KR20230083323A - 개선된 지질 나노입자 공정 및 제형화 - Google Patents

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KR20230083323A
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쉬리랑 카르브
하르딥 알. 고파니
프랑크 데로사
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트랜슬레이트 바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제조하기 위한 개선된 공정을 제공하며, 이는 치료적 사용을 위한 단기 및 장기 보관 모두에 적합한 높은 mRNA 완전성을 초래한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 아스코르브산을 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 수용액에 첨가하는 단계, 수용액을 냉동시켜 냉동된 용액을 수득하는 단계, 냉동된 용액을 건조시켜 동결건조된 조성물을 수득하는 단계, 및 동결건조된 조성물의 온도를 15℃ 내지 30℃의 온도로 증가시키고 유지하는 단계를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

Description

개선된 지질 나노입자 공정 및 제형화
관련 출원
본 출원은 2020년 10월 6일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/088,047호의 우선권을 주장하고, 그 개시내용은 본원에 참조로서 통합된다.
캡슐화된 전령 RNA(mRNA: messenger RNA)의 지질 나노입자 전달은 다양한 질환의 치료에 점점 더 중요한 접근법이 되고 있다. 그러나, mRNA는 고유한 안정성 및 온도에 대한 민감도로 인해 분해에 민감하다. 따라서, 치료적 사용을 위한 단기 및 장기 보관을 위해 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA의 완전성을 유지하는 것이 중요하다.
본 발명은, 무엇보다도, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(mRNA-LNP)를 포함하는 동결건조된 조성물을 제조하기 위한 개선된 공정을 제공한다. 본 발명은, 1) 동결건조 공정을 위해 아스코르브산을 첨가하는 단계, 2) mRNA-LNP 조성물을 완충액으로 전처리해서 동결건조 공정 전에 pH를 유지하는 단계, 및 3) 동결건조된 조성물의 온도를(예를 들어, 이차 건조 단계 동안) 고온(예를 들어, 15℃ 내지 30℃으로 증가시키고 유지하는 각각의 단계가 동결건조 후 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA의 완전성을 개별적으로 그리고 집합적으로 개선할 수 있고, 이에 따라 장기 보관을 견딜수 있는 고도로 안정적인 동결건조된 mRNA-LNP 조성물이 생성될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 또한, 본 발명에 따른 동결건조 공정은 동결건조 동안 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA의 완전성을 연장시키는 동시에, mRNA-LNP의 크기, PDI, 및 캡슐화 효율도 또한 유지한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 장기 및 단기 보관을 위해 mRNA 완전성이 높은 안정적인 동결건조된 mRNA를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은, 무엇보다도, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제조하는 방법을 제공하며, 이러한 방법은 (a) 초기 mRNA 완전성을 갖는 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 수용액에 5 mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 첨가하는 단계, (b) 수용액을 냉동시켜 냉동된 용액을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 55%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 65%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 70%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 80%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 85%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 95%이다.
일부 실시예에서, 상기 방법은 (a) 단계 전에, 수용액으로부터 시트르산을 제거하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 시트르산을 제거하는 단계는 pH 6 내지 pH 8의 pH에서 시트르산 및 EDTA를 포함하는 수용액을 세척하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 시트르산을 제거하는 단계는 pH 6 내지 pH 8의 pH에서 10 mM 시트르산 및 1 mM EDTA를 포함하는 수용액을 세척하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 시트르산을 제거하는 단계는 pH 6 내지 pH 8의 pH에서 시트르산 및 EDTA를 포함하는 수용액을 세척하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 1 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 2 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 5 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 8 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 10 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 15 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 20 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 25 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 50 mM 시트르산염 완충액일 수 있다. 일부 실시예에서, 수용액은 0.1 mM EDTA를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 0.5 mM EDTA를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 1 mM EDTA를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 2.5 mM EDTA를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 5 mM EDTA를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 7.5 mM EDTA를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 10 mM EDTA를 포함한다.
일부 실시예에서, 이러한 방법은, (c) 단계 후에, (d) 동결건조된 조성물의 온도를 15℃ 내지 30℃의 온도로 증가시키고 유지하는 단계를 포함한다.
일부 실시예에서, 수용액은 약 1 mM 내지 500 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 5 mM 내지 200 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 10 mM 내지 100 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 10 mM 내지 50 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 20 mM 내지 50 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 20 mM 내지 30 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 10 mM 내지 30 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 10 mM 내지 20 mM 아스코르브산을 포함한다.
일부 실시예에서, 수용액은 약 1 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 2 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 3 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 5 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 8 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 10 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 15 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 20 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 25 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 30 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 40 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 50 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 75 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 100 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 125 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 150 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 175 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 200 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 250 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 300 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 400 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 약 500 mM 아스코르브산을 포함한다.
일부 실시예에서, 건조 단계는 5시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 10시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 15시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 20시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 30시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 50시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 75시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 100시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 110시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 120시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 130시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 140시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 150시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 160시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 170시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 200시간 초과 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 건조 단계는 약 10시간 내지 300시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 50시간 내지 200시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 100시간 내지 150시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 120시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 130시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 140시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 150시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 160시간 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 1시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 2시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 3시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 4시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 5시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 7시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 10시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 5℃ 내지 40℃의 온도에서 15시간 초과 동안 유지된다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 1시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 2시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 3시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 4시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 5시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 7시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 10시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 10℃ 내지 30℃의 온도에서 15시간 초과 동안 유지된다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 1시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 2시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 3시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 4시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 5시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 7시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 10시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 20℃ 내지 30℃의 온도에서 15시간 초과 동안 유지된다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 1시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 2시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 3시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 4시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 5시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 7시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 10시간 초과 동안 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물은 약 20℃의 온도에서 15시간 초과 동안 유지된다.
일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 40% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 40% 초과로 유지된다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 45% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 45% 초과로 유지된다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 50% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 50% 초과로 유지된다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 55% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 55% 초과로 유지된다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 60% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 60% 초과로 유지된다.
일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 40% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 30% 초과이다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 45% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 35% 초과이다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 50% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 40% 초과이다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 55% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 45% 초과이다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 60% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 50% 초과이다. 일부 실시예에서, 초기 mRNA 완전성은 65% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 55% 초과이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 3일 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 1주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 2주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 3주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 4주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 5주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10 mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10 mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 45%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10 mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 45%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 45%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 40%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10 mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 40%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 40%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 80%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 80%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 85%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 5mM 및 200 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 10mM 및 30 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물은, 초기 mRNA 완전성을 갖도록 측정된, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자를 갖는 수용액에 약 20 mM 아스코르브산을 첨가함으로써 제조되며, 동결건조된 조성물을 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 보관한 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다.
일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 전기영동(CE, capillary electrophoresis)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 겔 전기영동에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 미세유체 장치에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 RT-qPCR에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 겔 전기영동(CGE, capillary gel electrophoresis)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 구역 전기영동(CZE, capillary zone electrophoresis)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 미셀 전기운동 모세관 크로마토그래피(MEKC, capillary micellular electrokinetic capillary chromatography)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 등전점 전기영동(cIEF, capillary isoelectric focusing)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA의 완전성은 모세관 전기크로마토그래피(CEC, capillary electrochromatography)에 의해 결정된다.
일부 실시예에서, 건조 단계는 빙점 미만의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 0℃ 내지 -100℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 -10℃ 내지 -50℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 -20℃ 내지 -30℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 -30℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 -25℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 -20℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 -15℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 -10℃의 온도에서 수행된다.
일부 실시예에서, 건조 단계는 4580 mTorr(4.58 Torr) 미만의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 0 mTorr 내지 300 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 10 mTorr 내지 200 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 20 mTorr 내지 60 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 100 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 80 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 60 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 50 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 40 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 30 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 건조 단계는 약 20 mTorr의 압력에서 수행된다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계(예를 들어, 이차 건조 단계)에서 0℃ 내지 40℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 5℃ 내지 30℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 20℃ 내지 30℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 10℃의 온도로 증가되고 유지된다. ). 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 15℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 20℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 25℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 30℃의 온도로 증가되고 유지된다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 35℃의 온도로 증가되고 유지된다.
일부 실시예에서, 수용액은 동결보호제를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 (유리) 탄수화물 예를 들어 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 소르보오스, 만노오스, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 디사카라이드 예를 들어 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 및 이들을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 폴리사카라이드, 예를 들어 라피노오스, 멜레지토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 덱스트린, 셀룰로오스, 전분 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 알디톨, 예를 들어 글리세롤, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨, 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 및 이들의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 락토오스를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 락토오스 만노오스를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 락토오스를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 만니톨을 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 수크로오스를 포함한다. 일부 실시예에서, 수용액은 트레할로오스를 포함한다.
일부 실시예에서, 수용액은 9.0 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 8.5 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 8.0 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 7.8 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 7.5 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 7.3 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 7.0 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 6.8 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 6.5 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 6.3 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 6.2 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 6.0 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 5.8 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 5.5 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 5.2 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 5.0 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 4.8 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 4.5 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 4.3 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 4.0 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 3.8 미만의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 3.0 내지 7.5 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 4.0 내지 7.0 범위의 pH를 갖는다. 일부 실시예에서, 수용액은 4.5 내지 6.5 범위의 pH를 갖는다.
일 측면에서, 본 발명은, 무엇보다도, 본 발명의 방법에 의해 제조된 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공한다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 40%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 40%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 40%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 45%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 45%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 45%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 75%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5 mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 80%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 80%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 80%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5 mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 85%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 85%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 85%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5 mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 10 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다.
일 측면에서, 본 발명은 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제공하며, 여기서 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 동안 동결건조된 조성물의 보관 후 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 90%이다.
일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 75% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 80% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 85% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 90% 이상이다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 약 95% 이상이다.
일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 5 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 4 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 3 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 2 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 1 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 0.5 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 0.3 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 0.2 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 0.1 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 0.05 mM 미만의 시트르산염을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 실질적으로 잔류 시트르산염을 포함하지 않는다.
일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 1 mM 내지 500 mM의 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 5 mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 10 mM 내지 100 mM의 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 10 mM 내지 50 mM의 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 20 mM 내지 50 mM의 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 20 mM 내지 30 mM의 아스코르브산을 포함한다.
일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 1 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 2 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 3 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 5 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 8 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 10 mM의 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 15 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 20 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 25 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 30 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 40 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 50 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 75 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 100 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 125 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 150 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 175 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물 c는 약 200 mM의 아스코르브산을상승시킨다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 250 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 300 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 400 mM 아스코르브산을 포함한다. 일부 실시예에서, 안정적인 동결건조된 조성물은 약 500 mM 아스코르브산을 포함한다.
도 1은 본 발명의 동결건조 조건을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 일반적으로, 동결건조는 동결보호제를 포함하는 수용액 중에서 mRNA를 냉동시키고, 이어서 일차 및 이차 건조 단계를 수행하여 수행된다. 도 1에 도시된 이러한 특정 예시적인 공정에서, 일차 건조 단계는 진공이 50 mTorr일 때 시작된다.
도 2는 실온에서 보관 시 4주에 걸쳐 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다. 특히, 아스코르브산을 갖는 동결건조된 mRNA 샘플은 아스코르브산을 갖지 않는 샘플과 비교하여 실질적으로 높은 mRNA 완전성을 갖는다.
도 3은 2℃ 내지 8℃에서 보관 시 3개월에 걸쳐 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 보여주는 예시적인 그래프 및 첨부된 표를 도시한다.
도 4는 실온에서 보관 시 4주에 걸쳐 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다.
도 5는 2℃ 내지 8℃에서 보관 시 6개월에 걸쳐 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다.
도 6은 실온에서 보관 시 4주에 걸쳐 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 다양한 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다.
도 7은 실온에서 보관 시 4주에 걸쳐 다양한 농도의 아스코르브산으로 제조된, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 보여주는 예시적인 그래프를 도시한다.
정의
본 발명을 보다 용이하게 이해하기 위하여, 우선적으로 특정 용어를 아래와 같이 정의한다. 다음의 용어들 및 기타 용어들에 대한 추가적인 정의가 본 명세서 전체를 통하여 설명된다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본원에서 참조된 출판물 및 기타 다른 참고물은 참조로서 본원에 의해 포함된다.
아미노산: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "아미노산"은 그의 가장 넓은 의미로, 폴리펩티드 사슬에 통합될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 아미노산은 일반적인 구조인 H2N-C(H)(R)-COOH를 가진다. 일부 실시예에서, 아미노산은 자연 발생 아미노산이다. 일부 실시예에서, 아미노산은 합성 아미노산이고, 일부 실시예에서 아미노산은 d-아미노산이며; 일부 실시예에서 아미노산은 l-아미노산이다. "표준 아미노산"은 주로 자연 발생 펩티드에서 발견되는 20종의 표준 l-아미노산 중 어느 하나를 지칭한다. "비표준 아미노산"은 합성으로 제조되었는지 또는 천연 공급원으로부터 수득한 것인지에 상관없이 표준 아미노산 이외의 임의의 아미노산을 지칭한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "합성 아미노산"은 염, 아미노산 유도체(예를 들어 아미드), 및/또는 치환물을 포함하는 화학적으로 변형된 아미노산을 망라하지만 이들로 한정되지는 않는다. 펩티드의 카르복시-말단 아미노산 및/또는 아미노-말단 아미노산을 포함하여, 아미노산은 메틸화, 아미드화, 아세틸화, 보호기에 의해 변형되고/되거나, 펩티드의 활성에 악영향을 미치지 않으면서 펩티드의 순환 반감기를 변화시킬 수 있는 다른 화학적 작용기와의 치환에 의해 변형될 수 있다. 아미노산은 이황화(disulfide) 결합에 참여할 수 있다. 아미노산은 예를 들어 하나 이상의 화학적 실재물(entity)(예를 들어, 메틸기, 아세테이트기, 아세틸기, 포스페이트기, 포밀 모이어티(formyl moieties), 이소프레노이드기, 설페이트기, 폴리에틸렌 글리콜 모이어티, 지질 모이어티, 탄수화물 모이어티, 바이오틴(biotin) 모이어티 등)와 같은 하나 이상의 번역 후 변형을 포함할 수 있다. 용어 "아미노산"은 "아미노산 잔기"와 상호교환적으로 사용되고, 자유 아미노산 및/또는 펩티드의 아미노산 잔기를 지칭할 수 있다. 유리 아미노산을 언급하는지 펩티드의 잔기를 언급하는지는 이 용어가 사용되는 문맥으로부터 분명해질 것이다.
대략(approximately) 또는 약(about): 본원에서 사용되는 용어 "대략(approximately)" 또는 "약(about)"은 하나 이상의 관심 값에 적용되는 경우, 명시된 기준 값과 유사한 값을 지칭한다. 소정의 실시예에서, 용어 "대략" 또는 "약"은, 달리 진술되거나 달리 문맥으로부터 분명한 경우가 아닌 한(이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함), 진술된 기준 수치의 어느 한 방향(초과 또는 미만)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 나타낸다.
배치(batch): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "배치"는 한 번에 정제된, 예를 들어, 동일한 제조 사이클 동안 단일 제조 순서에 따라 정제된 mRNA의 수량(quantity) 또는 양(amount)을 지칭한다. 배치는 한 번의 반응에서 정제된 mRNA의 양을 지칭할 수 있다.
생물학적으로 활성인(biologically active): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어구 "생물학적으로 활성인"은 생물학적 체계(biological system)에서, 특히 유기체에서 활성을 가지는 임의의 제제의 특성을 지칭한다. 예를 들어, 유기체에 투여될 때 본 유기체에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성이 있는 것으로 여겨진다.
전달: 본원에서 사용되는 용어 "전달"은 국소적인 전달과 전신적인 전달 둘 다를 망라한다. 예를 들어, mRNA의 전달은 mRNA가 표적 조직에 전달되고 암호화된 단백질이 발현되고 표적 조직 내에 유지되는 상황("국소 분포" 또는 "국소 전달"이라고도 함) 및 mRNA가 표적 조직에 전달되고 암호화된 단백질이 발현되고 환자의 순환계(예를 들어, 혈청)에 분비되며 전신에 분포되어 다른 조직에 의해 흡수된 상황("전신 분포" 또는 "전신 전달"이라고도 함)을 망라한다. 일부 실시예에서, 전달은 예를 들어, 분무화(nebulization)를 포함하는 폐 전달이다.
효능: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "효능" 또는 문법적으로 동등한 표현은, 관련 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA의 전달과 관련하여, 생물학적으로 관련된 평가변수가 개선되는 것을 지칭한다. 일부 실시예에서, 생물학적 평가변수는 투여 후 소정의 시점에 염화암모늄 유발(challenge)에 대항하여 보호하는 것이다.
캡슐화: 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "캡슐화" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 핵산 분자를 나노입자 내에 구속시키는(confining) 공정을 지칭한다.
발현: 본원에서 사용된 바와 같이, 핵산 서열의 "발현"은 mRNA가 폴리펩티드로 번역되는 것, 다수의 폴리펩티드(예를 들어, 항체의 중쇄 또는 경쇄)가 온전한 단백질(예를 들어, 항체)로 조립되는 것, 및/또는 폴리펩티드 또는 완전히 조립된 단백질(예를 들어, 항체)의 번역 후 변형을 지칭한다. 본 출원에서, 용어 "발현" 및 "생산" 및 이의 문법적으로 동등한 표현은 상호교환적으로 사용된다.
개선하다(improve), 증가하다(increase) 또는 감소하다(reduce): 본원에서 사용되는, 용어 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적으로 동등한 표현은 본원에 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정치 또는 본원에 기술된 치료의 부재 시 대조군 대상체(또는 다수의 대조군 대상체)에서의 측정치와 같은 기준선 측정치(baseline measurement)와 관련된 값들을 나타낸다. "대조군 대상체"는 치료 받는 대상체와 동일한 형태의 질환에 걸린, 치료 받는 대상체와 거의 동일한 연령인 대상체이다.
불순물(impurities): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "불순물"은 구속된 양의 액체, 기체 또는 고체 내부에 있는 물질로서, 표적 물질 또는 화합물의 화학적 조성과 상이한 물질을 지칭한다. 불순물은 오염물로도 지칭된다.
시험관 내(in vitro): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "시험관 내(in vitro)"는 다세포 유기체 내가 아니라 예를 들어, 시험관 또는 반응 용기, 세포 배양 등과 같은 인공적인 환경에서 발생하는 사건을 지칭한다.
생체 내(In Vivo): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 " 생체 내(in vivo)"는 인간 및 비인간 동물과 같은 다세포 유기체 내에서 발생하는 사건을 지칭한다. 세포-기반 시스템의 맥락에서, 이러한 용어는 (예를 들어, 시험관 내 시스템에 반대되는) 활세포 내에서 발생하는 사건을 지칭하도록 사용될 수 있다.
단리된(isolated): 본원에서 사용되는 바, 용어 "단리된"은 (1) 최초에 생산되었을 때(자연적이고/이거나 실험 환경이거나) 결합된 적어도 일부의 구성성분으로부터 분리되고/되거나, (2) 사람의 손에 의해 생산, 제조 및/또는 제작된 물질 및/또는 실재물(entity)를 지칭한다. 단리된 물질 및/또는 실재물은 최초에 결합된 다른 구성성분의 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과로 분리될 수 있다. 일부 실시예에서, 단리된 제제는 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 약 99%, 또는 약 99% 초과의 순도이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 실질적으로 다른 구성성분이 없는 경우, 물질은 "순수"하다. 본원에서 사용된 바와 같이, 단리된 물질 및/또는 실재물의 순도 백분율의 계산에는 부형제(예를 들어, 완충액, 용매, 물 등)가 포함되지 않아야 한다.
지질 나노입자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "지질 나노입자" 또는 "리포솜"은 임의의 박막(lamellar), 다층막(multilamellar), 또는 고형분 나노입자 소낭을 지칭한다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 리포솜은 하나 이상의 지질을 혼합하거나 하나 이상의 지질 및 중합체를 혼합하여 형성될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 적합한 리포솜은 양이온성 지질, 및 선택적으로 비-양이온성 지질, 선택적으로 콜레스테롤계 지질, 및/또는 PEG-변형된 지질을 함유한다.
국소 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는 용어 "국소 분포", "국소 전달" 또는 이의 문법적으로 동등한 표현은 조직 특이적 전달 또는 분포를 지칭한다. 일반적으로, 국소 분포 또는 전달은 mRNA에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질(예를 들어, 효소)이 세포 내에서 번역되고 발현되는 것을 필요로 하거나, 제한적으로 분비되어 환자의 순환계 내로 들어가지 않는 것을 필요로 한다.
전령 RNA(mRNA): 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "전령 RNA(mRNA)"는 적어도 하나의 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다. 본원에서 사용된 바와 같이, mRNA는 변형 및 비변형 RNA 둘 다를 망라한다. mRNA는 하나 이상의 암호화 및 비암호화 영역을 함유할 수 있다. mRNA는 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용해 생산될 수 있고 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성되거나 기타일 수 있다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, mRNA는 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. mRNA 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시예에서, mRNA는 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 2-티오시티딘, 슈도우리딘, 및 5-메틸시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 염기); 삽입된(intercalated) 염기; 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나 이들을 포함한다.
mRNA 완전성: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mRNA 완전성"은 mRNA의 품질(quality)을 지칭한다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 분해되지 않은 mRNA의 백분율을 지칭한다. mRNA 완전성은 당 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어, RNA 아가로오스 겔 전기영동(예를 들어, Ausubel 등, John Weley & Sons, Inc., 1997, Current Protocols in Molecular Biology) 또는 모세관 전기영동에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 정량화되고 백분율로서 표현될 수 있다. 예를 들어, 모세관 전기영동 및 유사한 방법을 사용하여, 분해되지 않은 mRNA로부터 분해된 mRNA를 분리하는데 사용될 수 있고, 이어서 완전성 백분율, 즉, 총 mRNA에 대해 분해되지 않은 mRNA의 백분율이 생성된 크로마토그램으로부터의 상대 면적에 기초하여 계산될 수 있다.
N/P 비율: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "N/P 비율"은 지질 나노입자 내에서 캡슐화된 mRNA 중 음으로 하전된 분자 단위 대비 지질 나노입자에서 양이온성 지질 중 양으로 하전된 분자 단위의 몰비를 지칭한다. 　 이와 같이, N/P 비율은 일반적으로, 지질 나노입자 내에서 캡슐화된 mRNA 중 인산염기의 몰 대비 지질 나노입자에서 양이온성 지질 중 아민기의 몰의 비율로 계산된다.
핵산: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "핵산"은 가장 넓은 의미로, 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 임의의 화합물 및/또는 물질을 지칭한다. 일부 실시예에서, 핵산은 포스포디에스테르 연결을 통해 폴리뉴클레오티드 사슬에 혼입되거나 혼입될 수 있는 화합물 및/또는 물질이다. 일부 실시예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드)를 지칭한다. 일부 실시예에서, "핵산"은 개별 핵산 잔기를 포함하는 폴리뉴클레오티드 사슬을 지칭한다. 일부 실시예에서, "핵산"은 RNA뿐만 아니라 단일 및/또는 이중-가닥 DNA 및/또는 cDNA를 망라한다. 또한, 용어 "핵산", "DNA", "RNA", 및/또는 유사한 용어는 핵산 유사체, 즉, 포스포디에스테르 골격 이외의 것을 갖는 유사체를 포함한다. 예를 들어, 당 기술분야에 공지되어 있고, 골격 내에 포스포디에스테르 결합 대신에 펩티드 결합을 갖는, 소위 "펩티드 핵산"은 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 용어 "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열"은 서로의 축퇴형 버전(degenerate version)이고/이거나 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및/또는 RNA는 인트론을 포함할 수 있다. 핵산은 천연 공급원으로부터 정제될 수 있고, 재조합 발현 시스템을 사용하여 생산될 수 있고, 선택적으로 정제될 수 있으며, 화학적으로 합성될 수 있는 등이다. 적절한 경우, 예를 들어, 화학적으로 합성된 분자의 경우, 핵산은 화학적으로 변형된 염기 또는 당, 골격 변형체 등을 갖는 유사체와 같은 뉴클레오시드 유사체를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 달리 표시하지 않는 한, 5'에서 3' 방향으로 제시된다. 일부 실시예에서, 핵산은 천연 뉴클레오시드(예를 들어, 아데노신, 티미딘, 구아노신, 시티딘, 우리딘, 데옥시아데노신, 데옥시티미딘, 데옥시구아노신, 및 데옥시시티딘); 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기(예를 들어, 메틸화된 염기); 삽입된(intercalated) 염기; 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나 이들을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명은 구체적으로는, 전달을 용이하게 하거나 전달을 달성하기 위해 화학적으로 변형되지 않은 핵산(예를 들어, 뉴클레오티드 및/또는 뉴클레오시드를 포함하는, 폴리뉴클레오티드 및 잔기)를 의미하는 "비변형 핵산"에 관한 것이다. 일부 실시예에서, 뉴클레오티드 T 및 U는 서열 설명에서 상호 교환적으로 사용된다.
환자: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "환자" 또는 "대상체"는 예를 들어, 실험, 진단, 예방, 미용 및/또는 치료 목적을 위해 제공된 조성물이 투여될 수 있는 임의의 유기체를 지칭한다. 전형적인 환자는 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 비인간 영장류 및/또는 인간과 같은 포유동물)을 포함한다. 일부 실시예에서, 환자는 인간이다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다.
약학적으로 허용되는(pharmaceutically acceptable): 본원에서 사용된, 용어 "약학적으로 허용되는"은 철저한 의학적 판단의 범주내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이 인간과 동물의 조직과의 접촉에 있어 사용에 적합하고, 합리적인 유익성/위험성 비(benefit/risk ratio)에 상응하는 물질을 지칭한다.
약학적으로 허용되는 염: 약학적으로 허용되는 염은 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, S. M. Berge 등은 약학적으로 허용되는 염에 대해 J. Pharmaceutical Sciences (1977) 66:1-19에서 상세하게 기술하고 있다. 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용되는 염은 적합한 무기 및 유기 산과 염기로부터 유래된 것들을 포함한다. 약학적으로 허용되는 비독성 산 첨가염의 예는 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 인산, 황산 및 과염소산과 같은 무기산 또는 예를 들어 아세트산, 옥살산, 말레산, 타르타르산, 시트르산, 숙신산, 또는 말론산과 같은 유기산으로 형성된 아미노기의 염 또는 이온교환과 같은 당해 기술분야에서 사용되는 다른 방법을 사용하여 형성된 아미노기의 염이다. 다른 약학적으로 허용되는 염은 아디핀산염(adipate), 알긴산염(alginate), 아스코르브산염(ascorbate), 아스파르트산염(aspartate), 벤젠설폰산염(benzenesulfonate), 벤조산염(benzoate), 중황산염(bisulfate), 붕산염(borate), 낙산염(butyrate), 캄퍼산염(camphorate), 캄퍼설폰산염(camphorsulfonate), 시트르산염(citrate), 시클로펜탄프로피오네이트(cyclopentanepropionate), 다이글루코네이트(digluconate), 도데실설페이트(dodecylsulfate), 에탄설폰산염(ethanesulfonate), 포름산염(formate), 푸마르산염(fumarate), 글루코헵토네이트(glucoheptonate), 글리세로인산염(glycerophosphate), 글루코네이트(gluconate), 헤미설페이트(hemisulfate), 헵타노에이트(heptanoate), 헥사노에이트(hexanoate), 요오드화수소산염(hydroiodide), 2-하이드록시-에탄설폰산염(2-hydroxy-thanesulfonate), 락토바이온산염(lactobionate), 젖산염(lactate), 라우린산염(laurate), 라우릴설페이트(lauryl sulfate), 말산염(malate), 말레산염(maleate), 말론산염(malonate), 메탄설폰산염(methanesulfonate), 2-나프탈렌설폰산염(2-naphthalenesulfonate), 니코티네이트(nicotinate), 질산염(nitrate), 올레산염(oleate), 옥살산염(oxalate), 팔미트산염(palmitate), 파모산염(pamoate), 펙티닌산염(pectinate), 과황산염(persulfate), 3-페닐프로피온산염(3-phenylpropionate), 인산염(phosphate), 피크르산염(picrate), 피발산염(pivalate), 프로피온산염(propionate), 스테아르산염(stearate), 숙신산염(succinate), 황산염(sulfate), 주석산염(tartrate), 티오시안산염(thiocyanate), p-톨루엔설폰산염(p-toluenesulfonate), 운데카노에이트(undecanoate), 발레르산염(valerate salts) 등을 포함한다. 적절한 염기로부터 유래된 염은 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 암모늄, 및 N+(C1-4 알킬)4 염을 포함한다. 대표적인 알칼리 또는 알칼리 토금속 염은 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 추가의 염은, 적절한 경우, 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 할로겐화물, 수산화물, 카르복시산염, 황산염, 인산염, 질산염, 설폰산염 및 아릴 설폰산염과 같은 반대 이온을 사용하여 형성된 아민 양이온을 포함한다. 추가적인 약학적으로 허용되는 염은 예를 들어 알킬 할로겐화물과 같은 적절한 친전자물질을 사용하여 4급 알킬화된 아미노염(quarternized alkylated amino salt)을 형성하는 아민의 4급화로 형성된 염을 포함한다.
역가(potency): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "역가" 또는 문법적으로 동등한 표현은 mRNA에 의해 암호화되는 단백질 또는 펩티드의 발현 수준 및/또는 이에 기인하는 생물학적 효과를 지칭한다.
염: 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "염"은 산과 염기 사이의 중화 반응에 의해 생성되거나 생성될 수 있는 이온 화합물을 지칭한다.
전신 분포 또는 전달: 본원에서 사용되는, 용어 "전신 분포" 또는 "전신 전달" 또는 문법적으로 동등한 표현은 전신 또는 전체 유기체에 영향을 주는 전달 또는 분포 메커니즘 또는 접근법을 지칭한다. 일반적으로 전신 분포 또는 전달은 예를 들어, 혈류와 같은 신체의 순환계를 통해 달성된다. "국소 분포 또는 전달"의 정의와 비교한다.
대상체(subject): 본원에서 사용되는, 용어 "대상체"는 인간 또는 임의의 비인간 동물(예를 들어, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)를 지칭한다. 인간은 출생-전 및 출생-후 형태를 포함한다. 많은 실시예에서, 대상체는 인간이다. 대상체는 질환의 진단 또는 치료를 위해 의료 제공자에게 가는 인간을 지칭하는 것으로, 환자일 수 있다. 용어 "대상체"는 본원에서 "개인" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용된다. 대상체는 질환 또는 장애에 걸릴 수 있거나 취약하지만 질환 또는 장애의 증상을 보일 수 있거나 보이지 않을 수 있다.
실질적으로(substantially): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로(substantially)"는 관심있는 특징이나 특성의 전체 또는 거의 전체의 범위 또는 정도를 나타내는 정성적인(qualititave) 상태를 지칭한다. 생물학 분야의 숙련자라면 생물학적 및 화학적 현상이 완전해지고/지거나, 진행되어 완전해지거나, 절대적인 결과를 달성하거나 회피하는 것은 드물다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 용어 "실질적으로"는 많은 생물학적 현상 및 화학적 현상에 내재하는 완전함의 잠재적인 결여를 표현하기 위해 본원에서 사용된다.
실질적으로 없는(substantially free): 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "실질적으로 없는"은 제거될 물질(예를 들어, 조기 미성숙 RNA 서열)의 양이 상대적으로 거의 없거나 전혀 없는 상태를 지칭한다. 예를 들어, "조기 미성숙 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 조기 미성숙 RNA 서열이 불순물의 약 5%, 4%, 3%, 2%, 1.0%, 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1%(w/w)보다 더 적은 수준으로 존재한다는 것을 의미한다. 대안적으로, "조기 미성숙 RNA 서열이 실질적으로 없는"은 조기 미성숙 RNA 서열이 약 100 ng, 90 ng, 80 ng, 70 ng, 60 ng, 50 ng, 40 ng, 30 ng, 20 ng, 10 ng, 1 ng, 500 pg, 100 pg, 50 pg, 10 pg보다 더 적은 수준으로 존재한다는 것을 의미한다.
표적 조직(Target tissues): 본원에서 사용되는, 용어 "표적 조직"은 치료 대상 질환이 발생된 임의의 조직을 지칭한다. 일부 실시예에서, 표적 조직은 질환 관련 병상, 증상 또는 특징을 나타내는 조직을 포함한다.
치료 유효량(Therapeutically effective amount): 본원에서 사용되는, 용어 치료제의 "치료 유효량"은 질환, 장애 및/또는 병태를 앓고 있거나 이에 취약한 대상체에 투여했을 때, 질환, 장애 및/또는 병태의 증상의 발현을 치료, 진단, 예방 및/또는 지연하는 데 충분한 양을 의미한다. 당 기술분야의 숙련자라면 치료 유효량이 일반적으로 적어도 하나의 단위 용량을 포함하는 투여 요법을 통해 투여되는 것을 인정할 것이다.
치료 지수: 본원에서 사용되는 바와 같이, "치료 지수"는 약물이 독성으로 변하는 혈중 약물 농도와 약물이 효과적인 농도의 비율이다. 치료 지수가 클수록 약물은 더 안전하다.
치료: 본원에서 사용되는, 용어 "치료하다(treat) "치료(treatment)", 또는 "치료하는(treating)"는 부분적으로 또는 완전하게 특정 질환, 장애 및/또는 병태의 하나 이상의 증상 또는 특징을 경감시키고, 개선시키고, 완화시키고, 억제하고, 예방하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고/시키거나 이의 발생 빈도를 감소시키는 임의의 방법을 지칭한다. 질환의 징후를 보이지 않고/않거나 질환의 초기 징후만을 보이는 대상체에 질환과 관련된 병상이 생길 위험을 감소시킬 목적으로 치료가 시행될 수 있다.
수율: 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "수율(yield)"은 출발 물질로서의 총 mRNA과 비교해 캡슐화 후 회수된 mRNA의 백분율을 지칭한다. 일부 실시예에서, 용어 "회수(recovery)"는 용어 "수율"과 상호 교환적으로 사용된다.
발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
본 발명은, 무엇보다도, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제조하기 위한 개선된 공정을 제공한다. 단일 가닥인 전령 RNA는 이중 가닥 DNA 또는 siRNA보다 구조적으로 더 영향을 받기 쉽고(liable) 불안정하다. 또한, 포유동물 세포의 세포액에서 네이키드 이중-가닥 DNA의 반감기는 약 50분 내지 90분인 반면, 네이키드 mRNA의 반감기는 단 1초 또는 1초 미만인 것으로 보고되며; 반감기에 기초하여, mRNA는 DNA보다 약 5,500배 더 불안정적인 것으로 추정되었다. 종래 기술은, 구조적 변화에 의해 제한되지 않고 보다 안정한, 네이키드 핵산 또는 리포솜 복합체화된 핵산의 동결건조에 초점을 맞추었다. 그러나, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자는 mRNA 완전성을 또한 보존하면서 mRNA-LNP의 크기, PDI 및 캡슐화 효율을 변경할 수 있는 온도 및 압력 변화를 포함하는 다양한 힘을 견뎌야 한다. 따라서, 동결건조 동안 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA의 품질과 완전성을 유지하는 동시에, mRNA-LNP의 크기, PDI, 및 캡슐화 효율을 유지하는 것도 또한 과제이다. 본 발명은, 1) 동결건조 공정을 위해 아스코르브산을 첨가하는 단계, 2) mRNA-LNP 조성물을 완충액으로 전처리해서 동결건조 공정 전에 pH를 유지하는 단계, 및 3) 동결건조된 조성물의 온도를(예를 들어, 이차 건조 단계 동안) 고온(예를 들어, 15℃ 내지 30℃)으로 증가시키고 유지하는 각각의 단계가 동결건조 후 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA의 완전성을 개별적으로 그리고 집합적으로 개선할 수 있고, 이에 따라 장기 보관을 견딜수 있는 고도로 안정적인 동결건조된 mRNA-LNP 조성물이 생성될 수 있다는 놀라운 발견에 기초한다. 따라서, 일 측면에서, 본 발명은 장기 및 단기 보관을 위해 mRNA 완전성이 높은 안정적인 동결건조된 mRNA를 제조하는 개선된 방법을 제공한다.
동결건조 공정
동결건조(lyophilization) 또는 냉동-건조(freeze-drying)는 얼음이 액체 상을 통과하지 않고 고체에서 증기로 직접 변할 수 있게 하는, 동결 및 진공하에 둔 후 생성물으로부터 물을 제거하는 공정이다. 이러한 공정은 냉동, 일차 건조(기화), 및 이차 건조(탈습)의 3가지 개별적이고, 고유하며, 상호의존적인 공정으로 구성된다.
동결건조 동안, 생체분자를 함유하는 샘플은 초기에 용액의 빙점 미만으로 냉각되고 그에 따라 그 안에 함유된 물의 빙점 미만으로 냉각된다. 그 결과, 물이 냉동된다. 다른 파라미터들 중에서, 온도, 냉각 속도(냉동 속도), 및 냉동 시간에 따라, 결정이 형성될 수 있다. 이는, 용액의 생체분자 및 다른 성분에 물리적 스트레스를 가하는데, 이는, -핵산의 경우에- 가닥의 파괴, 수퍼코일의 손실 등과 같은, 생체분자의 손상을 초래할 수 있다. 또한, 수화 구체의 부피 감소 및 손실로 인해, 예를 들어 미량의 전이 금속에 의해 자가촉매 분해 공정이 선호된다. 또한, 미량의 산 및 염기의 농도는 pH 값의 상당한 변화를 초래할 수 있다.
동결건조는 두 가지 유형의 스트레스, 즉 냉동 및 건조를 포함한다. 두 가지 유형의 스트레스는 핵산을 손상시키는 것으로 알려져 있다. 문헌에서, 이러한 손상을 방지하기 위한 동결건조 목적으로 다수의 동해방지제(cryoprotectant) 및 동결보호제(lyoprotectant)가 논의된다. 이러한 맥락에서, 동해방지제는 부형제로서 이해되며, 이는 혼합물의 공융 온도 또는 유리 전이 온도 및/또는 얼음의 구조에 영향을 미칠 수 있게 한다. 동결보호제는 통상적으로 부형제이며, 이는 분자 주위의 수화 구체를 부분적으로 또는 완전히 대체하며, 따라서 적어도 부분적으로 촉매 및 가수분해 공정을 방지할 수 있다. 동결건조는 잠재적으로 구조 변화, 핵산 사슬의 파괴 또는 금속 오염과 같은 반응성 요소의 농축을 통해, 초기 동결건조 공정으로 인해 핵산에 약간의 손상을 야기할 수 있다.
전처리
냉동 전에, 동결건조용 조성물은 통상적으로 "전처리"된다. 전처리는 냉동 전에 생성물을 처리하는 임의의 방법을 포함한다. 이는 생성물을 농축하거나, 제형 변형(즉, 안정성을 증가시키고, 외관을 보존하고/하거나 공정을 개선하기 위한 성분의 첨가), 고-증기-압력 용매를 감소시키거나, 표면적을 증가시키는 것을 포함할 수 있다.
일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 조성물은 냉동 전에 전처리된다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액을 시트르산염 완충액, EDTA, 및 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 세척된다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액은 10 mM 시트르산염 완충액(pH 7.0), 1 mM EDTA, 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 세척된다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액은 10 mM 시트르산염 완충액(pH 7.0), 1 mM EDTA, 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 2회 세척된다.
일부 실시예에서, 아스코르브산은 냉동 전에 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액에 첨가된다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액은 아스코르브산을 포함하는 완충액으로 완충액 교환된다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액은 아스코르브산 및 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 완충액 교환된다.
일부 실시예에서, 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA를 포함하는 수용액을 10 mM 시트르산염 완충액(pH 7.0), 1 mM EDTA, 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 세척된 다음, 20 mM 아스코르브산 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 완충액을 교환된다
냉동 단계
냉동 단계 동안, 물질은 물질의 고체, 액체 및 기체 상들이 공존할 수 있는 최저 온도인 그의 삼중점 미만으로 냉각된다. 이는, 용융 보다는 승화가 다음 단계에서 일어나게 한다. 보다 빠르고 보다 효율적인 냉동-건조를 용이하게 하기 위해, 보다 큰 얼음 결정이 바람직하다. 큰 얼음 결정은 생성물 내에 네트워크를 형성하며, 이는 승화 동안 수증기의 신속한 제거를 촉진한다. 더 큰 결정을 생성하기 위해, 생성물을 서서히 냉동시키거나 어닐링이라 불리는 공정에서 온도를 위아래로 순환시킬 수 있다. 냉동 단계는 전체 냉동-건조 공정에서 가장 중요한데, 이는 냉동 방법이 재구성 속도, 냉동-건조 주기의 지속시간, 제품 안정성, 및 적절한 결정화에 영향을 미칠 수 있기 때문이다.
일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -20 ℃ 내지 100℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -30 ℃ 내지 -60℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -40 ℃ 내지 -50℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -40 ℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -50 ℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -45 ℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 수용액은 -40 ℃의 온도가 되어 냉동된 용액이 수득된다. 일부 실시예에서, 냉동 단계는 약 20시간 동안 지속된다. 일부 실시예에서, 냉동 단계는 약 15시간 동안 지속된다. 일부 실시예에서, 냉동 단계는 약 12시간 동안 지속된다. 일부 실시예에서, 냉동 단계는 약 10시간 동안 지속된다. 일부 실시예에서, 냉동 단계는 약 8시간 동안 지속된다. 일부 실시예에서, 냉동 단계는 약 5시간 동안 지속된다.
일차 건조 단계
일차 건조 단계 동안, 압력이 (몇 밀리바의 범위까지) 낮아지고, 얼음이 승화될 수 있도록 충분한 열이 물질에 공급된다. 필요한 열의 양은 승화 분자의 승화의 잠재 열을 사용하여 계산될 수 있다. 이러한 초기 건조 단계에서, 물질 내의 물의 약 95%가 승화된다. 이러한 단계에서, 압력은 부분 진공의 인가를 통해 제어된다. 진공은 승화 속도를 높여서, 의도적인 건조 공정으로서 유용하다. 또한, 냉각 응축기 챔버 및/또는 응축기 플레이트는 수증기가 다시 액화되고 응고되도록 표면을 제공한다.
일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 빙점 미만의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 0℃ 내지 -100℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 -10℃ 내지 -50℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 -20℃ 내지 -30℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 -30℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 -25℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 -20℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 -15℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 -10℃의 온도에서 수행된다.
일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 4580 mTorr(4.58 Torr) 미만의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 0 mTorr 내지 300 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 10 mTorr 내지 200 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 20 mTorr 내지 60 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 100 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 80 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 60 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 50 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 40 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 30 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 20 mTorr의 압력에서 수행된다.
일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 5시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 10시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 15시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 20시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 30시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 50시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 75시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 100시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 110시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 120시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 130시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 140시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 150시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 160시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 170시간 초과 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 200시간 초과 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 10 내지 300시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 50 내지 200시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 100 내지 150시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 120시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 130시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 140시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 150시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 일차 건조 단계는 약 160시간 동안 수행된다.
이차 건조 단계
이차 건조 단계는 동결되지 않은 물 분자를 제거하는 것을 목표로 하며, 이는 얼음이 일차 건조 단계에서 제거되었기 때문이다. 냉동-건조 공정의 이러한 부분은 물질의 흡착 등온선에 의해 조절된다. 이러한 단계에서, 온도는 일차 건조 단계보다 더 높게 상승되고, 심지어 0℃(32℉)를 초과할 수 있어서, 물 분자와 동결 물질 사이에 형성된 임의의 물리-화학적 상호작용을 파괴할 수 있다. 일반적으로, 압력은 또한 (일반적으로 마이크로바의 범위, 또는 파스칼의 분획에서) 탈습을 촉진하기 위해 이 단계에서 낮아진다. 통상적으로, 전통적인 동결건조 공정의 이차 건조 단계의 종료 시, 수분 함량은 1% 초과, 예를 들어 ~3-4%이다.
일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 0℃ 내지 50℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 5℃ 내지 40℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 20℃ 내지 30℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 20℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 25℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 30℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 15℃의 온도에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 10℃의 온도에서 수행된다.
일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 4580 mTorr(4.58 Torr) 미만의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 0 mTorr 내지 300 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 10 mTorr 내지 200 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 20 mTorr 내지 60 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 100 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 80 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 60 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 50 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 40 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 30 mTorr의 압력에서 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 20 mTorr의 압력에서 수행된다.
일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 5시간 미만 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 10시간 미만 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 15시간 미만 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 20시간 미만 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 30시간 미만 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 50시간 미만 동안 수행된다.
일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 1 내지 20시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 3 내지 15시간 동안 수행된다. 일부 실시예에서, 이차 건조 단계는 약 5 내지 12시간 동안 수행된다.
일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 3% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 2.5% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 2% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 1% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 0.8% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 0.5% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 0.3% 미만을 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 약 0.1% 내지 3%를 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 동결건조된 조성물은 이차 건조 단계 후 수분 함량의 약 0.5% 내지 1%를 포함한다.
동결보호제 및 부형제
동결보호제는 건조 단계 동안 활성 성분, 예를 들어, mRNA-LNP를 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질이다. 동결보호제의 예는 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, 동결보호제는 탄수화물 예를 들어 글루코오스, 프럭토오스, 갈락토오스, 소르보오스, 만노오스, 및 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, 동결보호제는 디사카라이드 예를 들어 락토오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 셀로비오스, 및 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, 동결보호제는 폴리사카라이드, 예를 들어 라피노오스, 멜레지토오스, 말토덱스트린, 덱스트란, 덱스트린, 셀룰로오스, 전분, 및 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, 동결보호제는 알디톨, 예를 들어 글리세롤, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 락티톨, 자일리톨 소르비톨, 피라노실 소르비톨, 미오이노시톨, 및 이들의 조합이다. 일부 실시예에서, 동결보호제는 당, 예를 들어 락토오스, 만노오스, 만니톨, 수크로오스, 트레할로오스, 또는 이들의 조합이다. 일반적으로, 이러한 맥락에서 바람직한 당은 높은 물 변위 활성 및 높은 유리 전이 온도를 갖는다. 또한, 사용하기에 적합한 당은 바람직하게는 친수성이지만 흡습성은 아니다. 또한, 당은 바람직하게는 결정화되는 경향이 낮다. 일부 실시예에서, 동결보호제는 트레할로오스다. 또한, 하기 정의된 추가 성분 중 어느 하나가 동결보호제로서 사용될 수 있다. 특히, 알코올 예를 들어 PEG, 만니톨, 소르비톨, 시클로덱스트란, DMSO, 아미노산 및 단백질 예를 들어 프롤린, 글리신, 페닐알라닌, 아르기닌, 세린, 알부민 및 젤라틴이 동결보호제로서 사용될 수 있다. 추가적으로, 하기 정의된 바와 같은 금속 이온, 계면활성제 및 염이 동결보호제로서 사용될 수 있다. 또한, 중합체는 동결보호제, 특히 폴리비닐피롤리돈으로서 사용될 수 있다.
일부 실시예에서, 이러한 방법은 동해방지제를 첨가하는 단계를 포함한다. 동해방지제는 냉동 단계 동안 활성 성분, 예를 들어 mRNA-LNP를 보호하기 위해 제형에 첨가되는 물질로 이해된다. 동해방지제의 예는 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 디메틸 설폭시드(DMSO)이다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 에틸렌 글리콜이다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 글리세롤이다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 프로필렌 글리콜이다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 2-메틸-2, 4-펜탄디올(MPD)이다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 트레할로오스다. 일부 실시예에서, 동해방지제는 포름아미드, 글리세롤 3-포스페이트, 프롤린, 소르비톨, 디에틸 글리콜, 수크로오스, 트리에틸렌 글리콜, 또는 중합체이다.
일부 실시예에서, 이러한 방법은 부형제를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 항산화제를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 아스코르브산을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 시트르산을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 메티오닌을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 토코페롤을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 프로필 갈레이트를 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 삼차 부틸히드로퀴논을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 부틸화된 히드록시아니솔을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 이러한 방법은 부틸화된 히드록시톨루엔을 첨가하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, 부형제는 냉동 단계 전에 수용액에 첨가된다. 일부 실시예에서, 아스코르빅은 냉동 단계 전에 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 수용액에 첨가된다.
동결건조된 mRNA의 특성 분석
본원에 제공된 동결건조 방법은 실질적으로 높은 mRNA 완전성을 가지며 단기 및 장기 보관 후 완전성을 유지하는 안정적인 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 생성한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "mRNA 완전성"은 일반적으로 동결건조 후 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA의 품질을 지칭한다. mRNA 완전성은 당 기술분야에 잘 알려진 방법을 사용하여, 예를 들어 RNA 아가로오스 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동 (CE)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 CE에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 겔 전기영동(CGE)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 모세관 구역 전기영동(CZE)에 의해 결정된다. 일부 실시예에서, mRNA 완전성은 RNA 아가로오스 겔 전기영동의 밴딩 패턴(banding pattern)에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따라 정제된 mRNA는 RNA 아가로오스 겔 전기영동의 기준 밴드와 비교하여 밴딩을 거의 나타내지 않거나 전혀 나타내지 않는다.
모세관 전기영동(CE)에 의한 RNA 완전성 분석
RNA 완전성은 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 모세관 전기영동(CE)을 사용하여 평가될 수 있다. 간략하게, RNA 샘플이 전기영동식으로 분리되고, 단편이 UV 검출 분광계 또는 레이저-유도 형광 측정을 통해 검출된다. 합성된 mRNA의 전장 전사체 또는 불현 전사체의 상대적인 양은 전장 전사체 또는 불현 전사체에 대응하는 상대 피크 면적에 의해 결정된다.
모세관 겔 전기영동(CGE)에 의한 RNA 완전성 분석
RNA 완전성은 당 기술분야에 공지된 방법에 의해 모세관 겔 전기영동(CGE)을 사용하여 평가될 수 있다. 간략하게, RNA 샘플이 겔 상에서 분리된다. 이어서, 겔이 분석되어 밴딩 패턴 및 겉보기 뉴클레오티드 길이가 분석 기준 표준과 일치하는지 여부가 결정된다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 2개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 3개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 5개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 6개월 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 2℃ 내지 8℃의 온도에서 1년 초과 동안 보관 시 약 80% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 3일 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3일 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 1주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 1주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 2주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 2주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 3주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 3주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 4주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 실온(예를 들어, 15℃ 내지 25℃에서 5주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 20% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 30% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 40% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 45% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 50% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 55% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 60% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 65% 이상이다. 일부 실시예에서, 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성은 15℃ 내지 25℃의 온도에서 5주 초과 동안 보관 시 약 70% 이상이다.
mRNA 합성
본 발명에 따른 mRNA는 알려진 다양한 방법 중 어느 하나에 따라 합성될 수 있다. 여러 가지 방법이 미국 특허 출원 제US 2018/0258423호에 기술되어 있으며, 이 내용 전체는 본원에 참조로서 포함된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 mRNA는 시험관 내 전사(IVT, in vitro transcription)를 통해 합성될 수 있다. 요약하면, IVT는 일반적으로 프로모터를 함유하는 선형 또는 원형 DNA 템플릿, 리보뉴클레오티드 트리포스페이트의 풀, DTT 및 마그네슘 이온을 포함할 수 있는 완충액 시스템, 및 적합한 RNA 중합효소(예를 들어, T3, T7, 또는 SP6 RNA 중합효소), DNAse I, 피로포스파타제, 및/또는 RNAse 억제제로 수행된다. 정확한 조건은 특정 응용예에 따라 달라질 것이다.
일부 실시예에서, 적합한 mRNA 서열은 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA 서열이다. 일부 실시예에서, 적합한 mRNA 서열은 효율적인 인간 세포 발현에 최적화된 코돈이다. 일부 실시예에서, 적합한 mRNA 서열은 자연 발생 서열 또는 야생형 서열이다. 일부 실시예에서, 적합한 mRNA 서열은 아미노산 서열에 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 단백질 또는 펩티드를 암호화한다.
본 발명은 다양한 길이의 안정적인 동결건조된 mRNA를 제조하는데 사용될 수있다. 일부 실시예에서, 본 발명은 길이가 약 0.5 kb, 1 kb, 1.5 kb, 2 kb, 2.5 kb, 3 kb, 3.5 kb, 4 kb, 4.5 kb, 5 kb 6 kb, 7 kb, 8 kb, 9 kb, 10 kb, 11 kb, 12 kb, 13 kb, 14 kb, 15 kb, 20 kb, 30 kb, 40 kb, 또는 50 kb 이상인 시험관 내 합성된 mRNA를 전달하는데 사용될 수있다. 일부 실시예에서, 본 발명은 길이가 약 1 kb 내지 20 kb, 약 1 kb 내지 15 kb, 약 1 kb 내지 10 kb, 약 5 kb 내지 20 kb, 약 5 kb 내지 15 kb, 약 5 kb 내지 12 kb, 약 5 kb 내지 10 kb, 약 8 kb 내지 20 kb, 또는 약 8 kb 내지 50 kb 범위인 시험관 내 합성된 mRNA를 전달하는데 사용될 수있다.
일부 실시예에서, 본 발명에 따른 mRNA의 제조를 위해, DNA 템플릿이 시험관 내에서 전사된다. 적절한 DNA 템플릿은 일반적으로, 시험관 내 전사를 위한 프로모터, 예를 들어, T3, T7 또는 SP6 프로모터를 가지며, 원하는 mRNA에 대한 원하는 뉴클레오티드 서열 및 종결 신호가 이어진다.
뉴클레오티드
다양한 자연 발생 뉴클레오시드 또는 변형된 뉴클레오시드가 본 발명에 따른 mRNA를 생산하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, mRNA는 자연 발생 뉴클레오시드(또는 비변형된 뉴클레오티드; 예를 들어, 아데노신, 구아노신, 시티딘, 우리딘); 뉴클레오시드 유사체(예를 들어, 2-아미노아데노신, 2-티오티미딘, 이노신, 피롤로-피리미딘, 3-메틸 아데노신, 5-메틸시티딘, C-5 프로피닐-시티딘, C-5 프로피닐-우리딘, 2-아미노아데노신, C5-브로모우리딘, C5-플루오로우리딘, C5-요오도우리딘, C5-프로피닐-우리딘, C5-프로피닐-시티딘, C5-메틸시티딘, 2-아미노아데노신, 7-데아자아데노신, 7-데아자구아노신, 8-옥소아데노신, 8-옥소구아노신, O(6)-메틸구아닌, 슈도우리딘, (예를 들어, N-1-메틸-슈도우리딘), 2-티오우리딘, 및 2-티오시티딘); 화학적으로 변형된 염기; 생물학적으로 변형된 염기 (예를 들어, 메틸화된 염기); 삽입된(intercalated) 염기; 변형된 당(예를 들어, 2'-플루오로리보오스, 리보오스, 2'-데옥시리보오스, 아라비노오스, 및 헥소오스); 및/또는 변형된 포스페이트기(예를 들어, 포스포로티오에이트 및 5'-N-포스포르아미다이트 연결)이거나 이를 포함한다.
일부 실시예에서, 적합한 mRNA는 골격 변형, 당 변형 및/또는 염기 변형을 함유할 수 있다. 일부 실시예에서, 변형된 뉴클레오티드는 비제한적으로 변형된 퓨린(아데닌(A), 구아닌(G)) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C), 우라실(U)), 및 퓨린의 변형된 뉴클레오티드 유사체 또는 유도체 및 피리미딘, 예를 들어 예를 들어 1-메틸-아데닌, 2-메틸-아데닌, 2-메틸티오-N-6-이소펜테닐-아데닌, N6-메틸-아데닌, N6-이소펜테닐-아데닌, 2-티오-시토신, 3-메틸-시토신, 4-아세틸-시토신, 5-메틸-시토신, 2,6-디아미노퓨린, 1-메틸-구아닌, 2-메틸-구아닌, 2,2-디메틸-구아닌, 7-메틸-구아닌, 이노신, 1-메틸-이노신, 슈도우라실 (5-우라실), 디히드로-우라실, 2-티오-우라실, 4-티오-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오-우라실, 5-(카르복시히드록시메틸)-우라실, 5-플루오로-우라실, 5-브로모-우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-우라실, 5-메틸-2-티오-우라실, 5-메틸-우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 5-메틸아미노메틸-우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오-우라실, 5'-메톡시카르보닐메틸-우라실, 5-메톡시-우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 우라실-5-옥시아세트산(v), 1-메틸-슈도우라실, 쿠에오신, .베타.-D-만노실-쿠에오신, 와이부톡소신, 및 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트, 펩티드 뉴클레오티드, 메틸포스포네이트, 7-데아자구아노신, 5-메틸시토신 및 이노신을 포함할 수 있다. 이와 같은 유사체의 제조는 예를 들어, 미국 등록특허 번호 제4,373,071호, 미국 등록특허 번호 제4,401,796호, 미국 등록특허 번호 제4,415,732호, 미국 등록특허 번호 제4,458,066호, 미국 등록특허 번호 제4,500,707호, 미국 등록특허 번호 제4,668,777호, 미국 등록특허 번호 제4,973,679호, 미국 등록특허 번호 제5,047,524호, 미국 등록특허 번호 제5,132,418호, 미국 등록특허 번호 제5,153,319호, 미국 등록특허 번호 제5,262,530호, 및 미국 등록특허 번호 제5,700,642호로부터 숙련자에게 공지되어 있고, 이들 개시내용은 그 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
일부 실시예에서, mRNA는 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함한다. 비표준 뉴클레오티드 잔기는, 예를 들어, 5-메틸-시티딘("5mC"), 슈도우리딘("ψU"), 및/또는 2-티오-우리딘("2sU")을 포함할 수 있다. 이러한 잔기 및 이들의 mRNA로의 혼입에 대한 논의는 예를 들어, 미국 특허 제8,278,036호 또는 국제 공개 WO 2011/012316을 참조한다. mRNA는 25%의 U 잔기가 2-티오-우리딘이고 25%의 C 잔기는 5-메틸시티딘인 RNA로서 정의되는 RNA일 수 있다. RNA의 사용에 대한 교시는 미국 특허 공개 US 2012/0195936 및 국제 공개 WO 2011/012316에 개시되어 있으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 본원에 통합된다. 비표준 뉴클레오티드 잔기의 존재는 동일한 서열을 가지되 표준 잔기만을 함유하는 대조군 mRNA보다 mRNA를 더 안정시킬 수 있고/있거나 면역원성을 덜 가지게 할 수 있다. 다른 실시예에서, mRNA는 이소시토신, 슈도이소시토신, 5-브로모우라실, 5-프로피닐우라실, 6-아미노퓨린, 2-아미노퓨린, 이노신, 디아미노퓨린 및 2-클로로 -6-아미노퓨린 시토신뿐만 아니라 이들 변형체 및 다른 핵염기의 변형체의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 비표준 뉴클레오티드 잔기를 포함할 수 있다. 일부 실시예는 푸라노오스 고리 또는 핵염기에 대한 추가의 변형을 추가로 포함할 수 있다. 추가 변형은 예를 들어 당 변형 또는 치환(예를 들어, 2'-O-알킬 변형, 잠금 핵산(LNA) 중 하나 이상)을 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, RNA는 추가 폴리뉴클레오티드 및/또는 펩티드 폴리뉴클레오티드(PNA)와 복합체를 구성하거나 혼성화될 수 있다. 당 변형이 2'-O-알킬 변형인 일부 실시예에서, 이러한 변형은 2'-데옥시-2'-플루오로 변형, 2'-O-메틸 변형, 2'-O- 메톡시에틸 변형, 및 2'-데옥시 변형을 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시예에서, 이들 변형 중 어느 하나는 뉴클레오티드의 0% 내지 100%로 - 예를 들어 구성 뉴클레오티드의 0%, 1%, 10%, 25%, 50%, 75%, 85%, 90%, 95% 초과, 또는 100%로 개별적으로 또는 조합하여 존재할 수 있다.
일부 실시예에서, mRNA는 RNA 골격 변형을 함유할 수 있다. 전형적으로, 골격 변형은 RNA에 함유된 뉴클레오티드의 골격의 인산이 화학적으로 변형된 변형이다. 예시적인 골격 변형은 이에 제한되지 않지만, 메틸포스포네이트, 메틸포스포르아미데이트, 포스포르아미데이트, 포스포로티오에이트(예를 들어, 시티딘 5'-O-(1-티오포스페이트)), 보라노포스페이트, 양으로 하전된 구아니디늄기 이루어진 군으로부터의 변형을 포함하되, 이는 다른 음이온기, 양이온기, 또는 중성기에 의해 포스포디에스테르 연결을 대체하는 것을 의미한다.
일부 실시예에서, mRNA는 당 변형을 함유할 수 있다. 전형적인 당 변형은 뉴클레오티드의 당의 화학적 변형으로, 이에 제한되지 않지만, 2'-데옥시-2'-플루오로-올리고리보뉴클레오티드 (2'-플루오로-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-플루오로-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-데옥시-2'-디아민-올리고리보뉴클레오티드 (2'-아미노-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아미노-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-O-알킬올리고리보뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드 (2'-O-메틸시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-메틸우리딘 5'-트리포스페이트), 2'-C-알킬올리고리보뉴클레오티드, 및 이들의 이성질체(2'-아르시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아르우리딘 5'-트리포스페이트), 또는 아지도트리포스페이트(2'-아지도-2'-데옥시시티딘 5'-트리포스페이트, 2'-아지도-2'-데옥시우리딘 5'-트리포스페이트)로 이루어진 군에서 선택된 당 변형을 함유한다.
합성-후 공정
일반적으로, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성 후에 첨가될 수 있다. 캡의 존재는 대부분의 진핵세포에서 발견되는 뉴클레아제에게 내성을 제공하는데 있어서 중요하다. "꼬리"의 존재는 엑소뉴클레아제 분해로부터 mRNA를 보호하는 역할을 한다.
5' 캡은 전형적으로 다음과 같이 추가된다: 우선, RNA 말단 인산가수분해효소가 5' 뉴클레오티드로부터 말단 인산기 중 하나를 제거하고, 2개의 말단 인산기를 남긴다; 그런 다음, 구아노신 트리포스페이트(GTP)가 구아닐릴 전이효소를 통해 말단 인산에 첨가되고 5'5'5 트리포스페이트 연결을 생성한다; 그런 다음 구아닌의 7-질소가 메틸기 전이효소에 의해 메틸화된다. 캡 구조의 예는, m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A 및 G(5')ppp(5')G를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 캡 구조는 공개된 미국 특허 출원 제2016/0032356호 및 공개된 미국 출원 제2018/0125989호에 기술되어 있으며, 이들은 참조로서 본원에 통합된다.
일반적으로, 꼬리 구조는 폴리(A) 및/또는 폴리(C) 꼬리를 포함한다. mRNA의 3' 말단에 있는 폴리-A 꼬리 또는 폴리-C 꼬리는 각각 적어도 50개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 150개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 200개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 250개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 300개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 350개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 400개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 450개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 500개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 550개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 600개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 650개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 700개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 750개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 800개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 850개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 900개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 적어도 950개의 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 적어도 1 kb 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드를 일반적으로 포함한다. 일부 실시예에서, 폴리 A 꼬리 또는 폴리 C 꼬리는 각각 약 10개 내지 800개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드(예를 들어, 약 10개 내지 200개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 300개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 400개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 500개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 550개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 50개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 100개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 150개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 200개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 250개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 300개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 350개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 400개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 450개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 500개 내지 600개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 150개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 10개 내지 100개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 약 20개 내지 70개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드, 또는 약 20개 내지 60개 아데노신 또는 시토신 뉴클레오티드)일 수 있다. 일부 실시예에서, 꼬리 구조는 본원에서 설명된 다양한 길이를 갖는 폴리(A) 및 폴리(C) 꼬리의 조합을 포함한다. 일부 실시예에서, 꼬리 구조는 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 아데노신 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시예에서, 꼬리 구조는 적어도 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%의 시토신 뉴클레오티드를 포함한다.
본원에 기술된 바와 같이, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리의 첨가는 시험관 내 합성 동안 생성된 불현 전사체의 검출을 용이하게 하는데, 이는 캡핑 및/또는 테일링이 없을 때, 조기 불현성 mRNA 전사체들의 크기가 너무 작아 검출될 수 없기 때문이다. 따라서, 일부 실시예에서, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성된 mRNA에 첨가된 후, mRNA의 순도(예를 들어, mRNA에 존재하는 불현 전사체의 수준)가 시험된다. 일부 실시예에서, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성된 mRNA에 첨가된 후, mRNA가 본원에 기술된 바와 정제된다. 다른 실시예에서, 5' 캡 및/또는 3' 꼬리가 합성된 mRNA에 첨가되기 전, mRNA가 본원에 기술된 바와 정제된다.
본 발명에 따라 합성된 mRNA는 추가 정제 없이 사용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따라 합성된 mRNA는 쇼트머를 제거하는 단계 없이 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명에 따라 합성된 mRNA는 추가로 정제될 수 있다. 다양한 방법이 본 발명에 따라 합성된 mRNA를 정제하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, mRNA의 정제는 원심분리, 여과, 및/또는 크로마토그래피 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 일부 실시예에서, 합성된 mRNA는 에탄올 침전 또는 여과 또는 크로마토그래피, 또는 겔 정제 또는 임의의 다른 적절한 수단에 의해 정제된다. 일부 실시예에서, mRNA는 HPLC에 의해 정제된다. 일부 실시예에서, mRNA는 숙련자에게 잘 알려진 표준 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올 용액에서 추출된다. 일부 실시예에서, mRNA는 접선 유동 여과를 사용하여 정제된다. 적절한 정제 방법은, 그 모든 내용이 본원에 참조로서 통합되고 본 발명을 실시하는 데 사용될 수 있는, 공개된 미국 특허 출원 US 2016/0040154, 공개된 미국 특허 출원 US 2015/0376220, 공개된 미국 특허 출원 US 2018/0251755, 공개된 미국 특허 출원 2018/0251754, 2018년 11월 8일자로 출원된 미국 가출원 62/757,612, 및 2019년 8월 26일자로 출원된 미국 가출원 62/891,781에 기술되어 있는 내용을 포함한다.
일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전에 정제된다. 일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 후에 정제된다. 일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 및 후 모두에서 정제된다.
일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 원심분리에 의해 정제된다.
일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 여과에 의해 정제된다.
일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 접선 유동 여과(TFF)에 의해 정제된다.
일부 실시예에서, mRNA는 캡핑 및 테일링 전 또는 후, 또는 전 및 후 모두에 크로마토그래피에 의해 정제된다.
정제된 mRNA의 특성 분석
mRNA 조성물은 짧은 미성숙 RNA 종(abortive RNA species), 긴 미성숙 RNA 종, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 잔류 플라스미드 DNA, 잔류 시험관 내 전사 효소, 잔류 용매, 및/또는 잔류 염을 포함하는 오염 물질이 실질적으로 없다.
본원에 기술된 mRNA 조성물은 약 60% 내지 약 100%의 순도를 갖는다. 따라서, 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 60%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 65%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 70%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 75%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 80%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 85%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 90%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 91%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 92%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 93%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 94%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 95%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 96%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 97%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 98%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 99%의 순도를 갖는다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA는 약 100%의 순도를 갖는다.
일부 실시예에서, 본원에 기술된 mRNA는 전장 mRNA 이외의 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 및/또는 0.1% 미만의 불순물을 갖는다. 불순물은 IVT 오염물질, 예를 들어, 단백질, 효소, DNA 템플릿, 유리 뉴클레오티드, 잔류 용매, 잔류 염, 이중 가닥 RNA(dsRNA), 조기 미성숙 RNA 서열("쇼트머" 또는 "짧은 미성숙 RNA 종"), 및/또는 긴 미성숙 RNA 종을 포함한다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA에는 공정 효소가 실질적으로 없다.
일부 실시예에서, 본 발명의 정제된 mRNA에서 잔류 플라스미드 DNA는 약 1 pg/mg 미만, 약 2 pg/mg 미만, 약 3 pg/mg 미만, 약 4 pg/mg 미만, 약 5 pg/mg 미만, 약 6 pg/mg 미만, 약 7 pg/mg 미만, 약 8 pg/mg 미만, 약 9 pg/mg 미만, 약 10 pg/mg 미만, 약 11 pg/mg 미만, 또는 약 12 pg/mg 미만이다. 따라서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 1 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 2 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 3 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 4 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 5 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 6 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 7 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 8 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 9 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 10 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 11 pg/mg 미만이다. 일부 실시예에서, 정제된 mRNA 내의 잔류 플라스미드 DNA는 약 12 pg/mg 미만이다.
전달 비히클
본 발명에 따르면, 본원에 기술된 바와 같은 단백질 또는 펩티드(예를 들어, 전장, 단편, 또는 단백질 또는 펩티드의 일부)를 암호화하는 mRNA는 지질 나노입자로 전달될 수 있다.
일부 실시예에서, 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA는 단일 전달 비히클을 통해 전달될 수 있다. 일부 실시예에서, 적어도 하나의 단백질 또는 펩티드를 암호화하는 mRNA는 하나 이상의 전달 비히클을 통해 각각의 상이한 조성물에 전달될 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 mRNA 및/또는 은 동일한 지질 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 mRNA는 별도의 지질 나노입자 내에 캡슐화된다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자는 비어 있다.
리포솜 전달 비히클
일부 실시예에서, 적합한 전달 비히클은 리포솜 전달 비히클, 예를 들어 지질 나노입자이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 리포솜 전달 비히클, 예를 들어 지질 나노입자이는 보통 하나 이상의 이중층 막에 의해 외부 매질로부터 격리된 내부의 수성(aqua) 공간을 가지는 미세 소낭(microscopic vesicles)으로서 특징지어진다. 리포솜의 이중층 막은 공간적으로 분리된 친수성 및 소수성 도메인을 포함하는 합성 또는 천연 유래의 지질과 같은 양친매성 분자에 의해 전형적으로 형성된다(Lasic, Trends Biotechnol., 16: 307-321, 1998). 리포솜의 이중층 막은 양쪽 친매성(amphiphilic) 중합체 및 계면활성제(예를 들어, 폴리머좀, 니오좀 등)에 의해 형성될 수도 있다. 본 발명의 맥락에서, 리포솜 전달 비히클은 일반적으로 원하는 핵산(예를 들어, mRNA)를 표적 세포 또는 조직으로 수송하는 역할을 한다. 일부 실시예에서, 나노입자 전달 비히클은 리포솜이다. 일부 실시예에서, 리포솜은 하나 이상의 양이온성 지질, 하나 이상의 비양이온성 지질, 하나 이상의 콜레스테롤계 지질, 또는 하나 이상의 PEG-변형 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 리포솜은 3개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함한다. 일부 실시예에서, 하나의 구별되는 지질 성분은 스테롤계 양이온성 지질이다.
양이온성 지질
본원에서 사용되는 바와 같이, "양이온성 지질"이란 문구는 생리적인 pH와 같은 선택된 pH에서 순 양전하를 띄는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2010/144740호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (6Z,9Z,28Z,31Z)-헵타트리아콘타-6,9,28,31-테트라엔-19-일 4-(디메틸아미노) 부타노에이트:
Figure pct00001
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2013/149140호에 기재된 이온화(ionizable) 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화학식 중 하나의 양이온성 지질:
Figure pct00002
,
Figure pct00003
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 식 중, R1 및 R2는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C1-C20 알킬 및 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 아실로 이루어진 군에서 선택되고, L1 및 L2는 각각 독립적으로 수소, 선택적으로 치환된 C1-C30 알킬, 선택적으로 치환된 가변적으로 불포화된 C1-C30 알케닐, 및 선택적으로 치환된 C1-C30 알키닐로 이루어진 군에서 선택되며, m 및 o는 각각 독립적으로 0 및 임의의 양의 정수(예를 들어, m은 3)로 이루어진 군에서 선택되고, n은 0이거나 임의의 양의 정수(예를 들어, n은 1)이다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-(9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-l-일) 테트라코사-15,18-디엔-1-아민("HGT5000"):
Figure pct00004
(HGT-5000)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z, 18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-4,15,18-트리엔-l-아민("HGT5001"):
Figure pct00005
(HGT-5001)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 (15Z,18Z)-N,N-디메틸-6-((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔-1-일) 테트라코사-5,15,18-트리엔-1-아민("HGT5002"):
Figure pct00006
(HGT-5002)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2010/053572호에 아미노 알코올 리피도이드로 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00007
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118725호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00008
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/118724호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00009
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 이온은 14,25-디트리데실 15,18,21,24-테트라아자-옥타트리아콘탄의 화학식을 갖는 양이온성 지질 및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2013/063468호 및 WO 2016/205691호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00010
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 식 중, RL의 각 인스턴스는 독립적으로 임의 치환된 C6-C40 알케닐이다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00011
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00012
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00013
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00014
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/184256호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00015
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 식 중, 각각의 X는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 Y는 독립적으로 O 또는 S이고, 각각의 m은 독립적으로 0 내지 20이고, 각각의 n은 독립적으로 1 내지 6이고, 각각의 RA는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴(carbocycl일), 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴(heterocycl일), 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이고, 각각의 RB는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-50 알킬, 임의로 치환된 C2-50 알케닐, 임의로 치환된 C2-50 알키닐, 임의로 치환된 C3-10 카보시클릴, 임의로 치환된 3-14원 헤테로시클릴, 임의로 치환된 C6-14 아릴, 임의로 치환된 5-14원 헤테로아릴 또는 할로겐이다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 다음의 화합물 구조를 갖는 "표적 23":
Figure pct00016
(표적 23)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2016/004202호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00017
Figure pct00018
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00019
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00020
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합되는, 미국 특허 가출원 제62/758,179호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00021
,
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 식 중, 각각의 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 지방족이고; 각각의 m은 독립적으로 1 내지 4의 값을 갖는 정수이고; 각각의 A는 독립적으로 공유 결합 또는 아릴렌이고; 각각의 L1은 독립적으로 에스테르 기, 티오에스테르 기, 이황화 기, 또는 무수물 기이고; 각각의 L2는 독립적으로 C2-C10 지방족이고; 각각의 X1은 독립적으로 H 또는 OH이며; 각각의 R3은 독립적으로 C6-C20이다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00022
(화합물 1)
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00023
(화합물 2)
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00024
(화합물 3)
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 통합된 J. McClellan, M. C. King, Cell 2010, 141, 210-217 및 Whitehead 등, Nature Communications (2014) 5:4277에 기술된 것과 같은 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 양이온성 지질은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00025
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2015/199952호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00026
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00027
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00028
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00029
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00030
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00031
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00032
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00033
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00034
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00035
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00036
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00037
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00038
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/004143호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00039
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00040
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00041
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00042
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00043
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00044
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00045
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00046
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질
Figure pct00047
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00048
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00049
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00050
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00051
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00052
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00053
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00054
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00055
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/075531호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질:
Figure pct00056
또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하며, 식 중, L1 또는 L2 중 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O)x, -S-S-, -C(=O)S-, -SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa-, 또는 -NRaC(=O)O-이고, L1 또는 L2 중 다른 하나는 -O(C=O)-, -(C=O)O-, -C(=O)-, -O-, -S(O) x, -S-S-, -C(=O)S-, SC(=O)-, -NRaC(=O)-, -C(=O)NRa-, ,NRaC(=O)NRa-, -OC(=O)NRa- 또는 -NRaC(=O)O-이거나 직접 결합이고, G1 및 G2는 각각 독립적으로 치환되지 않은 C1-C12 알킬렌 또는 C1-C12 알케닐렌이고, G3는 C1-C24 알킬렌, C1-C24 알케닐렌, C3-C8 시클로알킬렌, C3-C8 시클로알케닐렌이고, Ra는 H 또는 C1-C12 알킬이고, R1 및 R2는 각각 독립적으로 C6-C24 알킬 또는 C6-C24 알케닐이고, R3은 H, OR5, CN, -C(=O)OR4, -OC(=O)R4 또는 -NR5 C(=O)R4이고, R4는 C1-C12 알킬이고, R5는 H 또는 C1-C6 알킬이고, x는 0, 1 또는 2이다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/117528호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00057
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00058
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00059
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/049245호에 기재된 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법의 양이온성 지질은 다음의 식 중 하나의 화합물:
Figure pct00060
및
Figure pct00061
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 이들 네 개의 화학식 중 어느 하나에 있어서, R4는 -(CH2)nQ 및 -(CH2) nCHQR에서 독립적으로 선택되고, Q는 -OR, -OH, -O(CH2)nN(R)2, -OC(O)R, -CX3, -CN, -N(R)C(O)R, -N(H)C(O)R, -N(R)S(O)2R, -N(H)S(O)2R, -N(R)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(R)2, -N(H)C(O)N(H)(R), -N(R)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(R)2, -N(H)C(S)N(H)(R) 및 헤테로고리로 이루어진 군에서 선택되며, n은 1, 2, 또는 3이다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00062
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00063
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00064
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00065
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 둘 다 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2017/173054호 및 WO 2015/095340호에 기술된 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00066
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00067
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00068
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질:
Figure pct00069
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 기타 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 공개 WO 2012/170889호에 기재된 절단 가능한 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화학식의 양이온성 지질을 포함하며:
Figure pct00070
,
식 중, R1은 이미다졸, 구아니디늄, 아미노, 이민, 엔아민, 선택적으로 치환된 알킬 아미노(예를 들어, 디메틸아미노와 같은 알킬 아미노) 및 피리딜로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2는 다음의 두 화학식 중 하나로 이루어진 군으로부터 선택된다:
Figure pct00071
및
Figure pct00072
식 중 R3 및 R4는 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 알킬, 및 선택적으로 치환된 가변 포화 또는 불포화 C6-C20 아실로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택되고; n은 0 또는 임의의 양의 정수(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 또는 그 이상)이다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 "HGT4001":
Figure pct00073
(HGT4001)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 "HGT4002":
Figure pct00074
(HGT4002)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 "HGT4003":
Figure pct00075
(HGT4003)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 "HGT4004":
Figure pct00076
(HGT4004)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질 "HGT4005":
Figure pct00077
(HGT4005)
및 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 사용하기 적합한 다른 양이온성 지질은 본원에 참조로서 포함되는, 국제 특허 출원 PCT/US2019/032522에 기재된 절단가능한 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 국제 특허 출원 PCT/US2019/032522에 기술된 일반 식 중 어느 하나 또는 구조 (1a)-(21a) 및 (1b)-(21b) 및 (22)-(237) 중 어느 하나에 해당하는 양이온성 지질을 포함한다. 소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 화학식 (I')에 따른 구조를 갖는 양이온성 지질을 포함한다,
Figure pct00078
(I'),
식 중,
RX는 독립적으로 -H, -L1-R1 또는 -L5A-L5B-B'이고;
각각의 L1, L2, 및 L3은 독립적으로 공유 결합, -C(O)-, -C(O)O-, -C(O)S- 또는 -C(O)NRL-이고;
각각의 L4A 및 L5A는 독립적으로 -C(O)-, -C(O)O- 또는 -C(O)NRL-이고;
각각의 L4B 및 L5B는 독립적으로 C1-C20 알킬렌; C2-C20 알케닐렌; 또는 C2-C20 알키닐렌이고;
각각의 B 및 B'는 NR4R5 또는 5-원 내지 10-원 질소-함유 헤테로아릴;
각각의 R1, R2, 및 R3은 독립적으로 C6-C30 알킬, C6-C30 알케닐 또는 C6-C30 알키닐이고;
각각의 R4 및 R5는 독립적으로 수소, C1-C10 알킬; C2-C10 알케닐; 또는 C2-C10 알키닐이고;
각각의 RL은 독립적으로 수소, C1-C20 알킬, C2-C20 알케닐 또는 C2-C20 알키닐이다.
소정의 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 다음의 화합물 구조를 갖는 양이온성 지질, 즉 국제 출원 PCT/US2019/032522의 화합물(139)을 포함한다:
Figure pct00079
("18:1 탄소 꼬리-리보오스 지질").
일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 양이온성 지질, 즉 N-[l-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄 클로라이드("DOTMA")를 포함한다. (본원에 참조로서 통합된 Feigner 등의 Proc. Nat'l Acad. Sci. 84, 7413 (1987); 미국 특허 제4,897,355호 참조). 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 기타 양이온성 지질은 예를 들어, 5-카복시스페르밀글리신디옥타데실아미드("DOGS"); 2,3-디올레일옥시-N-[2(스페르민-카복스아미도에틸]-N,N-디메틸-l-프로판아미늄("DOSPA")(Behr 등의 Proc. Nat.'l Acad. Sci. 86, 6982 (1989); 미국 특허 제5,171,678호; 미국 특허 제5,334,761호); l,2-디올레오일-3-디메틸암모늄-프로판("DODAP"); l,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄-프로판("DOTAP")을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 양이온성 지질의 추가 예시는 또한 다음을 포함한다: l,2-디스테아릴옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판( "DSDMA"); 1,2-디올레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DODMA"); 1 ,2-디리놀레일옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DLinDMA"); l,2-디리놀레닐옥시-N,N-디메틸-3-아미노프로판("DLenDMA"); N-디올레일-N,N-디메틸암모늄 클로라이드("DODAC"); N,N-디스테아릴-N,N-디메틸암모늄 브로마이드 ("DDAB"); N-(l,2-디미리스틸옥시프로프-3-일)-N,N-디메틸-N-히드록시에틸 암모늄 브로마이드("DMRIE"); 3-디메틸아미노-2-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시부탄-4-옥시)-l-(시스,시스-9,12-옥타데카디에녹시)프로판("CLinDMA"); 2-[5'-(콜레스트-5-엔-3-베타-옥시)-3'-옥사페녹시)-3-디메틸-l-(시스,시스-9', l-2'-옥타데카디에녹시)프로판("CpLinDMA"); N,N-디메틸-3,4-디올레일옥시벤질아민("DMOBA"); 1 ,2-N,N'-디올레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판("DOcarbDAP"); 2,3-디리놀레오일옥시-N,N-디메틸프로필아민("DLinDAP"); l,2-N,N'-디리놀레일카르바밀-3-디메틸아미노프로판("DLincarbDAP"); l ,2-디리놀레오일카르바밀-3-디메틸아미노프로판("DLinCDAP"); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노메틸-[l,3]-디옥솔레인("DLin-K-DMA"); 2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, N-디메틸-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1 -일옥시]프로판-1-아민("옥틸-CLinDMA"); (2R)-2-((8-[(3베타)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, N-디메틸-3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1-일옥시]프로판-1 -아민("옥틸-CLinDMA (2R)"); (2S)-2-((8-[(3P)-콜레스트-5-엔-3-일옥시]옥틸)옥시)-N, fsl-디메티3-[(9Z, 12Z)-옥타데카-9, 12-디엔-1 -일옥시]프로판-1 -아민("옥틸-CLinDMA (2S)"); 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[l,3]-디옥솔레인("DLin-K-XTC2-DMA"); 및 2-(2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,l 2-디엔- 1-일)-l ,3-디옥솔란-4-일)-N,N-디메틸에탄아민("DLin-KC2-DMA") (본원에 참조로서 포함되는 국제 특허 공개 WO 2010/042877; Semple 등, Nature Biotech. 28: 172-176 (2010) 참조). (Heyes, J., 등, J Controlled Release 107: 276-287 (2005); Morrissey, DV., 등, Nat. Biotechnol. 23(8): 1003-1007 (2005); 국제 특허 공개 WO 2005/121348). 일부 실시예에서, 양이온성 지질 중 하나 이상은 이미다졸, 디알킬아미노, 또는 구아니디늄 모이어티 중 적어도 하나를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 조성물 및 방법에 적합한 하나 이상의 양이온성 지질은 2,2-디리놀레일-4-디메틸아미노에틸-[1,3]-디옥솔레인("XTC"); (3aR,5s,6aS)-N,N-디메틸-2,2-디((9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디엔일)테트라히드로-3aH-시클로펜타[d] [1 ,3]디옥솔-5-아민("ALNY-100") 및/또는 4,7,13-트리스(3-옥소-3-(운데실아미노)프로필)-N1,N16-디운데실-4,7,10,13-테트라아자헥사데칸-1,16-디아미드("NC98-5")를 포함한다.
일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예를 들어, 지질 나노입자의 적어도 약 5중량%, 10중량%, 20중량%, 30중량%, 35중량%, 40중량%, 45중량%, 50중량%, 55중량%, 60중량%, 65중량%, 또는 70중량%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은, 조성물 중 총 지질 함량, 예를 들어, 지질 나노입자의 적어도 약 5 mol%, 10 mol%, 20 mol%, 30 mol%, 35 mol%, 40 mol%, 45 mol%, 50 mol%, 55 mol%, 60 mol%, 65 mol%, 또는 70 mol%를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은 조성물 중 총 지질 함량, 예를 들어, 지질 나노입자의 약 30중량% 내지 70중량%(예를 들어, 약 30중량% 내지 65중량%, 약 30중량% 내지 60중량%, 약 30중량% 내지 55중량%, 약 30중량% 내지 50중량%, 약 30중량% 내지 45중량%, 약 30중량% 내지 40중량%, 약 35중량% 내지 50중량%, 약 35중량% 내지 45중량%, 또는 약 35중량% 내지 40중량%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다. 일부 실시예에서, 본 발명의 조성물은 조성물 중 총 지질 함량, 예를 들어, 지질 나노입자의 약 30 mol% 내지 70 mol%(예를 들어, 약 30 mol% 내지 65 mol%, 약 30 mol% 내지 60 mol%, 약 30 mol% 내지 55 mol%, 약 30 mol% 내지 50 mol%, 약 30 mol% 내지 45 mol%, 약 30 mol% 내지 40 mol%, 약 35 mol% 내지 50 mol%, 약 35 mol% 내지 45 mol%, 또는 약 35 mol% 내지 40 mol%)를 구성하는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함한다.
비-양이온성 지질/헬퍼 지질
일부 실시예에서, 리포솜은 하나 이상의 비양이온성("헬퍼") 지질을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "비양이온성 지질"은 임의의 중성, 쌍성이온성(zwitterionic), 또는 음이온성 지질을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "음이온성 지질"은 선택된 pH, 예를 들어 생리적 pH에서 순 음전하를 보유하는 다수의 지질 종 중 어느 하나를 지칭한다. 비양이온성 지질은 디스테아로일포스파티딜콜린(DSPC), 디올레오일포스파티딜콜린(DOPC), 디팔미토일포스파티딜콜린(DPPC), 디올레오일포스파티딜글리세롤(DOPG), 디팔미토일포스파티딜글리세롤(DPPG), 디올레오일포스파티딜에탄올아민(DOPE), 팔미토일올레오일포스파티딜콜린(POPC), 팔미토일올레오일-포스파티딜에탄올아민(POPE), 디올레오일-포스파티딜에탄올아민 4-(N-말레이미도메틸)-사이클로헥산-l-카르복실레이트(DOPE-mal), 디팔미토일 포스파티딜 에탄올아민(DPPE), 디미리스토일포스포에탄올아민(DMPE), 디스테아로일-포스파티딜-에탄올아민(DSPE), 포스파티딜세린, 스핑고지질, 세레브로시드, 강글리오시드, 16-O-모노메틸 PE, 16-O-디메틸 PE, 18-1-트랜스 PE, l-스테아로일-2-올레오일-포스파티디에탄올아민(SOPE), 1,2-디에루코실-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DEPE), 또는 이들의 혼합물을 포함하지만 이들로 한정되지 않는다.
일부 실시예에서, 비양이온성 지질은 중성 지질, 즉 본 조성물이 제형화되고/되거나 투여되는 조건하에서 순전하(net charge)를 띠지 않는 지질이다.
일부 실시예에서, 이와 같은 비양이온성 지질은 단독으로 사용될 수 있지만, 바람직하게는 기타 지질 예를 들어, 양이온성 지질과 조합하여 사용된다.
일부 실시예에서, 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10 % 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 몰 비율(mol%)로 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 총 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10 % 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 몰 비율(mol%)로 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 초과, 10 mol% 초과, 20 mol% 초과, 30 mol% 초과, 또는 40 mol% 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 초과, 10 mol% 초과, 20 mol% 초과, 30 mol% 초과, 또는 40 mol% 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 10 mol% 이하, 20 mol% 이하, 30 mol% 이하, 또는 40 mol% 이하이다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 약 10 mol% 이하, 약 20 mol% 이하, 약 30 mol% 이하, 또는 약 40 mol% 이하일 수 있다.
일부 실시예에서, 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10 % 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 중량비(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 총 비양이온성 지질은 조성물에 존재하는 총 지질의 약 5% 내지 약 90%, 약 5% 내지 약 70%, 약 5% 내지 약 50%, 약 5% 내지 약 40%, 약 5% 내지 약 30%, 약 10 % 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 50%, 또는 약 10% 내지 약 40%의 중량비(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하이다. 일부 실시예에서, 리포솜 내의 총 비양이온성 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하일 수 있다.
콜레스테롤계 지질
일부 실시예에서, 리포솜은 하나 이상의 콜레스테롤계 지질을 포함한다. 예를 들어, 적합한 콜레스테롤계 양이온성 지질은 예를 들어, DC-Choi (N,N-디메틸-N-에틸카복스아미도콜레스테롤), 1,4-비스(3-N-올레일아미노-프로필)피페라진(Gao, 등 Biochem. Biophys. Res. Comm. 179, 280 (1991); Wolf 등 BioTechniques 23, 139 (1997); 미국특허 제5,744,335호), 또는 다음 구조를 갖는 이미다졸 콜레스테롤 에스테르(ICE)를 포함한다,
Figure pct00080
("ICE").
실시예에서, 콜레스테롤계 지질은 콜레스테롤이다.
일부 실시예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 몰비(mol%)를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5% 초과, 약 10% 초과, 약 20% 초과, 약 30% 초과, 또는 약 40% 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 mol% 이하, 약 10 mol% 이하, 약 20 mol% 이하, 약 30 mol% 이하, 또는 약 40 mol% 이하일 수 있다.
일부 실시예에서, 콜레스테롤계 지질은 리포솜에 존재하는 총 지질의 약 1% 내지 약 30%, 또는 약 5% 내지 약 20%의 중량비(wt%)로 존재할 수 있다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 wt% 초과, 약 10 wt% 초과, 약 20 wt% 초과, 약 30 wt% 초과, 또는 약 40 wt% 초과일 수 있다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자 중 콜레스테롤계 지질의 백분율은 약 5 wt% 이하, 약 10 wt% 이하, 약 20 wt% 이하, 약 30 wt% 이하, 또는 약 40 wt% 이하일 수 있다.
PEG-변형 지질
일부 실시예에서, 리포솜은 하나 이상의 PEG화 지질을 포함한다.
예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-변형 인지질, 및 N-옥타노일-스핑고신-1-[숙시닐(메톡시 폴리에틸렌 글리콜)-2000](C8 PEG-2000 세라미드)를 포함하는 유도체화된 세라미드(PEG-CER)와 같은 유도체화된 지질을 단독으로 사용하거나 바람직하게는 수송 비히클(예를 들어 지질 나노입자)을 포함하는 기타 지질 제형과 함께 조합하여 사용하는 것도 본 발명에서 고려된다.
고려된 PEG-변형 지질은 C6-C20 길이의 알킬 사슬을 갖는 지질에 공유 부착된 최대 5 kDa 길이의 폴리에틸렌 글리콜 사슬을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 일부 실시예에서, PEG-변형 또는 PEG화 지질은 PGE화 콜레스테롤 또는 PEG-2K이다. 이와 같은 성분을 첨가함으로써 복합체 응집을 예방할 수 있고, 또한 순환 수명을 늘리고 표적 조직에 대한 지질-핵산 조성물의 전달을 증가시키는 수단을 제공할 수 있거나(Klibanov 등 (1990) FEBS Letters, 268 (1): 235-237), 이들 성분은 생체 내에서 제형으로부터 신속하게 교환되도록 선택될 수 있다(미국 특허 제5,885,613호 참조). 특히 유용한 교환가능한 지질은 더 짧은 아실 사슬(예를 들어, C14 또는 C18)을 갖는 PEG-세라미드이다.
본 발명의 PEG-변형 인지질 및 유도된 지질은 리포솜 수송 비히클에 존재하는 총 지질의 약 0% 내지 약 20%, 약 0.5% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 15%, 약 4% 내지 약 10%, 또는 약 2%의 몰비를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 몰비 기준으로 총 지질의 약 4%를 구성한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 몰비 기준으로 총 지질의 약 5%를 구성한다. 일부 실시예에서, 하나 이상의 PEG-변형 지질은 몰비 기준으로 총 지질의 약 6%를 구성한다.
양친매성 블록 공중합체
일부 실시예에서, 적합한 조성물은 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 함유한다.
다양한 양친매성 블록 공중합체가 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 일부 실시예에서, 양친매성 블록 공중합체는 계면활성제 또는 비-이온성 계면활성제로도 지칭된다.
일부 실시예에서, 본 발명에 적합한 양친매성 중합체는 폴록사머(Pluronic®), 폴록사민(Tetronic®), 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르(폴리소르베이트), 및 폴리비닐 피롤리돈(PVP)으로부터 선택된다.
폴록사머
일부 실시예에서, 적합한 양친매성 중합체는 폴록사머이다. 예를 들어, 적합한 폴록사머는 다음 구조를 가지며:
Figure pct00081
식 중 a는 10 내지 150의 정수이고 b는 20 내지 60의 정수이다. 예를 들어, a는 약 12이고 b는 약 20이거나, a는 약 80이고 b는 약 27이거나, a는 약 64이고 b는 약 37이거나, a는 약 141이고 b는 약 44이거나, a는 약 101이고 b는 약 56이다.
일부 실시예에서, 본 발명에 적합한 폴록사머는 약 10개 내지 약 150개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다. 일부 실시예에서, 폴록사머는 약 10개 내지 약 100개의 에틸렌 옥사이드 단위를 갖는다.
일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 84이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 101이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 105이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 108이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 122이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 123이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 124이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 181이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 182이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 183이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 184이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 185이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 188이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 212이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 215이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 217이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 231이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 234이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 235이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 237이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 238이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 282이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 284이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 288이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 304이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 331이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 333이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 334이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 335이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 338이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 401이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 402이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 403이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 폴록사머 407이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 이들의 조합이다.
일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 4,000 g/mol 내지 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 1,000 g/mol 내지 약 50,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 1,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 2,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 3,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 4,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 5,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 6,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 7,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 8,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 9,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 10,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 20,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 25,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 30,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 40,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 실시예에서, 적합한 폴록사머는 약 50,000 g/mol의 평균 분자량을 갖는다.
기타 양친매성 중합체
일부 실시예에서, 양친매성 중합체는 폴록사민, 예를 들어 테트로닉(tetronic) 304 또는 테트로닉 904이다.
일부 실시예에서, 양친매성 중합체는 폴리비닐피롤리돈(PVP), 예를 들어 3 kDa, 10 kDa, 또는 29 kDa의 분자량을 갖는 PVP이다.
일부 실시예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르(Brij), 폴리소르베이트, 소르비탄, 및 이들의 유도체이다. 일부 실시예에서, 양친매성 중합체는 폴리소르베이트, 예를 들어 PS 20이다.
일부 실시예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르(Brij), 폴록사머, 폴리소르베이트, 소르비탄, 또는 이들의 유도체이다.
일부 실시예에서, 양친매성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 에테르이다. 일부 실시예에서, 적합한 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 화학식 (S-I)의 화합물:
Figure pct00082
또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중,
t는 1 내지 100의 정수이고;
R1BRIJ는 독립적으로 C10-40 알킬, C10-40 알케닐, 또는 C10-40 알키닐이고; 임의로 R5PEG의 하나 이상의 메틸렌 기는 C3-10 카보시클릴렌, 4원 내지 10원 헤테로시클릴렌, C6-10 아릴렌, 4원 내지 10원 헤테로아릴렌, -N(RN)-, -O-, -S-, -C(O)-, -C(O)N(RN)-, -NRNC(O)-, -NR C(O)N(R )-, -C(O)O- -OC(O)-, -OC(O)O- - OC(O)N(RN)-, -NRNC(O)O- -C(O)S- -SC(O)-, -C(=NRN)-,― C(=NR )N(R )―, - NRNC(=NRN)- -NRNC(=NRN)N(RN)-, -C(S)-, -C(S)N(RN)-, -NRNC(S)-, -NRNC(S)N(RN)-, -S(O)-, -OS(O)-, -S(O)O- -OS(O)O- -OS(O)2- -S(O)2O- -OS(O)2O- -N(RN)S(O)-, - S(O)N(RN)- -N(RN)S(O)N(RN)- -OS(O)N(RN)- -N(RN)S(O)0- -S(O)2- -N(RN)S(O)2- - S(O)2N(RN)-, -N(RN)S(O)2N(RN)- -OS(O)2N(RN)- 또는 -N(RN)S(O)2O-로 독립적으로 치환되고;
각각의 RN의 인스턴스는 독립적으로 수소, C1-6알킬또는 질소 보호기이다.
일부 실시예에서, R1BRIJ는 C는 알킬이다. 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 화학식 (S-la)의 화합물:
Figure pct00083
또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중 s는 1 내지 100의 정수이다.
일부 실시예에서, R1BRIJ는 C는 알케닐이다. 예를 들어, 적합한 폴리에틸렌 글리콜 에테르는 화학식 (S-lb)의 화합물:
Figure pct00084
또는 이의 염 또는 이성질체이며, 식 중 s는 1 내지 100의 정수이다.
일반적으로, 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)는 이의 임계 미셀 농도(CMC)보다 더 낮은 양으로 제형 중에 존재한다. 일부 실시예에서, 양친매성 중합체(예를 들어 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 또는 약 50% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 실시예에서, 양친매성 중합체(예를 들어 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 0.9%, 0.8%, 0.7%, 0.6%, 0.5%, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다. 일부 실시예에서, 양친매성 중합체(예를 들어 폴록사머)는 이의 CMC보다 약 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 95% 더 낮은 양으로 혼합물 중에 존재한다.
일부 실시예에서, 제거 시 제형 중에 존재하는 양친매성 중합체(예를 들어 폴록사머)의 원래 양의 약 0.1%, 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 미만이 남는다. 일부 실시예에서, 제거 시 제형 중에 양친매성 중합체(예를 들어, 폴록사머)의 잔류량이 남는다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잔류량(residual amount)은 조성물 중 실질적으로 모든 물질(폴록사머와 같은, 본원에 기술된 양친매성 중합체)이 제거된 후 남아 있는 양을 의미한다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 검출할 수 없을 수 있다.
일부 실시예에서, 적합한 조성물은 5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 3% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 2.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 2% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 1.5% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 1% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 0.5% 미만(예를 들어, 0.4%, 0.3%, 0.2%, 0.1% 미만)의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어, 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 0.09%, 0.08%, 0.07%, 0.06%, 0.05%, 0.04%, 0.03%, 0.02%, 또는 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 0.01% 미만의 양친매성 블록 공중합체(예를 들어 폴록사머)를 포함한다. 일부 실시예에서, 적합한 조성물은 양친매성 중합체(예를 들어 폴록사머)의 잔류량을 함유한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 잔류량(residual amount)은 조성물 중 실질적으로 모든 물질(폴록사머와 같은, 본원에 기술된 양친매성 중합체)이 제거된 후 남아 있는 양을 의미한다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 정성적으로 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 잔류량은 알려진 기술을 사용해 검출할 수 없을 수 있다.
중합체
일부 실시예에서, 적합한 전달 비히클은 담체로서 중합체를 단독으로 사용하거나 본원에 기술된 여러 가지 지질을 포함하는 다른 담체들과 조합하여 사용함으로써 제형화된다. 따라서, 일부 실시예에서, 본원에서 사용되는 리포솜 전달 비히클은 또한 중합체를 포함하는 나노입자를 망라한다. 적합한 중합체는 예를 들어, 폴리아크릴레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리락타이드, 폴리락타이드-폴리글리콜라이드(polyglycolide) 공중합체, 폴리카프로락톤, 덱스트란, 알부민, 젤라틴, 아르기네이트, 콜라겐, 키토산, 시클로덱스트린, 프로타민, PEG화 프로타민, PLL, PEG화 PLL 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 포함할 수 있다. PEI가 존재하는 경우, 예를 들어, 25 kDa 분지형 PEI(Sigma #408727)와 같이 10 kDa 내지 40 kDa 범위의 분자량의 PEI가 분지될 수 있다.
다양한 실시예에 따르면, 양이온성 지질, 비양이온성 지질, PEG-변형 지질, 콜레스테롤계 지질 및/또는 양친매성 블록 공중합체(지질 나노입자를 포함함)뿐만 아니라 이러한 성분(지질)의 서로에 대한 상대 몰비를 선택하는 것은 선택된 지질의 특성, 의도된 표적 세포의 성질, 전달될 mRNA의 특성에 기초한다. 추가적인 고려 사항은, 예를 들어, 알킬 사슬의 포화뿐만 아니라 선택된 지질의 크기, 전하, pH, pKa, 융해성(fusogenicity), 및 내약성을 포함한다. 따라서 몰비는 적절하게 조정될 수 있다.
구별되는 지질 성분의 비
본 발명에 적합한 리포솜은 본원에 기술된 양이온성 지질, 비양이온성 지질, 콜레스테롤 지질, PEG-변형 지질, 양친매성 블록 공중합체, 및/또는 중합체 중 하나 이상을 다양한 비율로 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자는 나노입자의 5개 이하의 구별되는 성분을 포함한다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자는 나노입자의 4개 이하의 구별되는 성분을 포함한다. 일부 실시예에서, 지질 나노입자는 나노입자의 3개 이하의 구별되는 성분을 포함한다. 비제한적인 예로서, 적합한 리포솜 제형은 cKK-E12(ML2로도 알려짐), DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; C12-200, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; HGT4003, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; ICE, DOPE, 콜레스테롤 및 DMG-PEG2K; 또는 ICE, DOPE, 및 DMG-PEG2K로부터 선택된 조합을 포함할 수 있다.
다양한 실시예에서, 양이온성 지질(예를 들어, cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)은 몰비로 리포솜의 약 30% 내지 60 %(예를 들어, 약 30% 내지 55%, 약 30% 내지 50%, 약 30% 내지 45%, 약 30% 내지 40%, 약 35% 내지 50%, 약 35% 내지 45%, 또는 약 35% 내지 40%)를 구성한다. 일부 실시예에서, 양이온성 지질(예를 들어, cKK-E12, C12-200, ICE, 및/또는 HGT4003)의 백분율은 몰비로 리포솜의 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40 % 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 또는 약 60% 이상이다.
일부 실시예에서, 양이온성 지질 대 비-양이온성 지질 대 콜레스테롤계 지질 대 PEG-변형 지질의 비는 각각 약 30 내지 60:25 내지 35:20 내지 30:1 내지 15 사이에 있을 수 있다. 일부 실시예에서, 양이온성 지질 대 비-양이온성 지질 대 콜레스테롤계 지질 대 PEG-변형 지질의 비는 각각 대략 40:30:20:10이다. 일부 실시예에서, 양이온성 지질 대 비-양이온성 질 대 콜레스테롤계 지질 대 PEG-변형 지질의 비는 각각 대략 40:30:25:5이다. 일부 실시예에서, 양이온성 지질 대 비-양이온성 지질 대 콜레스테롤계 지질 대 PEG-변형 지질의 비는 각각 대략 40:32:25:3이다. 일부 실시예에서, 양이온성 지질 대 비-양이온성 지질 대 콜레스테롤계 지질 대 PEG-변형 지질의 비는 대략 50:25:20:5이다.
지질 나노입자가 3개 및 3개 이하의 구별되는 지질 성분을 포함하는 실시예에서, 총 지질 함량의 비(즉, 지질 성분(1):지질 성분(2):지질 성분(3)의 비)는 x:y:z로 표시될 수 있으며, 여기서,
(y + z) = 100 - x이다.
일부 실시예에서, "x", "y", 및 "z"의 각각은 3개의 구별되는 지질 성분의 몰 백분율을 나타내며, 비는 몰비이다.
일부 실시예에서, "x", "y", 및 "z"의 각각은 3개의 구별되는 지질 성분의 중량%를 나타내며, 비는 중량비이다.
일부 실시예에서, 변수 "x"로 표시된 지질 성분(1)은 스테롤계 양이온성 지질이다.
일부 실시예에서, 변수 "y"로 표시된 지질 성분(2)은 헬퍼 지질이다.
일부 실시예에서, 변수 "z"로 표시된 지질 성분(3)은 PEG 지질이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(1)(예를 들어, 스테롤계 양이온성 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "x"는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(1)(예를 들어, 스테롤계 양이온성 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "x"는 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10% 이하이다. 실시예에서, 변수 "x"는 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 40% 이하이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(1) (예를 들어, 스테롤계 양이온성 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "x"는: 적어도 약 50% 및 약 95% 미만; 적어도 약 50% 및 약 90% 미만; 적어도 약 50% 및 약 85% 미만; 적어도 약 50% 및 약 80% 미만; 적어도 약 50% 및 약 75% 미만; 적어도 약 50% 및 약 70% 미만; 적어도 약 50% 및 약 65% 미만; 또는 적어도 약 50% 및 약 60% 미만이다. 실시예에서, 변수 "x"는 적어도 약 50% 및 약 70% 미만; 적어도 약 50% 및 약 65% 미만; 또는 적어도 약 50% 및 약 60% 미만이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(1) (예를 들어, 스테롤계 양이온성 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "x"는 적어도 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(1) (예를 들어, 스테롤계 양이온성 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "x"는 약 95%, 약 90%, 약 85%, 약 80%, 약 75%, 약 70%, 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 40%, 약 30%, 약 20%, 또는 약 10% 이하이다. 실시예에서, 변수 "x"는 약 65%, 약 60%, 약 55%, 약 50%, 약 40% 이하이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(1)(예를 들어, 스테롤계 양이온성 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "x"는: 적어도 약 50% 및 약 95% 미만; 적어도 약 50% 및 약 90% 미만; 적어도 약 50% 및 약 85% 미만; 적어도 약 50% 및 약 80% 미만; 적어도 약 50% 및 약 75% 미만; 적어도 약 50% 및 약 70% 미만; 적어도 약 50% 및 약 65% 미만; 또는 적어도 약 50% 및 약 60% 미만이다. 실시예에서, 변수 "x"는 적어도 약 50% 및 약 70% 미만; 적어도 약 50% 및 약 65% 미만; 또는 적어도 약 50% 및 약 60% 미만이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(3)(예를 들어, PEG 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하이다. 실시예에서, 지질 성분(3)(예를 들어, PEG 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%이다. 실시예에서, 지질 성분(3)(예를 들어, PEG 지질)의 몰 백분율을 나타내는 변수 "z"는 약 1% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 또는 약 5% 내지 약 10%이다.
일부 실시예에서, 지질 성분(3)(예를 들어, PEG 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 15%, 20%, 또는 25% 이하이다. 실시예에서, 지질 성분(3)(예를 들어, PEG 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "z"는 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%이다. 실시예에서, 지질 성분(3)(예를 들어, PEG 지질)의 중량%를 나타내는 변수 "z"는 약 1% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 10%, 약 3% 내지 약 10%, 약 4% 내지 약 10%, 약 1% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 10%, 약 2.5% 내지 약 7.5%, 약 2.5% 내지 약 5%, 약 5% 내지 약 7.5%, 또는 약 5% 내지 약 10%이다.
3개 및 단 3개의 구별되는 지질 성분을 갖는 조성물의 경우, 변수 "x", "y", 및 "z"는 3개 변수의 합이 총 지질 함량의 100%가 되는 한 임의의 조합일 수 있다.
조성물의 치료적 용도
본 발명은 무엇보다도, 환자를 치료하는데 유용한 치료적 mRNA-LNP 조성물을 제공한다. 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA는 생체 내에서 세포 또는 대상체에게 전달될 수 있고 단백질 또는 폴리펩티드를 암호화할 수 있다. 따라서, 소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 폐 또는 폐 세포에 전달하거나 대상체의 폐 또는 폐 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 포함하는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 낭성 섬유증 막관통 전도 조절자(CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 A 구성원 3 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 다이닌 축사 중간 사슬 1 단백질(dynein axonemal intermediate chain 1 protein)을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 다이닌 축사 중쇄 5(DNAH5, dynein axonemal heavy chain 5) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 알파-1-항트립신 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 포크헤드 박스 P3(FOXP3, forkhead box P3) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 계면활성제 단백질, 예를 들어, 계면활성제 A 단백질, 계면활성제 B 단백질, 계면활성제 C 단백질, 및 계면활성제 D 단백질 중 하나 이상을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 간 또는 간 세포에 전달하거나 대상체의 간 또는 간 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 이러한 펩티드 및 폴리펩티드는 요소 회로 질환과 관련된 것들, 리소좀 저장 장애와 관련된 것들, 글리코겐 저장 장애와 관련된 것들, 아미노산 대사 장애와 관련된 것들, 지질 대사 또는 섬유증 장애와 관련된 것들, 메틸말론 신혈증과 관련된 것들, 또는 풍부한 mRNA를 간 또는 간 세포에 전달하거나 이를 이용해 간 또는 간 세포를 치료하는 것이 치료적 이점을 제공하는 임의의 다른 대사 장애와 관련된 것들을 포함할 수 있다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 요소 회로 장애와 연관된 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 오르니틴 트랜스카바밀라제(OTC, ornithine transcarbamylase) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 합성효소 1 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 카바모일 인산염 합성효소 I 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 아르기노숙시네이트 리아제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 아르기나제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 리소좀 저장 장애와 연관된 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 알파 갈락토시다제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 글루코세레브로시다제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 이두로네이트-2-설파타제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 이두로니다제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 N-아세틸-알파-D-글루코사미니다제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 헤파란 N-설파타제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 갈락토사민-6-설파타제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 베타-갈락토시다제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 리소좀 리파제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 아릴설파타제 B(N-아세틸갈락토사민-4-설파타제) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 전사 인자 EB(TFEB, transcription factor EB)를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 글리코겐 저장 장애와 연관된 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 산성 알파-글루코시다제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 글루코오스-6-포스파타제(G6PC) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 간 글리코겐 포스포릴라제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 근육 포스포글리세레이트 무타제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 글리코겐 탈분지 효소를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 아미노산 대사와 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 페닐알라닌 히드록실라제 효소를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 글루타릴-CoA 탈수소효소를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 프로피오닐-CoA 카르복실라제 효소를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 옥살라제 알라닌-글리옥실레이트 아미노전이효소를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 지질 대사 또는 섬유증 장애와 연관된 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 mTOR 억제제를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 ATPase 인지질 수송 8B1(ATP8B1, ATPase phospholipid transporting 8B1) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 NF-카파 B 억제제, 예를 들어 I-카파 B 알파, 인터페론-관련 개발 조절제 1(IFRD1, interferon-related development regulator 1), 및 시르투인 1(SIRT1, Sirtuin 1) 중 하나 이상을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 PPAR-감마 단백질 또는 활성 변이체를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 메틸말론 신혈증과 관련된 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 실시예에서, 본 발명은 메틸말로닐 CoA 무타제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 메틸말로닐 CoA 에피머라제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 간으로의 전달 또는 간의 치료가 치료적 이점을 제공할 수 있는 전장 mRNA를 깆는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 윌슨병(Wilson disease) 단백질로도 알려진 ATP7B 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 포르포빌리노겐 탈아미노효소를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 인간 혈색소 침착증(HFE, human hemochromatosis) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포에 전달하거나 대상체의 심혈관 또는 심혈관 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 혈관 내피 성장 인자 A 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 릴랙신 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 뼈 형성 단백질-9 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 뼈 형성 단백질-2 수용체 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 근육 또는 근육 세포에 전달하거나 대상체의 근육 또는 근육 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 디스트로핀 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 심근 또는 심근 세포에 전달하거나 대상체의 심근 또는 심근 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 칼륨 채널 및 나트륨 채널 중 하나 또는 둘 다를 조절하는 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Kv7.1 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 근육 조직 또는 근육 세포에서 Nav1.5 채널을 조절하는 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 신경계 또는 신경계 세포에 전달하거나 대상체의 신경계 또는 신경계 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 실시예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 1 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 실시예에서, 본 발명은 생존 운동 뉴런 2 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 프라탁신 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 D 구성원 1(ABCD1, ATP binding cassette subfamily D member 1) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 CLN3 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포에 전달하거나 대상체의 혈액이나 골수 또는 혈액 세포나 골수 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 베타 글로빈 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 브루톤 티로신 키나제 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 하나 이상의 응고 효소, 예를 들어 인자 VIII, 인자 IX, 인자 VII, 및 인자 X을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 신장 또는 신장 세포에 전달하거나 대상체의 신장 또는 신장 세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 콜라겐 IV형 알파 5 사슬(COL4A5, collagen type IV alpha 5 chain) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체의 안구 또는 안세포에 전달하거나 대상체의 안구 또는 안세포를 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 ATP-결합 카세트 하위 계열 A 구성원 4(ABCA4, ATP-binding cassette sub-family A member 4) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 레티노쉬신 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 망막 색소 상피-특이적 65 kDa(RPE65, retinal pigment epithelium-specific 65 kDa) 단백질을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 290 kDa의 중심체 단백질(CEP290, centrosomal protein of 290 kDa)을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
소정의 실시예에서, 본 발명은 대상체 또는 대상체의 세포에 백신을 전달하거나 대상체 또는 대상체의 세포를 백신으로 치료하는데 사용하기 위한 펩티드 또는 폴리펩티드를 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 소정의 실시예에서, 본 발명은 바이러스와 같은 감염원의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 코로나바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 COVID 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 호흡기 세포융합 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 광견병 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 거대세포 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 로타 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 간염 바이러스, 예를 들어 A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 또는 C형 간염 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 인간 유두종 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 단순 헤르페스 바이러스, 예를 들어 단순 헤르페스 바이러스 1형 또는 단순 헤르페스 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 인간 면역 결핍 바이러스, 예를 들어 인간 면역 결핍 바이러스 1형 또는 인간 면역 결핍 바이러스 2형의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 인간 메타뉴모 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 인간 파라인플루엔자 바이러스, 예를 들어 인간 파라인플루엔자 바이러스 1형, 인간 파라인플루엔자 바이러스 2형, 또는 인간 파라인플루엔자 바이러스 3형의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 말라리아 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 지카 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다. 소정의 실시예에서, 본 발명은 치쿤구니야 바이러스의 항원을 암호화하는 mRNA를 갖는 치료 조성물을 생산하는 방법을 제공한다.
생체 내 mRNA의 발현을 촉진하기 위해서, mRNA를 캡슐화하는 조성물은 하나 이상의 추가적인 핵산, 담체, 표적 리간드 또는 안정화 제제의 조합이나 적합한 부형제와 혼합한 약학적 조성물로 제형화될 수 있다. 약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, Pa., 최신판에서 확인할 수 있다.
본 발명의 동결건조된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 정제수와 함께 재구성될 수 있다. 소정의 실시예에서, 적절한 재수화 배지(예를 들어, 정제수, 탈이온수, 5% 덱스트로오스(w/v), 10% 트레할로오스(w/v) 및/또는 생리식염수로 재구성할 때, 재구성된 조성물은 동결건조 전에 관찰된 것과 유사한 약리학적 또는 생물학적 활성을 나타낸다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위해 pH 완충 용액으로 재구성될 수 있다. 소정의 실시예에서, 적절히 완충된 용액으로 재구할 때, 재구성된 조성물은 원하는 pH를 포함할 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 5 내지 pH 8의 pH를 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 5.5 내지 pH 7.5의 pH를 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 6.0 내지 pH 7.0의 pH를 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 6.0을 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 6.5를 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 6.8을 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 7.0을 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 7.2를 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 7.5를 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다. 일부 실시예에서, 본 발명의 동결건조된 조성물은 pH 7.7을 갖는 재구성된 조성물을 수득하기 위해 pH 완충된 용액으로 재구성된다.
제공된 나노입자 내에 캡슐화된 mRNA 또는 이를 함유하는 조성물은 대상체의 임상 상태, 투여 부위 및 방법, 투여 일정, 대상체의 연령, 성별, 체중 및 당 기술분야의 임상의와 관련된 기타 요인을 고려하여 현행 의료 관행에 따라 투여 및 투약될 수 있다. 본원의 목적을 위한 "유효량"은 실험적 임상 연구, 약학적, 임상적 및 의학적 기술 분야의 숙련자에게 알려진 이러한 적절한 고려사항들에 의해 결정될 수 있다. 일부 실시예에서, 투여된 양은 증상의 적어도 어느 정도의 안정, 개선 또는 제거 및 당 기술분야의 숙련자에 의해 질환의 진행, 퇴행 또는 개선의 적절한 측정을 위해 선택되는 기타 지표를 달성하는데 효과적이다. 예를 들어, 적합한 양 및 투여 요법은 적어도 일시적인 단백질(예를 들어, 효소)의 생산을 야기하는 것이다.
본 발명은 생체 내 단백질 생산을 위해 지질 나노입자에 캡슐화된 mRNA(mRNA-LNP)를 전달하는 방법을 제공하며, 이러한` 방법은 mRNA-LNP를 포함하는 조성물을 전달을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 정맥내 전달, 피하 전달, 경구 전달, 진피하 전달, 안구 전달, 기관내 주사 폐 전달(예를 들어, 분무), 근육내 전달, 경막내 전달 또는 관절내 전달을 통해 투여된다.
적합한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 질, 점막경유, 기관내 또는 흡입을 포함하는 폐, 또는 장 투여; 진피내(intradermal), 경피(국소), 근육내, 피하, 골수내 주사뿐 아니라 경막내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내 또는 비강내 전달을 포함하는 비경구 전달을 포함한다.
일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 정맥내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 피하 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 경구 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 진피하 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 안구 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 기관내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 폐 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 분무 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 근육내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 경막내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 관절내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 직장 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 질 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 점막 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 장 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 비경구 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 진피내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 피하 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 심실내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 복강내 전달에 의해 투여된다. 일부 실시예에서, mRNA-LNP를 포함하는 조성물은 비강내 전달에 의해 투여된다.
특정한 실시예에서, 근육내 투여는 골격근, 평활근 및 심장근으로 이루어진 군으로부터 선택된 근육에 한다. 일부 실시예에서, 투여는 결과적으로 근육 세포에 mRNA의 전달을 야기한다. 일부 실시예에서, 투여는 결과적으로 간세포(즉, 간장 세포)에 mRNA의 전달을 야기한다. 특정한 실시예에서, 근육내 투여는 결과적으로 근육 세포에 mRNA의 전달을 가져온다.
폐 전달 및 분무화에 대한 추가적인 교시는 공개된 미국 특허 출원 US 2018/0125989호 및 공개된 미국 특허 출원 US 2018/0333457호에 기술되어 있으며, 이들 각각은 그 전체가 참조로서 통합된다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본 발명의 mRNA-로딩된 나노입자 및 조성물은 예를 들어, 표적 조직으로 직접 약학적 조성물의 주사를 통해, 바람직하게는 지속된 방출 제형으로 전신적인 방법보다는 국소적인 방법으로 투여될 수 있다. 국소적 전달은 표적화된 조직에 따라 다양한 방법으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물을 함유하는 에어로졸은 (비강, 기관, 또는 기관지 전달로) 흡입될 수 있거나; 본 발명의 조성물은 부상, 질환 징후 또는 통증 부위에 주입될 수 있거나, 예를 들어; 조성물은 경구, 기관 또는 식도 적용을 위한 로젠지(lozenge)로 제공될 수 있거나; 위 또는 장에 투여하기 위한 액형, 정제형 또는 캡슐형으로 공급될 수 있거나, 직장 또는 질 적용을 위한 좌약형으로 공급될 수 있거나; 크림, 점안약 또는 심지어 주사의 사용에 의해 눈에 전달될 수도 있다. 치료적 분자 또는 리간드와 복합체화된 제공된 조성물을 함유하는 제형은 예를 들어, 조성물이 이식 부위에서 주변 세포로 확산될 수 있게 하는중합체 또는 다른 구조 또는 물질과 관련하여 심지어 수술적으로 투여될 수 있다. 대안적으로, 이들은 중합체 또는 지지체의 사용없이 수술적으로 적용될 수 있다.
본 발명의 제공된 방법은 본원에 기술된 치료제(예를 들어, mRNA)의 치료 유효량의 일회뿐 아니라 다회 투여를 고려한다. 치료제는 대상의 상태의 성질, 중증도 및 정도에 따라 일정한 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 본 발명의 치료제(예를 들어, mRNA)의 치료 유효량을 정기적으로 일정한 간격(예를 들어, 일년에 한 번, 6개월에 한 번, 5개월에 한 번, 3개월에 한 번, 격월(2개월에 한 번), 매월(한 달에 한 번), 격주(이 주에 한 번), 한 달에 두 번, 30일에 한 번, 28일에 한 번, 14일에 한 번, 10일에 한 번, 7일에 한 번, 매주, 일 주일에 두 번, 매일 또는 계속)으로 경막내 투여될 수 있다.
일부 실시예에서, 제공된 리포솜 및/또는 조성물은 그에 함유된 mRNA의 연장 방출(extended-release)용으로 적합하도록 제형화된다. 이와 같은 연장 방출 조성물은 연장된 투여 간격으로 대상체에게 알맞게 투여될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시예에서, 본 발명의 조성물은 하루에 두 번, 매일 또는 격일로 대상체에게 투여된다. 바람직한 실시예에서, 본 발명의 조성물은 대상체에 일주일에 두 번, 일주일에 한 번, 7일에 한 번, 10일에 한 번, 14일에 한 번, 28일에 한 번, 30일에 한 번, 이 주에 한 번, 삼 주에 한 번, 또는 더욱 바람직하게는 사 주에 한 번, 한 달에 한 번, 한 달에 두 번, 6주에 한 번, 8주에 한 번, 두 달에 한 번, 3개월에 한 번, 4개월에 한 번, 6개월에 한 번, 8개월에 한 번, 9개월에 한 번, 또는 매년마다 투여된다. 또한, 연장된 기간 동안 치료제(예를 들어, mRNA)를 전달 또는 방출하기 위해 데포(depot) 투여(예를 들어, 근육내, 피하, 유리체강내)를 위해 제형화된 조성물 및 리포솜이 고려된다. 바람직하게는, 사용된 연장 방출 수단은 안정성을 강화하기 위해 mRNA에 이루어진 변형과 결합된다.
본원에서 사용되는 용어 "치료 유효량"은 대체로 본 발명의 약학적 조성물에 함유된 치료제의 총량에 따라 결정된다. 일반적으로, 치료 유효량은 대상체에 의미있는 유익을 달성하기에 충분하다(예를 들어, 질환 또는 장애를 치료, 조정, 치유, 예방 및/또는 개선하는 것). 예를 들어, 치료 유효량은 원하는 치료 및/또는 예방 효과를 달성하기에 충분한 양일 수 있다. 일반적으로, 치료제가 필요한 대상에 투여된 치료제(예를 들어, mRNA)의 양은 대상체의 특성에 따라 다를 것이다. 이러한 특성에는 대상체의 병태, 질환 중증도, 일반적인 건강 상태, 연령, 성별, 및 체중이 포함된다. 숙련자라면 이러한 요인들과 다른 관련 요인들에 따라 적절한 투여량을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 또한, 최적의 투여량 범위를 확인하는 데 객관적 검정 및 주관적 검정 모두가 임의로 채용될 수 있다.
치료 유효량은 보통 다수의 단위 용량을 포함할 수 있는 투여 요법으로 투여된다. 임의의 특정 치료 단백질의 경우, 치료 유효량(및/또는 효과적인 투여 요법 내의 적절한 단위 투여량)은, 예를 들어 투여 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 따라 달라질 수 있다. 또한, 임의의 특정 환자를 위한 특이적 치료 유효량(및/또는 단위 용량)은 치료받는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 전체적인 건강 상태, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 적용되는 특이적 융합 단백질의 대사; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 요인 등을 포함하는 다양한 요인들에 따라 결정될 수 있다.
일부 실시예에서, 치료 유효량은 약 0.005 mg/kg 체중 내지 500 mg/kg 체중의 범위, 예를 들어, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 400 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 300 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 200 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 100 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 90 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 80 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 70 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 60 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 50 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 40 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 30 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 25 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 20 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 15 mg/kg 체중, 약 0.005 mg/kg 체중 내지 10 mg/kg 체중의 범위이다.
일부 실시예에서, 치료 유효량은 약 0.1 mg/kg 체중 초과, 약 0.5 mg/kg 체중 초과, 약 1.0 mg/kg 체중 초과, 약 3 mg/kg 체중 초과, 약 5 mg/kg 체중 초과, 약 10 mg/kg 체중 초과, 약 15 mg/kg 체중 초과, 약 20 mg/kg 체중 초과, 약 30 mg/kg 체중 초과, 약 40 mg/kg 체중 초과, 약 50 mg/kg 체중 초과, 약 60 mg/kg 체중 초과, 약 70 mg/kg 체중 초과, 약 80 mg/kg 체중 초과, 약 90 mg/kg 체중 초과, 약 100 mg/kg 체중 초과, 약 150 mg/kg 체중 초과, 약 200 mg/kg 체중 초과, 약 250 mg/kg 체중 초과, 약 300 mg/kg 체중 초과, 약 350 mg/kg 체중 초과, 약 400 mg/kg 체중 초과, 약 450 mg/kg 체중 초과, 약 500 mg/kg 체중 초과이다. 특정한 실시예에서, 치료 유효량은 1.0 mg/kg이다. 일부 실시예에서, 1.0 mg/kg의 치료 유효량은 근육내 또는 정맥내 투여된다.
예를 들어, 동결건조된 약학적 조성물은 적절한 투여 제형(예를 들어, 원반, 막대 또는 막과 같은 진피내 투여 제형)으로 제형화될 수 있고 투여 제형이 시간이 흐름에 따라 생체 내에서 개인의 체액에 의해 다시 수화되도록 투여될 수 있다.
제공된 리포솜 및 조성물은 임의의 원하는 조직에 투여될 수 있다. 일부 실시예에서, 제공된 리포솜 또는 조성물에 의해 전달된 mRNA는 리포솜 및/또는 조성물이 투여된 조직에서 발현된다. 일부 실시예에서, 전달된 mRNA는 리포솜 및/또는 조성물이 투여된 조직과 상이한 조직에서 발현된다. 전달된 mRNA가 전달될 수 있고/있거나 발현될 수 있는 예시적인 조직은 이에 제한되지는 않지만, 간, 신장, 심장, 비장, 혈청, 뇌, 골격근, 림프절, 피부 및/또는 뇌척수액을 포함한다.
일부 실시예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 전의 기준 발현 수준과 비교하여 대상으로부터 채취한 생물학적 샘플의 mRNA 발현 수준을 증가시킨다. 전형적으로, 기준 수준은 치료 직전에 측정된다. 생물학적 샘플은 예를 들어 전혈, 혈청, 혈장, 소변 및 조직 샘플(예를 들어, 근육, 간, 피부 섬유아세포)을 포함한다. 일부 실시예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 직전의 기준 수준과 비교하여 mRNA 발현 수준을 적어도 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 만큼 증가시킨다. 일부 실시예에서, 제공된 조성물을 투여하는 것은 치료 받지 않은 대상체의 mRNA 발현 수준과 비교하여 mRNA 발현 수준을 증가시킨다
다양한 실시예에 따르면, 전달된 mRNA의 발현 시기는 특정한 의학적 필요에 맞추어 조정될 수 있다. 일부 실시예에서, 전달된 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현은 제공된 리포솜 및/또는 조성물의 투여 후 1, 2, 3, 6, 12, 24, 48, 72, 및/또는 96 시간 후에 검출가능하다. 일부 실시예에서, 전달된 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현은 투여 후 1주, 2주, 및/또는 1개월 후에 검출가능하다.
본 발명은 대상체, 예를 들어, 인간 대상체 또는 인간 대상체를 치료하고 인간 대상체에 전달되는 세포를 치료하는데 사용하기 위한 관심 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 mRNA 분자를 갖는 조성물을 전달하는 방법을 제공한다.
예
본 발명의 특정 화합물, 조성물 및 방법이 소정의 실시예와 관련하여 특이적으로 기술되었지만, 다음의 예들은 단지 본 발명을 예시하는 역할을 하며 이를 한정하도록 의도되지 않는다.
예 1. 아스코르브산과 함께 mRNA의 동결건조
본 예는 본 발명의 예시적인 동결건조 공정을 예시한다. 본 예는, mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자(mRNA-LNP)의 동결건조를 위해 아스코르브산을 첨가하는 것이 단기 및 장기 보관 후에 mRNA-LNP를 포함하는 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 증가시킨다는 것을 보여준다. 또한, 보다 높은 온도(예를 들어, 20 ℃에서 이차 건조 단계를 수행하는 것은 일정 기간에 걸쳐 mRNA 완전성에 의해 결정했을 때 동결건조된 조성물의 안정성을 또한 증가시켰다.
지질 나노입자에 캡슐화된 시험관 내 합성된 CFTR mRNA(mRNA-LNP)를 함유하는 용액을 표 1 및 2에 나타낸 바와 같이, 10 mM, 20 mM, 및 50 mM의 아스코르브산과 함께 또는 아스코르브산 없이 동결보호제(예를 들어 10% 트레할로오스)를 포함하는 수용액으로 완충액 교환하였다. 샘플 J의 경우(표 1 및 표 2에 나타낸 바와 같이), mRNA-LNP 제형을 10 mM 시트르산염(pH 7.0), 1 mM EDTA 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 2회 세척한 다음, 10% 트레할로오스 중 20 mM 아스코르브산으로 완충액을 교환하여 전처리하였다. 그런 다음, mRNA-LNP 제형 용액을 도 1에 도시된 바와 같이, 냉동, 일차 건조 및 이차 건조 단계에 대한 특이적 파라미터를 특징으로 하는 동결건조 공정을 거친 다음, 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 재구성하였다. 특히, 이차 건조 단계는 약 20℃의 온도에서 수행하였다. 전통적으로, mRNA의 동결건조를 위해, mRNA가 불안정하고 온도에 극도로 민감하기 때문에, 4℃에서 이차 건조 단계를 수행한다. 약 20℃의 온도에서 이차 건조 단계의 경우, 동결건조된 mRNA의 수분 함량은 약 0.5% 내지 1%였으며, 이는 전통적인 이차 건조 조건을 갖는 동결건조된 샘플의 3% 내지 4% 수분 함량보다 유의하게 더 적다.
동결건조된 mRNA-LNP 조성물의 각각의 샘플을 실온에서 4주 동안, 2℃ 내지 8℃에서 3개월 동안 보관하였다. 동결건조된 mRNA-LNP 조성물의 mRNA 완전성을 표 1 및 2에 나타낸 바와 같은 상이한 시점에서 모세관 전기영동(CE)에 의해 결정하였다.
실온에서 보관된 동결건조된 샘플의 mRNA 완전성
샘플 동결건조 조건 보관 후 mRNA 완전성
이차 건조 온도 아스코르브산 0주 1주 4주
A 20 ℃ 0 mM 59 % 37 % 14 %
B 20 ℃ 0 mM 64 % 42 % 17 %
C 4 ℃ 0 mM 43 % 21 % 4 %
D 4 ℃ 0 mM 55 % 13 % 1 %
E 4 ℃ 0 mM 69 % 15 % 2 %
F 20 ℃ 50 mM 59 % 47 % 36 %
G 20 ℃ 20 mM 58 % 44 % 30 %
H 20 ℃ 20 mM 58 % 46 % 29 %
I 20 ℃ 10 mM 59 % 49 % 32 %
J 20 ℃ 20 mM 55 % 47 % 30 %
표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 동결건조 공정을 위한 아스코르브산의 첨가는 실온에서 1주 및 4주 모두 동안 보관했을 때 mRNA 완전성을 연장시켰다. 특히, 다양한 농도의 아스코르브산을 함유하는 샘플 F 내지 J는, 임의의 아스코르브산을 갖지 않은 대조군(샘플 A 및 B)과 비교하여 4주 후에 약 20% 더 높은 mRNA 완전성을 가졌다.
또한, 표 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 동결건조 공정을 위한 아스코르브산의 첨가는 2℃ 내지 8℃에서 3개월 동안 보관했을 때 mRNA 완전성을 유지하였다. 20℃에서 이차 건조 단계를 거친 샘플 A 내지 B 및 F 내지 J는 일반적으로 4℃에서 이차 건조 단계를 거친 샘플 C 내지 E와 비교했을 때 더 높은 mRNA 완전성을 장기간 유지하였다.
2℃ 내지 8℃에 보관된 동결건조된 샘플의 mRNA 완전성
샘플 동결건조 조건 보관 후 mRNA 완전성
이차 건조 온도 아스코르브산 0개월 1개월 3개월
A 20 ℃ 0 mM 59 51 47
B 20 ℃ 0 mM 64 59
C 4 ℃ 0 mM 43 37 32
D 4 ℃ 0 mM 55 52 46
E 4 ℃ 0 mM 69 40 40
F 20 ℃ 50 mM 59 59
G 20 ℃ 20 mM 57 55 49
H 20 ℃ 20 mM 58 63
I 20 ℃ 10 mM 59 56
J 20 ℃ 20 mM 55 49 51
전반적으로, 본 예의 데이터는, mRNA를 동결건조하기 위해 아스코르브산을 첨가하고 20℃에서 이차 건조 단계를 수행하는 것이 단기 및 장기 보관을 위한 mRNA 완전성을 개선시킨다는 것을 보여준다.
예 2. 실온 및 2℃ 내지 8℃에서 LNP에 캡슐화된 동결건조된 mRNA의 mRNA 완전성
본 예는, 동결건조 공정 동안 고온(예를 들어, 20℃에서 이차 건조 단계가, mRNA-LNP 제형에 아스코르브산을 첨가하는 단계, 및 완충액으로 mRNA-LNP 제형을 전처리하는 단계("전처리")가 실온에서 그리고 2℃ 내지 8℃에서 장기간에 걸쳐 지질 나노입자에 캡슐화된 동결건조된 mRNA의 안정성 및 완전성에 기여한다는 것을 추가로 예시한다.
지질 나노입자에 캡슐화된 시험관 내 합성된 CFTR mRNA(mRNA-LNP)를 함유하는 용액을 표 3 내지 4에 나타낸 바와 같이, 20 mM의 아스코르브산과 함께 또는 아스코르브산 없이 동결보호제(예를 들어 10% 트레할로오스)를 포함하는 수용액으로 완충액 교환하였다. 샘플 E의 경우(표 3 및 4에 나타낸 바와 같이), mRNA-LNP 제형을 10 mM 시트르산염(pH 7.0), 1 mM EDTA 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 2회 세척한 다음, 10% 트레할로오스 중 20 mM 아스코르브산으로 완충액을 교환하여 전처리하였다.
그런 다음, mRNA-LNP를 포함하는 용액을 예 1에 설명된 바와 같이 표 3 내지 표 4에 나타낸 바와 같은 상이한 조건을 갖는 동결건조 공정을 거친 다음, 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 재구성하였다. 동결건조된 mRNA-LNP 조성물의 각각의 샘플을 실온에서 4주 동안 그리고 2℃ 내지 8℃에서 6개월 동안 보관하였다. 동결건조된 mRNA의 mRNA 완전성을 표 3 및 4에 나타낸 바와 같은 상이한 시점에서 모세관 전기영동(CE)에 의해 결정하였다.
실온에서 보관한 동결건조된 샘플의 mRNA 완전성
샘플 동결건조 조건 RT에서 보관 후 mRNA 완전성(%) 1주 보관 후 mRNA 완전성 저하
이차 건조 온도 아스코르브산 전처리 0주 1주 4주
A 4 ℃ 0 mM 없음 55 13 1 42
B 4 ℃ 0 mM 없음 69 15 2 54
C 20 ℃ 0 mM 없음 59 37 14 22
D 20 ℃ 20 mM 없음 58 44 30 14
E 20 ℃ 20 mM 있음 55 47 30 8
2℃ 내지 8℃에 보관된 동결건조된 샘플의 mRNA 완전성
샘플 동결건조 조건 RT에서 보관 후 mRNA 완전성(%) 6개월 보관 후 mRNA 완전성 저하
이차 건조 온도 아스코르브산 전처리 0개월 3개월 6개월
A 4 ℃ 0 mM 없음 69 40 43 26
C 20 ℃ 0 mM 없음 59 (±5) 47 (±2) 45 (±1) 14
D 20 ℃ 20 mM 없음 58 (±2) 47 (±4) 46 12
E 20 ℃ 20 mM 있음 55 (±5) 50 (±5) 47 (±0.3) 8
표 3 및 도 4에 나타낸 바와 같이, 각각의 동결건조 조건 - 1) 20℃에서의 이차 건조 단계, 2) 아스코르브산의 첨가, 및 3) 전처리 단계 - 실온에서 1주 및 4주 모두 동안 보관 시 mRNA 완전성을 연장시켰다. 특히, 20℃에서 이차 건조 단계와 함께 동결건조시킨 샘플 C 내지 E는 4℃에서 이차 건조 단계로 동결건조시킨 샘플 A 내지 B와 비교하여 4주 후 mRNA 완전성에서 상당히 더 작은 저하를 가졌다. 또한, 동결건조 전에 mRNA-LNP 제형에 아스코르브산을 첨가하는 것은 실온에서 동결건조된 조성물의 mRNA 완전성을 유지하는데 상당히 도움이 되었다. 전처리 단계는 또한, 실온에서 1주 및 4주 보관 후 mRNA 완전성의 상당히 작은 저하(샘플 E)에 의해 나타낸 바와 같이 mRNA 완전성을 추가로 연장시켰다.
표 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, 샘플을 2℃ 내지 8℃에서 보관했을 때 동일한 추세가 관찰되었다. 샘플 E의 2℃ 내지 8℃에서 6개월 보관 후 mRNA 완전성의 저하는 샘플 A(표 5)보다 약 6배 더 낮았으며, 이는 본 발명의 동결건조 조건이 동결건조된 mRNA-LNP 조성물의 mRNA 완전성을 상당히 연장시킬 수 있음을 보여준다.
일정 기간 동안 2℃ 내지 8℃에서 보관된 동결건조된 샘플의 mRNA 완전성 감소
샘플 동결건조 조건 0 시점과 비교하여 각 시점에서 mRNA 완전성의 저하
이차 건조 온도 아스코르브산 전처리 0개월 1개월 3개월 6개월
A 4 ℃ 0 mM 없음 0 29 29 26
C 20 ℃ 0 mM 없음 0 8 12 14
D 20 ℃ 20 mM 없음 0 3 11 12
E 20 ℃ 20 mM 있음 0 4 5 8
전반적으로, 본 예는 본 발명의 각각의 동결건조 조건 - 1) 20℃에서의 이차 건조 단계, 2) 아스코르브산의 첨가, 및 3) 전처리 단계-이 단기 및 장기 보관 모두에 대해 동결건조된 mRNA-LNP 조성물의 mRNA 완전성을 개별적으로 및 집합적으로 연장시킬 수 있음을 보여준다.
예 3. 아스코르브산 첨가는 mRNA-LNP의 동결건조 동안 mRNA 완전성의 개선에 기여한다
본 예는, 예 2 내지 예 3에 나타낸 바와 같이, 낮은 pH 또는 아스코르브산으로의 전처리가 mRNA 완전성을 개선할 수 있는지 여부를 조사한다.
mRNA-LNP를 포함하는 다양한 샘플을 표 6에 나타낸 바와 같이 동결건조를 위해 제조하였다. 샘플 A의 경우, 지질 나노입자에 캡슐화된 시험관 내 합성된 mRNA(mRNA-LNP)를 함유하는 용액을 10% 트레할로오스로 완충액 교환하였다. 샘플 B의 경우, mRNA-LNP 제형을 10% 트레할로오스 중 20 mM 아스코르브산을 포함하는 완충액으로 2회 세척한 다음, 10% 트레할로오스로 완충액을 교환하여 전처리하였다. 샘플 C의 경우, mRNA-LNP 제형을 pH 3.0 및 10% 트레할로오스를 포함하는 완충액으로 완충액 교환하였다. pH 3.0의 완충액을 1N HCl로 제조하였다. 샘플 D의 경우, mRNA-LNP 제형을 20 mM 아스코르브산과 함께 10% 트레할로오스로 완충액 교환하였다.
그런 다음, 각각 mRNA-LNP를 포함하는 샘플 A 내지 샘플 D를 20℃에서 이차 건조 단계를 갖는 예 1에 설명된 바와 같은 동결건조 공정을 거친 다음, 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 재구성하였다. 각각의 동결건조된 mRNA-LNP 샘플을 실온에서 4주 동안 보관하였고, mRNA 완전성을 표 6에 나타낸 바와 같은 상이한 시점에서 모세관 전기영동(CE)에 의해 결정하였다.
실온에서 보관된 동결건조된 샘플의 mRNA 완전성
샘플 조건 RT에서 보관 후 mRNA 완전성(%)
0주 2주 4주
A 대조군 62 22 15
B 아스코르브산으로 전처리 62 32 19
C 낮은 pH(pH 3)를 갖는
제형		 62 33 21
D 20 mM 아스코르브산 58 41 30
표 6 및 도 6에 나타낸 바와 같이, 낮은 pH 제형(샘플 C) 및 아스코르브산으로의 전처리(샘플 D)는 20 mM 아스코르브산을 갖는 샘플 D와 비교하여 mRNA-LNP의 mRNA 완전성을 연장시키는데 효과적이지 않았다.
예 4. 다양한 농도에서 아스코르브산의 효과
본 예는 동결건조 및 재구성 후 mRNA-LNP 조성물의 mRNA 완전성에 대한 아스코르브산 농도의 효과를 탐색한다.
mRNA-LNP를 함유하는 용액을 표 7에 나타낸 바와 같이 3 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 및 50 mM의 아스코르브산과 함께 또는 아스코르브산 없이 동결보호제(예를 들어 10% 트레할로오스)를 포함하는 수용액으로 완충액 교환하였다. 그런 다음, mRNA-LNP를 포함하는 용액을 예 1에 설명된 바와 같이 20℃에서 이차 건조 단계를 거치고, 이어서 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 재구성하여 동결건조 공정을 수행하였다. 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 실온에서 4주 동안 보관하였고, mRNA 완전성은 표 7에 나타낸 바와 같은 상이한 시점에서 모세관 전기영동(CE)에 의해 결정하였다.
일정 기간 동안 2℃ 내지 8℃에서 보관된동결건조된 샘플의 mRNA 완전성 감소
샘플 동결건조 조건 mRNA 완전성 (%)
아스코르브산 (mM) pH 0주 2주 4주
A 0 4.6 64 29 17
B 3 60 32 NA
C 5 57 39 25
D 10 3.4 60 41 32
E 20 3.3 58 40 29
F 50 2.9 59 44 36
표 7 및 도 7에 나타낸 바와 같이, 동결건조 전에 상기 또는 10 mM의 농도로 mRNA-LNP 조성물에 아스코르브산을 첨가하는 것이 mRNA 완전성을 연장시키는데 효과적이었다. 실온에서 4주 보관에 걸쳐, 아스코르브산을 10 mM 이상으로 첨가했을 때(표 7의 샘플 D 내지 F), 동결건조된 mRNA-LNP 조성물의 mRNA 완전성의 저하는 상당히 더 낮았다.
표 7에 나타낸 바와 같이, 아스코르브산을 첨가하면 mRNA-LNP 조성물의 pH가 약 2.9 내지 3.4로 낮아진다. 그러나, 생체 내 연구 또는 임상 목적을 위해, mRNA-LNP 조성물의 pH가 생리학적 pH에 가깝다는 것이 유익하다. 아스코르브산과 함께 동결건조시킨 mRNA-LNP 조성물의 pH를 증가시키기 위해, 상이한 완충액을 다양한 농도로 mRNA-LNP 조성물에 첨가하고 pH를 측정하였다.
아스코르브산과 함께 동결건조 후 pH 조정
완충액 완충액 농도 (mM) 동결건조 공정 전에 첨가된 아스코르브산 농도(mM) 최종 pH
트리스 pH 7.5 75 20 4.8
100 20 6.9
트리스 pH 8.0 20 20 4.2
50 20 6.9
포스페이트 pH 7.0 10 10 4.8
20 10 6.3
50 20 4.7
60 20 6.2
50 50 3.9
75 50 4.2
표 8은 동결건조 공정 전에 10 mM 또는 20 mM 아스코르브산으로 첨가된 샘플의 경우, mRNA-LNP 조성물의 pH가 다양한 완충액의 첨가에 의해 증가될 수 있음을 보여준다. 그러나, 동결건조 전에 50 nM 아스코르브산과 함께 첨가된 샘플의 pH는, 완충액의 고농도(예를 들어, 50 mM 및 75mM)가 샘플에 첨가된 경우에도 약 4로 유지되었다.
예 5. 동결건조 전 및 후의 제형 특성
본 예는, 크기, 다분산 지수(PDI, polydispersity index) 및 캡슐화 효율에 의해 입증된 바와 같이, mRNA 캡슐화된 LNP(mRNA-LNP)의 전반적인 완전성이 동결건조 공정 후 잘 유지되고, 아스코르브산의 첨가가 mRNA를 캡슐화하는 지질 나노입자의 완전성에 악영향을 미치지 않음을 보여준다.
지질 나노입자에 캡슐화된 시험관 내 합성된 mRNA(mRNA-LNP)를 함유하는 용액을 표 9에 나타낸 바와 같이 10 mM, 20 mM, 및 30 mM 아스코르브산과 함께 또는 아스코르브산 없이 동결보호제(예를 들어 10% 트레할로오스)를 포함하는 수용액으로 완충액 교환하였다. 그런 다음, mRNA-LNP를 포함하는 용액을 예 1에 설명된 바와 같이 20℃에서 이차 건조 단계를 거치고, 이어서 동결건조된 mRNA-LNP 조성물을 재구성하였다. mRNA-LNP의 크기, PDI, 및 캡슐화 효율을 표 9에 나타낸 샘플에 대해 동결건조 전 및 동결건조 후/재구성에 대해 측정하였다.
mRNA-LNP의 동결건조 공정 전 및 후의 특성
샘플 아스코르브산 크기 (mM) PDI 캡슐화 효율 (%)
동결건조 전 동결건조 후 동결건조 전 동결건조 후 동결건조 전 동결건조 후
A 0 mM 50 53 0.134 0.163 87 88
B 10 mM 52 52 0.140 0.165 87 82
C 20 mM 52 52 0.151 0.176 87 84
D 30 mM 53 53 0.155 0.140 84 84
표 9에 나타낸 바와 같이, mRNA-LNP의 크기, PDI, 및 캡슐화 효율을 mRNA-LNP가 본 발명의 동결건조 공정을 거친 후 유지하였다. 이러한 데이터는 본 발명의 동결건조 조건 및 공정이 LNPS 내로 캡슐화된 mRNA의 완전성을 연장시키면서 동시에, 또한 동결건조 후 mRNA-LNP의 크기, PDI 및 캡슐화 효율을 보존하는데 효과적임을 보여준다.
균등물
숙련자는 일상적인 실험만을 이용하여, 본원에서 설명되는 본 발명의 소정의 실시예에 대한 다수의 균등물을 인지하거나 확인할 수 있을 것이다. 본 발명의 범주는 전술된 설명에 한정되는 것으로 의도되는 것이 아니라, 오히려 첨부된 청구범위에서 설명되는 바와 같다.

Claims (39)

  1. mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은:
    (a) 초기 mRNA 완전성을 갖는 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 수용액에 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 첨가하는 단계,
    (b) 상기 수용액을 냉동시켜 냉동된 용액을 수득하는 단계,
    (c) 상기 냉동된 용액을 10시간 초과의 기간 동안 건조시켜 동결건조된 조성물을 수득하는 단계를 포함하고,
    여기서 상기 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 상기 동결건조된 조성물을 재구성하는 경우, 상기 재구성 후 mRNA 완전성은 상기 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%인, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 방법은 (a) 단계 이전에, 상기 수용액으로부터 시트르산을 제거하는 단계를 포함하는, 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 시트르산을 제거하는 단계는 pH 6 내지 pH 8의 pH에서 시트르산 및 EDTA를 포함하는 수용액을 세척하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 수용액은 1 mM 내지 10 mM의 시트르산염 완충액을 포함하는, 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 수용액은 1 mM EDTA를 포함하는, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 재구성 후 mRNA 완전성은 상기 초기 mRNA 완전성의 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 또는 적어도 85%인, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 (c) 단계 후에,
    (d) 상기 동결건조된 조성물의 온도를 15℃ 내지 30℃의 온도로 증가시키고 유지하는 단계를 포함하는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용액은 약 10 mM 내지 50 mM의 아스코르브산을 포함하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수용액은 약 20 mM의 아스코르브산을 포함하는, 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조 단계는 20시간, 50시간, 100시간, 120시간 또는 140시간 초과 동안 수행되는, 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물은 (d) 단계에서 15℃ 내지 30℃의 온도에서 1시간, 5시간 또는 10시간 초과 동안 유지되는, 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 mRNA 완전성은 50% 초과이고 재구성 후 mRNA 완전성은 40% 초과인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 mRNA 완전성은 40% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 40% 초과로 유지되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 mRNA 완전성은 50% 초과이고, 재구성 후 mRNA 완전성은 50% 초과로 유지되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA 완전성은 모세관 전기영동에 의해 결정되는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조 단계는 -20℃ 내지 -30℃의 온도에서 수행되는, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 건조 단계는 약 50 mTorr의 압력에서 수행되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 동결건조된 조성물의 온도는 (d) 단계에서 약 20℃의 온도로 증가되고 유지되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용액이 트레할로오스를 포함하는, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용액이 7.0 미만 pH을 갖는, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자를 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물.
  22. mRNA를 캡슐화하는 하나 이상의 지질 나노입자 및 5mM 내지 200 mM의 아스코르브산을 포함하는 안정적인 동결건조된 조성물로서, 상기 동결건조된 조성물을 15℃ 내지 25℃의 온도에서 4주 동안 보관한 후 상기 동결건조된 조성물을 재구성할 때, 상기 재구성 후 mRNA의 완전성은 초기 mRNA 완전성의 적어도 50%인, 안정적인 동결건조된 조성물.
  23. 제22항에 있어서, 상기 조성물은 pH 5 내지 pH 7의 pH를 포함하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 조성물은 0.1 mM 미만의 시트르산염을 가지는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  25. 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정적인 동결건조된 조성물은 약 10 mM 내지 50 mM의 아스코르브산을 포함하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 상기 안정적인 동결건조된 조성물은 약 20 mM 아스코르브산을 포함하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  27. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 mRNA 완전성은 50% 초과이고 재구성 후 mRNA 완전성은 40% 초과인, 안정적인 동결건조된 조성물.
  28. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 mRNA 완전성은 40% 초과이고 재구성 후 mRNA 완전성은 40% 초과인, 안정적인 동결건조된 조성물.
  29. 제22항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 초기 mRNA 완전성은 50% 초과이고 재구성 후 mRNA 완전성은 50% 초과인, 안정적인 동결건조된 조성물.
  30. 제22항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA 완전성은 모세관 전기영동에 의해 결정되는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  31. 제22항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정적인 동결건조된 조성물은 트레할로오스를 포함하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  32. 제22항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정적인 동결건조된 조성물은 7.0 미만의 pH를 가지는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  33. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 낭성 섬유증 전도 조절자를 암호화하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  34. 제22항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 mRNA는 백신을 암호화하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  35. 제22항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 양이온성 지질, 헬퍼 지질 및 PEG-변형 지질을 포함하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  36. 제35항에 있어서, 상기 지질 나노입자는 콜레스테롤을 추가로 포함하는, 안정적인 동결건조된 조성물.
  37. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 DOPE인, 안정적인 동결건조된 조성물.
  38. 제35항 또는 제36항에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 DEPE인, 안정적인 동결건조된 조성물.
  39. 제35항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PEG-변형 지질은 DMG-PEG 2000인, 안정적인 동결건조된 조성물.
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