JP2023545128A - ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を製造する改善された方法 - Google Patents

ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子を製造する改善された方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、脂質ナノ粒子製剤化およびｍＲＮＡ封入のための改善された方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、周囲温度で低シトレート濃度を含有するｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とを混合する工程を含む、脂質ナノ粒子にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する方法を提供する。よって、本発明は、脂質ナノ粒子へとｍＲＮＡを封入する、有効で信頼できる、省エネかつ費用対効果が高い方法を提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示を参照によって本明細書に組み入れる、２０２０年１０月１２日に出願された米国仮特許出願第６３／０９０，５１３号の優先権を主張する。
メッセンジャーＲＮＡ治療（ＭＲＴ）は、様々な疾患を処置するためのますます重要なアプローチになっている。ＭＲＴは、治療を必要とする患者の体内でｍＲＮＡによってコードされるタンパク質を産生するための、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の患者への投与を伴う。脂質ナノ粒子は、ｍＲＮＡの効率的なインビボ送達の目的でｍＲＮＡを封入するために一般的に使用される。脂質ナノ粒子送達を改善するために、ｍＲＮＡの細胞内送達および／または発現に影響を及ぼすことができ、拡張可能で費用対効果が高い製造プロセスに適応可能であり得る新規方法および組成物を特定することに多くの努力が集中してきた。
本発明は、とりわけ、ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を含む組成物を製造する改善された効率的かつ費用対効果が高い方法を提供する。本発明は、周囲温度で（ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液を予熱することなく）、低濃度のシトレート（すなわち、５ｍＭ以下）を含有するｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とを混合することが、高い封入効率、ｍＲＮＡ回収率、およびより均質かつより小さな粒径をもたらしたという驚くべき発見に基づく。よって、一態様では、本発明は、熱および高エネルギーを使用することなく治療用途のための大規模製造プロセスに使用することができる、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入する、有効で信頼できる、省エネで費用対効果が高くかつより安全な方法を提供する。
一態様では、本発明は、とりわけ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ溶液を（ｂ）１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質溶液と混合して、ＬＮＰ形成溶液中のＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する工程を含み、ｍＲＮＡ溶液は、５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、６０％超の封入効率を有する、方法を提供する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、混合前に周囲温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、周囲温度で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、混合後に周囲温度である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子内にｍＲＮＡを封入する方法は、熱を用いずに、周囲温度で行われる。
一部の実施形態では、周囲温度は約３５℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約３２℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約３０℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２８℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２６℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２５℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２４℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２３℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２２℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約１９℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８℃未満である。一部の実施形態では、周囲温度は約１６℃未満である。
一部の実施形態では、周囲温度は約１５～３５℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１６～３２℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１７～３０℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８～３０℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０～２８℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０～２６℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０～２５℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１～２４℃の範囲である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１～２３℃の範囲である。
一部の実施形態では、周囲温度は約１６℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約１８℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２０℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２１℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２２℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２３℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２４℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２５℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２６℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２７℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約２８℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３０℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３１℃である。一部の実施形態では、周囲温度は約３２℃である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約８．６ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約６．０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約５．０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４．０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．２５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．０ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．９ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．８ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．７ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．６ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．４ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．３ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．２５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．２ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．１ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．０５ｍＭ未満のクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０～１０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．５～７．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．０～５．０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５～３．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．１ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．２ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．２５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．３ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．４ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．６ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．７ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．８ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約０．９ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．２５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１．７５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４．０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４．５ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約５．０ｍＭのクエン酸緩衝液を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液はトレハロースをさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は２０％トレハロースを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は１５％トレハロースを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は１０％トレハロースを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は５％トレハロースを含む。
一部の実施形態では、本方法は、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液を加熱する工程を要さない。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１０Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液８Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液６Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液４Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１２５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．２５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約１．０ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約１．５ｍｇ／ｍＬ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約２．０ｍｇ／ｍＬ超である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は１：１～１０：１の間の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は２：１～６：１の間の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約２：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約３：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約５：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約６：１の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約２：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約３：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約５：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約６：１超の比（ｖ／ｖ）で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は２．５～５．５の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は３．０～５．０の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は３．５～４．５の間のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約３．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約３．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５．５のｐＨを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２５ｍＭ～５００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３７．５ｍＭ～３５０ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約７５ｍＭ～３００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１００ｍＭ～３００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１５０ｍＭ～３００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３７．５ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約７５ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１２５ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１５０ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１７５ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２２５ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３００ｍＭのＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３５０ｍＭのＮａＣｌを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約３．５のｐＨを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．０のｐＨを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約１００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．０ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３．５ｍＭのシトレート、約３００ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む。
一部の実施形態では、本方法は混合後にｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程をさらに含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２１℃～６５℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２５℃～６０℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは３０℃～５５℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは３５℃～５０℃の間の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２６℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３１℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３２℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３５℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３８℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４２℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４５℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５５℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０℃の温度でインキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６５℃の温度でインキュベートされる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約７０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約８０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約９０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１００分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１２０分間超インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約３０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約５０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約７０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約８０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１００分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１２０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１５０分間インキュベートされる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約１８０分間インキュベートされる。
一部の実施形態では、脂質溶液は、５０％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、４０％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、３０％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、２５％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、２０％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、１５％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、１０％未満の非水性溶媒を含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、５０％未満のエタノールを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、４０％未満のエタノールを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、３０％未満のエタノールを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、２５％未満のエタノールを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、２０％未満のエタノールを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、１５％未満のエタノールを含む。一部の実施形態では、脂質溶液は、１０％未満のエタノールを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、４０％エタノールへと混合されて、脂質ナノ粒子の懸濁液をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、２０％エタノールへと混合されて、脂質ナノ粒子の懸濁液をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、１５％エタノールへと混合されて、脂質ナノ粒子の懸濁液をもたらす。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、１０％エタノールへと混合されて、脂質ナノ粒子の懸濁液をもたらす。
一部の実施形態では、脂質溶液は、１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質をさらに含む。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、さらに精製される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は、タンジェンシャルフローフィルトレーションによって精製される。
一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、１８０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、１５０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、１００ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、９０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、８０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、７０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、６０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、５０ｎｍ未満の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、４０ｎｍ未満の平均径を有する。
一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、４０～１５０ｎｍの範囲の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、６０～１００ｎｍの範囲の平均径を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、４０～７０ｎｍの範囲の平均径を有する。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．３未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．２未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１８未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１５未満のＰＤＩを有する。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は約０．１未満のＰＤＩを有する。
一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約６０％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約６５％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約７０％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約７５％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約８０％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約８５％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約９０％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約９５％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約９６％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約９７％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約９８％超の封入率を有する。一部の実施形態では、精製された脂質ナノ粒子は、約９９％超の封入率を有する。
一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、１～１０の間である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、２～６の間である。一部の実施形態では、Ｎ／Ｐ比は、約４である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は１～１０の間のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は２～６の間のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約２のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４のＮ／Ｐ比で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約６のＮ／Ｐ比で混合される
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ３０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ４０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ７５ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １００ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２００ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ２５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５００ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ７５０ｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １ｋｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ ５ｋｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ １０ｋｇまたはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液はパルスレスフローポンプによって混合される。一部の実施形態では、ポンプはギアポンプである。一部の実施形態では、ポンプは遠心ポンプである。一部の実施形態では、ポンプは臑動ポンプである。
一部の実施形態では、緩衝溶液は、約１００～３００ｍｌ／分の間、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、または４８００～６０００ｍｌ／分の範囲の流速で混合される。一部の実施形態では、緩衝溶液は、約２２０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２４００ｍｌ／分、約３６００ｍｌ／分、約４８００ｍｌ／分、または約６０００ｍｌ／分の流速で混合される。
一部の実施形態では、クエン酸緩衝液は、約１００～３００ｍｌ／分の間、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、または４８００～６０００ｍｌ／分の範囲の流速で混合される。一部の実施形態では、クエン酸緩衝液は、約２２０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約１２００ｍｌ／分、約２４００ｍｌ／分、約３６００ｍｌ／分、約４８００ｍｌ／分、または約６０００ｍｌ／分の流速で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１５０～２５０ｍｌ／分、２５０～５００ｍｌ／分、５００～１０００ｍｌ／分、１０００～２０００ｍｌ／分、２０００～３０００ｍｌ／分、３０００～４０００ｍｌ／分または４０００～５０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、約２０００ｍｌ／分、約３０００ｍｌ／分、約４０００ｍｌ／分、または約５０００ｍｌ／分の流速で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約５００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約６００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約８００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１２００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１４００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１６００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約１８００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２４００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約３０００ｍｌ／分の流れで混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約４０００ｍｌ／分の流れで混合される。
一部の実施形態では、脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量と同じである。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より２倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より３倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より４倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より４．５倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より５倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より６倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より８倍大きい。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より１０倍大きい。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、ｍＲＮＡ溶液が１０ｍＭのシトレートを有することを除いて同じ条件下で脂質溶液と混合されたｍＲＮＡ溶液から形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して少なくとも５％高い。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、ｍＲＮＡ溶液が１０ｍＭのシトレートを有することを除いて同じ条件下で脂質溶液と混合されたｍＲＮＡ溶液から形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して少なくとも１０％高い。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、ｍＲＮＡ溶液が１０ｍＭのシトレートを有することを除いて同じ条件下で脂質溶液と混合されたｍＲＮＡ溶液から形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して少なくとも１５％高い。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、ｍＲＮＡ溶液が１０ｍＭのシトレートを有することを除いて同じ条件下で脂質溶液と混合されたｍＲＮＡ溶液から形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して少なくとも２０％高い。
一態様では、本発明は、とりわけ、本発明の方法によって製造された脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む組成物を提供する。
一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ２０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ２５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ５０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ７５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １００ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １２５ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １５０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ２５０ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ ５００ｇまたはそれ以上を含む。一部の実施形態では、組成物はｍＲＮＡ １ｋｇまたはそれ以上を含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは未修飾である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約０．５ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約１ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約２ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約３ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約４ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約５ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約６ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約８ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約１０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約２０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約３０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約４０ｋｂ超である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは約５０ｋｂ超である。
一態様では、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ溶液を（ｂ）１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質溶液と混合して、ＬＮＰ形成溶液中のＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する工程を含み、ｍＲＮＡ溶液は、０．１ｍＭ～５ｍＭの間のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、６０％超の封入効率を有する、方法が提供される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１ｍＭ～５ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１ｍＭ～４ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１ｍＭ～３ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１ｍＭ～２ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２ｍＭ～３ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３ｍＭ～４ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４ｍＭ～５ｍＭの間のシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約１ｍＭのシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約２ｍＭのシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約３ｍＭのシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約４ｍＭのシトレートを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、約５ｍＭのシトレートを含む。
本発明の他の機能、目的、および利点は、以下の詳細な説明、図面および特許請求の範囲で明らかである。しかしながら、詳細な説明、図面、および特許請求の範囲は、本発明の実施形態を示しているが、単なる例として与えられるものであって、限定として与えられるものではないことが理解されるべきである。本発明の範囲内の様々な変更および修正が当業者に明らかになるだろう。
ｍＲＮＡ溶液中の様々な濃度のシトレートを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率を示す例示的グラフを示す図である。封入効率は、混合後のインキュベーション前（０分）および後（９０分）に測定した。 ｍＲＮＡ溶液中の様々な濃度の塩化ナトリウムを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率を示す例示的グラフを示す図である。封入効率は、混合後のインキュベーション前（０分）および後（９０分）に測定した。 ｍＲＮＡ溶液中の様々な濃度のシトレートおよび塩化ナトリウムを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率を示す例示的グラフを示す図である。封入効率は、混合後のインキュベーション前（０分）および後（９０分）に測定した。 異なる比率（ｖ／ｖ）のｍＲＮＡ溶液：脂質溶液を用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率を示す例示的グラフを示す図である。封入効率は、混合後のインキュベーション前（０分）および後（９０分）に測定した。 混合プロセス中に様々な流速を用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率を示す例示的グラフを示す図である。封入効率は、混合後のインキュベーション前（０分）および後（９０分）に測定した。
定義
本発明がより容易に理解されるようにするために、ある特定の用語をまず以下に定義する。以下の用語および他の用語についての追加の定義は本明細書を通して示される。本発明の背景を説明し、その実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物および他の参考資料は参照によって本明細書に組み入れる。
アミノ酸：本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、最も広義の意味で、ポリペプチド鎖に組み込まれる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は一般構造Ｈ２Ｎ－Ｃ（Ｈ）（Ｒ）－ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は合成アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸はｄ－アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸はｌ－アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見られる２０種の標準ｌ－アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、合成的に製造されるか、天然の供給源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外の任意のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「合成アミノ酸」は、それだけに限らないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）、および／または置換を含む化学修飾アミノ酸を包含する。ペプチド中のカルボキシ－および／またはアミノ末端アミノ酸を含むアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基、および／またはその活性に悪影響を及ぼすことなくペプチドの循環半減期を変化させることができる他の化学基による置換によって修飾される。アミノ酸はジスルフィド結合に参加することができる。アミノ酸は、１つまたはそれ以上の化学実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分等）との会合などの１つまたはそれ以上の翻訳後修飾を含むことができる。「アミノ酸」という用語は、「アミノ酸残基」と互換的に使用され、遊離アミノ酸および／またはペプチドのアミノ酸残基を指す。この用語が遊離アミノ酸を指すか、ペプチドの残基を指すかは、この用語が使用される文脈から明らかになる。
動物：本明細書で使用される場合、「動物」という用語は、動物界の任意のメンバーを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階のヒトを指す。一部の実施形態では、「動物」は、任意の発達段階の非ヒト動物を指す。ある特定の実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物（例えば、齧歯類、マウス、ラット、ウサギ、サル、イヌ、ネコ、ヒツジ、ウシ、霊長類、および／またはブタ）である。一部の実施形態では、動物は、それだけに限らないが、哺乳動物、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、昆虫、および／または虫を含む。一部の実施形態では、動物は、トランスジェニック動物、遺伝子組換え動物、および／またはクローンである。
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つまたはそれ以上の値に適用される場合、言及される参照値に類似の値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記されるかまたは文脈から明らかでない限り（そのような数字が可能な値の１００％を超える場合を除く）、言及される参照値のいずれかの方向における（より大きいかまたはより小さい）２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％またはそれ以下に入る値の範囲を指す。
合わせる：本明細書で使用される場合、「合わせる」という用語は、混合するまたはブレンドすると互換的に使用される。合わせるは、別個の特性を有する離散的ＬＮＰ粒子を同じ溶液にまとめる、例えば、ｍＲＮＡ－ＬＮＰと空のＬＮＰを合わせて、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ組成物を得ることを指す。一部の実施形態では、２つのＬＮＰを合わせることが、合わせられる成分の特定の比で実施される。一部の実施形態では、合わせることから得られた結果として生じる組成物は、その成分のいずれか一方または両方と異なる特性を有する。
送達：本明細書で使用される場合、「送達」という用語は、局所送達と全身送達の両方を包含する。例えば、ｍＲＮＡの送達は、ｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて標的組織内に保持される状況（「局所分配」または「局所送達」とも呼ばれる）、およびｍＲＮＡが標的組織に送達され、コードされるタンパク質が発現されて患者の循環系（例えば、血清）内に分泌され、全身に分配され、他の組織によって取り込まれる状況（「全身分配」または「全身送達」とも呼ばれる）を包含する。一部の実施形態では、送達は、例えば噴霧を含む、肺送達である。
効能：本明細書で使用される場合、「効能」という用語、または文法上同等物は、関連するタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡの送達に関連する、生物学的に関連するエンドポイントの改善を指す。一部の実施形態では、生物学的エンドポイントは、投与後のある特定の時点での塩化アンモニウム負荷に対する保護である。
封入：本明細書で使用される場合、「封入」という用語、またはその文法上同等物は、核酸分子をナノ粒子内に閉じ込めるプロセスを指す。
発現：本明細書で使用される場合、核酸配列の「発現」は、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳、複数のポリペプチド（例えば、抗体の重鎖または軽鎖）のインタクトタンパク質（例えば、抗体）への組み立て、および／またはポリペプチドもしくは完全に組み立てられたタンパク質（例えば、抗体）の翻訳後修飾を指す。本出願において、「発現」および「産生」という用語、ならびにそれらの文法上同等物は互換的に使用される。
改善する、増加させる、または減少させる：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」もしくは「減少させる」という用語、または文法上同等物は、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下の対照となる対象（または複数の対照となる対象）における測定値などの、ベースライン測定値に対する値を示す。「対照となる対象」は、処置される対象とほぼ同じ年齢の、処置される対象と同じ形態の疾患に罹患している対象である。
不純物：本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、標的材料または化合物の化学組成とは異なる、限られた量の液体、気体、または固体内部の物質を指す。不純物は、汚染物質とも呼ばれる。
インビトロ：本明細書で使用される場合、「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的な環境、例えば、試験管または反応容器、細胞培養物等で起こるイベントを指す。
インビボ：本明細書で使用される場合、「インビボ」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物などの多細胞生物内で起こるイベントを指す。細胞系の文脈においては、この用語は、生細胞内で起こるイベントを指すために使用される（例えば、インビトロ系と対照的に）。
単離された：本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、（１）（天然および／または実験設定のいずれにせよ）最初に産生された際に会合していた成分の少なくとも一部から分離された、ならびに／または（２）人の手によって産生、製造、および／もしくは製作された、物質および／または実体を指す。単離された物質および／または実体は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超のこれらが最初に会合していた他の成分から分離される。一部の実施形態では、単離された薬剤が、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。本明細書で使用される場合、物質は、他の成分を実質的に含まない場合に、「純粋」である。本明細書で使用される場合、単離された物質および／または実体のパーセント純度の計算は賦形剤（例えば、緩衝剤、溶媒、水等）を含むべきでない。
リポソーム：本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、任意の層状、多層状、または固体ナノ粒子小胞を指す。典型的には、リポソームは、本明細書で使用される場合、１つもしくはそれ以上の脂質を混合することによって、または１つもしくはそれ以上の脂質とポリマーを混合することによって形成される。一部の実施形態では、本発明に適したリポソームは、カチオン性脂質および場合により非カチオン性脂質、場合によりコレステロール系脂質、および／または場合によりＰＥＧ修飾脂質を含有する。
局所分配または送達：本明細書で使用される場合、「局所分配」、「局所送達」という用語、または文法上同等物は、組織特異的送達または分配を指す。典型的には、局所分配または送達は、ｍＲＮＡによってコードされるペプチドまたはタンパク質（例えば、酵素）が、患者の循環系に入るのを回避する細胞内でまたは限られた分泌で翻訳および発現されることを要する。
メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）：本明細書で使用される場合、「メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）」という用語は、少なくとも１つのペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、本明細書で使用される場合、修飾ＲＮＡと未修飾ＲＮＡの両方を包含する。ｍＲＮＡは、１つまたはそれ以上のコード領域および非コード領域を含有する。ｍＲＮＡは、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学的に合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、ｍＲＮＡは、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。ｍＲＮＡ配列は、特に指示しない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、シュードウリジン、および５－メチルシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
Ｎ／Ｐ比：本明細書で使用される場合、「Ｎ／Ｐ比」という用語は、脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中の負に帯電した分子単位に対するその脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中の正に帯電した分子単位のモル比を指す。よって、Ｎ／Ｐ比は、典型的には脂質ナノ粒子内に封入されたｍＲＮＡ中のリン酸基のモルに対するその脂質ナノ粒子中のカチオン性脂質中のアミン基のモルの比として計算される。
核酸：本明細書で使用される場合、「核酸」という用語は、最も広義の意味で、ポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる任意の化合物および／または物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してポリヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込むことができる化合物および／または物質である。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むポリヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本鎖および／または二本鎖ＤＮＡおよび／またはｃＤＮＡを包含する。さらに、「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」という用語、および／または同様の用語は、核酸類似体、すなわち、ホスホジエステル骨格以外を有する類似体を含む。例えば、当技術分野で公知であり、骨格中にホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を有する、いわゆる「ペプチド核酸」は本発明の範囲内にあると考えられる。「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」という用語は、互いの縮重バージョンである、および／または同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列および／またはＲＮＡはイントロンを含む。核酸は、天然供給源から精製する、組換え発現系を使用して産生し、場合により精製する、化学合成すること等が可能である。適切な場合、例えば化学的に合成した分子の場合には、核酸は、化学修飾塩基または糖、骨格修飾等を有する類似体などのヌクレオシド類似体を含むことができる。核酸配列は、特に指示しない限り、５’から３’方向に提示される。一部の実施形態では、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。一部の実施形態では、本発明は、具体的には、送達を容易にするまたは達成するために化学的に修飾されていない核酸（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシドを含む、ポリヌクレオチドおよび残基）を意味する「未修飾核酸」に関する。一部の実施形態では、ヌクレオチドＴおよびＵは、配列記述中で互換的に使用される。
患者：本明細書で使用される場合、「患者」または「対象」という用語は、提供される組成物を、例えば、実験、診断、予防、化粧、および／または治療目的で投与することができる任意の生物を指す。典型的な患者には、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類、および／またはヒトなどの哺乳動物）が含まれる。一部の実施形態では、患者がヒトである。ヒトには、出生前および出生後形態が含まれる。
薬学的に許容される：「薬学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、信頼できる医学的判断の範囲内で、合理的なベネフィット／リスク比と釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症なしに、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適した物質を指す。
薬学的に許容される塩：薬学的に許容される塩は当技術分野で周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９７７）６６：１～１９において薬学的に許容される塩を詳細に記載している。本発明の化合物の薬学的に許容される塩には、適切な無機および有機酸ならびに塩基から誘導されるものが含まれる。薬学的に許容される、非毒性の酸付加塩の例は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸および過塩素酸などの無機酸により、または酢酸、シュウ酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、コハク酸もしくはマロン酸などの有機酸により、またはイオン交換などの当技術分野で使用される他の方法を使用することによって形成されるアミノ基の塩である。他の薬学的に許容される塩には、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、グルコン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ヨウ化水素酸塩、２－ヒドロキシ－エタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２－ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３－フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが含まれる。適切な塩基から誘導される塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩およびＮ＋（Ｃ１～４アルキル）４塩が含まれる。代表的なアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩には、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなどが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な場合、非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、ならびにハライド、ヒドロキシド、カルボキシレート、サルフェート、ホスフェート、ニトレート、スルホネートおよびアリールスルホネートなどの対イオンを使用して形成されるアミンカチオンが含まれる。さらなる薬学的に許容される塩には、適切な求電子試薬、例えばハロゲン化アルキルを使用してアミンを四級化して、四級化アルキル化アミノ塩を形成することから形成される塩が含まれる。
有効性：本明細書で使用される場合、「有効性」という用語、または文法上同等物は、ｍＲＮＡがコードするタンパク質もしくはペプチドの発現および／または得られる生物学的効果のレベルを指す。
塩：本明細書で使用される場合、「塩」という用語は、酸と塩基との間の中和反応から生じるか、または生じることができるイオン性化合物を指す。
全身分配または送達：本明細書で使用される場合、「全身分配」、「全身送達」という用語、または文法上同等物は、全身または生物全体に影響を及ぼす送達または分配の機序またはアプローチを指す。典型的には、全身分配または送達は、体の循環系、例えば血流を介して達成される。「局所分配または送達」の定義と比較されたい。
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトまたは任意の非ヒト動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長類）を指す。ヒトには、出生前および出生後形態が含まれる。多くの実施形態では、対象はヒトである。対象は、疾患の診断または処置のために医療提供者にかかっているヒトを指す患者であることができる。「対象」という用語は、本明細書において、「個体」または「患者」と互換的に使用される。対象は、疾患または障害に罹患することができるか、またはかかりやすいが、疾患または障害の症状を示していても、示していなくてもよい。
実質的に：本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、目的の特徴または特性の全部または全部に近い程度または度合いを示す定量的状態を指す。生物分野の当業者であれば、生物および化学現象が、完了するおよび／または完了まで進行するまたは絶対的な結果を達成するもしくは回避することがあったとしてもまれであることを理解するだろう。したがって、「実質的に」という用語は、多くの生物および化学現象に固有の完全性の潜在的な欠如をとらえるために本明細書で使用される。
標的組織：本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、処置される疾患に罹患している任意の組織を指す。一部の実施形態では、標的組織は、疾患に関連する病態、症状、または機能を示す組織を含む。
治療上有効量：本明細書で使用される場合、治療剤の「治療上有効量」という用語は、疾患、障害、および／または状態に罹患しているまたはかかりやすい対象に投与した場合に、疾患、障害、および／または状態の症状を処置する、診断する、予防する、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。治療上有効量は、典型的には少なくとも１単位用量を含む投薬レジメンを介して投与されることが当業者によって認識されよう。
治療指数：本明細書で使用される場合、「治療指数」は、毒性になる血中の薬物の濃度と、有効である濃度との比率である。治療指数が大きいほど、薬物はより安全である。
処置すること：本明細書で使用される場合、「処置する」、「処置」、または「処置すること」という用語は、特定の疾患、障害、および／または状態の１つまたは複数の症状または機能を部分的または完全に軽減する、改善する、緩和する、阻害する、予防する、その発症を遅延させる、その重症度を減少させる、および／またはその発生を減少させるために使用される任意の方法を指す。処置は、疾患に関連する病態を発症するリスクを減らす目的で、疾患の徴候を示していない、および／または疾患の早期徴候のみを示す対象に投与することができる。
収率：本明細書で使用される場合、「収率」という用語は、出発物質としての全ｍＲＮＡと比較した封入後に回収されたｍＲＮＡのパーセンテージを指す。一部の実施形態では、「回収率」という用語が「収率」という用語と互換的に使用される。
詳細な説明
本発明は、ｍＲＮＡ治療用組成物を製造するために、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤中に封入されたｍＲＮＡを製造する改善された方法を提供し、その結果方法は加熱工程を必要としない。本発明は、周囲温度で（ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液を予熱することなく）低クエン酸緩衝液中のｍＲＮＡ溶液と脂質溶液とを混合することが、高い封入効率、ｍＲＮＡ回収率、およびより均質かつより小さな粒径をもたらしたという驚くべき発見に基づく。よって、一態様では、本発明は、熱を使用することなく治療用途のための大規模製造プロセスに使用することができる、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入する、有効で信頼できる、省エネで費用対効果が高くかつより安全な方法を提供する。
ｍＲＮＡを封入するリポソームの形成
本明細書に開示されるｍＲＮＡを脂質ナノ粒子に封入する方法は、当技術分野で現在公知の様々な技術に適用することができる。様々な方法は、米国特許出願公開第２０１１／０２４４０２６号、米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号、米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号、米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号および２０１９年７月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／８７７，５９７号に記載されており、本発明を実施するために使用することができ、これらの全てを参照によって本明細書に組み入れる。本明細書で使用される場合、方法Ａは、米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号に記載される、脂質を脂質ナノ粒子に最初に事前形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合することによってｍＲＮＡを封入する慣用的な方法を指す。本明細書で使用される場合、方法Ｂは、米国特許出願公開第２０１８／０１５３８２２号に記載される、事前形成脂質ナノ粒子をｍＲＮＡと混合することによってメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を封入する方法を指す。
核酸を送達するために、高い封入効率を達成することが、原薬（例えば、ｍＲＮＡ）を保護し、インビボでの活性の喪失を減少させるために重要である。よって、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質またはペプチドの発現およびその治療効果の増強はｍＲＮＡ封入効率と高度に相関している。
上記の方法Ａを使用して高い封入効率を達成するために、方法は、典型的には、周囲温度より高い温度まで１０ｍＭのクエン酸緩衝液中の溶液の１つまたはそれ以上を加熱する（すなわち、熱源からの熱を溶液に加える）（または周囲温度より高い温度で維持する）工程を含む。米国特許出願公開第２０１６／００３８４３２号に記載されるように、１つまたはそれ以上の溶液を加熱することにより、ｍＲＮＡ封入効率および回収率が増加する。さらに、方法Ａは、典型的には、ｍＲＮＡおよび／または脂質溶液中に緩衝剤として１０～１００ｍＭのシトレートを含む。しかしながら、製造上の観点から、ｍＲＮＡおよび／または脂質溶液を加熱することは、大量のエネルギーおよび費用を必要とする。よって、一態様では、本発明は、熱を使用することなく、治療用途のための大規模製造プロセスに使用することができる、脂質ナノ粒子にｍＲＮＡを封入する費用対効果が高くかつより安全な方法を提供する。本発明は、ｍＲＮＡ溶液中で低濃度のシトレート（すなわち、５ｍＭ以下）を使用することによって、混合前にｍＲＮＡおよび／または脂質溶液を加熱することなく、高い封入率を達成することができる方法を初めて開示する。
ｍＲＮＡ溶液
様々な方法を使用して本発明に適したｍＲＮＡ溶液を製造することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載される緩衝液に直接溶解することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡストック溶液を封入用の脂質溶液と混合する直前に緩衝液と混合することによって作製することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、１．２ｍｇ／ｍｌ、１．４ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、１．６ｍｇ／ｍｌ、もしくは２．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。したがって、一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．２ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．４ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．５ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．６ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約０．８ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１．２ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１．４ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１．５ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１．６ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約２．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約２．５ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、もしくは５．０ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度で水中にｍＲＮＡを含有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡストック溶液は、約１ｍｇ／ｍｌ、約１０ｍｇ／ｍｌ、約５０ｍｇ／ｍｌ、もしくは約１００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える濃度でｍＲＮＡを含有する。
典型的には、適切なｍＲＮＡ溶液は、緩衝剤および／または塩を含有することもできる。一般的に、緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムを含むことができる。一部の実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、約０．１ｍＭ～１００ｍＭ、０．５ｍＭ～９０ｍＭ、１．０ｍＭ～８０ｍＭ、２ｍＭ～７０ｍＭ、３ｍＭ～６０ｍＭ、４ｍＭ～５０ｍＭ、５ｍＭ～４０ｍＭ、６ｍＭ～３０ｍＭ、７ｍＭ～２０ｍＭ、８ｍＭ～１５ｍＭ、または９～１２ｍＭの範囲であることができる。一部の実施形態では、緩衝剤の適切な濃度は、２．０ｍＭ～４．０ｍＭの範囲であることができる。
一部の実施形態では、緩衝液は約５ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約３ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約０．５ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約０．２５ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約０．１ｍＭ未満のシトレートを含む。一部の実施形態では、緩衝液はシトレートを含まない。
例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムが含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液中の塩の適切な濃度は、約１ｍＭ～５００ｍＭ、５ｍＭ～４００ｍＭ、１０ｍＭ～３５０ｍＭ、１５ｍＭ～３００ｍＭ、２０ｍＭ～２５０ｍＭ、３０ｍＭ～２００ｍＭ、４０ｍＭ～１９０ｍＭ、５０ｍＭ～１８０ｍＭ、５０ｍＭ～１７０ｍＭ、５０ｍＭ～１６０ｍＭ、５０ｍＭ～１５０ｍＭ、または５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲であることができる。適切なｍＲＮＡ溶液中の塩濃度は、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、もしくは１００ｍＭである、またはそれを超える。
一部の実施形態では、緩衝液は約３００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約２００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１７５ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約１００ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約７５ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約５０ｍＭ ＮａＣｌを含む。一部の実施形態では、緩衝液は約２５ｍＭ ＮａＣｌを含む。
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５～６．５、３．５～６．０、３．５～５．５、３．５～５．０、３．５～４．５、４．０～５．５、４．０～５．０、４．０～４．９、４．０～４．８、４．０～４．７、４．０～４．６、または４．０～４．５の範囲のｐＨを有することができる。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ溶液は、約３．５、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．２、５．４、５．６、５．８、６．０、６．１、６．３、および６．５またはそれ以下のｐＨを有することができる。
一部の実施形態は、緩衝液は約５．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．８のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．７のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．６のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．４のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．３のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．２のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．１のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約４．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．９のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．８のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．７のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．６のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．５のｐＨを有する。一部の実施形態では、緩衝液は約３．４のｐＨを有する。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液はポンプを使用して緩衝液と混合される。例示的なポンプには、それだけに限らないが、パルスレスフローポンプ、ギアポンプ、蠕動ポンプおよび遠心ポンプが含まれる。
典型的には、緩衝液は、ｍＲＮＡストック溶液の流量を超える流量で混合される。例えば、緩衝液は、ｍＲＮＡストック溶液の流量より少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、または２０倍大きい流量で混合される。一部の実施形態では、緩衝液は、約１００～６０００ｍｌ／分（例えば、約１００～３００ｍｌ／分、３００～６００ｍｌ／分、６００～１２００ｍｌ／分、１２００～２４００ｍｌ／分、２４００～３６００ｍｌ／分、３６００～４８００ｍｌ／分、４８００～６０００ｍｌ／分、または６０～４２０ｍｌ／分）の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、緩衝液は、約６０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、１４０ｍｌ／分、１８０ｍｌ／分、２２０ｍｌ／分、２６０ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、３４０ｍｌ／分、３８０ｍｌ／分、４２０ｍｌ／分、４８０ｍｌ／分、５４０ｍｌ／分、６００ｍｌ／分、１２００ｍｌ／分、２４００ｍｌ／分、３６００ｍｌ／分、４８００ｍｌ／分、もしくは６０００ｍｌ／分またはそれを超える流量で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～６００ｍｌ／分（例えば、約５～５０ｍｌ／分、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分）の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約５ｍｌ／分、１０ｍｌ／分、１５ｍｌ／分、２０ｍｌ／分、２５ｍｌ／分、３０ｍｌ／分、３５ｍｌ／分、４０ｍｌ／分、４５ｍｌ／分、５０ｍｌ／分、６０ｍｌ／分、８０ｍｌ／分、１００ｍｌ／分、２００ｍｌ／分、３００ｍｌ／分、４００ｍｌ／分、５００ｍｌ／分、もしくは６００ｍｌ／分またはそれを超える流量で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約１０～３０ｍｌ／分、約３０～６０ｍｌ／分、約６０～１２０ｍｌ／分、約１２０～２４０ｍｌ／分、約２４０～３６０ｍｌ／分、約３６０～４８０ｍｌ／分、または約４８０～６００ｍｌ／分の間の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡストック溶液は、約２０ｍｌ／分、約４０ｍｌ／分、約６０ｍｌ／分、約８０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、または約６００ｍｌ／分の流量で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は周囲温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２０～２５℃の温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は約２１～２３℃の温度である。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は脂質溶液と混合する前に加熱されない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液は周囲温度で維持される。
脂質溶液
本発明によると、脂質溶液は、ｍＲＮＡを封入するための脂質ナノ粒子を形成するのに適した脂質の混合物を含有する。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、エタノール系である。例えば、適切な脂質溶液は、純エタノール（すなわち、１００％エタノール）中に溶解された所望の脂質の混合物を含有することができる。別の実施形態では、適切な脂質溶液は、イソプロピルアルコール系である。別の実施形態では、適切な脂質溶液は、ジメチルスルホキシド系である。別の実施形態では、適切な脂質溶液は、それだけに限らないが、エタノール、イソプロピルアルコールおよびジメチルスルホキシドを含む適切な溶媒の混合物である。
適切な脂質溶液は、様々な濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。例えば、適切な脂質溶液は、約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、１．０ｍｇ／ｍｌ、２．０ｍｇ／ｍｌ、３．０ｍｇ／ｍｌ、４．０ｍｇ／ｍｌ、５．０ｍｇ／ｍｌ、６．０ｍｇ／ｍｌ、７．０ｍｇ／ｍｌ、８．０ｍｇ／ｍｌ、９．０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１５ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、もしくは１００ｍｇ／ｍｌまたはそれを超える総濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、約０．１～１００ｍｇ／ｍｌ、０．５～９０ｍｇ／ｍｌ、１．０～８０ｍｇ／ｍｌ、１．０～７０ｍｇ／ｍｌ、１．０～６０ｍｇ／ｍｌ、１．０～５０ｍｇ／ｍｌ、１．０～４０ｍｇ／ｍｌ、１．０～３０ｍｇ／ｍｌ、１．０～２０ｍｇ／ｍｌ、１．０～１５ｍｇ／ｍｌ、１．０～１０ｍｇ／ｍｌ、１．０～９ｍｇ／ｍｌ、１．０～８ｍｇ／ｍｌ、１．０～７ｍｇ／ｍｌ、１．０～６ｍｇ／ｍｌ、または１．０～５ｍｇ／ｍｌの範囲の総濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、最大約１００ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、または１０ｍｇ／ｍｌの総濃度で所望の脂質の混合物を含有することができる。
任意の所望の脂質を、ｍＲＮＡを封入するのに適した任意の比で混合することができる。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、カチオン性脂質、ヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）、両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）および／またはＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。一部の実施形態では、適切な脂質溶液は、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上のヘルパー脂質（例えば、非カチオン性脂質および／またはコレステロール脂質）および１つまたはそれ以上のＰＥＧ化脂質を含む所望の脂質の混合物を含有する。
一部の実施形態では、脂質溶液は周囲温度である。一部の実施形態では、脂質溶液は約２０～２５℃の温度である。一部の実施形態では、脂質溶液は約２１～２３℃の温度である。一部の実施形態では、脂質溶液は脂質溶液と混合する前に加熱されない。一部の実施形態では、脂質溶液は周囲温度で維持される。
ある特定の実施形態では、提供される組成物は、ｍＲＮＡがリポソームの両表面上に会合されており、同リポソーム内に封入されているリポソームを含む。例えば、本発明の組成物の製造中、カチオン性リポソームは、静電的相互作用を通してｍＲＮＡと会合することができる。
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法はリポソームに封入されたｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種は同じリポソームに封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡ種は異なるリポソームに封入される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、その脂質組成、脂質成分のモル比、径、電荷（ゼータ電位）、標的化リガンドおよび／またはこれらの組合せが異なる１つまたはそれ以上のリポソームに封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のリポソームは、ステロール系カチオン性脂質、中性脂質、ＰＥＧ修飾脂質および／またはこれらの組合せの異なる組成を有することができる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のリポソームは、リポソームを作製するために使用されるコレステロール系カチオン性脂質、中性脂質、およびＰＥＧ修飾脂質の異なるモル比を有することができる。
封入方法
本明細書で使用される場合、ｍＲＮＡ搭載脂質ナノ粒子（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する方法は、「ｍＲＮＡ封入」という用語またはその文法上同等物と互換的に使用される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは、ｍＲＮＡ溶液を脂質溶液と混合することによって形成され、ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は混合する前に周囲温度で維持される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液および脂質溶液は、ｍＲＮＡが脂質ナノ粒子に封入されるように、溶液に混合される。このような溶液は製剤または封入溶液とも呼ばれる。
適切な製剤または封入溶液は、エタノールのような溶媒を含む。例えば、適切な製剤または封入溶液は、約１０％エタノール、約１５％エタノール、約２０％エタノール、約２５％エタノール、約３０％エタノール、約３５％エタノール、または約４０％エタノールを含む。一部の実施形態では、適切な製剤または封入溶液は、イソプロピルアルコールのような溶媒を含む。例えば、適切な製剤または封入溶液は、約１０％イソプロピルアルコール、約１５％イソプロピルアルコール、約２０％イソプロピルアルコール、約２５％イソプロピルアルコール、約３０％イソプロピルアルコール、約３５％イソプロピルアルコール、または約４０％イソプロピルアルコールを含む。
一部の実施形態では、適切な製剤または封入溶液は、ジメチルスルホキシドのような溶媒を含む。例えば、適切な製剤または封入溶液は、約１０％ジメチルスルホキシド、約１５％ジメチルスルホキシド、約２０％ジメチルスルホキシド、約２５％ジメチルスルホキシド、約３０％ジメチルスルホキシド、約３５％ジメチルスルホキシド、または約４０％ジメチルスルホキシドを含む。
一部の実施形態では、適切な製剤または封入溶液は緩衝剤または塩も含有することができる。例示的な緩衝剤には、ＨＥＰＥＳ、硫酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムが含まれる。例示的な塩には、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、および塩化カリウムが含まれる。
一部の実施形態では、エタノール、クエン酸緩衝液、および他の不安定化剤はｍＲＮＡの添加中に存在せず、したがって、製剤はいずれのさらなる下流処理も要しない。一部の実施形態では、製剤溶液はトレハロースを含む。不安定化剤の欠如およびトレハロース溶液の安定性は、製剤の規模拡大およびｍＲＮＡ封入脂質ナノ粒子の製造の容易さを増加させる。
一部の実施形態では、脂質溶液は、１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ脂質を含有する。一部の実施形態では、脂質は１つまたはそれ以上のコレステロール脂質も含有する。一部の実施形態では、脂質はエタノールストック溶液中に存在する。
一部の実施形態では、脂質溶液とｍＲＮＡ溶液はポンプシステムを使用して混合される。一部の実施形態では、ポンプシステムはパルスレスフローポンプを含む。一部の実施形態では、ポンプシステムはギアポンプである。一部の実施形態では、適切なポンプは臑動ポンプである。一部の実施形態では、適切なポンプは遠心ポンプである。一部の実施形態では、ポンプシステムを使用した方法は大規模で実施される。例えば、一部の実施形態では、本方法は、本明細書に記載されるポンプを使用して、ｍＲＮＡ少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、５０ｇ、もしくは１００ｇまたはそれ以上の溶液を脂質溶液と混合して、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを製造することを含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合する方法は、封入されたｍＲＮＡ少なくとも約１ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、５００ｍｇ、１ｇ、１０ｇ、５０ｇ、もしくは１００ｇまたはそれ以上を含有する本発明による組成物を提供する。
一部の実施形態では、脂質ナノ粒子が封入するｍＲＮＡを脂質溶液と合わせる工程はポンプシステムを使用して実施される。このような合わせる工程はポンプを使用して実施される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は、約５０ｍｌ／分、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分、約４００ｍｌ／分、約４５０ｍｌ／分、約５００ｍｌ／分、約５５０ｍｌ／分、約６００ｍｌ／分、約６５０ｍｌ／分、約７００ｍｌ／分、約７５０ｍｌ／分、約８００ｍｌ／分、約８５０ｍｌ／分、約９００ｍｌ／分、約９５０ｍｌ／分、または約１０００ｍｌ／分の流量で混合される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ溶液を脂質溶液と混合する工程はポンプの非存在下で実施される。
一部の実施形態では、本発明による方法は、脂質を含む溶液、ｍＲＮＡを含む溶液および脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む混合溶液の１つまたはそれ以上を周囲温度で維持する（すなわち、熱源からの熱を溶液に加えない）ことを含む。一部の実施形態では、本方法は、混合工程前に、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液の一方または両方を周囲温度で維持する工程を含む。一部の実施形態では、本方法は、混合工程中に、脂質を含む溶液とｍＲＮＡを含む溶液の１つまたはそれ以上を周囲温度で維持することを含む。一部の実施形態では、本方法は、混合工程後に、脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを周囲温度で維持する工程を含む。一部の実施形態では、溶液の１つまたはそれ以上を維持する周囲温度は、約３５℃、３０℃、２５℃、２０℃、もしくは１６℃またはそれ未満である。一部の実施形態では、溶液の１つまたはそれ以上を維持する周囲温度は、約１５～３５℃、約１５～３０℃、約１５～２５℃、約１５～２０℃、約２０～３５℃、約２５～３５℃、約３０～３５℃、約２０～３０℃、約２５～３０℃または約２０～２５℃の範囲である。一部の実施形態では、溶液の１つまたはそれ以上を維持する周囲温度は２０～２５℃である。
一部の実施形態では、本発明による方法は、ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を混合してｍＲＮＡを封入した脂質ナノ粒子を形成する工程を周囲温度で実施することを含む。
一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超は、約１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的に全ては、１５０ｎｍ未満（例えば、約１４５ｎｍ、約１４０ｎｍ、約１３５ｎｍ、約１３０ｎｍ、約１２５ｎｍ、約１２０ｎｍ、約１１５ｎｍ、約１１０ｎｍ、約１０５ｎｍ、約１００ｎｍ、約９５ｎｍ、約９０ｎｍ、約８５ｎｍ、約８０ｎｍ、約７５ｎｍ、約７０ｎｍ、約６５ｎｍ、約６０ｎｍ、約５５ｎｍ、または約５０ｎｍ未満）の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超は、５０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的に全ては、５０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超は、８０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。一部の実施形態では、精製されたナノ粒子の実質的に全ては８０～１５０ｎｍの範囲の径を有する。
一部の実施形態では、本発明による方法は、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の封入率をもたらす。一部の実施形態では、本発明による方法は、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超のｍＲＮＡの回収率をもたらす。
一部の実施形態では、本発明による方法は、混合後にｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程を含む。混合後にｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程は、２０１９年５月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／８４７，８３７号に記載されており、本発明を実施するために使用することができ、その全てを参照によって本明細書に組み入れる。
精製
一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは精製および／または濃縮される。様々な精製方法を使用することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）法によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは重力式ノーマルフローフィルトレーション（ＮＦＦ）によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは任意の他の適切な濾過方法によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは遠心分離によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ－ＬＮＰはクロマトグラフィー法によって精製される。
送達ビヒクル
本発明によると、本明細書に記載されるタンパク質またはペプチド（例えば、タンパク質またはペプチドの完全長、フラグメント、または一部）をコードするｍＲＮＡは、裸のＲＮＡ（非パッケージング）としてまたは送達ビヒクルを介して送達される。本明細書で使用される場合、「送達ビヒクル」、「導入ビヒクル」、「ナノ粒子」という用語または文法上同等物は互換的に使用される。
送達ビヒクルは、１つもしくはそれ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または適切な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化される。例えば、ｍＲＮＡを封入するリポソームは上記のように形成される。薬物を製剤化および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見られる。特定の送達ビヒクルは、標的細胞への核酸のトランスフェクションを容易にする能力に基づいて選択される。
一部の実施形態では、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡは単一送達ビヒクルを介して送達される。一部の実施形態では、少なくとも１つのタンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡは、それぞれ異なる組成の１つまたはそれ以上の送達ビヒクルを介して送達される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡは同じ脂質ナノ粒子内に封入される。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のｍＲＮＡは別々の脂質ナノ粒子内に封入される。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は空である。
様々な実施形態によると、適切な送達ビヒクルには、それだけに限らないが、ポリマー系担体、例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、脂質ナノ粒子およびリポソーム、ナノリポソーム、セラミド含有ナノリポソーム、プロテオリポソーム、天然由来と合成由来の両方のエキソソーム、天然、合成および半合成ラメラ体、ナノ粒子、カルシウムケイ酸蛍光体ナノ粒子、リン酸カルシウムナノ粒子、二酸化ケイ素ナノ粒子、ナノ結晶粒子、半導体ナノ粒子、ポリ（Ｄ－アルギニン）、ゾル－ゲル、ナノデンドリマー、デンプンベースの送達システム、ミセル、エマルジョン、ニオソーム、マルチドメインブロックポリマー（ビニルポリマー、ポリプロピルアクリル酸ポリマー、ダイナミックポリコンジュゲート）、乾燥粉末製剤、プラスミド、ウイルス、リン酸カルシウムヌクレオチド、アプタマー、ペプチドおよび他の方向性タグが含まれる。適切な導入ビヒクルとしてのバイオナノカプセルおよび他のウイルスカプシドタンパク質集合体の使用も企図される（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．２００８年９月；１９（９）：８８７－９５）。
リポソーム送達ビヒクル
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルはリポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子である。本明細書で使用される場合、リポソーム送達ビヒクル、例えば脂質ナノ粒子は、通常、１つまたはそれ以上の二重層の膜によって外側媒体から隔離された内部水空間を有する顕微鏡的小胞として特徴付けられる。リポソームの二重層膜は、典型的には空間的に分離された親水性ドメインおよび疎水性ドメインを含む合成または天然起源の脂質などの両親媒性分子によって形成される（Ｌａｓｉｃ、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：３０７～３２１、１９９８）。リポソームの二重層膜はまた、両親媒性ポリマーおよび界面活性剤によっても形成される（例えば、ポリマーソーム、ニオソーム等）。本発明の文脈において、リポソーム送達ビヒクルは、典型的には所望の核酸（例えば、ｍＲＮＡ）を標的細胞または組織に輸送するのに役立つ。一部の実施形態では、ナノ粒子送達ビヒクルはリポソームである。一部の実施形態では、リポソームは、１つもしくはそれ以上のカチオン性脂質、１つもしくはそれ以上の非カチオン性脂質、１つもしくはそれ以上のコレステロール系脂質、または１つもしくはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む。一部の実施形態では、リポソームは３つ以下の別個の脂質成分を含む。一部の実施形態では、１つの別個の脂質成分はステロール系カチオン性脂質である。
カチオン性脂質
本明細書で使用される場合、「カチオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の正の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。
本発明の組成物および方法に使用するのに適したカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１０／１４４７４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000001
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート、およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１３／１４９１４０号に記載されるイオン化可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000002
 の１つのカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｒ１およびＲ２は、水素、場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ１～Ｃ２０アルキルおよび場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ６～Ｃ２０アシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；Ｌ１およびＬ２は、水素、場合により置換されたＣ１～Ｃ３０アルキル、場合により置換された、可変的に不飽和のＣ１～Ｃ３０アルケニル、および場合により置換されたＣ１～Ｃ３０アルキニルからなる群からそれぞれ独立に選択され；ｍおよびｏは０および任意の正の整数からなる群からそれぞれ独立に選択され（例えば、ｍは３である）；ｎは０または任意の正の整数である（例えば、ｎは１である））を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000003
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－１５，１８－ジエン－１－アミン（「ＨＧＴ５０００」）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000004
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－４，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００１」）およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000005
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質および（１５Ｚ，１８Ｚ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－６－（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）テトラコサ－５，１５，１８－トリエン－１－アミン（「ＨＧＴ５００２」）およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１０／０５３５７２号にアミノアルコールリピドイドとして記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000006
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／１１８７２５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000007
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／１１８７２４号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000008
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、１４，２５－ジトリデシル１５，１８，２１，２４－テトラアザ－オクタトリアコンタンの式を有するカチオン性脂質、およびその薬学的に許容される塩が含まれる。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、その各々を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１３／０６３４６８号および国際公開第２０１６／２０５６９１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000009
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、ＲＬの各例は独立に、場合により置換されたＣ６～Ｃ４０アルケニルである）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000010
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000011
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000012
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000013
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１５／１８４２５６号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000014
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、各Ｘは独立に、ＯまたはＳであり；各Ｙは独立に、ＯまたはＳであり；各ｍは独立に、０～２０であり；各ｎは独立に、１～６であり；各ＲＡは独立に、水素、場合により置換されたＣ１～５０アルキル、場合により置換されたＣ２～５０アルケニル、場合により置換されたＣ２～５０アルキニル、場合により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、場合により置換された３～１４員ヘテロシクリル、場合により置換されたＣ６～１４アリール、場合により置換された５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンであり；各ＲＢは独立に、水素、場合により置換されたＣ１～５０アルキル、場合により置換されたＣ２～５０アルケニル、場合により置換されたＣ２～５０アルキニル、場合により置換されたＣ３～１０カルボシクリル、場合により置換された３～１４員ヘテロシクリル、場合により置換されたＣ６～１４アリール、場合により置換された５～１４員ヘテロアリールまたはハロゲンである）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000015
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「標的２３」およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１６／００４２０２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000016
 を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000017
 を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000018
 を有するカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、米国仮特許出願第６２／７５８，１７９号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000019
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、各Ｒ１およびＲ２は独立に、ＨまたはＣ１～Ｃ６脂肪族であり；各ｍは独立に、１～４の値を有する整数であり；各Ａは独立に、共有結合またはアリーレンであり；各Ｌ１は独立に、エステル、チオエステル、ジスルフィド、または無水物基であり；各Ｌ２は独立に、Ｃ２～Ｃ１０脂肪族であり；各Ｘ１は独立に、ＨまたはＯＨであり；各Ｒ３は独立に、Ｃ６～Ｃ２０脂肪族である）を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000020
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000021
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000022
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、Ｊ．ＭｃＣｌｅｌｌａｎ、Ｍ．Ｃ．Ｋｉｎｇ、Ｃｅｌｌ ２０１０、１４１、２１０～２１７およびＷｈｉｔｅｈｅａｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ（２０１４）５：４２７７に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、
Figure 2023545128000023
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１５／１９９９５２号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000024
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000025
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000026
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000027
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000028
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000029
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000030
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000031
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000032
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000033
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000034
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000035
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000036
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／００４１４３号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000037
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000038
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000039
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000040
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000041
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000042
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000043
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000044
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000045
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000046
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000047
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000048
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000049
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000050
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000051
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000052
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000053
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／０７５５３１号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000054
 のカチオン性脂質またはその薬学的に許容される塩（式中、Ｌ１またはＬ２の一方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、－ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－であり；Ｌ１またはＬ２の他方は－Ｏ（Ｃ＝Ｏ）－、－（Ｃ＝Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｏ－、－Ｓ（Ｏ）ｘ、－Ｓ－Ｓ－、－Ｃ（＝Ｏ）Ｓ－、ＳＣ（＝Ｏ）－、－ＮＲａＣ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｏ）ＮＲａ－、ＮＲａＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－、－ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲａ－または－ＮＲａＣ（＝Ｏ）Ｏ－または直接結合であり；Ｇ１およびＧ２はそれぞれ独立に、非置換Ｃ１～Ｃ１２アルキレンまたはＣ１～Ｃ１２アルケニレンであり；Ｇ３はＣ１～Ｃ２４アルキレン、Ｃ１～Ｃ２４アルケニレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキレン、Ｃ３～Ｃ８シクロアルケニレンであり；ＲａはＨまたはＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ６～Ｃ２４アルキルまたはＣ６～Ｃ２４アルケニルであり；Ｒ３はＨ、ＯＲ５、ＣＮ、－Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ４、－ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ４または－ＮＲ５Ｃ（＝Ｏ）Ｒ４であり；Ｒ４はＣ１～Ｃ１２アルキルであり；Ｒ５はＨまたはＣ１～Ｃ６アルキルであり；ｘは０、１または２である）を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／１１７５２８号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000055
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000056
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、化合物構造：
Figure 2023545128000057
 を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／０４９２４５号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法のカチオン性脂質は、以下の式：
Figure 2023545128000058
 の１つの化合物およびその薬学的に許容される塩を含む。これらの４つの式のいずれか１つについて、Ｒ４は－（ＣＨ２）ｎＱおよび－（ＣＨ２）ｎＣＨＱＲから独立に選択され；Ｑは－ＯＲ、－ＯＨ、－Ｏ（ＣＨ２）ｎＮ（Ｒ）２、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ、－ＣＸ３、－ＣＮ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｈ）Ｓ（Ｏ）２Ｒ、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、－Ｎ（Ｒ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ）２、－Ｎ（Ｈ）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｈ）（Ｒ）、および複素環からなる群から選択され；ｎは１、２、または３である。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000059
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000060
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000061
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000062
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、その各々を参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１７／１７３０５４号および国際公開第２０１５／０９５３４０号に記載されるカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000063
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000064
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000065
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000066
 の化合物構造を有するカチオン性脂質およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１２／１７０８８９号に記載される切断可能なカチオン性脂質が含まれる。一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、以下の式：
Figure 2023545128000067
 のカチオン性脂質
（式中、Ｒ１はイミダゾール、グアニジニウム、アミノ、イミン、エナミン、場合により置換されたアルキルアミノ（例えば、ジメチルアミノなどのアルキルアミノ）およびピリジルからなる群から選択され；Ｒ２は以下の２つの式：
Figure 2023545128000068
 の１つからなる群から選択され、Ｒ３およびＲ４は、場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ６～Ｃ２０アルキルおよび場合により置換された、可変的に飽和または不飽和のＣ６～Ｃ２０アシルからなる群からそれぞれ独立に選択され；ｎは０または任意の正の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上）である）を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000069
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００１」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000070
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００２」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000071
 (HGT4003)
の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００３」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000072
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質、「ＨＧＴ４００４」およびその薬学的に許容される塩を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000073
 の化合物構造を有する、カチオン性脂質「ＨＧＴ４００５」およびその薬学的に許容される塩を含む。
本発明の組成物および方法に使用するのに適した他のカチオン性脂質には、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２５２２号に記載され、参照によって本明細書に組み入れる、切断可能なカチオン性脂質が含まれる。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２５２２号に記載される一般式のいずれかまたは構造（１ａ）～（２１ａ）および（１ｂ）～（２１ｂ）および（２２）～（２３７）のいずれかであるカチオン性脂質を含む。ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、式（Ｉ’）による構造を有するカチオン性脂質
Figure 2023545128000074
 （式中、
ＲＸは独立に、－Ｈ、－Ｌ１－Ｒ１、または－Ｌ５Ａ－Ｌ５Ｂ－Ｂ’であり；
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３の各々は独立に、共有結合、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｃ（Ｏ）Ｓ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４ＡおよびＬ５Ａは独立に、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、または－Ｃ（Ｏ）ＮＲＬ－であり；
各Ｌ４ＢおよびＬ５Ｂは独立に、Ｃ１～Ｃ２０アルキレン；Ｃ２～Ｃ２０アルケニレン；またはＣ２～Ｃ２０アルキニレンであり；
各ＢおよびＢ’はＮＲ４Ｒ５または５～１０員窒素含有ヘテロアリールであり；
各Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は独立に、Ｃ６～Ｃ３０アルキル、Ｃ６～Ｃ３０アルケニル、またはＣ６～Ｃ３０アルキニルであり；
各Ｒ４およびＲ５は独立に、水素、Ｃ１～Ｃ１０アルキル；Ｃ２～Ｃ１０アルケニル；またはＣ２～Ｃ１０アルキニルであり；
各ＲＬは独立に、水素、Ｃ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ２～Ｃ２０アルケニル、またはＣ２～Ｃ２０アルキニルである）
を含む。
ある特定の実施形態では、本発明の組成物および方法は、
Figure 2023545128000075
 の化合物構造を有する、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３２５２２の化合物（１３９）であるカチオン性脂質を含む。
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法は、カチオン性脂質、Ｎ－［１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＴＭＡ」）を含む（参照によって本明細書に組み入れる、Ｆｅｉｇｎｅｒら、（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４、７４１３（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号）。本発明の組成物および方法に適した他のカチオン性脂質には、例えば、５－カルボキシスペルミルグリシンジオクタデシルアミド（「ＤＯＧＳ」）；２，３－ジオレイルオキシ－Ｎ－［２－（スペルミン－カルボキサミド）エチル］－Ｎ，Ｎ－ジメチル－－プロパンアミニウム（「ＤＯＳＰＡ」）（Ｂｅｈｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６、６９８２（１９８９）、米国特許第５，１７１，６７８号；米国特許第５，３３４，７６１号）；１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＤＡＰ」）；１，２－ジオレオイル－３－トリメチルアンモニウム－プロパン（「ＤＯＴＡＰ」）が含まれる。
本発明の組成物および方法に適した追加の例示的なカチオン性脂質には、１，２－ジステアリルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＳＤＭＡ」）；１，２－ジオレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＯＤＭＡ」）；１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｉｎＤＭＡ」）；１，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－アミノプロパン（「ＤＬｅｎＤＭＡ」）；Ｎ－ジオレイル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（「ＤＯＤＡＣ」）；Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ，Ｎ－ジメチルアンモニウムブロミド（「ＤＤＡＢ」）；Ｎ－（１，２－ジミリスチルオキシプロパ－３－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（「ＤＭＲＩＥ」）；３－ジメチルアミノ－２－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシブタン－４－オキシ）－１－（シス，シス－９，１２－オクタデカジエノキシ）プロパン（「ＣＬｉｎＤＭＡ」）；２－［５’－（コレスタ－５－エン－３－ベータ－オキシ）－３’－オキサペントキシ）－３－ジメチル－１－（シス，シス－９’，１－２’－オクタデカジエノキシ）プロパン（「ＣｐＬｉｎＤＭＡ」）；Ｎ，Ｎ－ジメチル－３，４－ジオレイルオキシベンジルアミン（「ＤＭＯＢＡ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジオレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＯｃａｒｂＤＡＰ」）；２，３－ジリノレオイルオキシ－Ν，Ν－ジメチルプロピルアミン（「ＤＬｉｎＤＡＰ」）；１，２－Ｎ，Ｎ’－ジリノレイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎｃａｒｂＤＡＰ」）；１，２－ジリノレオイルカルバミル－３－ジメチルアミノプロパン（「ＤＬｉｎＣＤＡＰ」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ」）；２－（（８－［（３Ｐ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ」）；（２Ｒ）－２－（（８－［（３ベータ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｒ）」）；（２Ｓ）－２－（（８－［（３Ｐ）－コレスタ－５－エン－３－イルオキシ］オクチル）オキシ）－Ｎ，ｆｓｌ－ｄｉｍｅｔｈｙｈ３－［（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イルオキシ］プロパン－１－アミン（「オクチル－ＣＬｉｎＤＭＡ（２Ｓ）」）；２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＤＬｉｎ－Ｋ－ＸＴＣ２－ＤＭＡ」）；および２－（２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエン－１－イル）－１，３－ジオキソラン－４－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルエタンアミン（「ＤＬｉｎ－ＫＣ２－ＤＭＡ」）（参照によって本明細書に組み入れる、国際公開第２０１０／０４２８７７号；Ｓｅｍｐｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２８：１７２～１７６（２０１０）参照）が含まれる（Ｈｅｙｅｓ，Ｊ．ら、Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １０７：２７６～２８７（２００５）；Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ＤＶ．ら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３（８）：１００３～１００７（２００５）；国際公開第２００５／１２１３４８号）。一部の実施形態では、カチオン性脂質の１つまたはそれ以上は、イミダゾール、ジアルキルアミノ、またはグアニジニウム部分の少なくとも１つを含む。
一部の実施形態では、本発明の組成物および方法に適した１つまたはそれ以上のカチオン性脂質には、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン（「ＸＴＣ」）；（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール－５－アミン（「ＡＬＮＹ－１００」）および／または４，７，１３－トリス（３－オキソ－３－（ウンデシルアミノ）プロピル）－Ｎ１，Ｎ１６－ジウンデシル－４，７，１０，１３－テトラアザヘキサデカン－１，１６－ジアミド（「ＮＣ９８－５」）が含まれる。
一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、重量によって測定される、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、ｍｏｌ％として測定される、少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、または７０％を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の、重量によって測定される、約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。一部の実施形態では、本発明の組成物は、組成物、例えば脂質ナノ粒子中の総脂質含有量の約３０～７０％（例えば、約３０～６５％、約３０～６０％、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する１つまたはそれ以上のカチオン性脂質を含む。
非カチオン性／ヘルパー脂質
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上の非カチオン性（「ヘルパー」）脂質を含有する。本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という句は、任意の中性、双性イオン性またはアニオン性脂質を指す。本明細書で使用される場合、「アニオン性脂質」という句は、生理学的ｐＨなどの選択されたｐＨで正味の負の電荷を有するいくつかの脂質種のいずれかを指す。非カチオン性脂質には、それだけに限らないが、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ホスファチジルセリン、スフィンゴ脂質、セレブロシド、ガングリオシド、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、ｌ－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、またはこれらの混合物が含まれる。
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は中性脂質、すなわち、組成物が製剤化および／または投与される条件で正味の電荷を有さない脂質である。
一部の実施形態では、このような非カチオン性脂質は単独で使用されるが、好ましくは他の脂質、例えばカチオン性脂質と組み合わせて使用される。
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％のモル比（ｍｏｌ％）で存在することができる。一部の実施形態では、全非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％のモル比（ｍｏｌ％）で存在することができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％超、約１０ｍｏｌ％超、約２０ｍｏｌ％超、約３０ｍｏｌ％超、または約４０ｍｏｌ％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％超、約１０ｍｏｌ％超、約２０ｍｏｌ％超、約３０ｍｏｌ％超、または約４０ｍｏｌ％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％以下、約１０ｍｏｌ％以下、約２０ｍｏｌ％以下、約３０ｍｏｌ％以下、または約４０ｍｏｌ％以下である。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％以下、約１０ｍｏｌ％以下、約２０ｍｏｌ％以下、約３０ｍｏｌ％以下、または約４０ｍｏｌ％以下であることができる。
一部の実施形態では、非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％の重量比（重量％）で存在することができる。一部の実施形態では、全非カチオン性脂質は、組成物中に存在する全脂質の約５％～約９０％、約５％～約７０％、約５％～約５０％、約５％～約４０％、約５％～約３０％、約１０％～約７０％、約１０％～約５０％、または約１０％～約４０％の重量比（重量％）で存在することができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であることができる。一部の実施形態では、リポソーム中の非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下である。一部の実施形態では、リポソーム中の全非カチオン性脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下であることができる。
コレステロール系脂質
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質を含む。例えば、適切なコレステロール系カチオン性脂質には、例えば、ＤＣ－Ｃｈｏｉ（Ｎ，Ｎ－ジメチル－Ｎ－エチルカルボキサミドコレステロール）、１，４－ビス（３－Ｎ－オレイルアミノ－プロピル）ピペラジン（Ｇａｏら Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９、２８０（１９９１）；Ｗｏｌｆら ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３、１３９（１９９７）；米国特許第５，７４４，３３５号）、または以下の構造
Figure 2023545128000076
 を有するイミダゾールコレステロールエステル（ＩＣＥ）が含まれる。
一部の実施形態では、コレステロール系脂質はコレステロールである。
一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約１％～約３０％、または約５％～約２０％のモル比（ｍｏｌ％）を構成することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％超、約１０ｍｏｌ％超、約２０ｍｏｌ％超、約３０ｍｏｌ％超、または約４０ｍｏｌ％超であることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５ｍｏｌ％以下、約１０ｍｏｌ％以下、約２０ｍｏｌ％以下、約３０ｍｏｌ％以下、または約４０ｍｏｌ％以下であることができる。
一部の実施形態では、コレステロール系脂質は、リポソーム中に存在する全脂質の約１％～約３０％、または約５％～約２０％の重量比（重量％）で存在することができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５重量％超、約１０重量％超、約２０重量％超、約３０重量％超、または約４０重量％超であることができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子中のコレステロール系脂質のパーセンテージは、約５重量％以下、約１０重量％以下、約２０重量％以下、約３０重量％以下、または約４０重量％以下であることができる。
ＰＥＧ修飾脂質
一部の実施形態では、リポソームは１つまたはそれ以上のＰＥＧ化脂質を含む。
例えば、Ｎ－オクタノイル－スフィンゴシン－１－［スクシニル（メトキシポリエチレングリコール）－２０００］（Ｃ８ ＰＥＧ－２０００セラミド）を含む、誘導体化セラミド（ＰＥＧ－ＣＥＲ）などの、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）修飾リン脂質および誘導体化脂質の使用も、単独でまたは好ましくは導入ビヒクルを含む他の脂質製剤と組み合わせて（例えば、脂質ナノ粒子）、本発明によって企図される。
企図されるＰＥＧ修飾脂質には、それだけに限らないが、Ｃ６～Ｃ２０長のアルキル鎖を有する脂質に共有結合した最大５ｋＤａ長のポリエチレングリコール鎖が含まれる。一部の実施形態では、ＰＥＧ修飾またはＰＥＧ化脂質はＰＥＧ化コレステロールまたはＰＥＧ－２Ｋである。このような成分の添加は複雑な凝集を防ぎ、循環寿命を増加させ、脂質－核酸組成物の標的組織への送達を増加させる手段を提供することもできる（Ｋｌｉｂａｎｏｖら（１９９０）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ、２６８（１）：２３５～２３７）、またはこれらはインビボで製剤から迅速に交換するよう選択される（米国特許第５，８８５，６１３号参照）。特に有用な交換可能な脂質は、より短いアシル鎖（例えば、Ｃ１４またはＣ１８）を有するＰＥＧ－セラミドである。
本発明のＰＥＧ修飾リン脂質および誘導体化脂質は、リポソーム導入ビヒクル中に存在する全脂質の約０％～約２０％、約０．５％～約２０％、約１％～約１５％、約４％～約１０％、または約２％のモル比を構成することができる。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で全脂質の約４％を構成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で全脂質の約５％を構成する。一部の実施形態では、１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質は、モル比で全脂質の約６％を構成する。
両親媒性ブロックコポリマー
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含有する。
様々な両親媒性ブロックコポリマーを使用して本発明を実施することができる。一部の実施形態では、両親媒性ブロックコポリマーは界面活性剤または非イオン性界面活性剤とも呼ばれる。
一部の実施形態では、本発明に適した両親媒性ポリマーは、ポロキサマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポロキサミン（Ｔｅｔｒｏｎｉｃ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（ポリソルベート）およびポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）から選択される。
ポロキサマー
一部の実施形態では、適切な両親媒性ポリマーはポロキサマーである。例えば、適切なポロキサマーは以下の構造：
Figure 2023545128000077
 （式中、ａは１０～１５０の間の整数であり、ｂは２０～６０の間の整数である）
のものである。例えば、ａは約１２であり、ｂは約２０である、またはａは約８０であり、ｂは約２７である、またはａは約６４であり、ｂは約３７である、またはａは約１４１であり、ｂは約４４である、またはａは約１０１であり、ｂは約５６である。
一部の実施形態では、本発明に適したポロキサマーは、約１０～約１５０のエチレンオキシド単位を有する。一部の実施形態では、ポロキサマーは、約１０～約１００のエチレンオキシド単位を有する。
一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー８４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１０１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１０５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１０８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１２２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１２３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１２４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー１８８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２１２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２１５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２１７である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３７である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２３８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２８２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２８４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー２８８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３０４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３４である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３５である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー３３８である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０１である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０２である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０３である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはポロキサマー４０７である。一部の実施形態では、適切なポロキサマーはその組合せである。
一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約４，０００ｇ／ｍｏｌ～約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約１，０００ｇ／ｍｏｌ～約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約１，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約２，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約３，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約４，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約６，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約７，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約８，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約９，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約１０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約２０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約２５，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約３０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約４０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。一部の実施形態では、適切なポロキサマーは約５０，０００ｇ／ｍｏｌの平均分子量を有する。
他の両親媒性ポリマー
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポロキサミン、例えばｔｅｔｒｏｎｉｃ ３０４またはｔｅｔｒｏｎｉｃ ９０４である。
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーは、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、例えば３ｋＤａ、１０ｋＤａ、または２９ｋＤａの分子量を有するＰＶＰである。
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポリソルベート、ソルビタン、およびこれらの誘導体である。一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリソルベート、例えばＰＳ２０である。
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールエーテル（Ｂｒｉｊ）、ポロキサマー、ポリソルベート、ソルビタン、またはこれらの誘導体である。
一部の実施形態では、両親媒性ポリマーはポリエチレングリコールエーテルである。一部の実施形態では、適切なポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉ）の化合物：
Figure 2023545128000078
 またはその塩もしくは異性体
（式中、
ｔは１～１００の間の整数であり：
Ｒ１ＢＲＩＪは独立に、Ｃ１０～４０アルキル、Ｃ１０～４０アルケニル、またはＣ１０～４０アルキニルであり；場合によりＲ５ＰＥＧの１つまたはそれ以上のメチレン基は、Ｃ３～１０カルボシクリレン、４～１０員ヘテロシクリレン、Ｃ６～１０アリーレン、４～１０員ヘテロアリーレン、－Ｎ（ＲＮ）－、－Ｏ－、－Ｓ－、－Ｃ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）－、－ＮＲＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ）－、－Ｃ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＣ（Ｏ）－、－ＯＣ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＣ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｏ）Ｏ－ －Ｃ（Ｏ）Ｓ－ －ＳＣ（Ｏ）－、－Ｃ（＝ＮＲＮ）－、－Ｃ（＝ＮＲ）Ｎ（Ｒ）－、－ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）－ －ＮＲＮＣ（＝ＮＲＮ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｃ（Ｓ）－、－Ｃ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）－、－ＮＲＮＣ（Ｓ）Ｎ（ＲＮ）－、－Ｓ（Ｏ）－、－ＯＳ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）２－ －Ｓ（Ｏ）２Ｏ－ －ＯＳ（Ｏ）２Ｏ－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －ＯＳ（Ｏ）Ｎ（ＲＮ）－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）Ｏ－ －Ｓ（Ｏ）２－ －Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２－ －Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－、－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－ －ＯＳ（Ｏ）２Ｎ（ＲＮ）－または－Ｎ（ＲＮ）Ｓ（Ｏ）２Ｏ－で独立に置き換えられており；
ＲＮの各例は独立に、水素、Ｃ１～６アルキル、または窒素保護基である）
である。
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪはアルキルである。例えば、ポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉａ）の化合物：
Figure 2023545128000079
 またはその塩もしくは異性体（式中、ｓは１～１００の間の整数である）である。
一部の実施形態では、Ｒ１ＢＲＩＪはアルケニルである。例えば、適切なポリエチレングリコールエーテルは、式（Ｓ－Ｉｂ）の化合物：
Figure 2023545128000080
 またはその塩もしくは異性体（式中、ｓは１～１００の間の整数である）である。
典型的には、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、その臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）未満の量で製剤中に存在する。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣより約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％低い量で混合物中に存在する。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣより約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％低い量で混合物中に存在する。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）は、そのＣＭＣより約５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、または９５％低い量で混合物中に存在する。
一部の実施形態では、製剤中に存在する両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の元の量の約０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％未満は除去時に残る。一部の実施形態では、両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）の残留量は除去時に製剤中に残る。本明細書で使用される場合、残留量は、組成物中の物質（本明細書に記載される両親媒性ポリマー、例えばポロキサマー）の実質的に全部を除去した後に残っている量を意味する。残留量は、公知の技術を使用して定性的または定量的に検出可能である。残留量は、公知の技術を使用して検出可能でない場合もある。
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは３％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは２．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは２％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは１．５％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは０．５％未満（例えば、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％未満）の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、または０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは０．０１％未満の両親媒性ブロックコポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは残留量の両親媒性ポリマー（例えば、ポロキサマー）を含む。本明細書で使用される場合、残留量は、組成物中の物質（本明細書に記載される両親媒性ポリマー、例えばポロキサマー）の実質的に全部を除去した後に残っている量を意味する。残留量は、公知の技術を使用して定性的または定量的に検出可能である。残留量は、公知の技術を使用して検出可能でない場合もある。
ポリマー
一部の実施形態では、適切な送達ビヒクルは、担体としてのポリマーを単独で、または本明細書に記載される様々な脂質を含む他の担体と組み合わせて使用して製剤化される。よって、一部の実施形態では、リポソーム送達ビヒクルは、本明細書で使用される場合、ポリマーを含むナノ粒子も包含する。適切なポリマーには、例えば、ポリアクリレート、ポリアルキルシアノアクリレート、ポリラクチド、ポリラクチド－ポリグリコリドコポリマー、ポリカプロラクトン、デキストラン、アルブミン、ゼラチン、アルギネート、コラーゲン、キトサン、シクロデキストリン、プロタミン、ＰＥＧ化プロタミン、ＰＬＬ、ＰＥＧ化ＰＬＬおよびポリエチレンイミン（ＰＥＩ）が含まれる。ＰＥＩが存在する場合、これは１０～４０ｋＤａの範囲の分子量の分枝ＰＥＩ、例えば２５ｋＤａ分枝ＰＥＩ（Ｓｉｇｍａ 番号４０８７２７）であることができる。
様々な実施形態によると、脂質ナノ粒子を構成するカチオン性脂質、非カチオン性脂質、ＰＥＧ修飾脂質、コレステロール系脂質、および／または両親媒性ブロックコポリマーの選択、ならびにこのような成分（脂質）の互いに対する相対モル比は、選択される脂質の特徴、意図した標的細胞の性質、送達される核酸の特徴に基づく。追加の考慮事項には、例えば、アルキル鎖の飽和、ならびに選択される脂質のサイズ、電荷、ｐＨ、ｐＫａ、膜融合性および忍容性が含まれる。よって、それに応じてモル比を調整することができる。
別個の脂質成分の比
本発明の適切なリポソームは、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、コレステロール脂質、ＰＥＧ修飾脂質、両親媒性ブロックコポリマーおよび／または本明細書に記載されるポリマーのいずれかの１つまたはそれ以上を様々な比で含むことができる。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は５つおよび５つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は４つまたは４つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子は３つまたは３つ以下のナノ粒子の別個の成分を含む。非限定的な例として、適切なリポソーム製剤は、ｃＫＫ－Ｅ１２（ＭＬ２としても知られる）、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；Ｃ１２－２００、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＨＧＴ４００３、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；ＩＣＥ、ＤＯＰＥ、コレステロールおよびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋ；またはＩＣＥ、ＤＯＰＥ、およびＤＭＧ－ＰＥＧ２Ｋから選択される組合せを含むことができる。
様々な実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）は、モル比でリポソームの約３０～６０％（例えば、約３０～５５％、約３０～５０％、約３０～４５％、約３０～４０％、約３５～５０％、約３５～４５％、または約３５～４０％）を構成する。一部の実施形態では、カチオン性脂質（例えば、ｃＫＫ－Ｅ１２、Ｃ１２－２００、ＩＣＥ、および／またはＨＧＴ４００３）のパーセンテージは、モル比でリポソームの約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、もしくは約６０％であるかまたはこれらを超える。
一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれ約３０～６０：２５～３５：２０～３０：１～１５の間である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３０：２０：１０である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３０：２５：５である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はそれぞれおよそ４０：３２：２５：３である。一部の実施形態では、カチオン性脂質と非カチオン性脂質とコレステロール系脂質とＰＥＧ修飾脂質の比はおよそ５０：２５：２０：５である。
脂質ナノ粒子が３つまたは３つ以下の別個の脂質の成分を含む実施形態では、全脂質含有量の比（すなわち、脂質成分（１）：脂質成分（２）：脂質成分（３）の比）をｘ：ｙ：ｚとして表すことができ、ここでは、
（ｙ＋ｚ）＝１００－ｘ
である。
一部の実施形態では、「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」の各々は脂質の３つの別個の成分のモルパーセンテージを表し、比はモル比である。
一部の実施形態では、「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」の各々は脂質の３つの別個の成分の重量パーセンテージを表し、比は重量比である。
一部の実施形態では、変数「ｘ」によって表される、脂質成分（１）はステロール系カチオン性脂質である。
一部の実施形態では、変数「ｙ」によって表される、脂質成分（２）はヘルパー脂質である。
一部の実施形態では、変数「ｚ」によって表される、脂質成分（３）はＰＥＧ脂質である。
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％以下である。実施形態では、変数「ｘ」は約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％以下である。
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約５０％であるが約９５％未満；少なくとも約５０％であるが約９０％未満；少なくとも約５０％であるが約８５％未満；少なくとも約５０％であるが約８０％未満；少なくとも約５０％であるが約７５％未満；少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。実施形態では、変数「ｘ」は少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は、少なくとも約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％である。
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、または約１０％以下である。実施形態では、変数「ｘ」は約６５％、約６０％、約５５％、約５０％、約４０％以下である。
一部の実施形態では、脂質成分（１）（例えば、ステロール系カチオン性脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｘ」は：少なくとも約５０％であるが約９５％未満；少なくとも約５０％であるが約９０％未満；少なくとも約５０％であるが約８５％未満；少なくとも約５０％であるが約８０％未満；少なくとも約５０％であるが約７５％未満；少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。実施形態では、変数「ｘ」は少なくとも約５０％であるが約７０％未満；少なくとも約５０％であるが約６５％未満；または少なくとも約５０％であるが約６０％未満である。
一部の実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）のモルパーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約１％～約７．５％、約２．５％～約１０％、約２．５％～約７．５％、約２．５％～約５％、約５％～約７．５％、または約５％～約１０％である。
一部の実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、または２５％以下である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％である。実施形態では、脂質成分（３）（例えば、ＰＥＧ脂質）の重量パーセンテージを表す変数「ｚ」は、約１％～約１０％、約２％～約１０％、約３％～約１０％、約４％～約１０％、約１％～約７．５％、約２．５％～約１０％、約２．５％～約７．５％、約２．５％～約５％、約５％～約７．５％、または約５％～約１０％である。
３つおよび３つのみの別個の脂質の成分を有する組成物について、変数「ｘ」、「ｙ」、および「ｚ」は、３つの変数の和が合計して総脂質含有量の１００％になる限り、任意の組合せであることができる。
ｍＲＮＡ合成
本発明によるｍＲＮＡは、様々な公知の方法のいずれかに従って合成することができる。様々な方法は米国特許出願公開第２０１８／０２５８４２３号に記載されており、これらの方法を使用して本発明を実施することができ、その全てを参照によって本明細書に組み入れる。例えば、本発明によるｍＲＮＡはインビトロ転写（ＩＶＴ）を介して合成することができる。手短に言えば、ＩＶＴは、典型的にはプロモーターを含有する直鎖または環状ＤＮＡ鋳型、リボヌクレオチド三リン酸のプール、ＤＴＴおよびマグネシウムイオンを含むことができる緩衝系、ならびに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｔ３、Ｔ７、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼ）、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を用いて実施される。正確な条件は具体的な用途によって変化する。
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、タンパク質またはペプチドをコードするｍＲＮＡ配列である。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、ヒト細胞での効率的な発現のためにコドン最適化される。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は天然に存在する配列または野生型配列である。一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡ配列は、アミノ酸配列に１つまたはそれ以上の突然変異を含有するタンパク質またはペプチドをコードする。
本発明を使用して様々な長さのｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、約０．５ｋｂ、１ｋｂ、１．５ｋｂ、２ｋｂ、２．５ｋｂ、３ｋｂ、３．５ｋｂ、４ｋｂ、４．５ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂ、１１ｋｂ、１２ｋｂ、１３ｋｂ、１４ｋｂ、１５ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂ、４０ｋｂ、もしくは５０ｋｂ長のまたはこれを超えるインビトロ合成ｍＲＮＡを送達することができる。一部の実施形態では、本発明を使用して、約１～２０ｋｂ、約１～１５ｋｂ、約１～１０ｋｂ、約５～２０ｋｂ、約５～１５ｋｂ、約５～１２ｋｂ、約５～１０ｋｂ、約８～２０ｋｂ、または約８～５０ｋｂ長の範囲のインビトロ合成ｍＲＮＡを送達することができる。
一部の実施形態では、本発明によるｍＲＮＡを製造するために、ＤＮＡ鋳型をインビトロで転写する。適切なＤＮＡ鋳型は、典型的にはインビトロ転写のためのプロモーター、例えば、Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６プロモーター、引き続いて所望のＲＮＡのための所望のヌクレオチド配列および終結シグナルを有する。
ヌクレオチド
様々な天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドを使用して本発明によるｍＲＮＡを作製することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、天然に存在するヌクレオシド（または未修飾ヌクレオチド；例えば、アデノシン、グアノシン、シチジン、ウリジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザグアノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、シュードウリジン（例えば、Ｎ－１－メチルシュードウリジン）、２－チオウリジン、および２－チオシチジン）；化学修飾塩基；生物修飾塩基（例えば、メチル化塩基）；挿入塩基；修飾糖（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾リン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合）であるか、またはこれらを含む。
一部の実施形態では、適切なｍＲＮＡは、骨格修飾、糖修飾および／または塩基修飾を含有することができる。例えば、修飾ヌクレオチドには、それだけに限らないが、修飾プリン（アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ））、またはピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、ウラシル（Ｕ））、およびプリンおよびピリミジンの修飾ヌクレオチド類似体または誘導体、例えば１－メチル－アデニン、２－メチル－アデニン、２－メチルチオ－Ｎ－６－イソペンテニル－アデニン、Ｎ６－メチル－アデニン、Ｎ６－イソペンテニル－アデニン、２－チオ－シトシン、３－メチル－シトシン、４－アセチル－シトシン、５－メチル－シトシン、２，６－ジアミノプリン、１－メチル－グアニン、２－メチル－グアニン、２，２－ジメチル－グアニン、７－メチル－グアニン、イノシン、１－メチル－イノシン、シュードウラシル（５－ウラシル）、ジヒドロ－ウラシル、２－チオ－ウラシル、４－チオ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５－（カルボキシヒドロキシメチル）－ウラシル、５－フルオロ－ウラシル、５－ブロモ－ウラシル、５－カルボキシメチルアミノメチル－ウラシル、５－メチル－２－チオ－ウラシル、５－メチル－ウラシル、Ｎ－ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、５－メチルアミノメチル－ウラシル、５－メトキシアミノメチル－２－チオ－ウラシル、５’－メトキシカルボニルメチル－ウラシル、５－メトキシ－ウラシル、ウラシル－５－オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル－５－オキシ酢酸（ｖ）、１－メチル－シュードウラシル、キューオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、ベータ－Ｄ－マンノシル－キューオシン、ワイブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、およびホスホロアミダイト、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、メチルホスホネート、７－デアザグアノシン、５－メチルシトシンおよびイノシンが含まれる。このような類似体の製造は、例えばその開示全体を参照によって組み入れる、米国特許第４，３７３，０７１号、米国特許第４，４０１，７９６号、米国特許第４，４１５，７３２号、米国特許第４，４５８，０６６号、米国特許第４，５００，７０７号、米国特許第４，６６８，７７７号、米国特許第４，９７３，６７９号、米国特許第５，０４７，５２４号、米国特許第５，１３２，４１８号、米国特許第５，１５３，３１９号、米国特許第５，２６２，５３０号および米国特許第５，７００，６４２号から当業者に公知である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含む。非標準ヌクレオチド残基には、例えば５－メチル－シチジン（「５ｍＣ」）、シュードウリジン（「ΨＵ」）、および／または２－チオ－ウリジン（「２ｓＵ」）が含まれる。このような残基およびこれらのｍＲＮＡへの組み込みの議論については、例えば米国特許第８，２７８，０３６号または国際公開第２０１１／０１２３１６号を参照されたい。ｍＲＮＡは、Ｕ残基の２５％が２－チオ－ウリジンであり、Ｃ残基の２５％が５－メチルシチジンであるＲＮＡとして定義されるＲＮＡであることができる。ＲＮＡの使用についての教示は、共に全体を参照によって本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号および国際公開第２０１１／０１２３１６号に開示される。非標準ヌクレオチド残基の存在は、ｍＲＮＡを、同じ配列を有するが、標準残基のみを含有する対照ｍＲＮＡよりも安定におよび／またはあまり免疫原性ではなくすることができる。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、イソシトシン、シュードイソシトシン、５－ブロモウラシル、５－プロピニルウラシル、６－アミノプリン、２－アミノプリン、イノシン、ジアミノプリンおよび２－クロロ－６－アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基修飾の組合せから選択される１つまたはそれ以上の非標準ヌクレオチド残基を含むことができる。一部の実施形態は、フラノース環または核酸塩基に対する追加の修飾をさらに含むことができる。追加の修飾には、例えば、糖修飾または置換（例えば、２’－Ｏ－アルキル修飾、ロック核酸（ＬＮＡ）の１つまたはそれ以上）が含まれる。一部の実施形態では、ＲＮＡは追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体化またはハイブリダイズされる。糖修飾が２’－Ｏ－アルキル修飾である一部の実施形態では、このような修飾には、それだけに限らないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾、２’－Ｏ－メチル修飾、２’－Ｏ－メトキシエチル修飾および２’－デオキシ修飾が含まれる。一部の実施形態では、これらの修飾のいずれもヌクレオチドの０～１００％－例えば、個別にまたは組み合わせて構成ヌクレオチドの０％、１％、１０％、２５％、５０％、７５％、８５％、９０％、９５％超または１００％で存在することができる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＲＮＡ骨格修飾を含有することができる。典型的には、骨格修飾は、ＲＮＡに含有されるヌクレオチドの骨格のリン酸エステルが化学修飾される修飾である。例示的な骨格修飾には、典型的には、それだけに限らないが、メチルホスホネート、メチルホスホロアミダイト、ホスホロアミダイト、ホスホロチオエート（例えば、シチジン５’－Ｏ－（１－チオホスフェート））、ボラノホスフェート、正に帯電したグアニジニウム基等からなる群の修飾が含まれる（他のアニオン性、カチオン性または中性基によってホスホジエステル結合に取って代わることによることを意味する）。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは糖修飾を含有することができる。典型的な糖修飾は、それだけに限らないが、２’－デオキシ－２’－フルオロ－オリゴリボヌクレオチド（２’－フルオロ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－フルオロ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－デオキシ－２’－デアミン－オリゴリボヌクレオチド（２’－アミノ－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アミノ－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｏ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド（２’－Ｏ－メチルシチジン５’－三リン酸、２’－メチルウリジン５’－三リン酸）、２’－Ｃ－アルキルオリゴリボヌクレオチド、およびこれらの異性体（２’－アラシチジン５’－三リン酸、２’－アラウリジン５’－三リン酸）、またはアジド三リン酸（２’－アジド－２’－デオキシシチジン５’－三リン酸、２’－アジド－２’－デオキシウリジン５’－三リン酸）からなる群から選択される糖修飾を含む、ｍＲＮＡが含有するヌクレオチドの糖の化学修飾である。
合成後プロセシング
典型的には、５’キャップおよび／または３’テールを合成後に付加することができる。キャップの存在は、ほとんどの真核細胞に見られるヌクレアーゼに対する耐性を提供するのに重要である。「テール」の存在は、ｍＲＮＡをエキソヌクレアーゼ分解から保護するのに役立つ。
５’キャップは、典型的には以下のように付加される：最初に、ＲＮＡ末端ホスファターゼが５’ヌクレオチドから末端リン酸基の１つを除去して、２つの末端リン酸エステルを残し；次いで、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を、グアニリルトランスフェラーゼを介して末端リン酸エステルに付加して、５’５’５三リン酸結合を生成し；次いで、グアニンの７－窒素をメチルトランスフェラーゼによってメチル化する。キャップ構造の例としては、それだけに限らないが、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）ＡおよびＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇが挙げられる。追加のキャップ構造は、参照によって本明細書に組み入れる、米国特許出願公開第２０１６／００３２３５６号および米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号に記載されている。
典型的には、テール構造はポリ（Ａ）および／またはポリ（Ｃ）テールを含む。ｍＲＮＡの３’末端上のポリＡまたはポリＣテールは、典型的にはそれぞれ少なくとも５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも２５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも３５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも４５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも６５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも７５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも８５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、少なくとも９５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または少なくとも１ｋｂのアデノシンもしくはシトシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリＡまたはポリＣテールは、それぞれ約１０～８００個のアデノシンまたはシトシンヌクレオチド（例えば、約１０～２００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～３００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～４００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～５５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約３５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約４５０～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約５００～６００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１５０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約１０～１００個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、約２０～７０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド、または約２０～６０個のアデノシンもしくはシトシンヌクレオチド）であることができる。一部の実施形態では、テール構造は、本明細書に記載される様々な長さのポリ（Ａ）テールとポリ（Ｃ）テールの組合せである。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のアデノシンヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、テール構造は、少なくとも５０％、５５％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のシトシンヌクレオチドを含む。
本明細書に記載されるように、キャッピングおよび／またはテーリングがないと、早期中断ｍＲＮＡ転写産物のサイズがあまりに小さすぎて検出することができないために、５’キャップおよび／または３’テールの付加によって、インビトロ合成中に産生される中断転写産物の検出が容易になる。よって、一部の実施形態では、ｍＲＮＡを純度（ｍＲＮＡ中に存在する中断転写産物のレベル）について試験する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように精製する前に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。他の実施形態では、ｍＲＮＡを本明細書に記載されるように精製した後に、５’キャップおよび／または３’テールを合成されたｍＲＮＡに付加する。
本発明に従って合成されるｍＲＮＡは、さらに精製することなく使用することができる。特に、本発明に従って合成されるｍＲＮＡは、ショートマーを除去する工程なしに使用することができる。一部の実施形態では、本発明に従って合成されるｍＲＮＡは、さらに精製することができる。様々な方法を用いて、本発明に従って合成されるｍＲＮＡを精製することができる。例えば、遠心分離、濾過および／またはクロマトグラフィー法を使用して、ｍＲＮＡの精製を実施することができる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡは、エタノール沈殿もしくは濾過もしくはクロマトグラフィー、もしくはゲル精製または任意の他の適切な手段によって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはＨＰＬＣによって精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、当業者に周知の、標準フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール溶液中で抽出される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡはタンジェンシャルフローフィルトレーションを使用して精製される。適切な精製方法には、その全てを参照によって本明細書に組み入れ、本発明を実施するために使用することができる、米国特許出願公開第２０１６／００４０１５４号、米国特許出願公開第２０１５／０３７６２２０号、米国特許出願公開第２０１８／０２５１７５５号、米国特許出願公開第２０１８／０２５１７５４号、２０１８年１１月８日に出願された米国仮特許出願第６２／７５７，６１２号、および２０１９年８月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／８９１，７８１号に記載されるものが含まれる。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング前に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリング後に精製される。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、キャッピングおよびテーリングの前と後の両方で精製される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、遠心分離によって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、濾過によって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）によって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、クロマトグラフィーによって、キャッピングおよびテーリングの前もしくは後のいずれか、または前と後の両方で精製される。
精製されたｍＲＮＡの特性評価
本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、短い中断ＲＮＡ種、長い中断ＲＮＡ種、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、残留プラスミドＤＮＡ、残留インビトロ転写酵素、残留溶媒および／または残留塩を含む汚染物質を実質的に含まない。
本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、約６０％～約１００％の間の純度を有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９０％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９１％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９２％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９３％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９４％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９５％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９６％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９７％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９８％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約９９％の純度を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１００％の純度を有する。
一部の実施形態では、本明細書に記載されるｍＲＮＡ組成物は、１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、および／または０．１％未満の完全長ｍＲＮＡ以外の不純物を有する。不純物には、ＩＶＴ汚染物質、例えばタンパク質、酵素、ＤＮＡ鋳型、遊離ヌクレオチド、残留溶媒、残留塩、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、早期中断ＲＮＡ配列（「ショートマー」または「短い中断ＲＮＡ種」）、および／または長い中断ＲＮＡ種が含まれる。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡはプロセス酵素を実質的に含まない。
一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは、約１ｐｇ／ｍｇ未満、約２ｐｇ／ｍｇ未満、約３ｐｇ／ｍｇ未満、約４ｐｇ／ｍｇ未満、約５ｐｇ／ｍｇ未満、約６ｐｇ／ｍｇ未満、約７ｐｇ／ｍｇ未満、約８ｐｇ／ｍｇ未満、約９ｐｇ／ｍｇ未満、約１０ｐｇ／ｍｇ未満、約１１ｐｇ／ｍｇ未満、または約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。したがって、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約２ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約３ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約４ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約５ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約６ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約７ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約８ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約９ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１０ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１１ｐｇ／ｍｇ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の残留プラスミドＤＮＡは約１２ｐｇ／ｍｇ未満である。
一部の実施形態では、本発明による方法は、約９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％超または実質的に全ての早期中断ＲＮＡ配列（「ショートマー」としても知られる）を除去する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は早期中断ＲＮＡ配列を実質的に含まない。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）の早期中断ＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）の早期中断ＲＮＡ配列を含有する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ組成物は例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（例えば、ショルダーピークまたは別々のピーク）、臭化エチジウム、クーマシー染色、キャピラリー電気泳またはグリオキサールゲル電気泳動によって決定される、検出不能な早期中断ＲＮＡ配列（例えば、別々の低いバンドの存在）。本明細書で使用される場合、「ショートマー」、「短い中断ＲＮＡ種」、「早期中断ＲＮＡ配列」または「長い中断ＲＮＡ種」という用語は、完全長より短い任意の転写産物を指す。一部の実施形態では、「ショートマー」、「短い中断ＲＮＡ種」、または「早期中断ＲＮＡ配列」は、１００ヌクレオチド長未満、９０ヌクレオチド長未満、８０ヌクレオチド長未満、７０ヌクレオチド長未満、６０ヌクレオチド長未満、５０ヌクレオチド長未満、４０ヌクレオチド長未満、３０ヌクレオチド長未満、２０ヌクレオチド長未満、または１０ヌクレオチド長未満である。一部の実施形態では、ショートマーは、５’キャップ、および／または３’ポリＡテールを付加した後に検出または定量化される。一部の実施形態では、早期中断ＲＮＡ転写産物は１５個未満の塩基（例えば、１４個、１３個、１２個、１１個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、または３個未満の塩基）を含む。一部の実施形態では、早期中断ＲＮＡ転写産物は、約８～１５個、８～１４個、８～１３個、８～１２個、８～１１個、または８～１０個の塩基を含有する。
一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは、それだけに限らないが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡｓｅ Ｉ、ピロホスファターゼ、および／またはＲＮＡｓｅ阻害剤を含む、インビトロ合成に使用される酵素試薬を実質的に含まない。一部の実施形態では、本発明による精製されたｍＲＮＡは、約５％未満（例えば、約４％、３％、２％、または１％未満）のインビトロ合成に使用される酵素試薬を含有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、約１％未満（例えば、約０．９％、０．８％、０．７％、０．６％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、または０．１％未満）のインビトロ合成に使用される酵素試薬を含有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、例えば銀染色、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）、および／またはキャピラリー電気泳動、臭化エチジウムおよび／またはクーマシー染色によって決定されるものを含む、インビトロ合成に使用される検出不能な酵素試薬を含有する。
様々な実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは高い完全性の程度を維持する。本明細書で使用される場合、「ｍＲＮＡ完全性」という用語は、一般的に精製後のｍＲＮＡの質を指す。ｍＲＮＡ完全性は、例えば、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動によって、当技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性は、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動のバンドパターンによって決定することができる。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは、ＲＮＡアガロースゲル電気泳動の参照バンドと比較してほとんどまたは全くバンドを示さない。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは、約９５％超（例えば、約９６％、９７％、９８％、９９％超またはそれ以上）の完全性を有する。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは９８％超の完全性を有する。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡは９９％超の完全性を有する。一部の実施形態では、本発明の精製されたｍＲＮＡはおよそ１００％の完全性を有する。
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを以下の特徴：外観、同一性、量、濃度、不純物の存在、微生物学的評価、ｐＨレベルおよび活性のうちの１つまたはそれ以上について評価する。一部の実施形態では、許容される外観には、目に見える粒子を本質的に含まない、無色透明溶液が含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡの同一性は、配列決定法によって評価される。一部の実施形態では、濃度は、ＵＶ分光光度法などの適切な方法によって評価される。一部の実施形態では、適切な濃度は約９０％～１１０％公称の間（０．９～１．１ｍｇ／ｍＬ）である。
一部の実施形態では、ｍＲＮＡの純度の評価は、ｍＲＮＡ完全性の評価、残留プラスミドＤＮＡの評価、および残留溶媒の評価を含む。一部の実施形態では、ｍＲＮＡ完全性の許容されるレベルは、アガロースゲル電気泳動によって評価される。ゲルを分析して、結合パターンおよび見かけのヌクレオチド長が分析参照標準と一致しているかどうかを決定する。ＲＮＡ完全性を評価する追加の方法には、例えば、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）を使用した精製されたｍＲＮＡの評価が含まれる。一部の実施形態では、ＣＧＥによって決定される精製されたｍＲＮＡの許容される純度は、精製されたｍＲＮＡ組成物が約５５％以下の長い中断／分解された種を有することである。一部の実施形態では、残留プラスミドＤＮＡは、当技術分野の方法によって、例えば、ｑＰＣＲの使用によって評価される。一部の実施形態では、１０ｐｇ／ｍｇ未満（例えば、１０ｐｇ／ｍｇ未満、９ｐｇ／ｍｇ未満、８ｐｇ／ｍｇ未満、７ｐｇ／ｍｇ未満、６ｐｇ／ｍｇ未満、５ｐｇ／ｍｇ未満、４ｐｇ／ｍｇ未満、３ｐｇ／ｍｇ未満、２ｐｇ／ｍｇ未満、または１ｐｇ／ｍｇ未満）が残留プラスミドＤＮＡの許容されるレベルである。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは、１０，０００ｐｐｍ、９，０００ｐｐｍ、８，０００ｐｐｍ、７，０００ｐｐｍ、６，０００ｐｐｍ、５，０００ｐｐｍ、４，０００ｐｐｍ、３，０００ｐｐｍ、２，０００ｐｐｍ、１，０００ｐｐｍ以下である。したがって、一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１０，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは９，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは８，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは７，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは６，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは５，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは４，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは３，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは２，０００ｐｐｍ以下である。一部の実施形態では、許容される残留溶媒レベルは１，０００ｐｐｍ以下である。
一部の実施形態では、例えば、細菌内毒素の評価を含む微生物試験が精製されたｍＲＮＡに実施される。一部の実施形態では、細菌内毒素は、０．５ＥＵ／ｍＬ未満、０．４ＥＵ／ｍＬ未満、０．３ＥＵ／ｍＬ未満、０．２ＥＵ／ｍＬ未満または０．１ＥＵ／ｍＬ未満である。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．５ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．４ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．３ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．２ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．２ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡ中の細菌内毒素は０．１ＥＵ／ｍＬ未満である。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１ＣＦＵ／１０ｍＬ、１ＣＦＵ／２５ｍＬ、１ＣＦＵ／５０ｍＬ、１ＣＦＵ／７５ｍＬ以下、または１ＣＦＵ／１００ｍＬ以下を有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／１０ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／２５ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／５０ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／７５ｍＬ以下を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは１ＣＦＵ／１００ｍＬを有する。
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡのｐＨを評価する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容されるｐＨは５～８の間である。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約５のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約６のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７のｐＨを有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約８のｐＨを有する。
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの翻訳忠実度を評価する。翻訳忠実度は、様々な方法によって評価することができ、例えば、トランスフェクションおよびウエスタンブロット分析を含むことができる。精製されたｍＲＮＡの許容される特徴には、参照標準と同様の分子量で移動するウエスタンブロットでのバンドパターンが含まれる。
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡをコンダクタンスについて評価する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡの許容される特徴には、参照標準の約５０％～約１５０％の間のコンダクタンスが含まれる。
精製されたｍＲＮＡをキャップパーセンテージおよびポリＡテール長についても評価する。一部の実施形態では、許容されるキャップパーセンテージには、キャップ１、％面積：ＮＬＴ９０が含まれる。一部の実施形態では、許容されるポリＡテール長は、約１００～１５００ヌクレオチド（例えば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、および１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、または１５００ヌクレオチド）である。
一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡを残留ＰＥＧについても評価する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは、１０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ～１０００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇの間未満を有する。したがって、一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約２５０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約５００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約７５０ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。一部の実施形態では、精製されたｍＲＮＡは約１０００ｎｇ ＰＥＧ／精製されたｍＲＮＡのｍｇ未満を有する。
ｍＲＮＡ純度を検出および定量化する様々な方法は当技術分野で公知である。例えば、このような方法には、ブロット法、キャピラリー電気泳動、クロマトグラフィー、蛍光、ゲル電気泳動、ＨＰＬＣ、銀染色、分光法、紫外線（ＵＶ）、もしくはＵＰＬＣ、またはこれらの組合せが含まれる。一部の実施形態では、ｍＲＮＡを、ゲル電気泳動（「グリオキサールゲル電気泳動」）の前にまずグリオキサール色素によって変性させる。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングまたはテーリング前に特性評価する。一部の実施形態では、合成されたｍＲＮＡをキャッピングおよびテーリング後に特性評価する。
組成物の治療的使用
インビボでのｍＲＮＡの発現を容易にするために、リポソームなどの送達ビヒクルを、１つもしくはそれ以上の追加の核酸、担体、標的化リガンドもしくは安定化試薬と組み合わせて、または適切な賦形剤と混合される薬理学的組成物に製剤化することができる。薬物を製剤化および投与するための技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、ペンシルバニア州イーストン、最新版に見られる。
一部の実施形態では、組成物は、送達ビヒクルにより封入されたまたは送達ビヒクルと複合体化したｍＲＮＡを含む。一部の実施形態では、送達ビヒクルは、リポソーム、脂質ナノ粒子、固体－脂質ナノ粒子、ポリマー、ウイルス、ゾル－ゲル、およびナノゲルからなる群から選択される。
提供されるｍＲＮＡ搭載ナノ粒子、および同ナノ粒子を含有する組成物は、対象の臨床状態、投与の部位および方法、投与のスケジュール、対象の年齢、性別、体重、ならびに当業者の医師に関連する他の因子を考慮して、現在の医療行為に従って投与および投薬することができる。本明細書における目的のための「有効量」は、実験臨床研究、薬理学、臨床および医学分野の当業者に公知であるような関連する考慮事項によって決定することができる。一部の実施形態では、投与される量は、症状の少なくとも一部の安定化、改善または排除および当業者によって、疾患の進行、退行または改善の適切な尺度として選択されるような他の指標を達成するのに有効である。例えば、適切な量および投薬レジメンは、少なくとも一過的なタンパク質（例えば、酵素）産生を引き起こすものである。
本発明は、インビボタンパク質産生のためにｍＲＮＡを送達する方法であって、ｍＲＮＡを、送達を必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、ｍＲＮＡは、静脈内送達、皮下送達、経口送達、真皮下送達、眼送達、気管内注射肺送達（例えば、噴霧）、筋肉内送達、髄腔内送達、または関節内送達からなる群から選択される送達経路を介して投与される。
適切な投与経路には、例えば、経口、直腸、膣、経粘膜、気管内もしくは吸入を含む肺、または腸投与；真皮内、経皮（局所）、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内を含む非経口送達が含まれる。一部の実施形態では、筋肉内投与は、骨格筋、平滑筋および心筋からなる群から選択される筋肉に対するものである。一部の実施形態では、投与によってｍＲＮＡが筋細胞に送達される。一部の実施形態では、投与によってｍＲＮＡが肝細胞（すなわち、肝臓細胞）に送達される。特定の実施形態では、筋肉内投与によってｍＲＮＡが筋細胞に送達される。
肺送達および噴霧の追加の教示は、その各々全体を参照によって組み入れる、米国特許出願公開第２０１８／０１２５９８９号および米国特許出願公開第２０１８／０３３３４５７号に記載されている。
あるいはまたはさらに、本発明のｍＲＮＡ搭載ナノ粒子および組成物は、例えば、好ましくは徐放性製剤での、医薬組成物の標的組織への直接の注射を介して、全身的ではなく局所的に投与される。局所送達は、標的化される組織に応じて、様々な方法で行うことができる。例えば、本発明の組成物を含有するエアロゾルを吸入することができ（経鼻、気管、もしくは気管支送達のため）；本発明の組成物を、例えば、傷害、疾患顕在化、もしくは疼痛の部位に注射することができ；組成物を経口、気管、もしくは食道施用のためにロゼンジで提供することができ；胃もしくは腸への投与のために液体、錠剤もしくはカプセル剤形態で供給することができ；直腸もしくは膣施用のために坐剤形態で供給することができ；またはクリーム、液滴、もしくはさらには注射の使用によって眼に送達することさえできる。治療用分子またはリガンドと複合体化した提供される組成物を含有する製剤を、例えば、ポリマーまたは組成物が埋込部位から周囲の細胞に拡散するのを可能にすることができる他の構造もしくは物質と合わせて、外科的に投与することさえできる。あるいは、これらを、ポリマーも支持体も使用することなく外科的に施用することができる。
本発明の提供される方法は、治療上有効量の本明細書に記載される治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の単回ならびに複数回投与を企図する。治療剤は、対象の状態の性質、重症度および程度に応じて、一定の間隔で投与することができる。一部の実施形態では、治療上有効量の本発明の治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）を一定の間隔で定期的に（例えば、１年に１回、６か月に１回、５か月に１回、３か月に１回、隔月で（２か月に１回）、毎月（１か月に１回）、隔週で（２週間に１回）、１か月に２回、３０日に１回、２８日に１回、１４日に１回、１０日に１回、７日に１回、毎週、１週間に２回、毎日、または連続的に）髄腔内投与することができる。
一部の実施形態では、提供されるリポソームおよび／または組成物は、その中に含有されるｍＲＮＡの延長放出に適するように製剤化される。このような延長放出組成物は、延長された投薬間隔で対象に都合よく投与される。例えば、一実施形態では、本発明の組成物は、１日２回、毎日、または１日おきに対象に投与される。好ましい実施形態では、本発明の組成物は、１週間に２回、１週間に１回、７日に１回、１０日に１回、１４日に１回、２８日に１回、３０日に１回、２週間に１回、３週間に１回、またはより好ましくは４週間に１回、１か月に１回、１か月に２回、６週間に１回、８週間に１回、隔月１回、３か月に１回、４か月に１回、６か月に１回、８か月に１回、９か月に１回、または毎年、対象に投与される。長期間にわたって治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）を送達または放出するデポー投与（例えば、筋肉内、皮下、硝子体内）のために製剤化された組成物およびリポソームも企図される。好ましくは、使用される延長放出手段は、安定性を増強するためにｍＲＮＡになされる修飾と組み合わせられる。
本明細書で使用される場合、「治療上有効量」という用語は、主として、本発明の医薬組成物中に含有される治療剤の総量に基づいて決定される。一般的に、治療上有効量は、対象に対する意味のある利益（例えば、疾患または障害を処置する、調節する、治癒する、予防する、および／または改善する）を達成するのに十分である。例えば、治療上有効量は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量である。一般的に、それを必要とする対象に投与される治療剤（例えば、ｍＲＮＡ）の量は、対象の特徴に依存する。このような特徴には、対象の状態、疾患重症度、健康全般、年齢、性別および体重が含まれる。当業者であれば、これらのおよび他の関連する因子に応じて適切な投薬量を容易に決定することができるだろう。さらに、客観的アッセイと主観的アッセイの両方を場合により使用して最適な投薬量範囲を同定することができる。
治療上有効量は、複数単位用量を含むことができる投薬レジメンで一般的に投与される。特定の治療用タンパク質について、治療上有効量（および／または有効投薬レジメン内の適切な単位用量）は、例えば、投与経路、他の医薬品との組合せに応じて変化する。また、特定の患者のための具体的な治療上有効量（および／または単位用量）は、処置される障害および障害の重症度；使用される具体的な医薬品の活性；使用される具体的な組成物；患者の年齢、体重、健康全般、性別および食事；投与時間、投与経路、および／または使用される具体的なタンパク質の排泄もしくは代謝率；処置の持続時間；ならびに医学分野で周知である同様の因子を含む様々な因子に依存する。
一部の実施形態では、治療上有効用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～５００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～４００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～３００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～９０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～８０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～７０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～６０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～４０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～２０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～１５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．００５ｍｇ／ｋｇ体重～１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。
一部の実施形態では、治療上有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重超、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重超、約１．０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３ｍｇ／ｋｇ体重超、約５ｍｇ／ｋｇ体重超、約１０ｍｇ／ｋｇ体重超、約１５ｍｇ／ｋｇ体重超、約２０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３０ｍｇ／ｋｇ体重超、約４０ｍｇ／ｋｇ体重超、約５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約６０ｍｇ／ｋｇ体重超、約７０ｍｇ／ｋｇ体重超、約８０ｍｇ／ｋｇ体重超、約９０ｍｇ／ｋｇ体重超、約１００ｍｇ／ｋｇ体重超、約１５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約２００ｍｇ／ｋｇ体重超、約２５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約３００ｍｇ／ｋｇ体重超、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約４００ｍｇ／ｋｇ体重超、約４５０ｍｇ／ｋｇ体重超、約５００ｍｇ／ｋｇ体重超である。特定の実施形態では、治療上有効用量は１．０ｍｇ／ｋｇである。一部の実施形態では、１．０ｍｇ／ｋｇの治療上有効用量が筋肉内または静脈内投与される。
本明細書では、本明細書に開示されるリポソームの１つまたはそれ以上を含む凍結乾燥医薬組成物および例えば、その教示全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０１１年６月８日に出願された米国仮特許出願第６１／４９４，８８２号に開示されるこのような組成物を使用するための関連する方法も企図される。例えば、本発明による凍結乾燥医薬組成物は、投与前に再構成することができる、またはインビボで再構成することができる。例えば、凍結乾燥医薬組成物は、適切な剤形（例えば、ディスク、ロッドまたは膜などの真皮内剤形）に製剤化され、剤形が個体の体液によってインビボで時間とともに再水和されるように投与される。
提供されるリポソームおよび組成物は任意の所望の組織に投与される。一部の実施形態では、提供されるリポソームまたは組成物によって送達されるｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織で発現される。一部の実施形態では、送達されたｍＲＮＡは、リポソームおよび／または組成物が投与された組織とは異なる組織で発現される。送達されたｍＲＮＡが送達および／または発現される例示的な組織には、それだけに限らないが、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、血清、脳、骨格筋、リンパ節、皮膚、および／または脳脊髄液が含まれる。
一部の実施形態では、提供される組成物の投与が、処置前のベースライン発現レベルと比較して、対象由来の生物学的サンプルにおいて上昇したｍＲＮＡ発現レベルをもたらす。典型的には、ベースラインレベルは処置直前に測定される。生物学的サンプルには、例えば、全血、血清、血漿、尿および組織サンプル（例えば、筋肉、肝臓、皮膚線維芽細胞）が含まれる。一部の実施形態では、提供される組成物の投与によって、処置直前のベースラインレベルと比較して、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％上昇したｍＲＮＡ発現レベルが得られる。一部の実施形態では、提供される組成物の投与によって、処置されていない対象のｍＲＮＡ発現レベルと比較して上昇したｍＲＮＡ発現レベルが得られる。
様々な実施形態によると、送達されたｍＲＮＡの発現のタイミングを、特定の医療ニーズに適するように調整することができる。一部の実施形態では、送達されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、提供されるリポソームおよび／または組成物の投与１、２、３、６、１２、２４、４８、７２、および／または９６時間後に検出可能である。一部の実施形態では、送達されたｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現は、投与１週間、２週間、および／または１か月後に検出可能である。
本発明はまた、対象、例えばヒト対象またはヒト対象の細胞または処置され、ヒト対象に送達される細胞の処置に使用するための目的のペプチドまたはポリペプチドをコードするｍＲＮＡ分子を有する組成物の送達を提供する。
本発明のある特定の化合物、組成物および方法をある特定の実施形態によって具体的に説明してきたが、以下の実施例は本発明を単に例示するのに役立ち、これを限定することを意図するものではない。本発明のある特定の化合物、組成物および方法をある特定の実施形態によって具体的に説明してきたが、以下の実施例は本発明を単に例示するのに役立ち、これを限定することを意図するものではない。
高シトレート濃度を用いる脂質ナノ粒子製剤
本実施例は、混合前に脂質およびｍＲＮＡ溶液を加熱することなく、ｍＲＮＡ溶液中の高濃度のシトレート（すなわち、１０ｍＭ超）を用いて方法Ａによって形成されるｍＲＮＡ－ＬＮＰが、約６０％未満の封入効率を有することを例示する。
本明細書で使用される場合、方法Ａは、脂質を脂質ナノ粒子に最初に事前形成することなく、ｍＲＮＡを脂質の混合物と混合することによってｍＲＮＡを封入する慣用的な方法を指す。手短に言えば、この方法においては、脂質（すなわち、カチオン性脂質、ヘルパー脂質、ＰＥＧ修飾脂質、コレステロール脂質等）の混合物の溶液を、エタノールに脂質を溶解することによって製造した。ｍＲＮＡ溶液は、クエン酸緩衝液にｍＲＮＡを溶解することによって製造した。脂質溶液およびｍＲＮＡ溶液を、加熱せずに室温で維持した。次いで、これらの２種類の溶液を、ポンプシステムを使用して混合した。典型的には、混合後、ＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡを含む溶液を、ＴＦＦプロセスを用いる透析濾過による精製前に、６０～９０分間インキュベートした。
ｍＲＮＡ溶液中の様々な濃度のシトレートの効果を調べた。表１は、１０ｍＭ、２０ｍＭ、または４０ｍＭのシトレートを含むｍＲＮＡ溶液を用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰに関する例示的な封入効率を示す。バッチサイズ、流速、温度、ｐＨ、および塩濃度を含む全ての他の変数は、一定に保った、高シトレート濃度（１０ｍＭ超）を用いる脂質ナノ粒子製剤に関する封入効率は、約６０％であった。
Figure 2023545128000081
低シトレート濃度を用いる脂質ナノ粒子製剤
本実施例は、ｍＲＮＡ溶液中の低濃度のシトレート（すなわち、５ｍＭ以下）を用いて製造されるｍＲＮＡ－ＬＮＰが、約６０％またはそれを超える高い封入効率を有することを例示する。高い封入効率は、方法が混合工程前にｍＲＮＡおよび／または脂質溶液を加熱する工程を含まない場合でさえも観察された。
ｍＲＮＡ５０ｍｇを、ｍＲＮＡ溶液中の様々な濃度のシトレートを用いる方法Ａによって脂質ナノ粒子内に封入した。混合後、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを、３０℃で９０分間インキュベートした。図１は、３０℃でのインキュベーション前および後の、０、１．５、２．０、２．５、３、５、７．５、および１０ｍＭのシトレートを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰに関する封入効率を示す。図１に示される通り、５ｍＭ以下のシトレートを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰは、７０％を超える最終封入効率をもたらした。ｐＨの変化（３．０～４．５）は、封入効率に対して影響を有しなかったことも特筆すべきである。
様々な塩化ナトリウム濃度を用いる脂質ナノ粒子製剤
本実施例は、ｍＲＮＡ溶液中の塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）濃度が、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率に対して顕著な影響を有しないことを実証する。
ｍＲＮＡ５０ｍｇを、２．５ｍＭのシトレートおよび４．５のｐＨを有するｍＲＮＡ溶液中の様々な濃度のＮａＣｌを用いる方法Ａによって脂質ナノ粒子内に封入した。混合後、ｍＲＮＡ－ＬＮＰを、３０℃で９０分間インキュベートした。図２は、３０℃でのインキュベーション前および後の、０、３７．５、７５、１５０、および３００ｍＭのＮａＣｌを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率を示す。図２に示される通り、３７．５～３００ｍＭのＮａＣｌを用いて製造されたｍＲＮＡ－ＬＮＰは、７０％を超える最終封入効率をもたらした。ｐＨの変化（３．０～４．５）は、封入効率に対して影響を有しなかったことも特筆すべきである（データは示していない）。
上記の結果を確認するために、ｍＲＮＡ５０ｍｇを、以下の条件を用いて脂質ナノ粒子内にそれぞれ封入した：ｉ）２．５ｍＭのシトレート＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｉｉ）２．５ｍＭのシトレート＋３００ｍＭのＮａＣｌ、ｉｉｉ）３．０ｍＭのシトレート＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、またはｉｖ）３．０ｍＭのシトレート＋３００ｍＭのＮａＣｌ。結果を図３に示す。１５０ｍＭまたは３００ｍＭのＮａＣｌを伴う２．５ｍＭと３．０ｍＭのシトレート濃度の間には顕著な差異は観察されなかった。全４種類の条件は、７０％を超える最終封入効率をもたらした。
様々なｍＲＮＡ：脂質（ｖ／ｖ）比を用いる脂質ナノ粒子製剤
本実施例は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率に対するｍＲＮＡ：脂質比および混合中の流速の影響を例示する。
ｍＲＮＡ２０ｍｇを、１０ｍＭのシトレート、１５０ｍＭのＮａＣｌ、および４．５のｐＨを含むｍＲＮＡ溶液を用いて脂質ナノ粒子内に封入した。脂質溶液中の異なる脂質の濃度、ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度、および混合工程中の流速を調べた。ｍＲＮＡまたは脂質溶液の容量を減少または増加させて、それぞれ、より高いかまたはより低い濃度を達成した。
Figure 2023545128000082
表２に示される結果は、ｍＲＮＡの比較的高い濃度（すなわち、比較的低容量のｍＲＮＡ溶液；条件Ｄ）および脂質の比較的低い濃度（すなわち、比較的高容量の脂質溶液；条件Ｂ）が、対照（条件Ａ）と比較した場合に比較的高い封入効率に相関することを示す。
上記の結果を確認するために、ｍＲＮＡ溶液：脂質溶液の異なる（ｖ／ｖ）比率を調べた。ｍＲＮＡ５０ｍｇを、２．５ｍＭのシトレートおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ、および４．５のｐＨを含むｍＲＮＡ溶液を用いて脂質ナノ粒子内に封入した。図４に示される通り、３：１を超えるｍＲＮＡ：脂質比は、約７５％を超える最終封入効率をもたらした。注記すべきことに、４：１比は、インキュベーション工程の前および後に、７０％を超える封入効率をもたらした。
次に、ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率に対する流速の効果を調べた。ｍＲＮＡ５０ｍｇを、２．５ｍＭのシトレートおよび１５０ｍＭのＮａＣｌ、および４．５のｐＨを含むｍＲＮＡ溶液を用いて脂質ナノ粒子内に封入した。２００ｍＬ／分～５００ｍＬ／分の範囲の様々な合計流速（ｍＲＮＡ流速＋脂質流速）を試験した。図５に示される通り、異なる流速を用いて、封入効率の顕著な変化は観察されなかった。高い封入効率が、低シトレート濃度（５ｍＭ以下）を用いた場合に、流速、ｐＨ、およびＮａＣｌ濃度にかかわらず、方法Ａを用いて達成された。
等価物
当業者であれば、日常的な実験でしかないものを使用して、本明細書に記載される本発明の具体的な実施形態の多くの等価物を認識するか、または確認することができるだろう。本発明の範囲は、上記の明細書に限定されることを意図するものではなく、むしろ以下の特許請求の範囲に示される通りである。

Claims (59)

  1. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ溶液を（ｂ）１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質溶液と混合して、ＬＮＰ形成溶液中のＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する工程を含み、ｍＲＮＡ溶液は５ｍＭ未満のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは６０％超の封入効率を有する、方法。
  2. ｍＲＮＡ溶液および／または脂質溶液は、混合前に周囲温度である、請求項１に記載の方法。
  3. 周囲温度は約３５℃未満、約３０℃未満、約２６℃未満、約２３℃未満、約２１℃未満、約２０℃未満、または約１８℃未満である、請求項２に記載の方法。
  4. 周囲温度は約１８～３２℃、約２１～２６℃、または約２３～２５℃の範囲である、請求項２または３に記載の方法。
  5. ｍＲＮＡ溶液は、約４．０ｍＭ未満のシトレート、約３．０ｍＭ未満のシトレート、約２．５ｍＭ未満のシトレート、約２．０ｍＭ未満のシトレート、約１．５ｍＭ未満のシトレート、約１．２５ｍＭ未満のシトレート、約１．０ｍＭ未満のシトレート、または約０．５ｍＭ未満のシトレートを含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
  6. ｍＲＮＡ溶液は約３．０ｍＭのシトレートを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  7. ｍＲＮＡ溶液は約２．５ｍＭのシトレートを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  8. ｍＲＮＡ溶液は約２．０ｍＭのシトレートを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  9. ｍＲＮＡ溶液は約１．５ｍＭのシトレートを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  10. ｍＲＮＡ溶液は０ｍＭのシトレートを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
  11. ｍＲＮＡ溶液はトレハロースをさらに含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 混合工程の前にｍＲＮＡ溶液と脂質溶液を加熱する工程を要さない、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液１２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇ超を含む、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液８Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む、請求項１３に記載の方法。
  15. ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液４Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む、請求項１３に記載の方法。
  16. ｍＲＮＡ溶液は、ｍＲＮＡ溶液２Ｌ当たりｍＲＮＡ約１ｇを含む、請求項１３に記載の方法。
  17. ｍＲＮＡ溶液中のｍＲＮＡの濃度は約０．１２５ｍｇ／ｍＬ超、約０．２５ｍｇ／ｍＬ超、約０．５ｍｇ／ｍＬ超、または約１．０ｍｇ／ｍＬ超である、請求項１３に記載の方法。
  18. ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は２：１～６：１の間の比（ｖ／ｖ）で混合される、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。
  19. ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液は約４：１の比（ｖ／ｖ）で混合される、請求項１８に記載の方法。
  20. ｍＲＮＡ溶液は３．０～５．０の間のｐＨを有する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. ｍＲＮＡ溶液は約３．５、４．０、または４．５のｐＨを有する、請求項２０に記載の方法。
  22. ｍＲＮＡ溶液は約３７．５ｍＭ～３００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
  23. ｍＲＮＡ溶液は、約３７．５ｍＭ、約７５ｍＭ、約１００ｍＭ、約１５０ｍＭ、または約３００ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項２２に記載の方法。
  24. ｍＲＮＡ溶液は、約２．５ｍＭのシトレート、約１５０ｍＭのＮａＣｌ、および約４．５のｐＨを含む、請求項１に記載の方法。
  25. ｍＲＮＡ－ＬＮＰをインキュベートする工程をさらに含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２１℃～６５℃の間の温度でインキュベートされる、請求項２５に記載の方法。
  27. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２６℃、約３０℃、または約６５℃の温度でインキュベートされる、請求項２６に記載の方法。
  28. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約２０分間、約３０分間、約６０分間、約９０分間、または約１２０分間超インキュベートされる、請求項２５～２７のいずれか１項に記載の方法。
  29. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約６０分間インキュベートされる、請求項２８に記載の方法。
  30. 脂質溶液は、５０％未満、２５％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満のエタノールのような非水性溶媒を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
  31. 脂質溶液は１つまたはそれ以上のコレステロール系脂質をさらに含む、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
  32. ｍＲＮＡ－ＬＮＰはタンジェンシャルフローフィルトレーションによって精製される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
  33. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１５０ｎｍ未満、１００ｎｍ未満、８０ｎｍ未満、６０ｎｍ未満、または４０ｎｍ未満の平均径を有する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
  34. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは４０～７０ｎｍの範囲の平均径を有する、請求項３３に記載の方法。
  35. 脂質ナノ粒子は約０．３未満、約０．２未満、約０．１８未満、約０．１５未満、約０．１未満のＰＤＩを有する、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
  36. ｍＲＮＡ－ＬＮＰの封入効率は約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超である、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
  37. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは１～１０の間のＮ／Ｐ比を有する、請求項１～３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは２～６の間のＮ／Ｐ比を有する、請求項３７に記載の方法。
  39. ｍＲＮＡ－ＬＮＰは約４のＮ／Ｐ比を有する、請求項３８に記載の方法。
  40. ｍＲＮＡ ５ｇもしくはそれ以上、１０ｇもしくはそれ以上、２０ｇもしくはそれ以上、５０ｇもしくはそれ以上、１００ｇもしくはそれ以上、または１ｋｇもしくはそれ以上は単一バッチで脂質ナノ粒子に封入される、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. ｍＲＮＡ溶液と脂質溶液はパルスレスフローポンプによって混合される、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
  42. ポンプはギアポンプである、請求項４１に記載の方法。
  43. ポンプは遠心ポンプである、請求項４２に記載の方法。
  44. ｍＲＮＡ溶液は、約１５０～２５０ｍｌ／分、２５０～５００ｍｌ／分、５００～１０００ｍｌ／分、１０００～２０００ｍｌ／分、２０００～３０００ｍｌ／分、３０００～４０００ｍｌ／分、または４０００～５０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. ｍＲＮＡ溶液は、約８００ｍｌ／分、約１０００ｍｌ／分、または約１２０００ｍｌ／分の流量で混合される、請求項４４に記載の方法。
  46. 脂質溶液は、約２５～７５ｍｌ／分、約７５～２００ｍｌ／分、約２００～３５０ｍｌ／分、約３５０～５００ｍｌ／分、約５００～６５０ｍｌ／分、約６５０～８５０ｍｌ／分、または約８５０～１０００ｍｌ／分の範囲の流量で混合される、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 脂質溶液は、約１００ｍｌ／分、約１５０ｍｌ／分、約２００ｍｌ／分、約２５０ｍｌ／分、約３００ｍｌ／分、約３５０ｍｌ／分の流量で混合される、請求項４６に記載の方法。
  48. ｍＲＮＡ溶液の流量は脂質溶液の流量より２倍、４倍、または６倍大きい、請求項４４～４７のいずれか１項に記載の方法。
  49. 組成物であって、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法によって製造された脂質ナノ粒子に封入されたｍＲＮＡを含む組成物。
  50. ｍＲＮＡ ５ｇもしくはそれ以上、１０ｇもしくはそれ以上、２０ｇもしくはそれ以上、５０ｇもしくはそれ以上、１００ｇもしくはそれ以上、または１ｋｇもしくはそれ以上を含む、請求項４９に記載の組成物。
  51. ｍＲＮＡは１つまたはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む、請求項４９または５０に記載の組成物。
  52. ｍＲＮＡは未修飾である、請求項４９または５０に記載の組成物。
  53. ｍＲＮＡは約０．５ｋｂ、１ｋｂ、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、８ｋｂ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、３０ｋｂまたは４０ｋｂ超である、請求項４９～５２のいずれか１項に記載の組成物。
  54. ｍＲＮＡ－ＬＮＰ封入効率は、ｍＲＮＡ溶液が１０ｍＭのシトレートを有することを除いて同じ条件下で脂質溶液と混合されたｍＲＮＡ溶液から形成されたｍＲＮＡ－ＬＮＰと比較して少なくとも１０％高い、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。
  55. メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に封入する方法であって、（ａ）１つまたはそれ以上のｍＲＮＡを含むｍＲＮＡ溶液を（ｂ）１つまたはそれ以上のカチオン性脂質、１つまたはそれ以上の非カチオン性脂質、および１つまたはそれ以上のＰＥＧ修飾脂質を含む脂質溶液と混合して、ＬＮＰ形成溶液中のＬＮＰ内に封入されたｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ－ＬＮＰ）を形成する工程を含み、ｍＲＮＡ溶液は０．１ｍＭ～５ｍＭの間のシトレートを含み、ｍＲＮＡ－ＬＮＰは６０％超の封入効率を有する、方法。
  56. ｍＲＮＡ溶液は、約１ｍＭ～４ｍＭの間のシトレートを含む、請求項５５に記載の方法。
  57. ｍＲＮＡ溶液は、約２ｍＭ～約３ｍＭの間のシトレートを含む、請求項５６に記載の方法。
  58. ｍＲＮＡ溶液は約２ｍＭのシトレートを含む、請求項５７に記載の方法。
  59. ｍＲＮＡ溶液は約３ｍＭのシトレートを含む、請求項５７に記載の方法。
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