JP7245651B2 - Crispr/cas構成成分のための脂質ナノ粒子製剤 - Google Patents
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Description
LNP製剤を通して送達されるCRISPR/Casカーゴは、CasヌクレアーゼをコードするmRNA分子を含み、細胞でのCasヌクレアーゼの発現を可能にする。カーゴは、1つまたは複数のガイドRNAまたはガイドRNAをコードする核酸をさらに含有する。カーゴは、修復または組換えのための鋳型核酸をさらに含むことができる。
開示される製剤の1つの構成成分は、CasヌクレアーゼmRNAとも呼ばれる、CasヌクレアーゼをコードするmRNAである。向上した安定性および/または免疫原性のために、mRNAを改変することができる。改変は、mRNAの中の1つまたは複数のヌクレオシドに加えることができる。mRNA核酸塩基への化学的改変の例には、プソイドウリジン、1-メチル-プソイドウリジンおよび5-メチルシチジンが含まれる。安定性、発現および免疫原性を向上させるさらなる公知の改変が企図される。CasヌクレアーゼをコードするmRNAは、特定の細胞型、例えば、真核細胞、哺乳動物細胞または、より具体的にはヒト細胞での発現のためにコドンを最適化することができる。一部の実施形態では、mRNAは、Casヌクレアーゼとして、ヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼまたはヒトコドン最適化Cpfヌクレアーゼをコードする。一部の実施形態では、mRNAは精製される。一部の実施形態では、mRNAは沈殿法(例えば、LiCl沈殿、アルコール沈殿、または、例えば本明細書に記載される同等の方法)を使用して精製される。一部の実施形態では、mRNAは、クロマトグラフィーをベースとした方法、例えばHPLCをベースとした方法または同等の方法(例えば、本明細書に記載されるもの)を使用して精製される。一部の実施形態では、mRNAは、沈殿法(例えば、LiCl沈殿)およびHPLCをベースとした方法の両方を使用して精製される。
本開示の一部の実施形態では、LNP製剤のためのカーゴは、少なくとも1つのガイドRNAを含む。ガイドRNAは標的核酸分子の上の標的配列にクラス2 Casヌクレアーゼを誘導することができ、ここで、ガイドRNAは標的配列とハイブリダイズし、Casヌクレアーゼはそれを切断またはモジュレートする。一部の実施形態では、ガイドRNAは、クラス2ヌクレアーゼに結合し、それによる切断の特異性を提供する。一部の実施形態では、ガイドRNAおよびCasタンパク質は、リボ核タンパク質(RNP)、例えば、CRISPR/Cas複合体を形成することができる。一部の実施形態では、CRISPR複合体は、タイプIIのCRISPR/Cas9複合体であってよい。一部の実施形態では、CRISPR/Cas複合体は、Cpf1/ガイドRNA複合体などの、タイプVのCRISPR/Cas複合体であってよい。一部の実施形態では、Casヌクレアーゼは、単一タンパク質Casヌクレアーゼ、例えばCas9タンパク質またはCpf1タンパク質であってよい。一部の実施形態では、ガイドRNAは、Cas9タンパク質による切断を標的化する。
ガイドRNAまたはmRNAに、改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが存在してもよい。1つまたは複数の改変されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むmRNAをコードするガイドRNAまたはCasヌクレアーゼは、正規のA、G、CおよびU残基の代わりまたはそれに加えて使用される、1つまたは複数の天然に存在しないおよび/または天然に存在する構成成分または構成の存在を記載するために、「改変された」RNAと呼ばれる。一部の実施形態では、改変されたRNAは、「改変された」とここで呼ばれる、非正規のヌクレオシドまたはヌクレオチドで合成される。改変されたヌクレオシドおよびヌクレオチドは、以下の1つまたは複数を含むことができる:(i)非連結リン酸酸素の1つまたは両方および/またはホスホジエステル骨格連結中の連結リン酸酸素の1つまたは複数の変更、例えば交換(例示的な骨格改変);(ii)リボース糖の構成成分、例えば、リボース糖の上の2’ヒドロキシルの変更、例えば交換(例示的な糖改変);(iii)「デホスホ」リンカーによるリン酸部分の大幅な交換(例示的な骨格改変);(iv)非正規核酸塩基によるものを含む、天然に存在する核酸塩基の改変または交換(例示的な塩基改変);(v)リボース-リン酸骨格の交換または改変(例示的な骨格改変);(vi)オリゴヌクレオチドの3’末端または5’末端の改変、例えば、末端リン酸基の除去、改変もしくは交換、または部分、キャップもしくはリンカーのコンジュゲーション(そのような3’または5’キャップ改変は、糖および/または骨格の改変を含むことができる);ならびに(vii)糖の改変または交換(例示的な糖改変)。
本明細書に開示される製剤は、鋳型核酸を含むことができる。Casヌクレアーゼのための標的部位において、またはその近くで核酸配列を変更または挿入するために、鋳型を使用することができる。
一部の実施形態では、核酸は精製される。一部の実施形態では、核酸は、沈殿法(例えば、LiCl沈殿、アルコール沈殿、または、例えば本明細書に記載される同等の方法)を使用して精製される。一部の実施形態では、核酸は、クロマトグラフィーをベースとした方法、例えばHPLCをベースとした方法または同等の方法(例えば、本明細書に記載されるもの)を使用して精製される。一部の実施形態では、核酸は、沈殿法(例えば、LiCl沈殿)およびHPLCをベースとした方法の両方を使用して精製される。
一部の実施形態では、本開示のCRISPR/Cas系は、標的核酸分子の上の標的配列に誘導し、それを切断することができる。例えば、標的配列は、Casヌクレアーゼが認識して、切断することができる。一部の実施形態では、クラス2 Casヌクレアーゼは、標的核酸分子の標的配列にガイドRNAが誘導することができ、ここで、ガイドRNAは標的配列とハイブリダイズし、Casタンパク質がそれを切断する。一部の実施形態では、ガイドRNAはそのコグネイトPAMを含む標的配列とハイブリダイズし、Casタンパク質がそれを切断する。一部の実施形態では、標的配列は、ガイドRNAの標的化配列に相補性であってよい。一部の実施形態では、ガイドRNAの標的化配列とガイドRNAにハイブリダイズする対応標的配列の一部の間の相補性の程度は、約50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%であってよい。一部の実施形態では、標的の相同性領域は、コグネイトPAM配列に隣接している。一部の実施形態では、標的配列は、ガイドRNAの標的化配列に100%相補性である配列を含むことができる。他の実施形態では、標的配列は、ガイドRNAの標的化配列と比較して、少なくとも1つのミスマッチ、欠失または挿入を含むことができる。例えば、標的配列およびガイドRNAの標的化配列は、任意選択でPAMに隣接した標的配列の一部において、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のミスマッチを含有することができる。一部の実施形態では、標的配列およびガイドRNAの標的化配列は、1~9個のミスマッチを含有することができる。一部の実施形態では、標的配列およびガイドRNAの標的化配列は、3~6個のミスマッチを含有することができる。一部の実施形態では、標的配列およびガイドRNAの標的化配列は、5または6個のミスマッチを含有することができる。
CRISPR/CasカーゴのためのLNP製剤の様々な実施形態が、本明細書に開示される。そのようなLNP製剤は、ヘルパー脂質、中性脂質およびステルス脂質に加えて、CCD脂質を含むことができる。「脂質ナノ粒子」は、分子間力によって物理的に互いに関係する複数の(すなわち、1つより多い)脂質分子を含む粒子を意味する。LNPは、例えば、マイクロスフェア(一部の実施形態では実質的に球状であり、より特定の実施形態では、水性のコアを含むことができる、例えばRNA分子の相当部分を含む、単層および多層の小胞、例えば、「リポソーム」-ラメラ相脂質二重層を含む)、乳剤中の分散相、ミセルまたは懸濁液中の内相であってよい。乳剤、ミセルおよび懸濁液は、ローカルなおよび/または局所の送達のために適する組成物であってよい。
生物学的活性薬剤の送達のための脂質組成物は、肝臓細胞または器官を優先的に標的にするように調整することができる。ある特定の実施形態では、脂質組成物は、アポリポタンパク質E(ApoE)結合性細胞、例えばApoE受容体を発現する細胞を優先的に標的にする。肝臓細胞へのCRISPR/Cas mRNAおよびガイドRNA構成成分の送達のための脂質組成物は、CCD脂質を含む。
本開示の脂質組成物での使用に適する「中性脂質」には、例えば、様々な中性、非荷電または双性イオン性の脂質が含まれる。本開示で使用するのに適する中性リン脂質の例には、限定されずに、5-ヘプタデシルベンゼン-1,3-ジオール(レゾルシノール)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ホスホコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ホスファチジルコリン(PLPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DAPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン(PMPC)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DBPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジリノレオイルホスファチジルコリンジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、リゾホスファチジルエタノールアミンおよびその組合せが含まれる。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)からなる群から選択することができる。別の実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)であってよい。中性脂質は、LNPの処理を安定化し、向上させる働きをする。
LNPは、(i)封入のためおよびエンドソーム逃避のためにCCD脂質を、(ii)安定化のために中性脂質を、(iii)同じく安定化のためにヘルパー脂質を、ならびに(iv)ステルス脂質を含有することができる。
本明細書に開示されるLNP組成物は、in vivoおよびin vitroの両方での遺伝子編集を通して細胞を工学操作する方法において使用することができる。一部の実施形態では、本方法は、細胞を本明細書に記載されるLNP組成物と接触させることを含む。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物の細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、齧歯動物の細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、ヒトの細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、肝臓細胞であってよい。ある特定の実施形態では、細胞は、ヒトの肝臓細胞であってよい。一部の実施形態では、肝臓細胞は、肝細胞である。一部の実施形態では、肝細胞は、ヒトの肝細胞である。一部の実施形態では、肝臓細胞は、幹細胞である。一部の実施形態では、ヒト肝臓細胞は、肝臓の洞様内皮細胞(LSEC)であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、クッパー細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、肝臓の星状細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、腫瘍細胞であってよい。一部の実施形態では、ヒトの肝臓細胞は、肝臓の幹細胞であってよい。さらなる実施形態では、細胞は、ApoE結合性受容体を含む。
本明細書に開示されるLNP組成物は、in vivoおよびin vitroでの遺伝子編集のために使用することができる。一実施形態では、それを必要とする対象に、本明細書に記載される1つまたは複数のLNP組成物を投与することができる。一実施形態では、本明細書に記載される組成物の治療的有効量は、それを必要とする対象の細胞と接触させることができる。一実施形態では、本明細書に記載されるLNP組成物と細胞を接触させることによって、遺伝子操作された細胞を生成することができる。
本発明の様々な実施形態を以下に示す。
1.遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、細胞を、
クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
ガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含む脂質ナノ粒子(LNP)と接触させることを含む方法。
2.クラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよびガイドRNA核酸を肝臓細胞に送達することを含む遺伝子編集の方法であって、前記クラス2 Cas mRNAおよび前記ガイドRNA核酸は、
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含む少なくとも1つのLNP組成物として製剤化されている、方法。
3.クラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよびガイドRNA核酸を対象のApoE結合性細胞に投与することを含む遺伝子編集の方法であって、前記クラス2 Cas mRNAおよび前記ガイドRNA核酸は、
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含む少なくとも1つのLNP組成物として製剤化されている、方法。
4.肝臓細胞を、
CasヌクレアーゼをコードするmRNA;
ガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含むLNPと接触させることを含む遺伝子編集の方法。
5.肝臓細胞における遺伝子の発現を変更する方法であって、1つまたは複数のLNP製剤としてクラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよびガイドRNA核酸の治療的有効量を対象に投与することを含み、少なくとも1つのLNP製剤が、
ガイドRNA核酸またはクラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含む、方法。
6.遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、細胞を、
クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
単一ガイドRNA(sgRNA)であるかまたはそれをコードするガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含む脂質ナノ粒子(LNP)と接触させることを含む方法。
7.遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、細胞を、
クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含むLNPと接触させることを含む方法。
8.遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、細胞を、
クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
ガイドRNA核酸;
肝臓特異的方法で前記RNAを送達するための手段を含む脂質ナノ粒子組成物と接触させることを含む方法。
9.遺伝子操作された肝臓細胞を生成する方法であって、細胞を、
クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA核酸;
肝臓細胞に前記RNAを送達するための手段を含む脂質ナノ粒子と接触させることを含む方法。
10.CRISPR-Cas複合体を肝臓細胞に投与する方法であって、肝臓細胞における遺伝子編集のための、
Cas9ヌクレアーゼmRNA;
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA;
肝臓細胞に前記RNAを送達するための生分解性手段を含むLNP組成物を対象に投与することを含む方法。
11.前記肝臓細胞が肝細胞である、上記1~10のいずれかに記載の方法。
12.前記肝細胞が一次肝細胞である、上記11に記載の方法。
13.前記肝臓細胞が幹細胞である、上記11に記載の方法。
14.前記細胞が対象の中にある、上記1~13のいずれかに記載の方法。
15.前記対象がヒトである、上記14に記載の方法。
16.前記mRNAが第1のLNP組成物に製剤化され、前記ガイドRNA核酸が第2のLNP組成物に製剤化されている、上記1~15のいずれかに記載の方法。
17.前記第1および第2のLNP組成物が同時に投与される、上記16に記載の方法。
18.前記第1および第2のLNP組成物が逐次的に投与される、上記16に記載の方法。
19.前記mRNAおよび前記ガイドRNA核酸が単一のLNP組成物に製剤化されている、上記1~15のいずれかに記載の方法。
20.少なくとも1つの鋳型をさらに含む、上記1~19のいずれかに記載の方法。
21.前記mRNAがCas9ヌクレアーゼmRNAである、上記1~20のいずれかに記載の方法。
22.前記Cas9 mRNAがヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼである、上記16に記載の方法。
23.前記ガイドRNA核酸がガイドRNAをコードする発現カセットである、上記1~22のいずれかに記載の方法。
24.前記発現カセットが調節エレメントをさらに含む、上記23に記載の方法。
25.前記ガイドRNA核酸がガイドRNAである、上記1~22のいずれかに記載の方法。
26.前記ガイドRNAがsgRNAである、上記23~25のいずれかに記載の方法。
27.前記ガイドRNAが二重ガイドRNA(dgRNA)である、上記23~25のいずれかに記載の方法。
28.前記ガイドRNA核酸が改変された残基を含む、上記1~27のいずれかに記載の方法。
29.前記改変された残基が、骨格改変、糖改変および塩基改変から選択される改変を含む、上記28に記載の方法。
30.前記CCD脂質がリピドAである、上記1~29のいずれかに記載の方法。
31.前記CCD脂質が、リピドA、リピドB、リピドCおよびリピドDから選択される、上記1~29のいずれかに記載の方法。
32.前記ヘルパー脂質が、コレステロール、5-ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートから選択される、上記1~31のいずれかに記載の方法。
33.前記ヘルパー脂質がコレステロールである、上記32に記載の方法。
34.前記中性脂質がDSPCおよびDMPEから選択される、上記1~33のいずれかに記載の方法。
35.前記中性脂質がDSPCである、上記34に記載の方法。
36.前記ステルス脂質がPEG2k-DMGおよびPEG2k-C11から選択される、上記1~35のいずれかに記載の方法。
37.前記ステルス脂質がPEG2k-DMGである、上記36に記載の方法。
38.少なくとも1つのLNPがリピドA、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む、上記1~37のいずれかに記載の方法。
39.少なくとも1つのLNPがリピドB、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む、上記1~37のいずれかに記載の方法。
40.前記組成物が前記CCD脂質を約30モル%から約60モル%の範囲内の量で含む、上記1~39のいずれかに記載の方法。
41.前記組成物が前記ヘルパー脂質を約30モル%から約60モル%の範囲内の量で含む、上記1~40のいずれかに記載の方法。
42.前記組成物が前記中性脂質を約1モル%から約20モル%の範囲内の量で含む、上記1~41のいずれかに記載の方法。
43.前記組成物が前記ステルス脂質を約1モル%から約10モル%の範囲内の量で含む、上記1~42のいずれかに記載の方法。
44.前記組成物が前記CCD脂質を約45モル%の量で含む、上記1~43のいずれかに記載の方法。
45.前記組成物が前記ヘルパー脂質を約44モル%の量で含む、上記1~44のいずれかに記載の方法。
46.前記組成物が前記中性脂質を約9モル%の量で含む、上記1~45のいずれかに記載の方法。
47.前記組成物が前記ステルス脂質を約2モル%の量で含む、上記1~46のいずれかに記載の方法。
48.前記クラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよび前記ガイドRNA核酸が重量で約10:1から約1:10の範囲内の比で存在する、上記1~47のいずれかに記載の方法。
49.前記クラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよび前記ガイドRNAが重量で約1:1の比で存在する、上記1~48のいずれかに記載の方法。
50.前記CCD脂質アミン対前記RNAリン酸の比が約3から約5の範囲内である、上記1~49のいずれかに記載の方法。
51.前記CCD脂質アミン対前記RNAリン酸の比が約4.5である、上記1~50のいずれかに記載の方法。
52.前記組成物の粒径が約50nmから約120nmの範囲内である、上記1~51のいずれかに記載の方法。
53.前記組成物の粒径が約75nmから約150nmの範囲内である、上記1~52のいずれかに記載の方法。
54.前記組成物の封入効率が約70%から約100%の範囲内である、上記1~53のいずれかに記載の方法。
55.前記組成物の多分散指数が約.005から約0.5の範囲内である、上記1~54のいずれかに記載の方法。
56.前記組成物の多分散指数が約0.02から約0.35の範囲内である、上記1~55のいずれかに記載の方法。
57.前記組成物の投与が遺伝子編集をもたらす、上記1~56のいずれかに記載の方法。
58.前記遺伝子編集が遺伝子ノックアウトをもたらす、上記57に記載の方法。
59.前記遺伝子編集が遺伝子補正をもたらす、上記58に記載の方法。
60.前記遺伝子編集が持続的応答をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
61.前記遺伝子編集が約1日から約1年の応答期間をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
62.前記遺伝子編集が少なくとも1週間の応答期間をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
63.前記遺伝子編集が少なくとも2週間の応答期間をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
64.前記遺伝子編集が少なくとも1カ月の応答期間をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
65.前記遺伝子編集が少なくとも4カ月の応答期間をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
66.前記遺伝子編集が少なくとも1年の応答期間をもたらす、上記57~59のいずれかに記載の方法。
67.CasヌクレアーゼをコードするmRNA;
ガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含むLNP組成物。
68.クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含むLNP組成物。
69.肝臓細胞における遺伝子編集のためのLNP組成物であって、
クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA核酸;
CCD脂質;
ヘルパー脂質;
中性脂質;および
ステルス脂質を含むLNP組成物。
70.クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
ガイドRNA核酸;
肝臓特異的方法で前記RNAを送達するための手段を含むLNP組成物。
71.クラス2 CasヌクレアーゼmRNA;
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA核酸;
肝臓細胞に前記RNAを送達するための手段を含むLNP組成物。
72.肝臓細胞における遺伝子編集のためのLNP組成物であって、
Cas9ヌクレアーゼmRNA
sgRNAであるかまたはそれをコードするガイドRNA;
肝臓細胞に前記RNAを送達するための生分解性手段を含むLNP組成物。
73.前記mRNAおよび前記ガイドRNA核酸がLNPに別々に封入されおり、これらのLNPが合わされて前記LNP組成物を形成する、上記67~72のいずれかに記載の組成物。
74.前記mRNAおよび前記ガイドRNA核酸が前記LNP組成物に一緒に封入されている、上記67~72のいずれかに記載の組成物。
75.少なくとも1つの鋳型をさらに含む、上記67~74のいずれかに記載の組成物。
76.前記mRNAがCas9ヌクレアーゼmRNAである、上記67~75のいずれかに記載の組成物。
77.前記Cas9ヌクレアーゼmRNAがヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼである、上記76に記載の組成物。
78.前記ガイドRNA核酸がガイドRNAをコードする発現カセットである、上記67~77のいずれかに記載の組成物。
79.前記発現カセットが調節エレメントをさらに含む、上記78に記載の組成物。
80.前記ガイドRNA核酸がガイドRNAである、上記67~77のいずれかに記載の組成物。
81.前記ガイドRNAがsgRNAである、上記78~80のいずれかに記載の組成物。
82.前記ガイドRNAが二重ガイドRNA(dgRNA)である、上記73~80のいずれかに記載の組成物。
83.前記ガイドRNA核酸が改変された残基を含む、上記67~82のいずれかに記載の組成物。
84.前記改変された残基が、骨格改変、糖改変および塩基改変から選択される改変を含む、上記83に記載の組成物。
85.前記CCD脂質がリピドAである、上記67~74のいずれかに記載の組成物。
86.前記CCD脂質が、リピドA、リピドB、リピドCおよびリピドDから選択される、上記67~85のいずれかに記載の組成物。
87.前記ヘルパー脂質が、コレステロール、5-ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートから選択される、上記67~86のいずれかに記載の組成物。
88.前記ヘルパー脂質がコレステロールである、上記87に記載の組成物。
89.前記中性脂質がDSPCおよびDMPEから選択される、上記67~88のいずれかに記載の組成物。
90.前記中性脂質がDSPCである、上記89に記載の組成物。
91.前記ステルス脂質がPEG2k-DMGおよびPEG2k-C11から選択される、上記67~90のいずれかに記載の組成物。
92.前記ステルス脂質がPEG2k-DMGである、上記91に記載の組成物。
93.少なくとも1つのLNPがリピドA、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む、上記67~92のいずれかに記載の組成物。
94.少なくとも1つのLNPがリピドB、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む、上記67~93のいずれかに記載の組成物。
95.前記CCD脂質を約30モル%から約60モル%の範囲内の量で含む、上記67~94のいずれかに記載の組成物。
96.前記ヘルパー脂質を約30モル%から約60モル%の範囲内の量で含む、上記67~95のいずれかに記載の組成物。
97.前記中性脂質を約1モル%から約20モル%の範囲内の量で含む、上記67~96のいずれかに記載の組成物。
98.前記ステルス脂質を約1モル%から約10モル%の範囲内の量で含む、上記67~97のいずれかに記載の組成物。
99.前記CCD脂質を約45モル%の量で含む、上記67~98のいずれかに記載の組成物。
100.前記ヘルパー脂質を約44モル%の量で含む、上記67~99のいずれかに記載の組成物。
101.前記中性脂質を約9モル%の量で含む、上記67~100のいずれかに記載の組成物。
102.前記ステルス脂質を約2モル%の量で含む、上記67~101のいずれかに記載の組成物。
103.前記クラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよび前記ガイドRNA核酸が重量で約10:1から約1:10の範囲内の比で存在する、上記67~102のいずれかに記載の組成物。
104.前記クラス2 CasヌクレアーゼmRNAおよび前記ガイドRNA核酸が重量で約1:1のモル比で存在する、上記67~103のいずれかに記載の組成物。
105.前記CCD脂質アミン対前記RNAリン酸の比が約3から約5の範囲内である、上記67~104のいずれかに記載の組成物。
106.前記CCD脂質アミン対前記RNAリン酸の比が約4.5である、上記67~105のいずれかに記載の組成物。
107.前記組成物の粒径が約50nmから約120nmの範囲内である、上記67~106のいずれかに記載の組成物。
108.前記組成物の粒径が約75nmから約150nmの範囲内である、上記67~107のいずれかに記載の組成物。
109.前記組成物の封入効率が約70%から約100%の範囲内である、上記67~108のいずれかに記載の組成物。
110.前記組成物の多分散指数が約.005から約0.5の範囲内である、上記67~109のいずれかに記載の組成物。
111.前記組成物の多分散指数が約.02から約0.35の範囲内である、上記67~110のいずれかに記載の組成物。
112.肝臓選択的である、上記67~111のいずれかに記載の組成物。
113.肝細胞選択的である、上記112に記載の組成物。
114.ApoE受容体選択的である、上記112に記載の組成物。
115.上記1~59のいずれかの方法によって作製される、遺伝子操作された肝臓細胞。
116.上記67~114のいずれかの組成物で作製される、遺伝子操作された肝臓細胞。
117.前記肝臓細胞が一次肝細胞である、上記115または116に記載の遺伝子操作された肝臓細胞。
118.凍結保護物質をさらに含む、上記67~114のいずれかに記載の組成物。
119.前記凍結保護物質が約1%から約10w/v%の範囲内の量で存在する、上記118に記載の組成物。
120.前記凍結保護物質が、スクロース、トレハロース、グリセロール、DMSOおよびエチレングリコールから選択される、上記118または119に記載の組成物。
121.前記凍結保護物質がスクロースである、上記118~120のいずれかに記載の組成物。
122.緩衝液をさらに含む、上記67~114または118~121のいずれかに記載の組成物。
123.前記緩衝液が、リン酸緩衝液(PBS)、トリス緩衝液、クエン酸緩衝液およびそれらの混合物から選択される、上記122に記載の組成物。
124.NaClをさらに含む、上記122または123に記載の組成物。
125.前記凍結保護物質がスクロースであり;
前記スクロースが約1%から約10w/v%の範囲内の量で存在し;
前記緩衝液が前記トリス緩衝液およびNaCl緩衝液の混合物であり;
前記NaCl緩衝液が約40mMから約50mMの範囲内の量で存在し;
前記トリス緩衝液が約40mMから約60mMの範囲内の量で存在する、上記124に記載の組成物。
126.前記スクロースが約5w/v%の量で存在し;
前記NaCl緩衝液が約45mMの量で存在し;
前記トリス緩衝液が約50mMの量で存在する、上記125に記載の組成物。
127.約7.3から約7.7の範囲内のpHを有する、上記125または126に記載の組成物。
128.約7.3、約7.4、約7.5または約7.6のpHを有する、上記127に記載の組成物。
129.約7.4から約7.6の範囲内のpHを有する、上記127または128に記載の組成物。
130.約7.5のpHを有する、上記129に記載の組成物。
131.少なくとも20%の編集効率を達成することをさらに含む、上記1~66のいずれかに記載の方法。
132.少なくとも50%の編集効率を達成することをさらに含む、上記1~66のいずれかに記載の方法。
133.少なくとも80%の編集効率を達成することをさらに含む、上記1~66のいずれかに記載の方法。
134.少なくとも20%のDNA改変効率を達成することをさらに含む、上記1~66のいずれかに記載の方法。
135.少なくとも50%のDNA改変効率を達成することをさらに含む、上記1~66のいずれかに記載の方法。
136.少なくとも80%のDNA改変効率を達成することをさらに含む、上記1~66のいずれかに記載の方法。
材料および方法。
脂質ナノ粒子(「LNP」)製剤
約4.5のCCD脂質アミン対RNAリン酸(N:P)のモル比で、LNPを製剤化した。脂質ナノ粒子構成成分を100%エタノールに以下のモル比で溶解した:45モル%(12.7mM)のCCD脂質(例えば、リピドAまたはリピドB);44モル%(12.4mM)のヘルパー脂質(例えば、コレステロール);9モル%(2.53mM)の中性脂質(例えば、DSPC);および2モル%(.563mM)のPEG(例えば、PEG2k-DMGまたはPEG2k-C11)。RNAカーゴは50mM酢酸緩衝液pH4.5に溶解し、概ね0.45mg/mLのRNAカーゴの濃度をもたらした。
線状化プラスミドDNA鋳型およびT7 RNAポリメラーゼを使用したin vitro転写によって、N1-メチル偽性Uを含有するキャップされたおよびポリアデニル化されたCas9 mRNAを生成した。以下の条件でXbaIと37℃で2時間インキュベートすることによって、T7プロモーターおよび100ntポリ(A/T)領域を含有するプラスミドDNAを線状化した:200ng/μLのプラスミド、2U/μLのXbaI(NEB)および1×反応緩衝液。反応を65℃で20分間加熱することによって、XbaIを不活性化した。線状化プラスミドはシリカマキシスピンカラム(Epoch Life Sciences)を使用して酵素および緩衝塩から精製し、線形化を確認するためにアガロースゲルによって分析した。Cas9の改変mRNAを生成するIVT反応を、以下の条件において37℃で4時間インキュベートした:50ng/μLの線状化プラスミド;GTP、ATP、CTPおよびN1-メチル偽性UTP(Trilink)の各々の2mM;10mMのARCA(Trilink);5U/μLのT7 RNAポリメラーゼ(NEB);1U/μLのマウスRNアーゼ阻害剤(NEB);0.004U/μLの無機の大腸菌(E. coli)ピロホスファターゼ(NEB);ならびに1×反応緩衝液。4時間のインキュベーションの後、TURBO DNアーゼ(ThermoFisher)を0.01U/μLの最終濃度まで加え、反応をさらなる30分間インキュベートしてDNA鋳型を除去した。製造業者のプロトコル(ThermoFisher)に従ってMegaClear転写クリーンアップキットを使用して、酵素およびヌクレオチドからCas9 mRNAを精製した。代わりに、例えば実施例15に示すように、沈殿プロトコルを通してmRNAを精製し、その後、一部の場合にはHPLCに基づく精製が続いた。簡潔には、DNアーゼ消化の後、7.5MのLiCl溶液の0.21倍の量を加えて混合することによってmRNAを沈殿させ、沈殿したmRNAは遠心分離によってペレットにした。上清を除去したならば、mRNAを水で復元した。酢酸アンモニウムおよびエタノールを使用して、mRNAを再び沈殿させた。2倍量の100%EtOHと一緒に、5Mの酢酸アンモニウムを2Mの最終濃度のためにmRNA溶液に加えた。溶液を混合し、-20℃で15分間インキュベートした。沈殿したmRNAを遠心分離によって再びペレットにし、上清を除去し、mRNAを水で復元した。最終段階として、酢酸ナトリウムおよびエタノールを使用して、mRNAを沈殿させた。1/10量の3Mの酢酸ナトリウム(pH5.5)を、2倍量の100%EtOHと一緒に溶液に加えた。溶液を混合し、-20℃で15分間インキュベートした。沈殿したmRNAを遠心分離によって再びペレットにし、上清を除去し、ペレットを70%の冷エタノールで洗浄し、空気乾燥させた。mRNAを、水で復元した。HPLC精製mRNAのために、LiCl沈殿および復元の後に、mRNAをRP-IP HPLCによって精製した(例えば、Kariko, et al. Nucleic Acids Research, 2011, Vol. 39, No. 21 e142を参照)。プールするために選択された分画を合わせ、上記の酢酸ナトリウム/エタノール沈殿によって脱塩した(deslated)。
LNP製剤を、平均粒径、多分散(pdi)、全RNA含有量およびRNAの封入効率のために分析した。平均粒径および多分散は、Malvern Zetasizer DLS機器を使用して動的光散乱(DLS)によって測定した。DLSによる測定の前に、LNP試料をPBSで30倍に希釈した。平均粒径の強度に基づく測定であるZ平均直径を、pdiと一緒に報告した。
RiboGreen(登録商標)色素(ThermoFisher Scientific、カタログ番号R11491)の線形範囲の中に入るように、LNPを1×TE緩衝液で75倍に希釈した。希釈したLNPの50μlを、50μlの1×TE緩衝液または0.2%Triton X-100を含む1×TE緩衝液と2反復でさらに混合した。TritonがLNPを完全に破壊し、全RNAを曝露させてRiboGreen(登録商標)色素と相互作用させることを可能にするために、試料を37℃で10分の間インキュベートした。LNPを作製するために使用された出発RNA溶液を利用し、上記と同じステップに従うことによって、標準曲線のための試料を調製した。希釈したRiboGreen(登録商標)色素(100μL、1×TE緩衝液に100倍、製造業者の説明書による)を試料の各々に次に加え、光の非存在下において室温で10分の間インキュベートした。試料を読み取るためにSpectraMax M5マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を使用し、励起、オートカットオフおよび放射波長はそれぞれ488nm、515nmおよび525nmに設定した。封入効率(%EE)は、以下の式を使用して計算した:
Cas9によるDNA切断の後の非相同的末端連結(NHEJ)を通して生成された挿入、欠失および置換などのゲノムDNAにおける突然変異事象を検出するために、T7E1アッセイを一部の実施例において使用した(例えば、Cho et al., Targeted genome engineering in human cells with the Cas9 RNA-guided endonuclease. Nature Biotechnology. 2013; 31, 230-232を参照)。
ゲノム中の標的位置で編集効率を定量的に判定するために、深部配列決定を利用して遺伝子編集によって導入された挿入および欠失の存在を確認した。
マウス細胞株(Neuro2AおよびHepa1.6)を10%ウシ胎児血清を加えたDMEM培地で培養し、本明細書に記載される溶解および分析(例えば、リポーター発現、T7E1アッセイ、NGS)の18~24時間前のLNPによるトランスフェクションの24時間前に、15,000細胞/ウェルの密度で平板培養した。コラーゲンコート96ウェルプレートを使用して、肝細胞平板培養培地(Invitrogen)にマウス一次肝細胞(Invitrogen)を1ウェルにつき細胞数15,000で培養した。5時間後に、平板培養培地を除去し、LNPおよび3%マウス血清を含有する肝細胞維持培地(37℃で5分間プレインキュベートした)と交換した。本明細書に記載される溶解および分析(例えば、T7E1アッセイ、NGS)の前に、細胞に42~48時間トランスフェクトした。細胞株および一次肝細胞両方のために、LNPを希釈し、1ウェルにつき100ngのCas9 mRNAおよび概ね30nMのガイドRNAから出発して細胞に加え、1ウェルにつき0.1ngのCas9 mRNAおよび0.03nMのガイドRNAまでの段階希釈を片対数により実行した。
6~10週齢のCD-1雌マウスを、各研究で使用した。群平均体重に基づいて投与溶液を調製するために、動物を計量し、体重によってグループ分けした。1動物につき0.2mLの量(体重1キログラムにつき概ね10mL)で、LNPを側方の尾静脈を通して投与した。有害作用について投与の概ね6時間後に動物を観察した。投与の24時間後に体重を測定し、イソフルラン麻酔下で心臓の穿刺を通した放血によって動物を様々な時点で安楽死させた。血清分離管または本明細書に記載される血漿のための緩衝クエン酸ナトリウムを含有する管に、血液を収集した。in vivo編集を含む研究のために、DNA抽出および分析のために、肝臓組織を各動物からの中央の小葉から、または3つの独立した小葉(例えば、右中央、左中央および左側葉)から収集した。一部の研究のために、脾臓組織も収集した。
溶解緩衝液(組織10mgにつき概ね200μL)で組織をホモジナイズし、DNAを沈殿させることを含む製造業者のプロトコルに従って、Invitrogen PureLinkゲノムDNAキット(カタログK1820-02)を使用して、10mgの組織からゲノムDNAを抽出した。本明細書に記載される通り、PCRおよび以降のNGS分析のために、全てのDNA試料を100ng/μL濃度に正規化した。
血液を収集し、血清を示すように単離した。全TTR血清レベルは、マウスプレアルブミン(トランスチレチン)ELISAキット(Aviva Systems Biology、カタログOKIA00111)を使用して判定した。キット試薬および標準は、製造業者のプロトコルに従って調製した。マウス血清を、1×アッセイ希釈剤で10,000倍の最終希釈まで希釈した。2回の逐次的な50倍希釈を実行して2,500倍希釈をもたらすことによって、これは実行された。10,000倍の全体の試料希釈のために、最終の4倍希釈ステップを実行した。捕捉抗体をプレコーティングしたELISAプレートの各ウェルに、標準曲線希釈溶液(各々100μL)および希釈血清試料の両方を加えた。洗浄の前に、プレートを室温で30分の間インキュベートした。酵素抗体コンジュゲート(1ウェルにつき100μL)を、20分のインキュベーションのために加えた。未結合の抗体コンジュゲートを除去し、プレートを再び洗浄してから発色性基質溶液を加えた。プレートを10分の間インキュベートしてから、100μLの停止溶液、例えば硫酸(概ね0.3M)を加えた。450nmの吸光度で、プレートをSpectraMax M5プレートリーダーで読み取った。標準曲線から4つのパラメータロジスティック曲線あてはめを使用して、SoftMax Proソフトウェアバージョン6.4.2によって血清TTRレベルを計算した。最終血清値を、アッセイ希釈のために調整した。
示した通りに、血液を血漿のために収集した。BIOPHEN FVIIアッセイキット(Anaria Diagnostics、カタログA221304)を使用して、血漿中の第VII因子活性レベルを測定した。キット試薬は、製造業者のプロトコルに従って調製した。2回の逐次的な50倍希釈を実行して2,500倍希釈をもたらすことによって、キットの試料希釈緩衝液で血漿を10,000倍に希釈した。10,000倍の全体の試料希釈のために、最終の4倍希釈ステップを実行した。希釈した試料(30μL)を、キット試薬1(30μL)に加えた。次に、キット試薬2(60μL)をプレートに加え、その後それを37℃で7分の間インキュベートした。キット試薬3(60μL)を次にプレートに加え、プレートを37℃でさらなる5分の間インキュベートした後、酢酸(20v/v%水溶液、60μL)を加えて酵素反応を停止した。405nMで、プレートをSoftMax M5プレートリーダーで読み取った。対照動物の血漿から作成した較正曲線に基づいてFVII活性の相対値を計算し、ビヒクル対照のパーセントとして報告した。
eGFP mRNA封入LNPのin vitro送達。
eGFP(TriLink、カタログL-6101)をコードするmRNAを含むLNPを、実施例1に記載されている通りに調製した。各LNP調製物の構成成分には、CCD脂質(45モル%)、コレステロール(44モル%)、DSPC(9モル%)およびPEG2k-DMGまたはPEG2k-C11(2モル%)が含まれる。LNP-002、-006、-007、-010および-011は、リピドAをCCD脂質として含み、LNP-012および-013は、リピドBをCCD脂質として含む。LNP-002、-010および-012はPEG2k-DMGを含み、LNP-006、-007、-011および-013はPEG2k-C11を含む。平均粒径、多分散および封入効率を含むLNPの詳細は、表1に提供される。実施例1に記載のようにLNPはマウス肝細胞株(Hepa1.6)に送達され、送達されたeGFP mRNAの総量は、各LNPについて1ウェルにつき100ngまたは500ngであった。細胞をLNPと一緒に概ね18時間インキュベートし、eGFP発現はCytoFLEX細胞アナライザー(Bechman Coulter)を使用して測定した。
gLUC mRNA封入LNPのin vivo送達。
Gaussiaルシフェラーゼ(gLUC)(TriLink、カタログL-6123)をコードするmRNAを含むLNPを実施例1に記載されている通りに調製し、in vivoで動物へのmRNAの送達について試験した。各LNP調製物の構成成分には、CCD脂質(45モル%)、コレステロール(44モル%)、DSPC(9モル%)およびPEG2k-DMG(2モル%)が含まれる。LNP-014はリピドAを含み、LNP-015はリピドBを含んでいた。平均粒径、多分散および封入効率などのこれらの製剤の詳細は、表1に提供される。0.1mg/kgおよび0.3mg/kgのgLUC mRNA用量が、各LNP製剤と送達された。動物を24時間後に安楽死させ、実施例1に記載されている通りに血液採取および血清の単離を実行した。Pierce(商標)Gaussiaルシフェラーゼフラッシュアッセイキット(ThermoFisher Scientific、カタログ番号16158)を製造業者のプロトコルに従って使用して、血清ルシフェラーゼ発現を測定した。
Cas9 mRNA封入LNP(mRNA-LNP)と二重ガイドRNA封入LNP(dgRNA-LNP)を使用したin vivo送達および編集。
肝臓でのin vivo編集のためにCRISPR/Cas RNA構成成分(例えば、gRNAおよびCas9をコードするmRNA)を送達するためのLNPを、CD-1マウスで試験した。これらの実験において、dgRNAおよびmRNAは別々に製剤化した。
dgRNA-LNPおよびIVT sgRNA-LNPを使用したin vitroおよびin vivo送達および編集。
化学改変dgRNAを含むLNPおよびin vitro転写(IVT)sgRNAを含むLNPの効力を、Cas9 mRNA-LNPによる共投与との関連で試験した。
改変dgRNA-LNPまたは改変sgRNA-LNPを使用したin vitroおよびin vivo送達および編集。
化学改変されたdgRNAを含むLNPおよび化学改変されたsgRNAを含むLNPは、Cas9 mRNA-LNPとの共投与によっても試験した。
Cas9 mRNAと共製剤化したsgRNAを含むLNPを使用したin vitroおよびin vivo送達および編集。
LNP組成物に一緒に封入したCas9 mRNAおよびsgRNAの送達のために製剤化したLNPも、CRISPR/Cas構成成分を効果的に送達する。
製剤パラメータの変異。
1つの製剤としてCas9 mRNAおよびgRNAを一緒に送達するために製剤化されたLNPを、(1)ある範囲の用量にわたって;(2)変化させたmRNA:gRNAの比で;(3)1回投与対2回投与による効力について;および(4)LNPが脾臓によって取り込まれるかまたは脾臓における編集をもたらすかどうかについて試験した。
この研究で、実施例1に記載の通り1日目にLNP-169を0.1mg/kg、0.5mg/kgまたは2mg/kgの用量で動物に投与した(各群でn=5)。5日目および9日目に、TTRの血清レベル分析のために血液を採取した。実施例1に記載の通り、NGS分析のために9日目に検死で肝臓および脾臓を採取した。
1日目に、実施例1に記載されているように、1:1のmRNA:gRNA比のLNP-169(すなわち、1mg/kgのmRNA、1mg/kgのgRNA、合計2mg/kgのRNA用量)、10:1の比のLNP-170(すなわち、1.8mg/kgのmRNA、0.18mg/kgのgRNA、合計1.98mg/kgのRNA用量)、または、1:10の比のLNP-171(すなわち、0.18mg/kgのmRNA、1.8mg/kgのgRNA、合計1.98mg/kgのRNA用量)、を動物に投与した(各群につきn=5)。(注:1:1のmRNA:gRNA比の用量を受けた群およびデータは、上のこの実施例の用量応答研究に記載されるのと同じ群およびデータである。)5日目および9日目に血液を採取し、血清中TTRレベルを測定した。実施例1に記載の通り、NGS分析のために9日目に検死で肝臓および脾臓を採取した。
この研究では、1群の動物は、1日目にLNP-169の単回投与(2mg/kg)を受けたが、別の群は実施例1に記載されているようにLNP-169の2回の投与(各々2mg/kg)を受け、最初の投与は1日目におよび2回目の投与は5日目に投与された(両群でn=5)。(注:LNP-169の単回投与を受けた群およびデータは、上のこの実施例の用量応答およびmRNA:gRNA比研究に記載されるのと同じ群およびデータである。)5日目に(2回目の投与を受けた群のためには2回目の用量の投与の前に)および実施例1に記載の通りに再び9日目の検死で、血液をTTR血清中レベルのために両群から採取した。
LNPが脾臓に誘導されてそれによって取り込まれ、それによって遺伝子編集をもたらすかどうか判定するために、上記の研究(この実施例の中の)の各動物から脾臓を検死で採取した。ゲノムDNAを脾臓組織から抽出し、実施例1に記載の通りにNGS分析に付した。
(1)Cas9 mRNA-LNPと共投与される改変されたdgRNA-LNPと、(2)Cas9 mRNAおよび改変されたdgRNAを1つの製剤に一緒に含むLNPの間のin vivo比較研究。
別々のLNPとしての、または1つの製剤中に一緒の、Cas9 mRNAおよび改変されたdgRNAの送達のために製剤化されたLNPは、CRISPR/Cas構成成分を効果的に送達する。
LNPのApoE結合および一次肝細胞のトランスフェクション。
実施例8で実証されるように、本明細書で提供されるLNPは、肝臓によって効果的に取り込まれるが、脾臓によってわずかに取り込まれるだけである。この実施例は、一次肝細胞におけるApoE媒介取り込みに関するデータを提供し、LNPがApoEに結合することを実証したLNP-ApoE結合を試験するためのアッセイを提供する。
他のタンパク質に加えて、血清は培地にApoEの供与源を提供し、したがって、LNPが一次肝細胞への取り込みのために血清(例えば、ApoEの供与源として)を必要とするかどうかについて試験した。これは、血清の存在の有る無しで、LNPを一次肝細胞にin vitroで加えることによって達成された。
LNPをApoEで最も一般的な形態である組換えApoE3とインキュベートし、次に、HPLCの上の塩勾配を使用してヘパリン親和性カラムで分離した。HPLCランにおいて、ApoE3に結合したLNPおよび未結合のLNPに対応した2つのピーク群があった。ApoE3に結合せず、ヘパリンカラム中を自由に流れた遊離のLNPは未結合である。結合していたのは、ヘパリンカラムに結合し塩勾配において溶出したLNP/ApoE3複合体に相当する、より長い滞留時間を有するピークであった。結合を計算するために、ApoE3に結合したLNPに対応するピーク面積を、両方のピークの面積の合計によって割り算することによって結合ピーク面積の百分率を計算した。
DNA発現カセットから発現されたsgRNAとLNPを使用したin vitroおよびin vivo送達および編集。
この実施例は、Cas9 mRNAおよびsgRNAをコードする発現カセットを担持させたLNPを使用した遺伝子編集を実証する。
マウスTTRを標的にするsgRNAとして連結したU6プロモーターを含有するDNA配列のPCR増幅によって、sgRNAをコードするアンプリコンを調製した。ゲノムDNAへのDNAアンプリコンの組込みを阻止するために、各プライマーは、5’末端に反転したジデオキシTヌクレオチドを含有した。フェノール/クロロホルム抽出と続くエタノール沈殿によって、PCR生成物を精製した。DNAペレットを乾燥させて、TE緩衝液に再懸濁させた。
・Cas9 mRNAおよびsgRNA発現カセットの共送達;
・Cas9 mRNAの2時間前に投与したsgRNA発現カセット;および
・sgRNA発現カセットの2時間前に投与したCas9 mRNA。
in vitro対in vivo編集。
実施例1に記載の通りに、Cas9 mRNAおよび異なるマウスTTR配列を標的にする化学改変sgRNAを製剤化して、マウスに投与した(2mg/kg)。マウス一次肝細胞にin vitroでトランスフェクトするために、同じLNP調製物を使用した。この実施例のsgRNAは化学的に合成されて、民間の供給業者から供給され、それぞれsgRNAの5’および3’末端の両方における3つの末端ヌクレオチドで、およびその間に2’-O-メチル改変およびホスホロチオエート連結を有する。
LNPによって送達されたCRISPR/Cas9構成成分の薬物動態。
Cas9 mRNAおよびマウスTTRを標的にするsgRNAを含有するLNP-294を、実施例1に記載の通りに製剤化した。mRNA対ガイドRNAの比は、HPLCによって確認した。実施例1に記載の通りに各LNPを2mg/kgで動物に投与し(各群でn=3)、以下の時点で解体した:5分、15分、30分、60分、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、72時間および7日。検死時に、Cas9 mRNAおよびガイドRNAのレベルのqPCR分析のために、血漿、肝臓および脾臓を採取した。図23はこれらの構成成分の血漿中濃度を示し、図24は肝臓中の濃度を示し、図25は脾臓中の濃度を示す。血漿中濃度のために、以下の薬物動態学的パラメータを計算した:
in vivo編集の応答の期間
Cas9 mRNAおよびマウスTTR配列を標的にする化学改変sgRNAを、実施例1に記載の通りに製剤化した。
mRNA調製物を使用した製剤
実施例1に記載の通りに、Cas9 mRNAは、沈殿だけおよびHPLC精製プロトコルの両方を使用して調製した。HPLC精製mRNAを使用してLNPを製剤化し(LNP492)、沈殿だけで処理したmRNAを使用して製剤化したLNP(LNP490、LNP494)と比較した。LNP494のCas9 mRNAカーゴは、沈殿だけのmRNAの異なる合成ロットを使用して調製した。
凍結製剤
約4.5のリピドA対RNAリン酸(N:P)のモル比で、LNPを製剤化した。脂質ナノ粒子構成成分を100%エタノールに以下のモル比で溶解した:45モル%(12.7mM)のリピドA;44モル%(12.4mM)のコレステロール;9モル%(2.53mM)のDSPC;および2モル%(0.563mM)のPEG2k-DMG。RNAカーゴは50mM酢酸緩衝液pH4.5に溶解し、概ね0.45mg/mLのRNAカーゴの濃度をもたらした。この研究のために、実施例14に記載されるsg282を使用した。
sg396:
代わりのLNP製剤化プロセス
約4.5のリピドA対RNAリン酸(N:P)のモル比で、LNPを製剤化した。脂質ナノ粒子構成成分を100%エタノールに以下のモル比で溶解した:45モル%(12.7mM)のリピドA;44モル%(12.4mM)のコレステロール;9モル%(2.53mM)のDSPC;および2モル%(0.563mM)のPEG2k-DMG。酢酸緩衝液(最終濃度25mMの酢酸ナトリウム、pH4.5)またはクエン酸緩衝液(最終濃度25mMのクエン酸ナトリウム、100mMのNaCl、pH5)にRNAカーゴを溶解し、概ね0.45mg/mLのRNAカーゴの濃度をもたらした。この研究のために、実施例14に記載されるsg282を使用した。
より高等な種へのLNPの送達。
実施例14に記載されるものと同様に製剤を調製した。ある特定の実験では、sg282におけるのと同じ化学的改変でsgRNAを改変したが、ラットTTR配列に特異的な標的化配列であった。ラット肝臓において効率的な編集が、観察された。2mg/kg(全カーゴ)投与および5mg/kg(全カーゴ)投与は、実験で良好な耐容性を示した。GFPをコードするmRNAを含有する類似の製剤も、1mg/kgおよび3mg/kgの用量で非ヒト霊長類に良好な耐容性を示した。
上の実施例に記載される配列を以下のように掲載する(5’から3’までのポリヌクレオチド配列):
フォワード:
フォワード:
フォワード:
フォワード:
フォワード:
/5InvddT/=反転したジデオキシT
フォワード:
/5InvddT/GCTGCAAGGCGATTAAGTTG
リバース:
/5InvddT/TAGCTCACTCATTAGGCACC
Claims (44)
- CasヌクレアーゼをコードするmRNA;
ガイドRNA核酸;
以下を含む複数の成分脂質:
イオン化可能な脂質;
ステロイド、ステロールおよびアルキルレゾルシノールから選択されるヘルパー脂質;
ヘプタデシルベンゼン-1,3-ジオール(レゾルシノール)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ホスホコリン(DOPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、ホスファチジルコリン(PLPC)、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DAPC)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジラウリロイルホスファチジルコリン(DLPC)、ジミリストイルホスファチジルコリン(DMPC)、1-ミリストイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、1-パルミトイル-2-ミリストイルホスファチジルコリン(PMPC)、1-パルミトイル-2-ステアロイルホスファチジルコリン(PSPC)、1,2-ジアラキドイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DBPC)、1-ステアロイル-2-パルミトイルホスファチジルコリン(SPPC)、1,2-ジエイコセノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DEPC)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(POPE)、およびリゾホスファチジルエタノールアミンから選択される中性脂質、
;および
脂質部分に連結した親水性の頭基を有する、ステルス脂質
を含む脂質ナノ粒子(LNP)組成物であって、イオン化可能な脂質が、
リピドA[(9Z,12Z)-3-((4,4-ビス(オクチルオキシ)ブタノイル)オキシ)-2-((((3-(ジエチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)メチル)プロピルオクタデカ-9,12-ジエノエート]、
リピドB[(5-((ジメチルアミノ)メチル)-1,3-フェニレン)ビス(オキシ))ビス(オクタン-8,1-ジイル)ビス(デカノエート)]、
リピドC[2-((4-(((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)ヘキサデカノイル)オキシ)プロパン-1,3-ジイル(9Z,9’Z,12Z,12’Z)-ビス(オクタデカ-9,12-ジエノエート)]および
リピドD[3-(((3-(ジメチルアミノ)プロポキシ)カルボニル)オキシ)-13-(オクタノイルオキシ)トリデシル3-オクチルウンデカノエート]から選択される、LNP組成物。 - 前記CasヌクレアーゼをコードするmRNAが、クラス2 CasヌクレアーゼmRNAであり、前記ガイドRNA核酸が、単一のガイドRNA(sgRNA)であるかまたはそれをコードする、請求項1に記載のLNP組成物。
- 前記ガイドRNAが、sgRNAである、請求項1または2に記載のLNP組成物。
- 前記ガイドRNA核酸が、ガイドRNAをコードする発現カセットである、請求項1または2に記載のLNP組成物。
- 肝臓における遺伝子編集において用いるための、請求項1~4のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 第1のLNPおよび第2のLNPを含み、前記mRNAが第1のLNPに封入されており、前記ガイドRNA核酸が第2のLNPに封入されている、請求項1~5のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記mRNAおよび前記ガイドRNA核酸が前記LNP組成物に一緒に封入されている、請求項1~5のいずれか一項に記載の組成物。
- 少なくとも1つの鋳型核酸をさらに含む、請求項1~7のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記mRNAがCas9ヌクレアーゼmRNAである、請求項1~8のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記Cas9ヌクレアーゼmRNAがヒトコドン最適化Cas9ヌクレアーゼである、請求項9に記載のLNP組成物。
- 前記イオン化可能な脂質がリピドAである、請求項1~10のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記ヘルパー脂質が、コレステロール、5-ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートから選択される、請求項1~11のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記中性脂質がDSPCおよびDMPEから選択される、請求項1~12のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記ステルス脂質がPEG2k-DMGおよびPEG2k-C11から選択される、請求項1~13のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 少なくとも1つのLNPがリピドA、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む、請求項1~14のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 少なくとも1つのLNPがリピドB、コレステロール、DSPCおよびPEG2k-DMGを含む、請求項1~10および12~15のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を約30モル%から約60モル%の量で含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、ヘルパー脂質を約30モル%から約60モル%の量で含む、請求項1~17のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、中性脂質を約1モル%から約20モル%の量で含む、請求項1~18のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、ステルス脂質を約1モル%から約10モル%の量で含む、請求項1~19のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を約45モル%の量で含む、請求項1~20のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を約30モル%から約60モル%の量で含み、ヘルパー脂質を約30モル%から約60モル%の量で含み、中性脂質を約1モル%から約20モル%の量で含み、ステルス脂質を約1モル%から約10モル%の量で含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を42モル%から47モル%の量で含み、ヘルパー脂質を41モル%から46モル%の量で含み、中性脂質を5モル%から15モル%の量で含み、ステルス脂質を1モル%から5モル%の量で含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を42モル%から47モル%の量で含み、ヘルパー脂質を41モル%から46モル%の量で含み、中性脂質を7モル%から12モル%の量で含み、ステルス脂質を1モル%から3モル%の量で含む、請求項1~16のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記イオン化可能な脂質がリピドAおよびリピドBから選択され、ヘルパー脂質が、コレステロール、5-ヘプタデシルレゾルシノールおよびコレステロールヘミスクシネートから選択され、中性脂質がジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)およびジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)から選択される、請求項1~10のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を42モル%から47モル%の量で含み、ヘルパー脂質を41モル%から46モル%の量で含み、中性脂質を5モル%から15モル%の量で含み、ステルス脂質を1モル%から5モル%の量で含む、請求項25に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を42モル%から47モル%の量で含み、ヘルパー脂質を41モル%から46モル%の量で含み、中性脂質を7モル%から12モル%の量で含み、ステルス脂質を1モル%から3モル%の量で含む、請求項25に記載のLNP組成物。
- 前記イオン化可能な脂質がリピドAおよびリピドBから選択され、ヘルパー脂質が、コレステロールであり、中性脂質がDSPCであり、ステルス脂質の親水性の頭基がPEG-2000ポリエチレングリコールを含む、請求項1~10のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を42モル%から47モル%の量で含み、ヘルパー脂質を41モル%から46モル%の量で含み、中性脂質を5モル%から15モル%の量で含み、ステルス脂質を1モル%から5モル%の量で含む、請求項28に記載のLNP組成物。
- 前記成分脂質が、イオン化可能な脂質を42モル%から47モル%の量で含み、ヘルパー脂質を41モル%から46モル%の量で含み、中性脂質を7モル%から12モル%の量で含み、ステルス脂質を1モル%から3モル%の量で含む、請求項28に記載のLNP組成物。
- 前記イオン化可能な脂質がアミンを含み、イオン化可能な脂質アミン対前記RNAリン酸のモル比が約3~約5である、請求項1~24のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記LNPが、約75nmから約150nmの粒径を有する、請求項1~31のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 前記mRNAおよび前記ガイドRNA核酸が、約70%から約100%の封入効率で前記LNP組成物に封入されている、請求項1~32のいずれか一項に記載のLNP組成物。
- 対象中のApoE結合性細胞における遺伝子編集において用いるための、請求項1~33のいずれか一項に記載の組成物であって、前記遺伝子編集が、前記対象に治療有効量の前記LNP組成物を投与することを含む、LNP組成物。
- 対象中の肝臓細胞における遺伝子の発現を変更する方法において用いるための、請求項1~33のいずれか一項に記載の組成物であって、前記方法が、前記対象に治療有効量の前記LNP組成物を投与することを含む、LNP組成物。
- 対象中のApoE結合性細胞を遺伝子編集するための医薬の製造における、請求項1~33のいずれか一項に記載のLNP組成物の使用。
- 対象中の肝臓細胞における遺伝子の発現を変更するための医薬の製造における、請求項1~33のいずれか一項に記載のLNP組成物の使用。
- 請求項1~33のいずれか一項に記載のLNP組成物の、肝臓細胞を遺伝子編集するための使用であって、肝臓細胞を前記LNP組成物とin vitroで接触させることを含む、使用。
- 肝臓細胞またはApoE結合性細胞を遺伝子編集するin vitroの方法であって、
肝臓細胞またはApoE結合性細胞を、請求項1~33のいずれか一項に記載のLNP組成物と接触させることを含む、方法。 - 肝臓細胞において遺伝子編集する方法である請求項39に記載の方法であって、肝臓細胞を前記LNP組成物と接触させることが、前記LNP組成物を前記肝臓細胞に送達することを含む、方法。
- ApoE結合性細胞において遺伝子編集する方法である請求項39に記載の方法であって、ApoE結合性細胞を前記LNP組成物と接触させることが、前記LNP組成物を前記ApoE結合性細胞に送達することを含む、方法。
- 前記肝臓細胞が肝細胞である、請求項39または40に記載の方法。
- 前記肝臓細胞が幹細胞である、請求項39、40および42のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、少なくとも80%の編集効率をもたらす、請求項39~43のいずれか一項に記載の方法。
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