KR20230087536A

KR20230087536A - Mrna-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 프로세스

Info

Publication number: KR20230087536A
Application number: KR1020237015826A
Authority: KR
Inventors: 시리랑 카르베; 트래비스 지놋; 모닉 샤; 이 장; 킴벌리 길리스; 프랭크 데로사
Original assignee: 트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2021-10-12
Publication date: 2023-06-16
Also published as: JP2023545128A; CA3198411A1; US20220110884A1; IL301973A; AU2021361986A1; CN116490166A; EP4225272A1; WO2022081544A1

Abstract

본 발명은 지질 나노입자를 제형화하고 mRNA를 캡슐화하기 위한 개선된 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 지질 나노입자에 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 낮은 구연산염 농도를 포함하는 mRNA 용액과 지질 용액을 주변 온도에서 혼합하는 단계를 포함한다. 따라서, 본 발명은 mRNA를 지질 나노입자에 캡슐화하는 효과적이고, 신뢰할 수 있는, 에너지 절감 및 비용 효율적인 방법을 제공한다.

Description

MRNA-로딩된 지질 나노입자를 제조하는 개선된 프로세스

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2020년 10월 12일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/090,513호의 우선권을 주장하며, 그 개시 내용은 본원에 참조로서 통합된다.

전령 RNA 요법(MRT)은 다양한 질환의 치료에 점점 더 중요한 접근법이 되고 있다. MRT는 환자의 신체 내에서 mRNA에 의해 암호화된 단백질을 생산하기 위한 요법을 필요로 하는 환자에게 전령 RNA(mRNA)를 투여하는 것을 포함한다. 지질 나노입자는 mRNA의 효율적인 생체 내 전달을 위해 mRNA를 캡슐화하는 데 일반적으로 사용된다. 지질 나노입자 전달을 개선하기 위해, 생체 내 전달 및/또는 mRNA의 발현에 영향을 줄 수 있고 확장 가능하고 비용 효율적인 제조 프로세스에 적용될 수 있는 신규한 방법과 조성물을 식별하기 위한 많은 노력이 이루어져 왔다.

본 발명은, 무엇보다도, mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 개선되고 효율적이며 비용 효율적인 프로세스를 제공한다. 본 발명은 낮은 농도의 구연산염(즉, ≤5 mM)을 함유하는 mRNA 용액과 지질 용액을 주변 온도에서 (mRNA 용액 및/또는 지질 용액을 미리 가열하지 않고) 혼합함으로써 높은 캡슐화 효율, mRNA 회수 속도, 및 보다 균질하고 보다 작은 입자 크기를 초래하였다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 지질 나노입자로 mRNA를 캡슐화하는 효과적이고, 신뢰할 수 있고, 에너지-절감적이며, 비용 효율적이고, 보다 안전한 방법을 제공하며, 이는 열 및 고 에너지를 사용하지 않고 대규모 제조 프로세스 치료 응용예에 사용될 수 있다.

일 양태에서, 본 발명은 특히, 전령 RNA (mRNA)를 지질 나노입자 (LNP)에 캡슐화하는 프로세스를 제공하며, (a) 하나 이상의 mRNA를 포함하는 mRNA 용액과 (b) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 혼합하여 LNP 형성 용액에서 LNP(mRNA-LNP) 내에 캡슐화된 mRNA를 형성하는 단계를 포함하되, 상기 mRNA 용액은 5 mM 미만의 구연산염을 포함하고, 상기 mRNA-LNP는 60% 초과의 캡슐화 효율을 갖는다.

일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 혼합 전에 주변 온도에서 존재한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액과 지질 용액은 주변 온도에서 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액과 지질 용액은 혼합 후 주변 온도에서 유지된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 내에서 mRNA를 캡슐화하는 프로세스는 주변 온도에서 가열하지 않고 수행된다.

일부 구현예에서, 주변 온도는 약 35℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 32℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 30℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 28℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 26℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 25℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 24℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 23℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 22℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 21℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 20℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 19℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 18℃ 미만이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 16℃ 미만이다.

일부 구현예에서, 주변 온도는 약 15~35℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 16~32℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 17~30℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 18~30℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 20-28℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 20~26℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 20~25℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 21~24℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 21~23℃의 범위이다.

일부 구현예에서, 주변 온도는 약 16℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 18℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 20℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 20℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 21℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 22℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 23℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 24℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 25℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 26℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 27℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 28℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 30℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 31℃이다. 일부 구현예에서, 주변 온도는 약 32℃이다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 10 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 8.6 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 6.0 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 5.0 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4.0 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.0 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.5 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.25 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.0 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.9 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.8 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.7 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.6 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.5 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.4 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.3 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.25 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.2 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.1 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.05 mM 미만의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0~10 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.5~7.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.0~5.0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5~3.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.1 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.2 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.25 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.3 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.4 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.6 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.7 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.8 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 0.9 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.25 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1.75 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4.0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4.5 mM의 구연산염 완충액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 5.0 mM의 구연산염 완충액을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 트레할로스를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 20% 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 15% 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 10% 트레할로스를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 5% 트레할로스를 포함한다.

일부 구현예에서, 프로세스는 mRNA 용액 및/또는 지질 용액을 가열하는 단계를 필요로 하지 않는다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 12 L의 mRNA 용액 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 10 L의 mRNA 용액 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 8 L의 mRNA 용액 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 6 L의 mRNA 용액 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 4 L의 mRNA 용액 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 2 L의 mRNA 용액 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 mRNA 용액 1 L 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 0.1 mg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 0.125 mg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 0.25 mg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 0.5 mg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 1.0 mg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 1.5 mg/mL 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 내 mRNA의 농도는 약 2.0 mg/mL 초과이다.

일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 1:1 내지 10:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 2:1 내지 6:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 2:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 3:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 4:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 5:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 6:1의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 2:1 초과의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 3:1 초과의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 4:1 초과의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 5:1 초과의 비율(v/v)로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 6:1 초과의 비율(v/v)로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 2.5 내지 5.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 3.0 내지 5.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 3.5 내지 4.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 5.5의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 25 mM 내지 500 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 37.5 mM 내지 350 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 75 mM 내지 300 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 100 mM 내지 300 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 150 mM 내지 300 mM의 NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 37.5 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 75 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 100 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 125 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 150 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 175 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 200 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 225 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 250 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 300 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 350 mM NaCl을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 3.5의 pH를 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 4.0의 pH를 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 100 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.0 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3.5 mM 구연산염, 약 300 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함한다.

일부 구현예에서, 프로세스는 mRNA-LNP의 혼합 후 인큐베이션 단계를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 21℃ 내지 65℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 25℃ 내지 60℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 30℃ 내지 55℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 35℃ 내지 50℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 26℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 30℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 31℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 32℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 35℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 38℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 40℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 42℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 45℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 50℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 55℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 60℃의 온도에서 인큐베이션된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 65℃의 온도에서 인큐베이션된다.

일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 20분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 30분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 40분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 50분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 60분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 70분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 80분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 90분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 100분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 120분 이상 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 30분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 40분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 50분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 60분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 70분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 80분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 100분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 120분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 150분 동안 배양된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 약 180분 동안 배양된다.

일부 구현예에서, 지질 용액은 50% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 40% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 30% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 25% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 20% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 15% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 10% 미만의 비수성 용매를 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 50% 미만의 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 40% 미만의 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 30% 미만의 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 25% 미만의 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 20% 미만의 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 15% 미만의 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 10% 미만의 에탄올을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 40% 에탄올에 혼합되어, 지질 나노입자의 현탁액을 생성한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 20% 에탄올에 혼합되어, 지질 나노입자의 현탁액을 생성한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 15% 에탄올에 혼합되어, 지질 나노입자의 현탁액을 생성한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 10% 에탄올에 혼합되어, 지질 나노입자의 현탁액을 생성한다.

일부 구현예에서, 지질 용액은 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 지질 나노입자는 추가로 정제된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration)에 의해 정제된다.

일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 200 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 180 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 150 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 100 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 90 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 80 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 70 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 60 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 50 nm 미만의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 40 nm 미만의 평균 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 나노입자는 40~150 nm 범위의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자는 60~100 nm 범위의 평균 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자는 40~70 nm 범위의 평균 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 0.3 미만의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 0.2 미만의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 0.18 미만의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 0.15 미만의 PDI를 갖는다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 약 0.1 미만의 PDI를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 60% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 65% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 70% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 75% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 80% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 85% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 90% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 95% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 96% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 97% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 98% 초과의 캡슐화율을 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 지질 나노입자는 약 99% 초과의 캡슐화율을 갖는다.

일부 구현예에서, N/P 비율은 1 내지 10이다. 일부 구현예에서, N/P 비율은 2 내지 6이다. 일부 구현예에서, N/P 비율은 약 4이다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 1 내지 10의 N/P 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 2 내지 6의 N/P 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 2의 N/P 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 4의 N/P 비율로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 6의 N/P 비율로 혼합된다.

일부 구현예에서, 5 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 10 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 15 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 20 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 25 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 30 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 40 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 50 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 75 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 100 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 150 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 200 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 250 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 500 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 750 g 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 1 kg 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 5 kg 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 10 kg 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액 및 지질 용액은 무펄스 유동 펌프(pulse-less flow pump)를 사용하여 혼합된다. 일부 구현예에서, 펌프는 기어 펌프(gear pump)이다. 일부 구현예에서, 펌프는 삼투 펌프(centrifugal pump)이다. 일부 구현예에서, 펌프는 연동 펌프(peristaltic pump)이다.

일부 구현예에서, 완충액은 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 또는 4800~6000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 220 ml/분, 약 600 ml/분, 약 1200 ml/분, 약 2400 ml/분, 약 3600 ml/분, 약 4800 ml/분, 또는 약 6000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, 구연산염 완충액은 약 100~300 ml/분, 300~600 ml/분, 600~1200 ml/분, 1200~2400 ml/분, 2400~3600 ml/분, 3600~4800 ml/분, 또는 4800~6000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 구연산염 완충액은 약 220 ml/분, 약 600 ml/분, 약 1200 ml/분, 약 2400 ml/분, 약 3600 ml/분, 약 4800 ml/분, 또는 약 6000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 150~250 ml/분, 약 250~500 ml/분, 약 500~1000 ml/분, 약 1000~2000 ml/분, 약 2000~3000 ml/분, 약 3000~4000 ml/분, 또는 약 4000~5000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 200 ml/분, 약 500 ml/분, 약 1000 ml/분, 약 2000 ml/분, 약 3000 ml/분, 약 4000 ml/분, 또는 약 5000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 100 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 200 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 400 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 500 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 600 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 800 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1000 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1200 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1400 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1600 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1800 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2000 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2400 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3000 ml/분의 흐름으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4000 ml/분의 흐름으로 혼합된다.

일부 구현예에서, 지질 용액은 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속과 동일하다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 2배 더 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 3배 더 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 4배 더 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 4.5배 더 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 5배 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 6배 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 8배 더 빠르다. 일부 구현예에서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 10배 빠르다.

일부 구현예에서, mRNA-LNP 캡슐화 효율은, 10 mM 구연산염을 갖는 mRNA 용액과는 달리 동일한 조건 하에서 지질 용액과 혼합된 mRNA 용액으로부터 형성된 mRNA와 비교하여 적어도 5% 더 높다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP 캡슐화 효율은, 10 mM 구연산염을 갖는 mRNA 용액과는 달리 동일한 조건 하에서 지질 용액과 혼합된 mRNA 용액으로부터 형성된 mRNA와 비교하여 적어도 10% 더 높다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP 캡슐화 효율은, 10 mM 구연산염을 갖는 mRNA 용액과는 달리 동일한 조건 하에서 지질 용액과 혼합된 mRNA 용액으로부터 형성된 mRNA와 비교하여 적어도 15% 더 높다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP 캡슐화 효율은, 10 mM 구연산염을 갖는 mRNA 용액과는 달리 동일한 조건 하에서 지질 용액과 혼합된 mRNA 용액으로부터 형성된 mRNA와 비교하여 적어도 20% 더 높다.

일 양태에서, 본 발명은, 무엇보다도, 본 발명의 프로세스에 의해 제조된 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, 조성물은 1 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 5 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 10 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 15 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 20 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 25 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 50 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 75 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 100 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 125 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 150 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 250 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 500 g 이상의 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 1 kg 이상의 mRNA를 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 변형 뉴클레오티드를 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA는 변형되지 않는다.

일부 구현예에서, mRNA는 약 0.5 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 1 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 2 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 3 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 4 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 5 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 6 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 8 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 10 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 20 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 30 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 40 kb 초과이다. 일부 구현예에서, mRNA는 약 50 kb 초과이다.

일 양태에서, 전령 RNA (mRNA)를 지질 나노입자 (LNP)에 캡슐화하는 프로세스로서, (a) 하나 이상의 mRNA를 포함하는 mRNA 용액과 (b) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 혼합하여 LNP 형성 용액에서 LNP(mRNA-LNP) 내에 캡슐화된 mRNA를 형성하는 단계를 포함하되, 상기 mRNA 용액은 0.1 mM 내지 5 mM 의 구연산염을 포함하고, 상기 mRNA-LNP는 60% 초과의 캡슐화 효율을 갖는, 방법이 제공된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1 mM 내지 5 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1 mM 내지 4 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1 mM 내지 3 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1 mM 내지 2 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2 mM 내지 3 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3 mM 내지 4 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4 mM 내지 5 mM의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 1 mM 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 2 mM 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 3 mM 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 4 mM 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 5 mM 구연산염을 포함한다.

본 발명의 다른 특징, 목적 및 이점은 이어지는 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위에서 자명해진다. 하지만, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 도면 및 청구범위가 본 발명의 구현예를 나타내지만, 이는 제한을 위해서가 아니라 단지 예시를 위해 주어지는 것임을 이해해야 한다. 본 발명의 범주 내에서의 다양한 변형 및 수정이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백해질 것이다.

도 1은 mRNA 용액 중 다양한 농도의 구연산염으로 제조된 mRNA-LNP의 캡슐화 효율을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 혼합 후 인큐베이션 전(0분) 및 후(90분)에 캡슐화 효율을 측정하였다.
도 2는 mRNA 용액 중 다양한 농도의 염화나트륨으로 제조된 mRNA-LNP의 캡슐화 효율을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 혼합 후 인큐베이션 전(0분) 및 후(90분)에 캡슐화 효율을 측정하였다.
도 3은 mRNA 용액 중 다양한 농도의 구연산염 및 염화나트륨으로 제조된 mRNA-LNP의 캡슐화 효율을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 혼합 후 인큐베이션 전(0분) 및 후(90분)에 캡슐화 효율을 측정하였다.
도 4는 상이한 비율(v/v)의 mRNA 용액:지질 용액으로 제조된 mRNA-LNP의 캡슐화 효율을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 혼합 후 인큐베이션 전(0분) 및 후(90분)에 캡슐화 효율을 측정하였다.
도 5는 혼합 프로세스 동안 다양한 유속으로 제조된 mRNA-LNP의 캡슐화 효율을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 혼합 후 인큐베이션 전(0분) 및 후(90분)에 캡슐화 효율을 측정하였다.

정의

본 발명을 보다 용이하게 이해하기 위하여, 우선적으로 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체를 통하여 설명된다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본원에서 참조된 출판물 및 기타 다른 참고물은 참조로서 본원에 의해 포함된다.

아미노산: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “아미노산”은 그의 가장 넓은 의미로, 폴리펩티드 사슬에 통함될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 구현예에서, 아미노산은 일반적인 구조인 H₂N-C(H)(R)-COOH를 가진다. 일부 구현예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 실시예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고, 일부 실시예에서 아미노산은 D-아미노산이며; 일부 실시예에서 아미노산은 L-아미노산이다. “표준 아미노산”은 주로 자연 발생 펩티드에서 발견되는 20종의 표준 l-아미노산 중 어느 하나를 지칭한다. “비표준 아미노산”은 합성으로 제조되었는지 또는 천연 공급원으로부터 수득한 것인지에 상관업이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, “합성 아미노산”은 염, 아미노산 유도체(예: 아미드), 및/또는 치환물을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산을 망라하지만 이들로 한정되지는 않는다. 펩티드의 카복시-말단 아미노산 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하여, 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기에 의해 변형되고/되거나, 펩티드의 활성에 악영향을 미치지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학적 작용기와의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화(disulfide) 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 예를 들어 하나 이상의 화학적 엔티티(entities)(예: 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포밀 모이어티(formyl moieties), 이소프레노이드기, 설페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 바이오틴(biotin) 모이어티 등)와 같은 하나 이상의 번역후 변형을 포함할 수 있다. 용어 “아미노산”은 “아미노산 잔기”와 상호교환적으로 사용되고, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 말할 수 있다. 유리 아미노산을 언급하는지 펩티드의 잔기를 언급하는지는 이 용어가 사용되는 문맥으로부터 분명해질 것이다.

동물(animal): 본원에서 사용되는 용어 “동물”은 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 일부 구현예에서, “동물”은 임의의 발달 단계에 있는 인간을 지칭한다. 일부 구현예에서, “동물”은 임의의 발달 단계에 있는 비인간 동물을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 비인간 동물은 포유류(예: 설치류, 마우스, 랫트, 토끼, 원숭이, 개, 고양이, 양, 소, 영장류 및/또는 돼지)이다. 일부 구현예에서, 동물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류, 곤충, 및/또는 벌레를 포함하되 이에 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 동물은 유전자 이식 동물, 유전자 조작 동물, 및/또는 클론일 수 있다.

대략(approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 용어 “대략(approximately)”또는 “약(about)”은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 구현예에서, 용어 “대략”또는 “약”은, 달리 진술되거나 달리 문맥으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 나타낸다.

조합(combining): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “조합”은 혼합 또는 배합과 상호 교환적으로 사용된다. 조합은, mRNA-LNP 조성물을 수득하기 위해, 구별되는 특성을 갖는 이산된 LNP 입자들을 동일한 용액에서 서로 합치는 것, 예를 들어 mRNA-LNP와 빈 LNP를 조합하는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 2개의 LNP를 조합하는 것은 조합되는 성분의 특정 비율로 수행된다. 일부 구현예에서, 조합에 의해 생성된 조성물은 이의 성분 중 어느 하나 또는 둘 다와 구별되는 특성을 갖는다.

전달: 본원에서 사용되는 용어 “전달”은 국소적인 전달과 전신 전달 둘 다를 망라한다. 예를 들어, mRNA의 전달은 mRNA가 표적 조직에 전달되고 코딩된 단백질이 발현되고 표적 조직 내에 유지되는 상황(“국소 분포”또는 “국소 전달”이라고도 함) 및 mRNA가 표적 조직에 전달되고 코딩된 단백질이 발현되고 환자의 순환계(예: 혈청)에 분비되며 전신에 분포되어 다른 조직에 의해 흡수된 상황(“전신 분포”또는 “전신 전달”이라고도 함)을 망라한다. 일부 구현예에서, 전달은 예를 들어 분무화(nebulization)를 포함하는 폐 전달이다.

효능: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “효능”또는 문법적으로 동등한 표현은, 관련 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 전달과 관련하여, 생물학적으로 관련된 평가변수가 개선되는 것을 지칭한다. 일부 구현예에서, 생물학적 평가변수는 투여 후 소정의 시점에 염화암모늄 접종에 대항하여 보호하는 것이다.

캡슐화: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 핵 분자를 나노입자 내에 혼입하는 프로세스를 지칭한다.

발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산 서열의 “발현”은 mRNA가 폴리펩티드로 번역되는 것, 다수의 폴리펩티드(예: 항체의 중쇄 또는 경쇄)가 온전한 단백질(예: 항체)로 조립되는 것, 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 조립된 단백질(예: 항체)가 번역 후 변형시키는 것을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 “발현”및 “생산”및 문법적으로 동등한 표현은 상호교환적으로 사용된다.

개선(improve), 증가(increase) 또는 감소(reduce): 본원에서 사용되는, 용어 “개선하다”“증가하다”또는 “감소하다”또는 문법적으로 동등한 표현은 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정치 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 대상체(또는 다수의 대조군 대상체)에서의 측정치와 같은 기준선 측정치(baseline measurement)와 관련된 값들을 나타낸다. “대조군 대상체”는 치료 받는 대상체와 동일한 형태의 질환에 걸린, 치료 받는 대상체와 거의 동일한 연령인 대상체이다.

불순물(impurities): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “불순물”은 구속된 양의 액체, 기체 또는 고체 내부에 있는 물질로서, 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한 물질을 지칭한다. 불순물은 오염물로도 지칭된다.

시험관내(in vitro): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “생체외(in vitro)”는 다세포 유기체 내가 아니라 예컨대, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 말한다.

생체내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “생체내(in vivo)”는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 말한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 상기 용어는 (예를 들어, 생체외 시스템에 반대되는) 활세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.

단리된(isolated): 본원에서 사용되는 바, 용어 “분리된”은 (1) 최초에 생산되었을 때(자연적이고/이거나 실험 환경이거나) 결합된 적어도 일부의 구성 성분으로부터 분리된 및/또는 (2) 사람의 손에 의해 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 엔티티(entity)를 말한다. 단리된 물질 및/또는 엔티티는 최초에 결합된 다른 구성 성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 구현예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 보다 높은 순도이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 다른 성분이 없는 경우, 물질은 “순수”하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 엔티티의 순도 백분율의 계산에는 부형제(예: 완충액, 용매, 물 등)가 포함되지 않아야 한다.

리포솜(liposome): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “리포솜”은 임의의 박막(lamellar) 소낭, 다층막(multilamellar) 소낭, 또는 고형분 나노입자 소낭을 지칭한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 리포솜은 하나 이상의 지질을 혼합하거나 하나 이상의 지질 및 폴리머(들)를 혼합하여 형성될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 양이온성 지질(들), 및 임의로 비-양이온성 지질(들), 임의로 콜레스테롤계 지질(들), 및/또는 PEG-변형 지질(들)을 함유한다.

국소 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는 용어 "국소 분포", "국소 전달" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 조직 특이적 전달 또는 분포를 지칭한다. 일반적으로, 국소 분포 또는 전달은 mRNA에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질(예: 효소)이 세포 내에서 번역되고 발현되는 것을 필요로 하거나, 제한적으로 분비되어 환자의 순환계 내로 들어가지 않는 것을 필요로 한다.

전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “전령 RNA(mRNA)”는 적어도 하나의 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, mRNA는 변형 및 비변형 RNA 둘 다를 망라한다. mRNA는 하나 이상의 코딩 및 비코딩 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용해 생산되고 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. mRNA 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5’에서 3’방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예: 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 슈도우리딘, 및 5-메틸시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예: 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예: 2’플루오로리보스, 리보스, 2’디옥시리보스, 아라비노오스 및 헥소오스(hexose)); 및/또는 변형된 포스페이트기(예: 포스포로티오에이트(phosphorothioates) 및 5’포스포아미다이트(5’결합)이거나 또는 이들을 포함한다.

N/P 비율:본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “비율”은 지질 나노입자 내에서 캡슐화된 mRNA 중 음으로 하전된 분자 단위 대비 해당 지질 나노입자에서 양이온성 지질 중 양으로 하전된 분자 단위의 몰비를 지칭한다. 이와 같이, N/P 비율은 일반적으로, 지질 나노입자 내에서 캡슐화된 mRNA 중 인산염 기의 몰 대비 해당 지질 나노입자에서 양이온성 지질 중 아민 기의 몰의 비율로 계산된다.

핵산: 본원에서 사용되는 바, 용어 “핵산”은 가장 넓은 의미로 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 말한다. 일부 구현예에서, 핵산은 인산디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 구현예에서, “핵산”은 개별 핵산 잔기(예: 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 구현예에서, “핵산”은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 구현예에서, “핵산”은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중 가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 백본 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당업계에 공지되어 있고, 백본 내에 인산다이에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 갖는, 소위 "펩티드 핵산"은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 용어 “아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열”은 서로의 축퇴형 버전(degenerate version)이고/이거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 RNA는 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있고, 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있다. 적절한 경우, 예컨대, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 백본 변형체 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5’에서 3’방향으로 제시된다. 일부 구현예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예: 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체(예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예: 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예: 2’플루오로리보스, 리보스, 2’디옥시리보스, 아라비노오스 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예: 포스포로티오에이트 및 5’포스포아미다이트 결합)이거나 이들을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 구체적으로는, 전달을 용이하게 하거나 전달을 달성하기 위해 화학적으로 변형되지 않은 핵산(예: 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함하는, 뉴클레오티드 및 잔기)를 의미하는 “비변형 핵산”에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 뉴클레오티드 T 및 U는 서열 설명에서 상호 교환적으로 사용된다.

환자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “환자”또는 “대상체”는 예컨대, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예: 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 구현예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다.

약학적으로 허용 가능한(pharmaceutically acceptable): 본원에서 사용된, 용어 “약학적으로 허용 가능한”은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간과 동물의 조직과의 접촉에 있어 사용에 적합하고, 합리적인 유익성/위험성 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 물질을 지칭한다.

약학적으로 허용 가능한 염: 약학적으로 허용 가능한 염은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용 가능한 염에 대해 문헌[J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19]에서 상세하게 기술하고 있다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은 적합한 무기 및 유기 산과 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 비독성 산 첨가염의 예는 예컨대 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예컨대 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 구연산염, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용 가능한 염은 아디핀산염(adipate), 알지네이트(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠설폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 캄퍼산염(camphorate), 캄퍼설폰산염(camphorsulfonate), 구연산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 다이글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄설폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-하이드록시-에탄설폰산염(2-hydroxy-ethanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄설폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌설폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 파모산염(pamoate), 펙티닌산염(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔설폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 및 N⁺(C_1-4알킬)₄염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 약학적으로 허용 가능한 추가의 염은, 경우에 따라, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 (할로겐화물, 수산화물, 카르복시산염, 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온을 사용하여 형성된) 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용가능한 염은 예컨대 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로 형성된 염을 포함한다.

효험(potency): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “효험”또는 문법적으로 동등한 표현은 mRNA에 의해 암호화되는 단백질(들) 또는 펩티드(들)의 발현 수준 및/또는 이에 기인하는 생물학적 효과를 지칭한다.

염: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “염”은 산과 염기 사이의 중화 반응에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 이온 화합물을 지칭한다.

전신 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는, 용어 “전신 분포”또는 “전신 전달”또는 문법적으로 동등한 표현은 전신 또는 전체 유기체에 영향을 주는 전달 또는 분포 메커니즘 또는 접근법을 지칭한다. 일반적으로 전신 분포 또는 전달은 예컨대 혈류와 같은 신체의 순환계를 통해 달성된다. “국소 분포 또는 전달”의 정의와 비교됨.

대상체(subject): 본원에서 사용되는, 용어 “대상체”는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예: 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 많은 구현예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 가는 인간을 지칭하는 것으로, 환자일 수 있다. 용어 “대상체”는 본원에서 “개인”또는 “환자”와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.

실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “실질적으로(substantially)”는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 당업자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 (설사 있다 하더라도) 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 “실질적으로”는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.

표적 조직(Target tissues): 본원에서 사용되는, 용어 “표적 조직”은 치료 대상 질환이 발생된 임의의 조직을 지칭한다. 일부 구현예에서, 표적 조직은 질환 관련 병상, 증상 또는 특징을 나타내는 조직들을 포함한다.

치료 유효량(Therapeutically effective amount): 본원에서 사용되는, 용어 치료제의 “치료 유효량”은 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 취약한 대상체에 투여했을 때, 질환, 장애 및/또는 병태의 증상(들)의 발현을 치료, 진단, 예방 및/또는 지연하는 데 충분한 양을 의미한다. 당업자라면 치료 유효량이 일반적으로 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여되는 것을 인정할 것이다.

치료 지수: 본원에서 사용되는 바와 같이, “치료 지수”는 약물이 독성으로 변하는 혈중 약물 농도와 약물이 효과적인 농도의 비율이다. 치료 지수가 클수록 약물은 더 안전하다.

치료: 본원에서 사용되는, 용어 “치료(treat, treatment, 또는 treating)”는 부분적으로 또는 완전하게 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 지칭한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상체에 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.

수율: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 “수율(yield)”은 출발 물질로서의 총 mRNA과 비교해 캡슐화 후 회수된 mRNA의 백분율을 지칭한다. 일부 구현예에서, 용어 “회수(recovery)”는 용어 “수율”과 상호 교환적으로 사용된다.

발명을 실시하기 위한 구체적인 내용

본 발명은 프로세스가 가열 단계를 필요로 하지 않도록 mRNA 치료 조성물을 생산하기 위한 지질 나노입자(LNP) 제형에 캡슐화된 mRNA를 제조하기 위한 개선된 프로세스를 제공한다. 본 발명은 (mRNA 용액 및/또는 지질 용액을 예열하지 않고) 주변 온도에서 낮은 구연산염 완충액 및 지질 용액 중의 mRNA 용액을 혼합함으로써 높은 캡슐화 효율, mRNA 회수 속도, 및 보다 균질하고 보다 작은 입자 크기를 초래하였다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 열을 사용하지 않고도 치료 응용예의 대규모 제조 프로세스에 사용될 수 있는 효과적이고, 신뢰할 수 있으며, 에너지 절약적이고, 비용 효율적이며 더 안전한, 지질 나노입자에 mRNA를 캡슐화하는 방법을 제공한다.

mRNA를 캡슐화하는 리포솜의 형성

본원에 개시된 지질 나노입자로 mRNA를 캡슐화하는 방법은 당업계에 현재 공지된 다양한 기술에 적용될 수 있다. 다양한 방법이 공개된 미국 특허 출원 제2011/0244026호, 공개된 미국 특허 출원 제2016/0038432호, 공개된 미국 특허 출원 제2018/0153822호, 공개된 미국 특허 출원 제2018/0125989호, 및 2019년 7월 23일에 출원한 미국 특허 가출원 제62/877,597호에 기술되어 있고, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있으며, 이들 문헌 모두는 본원에 참조로서 통합된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 프로세스 A는, 미국 특허 제2016/0038432호에 기술된 바와 같이, 먼저 지질을 지질 나노입자로 미리 형성하지 않고, mRNA를 지질의 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 종래의 방법을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 프로세스 B는, 미국 특허 제2018/0153822호에 기술된 바와 같이, 미리 형성된 지질 나노입자를 mRNA와 혼합함으로써 전령 RNA(mRNA)를 캡슐화하는 프로세스를 지칭한다.

핵산의 전달을 위해서는, 높은 캡슐화 효율을 달성하는 것이 원료 의약품(예: mRNA)의 보호를 달성하고 생체 내 활성 손실을 감소시키는 데 중요하다. 따라서, mRNA에 의해 암호화된 단백질 또는 펩티드의 발현 강화 및 이의 치료 효과는 mRNA 캡슐화 효율과 고도로 상관된다.

전술한 프로세스 A를 사용하여 높은 캡슐화 효율을 달성하기 위해, 상기 프로세스는 일반적으로 10mM 구연산염 완충액에서 하나 이상의 용액을 주변 온도보다 높은 온도로 가열(또는 높은 온도에서 유지)하는 단계(즉, 열원으로부터 해당 용액에 열을 가하는 단계)를 포함한다. 공개된 미국 특허 출원 제US 2016/0038432호에 기술된 바와 같이, 하나 이상의 용액을 가열하는 것은 mRNA 캡슐화 효율 및 회수율을 증가시킨다. 또한, 상기 프로세스 A는 일반적으로 mRNA 및/또는 지질 용액 중의 완충액으로서 10~100 mM 구연산염을 포함한다. 그러나, 제조 관점에서, mRNA 및/또는 지질 용액을 가열하는 것은 많은 에너지와 비용을 필요로 한다. 따라서, 일 양태에서, 본 발명은 열을 사용하지 않고도 치료 응용예의 대규모 제조 프로세스에 사용될 수 있는 안전하고 비용 효율적인, 지질 나노 입자에 mRNA를 캡슐화하는 방법을 제공한다. 본 발명은, mRNA 용액에서 낮은 농도의 구연산염(즉, ≤ 5mM)을 사용함으로써, 혼합 전에 mRNA 및/또는 지질 용액을 가열하지 않고서 높은 캡슐화 속도가 달성될 수 있는 프로세스를 처음으로 개시하였다.

mRNA 용액

본 발명에 적절한 mRNA 용액은 다양한 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 본원에 기술된 완충액에 직접 용해될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은, 캡슐화를 위해 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합하기 전에 mRNA 스톡 용액과 완충액을 혼합함으로써 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은, 캡슐화를 위해 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합하기 직전에 mRNA 스톡 용액과 완충액을 혼합함으로써 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 물 중 mRNA를 약 0.2 mg/ml, 0.4 mg/ml, 0.5 mg/ml, 0.6 mg/ml, 0.8 mg/ml, 1.0 mg/ml, 1.2 mg/ml, 1.4 mg/ml, 1.5 mg/ml, 1.6 mg/ml, 또는 2.0 mg/ml 이상의 농도로 함유할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 원액은 약 0.2 mg/ml 이상의 농도로 물 중에 mRNA를 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 0.4 mg/ml 이상의 농도로 물 중에 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 0.5 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 0.6 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 0.8 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 1.0 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 1.2 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 1.4 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 1.5 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 1.6 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 2.0 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 물 중 mRNA를 약 2.5 mg/ml, 3.0 mg/ml, 3.5 mg/ml, 4.0 mg/ml, 4.5 mg/ml, 또는 5.0 mg/ml 이상의 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 스톡 용액은 약 1 mg/ml, 약 10 mg/ml, 약 50 mg/ml, 또는 약 100 mg/ml 이상의 농도로 mRNA를 함유한다.

일반적으로, 적절한 mRNA 용액은 완충제 및/또는 염을 함유할 수도 있다. 일반적으로, 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 적절한 농도는 약 0.1 mM 내지 100 mM, 0.5 mM 내지 90 mM, 1.0 mM 내지 80 mM, 2 mM 내지 70 mM, 3 mM 내지 60 mM, 4 mM 내지 50 mM, 5 mM 내지 40 mM, 6 mM 내지 30 mM, 7 mM 내지 20 mM, 8 mM 내지 15 mM, 또는 9 내지 12 mM의 범위일 수 있다. 일부 구현예에서, 완충제의 적절한 농도는 2.0 mM 내지 4.0 mM의 범위일 수 있다.

일부 구현예에서, 완충액은 약 5 mM 미만의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3 mM 미만의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 1 mM 미만의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 0.5 mM 미만의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 0.25 mM 미만의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 0.1 mM 미만의 구연산염을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 구연산염을 포함하지 않는다.

예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 용액 중 염의 적절한 농도는 약 1 mM 내지 500 mM, 5 mM 내지 400 mM, 10 mM 내지 350 mM, 15 mM 내지 300 mM, 20 mM 내지 250 mM, 30 mM 내지 200 mM, 40 mM 내지 190 mM, 50 mM 내지 180 mM, 50 mM 내지 170 mM, 50 mM 내지 160 mM, 50 mM 내지 150 mM, 또는 50 mM 내지 100 mM의 범위일 수 있다. 적절한 mRNA 용액 중 염 농도는 약 1 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 30 mM, 40 mM, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 또는 100 mM 이상이다.

일부 구현예에서, 완충액은 약 300 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 200 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 175 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 150 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 100 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 75 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 50 mM NaCl을 포함한다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 25 mM NaCl을 포함한다.

일부 구현예에서, 적절한 mRNA 용액은 약 3.5~6.5, 3.5~6.0, 3.5~5.5, 3.5~5.0, 3.5~4.5, 4.0~5.5, 4.0~5.0, 4.0~4.9, 4.0~4.8, 4.0~4.7, 4.0~4.6, 또는 4.0~4.5 범위의 pH를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 용액은 약 3.5, 4.0, 4.1, 4.2, 4.3, 4.4, 4.5, 4.6, 4.7, 4.8, 4.9, 5.0, 5.2, 5.4, 5.6, 5.8, 6.0, 6.1, 6.3, 및 6.5 이하의 pH를 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 완충액은 약 5.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.8의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.4의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.3의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.2의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.1의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 4.0의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3.9의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3.8의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3.7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3.6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3.5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 3.4의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 펌프를 사용하여 완충액과 혼합된다. 예시적인 펌프는 무펄스 유동 펌프, 기어 펌프, 연동 펌프, 및 원심 펌프를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

일반적으로, 완충액은 mRNA 스톡 용액의 속도보다 더 높은 속도로 혼합된다. 예를 들어, 완충액은 mRNA 스톡 용액의 속도보다 적어도 1x, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, 10x, 15x, 또는 20x 더 높은 속도로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 100 내지 6000 ml/분(예: 약 100 내지 300 ml/분, 300 내지 600 ml/분, 600 내지 1200 ml/분, 1200 내지 2400 ml/분, 2400 내지 3600 ml/분, 3600 내지 4800 ml/분, 4800 내지 6000 ml/분, 또는 60 내지 420 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, 완충액은 약 60 ml/분, 100 ml/분, 140 ml/분, 180 ml/분, 220 ml/분, 260 ml/분, 300 ml/분, 340 ml/분, 380 ml/분, 420 ml/분, 480 ml/분, 540 ml/분, 600 ml/분, 1200 ml/분, 2400 ml/분, 3600 ml/분, 4800 ml/분, 또는 6000 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 10 내지 600 ml/분(예: 약 5 내지 50 ml/분, 약 10 내지 30 ml/분, 약 30 내지 60 ml/분, 약 60 내지 120 ml/분, 약 120 내지 240 ml/분, 약 240 내지 360 ml/분, 약 360 내지 480 ml/분, 또는 약 480 내지 600 ml/분) 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 5 ml/분, 10 ml/분, 15 ml/분, 20 ml/분, 25 ml/분, 30 ml/분, 35 ml/분, 40 ml/분, 45 ml/분, 50 ml/분, 60 ml/분, 80 ml/분, 100 ml/분, 200 ml/분, 300 ml/분, 400 ml/분, 500 ml/분, 또는 600 ml/분 이상의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 10~30 ml/분, 약 30~60 ml/분, 약 60~120 ml/분, 약 120~240 ml/분, 약 240~360 ml/분, 약 360~480 ml/분, 또는 약 480~600 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 스톡 용액은 약 20 ml/분, 약 40 ml/분, 약 60 ml/분, 약 80 ml/분, 약 100 ml/분, 약 200 ml/분, 약 300 ml/분, 약 400 ml/분, 약 500 ml/분, 또는 약 600 ml/분의 유속으로 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액은 주변 온도에서 존재한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 20~25°의 온도에서 존재한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 약 21~23°의 온도에서 존재한다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 지질 용액과 혼합되기 전에 가열되지 않는다. 일부 구현예에서, mRNA 용액은 주변 온도에서 유지된다.

지질 용액

본 발명에 따르면, 지질 용액은 mRNA의 캡슐화를 위한 지질 나노입자를 형성하기에 적합한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 에탄올계이다. 예를 들어, 적합한 지질 용액은 순수 에탄올(즉, 100% 에탄올)에 용해된 바람직한 지질의 혼합물을 함유할 수 있다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 이소프로필 알코올계이다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 디메틸설폭시드계이다. 또 다른 구현예에서, 적절한 지질 용액은 에탄올, 이소프로필 알코올, 및 디메틸설폭시드를 포함하지만 이에 한정되지 않는 적절한 용매의 혼합물이다.

적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 다양한 농도로 함유할 수 있다. 예를 들어, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 약 0.1 mg/ml, 0.5 mg/ml, 1.0 mg/ml, 2.0 mg/ml, 3.0 mg/ml, 4.0 mg/ml, 5.0 mg/ml, 6.0 mg/ml, 7.0 mg/ml, 8.0 mg/ml, 9.0 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 또는 100 mg/ml 이상의 총 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 약 0.1 내지 100 mg/ml, 0.5 내지 90 mg/ml, 1.0 내지 80 mg/ml, 1.0 내지 70 mg/ml, 1.0 내지 60 mg/ml, 1.0 내지 50 mg/ml, 1.0 내지 40 mg/ml, 1.0 내지 30 mg/ml, 1.0 내지 20 mg/ml/ml, 1.0 내지 15 mg/ml/ml, 1.0 내지 10 mg/ml, 1.0 내지 9 mg/ml/ml, 1.0 내지 8 mg/ml, 1.0 내지 7 mg/ml, 1.0 내지 6ml, 또는 1.0 내지 5 mg/ml 범위의 총 농도로 함유할 수 있다. 일부 구현예에서, 적절한 지질 용액은 바람직한 지질의 혼합물을 최대 약 100 mg/ml, 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml, 또는 10 mg/ml의 총 농도로 함유할 수 있다.

임의의 바람직한 지질이 mRNA를 캡슐화하기에 적합한 임의의 비율로 혼합될 수 있다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 양이온성 지질, 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머), 및/또는 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다. 일부 구현예에서, 적합한 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 헬퍼 지질(예: 비양이온성 지질 및/또는 콜레스테롤 지질), 및/또는 하나 이상의 PEG화 지질을 포함하는 바람직한 지질의 혼합물을 함유한다.

일부 구현예에서, 지질 용액은 주변 온도에 있다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 약 20~25°의 온도에 있다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 약 21~23°의 온도에 있다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 지질 용액과 혼합되기 전에 가열되지 않는다. 일부 구현예에서, 지질 용액은 주변 온도에서 유지된다.

특정 구현예에서, 제공된 조성물은 리포솜을 포함하되, mRNA는 리포솜의 양 표면 상에 결합되어 동일한 리포솜 내에 캡슐화된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 제조하는 동안, 양이온성 리포솜은 정전기적 상호작용을 통해 mRNA와 결합할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 리포솜 내에 캡슐화된 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 mRNA 종은 동일한 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 mRNA 종은 상이한 리포솜 내에 캡슐화될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA는 지질 조성, 지질 성분의 몰비, 크기, 전하(제타 전위), 표적 리간드 및/또는 이들의 조합이 다른 하나 이상의 리포솜 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리포솜은 스테롤계 양이온 지질, 중성 지질, PEG-변형된 지질 및/또는 이들의 조합의 상이한 조성을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 리포솜은 리포솜을 생성하는 데 사용된 콜레스테롤계 양이온성 지질, 중성 지질, 콜레스테롤, 및 PEG-변형 지질의 상이한 몰비를 가질 수 있다.

캡슐화 프로세스

본원에서 사용되는 바와 같이, mRNA-로딩된 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 형성하는 방법은 용어 “캡슐화”또는 이의 문법적으로 다른 표현과 상호 교환적으로 사용된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 mRNA 용액을 지질 용액과 혼합함으로써 형성되며, 여기서 mRNA 용액 및/또는 지질 용액은 혼합 전에 주변 온도에서 유지된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액과 지질 용액을 혼합하여 mRNA가 지질 나노입자에 캡슐화되도록 한다. 이러한 용액은 제형 또는 캡슐화 용액으로도 지칭된다.

적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 에탄올과 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 에탄올, 약 15% 에탄올, 약 20% 에탄올, 약 25% 에탄올, 약 30% 에탄올, 약 35% 에탄올, 또는 약 40% 에탄올을 포함한다. 일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 이소프로필 알코올과 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 이소프로필 알코올, 약 15% 이소프로필 알코올, 약 20% 이소프로필 알코올, 약 25% 이소프로필 알코올, 약 30% 이소프로필 알코올, 약 35% 이소프로필 알코올, 또는 약 40% 이소프로필 알코올을 포함한다.

일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 다이메틸 설폭시드와 같은 용매를 포함한다. 예를 들어, 적합한 제형 또는 캡슐화 용액은 약 10% 다이메틸 설폭시드, 약 15% 다이메틸 설폭시드, 약 20% 다이메틸 설폭시드, 약 25% 다이메틸 설폭시드, 약 30% 다이메틸 설폭시드, 약 35% 다이메틸 설폭시드, 또는 약 40% 다이메틸 설폭시드를 포함한다.

일부 구현예에서, 적절한 제형 또는 캡슐화 용액은 완충제 또는 염을 함유할 수도 있다. 예시적인 완충제는 HEPES, 황산암모늄, 중탄산나트륨, 구연산나트륨, 아세트산나트륨, 인산칼륨, 및 인산나트륨을 포함할 수 있다. 예시적인 염은 염화나트륨, 염화마그네슘, 및 염화칼륨을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 에탄올, 구연산염 완충제, 및 기타 불안정화제는 mRNA를 첨가하는 동안 존재하지 않으며, 따라서 제형은 임의의 추가적인 하류 가공을 필요로 하지 않는다. 일부 구현예에서, 제형화 용액은 트레할로스를 포함한다. 불안정화제의 부재와 트레할로스 용액의 안정성은 mRNA-캡슐화 지질 나노입자의 제형화 규모를 쉽게 확장할 수 있게 하고 생산을 증가시킨다.

일부 구현예에서, 지질 용액은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질은 하나 이상의 콜레스테롤 지질을 또한 함유한다. 일부 구현예에서, 지질은 에탄올 스톡 용액으로 존재한다.

일부 구현예에서, 지질 및 mRNA 용액은 펌프 시스템을 사용해 혼합된다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템은 무펄스 유동 펌프(pulse-less flow pump)를 포함한다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템은 기어 펌프(gear pump)이다. 일부 구현예에서, 적절한 펌프는 연동 펌프(peristaltic pump)이다. 일부 구현예에서, 적절한 펌프는 삼투 펌프(centrifugal pump)이다. 일부 구현예에서, 펌프 시스템을 사용하는 방법은 대규모로 수행된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 상기 방법은 본원에 기술된 것과 같은 펌프를 사용해 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 1 g, 10 g, 50 g, 또는 100 mg의 mRNA 용액을 지질 나노입자 용액과 혼합하여 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 생성하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA와 지질 용액을 혼합하는 방법은 단계 (c) 이후에 적어도 약 1 mg, 5 mg, 10 mg, 50 mg, 100 mg, 500 mg, 1 g, 10 g, 50 g, 또는 100 mg 이상의 캡슐화된 mRNA를 함유하는 본 발명에 따른 조성물을 제공한다.

일부 구현예에서, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 지질 용액와 조합하는 단계는 펌프 시스템을 사용하여 수행된다. 이러한 조합하는 단계는 펌프를 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA와 지질 용액은 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 혼합된다. 일부 구현예에서, mRNA 용액과 지질 용액은 약 50 ml/분, 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분, 약 400 ml/분, 약 450 ml/분, 약 500 ml/분, 약 550 ml/분, 약 600 ml/분, 약 650 ml/분, 약 700 ml/분, 약 750 ml/분, 약 800 ml/분, 약 850 ml/분, 약 900 ml/분, 약 950 ml/분, 또는 약 1000 ml/분의 유속으로 용액에 혼합된다.

일부 구현예에서, mRNA 용액과 지질 용액을 혼합하는 단계는 임의의 펌프가 없는 상태로 수행된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 지질을 포함하는 용액, mRNA를 포함하는 용액, 및 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 주변 온도로 유지시키는 단계(즉, 열원으로부터 용액에 열을 인가하지 않는 단계)를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 mRNA 용액 및 지질 용액 중 하나 또는 둘 다를 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 전에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 지질을 포함하는 용액, 및 mRNA를 포함하는 용액 중 하나 이상을 주변 온도로 유지시키는 단계를 혼합 단계 동안에 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 방법은 혼합 단계 후에 지질 나노입자로 캡슐화된 mRNA를 주변 온도로 유지시키는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 35℃, 30℃, 25℃, 20℃, 또는 16℃ 이하이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 약 15~35℃, 약 15~30℃, 약 15~25℃, 약 15~20℃, 약 20~35℃, 약 25~35℃, 약 30~35℃, 약 20~30℃, 약 25~30℃, 또는 약 20~25℃의 범위이다. 일부 구현예에서, 용액 중 하나 이상이 유지되는 주변 온도는 20~25℃이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 상기 방법은 mRNA와 지질 용액을 혼합하여 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 형성하는 단계를 주변 온도에서 수행하는 것을 포함한다.

일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과는 약 150 nm 미만(예: 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노 입자의 실질적으로 전부는 150 nm 미만(예: 약 145 nm, 약 140 nm, 약 135 nm, 약 130 nm, 약 125 nm, 약 120 nm, 약 115 nm, 약 110 nm, 약 105 nm, 약 100 nm, 약 95 nm, 약 90 nm, 약 85 nm, 약 80 nm, 약 75 nm, 약 70 nm, 약 65 nm, 약 60 nm, 약 55 nm, 또는 약 50 nm 미만)의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 50~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 나노입자의 실질적으로 전부는 80~150 nm 범위의 크기를 갖는다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의하면 캡슐화율은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 초과한다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법에 의하면, 약 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 초과의 mRNA가 회수된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 mRNA-LNP의 혼합 후 인큐베이션 단계를 포함한다. 혼합 후 mRNA-LNP를 인큐베이션하는 단계는 2019년 5월 14일에 출원된 미국 가출원 제62/847,837호에 기술되어 있고, 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있으며, 이들 모두는 본원에 참조로서 통합된다.

정제

일부 구현예에서, 미리 형성된 빈 지질 나노입자 또는 mRNA-LNP는 정제 및/또는 농축된다. 다양한 정제 방법이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 접선 유동 여과(Tangential Flow Filtration)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 중력 기반 법선 여과(NFF)에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 임의의 다른 적합한 여과 방법에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 원심분리에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA-LNP는 크로마토그래피 방법에 의해 정제된다.

전달 운반체(Delivery Vehicles)

본 발명에 따르면, 본원에 기술된 바와 같은 단백질 또는 펩티드(예: 전장, 단편, 또는 단백질 또는 펩티드의 일부)를 암호화하는 mRNA는 네이키드 RNA(비포장)로서 또는 전달 비히클을 통해 전달될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 “전달 비히클”“수송 비히클”“나노입자”또는 문법적으로 동등한 용어는 상호 교환적으로 사용된다.

전달 비히클은 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적 리간드, 또는 안정화 시약과 조합하여 제형화되거나, 적합한 부형제와 혼합된 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 예를 들어, 리포좀 캡슐화 mRNA는 전술한 바와 같이 형성될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 “Pharmaceutical Sciences”Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판에서 확인할 수 있다. 특정 전달 비히클은 핵산을 표적 세포에 형질감염시키는 것을 용이하게 하는 능력에 기초하여 선택된다.

일부 구현예에서, 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA는 단일 전달 비히클을 통해 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA는 하나 이상의 전달 운반체를 통해 각각의 상이한 조성물에 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 mRNA 및/또는 동일한 지질 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 mRNA는 별도의 지질 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 비어 있다.

다양한 구현예에 따르면, 적합한 전달 운반체는 이에 제한되지 않지만, 예컨대 폴리에틸렌이민(polyethyleneimine, PEI), 지질 나노입자 및 리포솜, 나노리포솜, 세라미드(ceramide)-함유 나노리포솜, 프로테오리포솜(proteoliposomes), 천연 및 합성-유래 엑소좀 둘 다, 천연, 합성 및 반-합성 라멜라체(lamellar bodies), 나노미립자(nanoparticulates), 칼슘 포스포실리케이트(phosphor-silicate) 나노미립자, 칼슘 포스페이트 나노미립자, 실리콘 다이옥사이드 나노미립자, 나노결정 미립자, 반도체 나노미립자, 폴리(D-아르기닌), 졸-겔, 나노덴드리머(nanodendrimers), 전분-기반(starch-based) 전달 시스템, 미셀(micelles), 에멀전, 니오좀(niosomes), 다중-도메인-블록 폴리머(비닐 폴리머, 폴리프로필(polypropyl) 아크릴산 폴리머, 다이나믹 다중접합체(dynamic polyconjugates)), 건조 분말 제형, 플라스미드, 바이러스, 칼슘 포스페이트 뉴클레오티드, 압타머(aptamers), 펩타이드 및 기타 벡터형 태그(vectorial tags)와 같은 폴리머계 담체(carriers)를 포함한다. 적합한 전달 비히클로서 바이오 나노캡슐(bionanocapsules) 및 다른 바이러스 캡시드 조립체의 사용하는 것도 고려된다. (Hum. Gene Ther. 2008 September; 19(9):887-95).

리포솜 전달 운반체

일부 구현예에서, 적합한 전달 운반체는 지질 나노입자와 같은 리포솜 전달 운반체이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 지질 나노입자와 같은 리포솜 전달 운반체는 보통 하나 이상의 이중층 막에 의해 외부 매질로부터 격리된 내부의 수성(aqua) 공간을 가지는 미세 소낭(microscopic vesicles)으로서 특징지어진다. 리포솜의 이중층 막은 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 유래의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 전형적으로 형성된다(Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). 리포솜의 이중층 막은 양쪽 친매성(amphiphilic) 중합체 및 계면활성제(예: 폴리머좀, 니오좀 등)에 의해 형성될 수도 있다. 본 발명의 맥락에서, 리포솜 전달 비히클은 일반적으로 원하는 핵산(예: mRNA)를 표적 세포 또는 조직으로 수송하는 역할을 한다. 일부 구현예에서, 나노입자 전달 비히클은 리포솜이다. 일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비양이온성 지질, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질, 또는 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 리포좀은 3개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나의 구별되는 지질 성분은 스테롤계 양이온성 지질이다.

양이온성 지질

본원에서 사용되는 바와 같이, “양이온성 지질”이란 문구는 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띄는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2010/144740호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2013/149140호에 기재된 이온화(ionizable) 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화학식 중 하나의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

,

식 중, R₁및 R₂는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C₁-C₂₀알킬, 및 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C₆-C₂₀아실로 이루어진 군에서 선택되고, L₁및 L₂는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 C₁-C₃₀알킬, 선택적으로 치환된 가변 불포화 C₁-C₃₀알케닐, 및 선택적으로 치환된 C₁-C₃₀알키닐로 이루어진 군에서 선택되며, m 및 o는 각각 독립적으로 0 및 임의의 양의 정수(예를 들어, m은 3)로 이루어진 군에서 선택되고, n은 0이거나 임의의 양의 정수(예를 들어, n은 1)이다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-l-일) 테트라코사-15,18-디엔-1-아민(“”및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:

(HGT-5000)

소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민(“”및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

(HGT-5001)

소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민(“”및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

(HGT-5002)

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2010/053572호에 아미노 알코올 리피도이드로 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118725호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118724호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 이온은 14,25-디트리데실 15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄의 화학식을 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2013/063468호 및 WO 2016/205691호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중, R^L의 각 인스턴스는 독립적으로 임의 치환된 C₆-C₄₀알케닐이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/184256호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중, 각각의 X는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 Y는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 m은 독립적으로 0 내지 20이고, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 6이고, 각각의 R_A는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴(carbocyclyl), 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴(heterocyclyl), 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이고, 각각의 R_B는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴, 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴, 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 “표적 23”및 이의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다:

(표적 23)

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/004202호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 가출원 제62/758,179호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

(식 중, 각각의 R¹및 R²는 독립적으로 H 또는 C₁-C₆지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L¹은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기, 또는 무수물 기이고; 각각의 L²는 독립적으로 C₂-C₁₀지방족이고; 각각의 X¹은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R³은 독립적으로 C₆-C₂₀임). 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

(화합물 1)

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

(화합물 2)

(화합물 3)

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합된 J. McClellan, M. C. King의 문헌[Cell 2010, 141, 210-217] 및 Whitehead 등의 문헌[Nature Communications (2014) 5:4277]에 기술된 것과 같은 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 양이온성 지질은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/199952호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/004143호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/075531호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

식 중, L¹또는 L²중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x,-S-S-,-C(=O)S-,-SC(=O)-,-NR^aC(=O)-,-C(=O)NR^a-,NR^aC(=O)NR^a-,-OC(=O)NR^a-,또는 -NR^aC(=O)O-이고, L¹또는 L²중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)_x,-S-S-,-C(=O)S-,SC(=O)-,-NR^aC(=O)-,-C(=O)NR^a-,,NR^aC(=O)NR^a-,-OC(=O)NR^a-또는 -NR^aC(=O)O-이거나 직접 결합이고, G¹및 G²는 각각 독립적으로 치환되지 않은 C₁-C₁₂알킬렌 또는 C₁-C₁₂알케닐렌이고, G³는 C₁-C₂₄알킬렌, C₁-C₂₄알케닐렌, C₃-C₈시클로알킬렌, C₃-C₈시클로알케닐렌이고, R^a는 H 또는 C₁-C₁₂알킬이고, R¹및 R²는 각각 독립적으로 C₆-C₂₄알킬 또는 C₆-C₂₄알케닐이고, R³은 H, OR⁵,CN,-C(=O)OR⁴,-OC(=O)R⁴또는 -NR⁵C(=O)R⁴이고, R⁴는 C₁-C₁₂알킬이고, R⁵는 H 또는 C₁-C₆알킬이고, x는 0, 1 또는 2이다.

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/117528호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/049245호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 양이온성 지질은 다음의 식 중 하나의 화합물 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

,

,

, 및

,

이들 네 개의 화학식 중 어느 하나에 있어서, R₄는 -(CH₂)_nQ및 -(CH₂)_nCHQR에서 독립적으로 선택되고, Q는 -OR, -OH, -O(CH₂)_nN(R)₂,-OC(O)R,-CX₃,-CN,-N(R)C(O)R,-N(H)C(O)R,-N(R)S(O)₂R,-N(H)S(O)₂R,-N(R)C(O)N(R)₂,-N(H)C(O)N(R)₂,-N(H)C(O)N(H)(R),-N(R)C(S)N(R)₂,-N(H)C(S)N(R)₂,-N(H)C(S)N(H)(R)및 헤테로고리로 이루어진 군에서 선택되며, n은 1, 2, 또는 3이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/173054호 및 WO 2015/095340호에 기술된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다:

본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2012/170889호에 기재된 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

,

식 중, R₁은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로 치환된 알킬 아미노(예: 디메틸아미노와 같은 알킬 아미노) 및 피리딜로 이루어진 군으로부터 선택되고, R₂는 다음의 두 화학식 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택되며:

및

식 중 R₃및 R₄는 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C₆-C₂₀알킬, 및 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C₆-C₂₀아실로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; n은 0 또는 임의의 양의 정수(예: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)이다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 “HGT4001”:

(HGT4001)

및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 “HGT4002”:

(HGT4002)

및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 “HGT4003”:

(HGT4003)

및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 “HGT4004”

(HGT4004)

및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 “HGT4005”

(HGT4005)

및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 다른 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 출원 PCT/US2019/032522에 기재된 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 국제 출원 PCT/US2019/032522에 기술된 일반 식 중 어느 하나 또는 구조 (1a)-(21a) 및 (1b)-(21b) 및 (22)-(237) 중 어느 하나에 해당하는 양이온성 지질을 포함한다. 특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 (식 I’)에 따른 구조를 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하며:

(식 I’)

식 중,

R^X는 독립적으로 -H, -L¹-R¹,또는 -L^5A-L^5B-B’이고;

각각의 L¹,L²,및 L³은 독립적으로 공유 결합, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S-, 또는 -C(O)NR^L-이고;

각각의 L^4A및 L^5A는 독립적으로 -C(O)-, -C(O)O-, 또는 -C(O)NR^L-이고;

각각의 L^4B및 L^5B는 독립적으로 C₁-C₂₀알킬렌, C₂-C₂₀알케닐렌, 또는 C₂-C₂₀알키닐렌이고;

각각의 B 및 B’은 NR⁴R⁵또는 5-원 내지 10-원 질소 함유 헤테로아릴이고;

각각의 R¹,R²,및 R³은 독립적으로 C₆-C₃₀알킬, C₆-C₃₀알케닐, 또는 C₆-C₃₀알키닐이고;

각각의 R⁴,및 R⁵는 독립적으로 C₁-C₁₀알킬, C₂-C₁₀알케닐, 또는 C₂-C₁₀알키닐이며;

각각의 R^L은 독립적으로 수소, C₁-C₂₀알킬, C₂-C₂₀알케닐, 또는 C₂-C₂₀알키닐이다.

특정 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질, 즉 국제 출원 PCT/US2019/032522의 화합물 (139)를 포함한다:

("18:1 탄소 꼬리-리보스 지질")

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 N-[l-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드("DOTMA")를 포함한다. (본원에 참조로서 통합된 Feigner 등의 문헌[Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987)]; 미국 특허 제4,897,355호 참조). 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 기타 양이온성 지질은 예를 들어, 5-카복시스페르밀글리신디옥타데실아미드("DOGS"); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복스아미도에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄("DOSPA")(Behr 등의 문헌[Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989)]; 미국 특허 제5,171,678호; 미국 특허 제5,334,761호); l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판("DODAP"); l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판("DOTAP")을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 양이온성 지질의 추가 예시는 또한 다음을 포함한다: 1,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(“DSDMA”); 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(“DODMA”); 1,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(“DLinDMA”); l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판(“DLenDMA”); N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 염화물(“DODAC”); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드(“DDAB”); N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드(“DMRIE”); 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스,시스-9,12-옥타데카디엔옥시)프로판(“CLinDMA”); 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사펜톡시)-3-디메틸 l-l-(시스,시스-9', l-2'-옥타데칸디엔옥시)프로판(“CpLinDMA”); N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민(“DMOBA”); 1 ,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(“DOcarbDAP”); 2,3-디리놀레오일옥시-Ν,Ν-디메틸프로필아민(“DLinDAP”); l,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(“DLincarbDAP”); l,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판(“DLinCDAP”); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[l,3]-디옥솔란(“DLin-K-DMA”); 2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N,N-디메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(“옥틸-CLinDMA”); (2R)-2-((8-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, N-디메틸l-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(“옥틸-CLinDMA (2R)”); (2S)-2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, fsl-dimethyh3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1-일옥시]프로판-1-아민(“Octyl-CLinDMA (2S)”); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[l,3]-디옥솔란(“DLin-K-XTC2-DMA”); 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-디엔-1-일)-l ,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민(“DLin-KC2-DMA”)(본원에 참조로서 포함되는 WO 2010/042877; Semple 등, Nature Biotech. 28: 172-176 (2010) 참조). (Heyes, J. 등, J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV. 등, Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); 국제 특허 공개 WO 2005/121348). 일부 구현예에서, 양이온성 지질 중 하나 이상은 이미다졸, 디알킬아미노, 또는 구아니디늄 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 하나 이상의 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔란("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에틸)테트라하이드로-3aH-시클로펜타[d] [1 ,3]디옥솔-5-아민("ALNY-100") 및/또는 4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드("NC98-5")를 포함한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예컨대 지질 나노입자의 적어도 약 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 또는 70 중량%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조성물(예: 지질 나노입자) 중 총 지질 함량의 적어도 약 5 mol%, 10 mol%, 20 mol%, 30 mol%, 35 mol%, 40 mol%, 45 mol%, 50 mol%, 55 mol%, 60 mol%, 65 mol%, 또는 70 mol%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조성물(예: 지질 나노입자) 중 총 지질 함량의 약 30~70 중량%(예: 약 30~65 중량%, 약 30~60 중량%, 약 30~55 중량%, 약 30~50 중량%, 약 30~45 중량%, 약 30~40 중량%, 약 35~50 중량%, 약 35~45 중량%, 또는 약 35~40 중량%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, 본 발명의 조성물은 조성물(예: 지질 나노입자) 중 총 지질 함량의 약 30~70 mol%(예: 약 30~65 mol%, 약 30~60 mol%, 약 30~55 mol%, 약 30~50 mol%, 약 30~45 mol%, 약 30~40 mol%, 약 35~50 mol%, 약 35~45 mol%, 또는 약 35~40 mol%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다.

비-양이온성 지질/헬퍼 지질

일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 비양이온성("헬퍼") 지질을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비양이온성 지질"은 임의의 중성, 쌍성이온성(zwitterionic), 또는 음이온성 지질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "음이온성 지질"은 선택된 pH, 예컨대 생리적 pH에서 순 음전하를 보유하는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다. 비양이온성 지질은 다이스테아로일포스파티딜콜린(distearoylphosphatidylcholine, DSPC), 다이올레오일포스파티딜콜린(dioleoylphosphatidylcholine, DOPC), 다이팔미토일포스파티딜콜린(dipalmitoylphosphatidylcholine, DPPC), 다이올레오일포스파티딜글리세롤(dioleoylphosphatidylglycerol, DOPG), 다이팔미토일포스파티딜글리세롤(dipalmitoylphosphatidylglycerol, DPPG), 다이올레오일포스파티딜에탄올아민(dioleoylphosphatidylethanolamine, DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(palmitoyloleoylphosphatidylcholine, POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(palmitoyloleoyl-phosphatidylethanolamine, POPE), 다이올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-시클로헥산-l-카복실레이트(dioleoyl-phosphatidylethanolamine 4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-l-carboxylate, DOPE-mal), 다이팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(dipalmitoyl phosphatidyl ethanolamine, DPPE), 다이미리스토일포스포에탄올아민(dimyristoylphosphoethanolamine, DMPE), 다이스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(distearoyl-phosphatidyl-ethanolamine, DSPE), 포스파티딜세린(phosphatidylserine), 스핑고지질(sphingolipid), 세레브로시드(cerebroside), 강글리오시드(ganglioside), 16-O-모노메틸 PE(16-O-monomethyl PE), 16-O-다이메틸 PE(16-O-dimethyl PE), 18-1-트랜스 PE(18-1-trans PE), l-스테아로일-2-올레오일-포스파티딜에탄올아민(l-stearoyl-2-oleoyl-phosphatidyethanolamine, SOPE), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 한정되지는 않는다.

일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 중성 지질, 즉 본 조성물이 제형화되고/되거나 투여되는 조건하에서 순전하(net charge)를 띠지 않는 지질이다.

일부 구현예에서, 이와 같은 비양이온성 지질은 단독으로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 기타 지질 예를 들어, 양이온성 지질과 조합하여 사용된다.

일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 몰 비율(mol%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 총 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 몰 비율(mol%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 초과, 10 mol% 초과, 20 mol% 초과, 30 mol% 초과, 또는 40 mol% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 초과, 10 mol% 초과, 20 mol% 초과, 30 mol% 초과, 또는 40 mol% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 10 mol% 이하, 20 mol% 이하, 30 mol% 이하, 또는 40 mol% 이하이다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 약 10 mol% 이하, 약 20 mol% 이하, 약 30 mol% 이하, 또는 약 40 mol% 이하일 수 있다.

일부 구현예에서, 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 중량부(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 총 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 중량부(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하이다. 일부 구현예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하일 수 있다.

콜레스테롤계 지질

일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 예를 들어, 적합한 콜레스테롤계 양이온성 지질은 예를 들어, DC-Choi (N,N-디메틸-N-에틸카복스아미도콜레스테롤), l,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(Gao 등의 문헌[Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991)]; Wolf 등의 문헌[BioTechniques 23, 139 (1997)]; 미국 특허 제5,744,335호), 또는 다음 구조를 갖는 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE)를 포함한다:

("ICE").

구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.

일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 몰비(mol%)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 또는 약 40% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 약 10 mol% 이하, 약 20 mol% 이하, 약 30 mol% 이하, 또는 약 40 mol% 이하일 수 있다.

일부 구현예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 중량부(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하일 수 있다.

PEG-변형 지질

일부 구현예에서, 리포솜은 하나 이상의 PEG화 지질을 포함한다.

예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질, 및 N-옥타노일-스핑고신-1-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)를 포함하는 유도체화된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도체화된 지질을 단독으로 사용하거나 바람직하게는 수송 비히클(예: 지질 나노입자)을 포함하는 기타 지질 제형과 함께 조합하여 사용하는 것도 본 발명에서 고려된다.

고려된 PEG-변형 지질은 C₆-C₂₀ 길이의 알킬 사슬(들)을 갖는 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, PEG-변형 또는 PEG화 지질은 PGE화 콜레스테롤 또는 PEG-2K이다. 이와 같은 성분을 첨가함으로써 복합체 응집을 예방할 수 있고, 또한 순환 수명을 늘리고 표적 조직에 대한 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있거나(Klibanov 등의 문헌[(1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237] 참조), 이들 성분은 생체 내에서 제형으로부터 신속하게 교환되도록 선택될 수 있다(미국 특허 제5,885,613호 참조). 특히 유용한 교환 가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예: C₁₄ 또는 C₁₈)을 갖는 PEG-세라미드이다.

본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도된 지질은 리포솜 수송 비히클에 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 몰비 기준으로 총 지질의 약 4%를 구성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 몰비 기준으로 총 지질의 약 5%를 구성한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 몰비 기준으로 총 지질의 약 6%를 구성한다.

양친매성 블록 공중합체

일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 함유한다.

다양한 양친매성 블록 공중합체가 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 양친매성 블록 공중합체는 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제로도 지칭된다.

일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 양친매성 중합체는 폴록사머(Pluronic®), 폴록사민(Tetronic®), 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르(polysorbates), 및 폴리비닐 피롤리돈(PVP)으로부터 선택된다.

폴록사머

일부 구현예에서, 적합한 양친매성 중합체는 폴록사머이다. 예를 들어, 적합한 폴록사머는 다음 구조를 가지며:

식 중 a는 10 내지 150의 정수이고 b는 20 내지 60의 정수이다. 예를 들어, a는 약 12이고 b는 약 20이거나, a는 약 80이고 b는 약 27이거나, a는 약 64이고 b는 약 37이거나, a는 약 141이고 b는 약 44이거나, a는 약 101이고 b는 약 56이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 적합한 폴록사머는 약 10개 내지 약 150개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다. 일부 구현예에서, 폴록사머는 약 10개 내지 약 100개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다.

일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 84이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 101이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 105이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 108이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 122이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 123이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 124이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 181이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 182이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 183이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 184이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 185이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 188이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 212이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 215이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 217이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 231이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 234이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 235이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 237이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 238이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 282이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 284이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 288이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 304이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 331이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 333이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 334이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 335이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 338이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 401이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 402이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 403이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 407이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 이들의 조합이다.

일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 4,000 g/mol 내지 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 1,000 g/mol 내지 약 50,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 1,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 2,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 3,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 4,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 5,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 6,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 7,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 8,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 9,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 10,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 25,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 30,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 40,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 구현예에서, 적합한 폴록사머는 약 50,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다.

기타 양친매성 중합체

일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴록사민, 예를 들어 테트로닉(tetronic) 304 또는 테트로닉 904이다.

일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 예컨대 3 kDa, 10 kDa, 또는 29 kDa의 분자량을 갖는 PVP이다.

일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르(Brij), 폴리소르베이트, 소르비탄, 및 이들의 유도체이다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리소르베이트, 예컨대 PS 20이다.

일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르(Brij), 폴록사머, 폴리소르베이트, 소르비탄, 또는 이들의 유도체이다.

일부 구현예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르이다. 일부 구현예에서, 적합한 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 식 (S-I)의 화합물:

또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중,

t는 1 내지 100의 정수이고;

R^1BRIJ는 독립적으로 C_10-40 알킬, C_10-40 알케닐, 또는 C_10-40 알키닐이고; 임의로 R^5PEG의 하나 이상의 메틸렌 기는 C_3-10 카보시클릴렌, 4원 내지 10원 헤테로시클릴렌, C_6-10 아릴렌, 4원 내지 10원 헤테로아릴렌, -N(R^N)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)-, -NR C(O)N(R )-, -C(O)O- -OC(O)-, -OC(O)O- - OC(O)N(R^N)-, -NR^NC(O)O- -C(O)S- -SC(O)-, -C(=NR^N)-,― C(=NR )N(R )―, - NRNC(=NR^N)- -NR^NC(=NR^N)N(R^N)-, -C(S)-, -C(S)N(R^N)-, -NR^NC(S)-, -NR^NC(S)N(R^N)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O- -OS(O)O- -OS(O)₂- -S(O)₂O- -OS(O)₂O- -N(R^N)S(O)-, - S(O)N(R^N)- -N(R^N)S(O)N(R^N)- -OS(O)N(R^N)- -N(R^N)S(O)0- -S(O)₂- -N(R^N)S(O)₂- - S(O)₂N(R^N)-, -N(R^N)S(O)₂N(R^N)- -OS(O)₂N(R^N)- 또는 -N(R^N)S(O)₂O-로 독립적으로 치환되고;

R^N의 각 인스턴스는 독립적으로 수소, C_1-6알킬, 또는 질소 보호기이다.

일부 구현예에서, R^1BRIJ는 C가 알킬이다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 식 (S-la)의 화합물:

또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중 s는 1 내지 100의 정수이다.

일부 구현예에서, R^1BRIJ는 C is 알케닐이다. 예를 들어, 적합한 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 식 (S-lb)의 화합물:

일반적으로, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 임계 미셀 농도(CMC)보다 더 낮은 양으로 제형 중에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다.

일부 구현예에서, 제거 시 제형 중에 존재하는 양친매성 중합체(예: 폴록사머)의 원래 양의 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 미만이 남는다. 일부 구현예에서, 양친매성 중합체(예: 폴록사머)의 잔류량이 제거 후에 제형 중에 남는다.. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잔류량(residual amount)은 조성물 중 실질적으로 모든 물질(폴록사머와 같은, 본원에 기술된 양친매성 중합체)이 제거된 후 남아 있는 양을 의미한다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 검출할 수 없을 수 있다.

일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 3% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 2.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 2% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 1.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 1% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 0.5% 미만의 (예: 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 미만의) 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예: 폴록사머)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 양친매성 중합체(예: 폴록사머)의 잔류량을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잔류량(residual amount)은 조성물 중 실질적으로 모든 물질(폴록사머와 같은, 본원에 기술된 양친매성 중합체)이 제거된 후 남아 있는 양을 의미한다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 검출할 수 없을 수 있다.

중합체

일부 구현예에서, 적합한 전달 비히클은 담체로서 폴리머를 단독으로 사용하거나 본원에 기술된 여러 가지 지질을 포함하는 다른 담체들과 조합하여 사용함으로써 제형화된다. 따라서, 일부 구현예에서, 본원에서 사용되는 리포솜 전달 비히클은 또한 폴리머를 포함하는 나노입자를 망라한다. 적합한 폴리머는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polyglycolide) 코폴리머, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 아르기네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민(protamine), PEG화 프로타민, PLL, PEG화 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함할 수 있다. PEI가 존재하는 경우, 예컨대, 25 kDa 분지형 PEI(Sigma #408727)와 같이 10 내지 40 kDa 범위의 분자량의 PEI가 분지될 수 있다.

다양한 구현예에 따르면, 양이온성 지질, 비양이온성 지질, PEG-변형 지질, 콜레스테롤계 지질 및/또는 양친매성 블록 공중합체(지질 나노입자를 포함함)뿐만 아니라 이러한 성분(지질)의 서로에 대한 상대 몰비를 선택하는 것은 선택된 지질(들)의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달될 mRNA의 특성에 기초한다. 추가적인 고려 사항은, 예를 들어, 알킬 사슬의 포화뿐만 아니라 선택된 지질(들)의 크기, 전하, pH, pKa, 융해성(fusogenicity), 및 내약성을 포함한다. 따라서 몰비는 적절하게 조정될 수 있다.

구별되는 지질 성분의 비

본 발명에 적합한 리포솜은 본원에 기술된 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 콜레스테롤 지질, PEG-변형 지질, 양친매성 블록 공중합체, 및/또는 중합체 중 하나 이상을 다양한 비율로 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 나노입자의 5개 이하의 구별되는 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 나노입자의 4개 이하의 구별되는 성분을 포함한다. 일부 구현예에서, 지질 나노입자는 나노입자의 3개 이하의 구별되는 성분을 포함한다. 비제한적인 예로서, 적합한 리포솜 제형은 cKK-E12, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; ICE, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; 또는 ICE, DOPE, 및 DMG-PEG2K에서 선택된 조합을 포함할 수 있다.

다양한 구현예에서, 양이온성 지질(예: cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)은 몰비로 리포솜의 약 30~60%(예: 약 30~55%, 약 30~50%, 약 30~45%, 약 30~40%, 약 35~50%, 약 35~45%, 또는 약 35~40%)를 구성한다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(예: cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)의 백분율은 몰비로 리포솜의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40 % 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 60% 이상이다.

일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 약 30~60:25~35:20~30:1~15 사이에 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:30:20:10이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:30:25:5이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 각각 대략 40:32:25:3이다. 일부 구현예에서, 양이온성 지질(들) 대 비-양이온성 지질(들) 대 콜레스테롤계 지질(들) 대 PEG-변형 지질(들)의 비는 대략 50:25:20:5이다.

지질 나노입자가 3개 및 3개 미만의 구별되는 지질 성분을 포함하는 구현예에서, 총 지질 함량의 비(즉, 지질 성분(1):지질 성분(2):지질 성분(3)의 비)는 x:y:z로 표시될 수 있으며, 여기에서,

(y + z) = 100 - x이다.

일부 구현예에서, "x", "y", 및 "z"의 각각은 3개의 구별되는 지질 성분의 몰 백분율을 나타내며, 비는 몰비이다.

일부 구현예에서, "x", "y", 및 "z"의 각각은 3개의 구별되는 지질 성분의 중량%를 나타내며, 비는 중량비이다.

일부 구현예에서, 변수 "x"로 표시된 지질 성분(1)은 스테롤계 양이온 지질이다.

일부 구현예에서, 변수 "y"로 표시된 지질 성분(2)은 헬퍼 지질이다.

일부 구현예에서, 변수 "z"로 표시된 지질 성분(3)은 PEG 지질이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(1)(예: 스테롤계 양이온 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "x"는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(1)(예: 스테롤계 양이온 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "x"는 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10% 이하이다. 구현예에서, 변수 "x"는 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 또는 약 40% 이하이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(1)(예: 스테롤계 양이온 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "x"는: 약 50% 이상 및 약 95% 미만; 약 50% 이상 및 약 90% 미만; 약 50% 이상 및 약 85% 미만; 약 50% 이상 및 약 80% 미만; 약 50% 이상 및 약 75% 미만; 약 50% 이상 및 약 70% 미만; 약 50% 이상 및 약 65% 미만; 또는 약 50% 이상 및 약 60% 미만이다. 구현예에서, 변수 "x"는 적어도 약 50% 내지 약 70%; 적어도 약 50% 내지 약 65%; 또는 적어도 약 50% 내지 약 60%이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(1)(예: 스테롤계 양이온 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "x"는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(1)(예: 스테롤계 양이온 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "x"는 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10% 이하이다. 구현예에서, 변수 "x"는 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 또는 약 40% 이하이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(1)(예:, 스테롤계 양이온 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "x"는: 약 50% 이상 및 약 95% 미만; 약 50% 이상 및 약 90% 미만; 약 50% 이상 및 약 85% 미만; 약 50% 이상 및 약 80% 미만; 약 50% 이상 및 약 75% 미만; 약 50% 이상 및 약 70% 미만; 약 50% 이상 및 약 65% 미만; 또는 약 50% 이상 및 약 60% 미만이다. 구현예에서, 변수 "x"는 적어도 약 50% 내지 약 70%; 적어도 약 50% 내지 약 65%; 또는 적어도 약 50% 내지 약 60%이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(3)(예: PEG 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하이다. 구현예에서, 지질 성분(3)(예: PEG 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%이다. 구현예에서, 지질 성분(3)(예: PEG 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 또는 약 5% 내지 약 10%이다.

일부 구현예에서, 지질 성분(3)(예: PEG 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하이다. 구현예에서, 지질 성분(3)(예: PEG 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%이다. 구현예에서, 지질 성분(3)(예: PEG 지질)의 중량 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 또는 약 5% 내지 약 10%이다.

3개 및 단 3개의 구별되는 지질 성분을 갖는 조성물의 경우, 변수 "x", "y", 및 "z"는 3개 변수의 합이 총 지질 함량의 100%가 되는 한 임의의 조합일 수 있다.

mRNA 합성

본 발명에 따른 mRNA는 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 따라 합성될 수 있다. 여러 가지 방법이 미국 특허 출원 제US 2018/0258423호(이 내용 전체는 본원에 참조로서 포함됨)에 기술되어 있으며, 이는 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관 내 전사(IVT)를 통해 합성될 수 있다. 요약하면, IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 템플릿, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적합한 RNA 중합효소(예: T3, T7, 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다.

일부 구현예에서, 적합한 mRNA 서열은 단백질, 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA 서열이다. 일부 구현예에서, 적절한 mRNA 서열은 효율적인 인간 세포 발현에 최적화된 코돈이다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA 서열은 자연 발생 서열 또는 야생형 서열이다. 일부 구현예에서, 적합한 mRNA 서열은 아미노산 서열에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는 단백질, 또는 펩티드를 암호화한다.

본 발명은 다양한 길이의 mRNA를 전달하는 데 사용될 수있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 0.5 kb, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb 또는 50 kb 이상인 합성 mRNA를 시험관 내에서 전달하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명은 길이가 약 1~20 kb, 약 1~15 kb, 약 1~10 kb, 약 5~20 kb, 약 5~15 kb, 약 5~12kb, 약 5~10kb, 약 8~20kb, 또는 약 8~50kb 범위인 합성 mRNA를 시험관 내에서 전달하는 데 사용될 수있다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 mRNA의 제조를 위해, DNA 템플릿을 시험관 내에서 전사한다. 적절한 DNA 템플릿은 일반적으로, 시험관 내 전사를 위한 프로모터(예: T3, T7 또는 SP6 프로모터)를 가지며, 원하는 mRNA에 대한 원하는 뉴클레오티드 서열 및 종결 신호가 이어진다.

뉴클레오티드

다양한 자연 발생 뉴클레오시드 또는 변형된 뉴클레오시드가 본 발명에 따른 mRNA를 생산하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따른 mRNA는 천연 발생 뉴클레오시드(또는 변형되지 않은 뉴클레오티드, 예: 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예: 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-아이오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 슈도우리딘(예: N-1-메틸-슈도우리딘), 2-티오우리딘, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예: 메틸화된 염기); 삽입된 염기; 변형된 당(예: 2'-플루오로리보스, 리보스, 2'-데옥시리보스, 아라비노스, 및 헥소스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예: 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포아미다이트 결합) 이거나 이를 포함한다.

일부 구현예에서, 적합한 mRNA는 백본 변형, 당 변형 및/또는 염기 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 변형 뉴클레오티드는 변형 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U))을 포함할 수 있으며, 퓨린과 피리미딘의 변형 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체로서, 예를 들어, 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-다이아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-다이메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 유사우라실(5-우라실), 다이하이드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카복시하이드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-유사우라실, 큐에오신(queosine), 베타-D-만노실-큐에오신, 와이부톡소신(wybutoxosine), 및 포스포라미데이트(phosphoramidate), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신 및 이노신 등을 포함하되 이에 한정되지 않는다. 이와 같은 유사체의 제조는 미국 등록특허 번호 제4,373,071호, 미국 등록특허 번호 제4,401,796호, 미국 등록특허 번호 제4,415,732호, 미국 등록특허 번호 제4,458,066호, 미국 등록특허 번호 제4,500,707호, 미국 등록특허 번호 제4,668,777호, 미국 등록특허 번호 제4,973,679호, 미국 등록특허 번호 제5,047,524호, 미국 등록특허 번호 제5,132,418호, 미국 등록특허 번호 제5,153,319호, 미국 등록특허 번호 제5,262,530호, 미국 등록특허 번호 제5,700,642호로 부터 당업자에게 공지되어 있고, 이들 개시는 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다. 　　　　　　　　　　　

일부 구현예에서, mRNA는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 비표준 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어 5-메틸-시티딘("5mC"), 슈도우리딘("yU"), 및/또는 2-티오-우리딘("2sU")을 포함할 수 있다. 이러한 잔기 및 이들의 mRNA로의 혼입에 대한 논의는 예를 들어 미국 특허 제8,278,036호 또는 WO2011012316을 참조한다. mRNA는 25%의 U 잔기가 2-티오-우리딘이고 25%의 C 잔기는 5-메틸시티딘인 RNA로서 정의되는 RNA일 수 있다. RNA의 사용에 대한 교시는 미국 특허 공개 US 2012/0195936 및 국제 공개 WO 2011/012316에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 비표준 뉴클레오티드 잔기의 존재는 동일한 서열을 가지되 표준 잔기만을 함유하는 대조군 mRNA보다 mRNA를 더 안정시킬 수 있고/있거나 면역원성을 덜 가지게 할 수 있다. 다른 구현예에서, mRNA는 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린 및 2-클로로-6-아미노퓨린 시토신뿐만 아니라 이들 변형체 및 다른 핵염기의 변형체의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다. 일부 구현예는 푸라노오스 고리 또는 뉴클레오염기에 대한 추가의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 추가 변형은 예를 들어 당 변형 또는 치환(예: 2'-O-알킬 변형, 잠금 핵산(LNA) 중 하나 이상)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA는 추가 폴리뉴클레오티드 및/또는 펩티드 폴리뉴클레오티드(PNA)와 복합체를 구성하거나 혼성화될 수 있다. 당 변형이 2'-O-알킬 변형인 일부 구현예에서, 이러한 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 2'-O- 메톡시에틸 변형, 및 2'-데옥시 변형을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 구현예에서, 이들 변형 중 어느 하나는 뉴클레오티드의 0 내지 100%로 - 예를 들어 구성 뉴클레오티드의 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 초과, 또는 100%로 개별적으로 또는 조합하여 존재할 수 있다.

일부 구현예에서, mRNA는 RNA 백본 변형을 함유할 수 있다. 전형적으로, 백본 변형은 RNA에 함유된 뉴클레오티드의 백본의 인산이 화학적으로 변형된 변형이다. 예시적인 백본 변형은 이에 제한되지 않지만, 메틸포스포네이트, 메틸포스포라미데이트, 포스포라미데이트, 포스포티오에이트(예: 시티딘 5'-O-(1-티오포스페이트)), 보라노포스페이트(boranophosphate), 양하전된 구아니디늄기(guanidinium group) 등으로 이루어진 군에서의 변형을 전형적으로 포함하되, 이는 다른 음이온기, 양이온기, 또는 중성기에 의해 인산디에스테르 결합을 대체하는 것을 의미한다.

일부 구현예에서, mRNA는 당 변형을 함유할 수 있다. 전형적인 당 변형은 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형으로, 이에 제한되지 않지만, 2'-디옥시-2'-플루오로-올리고리보뉴클레오티드(2'-플루오로-2'-디옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-디옥시-2'-디아민-올리고리보뉴클레오티드(2'-아미노-2'-디옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드, 2'-디옥시-2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드(2'-O-메틸시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-메틸우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드, 및 이의 이성질체(2'-아라시티딘(aracytidine) 5'-트리포스페이트, 2'-아라우리딘 5'-트리포스페이트), 또는 아지도트리포스페이트(azidotriphosphate)(2'-아지도-2'-디옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-디옥시우리딘 5'-트리포스페이트)로 이루어진 군에서 선택된 당 변형을 포함한다.

합성-후 프로세싱

일반적으로, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성 후에 첨가될 수 있다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에게 내성을 제공하는 데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.

5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 삼인산(GTP)이 구아닐릴 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 삼인산 결합을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A and G(5')ppp(5')G를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 캡 구조는 공개된 미국 출원 US 2016/0032356 및 공개된 미국 출원 US 2018/0125989에 기술되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 통합된다.

일반적으로, 꼬리 구조는 폴리(A) 및/또는 폴리(C) 꼬리를 포함한다. mRNA의 3' 말단에 있는 폴리-A 꼬리 또는 폴리-C 꼬리는 각각 적어도 50개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 250개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 350개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 450개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 650개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 700개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 750개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 850개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 900개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 950개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 적어도 1kb의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드를 일반적으로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리A 꼬리 또는 폴리C 꼬리는 각각 약 10 내지 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드(예: 약 10 내지 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 50 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 100 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 150 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 200 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 250 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 300 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 350 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 400 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 450 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 500 내지 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10 내지 100개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 20 내지 70개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 20 내지 60개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드)일 수 있다. 일부 구현예에서, 꼬리 구조는 본원에서 설명된 다양한 길이를 갖는 폴리(A) 및 폴리(C) 꼬리의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 꼬리 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.

본원에 기술된 바와 같이, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리의 첨가는 시험관 내 합성 동안 생성된 불현 전사체의 검출을 용이하게 하는데, 이는 캡핑 및/또는 테일링이 없을 때, 조기 불현성 mRNA 전사체들의 크기가 너무 작아 검출될 수 없기 때문이다. 따라서, 일부 구현예에서, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성된 mRNA에 첨가된 후, mRNA의 순도(예: mRNA에 존재하는 불현 전사체의 수준)를 시험한다. 일부 구현예에서, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성된 mRNA에 첨가된 후, mRNA가 본원에 기술된 바와 정제된다. 다른 구현예에서, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성된 mRNA에 첨가되기 전, mRNA가 본원에 기술된 바와 정제된다.

본 발명에 따라 합성된 mRNA는 추가 정제 없이 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 합성된 mRNA는 쇼트머를 제거하는 단계 없이 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 합성된 mRNA는 추가로 정제될 수 있다. 다양한 방법이 본 발명에 따라 합성된 mRNA를 정제하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA의 정제는 원심분리, 여과, 및/또는 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA는 에탄올 침전 또는 여과 또는 크로마토그래피, 또는 겔 정제 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 HPLC에 의해 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 당업자에게 잘 알려진 표준 페놀:클로로포름:이소아밀 알코올 용액에서 추출된다. 일부 구현예에서, mRNA는 접선 유동 여과를 사용하여 정제된다. 적절한 정제 방법은, 그 모든 내용이 본원에 참조로서 통합되고 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있는, 공개된 미국 특허 출원 US 2016/0040154, 공개된 미국 특허 출원 US 2015/0376220, 공개된 미국 특허 출원 US 2018/0251755, published U.S. Application No. US 2018/0251754, 2018년 11월 8일자로 출원된 미국 가출원 제62/757,612호, 및 2019년 8월 26일자로 출원된 미국 가출원 제62/891,781호에 기술되어 있는 내용을 포함한다.

일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 후에 정제된다. 일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 및 후 모두에서 정제된다.

일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 원심분리에 의해 정제된다.

일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 여과에 의해 정제된다.

일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다.

일부 구현예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전, 또는 후, 또는 전과 후 모두에 크로마토그래피에 의해 정제된다.

정제된 mRNA의 특성 분석

본원에 기술된 mRNA 조성물은 짧은 미성숙 RNA 종(abortive RNA species), 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다.

본원에 기술된 mRNA 조성물은 약 60% 내지 약 100%의 순도를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 60%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 65%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 70%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 75%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 80%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 85%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 90%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 91%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 92%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 93%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 94%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 95%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 96%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 97%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 98%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 99%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 100%의 순도를 갖는다.

일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 전장 mRNA 이외의 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 및/또는 0.1% 미만의 불순물을 갖는다. 불순물은 IVT 오염물질, 예를 들어, 단백질, 효소, DNA 템플릿, 유리 뉴클레오티드, 잔류 용매, 잔류 염, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 조기 미성숙 RNA 서열("쇼트머" 또는 "짧은 미성숙 RNA 종"), 및/또는 긴 미성숙 RNA 종을 포함한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA에는 프로세스 효소가 실질적으로 없다.

일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 1 pg/mg 미만, 약 2 pg/mg 미만, 약 3 pg/mg 미만, 약 4 pg/mg 미만, 약 5 pg/mg 미만, 약 6 pg/mg 미만, 약 7 pg/mg 미만, 약 8 pg/mg 미만, 약 9 pg/mg 미만, 약 10 pg/mg 미만, 약 11 pg/mg 미만, 또는 약 12 pg/mg 미만이다. 따라서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 1 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 2 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 3 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 4 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 5 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 6 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 7 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 8 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 9 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 10 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 11 pg/mg 미만이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 12 pg/mg 미만이다.

일부 구현예에서, 본 발명에 따른 방법은 약 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 실질적으로 모든 조기 미성숙 RNA 서열("쇼트머"로도 알려짐)을 제거한다. 일부 구현예에서, mRNA 조성물에는 조기에 중단된 RNA 서열이 실질적으로 없다. 일부 구현예에서, mRNA 조성물은 약 5% 미만(예: 약 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)의 조기 미성숙 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, mRNA 조성물은 약 1% 미만(예: 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, .6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 또는 0.1% 미만)의 조기 미성숙 RNA 서열을 함유한다. 일부 구현예에서, mRNA 조성물은, 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)(예: 숄더 피크 또는 별도 피크), 에티듐 브롬화물, 쿠마시 염색, 모세관 전기영동, 또는 글리옥살 겔 전기영동(예: 별도의 하부 밴드의 존재)에 의해 결정했을 때 검출 불가능한 조기 미성숙 RNA 서열을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "쇼트머(shortmer)", "짧은 미성숙 RNA 종", "조기 미성숙 RNA 서열" 또는 "긴 미성숙 RNA 종"은 전장보다 짧은 임의의 전사체를 지칭한다. 일부 구현예에서, "쇼트머", "짧은 미성숙 RNA 종", 또는 "조기 미성숙 RNA 서열"은 길이가 100 뉴클레오티드 미만, 90 뉴클레오티드 미만, 80 뉴클레오티드 미만, 70 뉴클레오티드 미만, 60 뉴클레오티드 미만, 50 뉴클레오티드 미만, 40 뉴클레오티드 미만, 30 뉴클레오티드 미만, 20 뉴클레오티드 미만, 또는 10 뉴클레오티드 미만이다. 일부 구현예에서, 쇼트머는 5'-캡 및/또는 3'-폴리 A 꼬리를 첨가한 후에 검출되거나 정량화된다. 일부 구현예에서, 조기 미성숙 RNA 전사체는 15개 미만의 염기(예: 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 또는 3개 미만의 염기)를 포함한다. 일부 구현예에서, 조기 미성숙 RNA 전사체는 약 8~15개, 8~14개, 8~13개, 8~12개, 8~11개, 또는 8~10개의 염기를 함유한다.

일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 RNA는 시험관 내 합성에 사용되는 효소 시약이 실질적으로 없으며, T7 RNA 중합효소, DNAse I, 피로포스파타아제, 및/또는 RNAse 억제제를 포함하되 이들로 한정되지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약의 약 5% 미만(예: 약 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만)을 함유한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약의 약 1% 미만(예: 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 또는 0.1% 미만)을 함유한다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는, 예를 들어, 은 염색, 겔 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC), 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC), 및/또는 모세관 전기영동, 브롬화 에티듐 및/또는 쿠마시 염색에 의해 결정했을 때, 시험관 내 합성에 사용된 효소 시약을 검출 불가능한 정도로 함유한다.

다양한 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA는 높은 정도의 무결성을 유지한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mRNA 무결성"은 일반적으로 정제 후 mRNA의 품질을 지칭한다. mRNA 무결성은 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 RNA 아가로스 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성은 RNA 아가로스 겔 전기영동의 밴딩 패턴(banding pattern)에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA는 RNA 아가로오스 겔 전기영동의 기준 밴드와 비교하여 밴딩을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA는 약 95% 초과의 (예: 약 96%, 97%, 98%, 99% 초과의) 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA는 98% 초과의 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA는 99% 초과의 무결성을 갖는다. 일부 구현예에서, 본 발명의 정제된 mRNA는 대략 100%의 무결성을 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 다음 특성 중 하나 이상에 대해 평가된다: 외관, 동일성, 양, 농도, 불순물의 존재, 미생물학적 평가, pH 수준, 및 활성. 일부 구현예에서, 허용 가능한 외관은 본질적으로 가시적인 미립자가 없는 투명한 무색 용액을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA의 동일성은 시퀀싱 방법에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 농도는 UV 분광광도계와 같은 적절한 방법에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 적절한 농도는 약 90% 내지 110%의 공칭 농도(0.9~1.1 mg/mL)이다.

일부 구현예에서, mRNA의 순도를 평가하는 단계는 mRNA 무결성의 평가, 잔류 플라스미드 DNA의 평가, 및 잔류 용매의 평가를 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA 무결성의 허용 가능한 수준은 아가로스 겔 전기영동에 의해 평가된다. 겔을 분석하여 밴딩 패턴 및 겉보기 뉴클레오티드 길이가 분석 기준 표준과 일치하는지 여부를 결정한다. RNA 무결성을 평가하기 위한 추가적인 방법은, 예를 들어 모세관 겔 전기영동(CGE)을 사용하여 정제된 mRNA를 평가하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, CGE에 의해 결정했을 때, 정제된 mRNA의 허용 가능한 순도는 정제된 mRNA 조성물이 약 55% 이하의 긴 미성숙/분해된 종을 갖는 것이다. 일부 구현예에서, 잔류 플라스미드 DNA는 당업계의 방법, 예를 들어 qPCR의 사용에 의해 평가된다. 일부 구현예에서, 10 pg/mg 미만(예: 10 pg/mg 미만, 9 pg/mg 미만, 8 pg/mg 미만, 7 pg/mg 미만, 6 pg/mg 미만, 5 pg/mg 미만, 4 pg/mg 미만, 3 pg/mg 미만, 2 pg/mg 미만, 또는 1 pg/mg 미만)이 잔류 플라스미드 DNA의 허용 가능한 수준이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 10,000 ppm, 9,000 ppm, 8,000 ppm, 7,000 ppm, 6,000 ppm, 5,000 ppm, 4,000 ppm, 3,000 ppm, 2,000 ppm, 1,000 ppm 이하이다. 따라서, 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 10,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 9,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 8,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 7,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 6,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 5,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 4,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 3,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 2,000 ppm 이하이다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 잔류 용매 수준은 1,000 ppm 이하이다.

일부 구현예에서, 미생물학적 시험이 정제된 mRNA에 대해 수행되며, 이에는 예를 들어 박테리아 내독소의 평가가 포함된다. 일부 구현예에서, 박테리아 내독소는 < 0.5 EU/mL, < 0.4 EU/mL, < 0.3 EU/mL, < 0.2 EU/mL 또는 < 0.1 EU/mL이다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.5 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.4 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.3 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.2 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.2 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA 중의 박테리아 내독소는 < 0.1 EU/mL이다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/10 mL, 1 CFU/25 mL, 1CFU/50 mL, 1CFU/75 mL 이하, 또는 1 CFU/100 mL 이하를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/10 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/25 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/50 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/75 mL 이하를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 1 CFU/100 mL를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 pH가 평가된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 허용 가능한 pH는 5 내지 8이다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 5의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 6의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 7의 pH를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 약 8의 pH를 갖는다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 번역 충실도(translational fidelity)가 평가된다. 번역 충실도는 다양한 방법에 의해 평가될 수 있고, 이에는 예를 들어 형질감염 및 웨스턴 블롯 분석이 포함된다. 정제된 mRNA의 허용 가능한 특성은, 웨스턴 블롯 상에서 기준 표준과 유사한 분자량에서 이동하는 밴딩 패턴을 포함한다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 전도도에 대해 평가된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA의 허용 가능한 특성은 기준 표준의 약 50% 내지 150%의 전도도를 포함한다.

정제된 mRNA는 Cap 백분율 및 폴리A 꼬리 길이에 대해서도 평가된다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 Cap 백분율은 Cap1, 면적(%): NLT90을 포함한다. 일부 구현예에서, 허용 가능한 폴리A 꼬리 길이는 약 100~1500 뉴클레오티드(예: 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, and 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 또는 1500 뉴클레오티드)이다.

일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 임의의 잔류 PEG에 대해서도 평가된다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 10 ng PEG/mg(정제된 mRNA) 내지 1000 ng PEG/mg(mRNA)를 갖는다. 따라서, 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 10 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 100 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 250 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 500 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 750 ng 미만의 PEG를 갖는다. 일부 구현예에서, 정제된 mRNA는 정제된 mRNA 1 mg 당 약 1000 ng 미만의 PEG를 갖는다.

mRNA 순도를 검출하고 정량화하는 다양한 방법이 당업계에 공지되어 있다. 일부 구현예에서, 이러한 방법은 블롯팅, 모세관 전기영동, 크로마토그래피, 형광, 겔 전기영동, HPLC, 은 염색, 분광법, 자외선(UV), 또는 UPLC, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, mRNA는 겔 전기영동 이전에 글리옥살 염료에 의해 먼저 변성된다("글리옥살 겔 전기영동"). 일부 구현예에서, 합성된 mRNA의 특성을 캡핑 또는 테일링 전에 분석한다. 일부 구현예에서, 합성된 mRNA의 특성을 캡핑 및 테일링 후에 분석한다.

조성물의 치료적 용도

생체내 mRNA의 발현을 촉진하기 위해서, 리포솜과 같은 전달 운반체는 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적 리간드 또는 안정화 제제의 조합이나 적합한 부형제와 혼합한 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판에서 확인할 수 있다.

일부 구현예에서, 조성물은 전달 운반체와 함께 캡슐화되거나 복합체화된 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 전달 운반체는 리포솜, 지질 나노입자, 고형-지질 나노입자, 폴리머, 바이러스, 졸-겔, 및 나노겔로 이루어진 군으로부터 선택된다.

제공된 mRNA-담지된 나노입자 및 이를 함유하는 조성물은 당업계의 임상의에게 적절하다고 여겨지는 대상체의 임상적 상태, 투여 부위 및 방법, 투여 스케줄, 대상의 연령, 성별, 체중 및 다른 요인들을 고려하여, 현재의 의학적 관행에 따라 투여 및 투약될 수 있다. 본원의 목적을 위한 "유효량"은 실험적 임상 연구, 약학적, 임상적 및 의학적 기술 분야의 당업자에게 알려진 이러한 적절한 고려사항들에 의해 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 투여된 양은 증상의 적어도 어느 정도의 안정, 개선 또는 제거 및 당업자에 의해 질환의 진행, 퇴행 또는 개선의 적절한 측정을 위해 선택되는 기타 표지들을 달성하는 데 효과적이다. 예를 들어, 적합한 양 및 투여 요법은 적어도 일시적인 단백질(예: 효소)의 생산을 야기하는 것이다.

본 발명은 전달의 필요가 있는 대상에게 mRNA를 투여하는 것을 포함하는 생체내 단백질 생산을 위한 mRNA를 전달하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, mRNA는 정맥내 전달, 피하 전달, 경구 전달, 진피하 전달, 안구 전달, 기관내 주사 폐 전달(예: 분무), 근육내 전달, 경막내 전달 또는 관절내 전달로 이루어진 군으로부터 선택된 전달 경로를 통해 투여된다.

적합한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 질, 점막경유, 기관내 또는 흡입을 포함하는 폐, 또는 장 투여; 진피내(intradermal), 피부경유(transdermal, 국소), 근육내, 피하, 골수내 주사뿐 아니라 경막내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 전달을 포함하는 비경구 전달을 포함한다. 일부 구현예에서, 근육내 투여는 골격근, 평활근 및 심장근으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육에 한다. 일부 구현예에서, 투여는 결과적으로 근육 세포에 mRNA의 전달을 가져온다. 일부 구현예에서, 투여는 결과적으로 간세포(즉, 간장 세포)에 mRNA의 전달을 가져온다. 특정한 구현예에서, 근육내 투여는 결과적으로 근육 세포에 mRNA의 전달을 가져온다.

폐 전달 및 분무화에 대한 추가 교시는 공개된 미국 특허 출원 제US 2018/0125989호 및 공개된 미국 특허 출원 제US 2018/0333457호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다.

대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 mRNA-담지 나노입자 및 조성물은 예를 들어, 표적 조직으로 직접 약학적 조성물의 주사를 통해, 바람직하게는 지속된 방출 제형으로 전신적인 방법보다는 국소적인 방법으로 투여될 수 있다. 국소적 전달은 표적된 조직에 따라 다양한 방법으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 함유하는 에어로졸은 (비강, 기관, 또는 기관지 전달로) 흡입될 수 있거나; 본 발명의 조성물은 부상, 질환 징후 또는 통증 부위에 주입될 수 있거나, 예를 들어; 조성물은 경구, 기관 또는 식도 적용을 위한 로젠지(lozenge) 목캔디형으로 제공될 수 있거나; 위 또는 장에 투여하기 위한 액형, 정제형 또는 캡슐형으로 공급될 수 있거나, 직장 또는 질 적용을 위한 좌약형으로 공급될 수 있거나; 크림, 점안약 또는 심지어 주사의 사용에 의해 눈에 전달될 수도 있다. 치료적 분자 또는 리간드와 복합체화된 제공된 조성물을 함유하는 제형은 예를 들어, 조성물이 이식 부위에서 주변 세포로 확산될 수 있게 하는 폴리머 또는 다른 구조 또는 물질과 관련하여 심지어 수술적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들은 폴리머 또는 지지체의 사용없이 수술적으로 적용될 수 있다.

본 발명의 제공된 방법은 본원에 기술된 치료제(예: mRNA)의 치료 유효량의 일회뿐 아니라 다회 투여를 고려한다. 치료제는 대상의 상태의 성질, 중증도 및 정도에 따라 일정한 간격으로 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 치료제(예: mRNA)의 치료 유효량을 정기적으로 일정한 간격(예: 일년에 한 번, 6개월에 한 번, 5개월에 한 번, 3개월에 한 번, 격월(2개월에 한 번), 매월(한 달에 한 번), 격주(이 주에 한 번), 한 달에 두 번, 30일에 한 번, 28일에 한 번, 14일에 한 번, 10일에 한 번, 7일에 한 번, 매주, 일 주일에 두 번, 매일 또는 계속)으로 경막내 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 제공된 리포솜 및/또는 조성물은 그에 함유된 mRNA의 연장 방출(extended-release)용으로 적합하도록 제형화된다. 이와 같은 연장 방출 조성물은 연장된 투여 간격으로 대상에게 알맞게 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 본 발명의 조성물은 하루에 두 번, 매일 또는 격일로 대상에게 투여된다. 바람직한 구현예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에 일주일에 두 번, 일주일에 한 번, 7일에 한 번, 10일에 한 번, 14일에 한 번, 28일에 한 번, 30일에 한 번, 이 주에 한 번, 삼 주에 한 번, 또는 더욱 바람직하게는 사 주에 한 번, 한 달에 한 번, 한 달에 두 번, 6주에 한 번, 8주에 한 번, 두 달에 한 번, 3개월에 한 번, 4개월에 한 번, 6개월에 한 번, 8개월에 한 번, 9개월에 한 번, 또는 매년마다 투여된다. 또한, 연장된 기간 동안 mRNA를 전달 또는 방출하기 위해 데포(depot) 투여(예: 근육내, 피하, 유리체강내)를 위해 제형화된 조성물 및 리포솜이 고려된다. 바람직하게는, 사용된 연장 방출 수단은 안정성을 강화하기 위해 mRNA에 이루어진 변형과 결합된다.

본원에서 사용되는 용어 "치료적 유효량"은 대체로 본 발명의 약학적 조성물에 함유된 치료제의 총량에 따라 결정된다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상에 의미있는 유익을 달성하기에 충분하다(예: 질환 또는 장애를 치료, 조정, 치유, 예방 및/또는 개선하는 것). 예를 들어, 치료 유효량은 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 일반적으로, 치료제가 필요한 대상에 투여된 치료제(예: mRNA)의 양은 대상의 특성에 따라 다를 것이다. 이러한 특성에는 대상체의 병태, 질환 중증도, 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 및 체중이 포함된다. 당업자라면 이러한 요인들과 다른 관련 요인들에 따라 적절한 투여량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한, 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 객관적 검정 및 주관적 검정 모두가 임의로 채용될 수 있다.

치료 유효량은 보통 다수의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 요법으로 투여된다. 임의의 특정 치료 단백질의 경우, 치료적 유효량(및/또는 효과적인 투여 요법 내의 적절한 단위 투여량)은, 예를 들어 투여 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 따라 달라질 수 있다. 또한, 임의의 특정 환자를 위한 특이적 치료 유효량(및/또는 단위 용량)은 치료받는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 전체적인 건강 상태, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 적용되는 특이적 융합 단백질의 대사; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 요인 등을 포함하는 다양한 요인들에 따라 결정될 수 있다.

일부 구현예에서, 치료 유효량은 약 0.005 mg/kg 체중 내지 500 mg/kg 체중의 범위, 예컨대, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 400 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 300 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 200 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 90 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 80 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 70 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 60 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 40 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 30 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 25 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 15 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 범위이다.

일부 구현예에서, 치료 유효량은 약 0.1 mg/kg 체중 초과, 약 0.5 mg/kg 체중 초과, 약 1.0 mg/kg 체중 초과, 약 3 mg/kg 체중 초과, 약 5 mg/kg 체중 초과, 약 10 mg/kg 체중 초과, 약 15 mg/kg 체중 초과, 약 20 mg/kg 체중 초과, 약 30 mg/kg 체중 초과, 약 40 mg/kg 체중 초과, 약 50 mg/kg 체중 초과, 약 60 mg/kg 체중 초과, 약 70 mg/kg 체중 초과, 약 80 mg/kg 체중 초과, 약 90 mg/kg 체중 초과, 약 100 mg/kg 체중 초과, 약 150 mg/kg 체중 초과, 약 200 mg/kg 체중 초과, 약 250 mg/kg 체중 초과, 약 300 mg/kg 체중 초과, 약 350 mg/kg 체중 초과, 약 400 mg/kg 체중 초과, 약 450 mg/kg 체중 초과, 약 500 mg/kg 체중 초과이다. 특정한 구현예에서, 치료 유효량은 1.0 mg/kg이다. 일부 구현예에서, 1.0 mg/kg의 치료 유효량은 근육내 또는 정맥내 투여된다.

또한 본원에 기술된 리포솜 중 하나 이상을 포함하는 동결건조된 약학적 조성물 및 예를 들어 그 교시의 전체가 본원에 참조로서 포함되는, 2011년 6월 8일자로 출원된 미국 가특허 출원 번호 제61/494,882호에 개시된 바와 같이 이러한 조성물의 사용을 위한 관련된 방법이 본원에서 고려된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 동결건조된 약학적 조성물은 투여 전에 재구성될 수 있거나 생체내에서 재구성될 수 있다. 예를 들어, 동결건조된 약학적 조성물은 적절한 투여 제형(예: 원반, 막대 또는 막과 같은 진피내 투여 제형)으로 제형화될 수 있고 투여 제형이 시간이 흐름에 따라 생체내에서 개인의 체액에 의해 다시 수화되도록 투여될 수 있다.

제공된 리포솜 및 조성물은 임의의 원하는 조직에 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 제공된 리포솜 또는 조성물에 의해 전달된 mRNA는 리포솜 및/또는 조성물이 투여된 조직에서 발현된다. 일부 구현예에서, 제공된 리포솜 또는 조성물에 의해 전달된 mRNA는 리포솜 및/또는 조성물이 투여된 조직과 상이한 조직에서 발현된다. 전달된 mRNA가 전달될 수 있고/있거나 발현될 수 있는 예시적인 조직은 이에 제한되지는 않지만, 간, 신장, 심장, 비장, 혈청, 뇌, 골격근, 림프절, 피부 및/또는 뇌척수액을 포함한다.

일부 구현예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 전의 기준 발현 수준과 비교하여 대상으로부터 채취한 생물학적 샘플의 mRNA 발현 수준을 증가시킨다. 전형적으로, 기준 수준은 치료 직전에 측정된다. 생물학적 샘플은 예를 들어 전혈, 혈청, 혈장, 소변 및 조직 샘플(예: 근육, 간, 피부 섬유아세포)을 포함한다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 직전의 기준 수준과 비교하여 mRNA 발현 수준을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 만큼 증가시킨다. 일부 구현예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 받지 않은 대상의 mRNA 발현 수준과 비교하여 mRNA 발현 수준을 증가시킨다.

다양한 구현예에 따르면, 전달된 mRNA의 발현 시기는 특정한 의학적 필요에 맞추어 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 전달된 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현은 제공된 리포솜 및/또는 조성물의 투여 후 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 및/또는 96 시간 후에 탐지가능하다. 일부 구현예에서, 전달된 mRNA에 의해 인코딩된 단백질의 발현은 투여 후 1 주, 2 주, 및/또는 1개월 후에 탐지가능하다.

본 발명은 또한 대상체(예를 들어, 인간 대상체 또는 인간 대상체의 세포 또는 치료되어 인간 대상체에게 전달되는 세포)를 치료하는 데 사용하기 위한 관심 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 전장 mRNA 분자를 갖는 조성물을 전달하는 방법을 제공한다.

실시예

본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 구현예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다.

실시예 1. 구연산염 농도가 높은 지질 나노입자 제형

본 실시예는, 혼합 전에 지질 및 mRNA 용액을 가열하지 않고 mRNA 용액에서 고농도의 구연산(즉, > 10 mM)을 갖는 프로세스 A에 의해 형성된 mRNA-LNP가 약 60% 미만의 캡슐화 효율을 갖는다는 것을 도시한다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 프로세스 A는 먼저 지질을 지질 나노입자에 미리 형성하지 않고, mRNA를 지질의 혼합물과 혼합함으로써 mRNA를 캡슐화하는 종래의 방법을 지칭한다. 간략하게, 이 과정에서, 지질의 혼합물(즉, 양이온성 지질, 헬퍼 지질, PEG-변형 지질, 콜레스테롤 지질 등)의 용액을 에탄올에 용해시켜 제조하였다. mRNA 용액은 mRNA를 구연산염 완충액에 용해시켜 제조하였다. 지질 용액 및 mRNA 용액을 가열하지 않고 실온에서 유지시켰다. 그런 다음, 이들 2가지 용액을 펌프 시스템을 사용해 혼합하였다. 일반적으로, LNP 내에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 용액을 혼합 후, TFF 프로세스로 정용여과에 의해 정제 전에 60 내지 90분 동안 인큐베이션하였다.

mRNA 용액에서 다양한 농도의 구연산염의 영향을 연구하였다. 표 1은 10 mM, 20 mM, 또는 40 mM 구연산염을 포함하는 mRNA 용액으로 제조된 mRNA-LNP에 대한 예시적인 캡슐화 효율을 보여준다. 배치 크기, 유속, 온도, pH 및 염 농도를 포함하는 모든 다른 변수들은 일정하게 유지되었다. 높은 구연산염 농도(> 10 mM)를 갖는 지질 나노입자 제형에 대한 캡슐화 효율은 약 60%였다.

다양한 농도의 구연산염을 갖는 지질 나노입자 제형에 대한 캡슐화 효율
제형	구연산염 농도	캡슐화
1	10 mM	58.2 %
2	20 mM	60.9 %
3	40 mM	57.8 %

실시예 2. 구연산염 농도가 낮은 지질 나노입자 제형

본 실시예는 mRNA 용액에서 낮은 농도의 구연산염(즉,≤5 mM)으로 제조된 mRNA-LNP가 약 60% 이상의 높은 캡슐화 효율을 갖는다는 것을 보여준다. 혼합 단계 전에 mRNA 및/또는 지질 용액을 가열하는 단계를 포함하지 않은 프로세스에서도 높은 캡슐화 효율이 관찰되었다.

mRNA 용액에서 다양한 농도의 구연산염을 이용한 프로세스 A에 의해 50 mg의 mRNA는 지질 나노입자 내에서 캡슐화되었다. 혼합 후, mRNA-LNP를 30℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 도 1은 30℃에서 0, 1.5, 2.0, 2.5, 3, 5, 7.5, 및 10 mM 구연산염으로 제조된 mRNA-LNP에 대한 캡슐화 효율을 보여준다. 도 1에 도시된 바와 같이, 5 mM 이하의 구연산염으로 제조된 mRNA-LNP는 70%를 초과하는 최종 캡슐화 효율을 보여준다. 또한, pH(3.0 내지 4.5)의 변화는 캡슐화 효율에 영향을 미치지 않았다는 점도 주목할 만하다.

실시예 3. 다양한 염화나트륨 농도를 갖는 지질 나노입자 제형

본 실시예는 mRNA 용액 중 염화나트륨(NaCl) 농도가 mRNA-LNP의 캡슐화 효율에 상당한 영향을 미치지 않음을 보여준다.

50 mg의 mRNA는 2.5 mM의 구연산염 및 4.5의 pH를 갖는 mRNA 용액에서 다양한 농도의 NaCl을 사용하여 프로세스 A에 의해 지질 나노입자 내에 캡슐화되었다. 혼합 후, mRNA-LNP를 30℃에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 도 2는 30℃에서 배양 전 및 배양 후 0, 37.5, 75, 150 및 300 mM NaCl로 제조된 mRNA-LNP에 대한 캡슐화 효율을 보여준다. 도 2에 도시된 바와 같이, 37.5 내지 300 mM NaCl로 제조된 mRNA-LNP는 모두 70%를 초과하는 최종 캡슐화 효율을 나타냈다. 또한, pH(3.0 내지 4.5)의 변화는 캡슐화 효율(데이터 미도시)에 영향을 미치지 않았다는 점에 주목할 만하다.

상기 결과를 확인하기 위해, 다음과 같은 조건으로 지질 나노입자 내에서 각각 50 mg의 mRNA를 캡슐화하였다: i) 2.5 mM 구연산염 + 150 mM NaCl, ii) 2.5 mM 구연산염 + 300 mM NaCl, iii) 3.0 mM 구연산염 + 150 mM NaCl, 또는 iv) 3.0 mM 구연산염 + 300 mM NaCl. 결과는 도 3에 도시되어 있다. 150 mM 또는 300 mM NaCl을 갖는 2.5 mM 내지 3.0 mM 구연산염 농도 사이의 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 4가지 조건 모두 70% 초과의 최종 캡슐화 효율을 초래하였다.

실시예 4. 다양한 mRNA를 이용한 지질 나노입자 제형: 지질(v/v) 비율

본 실시예는 혼합 동안 mRNA:지질 비율 및 유속이 mRNA-LNP의 캡슐화 효율에 미치는 영향을 보여준다.

10 mM 구연산염, 150 mM NaCl, 및 4.5의 pH를 포함하는 mRNA 용액을 사용하여 20 mg의 mRNA를 지질 나노입자 내에 캡슐화하였다. 지질 용액 중의 상이한 지질 농도, 및 mRNA 용액 중의 mRNA 농도, 및 혼합 단계 동안의 유속을 연구하였다. mRNA 또는 지질 용액의 부피는 더 높거나 더 낮은 농도를 달성하기 위해 감소되거나 증가되었다.

다양한 농도의 mRNA/지질 및 유속을 갖는 지질 나노입자 제형에 대한 캡슐화 효율
조건	mRNA 용액 부피	지질 용액 부피	mRNA 유속: 지질 유속 비율	제형 1 EE%	제형 2 EE%
A (대조군)	100%	100%	4:1	46	43
B	100 %	133 %	3:1	50	51
C	100%	80 %	5:1	39	39
D	75%	100%	3:1	48	53
E	125 %	100 %	5:1	37	40

표 2의 결과는 상대적으로 더 높은 mRNA 농도(즉, 더 낮은 mRNA 용액 부피; 조건 D) 및 상대적으로 더 낮은 지질 농도(즉, 더 높은 지질 용액 부피; 조건 B)가 대조군(조건 A)과 비교하여 더 높은 캡슐화 효율과 상관된다는 것을 보여준다.상기 결과를 확인하기 위해, mRNA 용액: 지질 용액의 상이한 (v/v) 비율을 연구하였다. 2.5 mM 구연산염 및 150 mM NaCl, 및 4.5의 pH를 포함하는 mRNA 용액을 사용하여 50 mg의 mRNA를 지질 나노입자 내에 캡슐화하였다. 도 4에 도시된 바와 같이, 3:1 초과의 mRNA:지질 비율은 약 75% 초과의 최종 캡슐화 효율을 초래하였다. 특히, 4:1의 비율로 인큐베이션 단계 전과 후에 70%를 초과하는 캡슐화 효율을 초래하였다.

다음으로, mRNA-LNP의 캡슐화 효율에 대한 유속의 효과를 연구하였다. 2.5 mM 구연산 및 150 mM NaCl, 및 4.5의 pH를 포함하는 mRNA 용액을 사용하여 50 mg의 mRNA를 지질 나노입자 내에서 캡슐화하였다. 200 mL/분 내지 500 mL/분 범위의 다양한 조합 유속(mRNA 유속 + 지질 유속)을 시험하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 상이한 유속에서 캡슐화 효율의 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 유속, pH, 및 NaCl 농도에 관계없이, 낮은 구연산 농도(≤5mM)를 사용한 경우, 프로세스 A에서 높은 캡슐화 효율을 달성하였다.

균등물

당업자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 발명의 특정 구현예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나, 또는 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.

Claims

전령 RNA (mRNA)를 지질 나노입자 (LNP)에 캡슐화하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 mRNA를 포함하는 mRNA 용액과 (b) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 혼합하여 LNP 형성 용액에서 LNP(mRNA-LNP) 내에 캡슐화된 mRNA를 형성하는 단계를 포함하되, 상기 mRNA 용액은 5 mM 미만의 구연산염을 포함하고, 상기 mRNA-LNP는 60% 초과의 캡슐화 효율을 갖는, 방법.
제1항에 있어서, mRNA 용액 및/또는 지질 용액은 혼합 전에 주변 온도인, 방법.
제2항에 있어서, 주변 온도는 약 35℃ 미만, 약 30℃ 미만, 약 26℃ 미만, 약 23℃ 미만, 약 21℃ 미만, 약 20℃ 미만, 또는 약 18℃ 미만인, 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 주변 온도는 약 18~32℃, 약 21~26℃, 또는 약 23~25℃의 범위인, 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 4.0 mM 미만의 구연산염, 약 3.0 mM 미만의 구연산염, 약 2.5 mM 미만의 구연산염, 약 2.0 mM 미만의 구연산염, 약 1.5 mM 미만의 구연산염, 약 1.25 mM 미만의 구연산염, 약 1.0 mM 미만의 구연산염, 또는 약 0.5 mM 미만의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 3.0 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 2.5 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 2.0 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 1.5 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 0 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 트레할로스를 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 상기 혼합 단계 전에 상기 mRNA 용액 및 상기 지질 용액을 가열하는 단계를 필요로 하지 않는, 방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 mRNA 용액 12 L 당 약 1 g 초과의 mRNA를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, mRNA 용액은 mRNA 용액 8 L 당 약 1 g의 mRNA를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, mRNA 용액은 mRNA 용액 4 L 당 약 1 g의 mRNA를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, mRNA 용액은 mRNA 용액 2 L 당 약 1 g의 mRNA를 포함하는, 방법.
제13항에 있어서, mRNA 용액 중 mRNA의 농도는 약 0.125 mg/mL 초과, 약 0.25 mg/mL 초과, 약 0.5 mg/mL 초과, 또는 약 1.0 mg/mL 초과인, 방법.
제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액 및 지질 용액은 2:1 내지 6:1의 비율(v/v)로 혼합되는, 방법.
제18항에 있어서, mRNA 용액 및 지질 용액은 약 4:1의 비율(v/v)로 혼합되는, 방법.
제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 3.0 내지 5.0의 pH를 갖는, 방법.
제20항에 있어서, mRNA 용액은 약 3.5, 4.0 또는 4.5의 pH를 갖는, 방법.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 37.5 mM 내지 300 mM의 NaCl을 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, mRNA 용액은 약 37.5 mM, 약 75 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 또는 약 300 mM NaCl을 포함하는, 방법
제22항에 있어서, mRNA 용액은 약 37.5 mM, 약 75 mM, 약 100 mM, 약 150 mM, 또는 약 300 mM NaCl을 포함하는, 방법.
제1항에 있어서, mRNA 용액은 약 2.5 mM 구연산염, 약 150 mM NaCl, 및 약 4.5의 pH를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP를 인큐베이션하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
제25항에 있어서, mRNA-LNP는 21℃ 내지 65℃의 온도에서 인큐베이션되는, 방법.
제26항에 있어서, mRNA-LNP는 약 26℃, 약 30℃, 또는 약 65℃온도에서 인큐베이션되는, 방법.
제25항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP는 약 20분, 약 30분, 약 60분, 약 90분, 또는 약 120분 초과로 인큐베이션되는, 방법.
제28항에 있어서, mRNA-LNP는 약 60분 동안 인큐베이션되는, 방법.
제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 용액은 50% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만의 에탄올과 같은 비수성 용매를 포함하는, 방법.
제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 용액은 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 추가로 포함하는, 방법.
제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP는 접선 유동 여과에 의해 정제되는, 방법.
제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP는 150 nm 미만, 100 nm 미만, 80 nm 미만, 60 nm 미만, 또는 40 nm 미만의 평균 크기를 갖는, 방법.
제33항에 있어서, mRNA-LNP는 40~70 nm 범위의 평균 크기를 갖는, 방법.
제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 나노입자는 약 0.3 미만, 약 0.2 미만, 약 0.18 미만, 약 0.15 미만, 및 약 0.1 미만의 PDI를 갖는, 방법.
제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP의 캡슐화 효율은 적어도 약 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%인, 방법.
제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP는 1 내지 10의 N/P 비율을 갖는, 방법.
제37항에 있어서, mRNA-LNP는 2 내지 6의 N/P 비율을 갖는, 방법.
제38항에 있어서, mRNA-LNP는 약 4의 N/P 비율을 갖는, 방법.
제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 5 g 이상, 10 g 이상, 20 g 이상, 50 g 이상, 100 g 이상, 또는 1 kg 이상의 mRNA가 단일 배치로 지질 나노입자에 캡슐화되는, 방법.
제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액 및 지질 용액은 무펄스 유동 펌프에 의해 혼합되는, 방법.
제41항에 있어서, 펌프는 기어 펌프인, 방법.
제42항에 있어서, 펌프는 원심 펌프인, 방법.
제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액은 약 150~250 ml/분, 250 ~500 ml/분, 500~1000 ml/분, 1000~2000 ml/분, 2000~3000 ml/분, 3000~4000 ml/분, 또는 4000~5000 ml/분 범위의 유속으로 혼합되는, 방법.
제44항에 있어서, mRNA 용액은 약 800 ml/분, 약 1000 ml/분, 또는 약 12000 ml/분의 유속으로 혼합되는, 방법.
제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 지질 용액은 약 25~75 ml/분, 약 75~200 ml/분, 약 200~350 ml/분, 약 350~500 ml/분, 약 500~650 ml/분, 약 650~850 ml/분, 또는 약 850~1000 ml/분 범위의 유속으로 혼합되는, 방법.
제46항에 있어서, 지질 용액은 약 100 ml/분, 약 150 ml/분, 약 200 ml/분, 약 250 ml/분, 약 300 ml/분, 약 350 ml/분의 유속으로 혼합되는, 방법.
제44항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA 용액의 유속은 지질 용액의 유속보다 2배, 4배, 또는 6배 더 빠른, 방법.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는, 조성물.
제49항에 있어서, 조성물은 5 g 이상, 10 g 이상, 20 g 이상, 50 g 이상, 100 g 이상, 또는 1 kg 이상의 mRNA를 포함하는, 조성물.
제49항 또는 제50항에 있어서, mRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
제49항 또는 제50항에 있어서, mRNA는 변형되지 않은 것인, 조성물.
제49항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA는 약 0.5 kb, 1 kb, 2 kb, 3 kb, 4 kb, 5 kb, 8 kb, 10 kb, 20 kb, 30 kb 또는 40 kb 초과인, 조성물.
제1항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, mRNA-LNP 캡슐화 효율은, 10 mM 구연산염을 가진 것을 제외하고는 동일한 조건 하에서 지질 용액과 혼합된 mRNA 용액으로부터 형성된 mRNA-LNP와 비교하여 적어도 10% 더 높은, 방법.
전령 RNA (mRNA)를 지질 나노입자 (LNP)에 캡슐화하는 방법으로서, (a) 하나 이상의 mRNA를 포함하는 mRNA 용액과 (b) 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비-양이온성 지질, 및 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함하는 지질 용액을 혼합하여 LNP 형성 용액에서 LNP(mRNA-LNP) 내에 캡슐화된 mRNA를 형성하는 단계를 포함하되, mRNA 용액은 0.1 mM 내지 5 mM 의 구연산염을 포함하고, mRNA-LNP는 60% 초과의 캡슐화 효율을 갖는, 방법.
제55항에 있어서, mRNA 용액은 약 1 mM 내지 4 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제56항에 있어서, mRNA 용액은 약 2 mM 내지 3 mM의 구연산염을 포함하는, 방법.
제57항에 있어서, mRNA 용액은 약 2 mM 구연산염을 포함하는, 방법.
제57항에 있어서, mRNA 용액은 약 3 mM 구연산염을 포함하는, 방법.