縮肽受體阻斷劑、β阻斷劑、地高辛(digoxin)、利尿劑或硝酸異山梨酯/鹽酸肼苯噠嗪。在一些實施例中，ACE抑制劑係依那普利(enalapril)、卡托普利(captopril)、雷米普利(ramipril)、培哚普利(perindopril)、咪達普利(imidapril)或喹那普利(quinapril)。在一些實施例中，醛固酮拮抗劑係依普利酮(eplerenone)或螺內酯(spironolactone)。在一些實施例中，血管收縮肽受體阻斷劑係阿齊沙坦(azilsartan)、坎地沙坦(cadesartan)、依普羅沙坦(eprosartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(losartan)、奧美沙坦(olmesartan)、替米沙坦(telmisartan)或纈沙坦(valsartan)。在一些實施例中，β阻斷劑係醋丁洛爾(acebutolol)、阿替洛爾(atenolol)、比索洛爾(bisoprolol)、美托洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、奈必洛爾(nebivolol)或普萘洛爾(propranolol)。在一些實施例中，利尿劑係氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、氫氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、吲達帕胺(indapamide)、美托拉宗(metolazone)、布美他尼(bumetanide)、呋塞米(furosemide)、托塞米(torsemide)、阿米洛利(amiloride)或胺苯蝶啶(triameterene)。
在一些實施例中，組合療法包含含有表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA之任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)以及靶向TTR或突變TTR之siRNA。在一些實施例中，siRNA係能夠進一步減少或消除野生型或突變TTR表現之任何siRNA。在一些實施例中，siRNA係藥物帕替司蘭(Patisiran) (ALN-TTR02)或ALN-TTRsc02。在一些實施例中，在包含表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA的任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)之後投與siRNA。在一些實施例中，在用本文提供之任何gRNA組合物治療後定期投與siRNA。
在一些實施例中，組合療法包含含有表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA之任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)以及靶向TTR或突變TTR之反義核苷酸。在一些實施例中，反義核苷酸係任何能夠進一步減少或消除野生型或突變TTR之表現的反義核苷酸。在一些實施例中，反義核苷酸係藥物Inotersen (IONS-TTRRx )。在一些實施例中，在包含表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA的任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)之後投與反義核苷酸。在一些實施例中，在用本文提供之任何gRNA組合物治療後定期投與反義核苷酸。
在一些實施例中，組合療法包含含有表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA之任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)以及促進TTR之正確摺疊之四聚體形式之動力學穩定的小分子穩定劑。在一些實施例中，小分子穩定劑係藥物他發米帝司(tafamidis) (Vyndaqel® )或二氟尼柳(diflunisal)。在一些實施例中，在包含表1中揭示之任一種或多種引導序列或表2中任一種或多種sgRNA的任一gRNA (例如，在本文提供之組合物中)之後投與小分子穩定劑。在一些實施例中，在用本文提供之任何gRNA組合物治療後定期投與小分子穩定劑。
B . gRNA 組合物之遞送
在一些實施例中，單獨或在一或多個載體上編碼之本文所述引導RNA組合物調配於脂質奈米粒子中或經由脂質奈米粒子投與；參見(例如)於2017年3月30日提出申請之標題為「LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS」之PCT/US2017/024973，其全部內容以引用方式併入本文中。熟習此項技術者已知能將核苷酸遞送至個體之任何脂質奈米粒子(LNP)可與本文所述引導RNA以及編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas或Cas9)或RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas或Cas9蛋白自身)的mRNA一起使用。
本文揭示RNA之LNP調配物之各個實施例，包括CRISPR/Cas運送子。該等LNP調配物可包括(i) CCD脂質，例如胺脂質，(ii)中性脂質，(iii)輔助脂質，及(iv)隱密脂質，例如PEG脂質。LNP調配物之一些實施例包括「胺脂質」，以及輔助脂質、中性脂質及隱密脂質(例如PEG脂質)。「脂質奈米粒子」意指包含複數個(即一個以上)藉由分子間力彼此物理締合之脂質分子的粒子。
CCD脂質
用於遞送CRISPR/Cas mRNA及引導RNA組分至肝細胞之脂質組合物包含CCD脂質。
在一些實施例中，CCD脂質係脂質A，其係(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate)，亦稱作(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯(3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)。脂質A可繪示為：
。
脂質A可根據WO2015/095340 (例如，第84-86頁)合成。
在一些實施例中，CCD脂質係脂質B，其係雙(癸酸)((5-((二甲基胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯(((5-((dimethylamino)methyl)-1,3-phenylene)bis(oxy))bis(octane-8,1-diyl)bis(decanoate))，亦稱作雙(癸酸)((5-((二甲基胺基)甲基)-1,3-伸苯基)雙(氧基))雙(辛烷-8,1-二基)酯(((5-((dimethylamino)methyl)-1,3-phenylene)bis(oxy))bis(octane-8,1-diyl) bis(decanoate))。脂質B可繪示為：
。
脂質B可根據WO2014/136086 (例如，第107-09頁)合成。
在一些實施例中，CCD脂質係脂質C，其係(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-雙(十八-9,12-二烯酸)2-((4-(((3-(二甲基胺基)丙氧基)羰基)氧基)十六醯基)氧基)丙烷-1,3-二基酯。脂質C可繪示為：
。
在一些實施例中，CCD脂質係脂質D，其係3-辛基十一酸3-(((3-(二甲基胺基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛醯基氧基)十三烷基酯。
脂質D可繪示為：
。
脂質C及脂質D可根據WO2015/095340合成。
CCD脂質亦可為脂質A、脂質B、脂質C或脂質D之等效物。在某些實施例中，CCD脂質係脂質A之等效物、脂質B之等效物、脂質C之等效物或脂質D之等效物。
胺脂質
在一些實施例中，用於遞送生物活性劑之LNP組合物包含「胺脂質」，其定義為脂質A、脂質B、脂質C、脂質D或脂質A之等效物(包括脂質A之縮醛類似物)、脂質B之等效物、脂質C之等效物及脂質D之等效物。
在一些實施例中，胺脂質係脂質A，其係(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate)，亦稱作(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基酯(3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)。脂質A可繪示為：
。
脂質A可根據WO2015/095340 (例如第84-86頁)合成。在某些實施例中，胺脂質係脂質A之等效物。
在某些實施例中，胺脂質係脂質A之類似物。在某些實施例中，脂質A類似物係脂質A之縮醛類似物。在特定LNP組合物中，縮醛類似物係C4-C12縮醛類似物。在一些實施例中，縮醛類似物係C5-C12縮醛類似物。在額外實施例中，縮醛類似物係C5-C10縮醛類似物。在其他實施例中，縮醛類似物係選自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11及C12縮醛類似物。
適用於本文所述LNP之胺脂質在活體內生物可降解。胺脂質具有低毒性(例如，在大於或等於10 mg/kg之量下，在動物模型中耐受，而無不良效應)。在某些實施例中，包含胺脂質之LNP包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少75%之胺脂質的彼等。在某些實施例中，包含胺脂質之LNP包括其中在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少50%之mRNA或gRNA的彼等。在某些實施例中，包含胺脂質之LNP包括其中(例如)藉由量測脂質(例如胺脂質)、RNA (例如mRNA)或其他組分在8、10、12、24或48小時或3、4、5、6、7或10天內自血漿清除至少50%之LNP的彼等。在某些實施例中，量測LNP之脂質囊封對游離脂質、RNA或核酸組分。
可如文獻中所述量測脂質清除率。參見Maier, M.A.等人 Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Therapeutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 (「Maier」)。舉例而言，在Maier中，向六至八週齡之雄性C57Bl/6小鼠經由側尾靜脈藉由靜脈內濃注注射投與0.3 mg/kg之含有靶向螢光素酶之siRNA的LNP-siRNA系統。在投藥後0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、24、48、96及168小時收集血液、肝及脾樣本。在組織收集之前用鹽水灌注小鼠並處理血液樣本以獲得血漿。所有樣本皆經處理且藉由LC-MS分析。此外，Maier闡述在投與LNP-siRNA調配物後評估毒性之程序。舉例而言，經由單次靜脈內濃注注射以5 mL/kg之劑量體積向雄性Sprague-Dawley大鼠以0、1、3、5及10 mg/kg(5隻動物/組)投與靶向螢光素酶之siRNA。24小時後，自有意識動物之頸靜脈獲得約1 mL血液，且分離血清。在投藥後72小時，對所有動物進行安全死進行驗屍。評估臨床體徵、體重、血清化學、器官重量及組織病理學。儘管Maier闡述用於評估siRNA-LNP調配物之方法，但該等方法可應用於評估投與本發明之LNP組合物之清除率、藥物動力學及毒性。
胺脂質導致清除率增加。在一些實施例中，清除率係脂質清除率，例如自血液、血清或血漿清除胺脂質之速率。在一些實施例中，清除率係RNA清除率，例如自血液、血清或血漿清除mRNA或gRNA之速率。在一些實施例中，清除率係自血液、血清或血漿清除LNP之速率。在一些實施例中，清除率係自組織(例如肝組織或脾組織)清除LNP之速率。在某些實施例中，高清除率導致安全性概況而無顯著不良效應。胺脂質減少循環及組織中之LNP累積。在一些實施例中，循環及組織中LNP累積之減少導致安全性概況，而無顯著不良效應。
本發明之胺脂質可為可電離的，此取決於其所處之介質之pH。舉例而言，在微酸性介質中，胺脂質可經質子化並因此帶正電荷。相反，在略微鹼性之介質(例如pH約為7.35之血液)中，胺脂質可未經質子化，且因此不帶電荷。在一些實施例中，本發明之胺脂質可在至少約9之pH下質子化。在一些實施例中，本發明之胺脂質可在至少約10之pH下質子化。
胺脂質帶電荷之能力與其固有pKa有關。舉例而言，本發明之胺脂質可各自獨立地具有約5.8至約6.2之範圍內之pKa。舉例而言，本發明之胺脂質可各自獨立地具有約5.8至約6.5之範圍內之pKa。此可為有利的，此乃因已發現，具有約5.1至約7.4範圍之pKa之陽離子脂質對於將運送子活體內遞送(例如)肝係有效的。此外，已發現，具有約5.3至約6.4範圍內之pKa之陽離子脂質對於活體內遞送至(例如)腫瘤係有效的。例如，參見WO2014/136086。
額外脂質
適用於本揭示內容之脂質組合物中之「中性脂質」包括(例如)多種中性、不帶電荷或兩性離子脂質。適用於本發明中之中性磷脂之實例包括(但不限於) 5-十七烷基苯-1,3-二醇(間苯二酚)、二棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(DPPC)、二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)、磷酸膽鹼(DOPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、磷脂醯膽鹼(PLPC)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DAPC)、磷脂醯乙醇胺(PE)、卵磷脂醯膽鹼(EPC)、二月桂醯基磷脂醯膽鹼(DLPC)、二肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(DMPC)、1-肉豆蔻醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(MPPC)、1-棕櫚醯基-2-肉豆蔻醯基磷脂醯膽鹼(PMPC)、1-棕櫚醯基-2-硬脂醯基磷脂醯膽鹼(PSPC)、1,2-二花生醯基-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DBPC)、1-硬脂醯基-2-棕櫚醯基磷脂醯膽鹼(SPPC)、l,2-二(二十烯醯基)-sn-甘油-3-磷酸膽鹼(DEPC)、棕櫚醯基油醯磷脂醯膽鹼(POPC)、溶血磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯乙醇胺(DOPE)、二亞麻油醯氧基磷脂醯膽鹼二硬脂醯基磷脂醯乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)、二棕櫚醯基磷脂醯乙醇胺(DPPE)、棕櫚醯基油醯磷脂醯乙醇胺(POPE)、溶血磷脂醯乙醇胺及其組合。在一個實施例中，中性磷脂可選自由二硬脂醯基磷脂醯膽鹼(DSPC)及二肉豆蔻醯基磷脂醯乙醇胺(DMPE)組成之群。在另一實施例中，天然磷脂可為二硬脂醯基磷酯醯膽鹼(DSPC)。
「輔助脂質」包括類固醇、固醇及烷基間苯二酚。適用於本發明中之輔助脂質包括(但不限於)膽固醇、5-十七烷基間苯二酚及半琥珀酸膽固醇酯。在一個實施例中，輔助脂質可為膽固醇。在一個實施例中，輔助脂質可為半琥珀酸膽固醇酯。
「隱密脂質」係改變奈米粒子可於活體內(例如在血液中)存在之時間長度的脂質。隱密脂質可藉由(例如)減少粒子聚集及控制粒徑有助於調配過程。本文所用隱密脂質可調節LNP之藥物動力學性質。適用於本揭示內容之脂質組合物中之隱密脂質包括(但不限於)具有連接至脂質部分之親水頭基之隱密脂質。適用於本發明之脂質組合物之隱密脂質及關於該等脂質之生物化學之資訊可參見Romberg等人, Pharmaceutical Research，第25卷，第1期，2008，第 55-71頁及Hoekstra等人, Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52。額外適宜PEG脂質揭示於(例如) WO 2006/007712中。
在一個實施例中，隱密脂質之親水首基包含選自基於PEG之聚合物之聚合物部分。隱密脂質可包含脂質部分。在一些實施例中，隱密脂質係PEG脂質。
在一個實施例中，適宜隱密脂質包含選自以下之聚合物部分：基於PEG (有時稱為聚(環氧乙烷)之聚合物、聚(噁唑啉)、聚(乙烯醇)、聚(甘油)、聚(N-乙烯基吡咯啶酮)、聚胺基酸及聚[N-(2-羥基丙基)甲基丙烯醯胺]。
在一個實施例中，PEG脂質包含基於PEG (有時稱作聚(環氧乙烷))之聚合物部分。
PEG脂質進一步包含脂質部分。在一些實施例中，脂質部分可源自二醯基甘油或二醯基咪唑雙醯胺，包括包含具有獨立地包含約C4至約C40飽和或不飽和碳原子之烷基鏈長度的二烷基甘油或二烷基咪唑雙醯胺基團之彼等，其中鏈可包含一或多個官能基，例如醯胺或酯。在一些實施例中，烷基鏈長度包含約C10至C20。二烷基甘油或二烷基甘油醯胺基團可進一步包含一或多個經取代烷基。鏈長度可為對稱的或不對稱的。
除非另外指明，否則如本文所使用之術語「PEG」意指任何聚乙二醇或其他聚伸烷基醚聚合物。在一個實施例中，PEG係乙二醇或環氧乙烷之視情況經取代之直鏈或具支鏈聚合物。在一個實施例中，PEG未經取代。在一個實施例中，PEG經例如一或多個烷基、烷氧基、醯基、羥基或芳基取代。在一個實施例中，該術語包括諸如PEG-聚胺基甲酸酯或PEG-聚丙烯等PEG共聚物(參見例如J. Milton Harris, Poly(ethylene glycol) chemistry: biotechnical and biomedical applications (1992))；在另一實施例中，該術語不包括PEG共聚物。在一個實施例中，PEG之分子量為約130至約50,000，在子實施例中約150至約30,000，在子實施例中約150至約20,000，在子實施例中約150至約15,000，在子實施例中約150至約10,000，在子實施例中約150至約6,000，在子實施例中約150至約5,000，在子實施例中約150至約4,000，在子實施例中約150至約3,000，在子實施例中約300至約3,000，在子實施例中約1,000至約3,000，且在子實施例中約1,500至約2,500。
在某些實施例中，PEG (例如，結合至脂質部分或脂質，例如隱密脂質)係「PEG-2K」，亦稱為「PEG 2000」，其平均分子量為約2,000道爾頓。PEG-2K在本文中由下式(I)表示，其中n為45，此意味著數量平均聚合度包含約45個亞單位。然而，可使用業內已知之其他PEG實施例，包括例如數量平均聚合度包含約23個亞單位(n = 23)及/或68個亞單位(n = 68)之彼等。在一些實施例中，n可在約30至約60之範圍內。在一些實施例中，n可在約35至約55之範圍內。在一些實施例中，n可在約40至約50之範圍內。在一些實施例中，n可在約42至約48之範圍內。在一些實施例中，n可為45。在一些實施例中，R可選自H、經取代烷基及未經取代烷基。在一些實施例中，R可為未經取代烷基。在一些實施例中，R可為甲基。
在本文所述實施例中之任一者中，PEG脂質可選自PEG-二月桂醯基甘油、PEG-二肉豆蔻醯基甘油(PEG-DMG) (目錄號GM-020，來自NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二棕櫚醯基甘油、PEG-二硬脂醯基甘油(PEG-DSPE) (目錄號DSPE-020CN, NOF, Tokyo, Japan)、PEG-二月桂基咪唑雙醯胺、PEG-二肉豆蔻基咪唑雙醯胺、PEG-二棕櫚醯基咪唑雙醯胺、及PEG-二硬脂醯基咪唑雙醯胺、PEG-膽固醇(1-[8'-(膽固-5-烯-3[β]-氧基)甲醯胺基-3',6'-二氧雜辛烷基]胺甲醯基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)、PEG-DMB (3,4-二-十四氧基-[ω]-甲基-聚(乙二醇)醚)、1,2-二肉豆蔻醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DMG) (目錄 號880150P，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSPE) (目錄 號880120C，來自Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, USA)、1,2-二硬脂醯基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG2k-DSG；GS-020, NOF Tokyo, Japan)、聚(乙二醇)-2000-二甲基丙烯酸酯(PEG2k-DMA)及1,2-二硬脂醯基氧基丙基-3-胺-N-[甲氧基(聚乙二醇)-2000] (PEG2k-DSA)。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMG。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSG。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSPE。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DMA。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C-DMA。在一個實施例中，PEG脂質可為WO2016/010840 (第至段)中揭示之化合物S027。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-DSA。在一個實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C11。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C14。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C16。在一些實施例中，PEG脂質可為PEG2k-C18。
LNP調配物
LNP可含有(i) 用於囊封及用於胞內體逃逸之胺脂質，(ii) 用於穩定之中性脂質，(iii) 亦用於穩定之輔助脂質及(iv) 隱密脂質，例如PEG脂質。
在一些實施例中，LNP組合物可包含RNA組分，其包括RNA引導之DNA結合劑、Cas核酸酶mRNA、2類Cas核酸酶mRNA、Cas9 mRNA及gRNA中之一或多者。在一些實施例中，LNP組合物可包括2類Cas核酸酶及gRNA作為RNA組分。在某些實施例中，LNP組合物可包含RNA組分、胺脂質、輔助脂質、中性脂質及隱密脂質。在某些LNP組合物中，輔助脂質係膽固醇。在其他組合物中，中性脂質係DSPC。在額外實施例中，隱密脂質係PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，LNP組合物包含脂質A或脂質A之等效物；輔助脂質；中性脂質；隱密脂質；及引導RNA。在某些組合物中，胺脂質係脂質A。在某些組合物中，胺脂質係脂質A或其縮醛類似物；輔助脂質係膽固醇；中性脂質係DSPC；且隱密脂質係PEG2k-DMG。
在某些實施例中，根據調配物中組分脂質之各別莫耳比闡述脂質組合物。本發明之實施例提供，根據調配物中組分脂質之各別莫耳比闡述之脂質組合物。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約30 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約40 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約45 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約50 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約55 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約50 mol-%至約55 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約50 mol-%。在一個實施例中，胺脂質之mol-%可為約55 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之胺脂質mol-%將為靶mol-%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在一些實施例中，LNP批料之胺脂質mol-%將為靶mol-%之±4 mol-%、±3 mol-%、±2 mol-%、±1.5 mol-%、±1 mol-%、±0.5 mol-%或±0.25 mol-%。所有mol-%數皆隨LNP組合物之脂質組分變化給出。在某些實施例中，胺脂質mol-%之LNP批間可變性將小於15%、小於10%或小於5%。
在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約5 mol-%至約15 mol-%。在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約7 mol-%至約12 mol-%。在一個實施例中，中性脂質之mol-%可為約9 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之中性脂質mol-%將為靶中性脂質mol-%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批間可變性將小於15%、小於10%或小於5%。
在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約20 mol-%至約60 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約25 mol-%至約55 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約25 mol-%至約50 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約25 mol-%至約40 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約30 mol-%至約50 mol-%。在一個實施例中，輔助脂質之mol-%可為約30 mol-%至約40 mol-%。在一個實施例中，基於胺脂質、中性脂質及PEG脂質濃度調節輔助脂質之mol-%以使脂質組分達到100 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之輔助mol-%將為靶mol-%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批間可變性將小於15%、小於10%或小於5%。
在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約1 mol-%至約10 mol-%。在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約2 mol-%至約10 mol-%。在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約2 mol-%至約8 mol-%。在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約2 mol-%至約4 mol-%。在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約2.5 mol-%至約4 mol-%。在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約3 mol-%。在一個實施例中，PEG脂質之mol-%可為約2.5 mol-%。在一些實施例中，LNP批料之PEG脂質mol-%將為靶PEG脂質mol-%之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批間可變性將小於15%、小於10%或小於5%。
在某些實施例中，運送子包括編碼RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶、2類Cas核酸酶或Cas9)之mRNA及gRNA或編碼gRNA之核酸或mRNA與gRNA之組合。在一個實施例中，LNP組合物可包含脂質A或其等效物。在一些態樣中，胺脂質係脂質A。在一些態樣中，胺脂質係脂質A等效物，例如脂質A之類似物。在某些態樣中，胺脂質係脂質A之縮醛類似物。在各個實施例中，LNP組合物包含胺脂質、中性脂質、輔助脂質及PEG脂質。在某些實施例中，輔助脂質係膽固醇。在某些實施例中，中性脂質係DSPC。在具體實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG。在一些實施例中，LNP組合物可包含脂質A、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在一些實施例中，LNP組合物包含胺脂質、DSPC、膽固醇及PEG脂質。在一些實施例中，LNP組合物包含含有DMG之PEG脂質。在某些實施例中，胺脂質係選自脂質A及脂質A之等效物，包括脂質A之縮醛類似物。在額外實施例中，LNP組合物包含脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。
本發明之實施例亦提供根據胺脂質之帶正電的胺基(N)與欲囊封之核酸之帶負電的磷酸酯基團(P)之間的莫耳比闡述之脂質組合物。此可由公式N/P以數學方式表示。在一些實施例中，LNP組合物可包含脂質組分，其包含胺脂質、輔助脂質、中性脂質及輔助脂質；及核酸組分，其中N/P比率係約3至10。在一些實施例中，LNP組合物可包含脂質組分，其包含胺脂質、輔助脂質、中性脂質及輔助脂質；及RNA組分，其中N/P比率係約3至10。在一個實施例中，N/P比率可為約5-7。在一個實施例中，N/P比率可為約4.5-8。在一個實施例中，N/P比率可為約6。在一個實施例中，N/P比率可為6 ±1。在一個實施例中，N/P比率可為約6 ± 0.5。在一些實施例中，N/P比率將為靶N/P比率之±30%、±25%、±20%、±15%、±10%、±5%或±2.5%。在某些實施例中，LNP批間可變性將小於15%、小於10%或小於5%。
在一些實施例中，RNA組分可包含mRNA，例如本文揭示之例如編碼Cas核酸酶之mRNA。在一個實施例中，RNA組分可包含Cas9 mRNA。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA的一些組合物中，LNP進一步包含gRNA核酸，例如gRNA。在一些實施例中，RNA組分包含Cas核酸酶mRNA及gRNA。在一些實施例中，RNA組分包含2類Cas核酸酶mRNA及gRNA。
在某些實施例中，LNP組合物可包含本文揭示之例如編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA、胺脂質、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA的某些LNP組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA的其他組合物中，中性脂質係DSPC。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA的額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在包含編碼Cas核酸酶(例如2類Cas核酸酶)之mRNA的具體組合物中，胺脂質係選自脂質A及其等效物，例如脂質A之縮醛類似物。
在一些實施例中，LNP組合物可包含gRNA。在某些實施例中，LNP組合物可包含胺脂質、gRNA、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在包含gRNA之某些LNP組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含gRNA之一些組合物中，中性脂質係DSPC。在包含gRNA之額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，胺脂質係選自脂質A及其等效物，例如脂質A之縮醛類似物。
在一個實施例中，LNP組合物可包含sgRNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含Cas9 sgRNA。在一個實施例中，LNP組合物可包含Cpf1 sgRNA。在包含sgRNA之一些組合物中，LNP包括胺脂質、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在包含sgRNA之某些組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含sgRNA之其他組合物中，中性脂質係DSPC。在包含sgRNA之額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，胺脂質係選自脂質A及其等效物，例如脂質A之縮醛類似物。
在某些實施例中，LNP組合物包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA (其可為sgRNA)。在一個實施例中，LNP組合物可包含胺脂質、編碼Cas核酸酶之mRNA、gRNA、輔助脂質、中性脂質及PEG脂質。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的某些組合物中，輔助脂質係膽固醇。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的一些組合物中，中性脂質係DSPC。在包含編碼Cas核酸酶之mRNA及gRNA的額外實施例中，PEG脂質係PEG2k-DMG或PEG2k-C11。在某些實施例中，胺脂質係選自脂質A及其等效物，例如脂質A之縮醛類似物。
在某些實施例中，LNP組合物包括Cas核酸酶mRNA (例如2類Cas mRNA)及至少一種gRNA。在某些實施例中，LNP組合物包括約25:1至約1:25之gRNA對Cas核酸酶mRNA (例如2類Cas核酸酶mRNA)之比率。在某些實施例中，LNP調配物包括約10:1至約1:10之gRNA對Cas核酸酶mRNA (例如2類Cas核酸酶mRNA)之比率。在某些實施例中，LNP調配物包括約8:1至約1:8之gRNA對Cas核酸酶mRNA (例如2類Cas核酸酶mRNA)之比率。如本文所量測，比率係以重量計。在一些實施例中，LNP調配物包括約5:1至約1:5之gRNA對Cas核酸酶mRNA (例如2類Cas mRNA)之比率。在一些實施例中，比率範圍為約3:1至1:3、約2:1至1:2、約5:1至1:2、約5:1至1:1、約3:1至1:2、約3:1至1:1、約3:1、約2:1至1:1。在一些實施例中，gRNA對mRNA比率係約3:1或約2:1。在一些實施例中，gRNA對Cas核酸酶mRNA (例如2類Cas核酸酶)之比率係約1:1。比率可為約25:1、10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5、1:10或1:25。
本文揭示之LNP組合物可包括模板核酸。模板核酸可與編碼Cas核酸酶之mRNA (例如2類Cas核酸酶mRNA)共調配。在一些實施例中，模板核酸可與引導RNA共調配。在一些實施例中，模板核酸可與編碼Cas核酸酶之mRNA及引導RNA二者共調配。在一些實施例中，模板核酸可與編碼Cas核酸酶之mRNA或引導RNA分開調配。模板核酸可與LNP組合物一起遞送或分開遞送。在一些實施例中，端視期望修復機制而定，模板核酸可為單鏈或雙鏈。模板可具有與靶DNA或與毗鄰靶DNA之序列同源的區域。
在一些實施例中，藉由將RNA水溶液與基於有機溶劑之脂質溶液(例如，100%乙醇)混合形成LNP。適宜溶液或溶劑包括或可含有：水、PBS、Tris緩衝液、NaCl、檸檬酸鹽緩衝液、乙醇、氯仿、二乙醚、環己烷、四氫呋喃、甲醇、異丙醇。可使用(例如)用於活體內投與LNP之醫藥上可接受之緩衝液。在某些實施例中，緩衝液用於將包含LNP之組合物之pH維持在pH 6.5或以上。在某些實施例中，緩衝液用於將包含LNP之組合物之pH維持在pH 7.0或以上。在某些實施例中，組合物之pH範圍為約7.2至約7.7。在額外實施例中，組合物之pH範圍為約7.3至約7.7或約7.4至約7.6。在其他實施例中，組合物之pH為約7.2、7.3、7.4、7.5、7.6或7.7。可用微pH探針量測組合物之pH。在某些實施例中，組合物中包括低溫保護劑。低溫保護劑之非限制性實例包括蔗糖、海藻糖、甘油、DMSO及乙二醇。實例性組合物可包含高達10%之低溫保護劑，例如蔗糖。在某些實施例中，LNP組合物可包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之低溫保護劑。在某些實施例中，LNP組合物可包括約1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%之蔗糖。在一些實施例中，LNP組合物可包括緩衝液。在一些實施例中，緩衝液可包含磷酸鹽緩衝液(PBS)、Tris緩衝液、檸檬酸鹽緩衝液及其混合物。在某些實例性實施例中，緩衝液包含NaCl。在某些實施例中，省略NaCl。NaCl之實例性量可在約20 mM至約45 mM之範圍內。NaCl之實例性量可在約40 mM至約50 mM之範圍內。在一些實施例中，NaCl之量約為45 mM。在一些實施例中，緩衝液係Tris緩衝液。Tris之實例性量可在約20 mM至約60 mM之範圍內。Tris之實例性量可在約40 mM至約60 mM之範圍內。在一些實施例中，Tris之量約為50 mM。在一些實施例中，緩衝液包含NaCl及Tris。LNP組合物之某些實例性實施例在Tris緩衝液中含有5%蔗糖及45 mM NaCl。在其他實例性實施例中，組合物含有約5% w/v之量之蔗糖、約45 mM NaCl及約50 mM Tris (pH 7.5)。可改變鹽、緩衝液及低溫保護劑之量，使得維持整個調配物之滲透重量莫耳濃度。舉例而言，最終滲透重量莫耳濃度可維持於小於450 mOsm/L。在其他實施例中，滲透重量莫耳濃度介於350 mOsm/L與250 mOsm/L之間。某些實施例具有300 +/- 20 mOsm/L之最終滲透重量莫耳濃度。
在一些實施例中，使用微流體混合、T-混合或交叉混合。在某些態樣中，可改變流速、結大小、結幾何學、結形狀、管直徑、溶液及/或RNA及脂質濃度。可經由(例如)透析、切向流過濾或層析濃縮或純化LNP或LNP組合物。例如，LNP可以懸浮液、乳液或凍乾粉末形式儲存。在一些實施例中，將LNP組合物儲存於2-8℃，在某些態樣中，將LNP組合物儲存於室溫下。在額外實施例中，將LNP組合物於例如-20℃或-80℃下冷凍儲存。在其他實施例中，將LNP組合物於約0℃至約-80℃範圍內之溫度下儲存。冷凍之LNP組合物可在使用前例如在冰上、於4℃下、於室溫下或於25℃下解凍。冷凍之LNP組合物可維持在各種溫度下，例如在冰上、於4℃下、於室溫下、於25℃下或於37℃下。
在一些實施例中，LNP組合物具有大於約80%之囊封。在一些實施例中，LNP組合物之粒徑小於約120 nm。在一些實施例中，LNP組合物之pdi小於約0.2。在一些實施例中，存在該等特徵中之至少兩個。在一些實施例中，存在該三個特徵中之每一者。用於測定該等參數之分析方法在下文之一般試劑及方法部分中論述。
在一些實施例中，使用微流體混合、T-混合或交叉混合。在某些態樣中，可改變流速、結大小、結幾何學、結形狀、管直徑、溶液及/或RNA及脂質濃度。可經由(例如)透析或層析濃縮或純化LNP或LNP組合物。例如，LNP可以懸浮液、乳液或凍乾粉末形式儲存。在一些實施例中，將LNP組合物儲存於2-8℃，在某些態樣中，將LNP組合物儲存於室溫下。在額外實施例中，將LNP組合物於(例如)-20℃或-80℃下冷凍儲存。在其他實施例中，將LNP組合物儲存於0℃至-80℃範圍內之溫度。冷凍之LNP組合物可在使用前(例如)在冰上、於室溫下或於25℃下解凍。
動態光散射(「DLS」)可用於表徵本發明之LNP之多分散性指數(「pdi」)及大小。DLS量測由於使樣本經受光源而產生之光散射。如自DLS量測測定之PDI表示群體中粒徑(在平均粒徑附近)之分佈，其中完全均勻之群體之PDI為零。在一些實施例中，pdi可在0.005至0.75之範圍內。在一些實施例中，pdi可在0.01至0.5之範圍內。在一些實施例中，pdi可在0.02至0.4之範圍內。在一些實施例中，pdi可在0.03至0.35之範圍內。在一些實施例中，pdi可在0.1至0.35之範圍內。
在一些實施例中，本文揭示之LNP之大小為1 nm至250 nm。在一些實施例中，LNP之大小為10 nm至200 nm。在其他實施例中，LNP之大小為20 nm至150 nm。在一些實施例中，LNP之大小為50 nm至150 nm。在一些實施例中，LNP之大小為50 nm至100 nm。在一些實施例中，LNP之大小為50 nm至120 nm。在一些實施例中，LNP之大小為75 nm至150 nm。在一些實施例中，LNP之大小為30 nm至200 nm。除非另外指明，否則本文中提及之所有大小皆係完全形成之奈米粒子之平均大小(直徑)，如在Malvern Zetasizer上藉由動態光散射所量測。將奈米粒子樣本稀釋於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中以使計數率為約200-400 kct。數據呈現為強度量測之加權平均值。在一些實施例中，形成LNP，且平均囊封效率在50%至100%範圍內。在一些實施例中，形成LNP，且平均囊封效率在50%至70%範圍內。在一些實施例中，形成LNP，且平均囊封效率在70%至90%範圍內。在一些實施例中，形成LNP，且平均囊封效率在90%至100%範圍內。在一些實施例中，形成LNP，且平均囊封效率在75%至95%範圍內。
在一些實施例中，與本文揭示之gRNA相關之LNP用於製備用於治療ATTR之藥劑。在一些實施例中，與本文揭示之gRNA相關之LNP用於製備用於在患有ATTR之個體中減少或預防TTR在澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中累積及聚集的藥劑。在一些實施例中，與本文揭示之gRNA相關之LNP用於製備用於降低血清TTR濃度之藥劑。在一些實施例中，與本文揭示之gRNA相關之LNP用於治療個體(例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類)之ATTR。在一些實施例中，與本文揭示之gRNA相關之LNP用於在患有ATTR之個體(例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類)中減少或預防TTR在澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維中累積及聚集。在一些實施例中，與本文揭示之gRNA相關之LNP用於降低個體(例如哺乳動物，例如靈長類動物，例如人類)之血清TTR濃度。
電穿孔亦係用於遞送運送子之熟知方式，且任何電穿孔方法可用於遞送本文揭示之gRNA中之任一者。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文揭示之gRNA中之任一者及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas9)之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含用於將本文揭示之gRNA中之任一者遞送至離體細胞之方法，其中gRNA與LNP相關或不與LNP相關。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas9)之mRNA相關。
在某些實施例中，本發明包含編碼包含本文所述引導序列中之任一或多者之任何引導RNA的DNA或RNA載體。在一些實施例中，除了引導RNA序列之外，載體進一步包含不編碼引導RNA之核酸。不編碼引導RNA之核酸包括(但不限於)啟動子、增強子、調節序列及編碼RNA引導之DNA核酸酶(其可為核酸酶，例如Cas9)之核酸。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼sgRNA及mRNA之核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶，其可為Cas核酸酶，例如Cas9或Cpf1。在一些實施例中，載體包含一或多個編碼crRNA、trRNA及mRNA之核苷酸序列，該mRNA編碼RNA引導之DNA核酸酶，其可為Cas蛋白，例如Cas9。在一個實施例中，Cas9係來自釀膿鏈球菌(亦即，Spy Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA、或crRNA及trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含側接天然CRISPR/Cas系統之重複序列之全部或一部分的引導序列或由該引導序列組成。包含crRNA、trRNA或crRNA及trRNA或由其組成之核酸可進一步包含載體序列，其中載體序列包含並非與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起天然發現之核酸或由該核酸組成。
在一些實施例中，crRNA及trRNA由一個載體內之非鄰接核酸編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由鄰接核酸編碼。在一些實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相反鏈編碼。在其他實施例中，crRNA及trRNA由單一核酸之相同鏈編碼。
在一些實施例中，載體可為環形的。在其他實施例中，載體可為線性的。在一些實施例中，載體可包封在脂質奈米粒子、非脂質奈米粒子或病毒衣殼中。非限制性實例性載體包括質體、噬粒、黏粒、人工染色體、微型染色體、轉位子、病毒載體及表現載體。
在一些實施例中，載體可為病毒載體。在一些實施例中，病毒載體可自其野生型對應體遺傳修飾。舉例而言，病毒載體可包含一或多個核苷酸之插入、缺失或取代，以促進選殖或使得載體之一或多種性質發生變化。該等性質可包括包裝能力、轉導效率、免疫原性、基因體整合、複製、轉錄及轉譯。在一些實施例中，病毒基因體之一部分可缺失，使得病毒能包裝大小更大之外源序列。在一些實施例中，病毒載體可具有增強之轉導效率。在一些實施例中，可減少病毒在宿主中誘導之免疫反應。在一些實施例中，促進病毒序列整合至宿主基因體中之病毒基因(例如，整合酶)可突變，使得病毒變得非整合。在一些實施例中，病毒載體可為複製缺陷的。在一些實施例中，病毒載體可包含用於驅動編碼序列在載體上表現之外源轉錄或轉譯控制序列。在一些實施例中，病毒可為輔助依賴的。舉例而言，病毒可能需要一或多種輔助病毒以供應擴增並將載體包裝至病毒顆粒中所需之病毒組分(例如，病毒蛋白)。在這種情況下，一或多種輔助組分(包括一或多個編碼病毒組分之載體)可與本文所述之載體系統一起引入宿主細胞中。在其他實施例中，該病毒可為無輔助的。舉例而言，病毒可在無任何輔助病毒之情況下擴增及包裝載體。在一些實施例中，本文所述之載體系統亦可編碼病毒擴增及包裝所需之病毒組分。
非限制性實例性病毒載體包括腺相關病毒(AAV)載體、慢病毒載體、腺病毒載體、輔助依賴性腺病毒載體(HDAd)、單純疱疹病毒(HSV-1)載體、噬菌體T4、桿狀病毒載體及反轉錄病毒載體。在一些實施例中，病毒載體可為AAV載體。在一些實施例中，病毒載體係AAV2、AAV3、AAV3B、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAVrh.64R1、AAVhu.37、AAVrh.8、AAVrh.32.33、AAV8、AAV9、AAVrh10或AAVLK03。在其他實施例中，病毒載體可為慢病毒載體。
在一些實施例中，慢病毒可為非整合的。在一些實施例中，病毒載體可為腺病毒載體。在一些實施例中，腺病毒可為高選殖能力或「無病毒基因的」腺病毒，其中自病毒缺失除了5'及3'倒置末端重複(ITR)及包裝信號(「I」)之所有編碼病毒區域，以增加其包裝能力。在其他實施例中，病毒載體可為HSV-1載體。在一些實施例中，基於HSV-1之載體係輔助依賴的，且在其他實施例中，其係輔助獨立的。舉例而言，僅保留包裝序列之擴增子載體需要具有用於包裝之結構組分的輔助病毒，而移除非必需病毒功能之30kb缺失之HSV-1載體不需要輔助病毒。在額外實施例中，病毒載體可為噬菌體T4。在一些實施例中，當病毒之頭部被清空時，噬菌體T4可能能夠包裝任何線性或環狀DNA或RNA分子。在其他實施例中，病毒載體可為桿狀病毒載體。在其他實施例中，病毒載體可為反轉錄病毒載體。在使用具有較小選殖能力之AAV或慢病毒載體之實施例中，可能需要使用一個以上載體來遞送如本文揭示之載體系統之所有組分。舉例而言，一個AAV載體可含有編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶)之序列，而第二AAV載體可含有一或多個引導序列。
在一些實施例中，載體可能能夠驅動細胞中一或多個編碼序列之表現。在一些實施例中，細胞可為原核細胞，例如細菌細胞。在一些實施例中，細胞可為真核細胞，例如酵母、植物、昆蟲或哺乳動物細胞。在一些實施例中，真核細胞可為哺乳動物細胞。在一些實施例中，真核細胞可為齧齒動物細胞。在一些實施例中，真核細胞可為人類細胞。適於驅動不同類型細胞中表現之啟動子為業內已知。在一些實施例中，啟動子可為野生型。在其他實施例中，可修改啟動子以便更高效或更有效地表現。在其他實施例中，啟動子可經截短但仍保留其功能。舉例而言，啟動子可具有適於正常大小或將載體恰當包裝至病毒中之減小大小。
在一些實施例中，載體可包含編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如本文所述核酸酶)之核苷酸序列。在一些實施例中，由載體編碼之核酸酶可為Cas蛋白。在一些實施例中，載體系統可包含編碼核酸酶之核苷酸序列之一個拷貝。在其他實施例中，載體系統可包含編碼核酸酶之核苷酸序列之一個以上拷貝。在一些實施例中，編碼核酸酶之核苷酸序列可操作連接至至少一個轉錄或轉譯控制序列。在一些實施例中，編碼核酸酶之核苷酸序列可操作連接至至少一個啟動子。
在一些實施例中，啟動子可為組成型、誘導型或組織特定性的。在一些實施例中，啟動子可為組成型啟動子。非限制性實例性組成型啟動子包括巨細胞病毒立即早期啟動子(CMV)、猿猴病毒(SV40)啟動子、腺病毒主要晚期(MLP)啟動子、勞斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus，RSV)啟動子、小鼠乳房腫瘤病毒(MMTV)啟動子、磷酸甘油酸鹽激酶(PGK)啟動子、伸長因子-α (EF1a)啟動子、泛素啟動子、肌動蛋白啟動子、微管蛋白啟動子、免疫球蛋白啟動子、其功能片段或上述中之任一者之組合。在一些實施例中，啟動子可為CMV啟動子。在一些實施例中，啟動子可為經截短CMV啟動子。在其他實施例中，啟動子可為EF1a啟動子。在一些實施例中，啟動子可為誘導型啟動子。非限制性實例性誘導型啟動子包括可由熱休克、光、化學品、肽、金屬、類固醇、抗生素或酒精誘導之彼等。在一些實施例中，誘導型啟動子可為具有低基礎(非誘導)表現程度者，例如Tet-On® 啟動子(Clontech)。
在一些實施例中，啟動子可為組織特異性啟動子，例如對肝中之表現具有特異性之啟動子。
載體可進一步包含編碼本文所述引導RNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含引導RNA之一個拷貝。在其他實施例中，載體包含引導RNA之一個以上拷貝。在具有一個以上引導RNA之實施例中，引導RNA可為不相同的，使得其靶向不同靶序列，或可為相同的，使得其靶向相同靶序列。在載體包含一個以上引導RNA之一些實施例中，每一引導RNA可在與RNA引導之DNA核酸酶之複合物(例如Cas RNP複合物)中具有其他不同性質，例如活性或穩定性。在一些實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可操作連接至至少一個轉錄或轉譯控制序列，例如啟動子、3'UTR或5'UTR。在一個實施例中，啟動子可為tRNA啟動子，例如tRNALys3 或tRNA嵌合體。參見Mefferd等人, RNA. 2015 21:1683-9；Scherer等人,Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620-2628。在一些實施例中，啟動子可由RNA聚合酶III (Pol III)識別。Pol III啟動子之非限制性實例包括U6及H1啟動子。在一些實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可操作連接至小鼠或人類U6啟動子。在其他實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可操作連接至小鼠或人類H1啟動子。在具有一個以上引導RNA之實施例中，用於驅動表現之啟動子可相同或不同。在一些實施例中，編碼引導RNA之crRNA之核苷酸及編碼引導RNA之trRNA之核苷酸可提供於同一載體上。在一些實施例中，編碼crRNA之核苷酸及編碼trRNA之核苷酸可由相同啟動子驅動。在一些實施例中，crRNA及trRNA可轉錄成單一轉錄物。舉例而言，可自單一轉錄物處理crRNA及trRNA以形成雙分子引導RNA。或者，crRNA及trRNA可轉錄成單一分子引導RNA (sgRNA)。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由同一載體上之其相應啟動子驅動。在其他實施例中，crRNA及trRNA可由不同載體編碼。
在一些實施例中，編碼引導RNA之核苷酸序列可位於相同載體上，該載體包含編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶)之核苷酸序列。在一些實施例中，引導RNA之表現及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白)之表現可由其自身相應之啟動子驅動。在一些實施例中，引導RNA之表現可由驅動RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白)之表現之相同啟動子驅動。在一些實施例中，引導RNA及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白轉錄物)可包含於單一轉錄物中。舉例而言，引導RNA可在RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白轉錄物)之非轉譯區(UTR)內。在一些實施例中，引導RNA可在轉錄物之5' UTR內。在其他實施例中，引導RNA可在轉錄物之3' UTR內。在一些實施例中，轉錄物之細胞內半衰期可藉由在其3' UTR內含有引導RNA且藉此縮短其3' UTR之長度來減少。在額外實施例中，引導RNA可在轉錄物之內含子內。在一些實施例中，可在引導RNA所位於之內含子添加適宜剪接位點，使得引導RNA自轉錄物中恰當剪接出。在一些實施例中，來自相同載體之RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas蛋白)及引導RNA之緊密時間接近之表現可促進更有效地形成CRISPR RNP複合物。
在一些實施例中，組合物包含載體系統。在一些實施例中，載體系統可包含單一載體。在其他實施例中，載體系統可包含兩個載體。在額外實施例中，載體系統可包含三個載體。當使用不同引導RNA進行多工化時或當使用引導RNA之多個拷貝時，載體系統可包含三個以上載體。
在一些實施例中，載體系統可包含誘導型啟動子以僅在其遞送至靶細胞後開始表現。非限制性實例性誘導型啟動子包括可由熱休克、光、化學品、肽、金屬、類固醇、抗生素或酒精誘導之彼等。在一些實施例中，誘導型啟動子可為具有低基礎(非誘導)表現程度者，例如Tet-On® 啟動子(Clontech)。
在額外實施例中，載體系統可包含組織特異性啟動子以僅在其遞送至特定組織之後開始表現。
載體可由脂質體、奈米粒子、外來體或微囊泡遞送。載體亦可由脂質奈米粒子(LNP)遞送；參見(例如)於2016年12月12日提出申請之標題為「LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS」的U.S.S.N. 62/433,228，其全部內容以引用方式併入本文中。本文所述LNP及LNP調配物中之任一者適於單獨遞送引導或與cas核酸酶或編碼cas核酸酶之mRNA一起。在一些實施例中，涵蓋包含以下之LNP組合物：RNA組分及脂質組分，其中脂質組分包含胺脂質、中性脂質、輔助脂質及隱密脂質；及其中N/P比率係約1-10。
在一些情況下，脂質組分包含脂質A或其縮醛類似物、膽固醇、DSPC及PEG-DMG；且其中N/P比率為約1-10。在一些實施例中，脂質組分包含：約40-60 mol-%胺脂質；約5-15 mol-%中性脂質；及約1.5-10 mol-% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分係輔助脂質，其中LNP組合物之N/P比率係約3-10。在一些實施例中，脂質組分包含約50-60 mol-%胺脂質；約8-10 mol-%中性脂質；及約2.5-4 mol-% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分係輔助脂質，其中LNP組合物之N/P比率係約3-8。在一些情況下，脂質組分包含：約50-60 mol-%胺脂質；約5-15 mol-% DSPC；及約2.5-4 mol-% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分係膽固醇，且其中LNP組合物之N/P比率係約3-8。在一些情況下，脂質組分包含：48-53 mol-%脂質A；約8-10 mol-% DSPC；及1.5-10 mol-% PEG脂質，其中脂質組分之其餘部分係膽固醇，且其中LNP組合物之N/P比率為3-8 ±0.2。
在一些實施例中，載體可全身地遞送。在一些實施例中，載體可遞送至肝循環中。
本說明書及實例性實施例不應視為具有限制性。出於本說明書及所附申請專利範圍之目的，除非另有說明，否則在說明書及申請專利範圍中使用之表示數量、百分比或比例之所有數字及其他數值應理解為在所有情況下皆由術語「約」修飾至其尚未經如此修飾的程度。因此，除非指示相反情況，否則以下說明書及所附申請專利範圍中所闡明之數字參數皆為可根據尋求獲得之期望性質而變化的近似值。最低限度地，且並非試圖限制申請專利範圍之等效項之原則的應用，每一數字參數均應至少根據所報告有效位的數量且藉由施用普通舍入技術來解釋。
應注意，除非特別地且明確地限於一個指示物，否則如在本說明書及所附申請專利範圍中所使用之單數形式「一(a、an)」及「該」及任何詞語之任何單數使用包括複數個指示物。如本文所用術語「包括」及其語法變體意欲非限制性，使得清單中之項目之列舉不排除可取代或添加至列出之項目之其他類似項目。
實例
提供以下實例以闡釋某些揭示之實施例，而不應解釋為以任何方式限制本揭示內容之範圍。
實例 1. 材料及方法
核酸酶 mRNA 之活體外轉錄 ( 「 IVT 」 )
藉由使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶活體外轉錄產生含有N1-甲基假-U之封端及腺苷酸化釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。藉由利用以下條件在37℃下與XbaI一起培育2小時線性化含有T7啟動子(即根據SEQ ID NO: 1或2之轉錄序列)及100 nt多(A/T)區的質體DNA：200 ng/μL質體、2 U/μL XbaI (NEB)及1×反應緩衝液。藉由在65℃加熱反應20 min使XbaI不活化。使用二氧化矽maxi旋轉管柱(Epoch Life Sciences)自酶及緩衝液鹽純化線性化質體，且藉由瓊脂糖凝膠分析以確認線性化。將產生Cas9修飾之mRNA之IVT反應在37℃下在以下條件下培育4小時：50 ng/μL線性化質體；2 mM各GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)；10 mM ARCA (Trilink)；5 U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/μL鼠類RNase抑制劑(NEB)；0.004 U/μL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。4小時培育後，添加TURBO DNase (ThermoFisher)至最終濃度為0.01 U/μL，且將反應再培育30分鐘以移除DNA模板。根據製造商之方案(ThermoFisher)使用MegaClear轉錄清除套組自酶及核苷酸純化Cas9 mRNA。或者，經由沈澱方案純化mRNA，在一些情形下，之後係基於HPLC之純化。簡言之，在DNase消化後，藉由添加0.21× vol之7.5 M LiCl溶液並混合沈澱mRNA，並藉由離心使沈澱之mRNA成團塊。移除上清液後，將mRNA重構於水中。使用乙酸銨及乙醇再次沈澱mRNA。將5M乙酸銨添加至mRNA溶液中，最終濃度為2M，同時添加2×體積之100% EtOH。將溶液混合並在-20℃下培育15 min。藉由離心再次使沈澱之mRNA成團塊，移除上清液，並將mRNA重構於水中。作為最後步驟，使用乙酸鈉及乙醇沈澱mRNA。將1/10體積之3 M乙酸鈉(pH 5.5)與2x體積之100% EtOH一起添加至溶液中。將溶液混合並在-20℃下培育15 min。藉由離心再次使沈澱之mRNA成團塊，移除上清液，用70%冷乙醇洗滌團塊並使其風乾。將mRNA重構於水中。對於HPLC純化之mRNA，在LiCl沈澱及重構後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (例如，參見Kariko等人Nucleic Acids Research , 2011，第39卷，第21期，e142)。合併選擇用於彙集之部分且如上所述藉由乙酸鈉/乙醇沈澱脫鹽。藉由量測260 nm之吸光度(Nanodrop)測定轉錄物濃度，並藉由Bioanlayzer (Agilent)之毛細管電泳分析轉錄物。
當下文關於RNA提及SEQ ID NO: 1及2時，應理解，Ts應用Us置換(其為如上所述之N1-甲基假尿苷)。實例中使用之Cas9 mRNA包括5’帽及3’多-A尾，例如，至多100 nt，且由SEQ ID NO鑑別。
SEQ ID NO: 1：用於轉錄之Cas9序列1.
GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
SEQ ID NO: 2：用於轉錄之Cas9序列2.
GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATGGCGGTGGATCTCCGAAAAAGAAGAGAAAGGTGTAATGAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
人類 TTR 引導設計及具有食蟹猴同源性 引導設計之人類 TTR
使用人類參考基因體(例如，hg38)及用戶定義之所關注基因體區域(例如，編碼外顯子之TTR蛋白)，電腦模擬實施初始引導選擇，用於鑑別所關注區域中之PAM。對於每一鑑別之PAM，實施分析並報告統計值。進一步選擇gRNA分子並基於許多準則(例如，GC含量、預測靶上活性及潛在脫靶活性)進行等級次序化。
針對靶向外顯子1、2、3及4內之蛋白質編碼區之TTR (ENSG00000118271)設計總共68個引導RNA。在總共68個引導中，33個在食蟹猴(cynomolgus monkey，cyno)中100%同源。此外，對於10個在食蟹猴中並非完全同源之人類TTR引導，平行設計及製造「代用」引導以與相應食蟹猴靶序列完美匹配。可在食蟹猴中篩選該等「代用」或「工具」引導以例如近似同源人類引導序列之活性及功能。提供引導序列及相應基因體坐標(表1)。將所有引導RNA製成雙重導向RNA，並將導向序列之亞組製成經修飾之單引導RNA (表2)。提供雙重引導RNA (dgRNA) ID、經修飾單引導RNA (sgRNA) ID、與食蟹猴基因體之失配數量以及食蟹猴精確匹配之ID間的引導ID比對(表3)。在dgRNA用於實例中詳述之實驗之情況下，使用SEQ ID NO: 270。
活體外 Cas9 mRNA 及 引導 RNA 遞送
HEK293_Cas9 細胞系. 在補充有10%胎牛血清及500 µg/ml G418之DMEM培養基中培養組成型表現Spy Cas9之人類胚腎癌細胞系HEK293 (「HEK293_Cas9」)。在轉染之前24小時，將細胞以10,000個細胞/孔之密度平鋪於96孔板中。根據製造商之方案用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher，目錄13778150)轉染細胞。用含有個別crRNA (25 nM)、trRNA (25 nM)、Lipofectamine RNAiMAX (0.3 μL/孔)及OptiMem之脂複合物轉染細胞。
HUH7 細胞系. 在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養人類肝細胞癌細胞系HUH7 (Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank, 目錄JCRB0403)。在轉染之前20小時，將細胞以15,000個細胞/孔之密度平鋪於96孔板中。根據製造商之方案用Lipofectamine MessengerMAX (ThermoFisher，目錄LMRNA003)轉染細胞。依序用含有Spy Cas9 mRNA (100 ng)、MessengerMAX (0.3 µL/well)及OptiMem之脂複合物、之後含有個別crRNA (25 nM)、示蹤RNA (25 nM)、MessengerMAX (0.3 µL/孔)及OptiMem之單獨脂複合物轉染細胞。
HepG2 細胞系. 在補充有10%胎牛血清之DMEM培養基中培養人類肝細胞癌細胞系HepG2 (美國模式培養物保藏所(American Type Culture Collection)，目錄HB-8065)。計數細胞，並在轉染前24小時，以10,000個細胞/孔之密度平鋪於96孔板中之生物塗層膠原I塗佈之96孔板(ThermoFisher，目錄877272)上。根據製造商之方案用Lipofectamine 2000 (ThermoFisher，目錄11668019)轉染細胞。依序用含有Spy Cas9 mRNA (100 ng)、Lipofectamine 2000 (0.2 µL/孔)及OptiMem之脂複合物、之後含有個別crRNA (25 nM)、示蹤RNA (25 nM)、Lipofectamine 2000 (0.2 µL/孔)及OptiMem之單獨脂複合物轉染細胞。
原代肝細胞 . 根據製造商之方案(Invitrogen，方案11.28.2012)培養原代人類肝細胞(PHH)及原代食蟹猴肝細胞(PCH) (Gibco)。簡言之，將細胞解凍並重新懸浮於具有補充物之肝細胞解凍培養基(Gibco，目錄CM7000)中，之後對於人類以100 g離心10分鐘且對於食蟹猴以80g離心4分鐘。棄去上清液，將成團塊之細胞重新懸浮於加補充包之肝細胞平板培養基(Invitrogen，目錄A1217601及CM3000)中。計數細胞，並對於人類以33,000個細胞/孔或對於食蟹猴以60,000個細胞/孔(或當分析對TTR蛋白之效應時(下文進一步闡述)，為65,000個細胞/孔)的密度平鋪於生物塗層膠原I塗佈之96孔板(ThermoFisher，目錄877272)上。使平鋪之細胞在37℃及5% CO2 氣氛下在組織培養培育器中沉降並黏附6或24小時。在檢查培育細胞單層形成後，將培養基替換為含有無血清補充包(Invitrogen，目錄A1217601及CM4000)之肝細胞培養基。
根據製造商之方案執行基於Lipofectamine RNAiMax (ThermoFisher，目錄13778150)之轉染。依序用含有Spy Cas9 mRNA (100 ng)、Lipofectamine RNAiMax (0.4 µL/孔)及OptiMem之脂複合物、之後含有crRNA (25 nM)及示蹤RNA (25 nM)或sgRNA (25nM)、Lipofectamine RNAiMax (0.4 µL/孔)及OptiMem之單獨脂複合物轉染細胞。
在裝載有引導RNA (RNP)之Spy Cas9蛋白之電穿孔或轉染至細胞上之前實施核糖核苷酸形成。對於雙重引導(dgRNA)，藉由混合等效量之試劑並在95℃下培育2 min並冷卻至室溫來預處理個別crRNA及trRNA。將單引導(sgRNA)在95℃下煮沸2 min並冷卻至室溫。將煮沸之dgRNA或sgRNA於室溫下與Optimem中之Spy Cas9蛋白一起培育10分鐘以形成核糖核蛋白(RNP)複合物。
對於RNP電穿孔進入原代人類及食蟹猴肝細胞，將細胞解凍並重新懸浮於Lonza電穿孔原代細胞P3緩衝液中，濃度為對於人類肝細胞2500個細胞/μL，且對於食蟹猴肝細胞3500個細胞/μL。每個引導一起混合20 μL體積之重新懸浮之細胞及5 μL RNP。將20 μL混合物置於Lonza電穿孔板中。使用具有預設方案EX-147之Lonza nucleofector對細胞進行電穿孔。電穿孔後，將細胞轉移至含有預熱之維持培養基之Biocoat板中，並置於37℃及5% CO2 之組織培養培育器中。
對於RNP脂複合物轉染，根據製造商之方案用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher，目錄13778150)轉染細胞。用含有Spy Cas9 (10nM)、個別引導(10 nM)、示蹤RNA (10 nM)、Lipofectamine RNAiMAX (1.0 µL/孔)及OptiMem之RNP轉染細胞。如上所述實施RNP形成。
根據製造商之方案藉由使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM 臺式儀器微流體混合脂質及RNA溶液或交叉流混合來形成LNP。
LNP調配物 - NanoAssemblr
通常，將脂質奈米粒子組分溶解於100%乙醇中，其中脂質組分具有各種莫耳比。將RNA運送子溶解於25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，從而產生約0.45 mg/mL之RNA運送子濃度。用脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)莫耳比為約4.5或約6調配LNP，其中mRNA對gRNA之重量比為1:1。
根據製造商之方案藉由使用Precision Nanosystems NanoAssemblrTM 臺式儀器微流體混合脂質及RNA溶液來形成LNP。在混合期間使用不同之流速維持2:1之水溶液對有機溶劑之比率。混合後，收集LNP，稀釋於水(約1:1 v/v)中，於室溫下保持1小時，並在最終緩衝液更換之前用水(約1:1 v/v)進一步稀釋。利用PD-10脫鹽管柱(GE)完成至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)之最終緩衝液更換。若需要，藉由用Amicon 100 kDa離心過濾器(Millipore)離心濃縮調配物。然後使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將最終LNP儲存於-80℃直至進一步使用。
LNP調配物 - 交叉流
對於使用交叉流技術製備之LNP，藉由將乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液及一體積之水進行噴射混合來形成LNP。乙醇中之脂質經由混合交叉與兩體積之RNA溶液混合。第四水流經由線內T形管與十字架之出口流混合。(參見WO2016010840圖2)。將LNP於室溫下保持1小時，並進一步用水(約1:1 v/v)稀釋。使用切向流過濾在平板盒(Sartorius，100kD MWCO)上濃縮稀釋之LNP，且然後藉由滲濾至50 mM Tris、45 mM NaCl、5%(w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)中更換緩衝液。或者，用PD-10脫鹽管柱(GE)完成至TSS之最終緩衝液更換。若需要，藉由用Amicon 100 kDa離心過濾器(Millipore)離心濃縮調配物。然後使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將最終LNP儲存於4℃或-80℃直至進一步使用。
調配物分析
動態光散射(「DLS」)用於表徵本發明之LNP之多分散性指數(「pdi」)及大小。DLS量測由於使樣本經受光源而產生之光散射。如自DLS量測測定之PDI表示群體中粒徑(在平均粒徑附近)之分佈，其中完全均勻之群體之PDI為零。使用Malvern Zetasizer DLS儀器藉由動態光散射(DLS)量測平均粒徑及多分散性。在藉由DLS量測之前，將LNP樣本在PBS中稀釋30×。報告Z-平均直徑(其係基於強度之平均粒徑量測)以及數目平均直徑及pdi。Malvern Zetasizer儀器亦用於量測LNP之ζ電位。在量測之前，將樣本在0.1X PBS (pH 7.4)中1:17稀釋(50uL稀釋成800uL)。
基於螢光之分析(Ribogreen®, ThermoFisher Scientific)用於測定總RNA濃度及游離RNA。囊封效率計算為(總RNA-游離RNA)/總RNA。將LNP樣本用含有0.2% Triton-X 100之1x TE緩衝液適當稀釋以測定總RNA或用1x TE緩衝液適當稀釋以測定游離RNA。藉由利用用於製備調配物且稀釋於1x TE緩衝液+/- 0.2% Triton-X 100中之起始RNA溶液來製備標準曲線。然後將稀釋之RiboGreen®染料(根據製造商之說明書)添加至標樣及樣本中之每一中且於室溫下在不存在光下培育約10分鐘。使用SpectraMax M5微量讀數板(Molecular Devices)讀取樣本，其中激發、自動截止及發射波長設定為488 nm、515 nm及525 nm。自適當標準曲線測定總RNA及游離RNA。
囊封效率計算為(總RNA-游離RNA)/總RNA。可使用相同程序來測定基於DNA之運送子組分之囊封效率。對於單鏈DNA，可使用Oligreen染料，且對於雙鏈DNA，可使用Picogreen染料。
通常，當製備LNP時，囊封＞ 80%，粒徑＜120 nm，且pdi ＜0.2。
活體內 LNP 遞送
除非另有說明，否則在每一研究中使用6-10週齡範圍內之CD-1雌性小鼠。對動物進行稱重並根據體重分組，以基於組平均重量製備投用溶液。以0.2 mL/動物之體積(每公斤體重約10 mL)經由側尾靜脈投用LNP。在投藥後約6小時觀察動物之不良效應。在投藥後24小時量測體重，且藉由在異氟醚麻醉下經由心臟穿刺驅血在不同時間點使動物安樂死。如本文所述，將血液收集至血清分離管中或含有用於血漿之緩衝檸檬酸鈉之管中。對於涉及活體內編輯之研究，自每隻動物之中間葉或三個獨立葉(例如，右中值、左中值及左側葉)收集肝組織用於DNA提取及分析。
動物研究中所用之甲狀腺素運載蛋白 (TTR) ELISA 分析
收集血液並如所指示分離血清。使用小鼠前白蛋白(甲狀腺素運載蛋白) ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄OKIA00111)測定小鼠TTR血清總含量；使用大鼠特異性ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00159)量測大鼠TTR血清含量；使用人類特異性ELISA套組(Aviva Systems Biology，目錄號OKIA00081)量測人類TTR血清含量；各自根據製造商之方案。簡言之，當量測小鼠血清中之人類TTR時，用套組樣本稀釋劑將血清連續稀釋至10,000倍或5,000倍之最終稀釋度。將100ul製備之標準曲線或稀釋之血清樣本添加至ELISA板中，於室溫下培育30分鐘，且然後用提供之洗滌緩衝液洗滌3次。然後向每一孔中添加100uL檢測抗體，且於室溫下培育20分鐘，之後洗滌3次。添加100uL受質，然後於室溫下培育10分鐘，之後添加100uL停止溶液。在Spectramax M5分析盤讀數儀上使用SoftmaxPro 7.0版軟體進行分析，量測內容物之吸光度。使用4參數邏輯擬合將血清TTR含量根據標準曲線定量，並表示為ug/mL血清或相對於對照(媒劑處理之)動物之減弱百分比。
基因體 DNA 分離
在轉化染後24、48或72小時收穫轉染細胞。根據製造商之方案使用50 μL/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicenter，目錄QE09050)自96孔板之每一孔提取基因體DNA。如本文所述，使所有DNA樣本經受PCR及隨後之NGS分析。
次世代定序 ( 「 NGS 」 ) 分析
為了定量地測定基因體中靶位置之編輯效率，利用定序來鑑別由基因編輯引入之插入及缺失之存在。
引子設計在所關注基因(例如TTR )內之靶位點周圍，且擴增所關注基因體區域。
根據製造商之方案(Illumina)實施額外PCR以添加用於定序之化學。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子進行定序。在消除具有低品質評分之彼等讀數之後，將讀數與參考基因體(例如，人類參考基因體(hg38)、食蟹猴參考基因體(mf5)、大鼠參考基因體(rn6)或小鼠參考基因體(mm10))進行比對。將含有讀數之所得文件映射至參考基因體(BAM文件)，其中選擇與所關注靶區重疊之讀數，且計算野生型讀數之數量與含有插入、取代或缺失之讀數之數量。
編輯百分數(例如，「編輯效率」或「編輯百分比」或「插入或缺失頻率」)定義為相對於序列讀段(包括野生型)之總數之具有插入/缺失(「插入或缺失」)或取代之序列讀段之總數。
藉由西方墨點分析分泌之甲狀腺素運載蛋白 ( 「 TTR 」 ) 蛋白
使用西方墨點法測定培養基中TTR蛋白之分泌含量。如前所述，用表1之選擇引導轉染HepG2細胞。在轉染後每3天實施一次培養基更換。轉染後6天，移除培養基，且用不含胎牛血清(FBS)之培養基洗滌細胞一次。將無血清之培養基添加至細胞中並在37℃下培育。4hr後，移除培養基並離心以使任何碎片成團塊；基於自對剩餘細胞之CTG分析獲得之值來估計每一孔之細胞數且與板平均值進行比較。離心後，將培養基轉移至新板並儲存於-20℃下。實施培養基之丙酮沈澱以沈澱已分泌至培養基中之任何蛋白質。將四體積之冰冷丙酮添加至一體積之培養基中。將溶液充分混合並在-20℃下保持90min。將丙酮:培養基混合物以15,000xg且於4℃下離心15min。棄去上清液，且將保留之沈澱風乾以消除任何殘餘丙酮。將團塊重新懸浮於15μL RIPA緩衝液(Boston Bio Products，目錄BP-115)及新鮮添加之蛋白酶抑制劑混合物中，該蛋白酶抑制劑混合物由全蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma，目錄11697498001)及1mM DTT組成。將溶解物與Laemmli緩衝液混合，且在95℃下變性10分鐘。使用NuPage系統在12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher)上根據製造商之方案運行西方墨點法，之後濕轉移至0.45 μm硝化纖維素膜(Bio-Rad，目錄1620115)上。於室溫下在實驗室搖桿上使用TBS中之5%奶粉封閉墨點30分鐘。將墨點用TBST沖洗，並用TBST中1:1000之兔α-TTR單株抗體(Abcam，目錄Ab75815)探測。使用α-1抗胰蛋白酶作為TBST中之1:1000之上樣對照(Sigma，目錄HPA001292)，並與TTR一級抗體同時培育。將墨點密封於袋中並在4℃下在實驗室搖桿上保持過夜。培育後，將墨點在TBST中沖洗3次，每次5min，並於室溫下用TBST中1:25,000之兔之二次抗體(ThermoFisher，目錄PISA535571)探測30min。培育後，將墨點在TBST中沖洗3次，每次5min，且用PBS沖洗2次。使用Licor Odyssey系統使墨點可視化並對其進行分析。
藉由西方墨點分析細胞內 TTR
如前所述用表1之選擇引導轉染肝細胞癌細胞系HUH7。轉染後6天，移除培養基並用50 µL/孔RIPA緩衝液(Boston Bio Products，目錄BP-115)加上新鮮添加之蛋白酶抑制劑混合物溶解細胞，該蛋白酶抑制劑混合物由全蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma，目錄11697498001)、1 mM DTT及250 U/ml全能核酸酶(Benzonase) (EMD Millipore，目錄71206-3)組成。將細胞在冰上保持30分鐘，此時添加NaCl (1M最終濃度)。將細胞溶解物充分混合並在冰上保留30分鐘。將全細胞提取物(「WCE」)轉移至PCR板並離心以使碎片成團塊。使用Bradford分析(Bio-Rad，目錄500-0001)來評估溶解物之蛋白含量。根據製造商之方案完成Bradford分析程序。使用前將提取物儲存在-20℃下。實施西方墨點法以評估細胞內TTR蛋白含量。將溶解物與Laemmli緩衝液混合，且在95℃下變性10min。使用NuPage系統在12% Bis-Tris凝膠(ThermoFisher)上根據製造商之方案運行西方墨點法，之後濕轉移至0.45 μm硝化纖維素膜(Bio-Rad，目錄1620115)上。轉移後，用水徹底沖洗膜，並用Ponceau S溶液(Boston Bio Products，目錄ST-180)染色，以確認完全且均勻轉移。於室溫下在實驗室搖桿上使用TBS中之5%奶粉封閉墨點30分鐘。將墨點用TBST沖洗，並用TBST中1:1000之兔α-TTR單株抗體(Abcam，目錄Ab75815)探測。使用TBST中1:2500之β-肌動蛋白作為上樣對照(ThermoFisher，目錄AM4302)且與TTR一級抗體同時培育。將墨點密封於袋中並在4℃下在實驗室搖桿上保持過夜。培育後，將墨點在TBST中沖洗3次，每次5分鐘，並於室溫下用TBST中1:25,000之小鼠及兔之二次抗體(ThermoFisher，目錄PI35518及PISA535571)各探測30min。培育後，將墨點在TBST中沖洗3次，每次5min，且用PBS沖洗2次。使用Licor Odyssey系統使墨點可視化並對其進行分析。
實例 2. dgRNA 序列之篩選
多種細胞類型中TTR dgRNA 之交叉篩選
將靶向人類TTR及食蟹猴匹配序列之dgRNA格式中之引導遞送至HEK293_Cas9、HUH7及HepG2細胞系以及如實例1中所述之原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞。測定包含跨每一細胞類型之每一引導序列之crRNA的編輯百分比，且然後基於最高編輯%對引導序列分等級次序。下文列示所有五種細胞系中表1中之引導序列之篩選數據(表4至11)。
表4顯示人類腎腺癌細胞系HEK293_Cas9中TTR crRNA之編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均及標準偏差，該人類腎腺癌細胞系組成型地過度表現Spy Cas9蛋白。
表 4 ： 經 dgRNA 轉染之 Hek_Cas9 細胞中之 TTR 編輯數據
表5顯示人類肝細胞癌細胞系HUH7中經Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2)共轉染之測試TTR crRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 5 ： 經 Spy Cas9 mRNA 及 dgRNA 轉染之 HUH7 細胞中之 TTR 編輯數據
表6顯示人類肝細胞癌細胞系HepG2中經Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2)共轉染之測試TTR及對照crRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 6 ： 經 Spy Cas9 mRNA 及 dgRNA 轉染之 HepG2 細胞中之 TTR 編輯數據
表7顯示原代人類肝細胞中經Spy Cas9蛋白(RNP)電穿孔之測試TTR dgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 7 ： 經裝載有 dgRNA 之 Spy Cas9 蛋白電穿孔之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表8顯示原代人類肝細胞中經Spy Cas9蛋白(RNP)轉染之測試TTR及對照dgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 8 ： 經裝載有 dgRNA 之 Spy Cas9 轉染之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表9顯示原代人類肝細胞中經Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2)共轉染之測試TTR及對照dgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 9 ： 經 Spy Cas9 mRNA 及 dgRNA 轉染之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表10顯示原代食蟹猴肝細胞中經Spy Cas9蛋白(RNP)電穿孔之測試TTR dgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 10 ： 經 Spy Cas9 蛋白 及 dgRNA 電穿孔之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
表11顯示原代食蟹猴肝細胞上經Spy Cas9蛋白(RNP)電穿孔之測試之食蟹猴特異性TTR dgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 11 ： 經 Spy Cas9 蛋白及食蟹猴特異性 dgRNA 電穿孔之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
實例 3. sgRNA 序列之篩選
多個細胞類型中 TTR sgRNA 之交叉篩選
將靶向人類及/或食蟹猴TTR之經修飾sgRNA格式中之引導遞送至如實例1中所述之原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞。測定包含跨每一細胞類型之每一引導序列之crRNA的編輯百分比，且然後基於最高編輯%對引導序列分等級次序。下文列示兩種細胞系中表2中之引導序列之篩選數據(表12至15)。
表12顯示原代人類肝細胞中經Spy Cas9蛋白(RNP)轉染之測試TTR sgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 12 ： 經 Spy Cas9 蛋白及 sgRNA 轉染之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表13顯示原代人類肝細胞中經Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2)共轉染之測試TTR sgRNA在12.5 nM下的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 13 ： 經 Spy Cas9 mRNA 及 sgRNA 轉染之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表14顯示原代食蟹猴肝細胞上經Spy Cas9蛋白(RNP)電穿孔之測試TTR sgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。注意，引導G000480及G000488與食蟹猴具有一個失配，其可損害該等引導在食蟹猴細胞中之編輯效率。
表 14 ： 經 Spy Cas9 蛋白及 sgRNA 電穿孔之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
表15顯示原代食蟹猴肝細胞上經Spy Cas9蛋白(RNP)電穿孔之測試之食蟹猴特異性TTR sgRNA的編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%之平均值及標準偏差。
表 15 ： 經 Spy Cas9 蛋白及食蟹猴特異性 sgRNA ( 例如 ， 具有類似人類 gRNA 之彼等 ， 參見表 3) 電穿孔之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
實例 4. 含有 Spy Ca9 mRNA 及 sgRNA 之脂質奈米粒子 (LNP) 調配物之篩選
原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞中將TTR sgRNA與Spy Cas9 mRNA調配在一起之LNP的交叉篩選。
在劑量反應曲線中，在原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞上測試靶向人類TTR及食蟹猴匹配之sgRNA序列之經修飾sgRNA的脂質奈米粒子調配物。如實例1中所述平鋪原代人類及食蟹猴肝細胞。在用LNP處理之前，將兩個細胞系在37℃、5% CO2 下培育24小時。使用NanoassemblrTM 程序製備表16-19中詳述之實驗中使用之LNP，其各自含有指定之sgRNA及Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2)，各自具有脂質。LNP含有分別45:44:9:2莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG且N:P比率為4.5。於37℃下將LNP在含有6%食蟹猴血清之肝細胞維持培養基中培育5分鐘。在培育後，以100 ng mRNA開始在8點2倍劑量反應曲線上將LNP添加至原代人類或食蟹猴肝細胞上。如實例1中所述，在處理後72小時溶解細胞用於NGS分析。測定包含跨每一細胞類型之每一引導序列之crRNA的編輯百分比，且然後基於12.5 ng mRNA輸入及3.9 nM引導濃度下之最高編輯%對引導序列分等級次序。兩個細胞系中之引導序列之劑量反應曲線數據示於圖4至7中。下文列示12.5 ng mRNA輸入及3.9 nM引導濃度下之編輯%(表16至18)。
表16顯示作為劑量反應曲線之原代人類肝細胞上與Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試TTR sgRNA之編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%於12.5 ng cas9 mRNA下的平均值及標準偏差。與可為實驗之人工製品之其他sgRNA相比，G000570展現了非特徵性劑量反應曲線。數據在圖4中以圖形方式顯示。
表 16 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2) 及 sgRNA 處理之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表17顯示作為劑量反應曲線之原代食蟹猴肝細胞上與Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試TTR sgRNA之編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%於12.5 ng mNRA及3.9 nM引導濃度下的平均值及標準偏差。數據在圖5中以圖形方式顯示。
表 17 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2) 及 sgRNA 處理之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
表18顯示作為劑量反應曲線之原代食蟹猴肝細胞上與Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試之食蟹猴特異性TTR sgRNA之編輯%、插入(Ins)%及缺失(Del)%於12.5 ng mRNA及3.9 nM引導濃度下的平均值及標準偏差。數據在圖6中以圖形方式顯示。
表 18 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA (SEQ ID NO:2) 及食蟹猴匹配之 sgRNA 處理之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞中將 TTR sgRNA 與 Spy Cas9 mRNA 調配在一起之 LNP 的交叉篩選
在劑量反應曲線中，在原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞上測試靶向人類TTR及食蟹猴匹配之sgRNA序列之經修飾sgRNA的脂質奈米粒子調配物。如實例1中所述平鋪原代人類及食蟹猴肝細胞。在用LNP處理之前，將兩個細胞系在37℃、5% CO2 下培育24小時。使用上述交叉流程序製備表20-22中詳述之實例中使用之LNP，但使用PD-10管柱(GE Healthcare Life Sciences)純化且使用Amicon離心過濾器單元(Millipore Sigma)離心，其各自含有指定之sgRNA及Cas9 mRNA (SEQ ID NO:1)。LNP含有分別50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG且N:P比率為6.0。於37℃、5% CO2 下將LNP在含有6%食蟹猴血清之肝細胞維持培養基中培育5分鐘。在培育後，以300 ng mRNA開始在8點3倍劑量反應曲線上將LNP添加至原代人類或食蟹猴肝細胞上。如實例1中所述，在處理後72小時溶解細胞用於NGS分析。測定包含跨每一細胞類型之每一引導序列之crRNA的編輯百分比，且然後基於EC50值及最大編輯%對引導序列分等級次序。兩個細胞系中之引導序列之劑量反應曲線曲線示於圖4至7中。下文列示EC50值及最大編輯% (表19至22)。
表19顯示作為劑量反應曲線之原代人類肝細胞上與U缺失之Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試之人類特異性TTR sgRNA的EC50及最大編輯。數據在圖4中以圖形方式顯示。
表 19 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA 及人類特異性 sgRNA 處理之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表20顯示作為劑量反應曲線之原代人類肝細胞上與U缺失之Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試之人類特異性TTR sgRNA的EC50及最大編輯。數據在圖16中以圖形方式顯示。
表 20 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA 及人類特異性 sgRNA 處理之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
表21顯示作為劑量反應曲線之原代人類肝細胞上與U缺失之Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試之食蟹猴匹配之TTR sgRNA的EC50及最大編輯。數據在圖17中以圖形方式顯示。
表 21 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA 及食蟹猴特異性 sgRNA 處理之原代人類肝細胞中的 TTR 編輯數據
表22顯示作為劑量反應曲線之原代食蟹猴肝細胞上與U缺失之Spy Cas9 mRNA調配於脂質奈米粒子中的測試之食蟹猴匹配之TTR sgRNA的EC50及最大編輯。數據在圖18中以圖形方式顯示。
表 22 ： 經 LNP 調配之 Spy Cas9 mRNA 及食蟹猴特異性 sgRNA 處理之原代食蟹猴肝細胞中的 TTR 編輯數據
實例 5. TTR dgRNA 及 sgRNA 之 脫 靶分析
TTR 引導之脫靶分析
使用基於寡核苷酸插入之分析(例如，參見Tsai等人，Nature Biotechnology 33,187-197；2015)測定由靶向TTR之Cas9切割之潛在脫靶基因體位點。在HEK293_Cas9細胞中篩選表1之45個dgRNA (及具有已知脫靶特性之兩個對照引導)。在補充有10%胎牛血清及500 µg/ml G418之DMEM培養基中培養組成型表現Spy Cas9之人類胚腎癌細胞系HEK293 (「HEK293_Cas9」)。在轉染之前24小時，將細胞以30,000個細胞/孔之密度平鋪於96孔板中。根據製造商之方案用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher，目錄13778150)轉染細胞。用含有個別crRNA (15 nM)、trRNA (15 nM)、具有(10 nM) Lipofectamine RNAiMAX之供體寡核苷酸(0.3 μL/孔)及OptiMem之脂複合物轉染細胞。轉染後24小時溶解細胞，且根據製造商推薦之方案使用Zymo之Quick gDNA 96提取套組(目錄號D3012)提取基因體DNA。使用Qubit高靈敏度dsDNA套組(Life Technologies)定量gDNA。根據Tsai等人(2015)之先前所述之方法製備文庫，其中進行微小修改。在Illumina之MiSeq及HiSeq 2500上實施定序。該分析鑑別一些crRNA之潛在脫靶位點，其繪製於圖2中。
表23顯示經TTR dgRNA以及雙鏈DNA寡核苷酸供體序列轉染之HekCas9細胞中檢測之脫靶整合位點數。
表 23 ： 經由基於寡核苷酸插入之分析針對 TTR dgRNA 檢測之脫靶整合位點數
另外，經由上述基於寡核苷酸之插入方法，評估引導亞組之Hek_Cas9細胞中原樣修飾之sgRNA的脫靶電位。脫靶結果繪製於圖4中。
表24顯示經TTR sgRNA以及雙鏈DNA寡核苷酸供體序列轉染之HekCas9細胞中檢測之脫靶整合位點數。
表 24 ： 經由插入檢測方法針對 TTR sgRNA 檢測之脫靶整合位點數
實例 6. 用於驗證潛在 脫 靶位點之 靶向定序
實例5中用於檢測潛在脫靶之HEK293_Cas9細胞組成型過度表現Cas9，與各種細胞類型中之瞬時遞送範例相比，導致更高數量之潛在脫靶「命中」。此外，當遞送sgRNA時(與dgRNA相反)，潛在脫靶命中數可進一步增多，此乃因sgRNA分子比dgRNA更穩定(特別當經化學修飾時)。因此，可使用鑑別之潛在脫靶位點之靶向定序來驗證藉由如實例5中使用之寡核苷酸插入方法鑑別的潛在脫靶位點。
在一種方法中，用包含Cas9 mRNA及所關注sgRNA (例如，具有用於評估之潛在脫靶位點之sgRNA)之LNP處理原代肝細胞。然後溶解原代肝細胞，並將側接潛在脫靶位點之引子用於產生用於NGS分析之擴增子。在一定程度上鑑別插入或缺失可驗證潛在脫靶位點，而在潛在脫靶位點未發現插入或缺失可指示HEK293_Cas9細胞分析中之偽陽性。
實例 7. 表型分析
分泌之 TTR 之西方墨點分析
如實例1中所述用表1之選擇引導一式三份轉染肝細胞癌細胞系HepG2。轉染後2天，收穫基因體DNA之一個重複，並藉由NGS定序分析編輯效率。轉染後5天，一次重複更換無血清之培養基。4hr後，如前所述，藉由WB收穫培養基用於分析分泌之TTR。每一引導之編輯%及細胞外TTR之減少之數據提供於圖7中。
細胞內 TTR 之西方墨點分析
如實例1中所述用包含表1之引導之crRNA轉染肝細胞癌細胞系HUH7。將轉染之細胞池保留在組織培養中並傳代用於進一步分析。轉染後7天，收穫細胞，且製備全細胞提取物(WCE)，並如前所述藉由西方墨點法經受分析。
藉由西方墨點法分析WCE之TTR蛋白減少。全長TTR蛋白具有約16 kD之預測分子量。在西方墨點之對照泳道中觀察到該分子量下之條帶。
使用Licor Odyssey Image Studio 5.2版軟體計算TTR蛋白之減少百分比。使用GAPDH作為上樣對照並與TTR同時探測。計算每一樣本內GAPDH之密度測定值與涵蓋TTR條帶之總區域相比的比率。在比率針對對照泳道正規化後測定TTR蛋白之減少百分比。結果顯示於圖8中。
實例 8. 至人類化 TTR 小鼠及具有 wt ( 鼠類 ) TTR 之小鼠之 LNP 遞送
向相對於TTR 基因人類化之小鼠投用含有表25中所指示之引導之LNP調配物701-704 (每個調配物5隻小鼠)。對該等人類化TTR小鼠進行工程改造，使得內源性鼠類TTR 基因座區域缺失，並經直向同源人類TTR序列置換，以使基因座編碼人類TTR蛋白。為了比較，向6隻具有鼠類TTR之小鼠投用LNP700，其含有靶向鼠類TTR之引導(G000282)。使用如上所述NanoassemblrTM 程序製備具有表25中之調配物編號1-5之LNP，而具有調配物編號6-16之LNP使用上述交叉流程序製備，但使用PD-10管柱(GE Healthcare Life Sciences)純化且使用Amicon離心過濾單元(Millipore Sigma)濃縮。作為陰性對照，向相應基因型之小鼠單獨投用媒劑(Tris-鹽水-蔗糖緩衝液(TSS))。投與具有表25中之調配物編號2-5之LNP的人類化TTR小鼠之背景係50% 129S6/SvEvTac 50% C57BL/6NTac；投與具有表25中之調配物編號6-16之LNP的人類化TTR小鼠以及具有鼠類TTR之小鼠(投與LNP700，調配物編號1)的背景係75% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac。
表 25. 投藥 人類化 TTR 小鼠之 LNP 調配物 .
具有調配物編號1-5之LNP含有SEQ ID NO:2之Cas9 mRNA且具有調配物編號6-16之LNP含有SEQ ID NO: 1之Cas9 mRNA，所有與引導皆呈1:1重量比。LNP分別含有表25中所列舉之莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。具有調配物編號1-5之LNP係以2 mg/kg (總RNA含量)投用且具有調配物編號6-16之LNP係以1 mg/kg (總RNA含量)投用。使用經設計以使用於NGS分析之所關注區域擴增的引子測定肝編輯結果。調配物編號1-5之肝編輯結果示於圖9中且指示人類TTR序列之編輯，其中四個引導中之每一者測試為＞35%編輯(平均值)之值，且G000494及G000499提供接近60%之值。調配物編號6-8、10-13及15-16之肝編輯結果示於圖13及表26中，其顯示利用所測試每一調配物之人類TTR序列的有效編輯。所有調配物皆觀察到大於38%編輯，其中若干調配物提供大於60%之編輯值。由於PCR擴增子之設計及產生之低定序讀數，未顯示調配物9及14。
在提供調配物編號6-8、10-13及15-16之小鼠中量測血清中人類TTR之含量。參見圖14B。圖14A係出於比較目的提供之圖13之重複。對於所測試每一調配物檢測到血清人類TTR之減弱，其與在肝中檢測到之編輯量相關(參見圖14A對圖14B，表26)。
表 26
在另一組實驗中，向人類化TTR小鼠投用一系列劑量之具有引導G000480、G000488、G000489及G000502的LNP調配物。調配物含有與引導呈1:1之重量比之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。LNP含有分別呈50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG，且N:P比率為6。劑量為1、0.3、0.1或0.03 mg/kg(n = 5/組)。使用上述交叉流程序製備LNP且分別使用PD-10管柱及Amicon離心過濾器單元純化及濃縮。使用經設計以使用於NGS分析之所關注區域擴增的引子測定肝編輯結果，且如上文所述量測血清人類TTR含量。肝編輯之結果示於圖26A中且血清人類TTR含量示於圖26B-C中。編輯及血清TTR含量之劑量反應係明顯的。
在另一組實驗中，向人類化TTR小鼠投用一系列劑量之具有引導G000481、G000482、G000486及G000499的LNP調配物。調配物含有與引導呈1:1之重量比之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。LNP含有分別呈50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG，且N:P比率為6。劑量為1、0.3或0.1 mg/kg(n = 5/組)。使用上述交叉流程序製備LNP且分別使用PD-10管柱及Amicon離心過濾器單元純化及濃縮。使用經設計以使用於NGS分析之所關注區域擴增的引子測定肝編輯結果，且如上文所述量測血清人類TTR含量。肝編輯之結果示於圖27A中且血清人類TTR含量示於圖27B-C中。編輯及血清TTR含量之劑量反應係明顯的。
在另一組實驗中，向人類化TTR小鼠投用一系列劑量之具有引導G000480、G000481、G000486、G000499及G000502的LNP調配物。調配物含有與引導呈1:2之重量比之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。LNP含有分別呈50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG，且N:P比率為6。劑量為1、0.3或0.1 mg/kg(n = 5/組)。使用上述交叉流程序製備LNP且分別使用PD-10管柱及Amicon離心過濾器單元純化及濃縮。使用經設計以使用於NGS分析之所關注區域擴增的引子測定肝編輯結果，且如上文所述量測血清人類TTR含量。肝編輯之結果示於圖28A中且血清人類TTR含量示於圖28B-C中。編輯及血清TTR含量之劑量反應係明顯的。
在使用野生型CD-1小鼠之單獨實驗中，在劑量反應研究中測試包含引導G000502 (其在小鼠與食蟹猴之間交叉同源)之LNP調配物。調配物含有與引導呈1:1之重量比之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。LNP含有分別呈45:44:9:2莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG，且N:P比率為6。劑量為1、0.3、0.1、0.03或0.01 mg/kg(n = 5/組)。使用經設計以使用於NGS分析之所關注區域擴增的引子測定肝編輯結果。肝編輯結果示於圖15A中且血清小鼠TTR含量示於圖15B中。編輯及血清TTR含量之劑量反應係明顯的。
實例 9. LNP 以多個劑量遞送至小鼠
向小鼠(雌性，來自Charles River Laboratory，約6-7週齡)投用LNP調配物LNP705，該LNP調配物係使用如上文所述交叉流及TFF程序製備且含有1:1重量比之G000282 (「G282」)及Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 2)及0.5 mg/ml之總RNA濃度。LNP之N:P比率為4.5，且分別含有45:44:9:2莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。每週一次至一週、兩週、三週或四週一次(QWx1-4)或每月一次至每兩個月或三個月一次(QMx2-3)向各組投藥。劑量為0.5 mg/kg或1 mg/kg (總RNA含量)。對照組在第1天接受0.5、1或2 mg/kg之單劑量。每組含有5隻小鼠。藉由ELISA分析血清TTR，且在驗證時收集各肝、脾及肌肉用於NGS編輯分析。各組示於表27中。X = 處死及驗屍。MPK = mg/kg。
表 27. 研究組
表28及圖10A-11B顯示血清TTR含量結果(KD% = 減弱%)。表29及圖12A-C顯示肝編輯結果。


表 28. 血清 TTR 結果 .
表 29. 肝編輯結果 .
結果顯示，隨著時間推移，可建立累積劑量及多次投與(包括以每週或每月間隔)之效應，以實現TTR之增加編輯程度及KD%。
實例 10. RNA 運送子 : 變化 mRNA 及 gRNA 比率
此研究評估不同比率之gRNA對mRNA之小鼠中之活體內效能。如實例1中所指示用N1-甲基假尿苷三磷酸酯代替尿苷三磷酸酯藉由IVT合成製備具有SEQ ID NO: 4之ORF、HSD 5’ UTR、人類白蛋白3’ UTR、Kozak序列及多-A尾之CleanCap™加帽之Cas9 mRNA。
自所述mRNA及如實例1中所述之G282 (SEQ ID NO: 124)利用呈50:38:9:3莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG且以6之N:P比率製備LNP調配物。調配物之gRNA:Cas9 mRNA重量比示於圖19A及19B中。
對於活體內表徵，將LNP以0.1 mg總RNA (mg引導RNA + mg mRNA)/kg投與小鼠(n = 5/組)。在投藥後7-9天，處死動物，收集血液及肝，且如實例1中所述量測血清TTR及肝編輯。血清TTR及肝編輯結果示於圖19A及19B中。向陰性對照小鼠投用TSS媒劑。
此外，將上述LNP以0.05 mg mRNA/kg之恆定mRNA劑量投與小鼠(n = 5/組)，同時將gRNA劑量自0.06 mg/kg變為0.4 mg/kg。在投藥後7-9天，處死動物，收集血液及肝，並量測血清TTR及肝編輯。血清TTR及肝編輯結果示於圖19C及圖19D中。向陰性對照小鼠投用TSS媒劑。
實 例 11. 原代人類肝細胞中 TTR sgRNA 之 脫 靶分析
如實例5中所述在原代人類肝細胞(PHH)中實施靶向TTR之sgRNA之脫靶分析，且具有以下修改。如實例1中所述將PHH以33,000個細胞/孔之密度平鋪於膠原塗佈之96孔板上。平鋪後24小時，用介質洗滌細胞並如實例1所述用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher，目錄13778150)進行轉染。用含有100 ng Cas9 mRNA之脂複合物轉染細胞，之後立即添加含有25 nM sgRNA及12.5 nM供體寡核苷酸之另一脂複合物(0.3 μL/孔)。轉染後48小時溶解細胞，且提取gDNA並如實例5中進一步闡述進行分析。數據在圖20中以圖形方式表示。
表30顯示PHH中檢測到之脫靶整合位點數，且與在實例5中使用之HekCas9細胞中檢測到之位點數相比較。與HekCas9細胞系相比，每個測試引導在PHH中檢測到之位點較少，在單獨PHH中未檢測到獨特位點。
表 30. 經由基於寡核苷酸插入之分析針對 PHH 中 TTR sgRNA 檢測之脫靶整合位點數
在經由寡核苷酸插入分析鑑別PHH中之潛在脫靶位點之後，例如如實例6中所述，藉由靶向之擴增子定序進一步評估某些潛在位點。除了藉由寡核苷酸插入策略鑑別之潛在脫靶位點之外，在分析中亦包括藉由電腦模擬預測鑑別之額外潛在脫靶位點。
為此，如實例4中所述，用包含100 ng Cas9 mRNA(SEQ ID NO:1)及14.68 nM所關注gRNA (以1:1重量比)之LNP處理PHH。使用上述交叉流程序製備LNP且分別使用PD-10管柱及Amicon離心過濾器單元純化及濃縮。LNP經調配以具有6.0之N:P比率，且分別含有呈50:38:9:2莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。在LNP處理後，藉由NGS (例如，如實例1及6中所述)分析分離之基因體DNA以確定是否可在潛在脫靶位點檢測到插入或缺失，此將指示Cas9介導之裂解事件。表31及32分別顯示對於gRNA G000480及G000486進行評估之潛在脫靶位點。
如圖21A-B及22A-B以及下表33中所示，對於G000480，藉由寡核苷酸插入分析鑑別之潛在脫靶位點中僅兩個以低程度檢測到插入或缺失，且對於G000486為僅一個以低程度檢測到插入或缺失。在任何引導之電腦模擬預測之位點中之任一者皆未檢測到插入或缺失。此外，僅在使用LNP之近飽和劑量之該等位點檢測到插入或缺失，此乃因在G000480及G000486之靶上位點觀察到之插入或缺失率分別為約97%及約91%(參見表33)。該等位點之基因體坐標亦報告於表31及32中，且各自對應於不編碼任何蛋白質之序列。
然後實施劑量反應分析以測定其中未檢測到脫靶之LNP之最高劑量。如實例4中所述用包含G000480或G000486之LNP處理PHH。相對於gRNA濃度，劑量範圍跨越11個點(0.001 nM、0.002 nM、0.007 nM、0.02 nM、0.06 nM、0.19 nM、0.57 nM、1.72 nM、5.17 nM、15.51 nM及46.55 nM)。如由圖21A-B及22A-B中之垂直虛線所表示，對於G000480及G000486不再檢測到潛在脫靶位點之最高濃度(相對於gRNA之濃度)分別為0.57 nM及15.51 nM，其分別導致84.60%及89.50%之靶上插入或缺失率。
表 31. 經由插入檢測及針對經由靶向擴增子定序評估之 G000480 電腦模擬預測鑑別之潛在脫靶位點
「INS-OT.N」係指藉由寡核苷酸插入檢測之脫靶位點ID，其中N係上文指定之整數；「PRED-OT.N」係指經由電腦模擬方法預測之脫靶位點ID，其中N係上文指定之整數。
表 32. 經由靶向擴增子定序評估之 G000486 經由插入檢測及電腦模擬預測的鑑別潛在脫靶位點
「INS-OT.N」係指藉由寡核苷酸插入檢測之脫靶位點ID，其中N係上文指定之整數；「PRED-OT.N」係指經由電腦模擬方法預測之脫靶位點ID，其中N係所指定之整數。
表 33. 經含有 100 ng mRNA 及 31.03 nM gRNA 之 LNP 處理之 PHH 中檢測到之脫靶位點
實例 12. 至 ATTR 之人 類 化小鼠模型 之 LNP 遞 送
此實例中使用表現人類TTR蛋白之V30M病原體突變形式之遺傳性ATTR澱粉樣變性的公認之人類化轉基因小鼠模型。此小鼠模型重述了在ATTR患者中觀察之組織中(包括在周圍神經系統及胃腸道內)的TTR沈積表型，(參見Santos等人，Neurobiol Aging. 2010年2月；31(2):280-9)。
向小鼠(約4-5個月齡)投用使用如實例1中所述之交叉流及TFF程序製備的LNP調配物。LNP經調配以具有6.0之N:P比率，且分別含有呈50:38:9:2莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。LNP含有Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)及G000481 (「G481」)或非靶向對照引導G000395 (「G395」；SEQ ID NO: 273)，gRNA:mRNA之重量比為1:1。
如實例1中所述經由側尾靜脈向小鼠注射1mg/kg (總RNA含量)之單一劑量之LNP，其中n = 10/組。在處理後8週，將小鼠安樂死用於樣本收集。如先前由Butler等人，Amyloid. 2016年6月；23(2):109-18所述藉由ELISA在血清及腦脊髓液(CSF)中量測人類TTR蛋白含量。如實例1中所述分析肝組織之編輯程度。收集其他組織(胃、結腸、坐骨神經、背根神經節(DRG))且如先前由Gonçalves等人，Amyloid. 2014年9月；21(3): 175-184所述處理，進行半定量免疫組織化學。使用曼-懷特尼試驗法(Mann Whitney test)進行免疫組織化學數據之統計分析，其中p值＜0.0001。
如圖23A-B中所示，在單劑量之包含G481之LNP後，在人類化小鼠之肝中觀察到TTR之穩健編輯(49.4%)，且在對照組中未檢測到編輯。編輯事件之分析證實，96.8%之事件係插入，其餘係缺失。
如圖24A-B中所示，TTR蛋白含量在經處理小鼠之血漿中降低但在CSF中不降低，觀察到TTR血漿含量減弱大於99% (p ＜0.001)。
經處理動物之血漿中觀察到之接近完全減弱之TTR，與分析之組織中TTR蛋白澱粉樣沈積之清除率呈相關性。如圖25中所示，對照小鼠在組織中出現之澱粉樣染色類似在患有ATTR之人類個體中觀察到之病理生理學。藉由編輯HuTTR V30M基因座減少循環TTR，導致組織中澱粉樣沈積顯著減少。在處理後8週，在處理之組織中觀察到約85%或更佳之TTR染色減少(圖25)。
實例 13. 原代人類肝細胞 (PHH) 中之 TTR mRNA 減弱
在一個實驗中，如實例4中所述，培養PHH且用包含Cas9 mRNA (SEQ ID NO:1)及所關注gRNA (參見圖29、表34)之LNP處理。使用上述交叉流程序製備LNP，且分別使用PD-10管柱及Amicon離心過濾器單元純化及濃縮。LNP經調配以具有6.0之N:P比率，且分別含有呈50:38:9:2莫耳比之脂質A、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。LNP包含1:2之gRNA:mRNA比率，且以300 ng之劑量(相對於所遞送mRNA運送子之量)處理細胞。
在LNP處理後九十六(96)小時(對於每種條件進行生物學一式三份)，根據製造商之方案，使用Dynabeads mRNA DIRECT套組(ThermoFisher Scientific)自PHH細胞純化mRNA。利用Maxima反轉錄酶(ThermoFisher Scientific)及聚-dT引子進行反轉錄(RT)。利用Ampure XP珠粒(Agencourt)純化所得cDNA。對於定量PCR，利用Taqman Fast Advanced Mastermix及3個Taqman探針組TTR (分析ID：Hs00174914_m1)、GAPDH (分析ID：Hs02786624_g1)及PPIB (分析ID：Hs00168719_m1)擴增2%之純化之cDNA。根據製造商之說明書(Life Technologies)在QuantStudio 7 Flex即時PCR系統上運行分析。藉由個別地正規化至內源對照(GAPDH及PPIB)計算TTR mRNA之相對表現，且然後取平均值。
如圖29中所示且在下表34中以數字方式再現，與陰性(未處理)對照相比，測試之每一LNP調配物導致TTR mRNA減弱。藉由每一LNP製備中使用之gRNA ID鑑別圖29及表34中之組。TTR mRNA之相對表現繪製於圖29中，而TTR mRNA之減弱百分比提供於表34中。
表 34.
在單獨實驗中，在用包含G000480、G000486及G000502之LNP處理後，評估TTR mRNA減弱。調配LNP且培養PHH並用LNP處理，各自如此實例中之上述實驗中所述，只是以100 ng之劑量(相對於所遞送mRNA運送子之量)處理細胞。
在LNP處理後九十六(96)小時(對於每種條件單次處理)，根據製造商之方案使用Dynabeads mRNA DIRECT套組(ThermoFisher Scientific)自PHH細胞純化mRNA。根據製造商之說明書用高容量cDNA反轉錄套組(ThermoFisher Scientific)實施反轉錄(RT)。對於定量PCR，利用Taqman Fast Advanced Mastermix及3個Taqman探針組TTR (分析ID：Hs00174914_m1)、GAPDH (分析ID：Hs02786624_g1)及PPIB (分析ID：Hs00168719_m1)擴增2%之cDNA。根據製造商之說明書(Life Technologies)在QuantStudio 7 Flex即時PCR系統上運行分析。藉由個別地正規化至內源對照(GAPDH及PPIB)計算TTR mRNA之相對表現，且然後取平均值。
如圖30中所示且在下表35中以數字方式再現，與陰性(未處理)對照相比，測試之每一LNP調配物導致TTR mRNA減弱。藉由每一LNP製備中使用之gRNA ID鑑別圖30及表35中之組。TTR mRNA之相對表現繪製於圖30中，而TTR mRNA之減弱百分比提供於表35中。
表 35.
序列表
以下序列表提供本文揭示之序列清單。應理解，若關於RNA提及DNA序列(包含Ts)，則Ts應經Us (其可根據上下文經修飾或經未修飾)置換，且反之亦然。
說明 序列 SEQ ID No.
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 1
包含對應於SEQ ID NO: 205之Cas9 ORF且使用在人類中通常高度表現之密碼子的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGCCTAAGAAAAAGCGGAAGGTCGACGGGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATTGATAGTCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 2
經修飾sgRNA序列(「N」可為任何天然或非天然核苷酸) mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 3
30/30/39多-A序列 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAACCGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 4
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003335 gRNA CUGCUCCUCCUCUGCCUUGC 5
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003336 gRNA CCUCCUCUGCCUUGCUGGAC 6
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003337 gRNA CCAGUCCAGCAAGGCAGAGG 7
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003338 gRNA AUACCAGUCCAGCAAGGCAG 8
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003339 gRNA ACACAAAUACCAGUCCAGCA 9
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003340 gRNA UGGACUGGUAUUUGUGUCUG 10
靶向人類TTR (外顯子1)之CR003341 gRNA CUGGUAUUUGUGUCUGAGGC 11
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003342 gRNA CUUCUCUACACCCAGGGCAC 12
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003343 gRNA CAGAGGACACUUGGAUUCAC 13
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003344 gRNA UUUGACCAUCAGAGGACACU 14
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003345 gRNA UCUAGAACUUUGACCAUCAG 15
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003346 gRNA AAAGUUCUAGAUGCUGUCCG 16
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003347 gRNA CAUUGAUGGCAGGACUGCCU 17
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003348 gRNA AGGCAGUCCUGCCAUCAAUG 18
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003349 gRNA UGCACGGCCACAUUGAUGGC 19
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003350 gRNA CACAUGCACGGCCACAUUGA 20
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003351 gRNA AGCCUUUCUGAACACAUGCA 21
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003352 gRNA GAAAGGCUGCUGAUGACACC 22
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003353 gRNA AAAGGCUGCUGAUGACACCU 23
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003354 gRNA ACCUGGGAGCCAUUUGCCUC 24
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003355 gRNA CCCAGAGGCAAAUGGCUCCC 25
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003356 gRNA GCAACUUACCCAGAGGCAAA 26
靶向人類TTR (外顯子2)之CR003357 gRNA UUCUUUGGCAACUUACCCAG 27
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003358 gRNA AUGCAGCUCUCCAGACUCAC 28
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003359 gRNA AGUGAGUCUGGAGAGCUGCA 29
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003360 gRNA GUGAGUCUGGAGAGCUGCAU 30
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003361 gRNA GCUGCAUGGGCUCACAACUG 31
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003362 gRNA GCAUGGGCUCACAACUGAGG 32
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003363 gRNA ACUGAGGAGGAAUUUGUAGA 33
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003364 gRNA CUGAGGAGGAAUUUGUAGAA 34
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003365 gRNA UGUAGAAGGGAUAUACAAAG 35
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003366 gRNA AAAUAGACACCAAAUCUUAC 36
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003367 gRNA AGACACCAAAUCUUACUGGA 37
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003368 gRNA AAGUGCCUUCCAGUAAGAUU 38
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003369 gRNA CUCUGCAUGCUCAUGGAAUG 39
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003370 gRNA CCUCUGCAUGCUCAUGGAAU 40
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003371 gRNA ACCUCUGCAUGCUCAUGGAA 41
靶向人類TTR (外顯子3)之CR003372 gRNA UACUCACCUCUGCAUGCUCA 42
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003373 gRNA GUAUUCACAGCCAACGACUC 43
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003374 gRNA GCGGCGGGGGCCGGAGUCGU 44
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003375 gRNA AAUGGUGUAGCGGCGGGGGC 45
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003376 gRNA CGGCAAUGGUGUAGCGGCGG 46
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003377 gRNA GCGGCAAUGGUGUAGCGGCG 47
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003378 gRNA GGCGGCAAUGGUGUAGCGGC 48
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003379 gRNA GGGCGGCAAUGGUGUAGCGG 49
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003380 gRNA GCAGGGCGGCAAUGGUGUAG 50
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003381 gRNA GGGGCUCAGCAGGGCGGCAA 51
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003382 gRNA GGAGUAGGGGCUCAGCAGGG 52
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003383 gRNA AUAGGAGUAGGGGCUCAGCA 53
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003384 gRNA AAUAGGAGUAGGGGCUCAGC 54
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003385 gRNA CCCCUACUCCUAUUCCACCA 55
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003386 gRNA CCGUGGUGGAAUAGGAGUAG 56
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003387 gRNA GCCGUGGUGGAAUAGGAGUA 57
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003388 gRNA GACGACAGCCGUGGUGGAAU 58
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003389 gRNA AUUGGUGACGACAGCCGUGG 59
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003390 gRNA GGGAUUGGUGACGACAGCCG 60
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003391 gRNA GGCUGUCGUCACCAAUCCCA 61
靶向人類TTR (外顯子4)之CR003392 gRNA AGUCCCUCAUUCCUUGGGAU 62
靶向人類TTR (外顯子1)之CR005298 gRNA UCCACUCAUUCUUGGCAGGA 63
靶向人類TTR (外顯子4)之CR005299 gRNA AGCCGUGGUGGAAUAGGAGU 64
靶向人類TTR (外顯子1)之CR005300 gRNA UCACAGAAACACUCACCGUA 65
靶向人類TTR (外顯子1)之CR005301 gRNA GUCACAGAAACACUCACCGU 66
靶向人類TTR (外顯子2)之CR005302 gRNA ACGUGUCUUCUCUACACCCA 67
靶向人類TTR (外顯子2)之CR005303 gRNA UGAAUCCAAGUGUCCUCUGA 68
靶向人類TTR (外顯子2)之CR005304 gRNA GGCCGUGCAUGUGUUCAGAA 69
靶向人類TTR (外顯子3)之CR005305 gRNA UAUAGGAAAACCAGUGAGUC 70
靶向人類TTR (外顯子3)之CR005306 gRNA AAAUCUUACUGGAAGGCACU 71
靶向人類TTR (外顯子4)之CR005307 gRNA UGUCUGUCUUCUCUCAUAGG 72
靶向食蟹猴TTR之CR000689 gRNA ACACAAAUACCAGUCCAGCG 73
靶向食蟹猴TTR之CR005364 gRNA AAAGGCUGCUGAUGAGACCU 74
靶向食蟹猴TTR之CR005365 gRNA CAUUGACAGCAGGACUGCCU 75
靶向食蟹猴TTR之CR005366 gRNA AUACCAGUCCAGCGAGGCAG 76
靶向食蟹猴TTR之CR005367 gRNA CCAGUCCAGCGAGGCAGAGG 77
靶向食蟹猴TTR之CR005368 gRNA CCUCCUCUGCCUCGCUGGAC 78
靶向食蟹猴TTR之CR005369 gRNA AAAGUUCUAGAUGCCGUCCG 79
靶向食蟹猴TTR之CR005370 gRNA ACUUGUCUUCUCUAUACCCA 80
靶向食蟹猴TTR之CR005371 gRNA AAGUGACUUCCAGUAAGAUU 81
靶向食蟹猴TTR之CR005372 gRNA AAAAGGCUGCUGAUGAGACC 82
未使用 83
未使用 84
未使用 85
未使用 86
靶向人類TTR之G000480 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mA*GGCUGCUGAUGACACCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 87
靶向人類TTR之G000481 sgRNA修飾之序列 mU*mC*mU*AGAACUUUGACCAUCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 88
靶向人類TTR之G000482 sgRNA修飾之序列 mU*mG*mU*AGAAGGGAUAUACAAAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 89
靶向人類TTR之G000483 sgRNA修飾之序列 mU*mC*mC*ACUCAUUCUUGGCAGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 90
靶向人類TTR之G000484 sgRNA修飾之序列 mA*mG*mA*CACCAAAUCUUACUGGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 91
靶向人類TTR之G000485 sgRNA修飾之序列 mC*mC*mU*CCUCUGCCUUGCUGGACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 92
靶向人類TTR之G000486 sgRNA修飾之序列 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 93
靶向人類TTR之G000487 sgRNA修飾之序列 mU*mU*mC*UUUGGCAACUUACCCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 94
靶向人類TTR之G000488 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mA*GUUCUAGAUGCUGUCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 95
靶向人類TTR之G000489 sgRNA修飾之序列 mU*mU*mU*GACCAUCAGAGGACACUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 96
靶向人類TTR之G000490 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mA*UAGACACCAAAUCUUACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 97
靶向人類TTR之G000491 sgRNA修飾之序列 mA*mU*mA*CCAGUCCAGCAAGGCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 98
靶向人類TTR之G000492 sgRNA修飾之序列 mC*mU*mU*CUCUACACCCAGGGCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 99
靶向人類TTR之G000493 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mG*UGCCUUCCAGUAAGAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 100
靶向人類TTR之G000494 sgRNA修飾之序列 mG*mU*mG*AGUCUGGAGAGCUGCAUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 101
靶向人類TTR之G000495 sgRNA修飾之序列 mC*mA*mG*AGGACACUUGGAUUCACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 102
靶向人類TTR之G000496 sgRNA修飾之序列 mG*mG*mC*CGUGCAUGUGUUCAGAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 103
靶向人類TTR之G000497 sgRNA修飾之序列 mC*mU*mG*CUCCUCCUCUGCCUUGCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 104
靶向人類TTR之G000498 sgRNA修飾之序列 mA*mG*mU*GAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 105
靶向人類TTR之G000499 sgRNA修飾之序列 mU*mG*mA*AUCCAAGUGUCCUCUGAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 106
靶向人類TTR之G000500 sgRNA修飾之序列 mC*mC*mA*GUCCAGCAAGGCAGAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 107
靶向人類TTR之G000501 sgRNA修飾之序列 mU*mC*mA*CAGAAACACUCACCGUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 108
靶向人類TTR之G000567 sgRNA修飾之序列 mG*mA*mA*AGGCUGCUGAUGACACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 109
靶向人類TTR之G000568 sgRNA修飾之序列 mG*mG*mC*UGUCGUCACCAAUCCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 110
靶向人類TTR之G000570 sgRNA修飾之序列 mC*mA*mU*UGAUGGCAGGACUGCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 111
靶向人類TTR之G000571 sgRNA修飾之序列 mG*mU*mC*ACAGAAACACUCACCGUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 112
靶向人類TTR之G000572 sgRNA修飾之序列 mC*mC*mC*CUACUCCUAUUCCACCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 113
靶向食蟹猴TTR之G000502 sgRNA修飾之序列 mA*mC*mA*CAAAUACCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 114
靶向食蟹猴TTR之G000503 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mA*AGGCUGCUGAUGAGACCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 115
靶向食蟹猴TTR之G000504 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mA*GGCUGCUGAUGAGACCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 116
靶向食蟹猴TTR之G000505 sgRNA修飾之序列 mC*mA*mU*UGACAGCAGGACUGCCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 117
靶向食蟹猴TTR之G000506 sgRNA修飾之序列 mA*mU*mA*CCAGUCCAGCGAGGCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 118
靶向食蟹猴TTR之G000507 sgRNA修飾之序列 mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAGAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 119
靶向食蟹猴TTR之G000508 sgRNA修飾之序列 mC*mC*mU*CCUCUGCCUCGCUGGACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 120
靶向食蟹猴TTR之G000509 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mA*GUUCUAGAUGCCGUCCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 121
靶向食蟹猴TTR之G000510 sgRNA修飾之序列 mA*mC*mU*UGUCUUCUCUAUACCCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 122
靶向食蟹猴TTR之G000511 sgRNA修飾之序列 mA*mA*mG*UGACUUCCAGUAAGAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 123
靶向小鼠TTR之G000282 sgRNA修飾之序列 mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 124
未使用 125至200
使用表3中所列示最小尿苷密碼子之胸苷類似物之Cas9的DNA編碼序列，具有起始及終止密碼子 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG 201
使用在人類中通常高度表現之密碼子之Cas9的DNA編碼序列 ATGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATGGCGGTGGATCTCCGAAAAAGAAGAGAAAGGTGTAATGA 202
具有一個核定位信號(1xNLS)作為C-末端7個胺基酸之Cas9的胺基酸序列 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV 203
使用最小尿苷密碼子之Cas9 mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG 204
使用在人類中通常高度表現之密碼子之Cas9 mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGAUAAGAAGUACUCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAGUGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGGAGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUCGCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGGUGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAACAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCUACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGACCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCCGCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUCCGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACCAACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCCAAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUUUUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUUUCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACUCUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCACAAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAACCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAACACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCGGUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUCGUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGACCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCUAGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAGGAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCCCCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGCCAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAUCGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCACUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAUCAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGAUAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACUUCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGCCUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGUGAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCCGGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAACCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGAAGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGACAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGACAUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUCGCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUUCGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUGGUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGAUAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUGGCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGCCUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACAGGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCGCCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCGACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAUCGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCCAGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAAACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAAAAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUCGGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUUUCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGGUCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGCGAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCGAGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAAACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCGCAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGAUAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAACUUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAGAGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACGCUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAAUCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGAAGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCGAAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGAAAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUCGAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCAGGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGUCAAUAUUGUGAAGAAAACCGAAGUGCAAACCGGCGGAUUUUCAAAGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCACGCAAGAAAGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGAUUCGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGGGGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUUGAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUCUGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAUGGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAGGAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUAUCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUAACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUGGAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAUCCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUAAGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUCCACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCAAGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACCAAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUGGACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGAUGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGA 205
Cas9切口酶(D10A)胺基酸序列 MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV 206
Cas9切口酶(D10A) mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG 207
dCas9 (D10A H840A)胺基酸序列 MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV 208
dCas9 (D10A H840A) mRNA ORF AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCUAG 209
使用最小尿苷密碼子之Cas9 mRNA編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC 210
使用最小尿苷密碼子之Cas9切口酶編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC 211
使用最小尿苷密碼子之dCas9編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC 212
Cas9之胺基酸序列(無NLS) MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 213
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 213之Cas9 mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG 214
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 213之Cas9編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC 215
Cas9切口酶之胺基酸序列(無NLS) MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 216
使用如表3中所列示之最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 216之Cas9切口酶mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG 217
使用如表3中所列示之最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 216之Cas9切口酶編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC 218
dCas9之胺基酸序列(無NLS) MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD 219
使用如表3中所列示之最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 219之dCas9 mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG 220
使用如表3中所列示之最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 219之dCas9編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGC 221
具有兩個核定位信號(2xNLS)作為C-末端胺基酸之Cas9的胺基酸序列 MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSGSPKKKRKVDGSPKKKRKVDSG 222
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 222之Cas9 mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUAG 223
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 222之Cas9編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA 224
具有兩個核定位信號作為C-末端胺基酸之Cas9切口酶的胺基酸序列 MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSGSPKKKRKVDGSPKKKRKVDSG 225
使用如表3中所列示之最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 25之Cas9切口酶mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUAG 226
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 25之Cas9切口酶編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA 227
具有兩個核定位信號作為C-末端胺基酸之dCas9的胺基酸序列 MDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSGSPKKKRKVDGSPKKKRKVDSG 228
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 228之dCas9 mRNA ORF，具有起始及終止密碼子 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC GGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUAG 229
使用最小尿苷密碼子之編碼SEQ ID NO: 228之dCas9編碼序列(無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGCAAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACGCAAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA 230
T7啟動子 TAATACGACTCACTATA 231
人類β-珠蛋白5’ UTR ACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC 232
人類β-珠蛋白3’ UTR GCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGC 233
人類α-珠蛋白5’ UTR CATAAACCCTGGCGCGCTCGCGGCCCGGCACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCACC 234
人類α-珠蛋白3’ UTR GCTGGAGCCTCGGTGGCCATGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC 235
非洲爪蟾β-珠蛋白5’ UTR AAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCC 236
非洲爪蟾β-珠蛋白3’ UTR ACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACATTCT 237
牛生長激素5’ UTR CAGGGTCCTGTGGACAGCTCACCAGCT 238
牛生長激素3’ UTR TTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCA 239
小鼠血紅素α，成人鏈1 (Hba-a1)，3’UTR GCTGCCTTCTGCGGGGCTTGCCTTCTGGCCATGCCCTTCTTCTCTCCCTTGCACCTGTACCTCTTGGTCTTTGAATAAAGCCTGAGTAGGAAG 240
HSD17B4 5’ UTR TCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTC 241
靶向小鼠TTR 基因之G282單引導RNA mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 242
未使用 243
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 244
具有19.36% U含量之替代Cas9 ORF ATGGATAAGAAGTACTCGATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAGAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAAATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTGGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTGTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCCAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAGAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATTTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCCAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGCAAACAGAGAACCTTTGACAACGGAAGCATTCCACACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAATCCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGAGCGGAGAACAGAAGAAAGCGATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGAGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAGTTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTGAGCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATCCTGCAAACTGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCCATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCCTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTCTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTGGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTGCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAGAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAGAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCTCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGACCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATGGTGGCGGTGGATCCTACCCATACGACGTGCCTGACTACGCCTCCGGAGGTGGTGGCCCCAAGAAGAAACGGAAGGTGTGATAG 245
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 245之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCTGCCACCATGGATAAGAAGTACTCGATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAGAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAAATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTGGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTGTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCCAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAGAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATTTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCCAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGCAAACAGAGAACCTTTGACAACGGAAGCATTCCACACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAATCCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGAGCGGAGAACAGAAGAAAGCGATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGAGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAGTTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTGAGCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATCCTGCAAACTGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCCATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCCTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTCTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTGGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTGCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAGAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAGAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCTCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGACCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATGGTGGCGGTGGATCCTACCCATACGACGTGCCTGACTACGCCTCCGGAGGTGGTGGCCCCAAGAAGAAACGGAAGGTGTGATAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 246
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 245之ORF及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCTATGGATAAGAAGTACTCGATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAGAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAAATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTGGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTGTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCCAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAGAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATTTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCCAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGCAAACAGAGAACCTTTGACAACGGAAGCATTCCACACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAATCCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGAGCGGAGAACAGAAGAAAGCGATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGAGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAGTTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAGAAAGCACAAGTGAGCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATCCTGCAAACTGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCCATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCCTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTCTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTGGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTGCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAGAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAGAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCTCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGACCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATGGTGGCGGTGGATCCTACCCATACGACGTGCCTGACTACGCCTCCGGAGGTGGTGGCCCCAAGAAGAAACGGAAGGTGTGATAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 247
未使用 248
包含Kozak序列與Cas9 ORF且使用在人類中通常高度表現之密碼子的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGCCTAAGAAAAAGCGGAAGGTCGACGGGGATAAGAAGTACTCAATCGGGCTGGATATCGGAACTAATTCCGTGGGTTGGGCAGTGATCACGGATGAATACAAAGTGCCGTCCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGGAACACCGATAGACACAGCATCAAGAAAAATCTCATCGGAGCCCTGCTGTTTGACTCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGGCTCAAACGTACCGCGAGGCGACGCTACACCCGGCGGAAGAATCGCATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTTTCGAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACCGCCTGGAAGAATCTTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCATGAACGGCATCCTATCTTTGGAAACATCGTCGACGAAGTGGCGTACCACGAAAAGTACCCGACCATCTACCATCTGCGGAAGAAGTTGGTTGACTCAACTGACAAGGCCGACCTCAGATTGATCTACTTGGCCCTCGCCCATATGATCAAATTCCGCGGACACTTCCTGATCGAAGGCGATCTGAACCCTGATAACTCCGACGTGGATAAGCTTTTCATTCAACTGGTGCAGACCTACAACCAACTGTTCGAAGAAAACCCAATCAATGCTAGCGGCGTCGATGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCGAAGTCGCGGCGCCTCGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACTTTTCGGCAACTTGATCGCTCTCTCACTGGGACTCACTCCCAATTTCAAGTCCAATTTTGACCTGGCCGAGGACGCGAAGCTGCAACTCTCAAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAATTTGCTGGCACAAATTGGCGATCAGTACGCGGATCTGTTCCTTGCCGCTAAGAACCTTTCGGACGCAATCTTGCTGTCCGATATCCTGCGCGTGAACACCGAAATAACCAAAGCGCCGCTTAGCGCCTCGATGATTAAGCGGTACGACGAGCATCACCAGGATCTCACGCTGCTCAAAGCGCTCGTGAGACAGCAACTGCCTGAAAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAATGGGTACGCAGGGTACATCGATGGAGGCGCTAGCCAGGAAGAGTTCTATAAGTTCATCAAGCCAATCCTGGAAAAGATGGACGGAACCGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGGGAGGATCTGCTCCGGAAACAGAGAACCTTTGACAACGGATCCATTCCCCACCAGATCCATCTGGGTGAGCTGCACGCCATCTTGCGGCGCCAGGAGGACTTTTACCCATTCCTCAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAAATTCTGACGTTCCGCATCCCGTATTACGTGGGCCCACTGGCGCGCGGCAATTCGCGCTTCGCGTGGATGACTAGAAAATCAGAGGAAACCATCACTCCTTGGAATTTCGAGGAAGTTGTGGATAAGGGAGCTTCGGCACAAAGCTTCATCGAACGAATGACCAACTTCGACAAGAATCTCCCAAACGAGAAGGTGCTTCCTAAGCACAGCCTCCTTTACGAATACTTCACTGTCTACAACGAACTGACTAAAGTGAAATACGTTACTGAAGGAATGAGGAAGCCGGCCTTTCTGTCCGGAGAACAGAAGAAAGCAATTGTCGATCTGCTGTTCAAGACCAACCGCAAGGTGACCGTCAAGCAGCTTAAAGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGTTTCGACTCAGTGGAAATCAGCGGGGTGGAGGACAGATTCAACGCTTCGCTGGGAACCTATCATGATCTCCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTTGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAAGATATCGTCCTGACCTTGACCCTTTTCGAGGATCGCGAGATGATCGAGGAGAGGCTTAAGACCTACGCTCATCTCTTCGACGATAAGGTCATGAAACAACTCAAGCGCCGCCGGTACACTGGTTGGGGCCGCCTCTCCCGCAAGCTGATCAACGGTATTCGCGATAAACAGAGCGGTAAAACTATCCTGGATTTCCTCAAATCGGATGGCTTCGCTAATCGTAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAGGAGGACATCCAAAAAGCACAAGTGTCCGGACAGGGAGACTCACTCCATGAACACATCGCGAATCTGGCCGGTTCGCCGGCGATTAAGAAGGGAATTCTGCAAACTGTGAAGGTGGTCGACGAGCTGGTGAAGGTCATGGGACGGCACAAACCGGAGAATATCGTGATTGAAATGGCCCGAGAAAACCAGACTACCCAGAAGGGCCAGAAAAACTCCCGCGAAAGGATGAAGCGGATCGAAGAAGGAATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAGCACCCGGTGGAAAACACGCAGCTGCAGAACGAGAAGCTCTACCTGTACTATTTGCAAAATGGACGGGACATGTACGTGGACCAAGAGCTGGACATCAATCGGTTGTCTGATTACGACGTGGACCACATCGTTCCACAGTCCTTTCTGAAGGATGACTCGATCGATAACAAGGTGTTGACTCGCAGCGACAAGAACAGAGGGAAGTCAGATAATGTGCCATCGGAGGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAATTACTGGCGGCAGCTCCTGAATGCGAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTTGACAATCTCACTAAAGCCGAGCGCGGCGGACTCTCAGAGCTGGATAAGGCTGGATTCATCAAACGGCAGCTGGTCGAGACTCGGCAGATTACCAAGCACGTGGCGCAGATCTTGGACTCCCGCATGAACACTAAATACGACGAGAACGATAAGCTCATCCGGGAAGTGAAGGTGATTACCCTGAAAAGCAAACTTGTGTCGGACTTTCGGAAGGACTTTCAGTTTTACAAAGTGAGAGAAATCAACAACTACCATCACGCGCATGACGCATACCTCAACGCTGTGGTCGGTACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAACTTGAATCGGAGTTTGTGTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTGAGGAAGATGATAGCCAAGTCCGAACAGGAAATCGGGAAAGCAACTGCGAAATACTTCTTTTACTCAAACATCATGAACTTTTTCAAGACTGAAATTACGCTGGCCAATGGAGAAATCAGGAAGAGGCCACTGATCGAAACTAACGGAGAAACGGGCGAAATCGTGTGGGACAAGGGCAGGGACTTCGCAACTGTTCGCAAAGTGCTCTCTATGCCGCAAGTCAATATTGTGAAGAAAACCGAAGTGCAAACCGGCGGATTTTCAAAGGAATCGATCCTCCCAAAGAGAAATAGCGACAAGCTCATTGCACGCAAGAAAGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGATTCGCCGACTGTCGCATACTCCGTCCTCGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGAAAGAGCAAAAAGCTCAAATCCGTCAAAGAGCTGCTGGGGATTACCATCATGGAACGATCCTCGTTCGAGAAGAACCCGATTGATTTCCTCGAGGCGAAGGGTTACAAGGAGGTGAAGAAGGATCTGATCATCAAACTCCCCAAGTACTCACTGTTCGAACTGGAAAATGGTCGGAAGCGCATGCTGGCTTCGGCCGGAGAACTCCAAAAAGGAAATGAGCTGGCCTTGCCTAGCAAGTACGTCAACTTCCTCTATCTTGCTTCGCACTACGAAAAACTCAAAGGGTCACCGGAAGATAACGAACAGAAGCAGCTTTTCGTGGAGCAGCACAAGCATTATCTGGATGAAATCATCGAACAAATCTCCGAGTTTTCAAAGCGCGTGATCCTCGCCGACGCCAACCTCGACAAAGTCCTGTCGGCCTACAATAAGCATAGAGATAAGCCGATCAGAGAACAGGCCGAGAACATTATCCACTTGTTCACCCTGACTAACCTGGGAGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGATACTACTATCGATCGCAAAAGATACACGTCCACCAAGGAAGTTCTGGACGCGACCCTGATCCACCAAAGCATCACTGGACTCTACGAAACTAGGATCGATCTGTCGCAGCTGGGTGGCGATTGATAGTCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 249
移除剪接點之Cas9 ORF；12.75% U含量 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACcggCTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAaAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG 250
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 250之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACcggCTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAaAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 251
具有通常頻繁用於人類中之最小尿苷密碼子的Cas9 ORF；12.75% U含量 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGAATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAGAGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAGAAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCAGAAAGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGTGAGAAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAGAAAGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGTGA 252
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 252之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGAATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAGAGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAGAAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCAGAAAGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGTGAGAAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAGAAAGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGTGACTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 253
具有通常很少用於人類中之最小尿苷密碼子的Cas9 ORF；12.75% U含量 ATGGACAAAAAATACAGCATAGGGCTAGACATAGGGACGAACAGCGTAGGGTGGGCGGTAATAACGGACGAATACAAAGTACCGAGCAAAAAATTCAAAGTACTAGGGAACACGGACCGACACAGCATAAAAAAAAACCTAATAGGGGCGCTACTATTCGACAGCGGGGAAACGGCGGAAGCGACGCGACTAAAACGAACGGCGCGACGACGATACACGCGACGAAAAAACCGAATATGCTACCTACAAGAAATATTCAGCAACGAAATGGCGAAAGTAGACGACAGCTTCTTCCACCGACTAGAAGAAAGCTTCCTAGTAGAAGAAGACAAAAAACACGAACGACACCCGATATTCGGGAACATAGTAGACGAAGTAGCGTACCACGAAAAATACCCGACGATATACCACCTACGAAAAAAACTAGTAGACAGCACGGACAAAGCGGACCTACGACTAATATACCTAGCGCTAGCGCACATGATAAAATTCCGAGGGCACTTCCTAATAGAAGGGGACCTAAACCCGGACAACAGCGACGTAGACAAACTATTCATACAACTAGTACAAACGTACAACCAACTATTCGAAGAAAACCCGATAAACGCGAGCGGGGTAGACGCGAAAGCGATACTAAGCGCGCGACTAAGCAAAAGCCGACGACTAGAAAACCTAATAGCGCAACTACCGGGGGAAAAAAAAAACGGGCTATTCGGGAACCTAATAGCGCTAAGCCTAGGGCTAACGCCGAACTTCAAAAGCAACTTCGACCTAGCGGAAGACGCGAAACTACAACTAAGCAAAGACACGTACGACGACGACCTAGACAACCTACTAGCGCAAATAGGGGACCAATACGCGGACCTATTCCTAGCGGCGAAAAACCTAAGCGACGCGATACTACTAAGCGACATACTACGAGTAAACACGGAAATAACGAAAGCGCCGCTAAGCGCGAGCATGATAAAACGATACGACGAACACCACCAAGACCTAACGCTACTAAAAGCGCTAGTACGACAACAACTACCGGAAAAATACAAAGAAATATTCTTCGACCAAAGCAAAAACGGGTACGCGGGGTACATAGACGGGGGGGCGAGCCAAGAAGAATTCTACAAATTCATAAAACCGATACTAGAAAAAATGGACGGGACGGAAGAACTACTAGTAAAACTAAACCGAGAAGACCTACTACGAAAACAACGAACGTTCGACAACGGGAGCATACCGCACCAAATACACCTAGGGGAACTACACGCGATACTACGACGACAAGAAGACTTCTACCCGTTCCTAAAAGACAACCGAGAAAAAATAGAAAAAATACTAACGTTCCGAATACCGTACTACGTAGGGCCGCTAGCGCGAGGGAACAGCCGATTCGCGTGGATGACGCGAAAAAGCGAAGAAACGATAACGCCGTGGAACTTCGAAGAAGTAGTAGACAAAGGGGCGAGCGCGCAAAGCTTCATAGAACGAATGACGAACTTCGACAAAAACCTACCGAACGAAAAAGTACTACCGAAACACAGCCTACTATACGAATACTTCACGGTATACAACGAACTAACGAAAGTAAAATACGTAACGGAAGGGATGCGAAAACCGGCGTTCCTAAGCGGGGAACAAAAAAAAGCGATAGTAGACCTACTATTCAAAACGAACCGAAAAGTAACGGTAAAACAACTAAAAGAAGACTACTTCAAAAAAATAGAATGCTTCGACAGCGTAGAAATAAGCGGGGTAGAAGACCGATTCAACGCGAGCCTAGGGACGTACCACGACCTACTAAAAATAATAAAAGACAAAGACTTCCTAGACAACGAAGAAAACGAAGACATACTAGAAGACATAGTACTAACGCTAACGCTATTCGAAGACCGAGAAATGATAGAAGAACGACTAAAAACGTACGCGCACCTATTCGACGACAAAGTAATGAAACAACTAAAACGACGACGATACACGGGGTGGGGGCGACTAAGCCGAAAACTAATAAACGGGATACGAGACAAACAAAGCGGGAAAACGATACTAGACTTCCTAAAAAGCGACGGGTTCGCGAACCGAAACTTCATGCAACTAATACACGACGACAGCCTAACGTTCAAAGAAGACATACAAAAAGCGCAAGTAAGCGGGCAAGGGGACAGCCTACACGAACACATAGCGAACCTAGCGGGGAGCCCGGCGATAAAAAAAGGGATACTACAAACGGTAAAAGTAGTAGACGAACTAGTAAAAGTAATGGGGCGACACAAACCGGAAAACATAGTAATAGAAATGGCGCGAGAAAACCAAACGACGCAAAAAGGGCAAAAAAACAGCCGAGAACGAATGAAACGAATAGAAGAAGGGATAAAAGAACTAGGGAGCCAAATACTAAAAGAACACCCGGTAGAAAACACGCAACTACAAAACGAAAAACTATACCTATACTACCTACAAAACGGGCGAGACATGTACGTAGACCAAGAACTAGACATAAACCGACTAAGCGACTACGACGTAGACCACATAGTACCGCAAAGCTTCCTAAAAGACGACAGCATAGACAACAAAGTACTAACGCGAAGCGACAAAAACCGAGGGAAAAGCGACAACGTACCGAGCGAAGAAGTAGTAAAAAAAATGAAAAACTACTGGCGACAACTACTAAACGCGAAACTAATAACGCAACGAAAATTCGACAACCTAACGAAAGCGGAACGAGGGGGGCTAAGCGAACTAGACAAAGCGGGGTTCATAAAACGACAACTAGTAGAAACGCGACAAATAACGAAACACGTAGCGCAAATACTAGACAGCCGAATGAACACGAAATACGACGAAAACGACAAACTAATACGAGAAGTAAAAGTAATAACGCTAAAAAGCAAACTAGTAAGCGACTTCCGAAAAGACTTCCAATTCTACAAAGTACGAGAAATAAACAACTACCACCACGCGCACGACGCGTACCTAAACGCGGTAGTAGGGACGGCGCTAATAAAAAAATACCCGAAACTAGAAAGCGAATTCGTATACGGGGACTACAAAGTATACGACGTACGAAAAATGATAGCGAAAAGCGAACAAGAAATAGGGAAAGCGACGGCGAAATACTTCTTCTACAGCAACATAATGAACTTCTTCAAAACGGAAATAACGCTAGCGAACGGGGAAATACGAAAACGACCGCTAATAGAAACGAACGGGGAAACGGGGGAAATAGTATGGGACAAAGGGCGAGACTTCGCGACGGTACGAAAAGTACTAAGCATGCCGCAAGTAAACATAGTAAAAAAAACGGAAGTACAAACGGGGGGGTTCAGCAAAGAAAGCATACTACCGAAACGAAACAGCGACAAACTAATAGCGCGAAAAAAAGACTGGGACCCGAAAAAATACGGGGGGTTCGACAGCCCGACGGTAGCGTACAGCGTACTAGTAGTAGCGAAAGTAGAAAAAGGGAAAAGCAAAAAACTAAAAAGCGTAAAAGAACTACTAGGGATAACGATAATGGAACGAAGCAGCTTCGAAAAAAACCCGATAGACTTCCTAGAAGCGAAAGGGTACAAAGAAGTAAAAAAAGACCTAATAATAAAACTACCGAAATACAGCCTATTCGAACTAGAAAACGGGCGAAAACGAATGCTAGCGAGCGCGGGGGAACTACAAAAAGGGAACGAACTAGCGCTACCGAGCAAATACGTAAACTTCCTATACCTAGCGAGCCACTACGAAAAACTAAAAGGGAGCCCGGAAGACAACGAACAAAAACAACTATTCGTAGAACAACACAAACACTACCTAGACGAAATAATAGAACAAATAAGCGAATTCAGCAAACGAGTAATACTAGCGGACGCGAACCTAGACAAAGTACTAAGCGCGTACAACAAACACCGAGACAAACCGATACGAGAACAAGCGGAAAACATAATACACCTATTCACGCTAACGAACCTAGGGGCGCCGGCGGCGTTCAAATACTTCGACACGACGATAGACCGAAAACGATACACGAGCACGAAAGAAGTACTAGACGCGACGCTAATACACCAAAGCATAACGGGGCTATACGAAACGCGAATAGACCTAAGCCAACTAGGGGGGGACGGGGGGGGGAGCCCGAAAAAAAAACGAAAAGTATGA 254
具有HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 254之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAAAAATACAGCATAGGGCTAGACATAGGGACGAACAGCGTAGGGTGGGCGGTAATAACGGACGAATACAAAGTACCGAGCAAAAAATTCAAAGTACTAGGGAACACGGACCGACACAGCATAAAAAAAAACCTAATAGGGGCGCTACTATTCGACAGCGGGGAAACGGCGGAAGCGACGCGACTAAAACGAACGGCGCGACGACGATACACGCGACGAAAAAACCGAATATGCTACCTACAAGAAATATTCAGCAACGAAATGGCGAAAGTAGACGACAGCTTCTTCCACCGACTAGAAGAAAGCTTCCTAGTAGAAGAAGACAAAAAACACGAACGACACCCGATATTCGGGAACATAGTAGACGAAGTAGCGTACCACGAAAAATACCCGACGATATACCACCTACGAAAAAAACTAGTAGACAGCACGGACAAAGCGGACCTACGACTAATATACCTAGCGCTAGCGCACATGATAAAATTCCGAGGGCACTTCCTAATAGAAGGGGACCTAAACCCGGACAACAGCGACGTAGACAAACTATTCATACAACTAGTACAAACGTACAACCAACTATTCGAAGAAAACCCGATAAACGCGAGCGGGGTAGACGCGAAAGCGATACTAAGCGCGCGACTAAGCAAAAGCCGACGACTAGAAAACCTAATAGCGCAACTACCGGGGGAAAAAAAAAACGGGCTATTCGGGAACCTAATAGCGCTAAGCCTAGGGCTAACGCCGAACTTCAAAAGCAACTTCGACCTAGCGGAAGACGCGAAACTACAACTAAGCAAAGACACGTACGACGACGACCTAGACAACCTACTAGCGCAAATAGGGGACCAATACGCGGACCTATTCCTAGCGGCGAAAAACCTAAGCGACGCGATACTACTAAGCGACATACTACGAGTAAACACGGAAATAACGAAAGCGCCGCTAAGCGCGAGCATGATAAAACGATACGACGAACACCACCAAGACCTAACGCTACTAAAAGCGCTAGTACGACAACAACTACCGGAAAAATACAAAGAAATATTCTTCGACCAAAGCAAAAACGGGTACGCGGGGTACATAGACGGGGGGGCGAGCCAAGAAGAATTCTACAAATTCATAAAACCGATACTAGAAAAAATGGACGGGACGGAAGAACTACTAGTAAAACTAAACCGAGAAGACCTACTACGAAAACAACGAACGTTCGACAACGGGAGCATACCGCACCAAATACACCTAGGGGAACTACACGCGATACTACGACGACAAGAAGACTTCTACCCGTTCCTAAAAGACAACCGAGAAAAAATAGAAAAAATACTAACGTTCCGAATACCGTACTACGTAGGGCCGCTAGCGCGAGGGAACAGCCGATTCGCGTGGATGACGCGAAAAAGCGAAGAAACGATAACGCCGTGGAACTTCGAAGAAGTAGTAGACAAAGGGGCGAGCGCGCAAAGCTTCATAGAACGAATGACGAACTTCGACAAAAACCTACCGAACGAAAAAGTACTACCGAAACACAGCCTACTATACGAATACTTCACGGTATACAACGAACTAACGAAAGTAAAATACGTAACGGAAGGGATGCGAAAACCGGCGTTCCTAAGCGGGGAACAAAAAAAAGCGATAGTAGACCTACTATTCAAAACGAACCGAAAAGTAACGGTAAAACAACTAAAAGAAGACTACTTCAAAAAAATAGAATGCTTCGACAGCGTAGAAATAAGCGGGGTAGAAGACCGATTCAACGCGAGCCTAGGGACGTACCACGACCTACTAAAAATAATAAAAGACAAAGACTTCCTAGACAACGAAGAAAACGAAGACATACTAGAAGACATAGTACTAACGCTAACGCTATTCGAAGACCGAGAAATGATAGAAGAACGACTAAAAACGTACGCGCACCTATTCGACGACAAAGTAATGAAACAACTAAAACGACGACGATACACGGGGTGGGGGCGACTAAGCCGAAAACTAATAAACGGGATACGAGACAAACAAAGCGGGAAAACGATACTAGACTTCCTAAAAAGCGACGGGTTCGCGAACCGAAACTTCATGCAACTAATACACGACGACAGCCTAACGTTCAAAGAAGACATACAAAAAGCGCAAGTAAGCGGGCAAGGGGACAGCCTACACGAACACATAGCGAACCTAGCGGGGAGCCCGGCGATAAAAAAAGGGATACTACAAACGGTAAAAGTAGTAGACGAACTAGTAAAAGTAATGGGGCGACACAAACCGGAAAACATAGTAATAGAAATGGCGCGAGAAAACCAAACGACGCAAAAAGGGCAAAAAAACAGCCGAGAACGAATGAAACGAATAGAAGAAGGGATAAAAGAACTAGGGAGCCAAATACTAAAAGAACACCCGGTAGAAAACACGCAACTACAAAACGAAAAACTATACCTATACTACCTACAAAACGGGCGAGACATGTACGTAGACCAAGAACTAGACATAAACCGACTAAGCGACTACGACGTAGACCACATAGTACCGCAAAGCTTCCTAAAAGACGACAGCATAGACAACAAAGTACTAACGCGAAGCGACAAAAACCGAGGGAAAAGCGACAACGTACCGAGCGAAGAAGTAGTAAAAAAAATGAAAAACTACTGGCGACAACTACTAAACGCGAAACTAATAACGCAACGAAAATTCGACAACCTAACGAAAGCGGAACGAGGGGGGCTAAGCGAACTAGACAAAGCGGGGTTCATAAAACGACAACTAGTAGAAACGCGACAAATAACGAAACACGTAGCGCAAATACTAGACAGCCGAATGAACACGAAATACGACGAAAACGACAAACTAATACGAGAAGTAAAAGTAATAACGCTAAAAAGCAAACTAGTAAGCGACTTCCGAAAAGACTTCCAATTCTACAAAGTACGAGAAATAAACAACTACCACCACGCGCACGACGCGTACCTAAACGCGGTAGTAGGGACGGCGCTAATAAAAAAATACCCGAAACTAGAAAGCGAATTCGTATACGGGGACTACAAAGTATACGACGTACGAAAAATGATAGCGAAAAGCGAACAAGAAATAGGGAAAGCGACGGCGAAATACTTCTTCTACAGCAACATAATGAACTTCTTCAAAACGGAAATAACGCTAGCGAACGGGGAAATACGAAAACGACCGCTAATAGAAACGAACGGGGAAACGGGGGAAATAGTATGGGACAAAGGGCGAGACTTCGCGACGGTACGAAAAGTACTAAGCATGCCGCAAGTAAACATAGTAAAAAAAACGGAAGTACAAACGGGGGGGTTCAGCAAAGAAAGCATACTACCGAAACGAAACAGCGACAAACTAATAGCGCGAAAAAAAGACTGGGACCCGAAAAAATACGGGGGGTTCGACAGCCCGACGGTAGCGTACAGCGTACTAGTAGTAGCGAAAGTAGAAAAAGGGAAAAGCAAAAAACTAAAAAGCGTAAAAGAACTACTAGGGATAACGATAATGGAACGAAGCAGCTTCGAAAAAAACCCGATAGACTTCCTAGAAGCGAAAGGGTACAAAGAAGTAAAAAAAGACCTAATAATAAAACTACCGAAATACAGCCTATTCGAACTAGAAAACGGGCGAAAACGAATGCTAGCGAGCGCGGGGGAACTACAAAAAGGGAACGAACTAGCGCTACCGAGCAAATACGTAAACTTCCTATACCTAGCGAGCCACTACGAAAAACTAAAAGGGAGCCCGGAAGACAACGAACAAAAACAACTATTCGTAGAACAACACAAACACTACCTAGACGAAATAATAGAACAAATAAGCGAATTCAGCAAACGAGTAATACTAGCGGACGCGAACCTAGACAAAGTACTAAGCGCGTACAACAAACACCGAGACAAACCGATACGAGAACAAGCGGAAAACATAATACACCTATTCACGCTAACGAACCTAGGGGCGCCGGCGGCGTTCAAATACTTCGACACGACGATAGACCGAAAACGATACACGAGCACGAAAGAAGTACTAGACGCGACGCTAATACACCAAAGCATAACGGGGCTATACGAAACGCGAATAGACCTAAGCCAACTAGGGGGGGACGGGGGGGGGAGCCCGAAAAAAAAACGAAAAGTATGACTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 255
具有AGG作為前三個核苷酸用於CleanCapTM 、HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 AGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 256
具有CMV之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGCAGATCGCCTGGAGACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGCGGCCGGGAACGGTGCATTGGAACGCGGATTCCCCGTGCCAAGAGTGACTCACCGTCCTTGACACGGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 257
具有HBB之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及HBB之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACCGGATCTGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAAAGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCTCGAG 258
具有XBG之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及XBG之3’ UTR的Cas9轉錄物 GGGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCCGGATCTGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACATTCTCTCGAG 259
具有AGG作為前三個核苷酸用於CleanCapTM 、XBG之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及XBG之3’ UTR的Cas9轉錄物 AGGAAGCTCAGAATAAACGCTCAACTTTGGCCGGATCTGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCACCAGCCTCAAGAACACCCGAATGGAGTCTCTAAGCTACATAATACCAACTTACACTTTACAAAATGTTGTCCCCCAAAATGTAGCCATTCGTATCTGCTCCTAATAAAAAGAAAGTTTCTTCACATTCTCTCGAG 260
具有AGG作為前三個核苷酸用於CleanCapTM 、HSD之5’ UTR、對應於SEQ ID NO: 204之ORF、Kozak序列及ALB之3’ UTR的Cas9轉錄物 AGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG 261
30/30/39多-A序列 未使用 262
多-A 100序列 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA 263
靶向小鼠TTR 基因之G209單引導RNA AAATAAGAGAGAAAAGAAGAGTAAGAAGAAATATAAGAGCCACC 264
使用最小尿苷密碼子之編碼腦膜炎雙球菌Cas9之ORF，具有起始及終止密碼子 ATGGCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAACTACATCCTGGGACTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGGATGGGCAATGGTCGAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGATCAGACTGATCGACCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGAGCAGAAGTCCCGAAGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGCAAGAAGACTGGCAAGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAAGAAGAGCACACAGACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTGAAGAGAGAAGGAGTCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGAAAACGGACTGATCAAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGCAGCTGAGAGCAGCAGCACTGGACAGAAAGCTGACACCGCTGGAATGGTCGGCAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCACAGAGGATACCTGTCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGAACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCGCAGGAAACGCACACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGAACACCGGCAGAACTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGAATCGGGACACATCAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGCACACATTCTCGAGAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATCCTGCTGTTCGAAAAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCACGTCTCGGGAGGACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGCTGATGACACAGAGACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTCCAGAAGATGCTGGGACACTGCACATTCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGCAAAGAACACATACACAGCAGAAAGATTCATCTGGCTGACAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGGAACAGGGATCGGAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGAGCAACACTGATGGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCTGACATACGCACAGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAGACACAGCATTCTTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGACAACGCAGAAGCATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATACCACGCAATCTCGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGAAGGACAAGAAGTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTGCAGGACGAAATCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGACAGACGAAGACATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCCAGCCGGAAATCCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGTTCGACAAGTTCGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAAGAATCGTCCCGCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGACGAAGCATGCGCAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAAGAAGAACACAGAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCCCGGCAGACGAAATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCACTGTCGCAGGCAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAGAAGATACGGATCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAGCAAGAGAAGTCGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAAATCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGCAGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAACTTCGTCGGAGAACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCTGAGACTGTACGAACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACTCGGGAAAGGAAATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAGGGATACGTCGAAATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGAACATGGGACGACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTGGGATCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTACGAATACTTCAACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGCAGGAATTCAAGGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCGAGATCGAAGAAGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAAGACGGATTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAAGATACGTCAACAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACAGAATGAGACTGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTCGCATCGAACGGACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATTCTGGGGACTGAGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACTGGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAGTCGCAATGCAGCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATACAAGGAAATGAACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAAGGAAACAGGAGAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCCCGCAGCCGTGGGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCAGAGTCTTCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAAGAAGCAGACACACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGCAGAAAAGCTGTCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAATACGTCACACCGCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAAAGATGTCGGGACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCGGCAAAGAGACTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGTCCCGCTGACACAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGATGGTCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCACTGAAGGCAAGACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCATTCGCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGGCAGGAAACAGAACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTCGAACAGGTCCAGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCACAACGGAATCGCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAGACGTCTTCGAAAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCGATCTACTCGTGGCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGACAGAGCAGTCGTCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCAGCTGATCGACGACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCACCCGAACGACCTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAAGAATGTTCGGATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAGGAAACATCAACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAGATCGGAAAGAACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAAGACAGCACTGTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACTGGGAAAGGAAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGACCGCCGGTCAGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCGGAATTCGAATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAATGA 265
使用最小尿苷密碼子之編碼腦膜炎雙球菌Cas9之ORF (無起始或終止密碼子；適於納入融合蛋白編碼序列中) GCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAACTACATCCTGGGACTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGGATGGGCAATGGTCGAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGATCAGACTGATCGACCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGAGCAGAAGTCCCGAAGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGCAAGAAGACTGGCAAGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAAGAAGAGCACACAGACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTGAAGAGAGAAGGAGTCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGAAAACGGACTGATCAAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGCAGCTGAGAGCAGCAGCACTGGACAGAAAGCTGACACCGCTGGAATGGTCGGCAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCACAGAGGATACCTGTCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGAACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCGCAGGAAACGCACACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGAACACCGGCAGAACTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGAATCGGGACACATCAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGCACACATTCTCGAGAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATCCTGCTGTTCGAAAAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCACGTCTCGGGAGGACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGCTGATGACACAGAGACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTCCAGAAGATGCTGGGACACTGCACATTCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGCAAAGAACACATACACAGCAGAAAGATTCATCTGGCTGACAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGGAACAGGGATCGGAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGAGCAACACTGATGGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCTGACATACGCACAGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAGACACAGCATTCTTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGACAACGCAGAAGCATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATACCACGCAATCTCGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGAAGGACAAGAAGTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTGCAGGACGAAATCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGACAGACGAAGACATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCCAGCCGGAAATCCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGTTCGACAAGTTCGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAAGAATCGTCCCGCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGACGAAGCATGCGCAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAAGAAGAACACAGAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCCCGGCAGACGAAATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCACTGTCGCAGGCAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAGAAGATACGGATCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAGCAAGAGAAGTCGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAAATCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGCAGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAACTTCGTCGGAGAACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCTGAGACTGTACGAACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACTCGGGAAAGGAAATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAGGGATACGTCGAAATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGAACATGGGACGACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTGGGATCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTACGAATACTTCAACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGCAGGAATTCAAGGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCGAGATCGAAGAAGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAAGACGGATTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAAGATACGTCAACAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACAGAATGAGACTGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTCGCATCGAACGGACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATTCTGGGGACTGAGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACTGGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAGTCGCAATGCAGCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATACAAGGAAATGAACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAAGGAAACAGGAGAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCCCGCAGCCGTGGGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCAGAGTCTTCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAAGAAGCAGACACACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGCAGAAAAGCTGTCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAATACGTCACACCGCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAAAGATGTCGGGACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCGGCAAAGAGACTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGTCCCGCTGACACAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGATGGTCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCACTGAAGGCAAGACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCATTCGCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGGCAGGAAACAGAACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTCGAACAGGTCCAGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCACAACGGAATCGCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAGACGTCTTCGAAAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCGATCTACTCGTGGCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGACAGAGCAGTCGTCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCAGCTGATCGACGACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCACCCGAACGACCTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAAGAATGTTCGGATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAGGAAACATCAACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAGATCGGAAAGAACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAAGACAGCACTGTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACTGGGAAAGGAAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGACCGCCGGTCAGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCGGAATTCGAATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAA 266
包含SEQ ID NO: 265 (編碼腦膜炎雙球菌Cas9)之轉錄物 GGGAGACCCAAGCTGGCTAGC GTTTAAACTTAAGCTT GGATCCGCCACCATGGCAGCATTCAAGCCGAACTCGATCAACTACATCCTGGGACTGGACATCGGAATCGCATCGGTCGGATGGGCAATGGTCGAAATCGACGAAGAAGAAAACCCGATCAGACTGATCGACCTGGGAGTCAGAGTCTTCGAAAGAGCAGAAGTCCCGAAGACAGGAGACTCGCTGGCAATGGCAAGAAGACTGGCAAGATCGGTCAGAAGACTGACAAGAAGAAGAGCACACAGACTGCTGAGAACAAGAAGACTGCTGAAGAGAGAAGGAGTCCTGCAGGCAGCAAACTTCGACGAAAACGGACTGATCAAGTCGCTGCCGAACACACCGTGGCAGCTGAGAGCAGCAGCACTGGACAGAAAGCTGACACCGCTGGAATGGTCGGCAGTCCTGCTGCACCTGATCAAGCACAGAGGATACCTGTCGCAGAGAAAGAACGAAGGAGAAACAGCAGACAAGGAACTGGGAGCACTGCTGAAGGGAGTCGCAGGAAACGCACACGCACTGCAGACAGGAGACTTCAGAACACCGGCAGAACTGGCACTGAACAAGTTCGAAAAGGAATCGGGACACATCAGAAACCAGAGATCGGACTACTCGCACACATTCTCGAGAAAGGACCTGCAGGCAGAACTGATCCTGCTGTTCGAAAAGCAGAAGGAATTCGGAAACCCGCACGTCTCGGGAGGACTGAAGGAAGGAATCGAAACACTGCTGATGACACAGAGACCGGCACTGTCGGGAGACGCAGTCCAGAAGATGCTGGGACACTGCACATTCGAACCGGCAGAACCGAAGGCAGCAAAGAACACATACACAGCAGAAAGATTCATCTGGCTGACAAAGCTGAACAACCTGAGAATCCTGGAACAGGGATCGGAAAGACCGCTGACAGACACAGAAAGAGCAACACTGATGGACGAACCGTACAGAAAGTCGAAGCTGACATACGCACAGGCAAGAAAGCTGCTGGGACTGGAAGACACAGCATTCTTCAAGGGACTGAGATACGGAAAGGACAACGCAGAAGCATCGACACTGATGGAAATGAAGGCATACCACGCAATCTCGAGAGCACTGGAAAAGGAAGGACTGAAGGACAAGAAGTCGCCGCTGAACCTGTCGCCGGAACTGCAGGACGAAATCGGAACAGCATTCTCGCTGTTCAAGACAGACGAAGACATCACAGGAAGACTGAAGGACAGAATCCAGCCGGAAATCCTGGAAGCACTGCTGAAGCACATCTCGTTCGACAAGTTCGTCCAGATCTCGCTGAAGGCACTGAGAAGAATCGTCCCGCTGATGGAACAGGGAAAGAGATACGACGAAGCATGCGCAGAAATCTACGGAGACCACTACGGAAAGAAGAACACAGAAGAAAAGATCTACCTGCCGCCGATCCCGGCAGACGAAATCAGAAACCCGGTCGTCCTGAGAGCACTGTCGCAGGCAAGAAAGGTCATCAACGGAGTCGTCAGAAGATACGGATCGCCGGCAAGAATCCACATCGAAACAGCAAGAGAAGTCGGAAAGTCGTTCAAGGACAGAAAGGAAATCGAAAAGAGACAGGAAGAAAACAGAAAGGACAGAGAAAAGGCAGCAGCAAAGTTCAGAGAATACTTCCCGAACTTCGTCGGAGAACCGAAGTCGAAGGACATCCTGAAGCTGAGACTGTACGAACAGCAGCACGGAAAGTGCCTGTACTCGGGAAAGGAAATCAACCTGGGAAGACTGAACGAAAAGGGATACGTCGAAATCGACCACGCACTGCCGTTCTCGAGAACATGGGACGACTCGTTCAACAACAAGGTCCTGGTCCTGGGATCGGAAAACCAGAACAAGGGAAACCAGACACCGTACGAATACTTCAACGGAAAGGACAACTCGAGAGAATGGCAGGAATTCAAGGCAAGAGTCGAAACATCGAGATTCCCGAGATCGAAGAAGCAGAGAATCCTGCTGCAGAAGTTCGACGAAGACGGATTCAAGGAAAGAAACCTGAACGACACAAGATACGTCAACAGATTCCTGTGCCAGTTCGTCGCAGACAGAATGAGACTGACAGGAAAGGGAAAGAAGAGAGTCTTCGCATCGAACGGACAGATCACAAACCTGCTGAGAGGATTCTGGGGACTGAGAAAGGTCAGAGCAGAAAACGACAGACACCACGCACTGGACGCAGTCGTCGTCGCATGCTCGACAGTCGCAATGCAGCAGAAGATCACAAGATTCGTCAGATACAAGGAAATGAACGCATTCGACGGAAAGACAATCGACAAGGAAACAGGAGAAGTCCTGCACCAGAAGACACACTTCCCGCAGCCGTGGGAATTCTTCGCACAGGAAGTCATGATCAGAGTCTTCGGAAAGCCGGACGGAAAGCCGGAATTCGAAGAAGCAGACACACTGGAAAAGCTGAGAACACTGCTGGCAGAAAAGCTGTCGTCGAGACCGGAAGCAGTCCACGAATACGTCACACCGCTGTTCGTCTCGAGAGCACCGAACAGAAAGATGTCGGGACAGGGACACATGGAAACAGTCAAGTCGGCAAAGAGACTGGACGAAGGAGTCTCGGTCCTGAGAGTCCCGCTGACACAGCTGAAGCTGAAGGACCTGGAAAAGATGGTCAACAGAGAAAGAGAACCGAAGCTGTACGAAGCACTGAAGGCAAGACTGGAAGCACACAAGGACGACCCGGCAAAGGCATTCGCAGAACCGTTCTACAAGTACGACAAGGCAGGAAACAGAACACAGCAGGTCAAGGCAGTCAGAGTCGAACAGGTCCAGAAGACAGGAGTCTGGGTCAGAAACCACAACGGAATCGCAGACAACGCAACAATGGTCAGAGTAGACGTCTTCGAAAAGGGAGACAAGTACTACCTGGTCCCGATCTACTCGTGGCAGGTCGCAAAGGGAATCCTGCCGGACAGAGCAGTCGTCCAGGGAAAGGACGAAGAAGACTGGCAGCTGATCGACGACTCGTTCAACTTCAAGTTCTCGCTGCACCCGAACGACCTGGTCGAAGTCATCACAAAGAAGGCAAGAATGTTCGGATACTTCGCATCGTGCCACAGAGGAACAGGAAACATCAACATCAGAATCCACGACCTGGACCACAAGATCGGAAAGAACGGAATCCTGGAAGGAATCGGAGTCAAGACAGCACTGTCGTTCCAGAAGTACCAGATCGACGAACTGGGAAAGGAAATCAGACCGTGCAGACTGAAGAAGAGACCGCCGGTCAGATCCGGAAAGAGAACAGCAGACGGATCGGAATTCGAATCGCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCGAATGATAGCTAGCTCGAG TCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAA TAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGG 267
腦膜炎雙球菌Cas9之胺基酸序列 MAAFKPNSINYILGLDIGIASVGWAMVEIDEEENPIRLIDLGVRVFERAEVPKTGDSLAMARRLARSVRRLTRRRAHRLLRTRRLLKREGVLQAANFDENGLIKSLPNTPWQLRAAALDRKLTPLEWSAVLLHLIKHRGYLSQRKNEGETADKELGALLKGVAGNAHALQTGDFRTPAELALNKFEKESGHIRNQRSDYSHTFSRKDLQAELILLFEKQKEFGNPHVSGGLKEGIETLLMTQRPALSGDAVQKMLGHCTFEPAEPKAAKNTYTAERFIWLTKLNNLRILEQGSERPLTDTERATLMDEPYRKSKLTYAQARKLLGLEDTAFFKGLRYGKDNAEASTLMEMKAYHAISRALEKEGLKDKKSPLNLSPELQDEIGTAFSLFKTDEDITGRLKDRIQPEILEALLKHISFDKFVQISLKALRRIVPLMEQGKRYDEACAEIYGDHYGKKNTEEKIYLPPIPADEIRNPVVLRALSQARKVINGVVRRYGSPARIHIETAREVGKSFKDRKEIEKRQEENRKDREKAAAKFREYFPNFVGEPKSKDILKLRLYEQQHGKCLYSGKEINLGRLNEKGYVEIDHALPFSRTWDDSFNNKVLVLGSENQNKGNQTPYEYFNGKDNSREWQEFKARVETSRFPRSKKQRILLQKFDEDGFKERNLNDTRYVNRFLCQFVADRMRLTGKGKKRVFASNGQITNLLRGFWGLRKVRAENDRHHALDAVVVACSTVAMQQKITRFVRYKEMNAFDGKTIDKETGEVLHQKTHFPQPWEFFAQEVMIRVFGKPDGKPEFEEADTLEKLRTLLAEKLSSRPEAVHEYVTPLFVSRAPNRKMSGQGHMETVKSAKRLDEGVSVLRVPLTQLKLKDLEKMVNREREPKLYEALKARLEAHKDDPAKAFAEPFYKYDKAGNRTQQVKAVRVEQVQKTGVWVRNHNGIADNATMVRVDVFEKGDKYYLVPIYSWQVAKGILPDRAVVQGKDEEDWQLIDDSFNFKFSLHPNDLVEVITKKARMFGYFASCHRGTGNINIRIHDLDHKIGKNGILEGIGVKTALSFQKYQIDELGKEIRPCRLKKRPPVRSGKRTADGSEFESPKKKRKVE 268
靶向大鼠TTR 基因之G390單引導RNA mG*mC*mC*GAGUCUGGAGAGCUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 269
trRNA AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUUUUU 270
未使用 271
靶向大鼠TTR 基因之G534單引導RNA mA*mC*mG*CAAAUAUCAGUCCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 272
G000395 5’截短之無活性sgRNA修飾之序列 mG*mC*mA*AUGGUGUAGCGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 273
SV40 NLS PKKKRKV 274
替代SV40 NLS PKKKRRV 275
核漿素NLS KRPAATKKAGQAKKKK 276
實例性Kozak序列 gccRccAUGG 277
實例性Kozak序列 gccgccRccAUGG 278
* = PS鏈接；「m」 = 2'-O-Me核苷酸
圖1顯示具有由表1中提供之引導序列靶向之TTR 基因之區的染色體18之示意圖。
圖2顯示靶向TTR之某些雙重引導RNA之HEK293_Cas9細胞中的脫靶分析。對於測試之每一雙重引導RNA，靶上位點用實心方塊表示，而封閉圓圈代表潛在脫靶位點。
圖3顯示靶向TTR之某些單引導RNA之HEK_Cas9細胞中的脫靶分析。對於測試之每一單引導RNA，靶上位點用實心方塊表示，而開口圓圈代表潛在脫靶位點。
圖4顯示原代人類肝細胞上脂質奈米粒子調配之人類TTR特異性sgRNA之劑量反應曲線。
圖5顯示原代食蟹猴肝細胞上脂質奈米粒子調配之人類TTR特異性sgRNA的劑量反應曲線。
圖6顯示原代食蟹猴肝細胞上脂質奈米粒子調配之食蟹猴TTR特異性sgRNA之劑量反應曲線。
圖7顯示於HepG2細胞中在投與x軸上提供之引導序列後TTR之編輯百分比(編輯%)及分泌之TTR之減少。該等值正規化至α-1-抗胰蛋白酶(AAT)蛋白之量。
圖8顯示在HUH7細胞中在投與靶向引導(表1中所列示)後細胞內TTR的西方墨點分析。
圖9顯示在向具有人類化(G481-G499)或鼠類(G282) TTR之小鼠投與LNP調配物後觀察到之TTR之肝編輯百分比。注意：圖中省略了每一引導ID中之前三個「0」，例如「G481」係表2及3中之「G000481」。
圖10A-B顯示在水平軸上指示之投藥方案後觀察到之作為μg/ml (圖10A)或TSS對照之百分比(圖10B)的血清TTR含量。貫穿本文，MPK = mg/kg。
圖11A-B顯示在水平軸上指示之1 mg/kg (圖11A)或0.5 mg/kg劑量(圖11B)之投藥方案後觀察到之血清TTR含量。單一2 mg/kg劑量之數據以兩個組包括作為右欄。
圖12A-B顯示在水平軸上指示之0.5 mg/kg (圖12A)或1 mg/kg劑量(圖12B)之投藥方案後觀察到之肝編輯百分比。圖12C顯示在0.5、1或2 mg/kg之單劑量後觀察到之肝編輯百分比。
圖13顯示在向關於TTR 基因人類化之小鼠投與LNP調配物後觀察到之肝編輯百分比。注意：圖中省略了每一引導ID中之前三個「0」，例如「G481」係表2及3中之「G000481」。
圖14A-B顯示在向關於TTR 基因人類化之小鼠投與LNP調配物後肝編輯(圖14A)與血清人類TTR含量(圖14B)之間存在相關性。注意：圖中省略了每一引導ID中之前三個「0」，例如「G481」係表2及3中之「G000481」。
圖15A-B顯示在投與包含引導G502之LNP調配物後，野生型小鼠中存在相對於編輯百分比(圖15A)及血清TTR含量(圖15B)之劑量反應，該引導G502在小鼠與食蟹猴之間交叉同源。
圖16顯示原代食蟹猴肝細胞上脂質奈米粒子調配之人類TTR特異性sgRNA的劑量反應曲線。
圖17顯示原代人類肝細胞上脂質奈米粒子調配之食蟹猴TTR特異性sgRNA的劑量反應曲線。
圖18顯示原代食蟹猴肝細胞上脂質奈米粒子調配之食蟹猴TTR特異性sgRNA之劑量反應曲線。
圖19A-D顯示在以指示比率及量投用LNP調配物後之血清TTR(%TSS；圖19A及19C)及編輯結果(圖19B及19D)。
圖20顯示靶向TTR之原代人類肝細胞(PHH)中某些單引導RNA的脫靶分析。在圖中，實心方塊代表靶上切割位點之鑑別，而開口圓圈代表潛在脫靶位點之鑑別。
圖21A-B顯示在投與脂質奈米粒子調配之G000480後原代人類肝細胞中之靶上(ONT，圖21A)及兩個脫靶位點(OT2及OT4)之編輯百分比。圖21B係圖21A中之OT2、OT4及陰性對照(Neg Cont)數據之重新縮放版本。
圖22A-B顯示在投與脂質奈米粒子調配之G000486後原代人類肝細胞中之靶上(ONT，圖22A)及脫靶位點(OT4)之編輯百分比。圖22B係圖22A中之OT4及陰性對照(Neg Cont)數據之重新縮放版本。
圖23A-B顯示編輯百分比(圖23A)及TTR 基因座處之插入及缺失事件之數目(圖23B)。圖23A顯示對照及治療(投用脂質奈米粒子調配之TTR特異性sgRNA)組中之TTR 基因座之編輯百分比。圖23B顯示當在圖23A之治療組中觀察到編輯時在TTR 基因座之插入及缺失事件的數目。
圖24A-B分別顯示對照及治療(投用脂質奈米粒子調配之TTR特異性sgRNA)組之循環血清(圖24A)及腦脊髓液(CSF) (圖24B)中的TTR含量，以μg/mL表示。治療導致血清中TTR含量減少＞99%。
圖25A-D顯示來自對照及治療(投用脂質奈米粒子調配之TTR特異性sgRNA)小鼠之胃(圖25A)、結腸(圖25B)、坐骨神經(圖25C)及背根神經節(DRG) (圖25D)中針對TTR染色之免疫組織化學影像。在右邊，條形圖顯示在經治療小鼠中治療後8週TTR染色之減少，如藉由每一組織類型之佔據面積百分比所量測。
圖26A-C分別顯示來自投用跨越一系列劑量之LNP調配物之人類化TTR小鼠之肝TTR編輯(圖26A)及血清TTR結果(以µg/mL表示(圖26B)及作為TSS治療之對照之百分比(圖26C))，該LNP調配物具有引導G000480、G000488、G000489及G000502且含有以重量計與引導呈1:1比率之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。
圖27A-C分別顯示來自投用跨越一系列劑量之LNP調配物之人類化TTR小鼠之肝TTR編輯(圖27A)及血清TTR結果(以µg/mL表示(圖27B)及作為TSS治療之對照之百分比(圖27C))，該LNP調配物具有引導G000481、G000482、G000486及G000499且含有以重量計與引導呈1:1比率之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。
圖28A-C分別顯示來自投用跨越一系列劑量之LNP調配物之人類化TTR小鼠之肝TTR編輯(圖28A)及血清TTR結果(以µg/mL表示(圖28B)及作為TSS治療之對照之百分比(圖28C))，該LNP調配物具有引導G000480、G000481、G000486、G000499及G000502且含有以重量計與引導呈1:2比率之Cas9 mRNA (SEQ ID NO: 1)。
圖29顯示與陰性(未治療)對照相比，用包含Cas9 mRNA及gRNA (如指示)之LNP治療後原始人類肝細胞(PHH)中TTR mRNA的相對表現。
圖30顯示與陰性(未治療)對照相比，用包含Cas9 mRNA及gRNA (如指示)之LNP治療後原代人類肝細胞(PHH)中TTR mRNA的相對表現。

Claims (209)

  1. 一種誘導TTR 基因內之雙鏈斷裂(DSB)的方法，其包含向細胞遞送組合物，其中該組合物包含 a. 包含選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列之引導RNA； b. 包含選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸的引導RNA；或 c. 包含與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性之引導序列的引導RNA。
  2. 一種修飾TTR 基因之方法，其包含向細胞遞送組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA： a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列； b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
  3. 一種治療與TTR相關之澱粉樣變性(ATTR)之方法，其包含向有需要之個體投與組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA： a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列； b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列， 藉此治療ATTR。
  4. 一種降低TTR血清濃度之方法，其包含向有需要之個體投與組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA： a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列； b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列， 藉此降低TTR血清濃度。
  5. 一種減少或預防個體中包含TTR之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之累積之方法，其包含向有需要之個體投與組合物，其中該組合物包含(i) RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸及(ii) 包含以下之引導RNA： a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列； b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列， 藉此減少澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之累積。
  6. 一種組合物，其包含含有以下之引導RNA： a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列； b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
  7. 一種包含編碼引導RNA之載體的組合物，其中該引導RNA包含： a. 選自SEQ ID NO: 5-82之引導序列； b. 選自SEQ ID NO: 5-82之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 c. 與選自SEQ ID NO: 5-82之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
  8. 如請求項6或7之組合物，其用於誘導細胞或個體中TTR 基因內之雙鏈斷裂(DSB)。
  9. 如請求項6或7之組合物，其用於修飾細胞或個體中之該TTR 基因。
  10. 如請求項6或7之組合物，其用於治療個體之與TTR相關之澱粉樣變性(ATTR)。
  11. 如請求項6或7之組合物，其用於降低個體之TTR血清濃度。
  12. 如請求項6或7之組合物，其用於減少或預防個體中澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維之累積。
  13. 如請求項1至5中任一項之方法或如請求項8至12中任一項所使用之組合物，其中該組合物降低血清TTR含量。
  14. 如請求項13之方法或使用之組合物，其中與投與該組合物之前之血清TTR含量相比，該等血清TTR含量降低至少50%。
  15. 如請求項13之方法或使用之組合物，其中與投與該組合物之前之血清TTR含量相比，該等血清TTR含量降低50-60%、60-70%、70-80%、80-90%、90-95%、95-98%、98-99%或99-100%。
  16. 如請求項1至5或8至15中任一項之方法或使用之組合物，其中該組合物導致該TTR 基因之編輯。
  17. 如請求項16之方法或使用之組合物，其中該編輯係計算經編輯群體之百分比(編輯百分比)。
  18. 如請求項17之方法或使用之組合物，其中該編輯百分比介於該群體之30%與99%之間。
  19. 如請求項17之方法或使用之組合物，其中該編輯百分比介於該群體之30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
  20. 如請求項1至5中任一項之方法或如請求項8至19中任一項所使用之組合物，其中該組合物減少至少一種組織中之澱粉樣沈積。
  21. 如請求項20之方法或使用之組合物，其中該至少一種組織包含胃、結腸、坐骨神經或背根神經節中之一或多者。
  22. 如請求項20或21之方法或使用之組合物，其中在投與該組合物後8週量測澱粉樣沈積。
  23. 如請求項20至22中任一項之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積係與陰性對照或投與該組合物之前量測之含量進行比較。
  24. 如請求項20至23中任一項之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積係在生檢樣本中及/或藉由免疫染色量測。
  25. 如請求項20至24中任一項之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積之減少係介於陰性對照中所觀察到之澱粉樣沈積之30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
  26. 如請求項20至25中任一項之方法或使用之組合物，其中澱粉樣沈積之減少係介於投與該組合物之前觀察到之澱粉樣沈積之30%與35%之間、35%與40%之間、40%與45%之間、45%與50%之間、50%與55%之間、55%與60%之間、60%與65%之間、65%與70%之間、70%與75%之間、75%與80%之間、80%與85%之間、85%與90%之間、90%與95%之間或95%與99%之間。
  27. 如請求項1至5或8至26中任一項之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物至少兩次。
  28. 如請求項27之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物至少三次。
  29. 如請求項27之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物至少四次。
  30. 如請求項27之方法或使用之組合物，其中投與或遞送該組合物高達五次、六次、七次、八次、九次或十次。
  31. 如請求項27至30中任一項之方法或使用之組合物，其中係依1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15天之間隔進行該投與或遞送。
  32. 如請求項27至30中任一項之方法或使用之組合物，其中係依1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週之間隔進行該投與或遞送。
  33. 如請求項27至30中任一項之方法或使用之組合物，其中係依1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15個月之間隔進行該投與或遞送。
  34. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導序列係選自SEQ ID NO: 5-82。
  35. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA與該人類TTR 基因中存在之靶序列至少部分互補。
  36. 如請求項35之方法或組合物，其中該靶序列係在該人類TTR 基因之外顯子1、2、3或4中。
  37. 如請求項35之方法或組合物，其中該靶序列係在該人類TTR 基因之外顯子1中。
  38. 如請求項35之方法或組合物，其中該靶序列係在該人類TTR 基因之外顯子2中。
  39. 如請求項35之方法或組合物，其中該靶序列係在該人類TTR 基因之外顯子3中。
  40. 如請求項35之方法或組合物，其中該靶序列係在該人類TTR 基因之外顯子4中。
  41. 如請求項1至40中任一項之方法或組合物，其中該引導序列與TTR 之正鏈中之靶序列互補。
  42. 如請求項1至40中任一項之方法或組合物，其中該引導序列與TTR 之負鏈中之靶序列互補。
  43. 如請求項1至40中任一項之方法或組合物，其中第一引導序列與該TTR 基因之正鏈中之第一靶序列互補，且其中該組合物進一步包含與該TTR 基因之負鏈中之第二靶序列互補的第二引導序列。
  44. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA包含含有該引導序列之crRNA且進一步包含SEQ ID NO: 126之核苷酸序列，其中SEQ ID NO: 126之核苷酸在其3’端引導序列之後。
  45. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA係雙重引導(dgRNA)。
  46. 如請求項45之方法或組合物，其中該雙重引導RNA包含含有SEQ ID NO: 126之核苷酸序列的crRNA(其中SEQ ID NO: 126之核苷酸在其3’端引導序列之後)及trRNA。
  47. 如請求項1至43中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA係單引導(sgRNA)。
  48. 如請求項47之方法或組合物，其中該sgRNA包含具有SEQ ID NO: 3之型式之引導序列。
  49. 如請求項47之方法或組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 3之序列。
  50. 如請求項48或49之方法或組合物，其中SEQ ID NO: 3中之每一N係任何天然或非天然核苷酸，其中該等N形成該引導序列，且該引導序列使Cas9靶向該TTR 基因。
  51. 如請求項47至50中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包含SEQ ID NO: 5-82之引導序列及SEQ ID NO: 126之核苷酸中之任一者。
  52. 如請求項47至51中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包含與選自SEQ ID No: 87-124之序列具有至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致性的引導序列。
  53. 如請求項47之方法或組合物，其中該sgRNA包含選自SEQ ID No: 87-124之序列。
  54. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA包含至少一個修飾。
  55. 如請求項54之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。
  56. 如請求項54或55之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵。
  57. 如請求項54至56中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸。
  58. 如請求項54至57中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括5’端之前五個核苷酸中之一或多者的修飾。
  59. 如請求項54至58中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括3’端之最後五個核苷酸中之一或多者的修飾。
  60. 如請求項54至59中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括前四個核苷酸之間之PS鍵。
  61. 如請求項54至60中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括最後四個核苷酸之間之PS鍵。
  62. 如請求項54至61中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括在5’端之前三個核苷酸之2’-O-Me修飾之核苷酸。
  63. 如請求項54至62中任一項之方法或組合物，其中該至少一個修飾包括在3’端之最後三個核苷酸之2’-O-Me修飾之核苷酸。
  64. 如請求項54至63中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA包含SEQ ID NO: 3之修飾之核苷酸。
  65. 如請求項1至64中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包含醫藥上可接受之賦形劑。
  66. 如請求項1至65中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA與脂質奈米粒子(LNP)相聯。
  67. 如請求項66之方法或組合物，其中該LNP包含CCD脂質。
  68. 如請求項67之方法或組合物，其中該CCD脂質係脂質A或脂質B。
  69. 如請求項66至68之方法或組合物，其中該LNP包含中性脂質。
  70. 如請求項69之方法或組合物，其中該中性脂質係DSPC。
  71. 如請求項66至70中任一項之方法或組合物，其中該LNP包含輔助脂質。
  72. 如請求項71之方法或組合物，其中該輔助脂質係膽固醇。
  73. 如請求項66至72中任一項之方法或組合物，其中該LNP包含隱密脂質。
  74. 如請求項73之方法或組合物，其中該隱密脂質係PEG2k-DMG。
  75. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包含RNA引導之DNA結合劑。
  76. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包含編碼RNA引導之DNA結合劑的mRNA。
  77. 如請求項75或76之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係Cas裂解酶。
  78. 如請求項77之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係Cas9。
  79. 如請求項75至78中任一項之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑經修飾。
  80. 如請求項75至79中任一項之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係切口酶(nickase)。
  81. 如請求項79或80之方法或組合物，其中該經修飾RNA引導之DNA結合劑包含核定位信號(NLS)。
  82. 如請求項75至81中任一項之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas。
  83. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物係醫藥調配物且進一步包含醫藥上可接受之載劑。
  84. 如請求項1至5或8至83中任一項之方法或使用之組合物，其中該組合物減少或防止包含TTR之澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維。
  85. 如請求項84之方法或使用之組合物，其中該澱粉樣蛋白或澱粉樣原纖維係在神經、心臟或胃腸道中。
  86. 如請求項1至5或8至83中任一項之方法或使用之組合物，其中非同源末端接合(NHEJ)在該TTR 基因中之DSB修復期間導致突變。
  87. 如請求項86之方法或使用之組合物，其中NHEJ在該TTR 基因中之DSB修復期間導致核苷酸(群)之缺失或插入。
  88. 如請求項87之方法或使用之組合物，其中該核苷酸(群)之缺失或插入誘導該TTR 基因中之框移或無義突變。
  89. 如請求項87之方法或使用之組合物，其中在至少50%之肝細胞之TTR 基因中誘導框移或無義突變。
  90. 如請求項89之方法或使用之組合物，其中在50%-60%、60%-70%、70%或80%、80%-90%、90-95%、95%-99%或99%-100%之肝細胞之TTR 基因中誘導框移或無義突變。
  91. 如請求項87至90中任一項之方法或使用之組合物，其中在該TTR 基因中出現之核苷酸之缺失或插入係脫靶位點中之至少50倍或更多。
  92. 如請求項91之方法或使用之組合物，其中在該TTR 基因中出現之核苷酸之該缺失或該插入係脫靶位點中之50倍至150倍、150倍至500倍、500倍至1500倍、1500倍至5000倍、5000倍至15000倍、15000倍至30000倍或30000倍至60000倍。
  93. 如請求項87至92中任一項之方法或使用之組合物，其中核苷酸之該缺失或該插入出現在原代人類肝細胞中少於或等於3、2、1或0個脫靶位點處，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
  94. 如請求項93之方法或使用之組合物，其中核苷酸之該缺失或該插入出現在原代人類肝細胞中之一定數目脫靶位點處，該數目少於在Cas9過度表現細胞中出現核苷酸之缺失或插入之脫靶位點的數目，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
  95. 如請求項94之方法或使用之組合物，其中該等Cas9過度表現細胞係穩定表現Cas9之HEK293細胞。
  96. 如請求項93至95中任一項之方法或使用之組合物，其中藉由分析來自經Cas9 mRNA及該引導RNA活體外轉染之原代人類肝細胞的基因體DNA來測定原代人類肝細胞中脫靶位點之數目，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
  97. 如請求項93至95中任一項之方法或使用之組合物，其中藉由寡核苷酸插入分析法測定原代人類肝細胞中脫靶位點之數目，該分析法包括：分析來自經Cas9 mRNA、該引導RNA及供體寡核苷酸活體外轉染之原代人類肝細胞的基因體DNA，視情況其中該(等)脫靶位點不出現在該等原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中。
  98. 如請求項1至43或47至97中任一項之方法或組合物，其中該引導RNA之序列係： a) SEQ ID NO: 92或104； b) SEQ ID NO: 87、89、96或113； c) SEQ ID NO: 100、102、106、111或112；或 d) SEQ ID NO: 88、90、91、93、94、95、97、101、103、108或109， 視情況其中該引導RNA不在出現在原代人類肝細胞之基因體中之蛋白質編碼區中之脫靶位點產生插入或缺失(indel)。
  99. 如請求項1至5或8至98中任一項之方法或使用之組合物，其中投與該組合物以降低該個體中之TTR含量。
  100. 如請求項99之方法或使用之組合物，其中TTR之含量降低至少50%。
  101. 如請求項100之方法或使用之組合物，其中TTR之含量降低50%-60%、60%-70%、70%或80%、80%-90%、90-95%、95%-99%或99%-100%。
  102. 如請求項100或101之方法或使用之組合物，其中在血清、血漿、血液、腦脊液或痰中量測TTR之含量。
  103. 如請求項100或101之方法或使用之組合物，其中在肝、脈絡叢及/或視網膜中量測TTR之含量。
  104. 如請求項99至103中任一項之方法或使用之組合物，其中經由酶聯免疫吸附分析(ELISA)量測TTR之含量。
  105. 如請求項1至5或8至104中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體患有ATTR。
  106. 如請求項1至5或8至105中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體係人類。
  107. 如請求項105或106之方法或使用之組合物，其中該個體患有ATTRwt。
  108. 如請求項105或106之方法或使用之組合物，其中該個體患有遺傳性ATTR。
  109. 如請求項1至5、8至106或108中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體具有ATTR家族史。
  110. 如請求項1至5、8至106或108至109中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體患有家族性澱粉樣多神經病變。
  111. 如請求項1至5或8至110中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體僅具有或主要具有ATTR之神經症狀。
  112. 如請求項1至5或8至110中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體患有家族性澱粉樣心肌病。
  113. 如請求項1至5、8至109或112中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體僅具有或主要具有ATTR之心臟症狀。
  114. 如請求項1至5或8至113中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體表現具有V30突變之TTR。
  115. 如請求項114之方法或使用之組合物，其中該V30突變係V30A、V30G、V30L或V30M。
  116. 如請求項1至5或8至113中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體表現具有T60突變之TTR。
  117. 如請求項116之方法或使用之組合物，其中該T60突變係T60A。
  118. 如請求項1至5或8至113中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體表現具有V122突變之TTR。
  119. 如請求項118之方法或使用之組合物，其中該V122突變係V122A、V122I或V122(-)。
  120. 如請求項1至5或8至119中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體表現野生型TTR。
  121. 如請求項1至5、8至107或120中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體不表現具有V30、T60或V122突變之TTR。
  122. 如請求項1至5、8至107或120至121中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體不表現具有病理突變之TTR。
  123. 如請求項121之方法或使用之組合物，其中該個體之野生型TTR係同型接合。
  124. 如請求項1至5或8至123中任一項之方法或使用之組合物，其中在投與後，該個體具有改善、穩定或減緩變化之感覺運動神經病變之症狀。
  125. 如請求項124之方法或使用之組合物，其中使用肌電圖、神經傳導測試或患者報告之結果量測感覺神經病變之改善、穩定或減緩變化。
  126. 如請求項1至5或8至125中任一項之方法或使用之組合物，其中該個體具有改善、穩定或減緩變化之鬱血性心臟衰竭之症狀。
  127. 如請求項126之方法或使用之組合物，其中使用心臟生物標記測試、肺功能測試、胸部x射線或心電圖量測鬱血性心臟衰竭之改善、穩定或減緩變化。
  128. 如請求項1至5或8至127中任一項之方法或使用之組合物，其中該組合物或該醫藥調配物係經由病毒載體投與。
  129. 如請求項1至5或8至127中任一項之方法或使用之組合物，其中該組合物或該醫藥調配物係經由脂質奈米粒子投與。
  130. 如請求項1至5或8至129中任一項之方法或使用之組合物，其中在投與該組合物或該調配物之前測試該個體之該TTR 基因之特異性突變。
  131. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 5。
  132. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 6。
  133. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 7。
  134. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 8。
  135. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 9。
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  198. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 72。
  199. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 73。
  200. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 74。
  201. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 75。
  202. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 76。
  203. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 77。
  204. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 78。
  205. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 79。
  206. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 80。
  207. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 81。
  208. 如請求項1至130中任一項之方法或組合物，其中選自SEQ ID NO: 5-82之該序列係SEQ ID NO: 82。
  209. 一種如請求項6至208中任一項之組合物或調配物的用途，其用於製備用於治療患有ATTR之人類個體之藥劑。
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