JP2020537541A - 脂質ナノ粒子を用いるインビトロでのｍｒｎａの送達方法 - Google Patents

脂質ナノ粒子を用いるインビトロでのｍｒｎａの送達方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、ＨＳＰＣなどの幹細胞内にｍＲＮＡを導入し、かつ、そのような細胞に遺伝子編集成分をインビトロで送達するための組成物及び方法に関する。例えば、本開示は、ＨＳＰＣにおいてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９複合体を使用して遺伝子配列を修飾すること、及びＨＳＰＣにおけるそのような遺伝子修飾を達成するための方法及び送達システムに関する。【選択図】なし

Description

本出願は、２０１７年９月２９日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，２３２号の優先権の利益を主張し、その記載内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本発明は、脂質ナノ粒子を用いるインビトロでのＭＲＮＡの送達方法に関する。
遺伝子編集方法及び遺伝子治療方法にとって、造血幹細胞（ＨＳＣ）及びその子孫を含め幹細胞内に遺伝子変化を導入することに関心が持たれている。ＨＳＣなどの幹細胞には、成熟細胞では失われている増殖能があり、分化系列が決定された前駆細胞は遺伝子編集技術に特に有用である。例えば、ＨＳＣ及び幹細胞をインビトロで修飾することができることは重要であり、ＨＳＣ及び他の幹細胞に生物学的因子を培養で送達する方法が求められている。ヒトＨＳＣについての培養での送達技術が特に必要とされている。
ＨＳＣは生涯にわたる血液産生に必要不可欠である。ＨＳＣは、分化して骨髄系及びリンパ系の血液系列すべての成熟子孫を産生する能力、または自己複製し、段階的に分化系列が決定されていくことになる細胞に置き換わる能力の両方ともあるため、長期にわたり機能する造血を持続させることができる。ＨＳＣを使用して、移植レシピエント、免疫不全患者、または他の患者の血液及び免疫細胞を修復することができる。具体的には、遺伝性免疫不全及び自己免疫疾患ならびに種々の造血障害を有する患者の治療にＨＳＣの自家移植または同種移植を使用して造血細胞系列及び免疫系による防御を再構成することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子編集システムの成分を培養でＨＳＣに送達する方法は特に関心が持たれている。本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系成分が含まれるＲＮＡをＨＳＣなど造血細胞培養物に送達する方法を提供する。かかる方法では、インビトロで培養されたＨＳＣなど幹細胞に活性タンパク質を送達し、これには、かかるタンパク質をコードするｍＲＮＡを提供する脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物と細胞を接触させることが含まれる。さらに、ＨＳＣなど幹細胞においてインビトロで遺伝子を編集する方法、及び工学的に操作された細胞を作製する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、インビトロでのＨＳＣにおける遺伝子編集方法、及び工学的に操作したＨＳＣ細胞の作製方法を提供する。さらなる実施形態では、本明細書により、造血幹及び／または前駆細胞（ＨＳＰＣ）またはＨＳＰＣ集団にｍＲＮＡを送達する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物と血清因子をプレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をインビトロで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をインビトロで培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法により、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団へのｍＲＮＡ送達がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本明細書により、幹細胞、例えば、ＨＳＰＣにＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを導入する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物と血清因子をプレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣをインビトロで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法により、ＨＳＰＣへのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの導入がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本明細書により、遺伝子操作された幹細胞、例えば、ＨＳＰＣをインビトロで作製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物と血清因子をプレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣをインビトロで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣをインビトロで培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法により、遺伝子操作されたＨＳＰＣの作製がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団にｍＲＮＡを送達する方法を提供し、かかる方法は、ＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞または集団とをインビトロで接触させ、細胞または集団をインビトロで培養し、それによりＨＳＰＣにｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、ＨＳＰＣはＨＳＣである。いくつかの実施形態では、方法により、ＨＳＰＣ集団（例えば、ＣＤ３４＋細胞集団）にＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのｍＲＮＡが送達される。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を、任意選択でＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡと組み合わせて、細胞に送達する。
ＬＮＰを使用した、ＣＤ３４＋骨髄細胞内における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡの送達を示す。 ＣＤ３４＋骨髄細胞におけるｍＲＮＡ送達は、血清とのプレインキュベーションに依存することを示す。 図３Ａ及び図３Ｂは、血清とのプレインキュベーションを行った場合のＣＤ３４＋骨髄細胞におけるＢ２Ｍ編集を示し、図３ＡはＢ２Ｍ−（タンパク質発現をノックダウン）細胞の割合を示し、実験で達成された編集率を図３Ｂにグラフ化している。 図４Ａ及び図４Ｂは、血清とプレインキュベーションした場合及びＡｐｏＥ３とプレインキュベーションした場合の効率的送達を示す。図４ＡはＢ２Ｍ−細胞の割合を示し、図４Ｂは実験で達成された編集率を示す。 ＬＮＰとさまざまな血清因子調製物とのプレインキュベーションがＣＤ３４＋細胞へのＬＮＰ送達に及ぼす効果を示す。 さまざまな間隔でＬＮＰ処理に曝露されたＣＤ３４＋細胞の生存率及び編集データを示す。ＬＮＰに２時間、６時間、及び２４時間曝露した後のＣＤ３４＋細胞の生存率を示す。 さまざまな間隔でＬＮＰ処理に曝露されたＣＤ３４＋細胞の生存率及び編集データを示す。処置時間が２時間、６時間、及び２４時間の各群の編集率データを示す。
本開示は、ＣＤ３４＋細胞、例えば、ＨＳＣ含有細胞集団へのインビトロ送達のために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ成分のＲＮＡ（「カーゴ」）など、ＲＮＡのＬＮＰ組成物を使用する方法を提供する。方法は、従来の送達技術と比較して改善された特性を示し得、例えば、方法によりＲＮＡが効率的に送達される一方で、トランスフェクションにより引き起こされる細胞死が減少する。
いくつかの実施形態では、本明細書により、幹細胞、例えば、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団にｍＲＮＡを送達する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物と血清因子をプレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をインビトロで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をインビトロで培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法により、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団へのｍＲＮＡ送達がもたらされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはＣａｓヌクレアーゼをコードする。
いくつかの実施形態では、本明細書により、幹細胞、例えば、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団にＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを導入する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物と血清因子をプレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣをインビトロで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣを培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法により、ＨＳＰＣへのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡの導入がもたらされる。
いくつかの実施形態では、本明細書により、遺伝子操作された幹細胞、例えば、ＨＳＰＣをインビトロで作製する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物と血清因子をプレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣをインビトロで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣをインビトロで培養することを含む。いくつかの実施形態では、方法により、遺伝子操作されたＨＳＰＣの作製がもたらされる。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はさらにｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼをコードする。特定の実施形態では、カーゴまたはＲＮＡ成分にはＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどが含まれる。特定の実施形態では、カーゴまたはＲＮＡ成分にはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系ｇＲＮＡまたはｇＲＮＡをコードする核酸が含まれる。遺伝子編集方法及び工学的に操作された細胞の作製方法も提供される。
インビトロ法
本方法によりインビトロでＣＤ３４＋細胞にＲＮＡを送達する。「ＣＤ３４＋細胞」とは、表面にＣＤ３４マーカーを発現する細胞を指す。ＣＤ３４＋細胞は、例えば、フローサイトメトリー及び蛍光標識した抗ヒトＣＤ３４抗体などを使用して検出し、計数することができる。
いくつかの実施形態では、幹細胞、例えば、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団にｍＲＮＡを送達する方法を提供し、かかる方法は、（ａ）ｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、（ｂ）プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団とをインビトロで接触させ、（ｃ）ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をインビトロで培養し、それによりＨＳＰＣにｍＲＮＡを送達することを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードする。いくつかの態様では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡはＣａｓ９ ｍＲＮＡまたはＣｐｆ１ ｍＲＮＡである。特定の実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はさらにｇＲＮＡを含む。さらなる実施形態では、方法によりＨＳＰＣにＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡが導入され、かかる方法は、（ａ）ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、（ｂ）プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣとをインビトロで接触させ、（ｃ）ＨＳＰＣを培養し、それによりＨＳＰＣにＣａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡを導入することを含む。
さまざまな実施形態では、本明細書に記載する方法のｇＲＮＡは二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）であっても単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）であってもよい。
インビトロ法のいくつかの実施形態では、ＬＮＰトランスフェクションでは、電気穿孔法のような公知技術に比べてＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞の細胞死が減少し得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰトランスフェクションでは、５％未満、１０％未満、２０％未満、３０％未満、または４０％未満の細胞死が引き起こされる場合がある。特定の実施形態では、トランスフェクション後の細胞生存は少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％である。
幹細胞は、自己複製能、及び多様な細胞型への分化能を特徴とする。哺乳類の幹細胞は大きく分けて胚性幹（ＥＳ）細胞及び成体幹細胞の２種類がある。成体幹細胞または前駆細胞は特殊化した細胞を補充し得る。ほとんどの成体幹細胞は系列が限定され、その由来組織によって言及され得る。ＥＳ細胞株は、胚盤胞期または初期桑実胚期の胚の内部細胞塊のエピブラスト組織に由来する。ＥＳ細胞は多能性であり、三胚葉、すなわち、外胚葉、内胚葉及び中胚葉からの由来細胞を発生させる。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、胚性幹細胞の決定的特性の維持にとって重要な遺伝子及び因子を強制発現させることにより、胚性幹細胞様状態に遺伝子が再プログラムされている成体細胞である。「幹細胞」は、例えば、ＥＳＣ、ｉＰＳＣ、前駆細胞、またはＨＳＰＣであってよい。
用語「造血幹及び／または前駆細胞」及び「ＨＳＰＣ」は同じ意味で使用され、ＨＳＣ及び造血前駆細胞（「ＨＰＣ」）の両方を含む細胞の集団を指す。そのような細胞は、例えば、ＣＤ３４＋として特徴付けられる。例示的な実施形態では、ＨＳＰＣは骨髄から単離される。他の例示的な実施形態では、ＨＳＰＣは末梢血から単離される。他の例示的な実施形態では、ＨＳＰＣは臍帯血から単離される。
ＨＳＰＣは骨髄、末梢血、または臍帯血に由来してよく、また、自己由来（患者自身の幹細胞）であっても同種（ドナーから得た幹細胞）であってもよい。
本明細書で使用する「造血前駆細胞」または「ＨＰＣ」という用語は未分化の造血細胞を指し、これは、自己複製能が限られており、造血階層内のどこに置かれているかによって異なる、複数系列への分化能（例えば、骨髄系、リンパ系）、単一系列への分化能（例えば、骨髄系またはリンパ系）または細胞型が限定された分化能（例えば、赤血球前駆細胞）を有する（Ｄｏｕｌａｔｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ２０１２）。
本明細書で使用する「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、自己複製能を有し、かつ、顆粒球（例えば、前骨髄球、好中球、好酸球、好塩基性細胞）、赤血球（例えば、網状赤血球、赤血球）、血小板（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｅｓ）（例えば、巨核芽球、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ）産生巨核球、血小板（ｐｌａｔｅｌｅｔ））、及び単球（例えば、単球、マクロファージ）を含むより成熟した血液細胞への分化能を有する未熟血液細胞も指す。そのような細胞にＣＤ３４＋細胞が含まれる場合と含まれない場合があることは当該技術分野で公知である。ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４細胞表面マーカーを発現する未成熟細胞である。ＣＤ３４＋細胞は、上記で定義した幹細胞特性を有する細胞の亜集団が含まれていると考えられている。白血病、リンパ腫、及び他の障害を治療するために、多能性ＨＳＣを含有するＨＳＰＣなどの細胞集団の移植を使用することができる。
ＨＳＣは、未分化前駆細胞（例えば、多能性前駆細胞）及び／または特定の造血系（例えば、リンパ系前駆細胞）への分化が決定された前駆細胞を発生させることができる多能性細胞である。特定の造血系に分化が決定された幹細胞は、Ｔ細胞系列、Ｂ細胞系列、樹状細胞系列、ランゲルハンス細胞系列及び／またはリンパ組織特異的マクロファージ細胞系列の幹細胞であり得る。さらに、ＨＳＣとは、長期ＨＳＣ（ＬＴ−ＨＳＣ）及び短期ＨＳＣ（ＳＴ−ＨＳＣ）も指す。ＳＴ−ＨＳＣはＬＴ−ＨＳＣよりも活性があり、より増殖性である。ただし、ＬＴ−ＨＳＣが無限に自己複製（すなわち、成体期を通じて生存）するのに対し、ＳＴ−ＨＳＣでは自己複製が限られている（すなわち、限定された期間しか生存しない）。これらのＨＳＣのうちどのＨＳＣでも本明細書に記載の任意の方法において使用することができる。任意選択で、ＳＴ−ＨＳＣは、高増殖性であるためＨＳＣとその子孫の数が急増すばやく増加するという理由から有用である。
ＨＳＣ、ＨＰＣ、及びＨＳＰＣは任意選択で血液製剤から得られる。血液製剤には、造血由来の細胞を含有している、身体または身体の臓器から得られた製剤が含まれる。そのような供給源には、骨髄、臍帯、末梢血（例えば、動員された末梢血で、例えば、Ｇ−ＣＳＦまたはＰｌｅｒｉｘａｆｏｒ（登録商標）（ＡＭＤ３１００）などの動員剤を用いて動員されたもの）、肝臓、胸腺、リンパ及び脾臓が含まれる。前述の血液製剤はすべて（例えば、粗形態、未分画形態、または分画形態）、ＨＳＣ特徴を有する細胞について当業者に公知の方法で濃縮することができる。同様に、前述の血液製剤は、ＨＰＣ及び／またはＨＳＰＣ集団の特徴について濃縮することができる。一実施形態では、ＨＳＣはＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−と特徴付けられる。実施形態では、ＨＳＣはＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋細胞と特徴付けられる。さらなる実施形態では、ＨＳＣはＬｉｎｅａｇｅ−（陰性）ＣＤ３４＋／ＣＤ３８−／ＣＤ９０＋／ＣＤ４５ＲＡ−と特徴付けられる。実施形態では、ＨＳＣはＬｉｎｅａｇｅ−（陰性）ＣＤ３４＋／ＣＤ９０＋／ＣＤ４９ｆ＋の細胞と特徴付けられ、ここで、「ｌｉｎｅａｇｅ」とは、最終分化細胞、例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞等を除外するマーカーを意味する。これらは、造血系への分化が決定した細胞により発現される表面マーカーに対する抗体を用いて細胞を染色することにより取り除くことができる。これらには、ＣＤ３（Ｔ細胞）、ＣＤ１９（Ｂ細胞）、ＣＤ３３（骨髄系）、ＣＤ５６（ＮＫ細胞）、ＣＤ２３５ａ（赤血球細胞）、ＣＤ７１（赤血球細胞）が挙げられるが、これに限定されるものではない。
細胞集団において使用される場合の「濃縮された」とは、１つ以上のマーカー、例えば、ＣＤ３４＋などの存在に基づいて選択された細胞集団を指す。幹細胞集団またはＨＳＰＣ集団などの細胞集団とは、生物学的供給源、例えば、血液製剤または組織から単離され、かつ、２つ以上の細胞に由来する、真核生物の哺乳類、好ましくはヒトの細胞を指す。
プレインキュベーション中に血清因子とＬＮＰ組成物とを接触させてから、インビトロでＨＳＰＣ細胞に送達してよい。
インビトロ法のいくつかの実施形態では、血清因子とＬＮＰ組成物とを約３０秒〜一晩プレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、プレインキュベーションステップには、血清因子とＬＮＰ組成物とを約１分〜１時間プレインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、かかるステップは約１〜３０分間プレインキュベートすることを含む。他の実施形態では、かかるステップは約１〜１０分間プレインキュベートすることを含む。さらに別の実施形態では、約５分間プレインキュベートすることを含む。特定の実施形態では、上記の範囲の端点及び値は±０．５分、１分、２分、３分、または４分であってよい。
特定の実施形態では、プレインキュベートステップは約４℃にて生じる。特定の実施形態では、プレインキュベートステップは約２５℃にて生じる。特定の実施形態では、プレインキュベートステップは約３７℃にて生じる。プレインキュベートステップは炭酸水素ナトリウムまたはＨＥＰＥＳなどの緩衝液を含んでよい。特定の実施形態では、緩衝液はＨＳＰＣ用培地を含んでよい。さらなる実施形態では、緩衝液はＨＳＰＣ用培地で構成されてよい。
ＬＮＰ組成物と血清因子のプレインキュベーションは、血清とのプレインキュベーション、血清分画とのプレインキュベーション、または単離された血清因子とのプレインキュベーションを含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物を血清とプレインキュベートする。血清は、哺乳類、マウス、霊長類、またはヒトの血清であってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物を単離された血清因子とプレインキュベートする。特定の実施形態では、血清因子はＡｐｏＥである。特定の実施形態では、血清因子はＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４から選ばれる。さらなる実施形態では、ＡｐｏＥはヒト組換えタンパク質などの組換えタンパク質である。ＡｐｏＥはヒト組換えＡｐｏＥ３であってよい。ＡｐｏＥはヒト組換えＡｐｏＥ４であってよい。
いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベーションステップ後、幹細胞、例えば、ＨＳＰＣ、または幹細胞集団、例えば、ＨＳＰＣ集団を接触させること、例えば、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベーションステップ後、ＥＳまたはｉＰＳＣの集団などの幹細胞集団を接触させること、例えば、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約１分〜約７２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約１時間〜約２４時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約４時間〜約２４時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約４時間〜約１２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約２時間〜約１２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約６時間〜約８時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約６時間〜約２４時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約６時間〜約２４時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを約４時間〜約１２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と細胞とを少なくとも約０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、または１２時間接触させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、接触ステップの後に洗浄ステップを含む。洗浄ステップは培地を含んでよい。
いくつかの実施形態では、方法はＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、方法はｇＲＮＡなどのｇＲＮＡ核酸を含む。特定の実施形態では、方法は少なくとも２つのｇＲＮＡ核酸を含む。さらなる実施形態では、方法は３つ以上のｇＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを単一のＬＮＰ組成物に製剤化する。いくつかの実施形態では、方法は、ＬＮＰ組成物に共封入されるＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのｍＲＮＡとｇＲＮＡ核酸とを含む。さらなる実施形態では、方法は、別々のＬＮＰに封入されるｍＲＮＡ及びｇＲＮＡ核酸を含む。特定の実施形態では、ｍＲＮＡを第１のＬＮＰ組成物に製剤化し、ｇＲＮＡ核酸を第２のＬＮＰ組成物に製剤化する。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＬＮＰ組成物を同時に投与する。他の実施形態では、第１及び第２のＬＮＰ組成物を逐次投与する。インビトロ法のいくつかの実施形態では、プレインキュベーションステップの前に第１及び第２のＬＮＰ組成物を合わせる。いくつかの実施形態では、第１及び第２のＬＮＰ組成物を別々にプレインキュベートする。
一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を、ｇＲＮＡを含む組成物の投与とは別に細胞または細胞集団、例えば、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団などに投与してよい。一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとｇＲＮＡとを含むＬＮＰ組成物をＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団などに、鋳型核酸の投与とは別に細胞に投与してよい。一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物をＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団などに投与し、その後、ｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を逐次投与してから、細胞または集団に鋳型を投与してよい。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を投与してからｇＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を投与する実施形態では、投与と投与の間を約４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、もしくは７２時間、または約１日、２日、もしくは３日空けてよい。
本明細書に記載するインビトロ法のいくつかの実施形態では、幹細胞、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団は、ＬＮＰによるトランスフェクション後にインビトロで培養され得る。
いくつかの実施形態では、トランスフェクトした幹細胞、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をＨＳＰＣ用培地などの幹細胞用培地で増殖させる。細胞に関して「増殖」または「増殖する」とは、特徴的な細胞型、または複数の細胞型の数が、細胞の最初の細胞集団から増加することを指し、それらは同一であっても同一でなくてもよい。増殖に使用された最初の細胞は、その増殖で発生した細胞と同じでなくてよい。インビトロ法のいくつかの実施形態では、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団をＨＳＰＣ用培地で培養することを含む。いくつかの実施形態はさらに、幹細胞増殖因子を含むＨＳＰＣ用培地でＨＳＰＣを増殖させることを含む。例えば、幹細胞増殖用の適切な化合物に関して参照することにより本明細書に組み込まれるＷＯ２０１０／０５９４０１（例えば、実施例１の化合物）、ＷＯ２０１３／１１０１９８、及びＷＯ２０１７１１５２６８を参照のこと。「幹細胞増殖因子」とは、細胞、例えば、ＨＳＰＣ、ＨＳＣ及び／またはＨＰＣなどに、同じ細胞型で前記物質を存在させない場合より速い速度で増殖を引き起こす、例えば、数を増加させる化合物を指す。例示的な一態様では、幹細胞増殖因子は芳香族炭化水素受容体経路の阻害因子である。
さらなる実施形態では、インビトロ法はさらに、接触ステップと培養ステップとで培地を変えることを含む。さらに別の実施形態では、培養ステップは、トロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）が含まれる細胞培地を含む。実施形態では、細胞培地にはさらにヒトインターロイキン−６（ＩＬ−６）が含まれる。実施形態では、細胞培地にはトロンボポエチン（Ｔｐｏ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、及びヒト幹細胞因子（ＳＣＦ）が含まれる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴ
ＬＮＰ製剤を介して送達されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴには、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡ分子が含まれる。例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のようなタンパク質とＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子とを発現させるためのｍＲＮＡ、またはＣａｓヌクレアーゼが含まれる。Ｃａｓ９タンパク質の細胞内発現を可能にするＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどを含むＬＮＰ組成物を提供する。さらに、カーゴは、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を１つ以上含有してよい。例えば、修復用または組換え用などの鋳型核酸も組成物に含めてよく、または本明細書に記載する方法で鋳型核酸を使用してもよい。
「ｍＲＮＡ」とは、ポリペプチドに翻訳され得る（すなわち、リボソーム及びアミノアシル化ｔＲＮＡによる翻訳のための基質として使用され得る）オープンリーディングフレームを含む、ＤＮＡではないポリヌクレオチドを指す。ｍＲＮＡは、リボース残基またはその類似体、例えば、２’−メトキシリボース残基など、リン酸塩−糖骨格を含むことができる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡリン酸塩−糖骨格の糖は本質的にリボース残基、２’−メトキシリボース残基、またはその組み合わせからなる。一般に、ｍＲＮＡは実質的な量のチミジン残基を含有しない（例えば、チミジン残基が０であるかまたは３０、２０、１０、５、４、３、もしくは２より少ない、あるいはチミジン含量が１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、０．５％未満、０．２％未満、または０．１％未満である）。ｍＲＮＡは、そのウリジンの位置のうち一部または全部において修飾ウリジンを含有することができる。
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系
開示製剤の成分の一つは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子、例えば、ＣａｓヌクレアーゼなどをコードするｍＲＮＡである。
本明細書で使用する場合、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子」とは、ＲＮＡ及びＤＮＡ結合活性を有するポリペプチドもしくはポリペプチドの複合体、またはそのような複合体のＤＮＡ結合サブユニットを意味し、ここで、ＤＮＡ結合活性は配列特異的であり、ＲＮＡの配列に依存する。例示的なＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子としては、Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びその不活性型（「ｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質」）が挙げられる。本明細書で使用する場合、「Ｃａｓヌクレアーゼ」には、Ｃａｓクリベース、Ｃａｓニッカーゼ、及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質が包含される。Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ及びｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍ複合体またはＣｍｒ複合体、そのサブユニットのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、またはＣｍｒ２、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓｃａｄｅ複合体、そのサブユニットのＣａｓ３、及びクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが挙げられる。本明細書で使用する場合、「クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ」は、ＲＮＡ誘導型のＤＮＡ結合活性のある一本鎖ポリペプチドである。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼには、ＲＮＡ誘導によるＤＮＡクリベース活性またはニッカーゼ活性をさらに有するクラス２Ｃａｓクリベース／ニッカーゼ（例えば、Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ、またはＮ８６３Ａという変異型）、及びクリベース／ニッカーゼ活性が不活性化されているクラス２ ｄＣａｓ ＤＮＡ結合物質が含まれる。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２ｃ３、ＨＦ Ｃａｓ９というタンパク質（例えば、Ｎ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｑ９２６Ａという変異型）、ＨｙｐａＣａｓ９タンパク質（例えば、Ｎ６９２Ａ、Ｍ６９４Ａ、Ｑ６９５Ａ、Ｈ６９８Ａという変異型）、ｅＳＰＣａｓ９（１．０）タンパク質（例えば、Ｋ８１０Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａという変異型）、及びｅＳＰＣａｓ９（１．１）タンパク質（例えば、Ｋ８４８Ａ、Ｋ１００３Ａ、Ｒ１０６０Ａという変異型）、及びその改変体が挙げられる。Ｃｐｆ１タンパク質（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１６３：１−１３（２０１５））はＣａｓ９に相同であり、ＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインを含有する。ＺｅｔｓｃｈｅのＣｐｆ１配列は、参照によりその全体が組み込まれる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅの表Ｓ１及び表Ｓ３を参照のこと。例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３（１１）：７２２−３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５−３９７（２０１５）を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はクラス２Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はクリベース活性を有し、これは二本鎖エンドヌクレアーゼ活性とも呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ（これは、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型のＣａｓヌクレアーゼであってよい）などのＣａｓヌクレアーゼを含む。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼとしては、例えば、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、及びＣ２ｃ３タンパク質及びその改変体が挙げられる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼの例としては、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、及び他の原核生物（例えば、次段落の一覧を参照のこと）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のもの、ならびにその改変型（例えば、工学的に操作されたもの、または変異体）が挙げられる。例えば、ＵＳ２０１６／０３１２１９８ Ａ１、ＵＳ２０１６／０３１２１９９ Ａ１を参照のこと。Ｃａｓヌクレアーゼの他の例としては、ＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣｓｍ複合体もしくはＣｍｒ複合体またはそのサブユニットのＣａｓ１０、Ｃｓｍ１、もしくはＣｍｒ２、及びＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のＣａｓｃａｄｅ複合体、またはそのサブユニットのＣａｓ３が挙げられる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＩＩＡ型、ＩＩＢ型、またはＩＩＣ型の系のものであってよい。さまざまなＣＲＩＳＰＲ系及びＣａｓヌクレアーゼの考察については、例えば、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：４６７−４７７（２０１１）、Ｍａｋａｒｏｖａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１３：７２２−３６（２０１５）、Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，６０：３８５−３９７（２０１５）を参照のこと。
Ｃａｓヌクレアーゼが由来し得る非限定的な例示的種としては、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｎｎｏｃｕａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｇａｓｓｅｒｉ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ、Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｆｉｂｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｒｕｂｒｕｍ、Ｎｏｃａｒｄｉｏｐｓｉｓ ｄａｓｓｏｎｖｉｌｌｅｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｖｉｒｉｄｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｓｐｏｒａｎｇｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｓｅｕｄｏｍｙｃｏｉｄｅｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｅｌｅｎｉｔｉｒｅｄｕｃｅｎｓ、Ｅｘｉｇｕｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｂｉｒｉｃｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｂｕｃｈｎｅｒｉ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、Ｍｉｃｒｏｓｃｉｌｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｎａｐｈｔｈａｌｅｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｐｏｌａｒｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｃｒｏｃｏｓｐｈａｅｒａ ｗａｔｓｏｎｉｉ、Ｃｙａｎｏｔｈｅｃｅ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ａｃｅｔｏｈａｌｏｂｉｕｍ ａｒａｂａｔｉｃｕｍ、Ａｍｍｏｎｉｆｅｘ ｄｅｇｅｎｓｉｉ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｂｅｃｓｃｉｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｄｅｓｕｌｆｏｒｕｄｉｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉ
ｌｅ、Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ ｍａｇｎａ、Ｎａｔｒａｎａｅｒｏｂｉｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｐｅｌｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ ｔｈｅｒｍｏｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃａｌｄｕｓ、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ、Ａｌｌｏｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ ｖｉｎｏｓｕｍ、Ｍａｒｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｈａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｎｉｔｒｏｓｏｃｏｃｃｕｓ ｗａｔｓｏｎｉ、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａ
ｓ ｈａｌｏｐｌａｎｋｔｉｓ、Ｋｔｅｄｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｒａｃｅｍｉｆｅｒ、Ｍｅｔｈａｎｏｈａｌｏｂｉｕｍ ｅｖｅｓｔｉｇａｔｕｍ、Ａｎａｂａｅｎａ ｖａｒｉ
ａｂｉｌｉｓ、Ｎｏｄｕｌａｒｉａ ｓｐｕｍｉｇｅｎａ、Ｎｏｓｔｏｃ ｓｐ．、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｍａｘｉｍａ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｐｌａｔｅｎｓｉｓ、Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ ｓｐ．、Ｌｙｎｇｂｙａ ｓｐ．、Ｍｉｃｒｏｃｏｌｅｕｓ ｃｈｔｈｏｎｏｐｌａｓｔｅｓ、Ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｉａ ｓｐ．、Ｐｅｔｒｏｔｏｇａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６、及びＡｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ ｍａｒｉｎａが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＮｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＮＤ２００６由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。さらなる実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＦｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ、Ｐｅｒｅｇｒｉｎｉｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｐａｒｃｕｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｓｍｉｔｈｅｌｌａ、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｍｅｔｈａｎｏｐｌａｓｍａ ｔｅｒｍｉｔｕｍ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｌｉｇｅｎｓ、Ｍｏｒａｘｅｌｌａ ｂｏｖｏｃｕｌｉ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｉｎａｄａｉ、Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ、Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ ｄｉｓｉｅｎｓ、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ ｍａｃａｃａｅ由来のＣｐｆ１ヌクレアーゼである。特定の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＡｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓまたはＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅに由来するＣｐｆ１ヌクレアーゼである。
野生型Ｃａｓ９はＲｕｖＣ及びＨＮＨという２つのヌクレアーゼドメインを有する。ＲｕｖＣドメインは非標的ＤＮＡ鎖を切断し、ＨＮＨドメインは標的ＤＮＡ鎖を切断する。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、２つ以上のＲｕｖＣドメイン及び／または２つ以上のＨＮＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは野生型Ｃａｓ９である。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡに二本鎖切断を誘導することができる。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ｄｓＤＮＡを切断するか、ｄｓＤＮＡの１本鎖を切断するか、またはＤＮＡのクリベース活性もニッカーゼ活性も持たない場合がある。例示的なＣａｓ９アミノ酸配列を配列番号３として記載する。開始コドン及び終止コドンを含む、例示的なＣａｓ９ ｍＲＮＡ ＯＲＦ配列を配列番号４として記載する。融合タンパク質に含めるのに好適な例示的Ｃａｓ９ ｍＲＮＡコード配列を配列番号１０として記載する。
いくつかの実施形態では、キメラＣａｓヌクレアーゼを使用し、その場合、かかるタンパク質の１つのドメインまたは領域は、異なるタンパク質の一部で置換される。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼドメインを、Ｆｏｋ１などの異なるヌクレアーゼに由来するドメインで置き換えてよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは修飾ヌクレアーゼであってよい。
他の実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来してよい。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、Ｉ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のＣａｓｃａｄｅ複合体の成分であってよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ３タンパク質であってよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来してよい。いくつかの実施形態では、ＣａｓヌクレアーゼはＲＮＡ切断活性を有してよい。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は一本鎖ニッカーゼ活性を有し、すなわち、一本のＤＮＡ鎖を切断して、「ニック」としても知られる一本鎖の切れ目を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はＣａｓニッカーゼを含む。ニッカーゼは、ｄｓＤＮＡにニックをつくる、すなわち、ＤＮＡ二重らせんの１本の鎖を切断するが、もう１本の鎖は切断しない酵素である。いくつかの実施形態では、ＣａｓニッカーゼはＣａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の変形の１種であり、例えば、触媒ドメイン内の１つ以上の変化（例えば、点変異）によって、エンドヌクレアーゼによる分解活性部位が不活性化されている。Ｃａｓニッカーゼ及び例示的な触媒ドメイン改変に関する考察については、例えば、米国特許第８，８８９，３５６号を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼなどのＣａｓニッカーゼは不活性化されたＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインを有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、機能するヌクレアーゼドメインを１つのみ含有するよう修飾される。例えば、因子のタンパク質は、ヌクレアーゼドメインの１つを変異させるかまたは完全もしくは部分的に欠失させてその核酸切断活性を低下させるよう修飾されてよい。いくつかの実施形態では、活性を低下させたＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、不活性なＲｕｖＣドメインを有するニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、活性を低下させたＨＮＨドメインを有するニッカーゼを使用する。いくつかの実施形態では、不活性なＨＮＨドメインを有するニッカーゼを使用する。
いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質ヌクレアーゼドメイン内の保存されたアミノ酸を置換してヌクレアーゼ活性を低下または変化させる。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでよい。ＲｕｖＣまたはＲｕｖＣ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ１０Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ Ｏｃｔ ２２：１６３（３）：７５９−７７１を参照のこと。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼは、ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにアミノ酸置換を含んでよい。ＨＮＨまたはＨＮＨ様ヌクレアーゼドメインにおける例示的なアミノ酸置換としては、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８６３Ａ、Ｈ９８３Ａ、及びＤ９８６Ａ（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９タンパク質に基づく）が挙げられる。例えば、Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ．（２０１５）を参照のこと。さらなる例示的なアミノ酸置換としては、Ｄ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、及びＤ１２５５Ａ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ Ｕ１１２ Ｃｐｆ１（ＦｎＣｐｆ１）配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２（ＣＰＦ１＿ＦＲＡＴＮ）に基づく）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、ニッカーゼをコードするｍＲＮＡは、標的配列のセンス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれに相補的な一対のガイドＲＮＡと組み合わせて提供される。この実施形態では、ガイドＲＮＡはニッカーゼを標的配列へと導き、標的配列の反対鎖にニックを生じさせることによりＤＳＢを導入する（すなわち、ダブルニッキング）。いくつかの実施形態では、ダブルニッキングの使用により特異性が改善され、オフターゲット作用が低減され得る。いくつかの実施形態では、ニッカーゼを、対抗するＤＮＡ鎖を標的にする２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用して、標的ＤＮＡにダブルニックを作製する。いくつかの実施形態では、ニッカーゼを、近接するよう選択された２つの別々のガイドＲＮＡと共に使用して、標的ＤＮＡにダブルニックを作製する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子にはクリベース活性及びニッカーゼ活性がない。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子はｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。ｄＣａｓポリペプチドはＤＮＡ結合活性を有するが、本質的に触媒（クリベース／ニッカーゼ）活性がない。いくつかの実施形態では、ｄＣａｓポリペプチドはｄＣａｓ９ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、クリベース活性及びニッカーゼ活性がないＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子またはｄＣａｓ ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、上述のＣａｓヌクレアーゼ）の変形の１種であり、例えば、その触媒ドメイン内の１つ以上の変化（例えば、点変異）によってそのエンドヌクレアーゼによる分解活性部位が不活性化されている。例えば、ＵＳ２０１４／０１８６９５８Ａ１、ＵＳ２０１５／０１６６９８０Ａ１を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、１つ以上の異種機能ドメイン（例えば、融合ポリペプチドであるかまたはそれを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、細胞の核内へのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の輸送を容易にし得る。例えば、異種機能ドメインは核局在化シグナル（ＮＬＳ）であってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を１〜１０のＮＬＳ（複数可）と融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を１〜５のＮＬＳ（複数可）と融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を１つのＮＬＳと融合させてよい。１つのＮＬＳを使用する場合、かかるＮＬＳを、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子配列のＮ末端またはＣ末端にて連結させてよい。かかる１つのＮＬＳを、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子配列の内部に挿入してもよい。他の実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つ以上のＮＬＳと融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つ、３つ、４つ、または５つのＮＬＳと融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つのＮＬＳと融合させてよい。特定の状況では、２つのＮＬＳは同一であっても（例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳが２つ）異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を、２つのＳＶ４０ ＮＬＳ配列とカルボキシ末端で連結して融合させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を２つのＮＬＳと融合させて、その際、１つはＮ末端で連結し、１つはＣ末端で連結してよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を３つのＮＬＳと融合させてよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をＮＬＳと融合させなくてよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、例えば、ＳＶ４０ ＮＬＳであるＰＫＫＫＲＫＶまたはＰＫＫＫＲＲＶのような一分（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）配列であってよい。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、ヌクレオプラスミンのＮＬＳであるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫのような二分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）配列であってよい。特定の実施形態では、単一のＰＫＫＫＲＫＶ ＮＬＳをＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子のＣ末端で連結させてよい。任意選択で１つ以上のリンカーが融合部位において含まれる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の細胞内半減期を改変する能力があってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の半減期を延長させる能力があってよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の半減期は短縮されてよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の安定性を増大させる能力があってよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子の安定性を低下させる能力があってよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、タンパク質分解のシグナルペプチドとして作用してよい。いくつかの実施形態では、タンパク質分解は、例えば、プロテアソーム、リソソームのプロテアーゼ、またはカルパインプロテアーゼなどのタンパク質分解酵素によって媒介されてよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインはＰＥＳＴ配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は、ユビキチンまたはポリユビキチン鎖の付加によって修飾されてよい。いくつかの実施形態では、ユビキチンはユビキチン様タンパク質（ＵＢＬ）であってよい。ユビキチン様タンパク質の非限定的な例としては、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン交差反応性タンパク質（ＵＣＲＰ；インターフェロン誘導性遺伝子１５（ＩＳＧ１５）としても知られる）、ユビキチン関連修飾因子１（ＵＲＭ１）、神経前駆細胞発現し発生段階で下方制御されたタンパク質８（ＮＥＤＤ８；Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅではＲｕｂ１とも呼ばれる）、ヒト白血球抗原Ｆ関連（ＦＡＴ１０）、オートファジー８（ＡＴＧ８）及びオートファジー１２（ＡＴＧ１２）、Ｆａｕユビキチン様タンパク質（ＦＵＢ１）、膜アンカー型ＵＢＬ（ＭＵＢ）、ユビキチンフォールド修飾因子１（ＵＦＭ１）、及びユビキチン様タンパク質５（ＵＢＬ５）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、異種機能ドメインはマーカードメインであってよい。マーカードメインの非限定的な例としては、蛍光タンパク質、精製タグ、エピトープタグ、及びレポーター遺伝子配列が挙げられる。いくつかの実施形態では、マーカードメインは蛍光タンパク質であってよい。適切な蛍光タンパク質の非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、タグＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｓｆＧＦＰ、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、単量体Ａｚａｍｉ Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ１）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ１、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、Ｊｒｅｄ）、及びオレンジ色蛍光タンパク質（ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、単量体Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ）または他の適切な任意の蛍光タンパク質が挙げられる。他の実施形態では、マーカードメインは精製タグ及び／またはエピトープタグであってよい。非限定的な例示的タグとしては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティー精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ−Ｇ、６ｘＨｉｓ、８ｘＨｉｓ、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質（ＢＣＣＰ）、ポリ−Ｈｉｓ、及びカルモジュリンが挙げられる。非限定的な例示的レポーター遺伝子としては、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、または蛍光タンパク質が挙げられる。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子を、特定の細胞小器官、細胞型、組織、または臓器に指向させてよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をミトコンドリアに指向させてよい。
さらなる実施形態では、異種機能ドメインはエフェクタードメインであってよい。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をその標的配列へ配向させる場合、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをｇＲＮＡによって標的配列へ配向させる場合、エフェクタードメインは標的配列を修飾するかまたはそれに影響を与えてよい。いくつかの実施形態では、エフェクタードメインは、核酸結合ドメイン、ヌクレアーゼドメイン（例えば、非Ｃａｓヌクレアーゼドメイン）、エピジェネティック修飾ドメイン、転写活性化ドメイン、または転写抑制因子ドメインから選んでよい。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインはＦｏｋＩヌクレアーゼなどのヌクレアーゼである。例えば、米国特許第９，０２３，６４９号を参照のこと。いくつかの実施形態では、異種機能ドメインは転写活性化因子または転写抑制因子である。例えば、Ｑｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ １５２：１１７３−８３（２０１３）、Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｇｅｎｅ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １０：９７３−６（２０１３）、Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ．，“ＣＡＳ９ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｃｔｉｖａｔｏｒｓｆｏｒｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｎｄ ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋａｓｅｓ ｆｏｒ ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３１：８３３−８（２０１３）、Ｇｉｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｄｕｌａｒ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｉｎ ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，”Ｃｅｌｌ １５４：４４２−５１（２０１３）を参照のこと。したがって、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子は本質的に、ガイドＲＮＡを使用して所望の標的配列と結合させるために配向可能な転写因子になる。特定の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは脱メチル化ドメインまたはメチルトランスフェラーゼドメインなどのメチル化ドメインである。特定の実施形態では、エフェクタードメインは塩基編集ドメインなどのＤＮＡ修飾ドメインである。特定の実施形態では、ＤＮＡ修飾ドメインは、デアミナーゼドメインなど、ＤＮＡ内に特定の修飾を導入する核酸編集ドメインである。例えば、ＷＯ２０１５／０８９４０６、ＵＳ２０１６／０３０４８４６を参照のこと。ＷＯ２０１５／０８９４０６及びＵ．Ｓ．２０１６／０３０４８４６に記載の核酸編集ドメイン、デアミナーゼドメイン、及びＣａｓ９変異型は参照により本明細書に組み込まれる。
ヌクレアーゼは、ガイドＲＮＡ（「ｇＲＮＡ」）と相互作用する少なくとも１つのドメインを含んでよい。さらに、ヌクレアーゼをｇＲＮＡによって標的配列に配向させてよい。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ系では、ｇＲＮＡはヌクレアーゼ及び標的配列と相互作用し、それにより標的配列への結合が導かれるようにする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは目標とする切断に対する特異性を提供する一方、ヌクレアーゼは汎用性があってよく、異なるｇＲＮＡと対形成して異なる標的配列を切断し得る。クラス２Ｃａｓヌクレアーゼは、上掲の型、オルソログ、及び例示的種のｇＲＮＡ足場構造と対形成してよい。
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）
本開示のいくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤のカーゴには少なくとも１つのｇＲＮＡが含まれる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを標的核酸分子上の標的配列に誘導してよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼと結合して、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼによる切断の特異性を提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとＣａｓヌクレアーゼはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体のようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体などを形成してよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体であってよい。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体はＣｐｆ１／ガイドＲＮＡ複合体などのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体であってよい。Ｃａｓヌクレアーゼと特異的ｇＲＮＡとを対形成させてよい。各クラス２Ｃａｓヌクレアーゼと対形成するｇＲＮＡ足場構造は個々のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系によって異なる。
「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、及び単に「ガイド」は本明細書では同じ意味で使用され、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡとしても知られる）、またはｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡの組み合わせ（ｔｒａｃｒＲＮＡとしても知られる）のいずれも指す。ｃｒＲＮＡとｔｒＲＮＡは、単一ＲＮＡ分子として会合していても（単一ガイドＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）、または２つの別々のＲＮＡ分子（デュアルガイドＲＮＡ、ｄｇＲＮＡ）であってもよい。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」とはそれぞれの型を指す。ｔｒＲＮＡは、天然に生じる配列、または天然に生じる配列と比較して修飾または変形を有するｔｒＲＮＡ配列のいずれであってもよい。
本明細書で使用する場合、「ガイド配列」とは、ガイドＲＮＡ内にある配列であって、標的配列に相補的であり、かつ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子が結合または修飾（例えば、切断）を行うためにガイドＲＮＡを標的配列へと導くよう機能する配列を指す。「ガイド配列」は、「指向性配列」または「スペーサー配列」とも呼ばれ得る。ガイド配列は、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ（すなわち、Ｓｐｙ Ｃａｓ９）及び関連Ｃａｓ９相同体／オルソログの場合、長さが２０塩基対であり得る。それより短いかまたは長い配列、例えば、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、または２５ヌクレオチド長の配列をガイドとして使用することができる。いくつかの実施形態では、標的配列は、例えば、遺伝子内または染色体上にあり、ガイド配列に相補的である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列の間の相補性または同一性の程度は約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域は１００％相補的であっても同一であってもよい。他の実施形態では、ガイド配列と標的領域には少なくとも１つのミスマッチが含有されてよい。例えば、ガイド配列と標的配列には、１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチが含有されてよく、その場合、標的配列の全長は少なくとも１７塩基対、１８塩基対、１９塩基対、２０塩基対、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域には１〜４つのミスマッチが含有されてよく、その場合、ガイド配列は少なくとも１７個、１８個、１９個、２０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ガイド配列と標的領域には１つ、２つ、３つ、または４つのミスマッチが含有されてよく、その場合、ガイド配列は２０個のヌクレオチドを含む。
Ｃａｓタンパク質のための基質となる核酸は二本鎖核酸であるため、Ｃａｓタンパク質の標的配列にはゲノムＤＮＡのプラス鎖とマイナス鎖の両方（すなわち、所与の配列と、かかる配列の逆相補鎖）が含まれる。したがって、ガイド配列が「標的配列に相補的である」という場合は、かかるガイド配列がガイドＲＮＡを導いて標的配列の逆相補鎖に結合させ得ることを理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、ガイド配列が標的配列の逆相補鎖と結合する場合、かかるガイド配列は、ガイド配列のＴがＵで置換される以外は標的配列（例えば、ＰＡＭを含まない標的配列）の特定のヌクレオチドと同一である。
指向性配列の長さは使用するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系及び成分によって異なってよい。例えば、異なる細菌種に由来する異なるクラス２Ｃａｓヌクレアーゼでは最適な指向性配列長がさまざまである。したがって、指向性配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超のヌクレオチド長を含んでよい。いくつかの実施形態では、指向性配列長は、天然に生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のガイド配列よりも０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、または５ヌクレオチド長いかまたは短い。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡ足場は同じＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に由来する。いくつかの実施形態では、指向性配列は１８〜２４個のヌクレオチドを含むかまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、指向性配列は１９〜２１個のヌクレオチドを含むかまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、指向性配列は２０個のヌクレオチドを含むかまたはそれからなってよい。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質によるＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃａｓ９ ｓｇＲＮＡ」である。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質によるＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介することができる「Ｃｐｆ１ ｓｇＲＮＡ」である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との活性複合体を形成してＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介するのに十分な、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡは、Ｃｐｆ１タンパク質との活性複合体を形成してＲＮＡ誘導性ＤＮＡ切断を媒介するのに十分なｃｒＲＮＡを含む。Ｚｅｔｓｃｈｅ ２０１５を参照のこと。
本発明の特定の実施形態はまた、本明細書に記載のｇＲＮＡをコードする核酸、例えば、発現カセットも提供する。「ガイドＲＮＡ核酸」は、本明細書で使用する場合、ガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｄｇＲＮＡ）、及び１つ以上のガイドＲＮＡをコードする核酸であるガイドＲＮＡ発現カセットを指す。
いくつかの実施形態では、核酸はＤＮＡ分子であってよい。いくつかの実施形態では、核酸は、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、天然に生じるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系由来の繰り返し配列の全部または一部が隣接する指向性配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、ｔｒａｃｒＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、２つの別々の核酸によってコードされてよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは単一核酸によってコードされてよい。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは単一核酸の反対鎖によってコードされてよい。他の実施形態では、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは単一核酸の同一鎖によってコードされてよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はＣａｓ９ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸はＣｐｆ１ヌクレアーゼｓｇＲＮＡをコードする。
ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの転写性または調節性の制御配列、例えば、プロモーター、３’ＵＴＲ、または５’ＵＴＲなどに機能的に連結されてよい。一例では、プロモーターは、ｔＲＮＡプロモーター、例えば、ｔＲＮＡＬｙｓ３、またはｔＲＮＡキメラであってよい。Ｍｅｆｆｅｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ．２０１５ ２１：１６８３−９、Ｓｃｈｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２００７ ３５：２６２０−２６２８を参照のこと。特定の実施形態では、プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されてよい。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの非限定的な例としてはＵ６プロモーター及びＨ１プロモーターも挙げられる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、マウスまたはヒトのＵ６プロモーターに機能的に連結されてよい。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸は修飾核酸である。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドが含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、５’末端修飾、例えば、核酸を安定させ、かつ、核酸の組み込みを妨げる修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドなどが含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸は、各鎖に５’末端修飾を有する二本鎖ＤＮＡを含む。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、逆位ジデオキシ−Ｔまたは逆位脱塩基ヌクレオシドもしくはヌクレオチドが５’末端修飾として含まれる。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡ核酸には、ビオチン、デスチオビオテン−ＴＥＧ、ジゴキシゲニン、ならびに蛍光マーカー、例えば、ＦＡＭ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、及びＡｌｅｘａＦｌｕｏｒなどといった標識が含まれる。
特定の実施形態では、２つ以上のｇＲＮＡ核酸、例えば、ｇＲＮＡなどをＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系と共に使用することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系により２つ以上の標的配列が切断されるよう、ｇＲＮＡ核酸ごとに異なる指向性配列を含有してよい。いくつかの実施形態では、１つ以上のｇＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ複合体内で特性、例えば、活性または安定性などが同一であっても異なっていてもよい。２つ以上のｇＲＮＡを使用する場合、それぞれのｇＲＮＡは同一ｇＲＮＡ核酸上または異なるｇＲＮＡ核酸上のいずれでもコードされ得る。２つ以上のｇＲＮＡの発現誘導に使用するプロモーターは同一であっても異なっていてもよい。
修飾ＲＮＡ
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は修飾ＲＮＡを含む。
修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、ＲＮＡ、例えば、ｇＲＮＡまたはｍＲＮＡなどに存在し得る。例えば、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡまたはｍＲＮＡは「修飾」ＲＮＡと呼ばれ、標準残基Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵの代わりまたは追加で使用される、天然に生じない成分もしくは構成及び／または天然に生じる成分もしくは構成が１つ以上存在することを表す。いくつかの実施形態では、修飾ＲＮＡは、本明細書で「修飾」と呼ばれる非標準ヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成される。
修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドには、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合におけるリン酸基の非連結酸素のうちの一方もしくは両方及び／またはリン酸基の連結酸素のうち１つ以上の変化、例えば、置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’位のヒドロキシルなどの変化、例えば、置換（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーでのリン酸部分の大幅な置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準核酸塩基を用いる場合が含まれる、天然に生じる核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース−リン酸骨格の置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基を除去、修飾もしくは置換するか、または部分、キャップもしくリンカーを結合させる修飾（そのような３’または５’のキャップ修飾は糖修飾及び／または骨格修飾を含んでよい）、及び（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）のうち１つ以上が含まれ得る。特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する５’末端修飾を含む。特定の実施形態は、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または核酸に対する３’末端修飾を含む。修飾ＲＮＡは、５’末端及び３’末端の修飾を含有し得る。修飾ＲＮＡは、末端ではない位置に１つ以上の修飾残基を含有し得る。特定の実施形態では、ｇＲＮＡには少なくとも１つの修飾残基が含まれる。特定の実施形態では、ｍＲＮＡには少なくとも１つの修飾残基が含まれる。
本明細書で使用する場合、第１の配列と第２の配列のアラインメントにより、第１の配列が、第２の配列全体の位置のＸ％以上と一致することが示される場合、第１の配列は、第２の配列「に対する同一性が少なくともＸ％である配列を含む」とみなされる。例えば、配列ＡＡＧＡは、配列ＡＡＧに対する同一性が１００％の配列を含むが、これは、アラインメントにより、第２の配列の３つの位置すべてに対して一致が見られる１００％という同一性が示されると考えられるためである。関連するヌクレオチド（チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンなど）が同一の補体を有する限り（例えば、チミジン、ウリジン、または修飾ウリジンのいずれについてもアデノシンであり、別の例では、シトシン及び５−メチルシトシンはいずれもグアノシンまたは修飾グアノシンを補体として有する）、ＲＮＡとＤＮＡの違い（一般に、ウリジンをチミジンに交換、またはその逆）及び修飾ウリジンなどのヌクレオシド類似体の存在は、ポリヌクレオチド間の同一性または相補性の違いに寄与しない。したがって、例えば、Ｘが任意の修飾ウリジン、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、または５−メトキシウリジンなどである５’−ＡＸＧという配列はＡＵＧと１００％同一であるとみなされ、両配列とも同じ配列（５’−ＣＡＵ）に対して完全に相補的である。例示的なアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ及びＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムであり、これらは当該技術分野で周知である。当業者は、所与の整列させるべき配列対にどのアルゴリズム及びパラメータ設定を選択するのが適切であるかを理解するが、概して長さが同様で、期待されるアミノ酸同一性が５０％超またはヌクレオチド同一性が７５％超という配列の場合、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋウェブサーバーにてＥＢＩより提供されているＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムインターフェースのデフォルト設定で用いるのが一般に適切である。
ｍＲＮＡ
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する組成物または製剤は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、例えば、本明細書に記載するＣａｓヌクレアーゼまたはクラス２ＣａｓヌクレアーゼのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦなどを含むｍＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼまたはクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡを提供するか、使用するか、または投与する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦは、「修飾ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子ＯＲＦ」または単に「修飾ＯＲＦ」であり、ＯＲＦが、以下の方法のうち１つ以上の方法で修飾されることを示す簡略表現として使用される：（１）修飾ＯＲＦはウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、かかる最小ウリジン含量の１５０％までの範囲である、（２）修飾ＯＲＦはウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、かかる最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％までの範囲である、（３）修飾ＯＲＦは、配列番号１、４、１０、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％である、（４）修飾ＯＲＦは、コドンの少なくとも７５％が所与のアミノ酸についての最小ウリジンコドン（複数可）、例えば、ウリジンが最も少ないコドン（複数可）（最小ウリジンコドンは、ウリジンを２つ有するフェニルアラニンのコドンを除いては、通常０または１つである）である、１セットのコドンからなる、または（５）修飾ＯＲＦは少なくとも１つの修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは、上述の方法のうち少なくとも２つ、３つ、または４つの方法で修飾される。いくつかの実施形態では、修飾ＯＲＦは少なくとも１つの修飾ウリジンを含み、上記（１）〜（４）のうち少なくとも１つ、２つ、３つ、またはすべての方法で修飾される。
本明細書では「修飾ウリジン」は、水素結合受容体がウリジンの場合と同じであり、かつ、ウリジンとの構造上の違いが１つ以上ある、チミジン以外のヌクレオシドを指すために使用される。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換ウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メトキシなどのアルコキシ）がプロトンに取って代わるウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換プソイドウリジン、すなわち、１つ以上の非プロトン置換基（例えば、メチルなどのアルキル）がプロトンに取って代わるプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、置換ウリジン、プソイドウリジン、または置換プソイドウリジンのいずれかである。
本明細書で使用する「ウリジン位置」とは、ポリヌクレオチドにおいてウリジンまたは修飾ウリジンが占めている位置を指す。したがって、例えば、「ウリジン位置の１００％が修飾ウリジン」であるポリヌクレオチドは、それと同じ配列の従来のＲＮＡ（この場合、塩基はいずれも標準塩基のＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧである）ではウリジンであるはずのどの位置においても修飾ウリジンを含有する。特に明記しない限り、本開示内または本開示に添付の配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｂｌｅ）もしくは配列表（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ）に記載のポリヌクレオチド配列におけるＵはウリジンまたは修飾ウリジンであり得る。
Figure 2020537541
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、コドンのうち少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％が最小ウリジンコドンの表に記載のコドンである、１セットのコドンで構成されてよい。上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、配列番号１、４、１０、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％である配列を含んでよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、ウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、かかる最小ウリジン含量の１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％までの範囲であってよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、ウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、かかる最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％、１４５％、１４０％、１３５％、１３０％、１２５％、１２０％、１１５％、１１０％、１０５％、１０４％、１０３％、１０２％、または１０１％までの範囲であってよい。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦはウリジン位置の少なくとも１つ、複数、またはすべてにおいて修飾ウリジンを含んでよい。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５位において、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルなどで修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、１位において、例えば、ハロゲン、メチル、またはエチルなどで修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、５−メトキシウリジン、５−ヨードウリジン、またはその組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５−ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１−メチル−プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１−メチルプソイドウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５−ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は修飾ウリジン、例えば、５−メトキシウリジン、５−ヨードウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、プソイドウリジン、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％はプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％はＮ１−メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−メトキシウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１−メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｍＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−ヨードウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１−メチルプソイドウリジンである。
上述の実施形態のいずれにおいても、修飾ＯＲＦは、可能な限り低いウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含量など、低いウリジンジヌクレオチド含量を含んでよく、例えば、（ａ）どの位置にも最小ウリジンコドン（上述）を使用し、（ｂ）所与のＯＲＦと同じアミノ酸配列をコードするＯＲＦである。ウリジンジヌクレオチド（ＵＵ）含量は、ＯＲＦ内のＵＵジヌクレオチドの計数として絶対値で表すか、またはウリジンジヌクレオチドのウリジンが占めている位置の割合として比率で表すことができる（例えば、ＡＵＵＡＵの場合であれば、５つの位置のうち２つがウリジンジヌクレオチドのウリジンで占められているのでウリジンジヌクレオチド含量は４０％となる）。最小ウリジンジヌクレオチド含量を評価するために、修飾ウリジン残基はウリジンと同等であるとみなす。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、発現された哺乳類ｍＲＮＡ、例えば、構成的に発現しているｍＲＮＡなどに由来するＵＴＲを少なくとも１つ含む。ｍＲＮＡは、健常成体哺乳類の少なくとも１つの組織で継続的に転写されている場合、哺乳類で構成的に発現されているとみなされる。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、発現された哺乳類のＲＮＡ、例えば、構成的に発現された哺乳類のｍＲＮＡなどに由来する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’と３’の両ＵＴＲを含む。アクチンｍＲＮＡは構成的に発現しているｍＲＮＡの一例である。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、１７−ベータヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ４（ＨＳＤ１７Ｂ４またはＨＳＤ）由来の少なくとも１つのＵＴＲ、例えば、ＨＳＤ由来の５’ＵＴＲなどを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ヒトアルファグロビン（ＨＢＡ）ｍＲＮＡ、ヒトベータグロビン（ＨＢＢ）ｍＲＮＡ、またはアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）ベータグロビン（ＸＢＧ）ｍＲＮＡなどに由来する少なくとも１つのＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、グロビンｍＲＮＡ、例えば、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧなどに由来する５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、または５’と３’の両ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、マウスＨｂａ−ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧに由来する５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ−ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、またはＸＢＧに由来する３’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ウシ成長ホルモン、サイトメガロウイルス、マウスＨｂａ−ａ１、ＨＳＤ、アルブミン遺伝子、ＨＢＡ、ＨＢＢ、ＸＢＧ、熱ショックタンパク質９０（Ｈｓｐ９０）、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ベータ−アクチン、アルファ−チューブリン、腫瘍タンパク質（ｐ５３）、または上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に由来する５’と３’の両ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、同じ供給源、例えば、アクチン、アルブミン、またはＨＢＡ、ＨＢＢ、もしくはＸＢＧのようなグロビンな構成的に発現しているｍＲＮＡに由来する５’と３’の両ＵＴＲを含む。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’ＵＴＲを含まず、例えば、５’キャップと開始コドンの間にはさらなるヌクレオチドはない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは５’キャップと開始コドンの間にコザック配列（以下に記載）を含むが、さらなる５’ＵＴＲは何もない。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは３’ＵＴＲを含まず、例えば、終止コドンとポリＡ尾部の間にはさらなるヌクレオチドはない。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはコザック配列を含む。コザック配列は、翻訳開始及びｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの全体としての収率に影響を及ぼし得る。コザック配列には、開始コドンとして機能し得るメチオニンコドンが含まれる。最小コザック配列はＮＮＮＲＵＧＮであり、以下のうち少なくとも１つが真である、すなわち、１番目のＮはＡまたはＧであり、かつ２番目のＮはＧである。ヌクレオチド配列においては、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）を意味する。いくつかの実施形態では、コザック配列はＲＮＮＲＵＧＮ、ＮＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＲＵＧＧ、ＲＮＮＡＵＧＮ、ＮＮＮＡＵＧＧ、またはＲＮＮＡＵＧＧである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｒｃｃＲＵＧｇであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つもしくは２つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はｒｃｃＡＵＧｇであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つもしくは２つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つ、２つ、もしくは３つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃＡｃｃＡＵＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つ、２つ、３つ、もしくは４つ有する。いくつかの実施形態では、コザック配列はＧＣＣＡＣＣＡＵＧである。いくつかの実施形態では、コザック配列はｇｃｃｇｃｃＲｃｃＡＵＧＧであり、ミスマッチがゼロであるか、または小文字の位置に対するミスマッチを最高で１つ、２つ、３つ、もしくは４つ有する。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするＯＲＦを含むｍＲＮＡは、配列番号４３に対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、任意選択で、配列番号４３のＯＲＦ（すなわち、配列番号４）は代替的ＯＲＦで置換される。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは配列番号１０、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれかを含む。
いくつかの実施形態では、配列番号４３の任意選択で置換された配列に対する同一性の程度は９５％である。いくつかの実施形態では、配列番号４の任意選択で置換された配列に対する同一性の程度は９８％である。いくつかの実施形態では、配列番号４３の任意選択で置換された配列に対する同一性の程度は９９％である。いくつかの実施形態では、配列番号４３の任意選択で置換された配列に対する同一性の程度は１００％である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するｍＲＮＡは、５’キャップ、例えば、Ｃａｐ０、Ｃａｐ１、またはＣａｐ２などを含む。５’キャップは一般に、ｍＲＮＡの５’から３’方向への鎖の１番目のヌクレオチドの５’位に５’−三リン酸を介して連結されている７−メチルグアニンリボヌクレオチド（これを、以下に考察するように、例えば、ＡＲＣＡに関してさらに修飾してよい）であり、すなわち、第１のキャップ近傍ヌクレオチドである。Ｃａｐ０では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近傍ヌクレオチドのリボースはいずれも２’−ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ１では、ｍＲＮＡの第１及び第２の転写されたヌクレオチドのリボースはそれぞれ、２’−メトキシ及び２’−ヒドロキシルを含む。Ｃａｐ２では、ｍＲＮＡの第１及び第２のキャップ近傍ヌクレオチドのリボースはいずれも２’−メトキシを含む。例えば、Ｋａｔｉｂａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ １１１（３３）：１２０２５−３０、Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ ＳｃｉＵＳＡ １１４（１１）：Ｅ２１０６−Ｅ２１１５を参照のこと。ヒトｍＲＮＡなど哺乳類ｍＲＮＡを含め、高等真核生物のほとんどの内在性ｍＲＮＡはＣａｐ１またはＣａｐ２を含む。Ｃａｐ０、ならびにＣａｐ１及びＣａｐ２とは異なる他のキャップ構造は、ヒトなどの哺乳類ではＩＦＩＴ−１及びＩＦＩＴ−５などの自然免疫系の成分によって「非自己」として認識されるために免疫原性である場合があり、これによりＩ型インターフェロンを含めサイトカインレベルが上昇し得る。ＩＦＩＴ−１及びＩＦＩＴ−５などの自然免疫系の成分はまた、Ｃａｐ１またはＣａｐ２以外のキャップを有するｍＲＮＡの結合についてｅＩＦ４Ｅと競合する場合もあり、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する可能性がある。
キャップは共転写によって含めることができる。例えば、ＡＲＣＡ（アンチリバースキャップアナログ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＡＭ８０４５）は、グアニンリボヌクレオチドの５’位に連結された７−メチルグアニン３’−メトキシ−５’−三リン酸を含む、インビトロにおいて転写開始時に転写産物内に組み込まれ得るキャップアナログである。ＡＲＣＡでは、第１キャップ近傍ヌクレオチドの２’位がヒドロキシルであるＣａｐ０のキャップになる。例えば、Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，（２００１）“Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｍＲＮＡｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ ｎｏｖｅｌ ‘ａｎｔｉ−ｒｅｖｅｒｓｅ’ ｃａｐ ａｎａｌｏｇｓ ７−ｍｅｔｈｙｌ（３’−Ｏ−ｍｅｔｈｙｌ）ＧｐｐｐＧ ａｎｄ ７−ｍｅｔｈｙｌ（３’ｄｅｏｘｙ）ＧｐｐｐＧ，”ＲＮＡ ７：１４８６−１４９５を参照のこと。ＡＲＣＡの構造を以下に示す。
Figure 2020537541
ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＡ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ−７１１３）またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧ（ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）（２’ＯＭｅＧ）ｐＧ；ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓカタログ番号Ｎ−７１３３）を使用すると、共転写によってＣａｐ１構造を得ることができる。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ及びＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＧＧの３’−Ｏ−メチル化型もそれぞれＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓよりカタログ番号Ｎ−７４１３及びＮ−７４３３として入手可能である。ＣｌｅａｎＣａｐ（商標）ＡＧ構造を以下に示す。
Figure 2020537541
別法として、転写後にＲＮＡにキャップを付加することができる。例えば、ワクシニアのキャッピング酵素が市販されているが（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓカタログ番号Ｍ２０８０Ｓ）、これは、そのＤ１サブユニットにより与えられるＲＮＡトリホスファターゼ活性及びグアニリルトランスフェラーゼ活性、ならびにそのＤ１２サブユニットにより与えられるグアニンメチルトランスフェラーゼを有する。したがって、この酵素は、Ｓ−アデノシルメチオニン及びＧＴＰの存在下、Ｃａｐ０を与えるようＲＮＡに７−メチルグアニンを付加することができる。例えば、Ｇｕｏ，Ｐ．ａｎｄ Ｍｏｓｓ，Ｂ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，４０２３−４０２７、Ｍａｏ，Ｘ．ａｎｄ Ｓｈｕｍａｎ，Ｓ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，２４４７２−２４４７９を参照のこと。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡはさらにポリアデニル化（ポリＡ）尾部を含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は少なくとも２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、または１００個のアデニン、任意選択で最高３００個のアデニンを含む。いくつかの実施形態では、ポリＡ尾部は、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、または１００個のアデニンヌクレオチドを含む。いくつかの例では、ポリＡ尾部は、ポリＡ尾部内の１つ以上の位置において１個以上の非アデニンヌクレオチド「アンカー」で「中断」される。ポリＡ尾部は少なくとも８個の連続するアデニンヌクレオチドを含んでよいが、１個以上の非アデニンヌクレオチドも含む。本明細書で使用する場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない天然または非天然の任意のヌクレオチドを指す。グアニン、チミン、及びシトシンヌクレオチドは例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載するｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続するアデニンヌクレオチドを含んでよい。いくつかの例では、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続的なアデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドによりアデニンヌクレオチドが規則的または不規則に空いた間隔で中断される。
本明細書で使用する場合、「非アデニンヌクレオチド」とは、アデニンを含まない天然または非天然の任意のヌクレオチドを指す。グアニン、チミン、及びシトシンヌクレオチドは例示的な非アデニンヌクレオチドである。したがって、本明細書に記載するｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する連続するアデニンヌクレオチドを含んでよい。いくつかの例では、ｍＲＮＡのポリＡ尾部は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子または目的配列をコードするヌクレオチドの３’に位置する非連続的なアデニンヌクレオチドを含み、ここで、非アデニンヌクレオチドによりアデニンヌクレオチドが規則的または不規則に空いた間隔で中断される。
いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡを精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿など、または同等の方法、例えば、本明細書に記載の方法など）を使用してｍＲＮＡを精製する。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣを用いる方法など、クロマトグラフィーを用いる方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載の方法）を使用してｍＲＮＡを精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）及びＨＰＬＣを用いる方法の両方を使用してｍＲＮＡを精製する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示のｍＲＮＡと組み合わせて少なくとも１つのｇＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、ｍＲＮＡとは別の分子として提供される。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、本明細書に開示のｍＲＮＡの一部として、例えば、ＵＴＲの一部として提供される。
ｇＲＮＡ
ある態様では、本開示は、ゲノム編集システム（例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ系、ＴＡＬＥＮ系、メガヌクレアーゼ系またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）を細胞（または細胞の集団）、例えば、ＨＳＰＣ（またはＨＳＰＣ集団）、例えば、ＣＤ３４＋細胞（またはＣＤ３４＋細胞集団）に送達する方法を提供し、ここで、結果として得られるのは、胎児ヘモグロビンの発現が増大している（例えば、前記細胞が赤血球に分化する場合）細胞（またはその子孫）である。本明細書では、そうした効果を達成する上で有用なガイド配列を開示する。実施形態では、ゲノム編集システムは、ゲノム編集システムの成分をコードする１つ以上のベクター、例えば、ｍＲＮＡなどを含む。他の実施形態では、ゲノム編集システムは１つ以上のポリペプチドを含む。好ましい態様では、方法は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を送達することを含む。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、例えば、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）の形態に複合体化された、ｇＲＮＡ及びＣａｓヌクレアーゼを含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、ｇＲＮＡ及び／またはＣａｓヌクレアーゼをコードする１つ以上のベクターを含む。他の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、Ｃａｓヌクレアーゼ（例えば、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ）をコードする１つ以上のベクター、例えば、ｍＲＮＡと、１つ以上のｇＲＮＡとを含む。態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、参照によりその記載内容全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１１５２６８に記載のｇＲＮＡが含まれる。態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、ＢＣＬ１１ａ遺伝子またはその調節エレメント内の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２内（例えば、ＧＡＴＡ１結合部位またはその近傍の、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２領域内）の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、ｃｈ２：６０４９４０００〜ｃｈ２：６０４９８０００（ｈｇ３８に従う）の、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２領域内、例えば、ｃｈ２：６０４９４２５０〜ｃｈ２：６０４９６３００（ｈｇ３８に従う）の、ＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２領域内の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、参照により本明細書に組み込まれる２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６６，２３２号の表２に記載のガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。
ｇＲＮＡの例示的ガイド配列はＢＣＬ１１ａ遺伝子のイントロン２内の標的配列に相補的である。＋５８、＋６２及び＋５５とは、Ｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２０１３；３４２（６１５５）：２５３−２５７に記載のように、赤血球特異的エンハンサー領域のＤＮＡｓｅ高感受性部位を指す。
他の態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、１１番染色体上のグロビン遺伝子座内の標的配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。ある態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、ＨＰＦＨ領域内の配列に相補的なガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。本明細書で使用する場合、用語「ＨＰＦＨ領域」とは、修飾された場合（例えば、変異するかまたは欠失した場合）、成体赤血球にＨｂＦ高産生を引き起こすゲノム部位を指し、これには、文献（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＯｎｌｉｎｅ Ｍｅｎｄｅｌｉａｎ Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ ｉｎ Ｍａｎ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｍｉｍ．ｏｒｇ／ｅｎｔｒｙ／１４１７４９を参照のこと）において同定されているＨＰＦＨ領域が含まれる。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、染色体１１ｐ１５上のベータグロビン遺伝子クラスター内にあるかまたはそれを包含する領域である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、デルタグロビン遺伝子及びその調節エレメント内にあるかまたは少なくともその一部を包含する。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域はＨＢＧ１のプロモーター領域である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域はＨＢＧ２のプロモーター領域である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載の領域である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載の切断点欠失型フランス型ＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のアルジェリア型ＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のスリランカ型ＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のＨＰＦＨ−３である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のＨＰＦＨ−２である。一実施形態では、ＨＰＦＨ−１領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のＨＰＦＨ−３である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のスリランカ型（δβ）０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のシチリア型（δβ）０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のマケドニア型（δβ）０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４に記載のクルド人型β０−サラセミアＨＰＦＨである。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２１３８７４〜５２１４４００（ｈｇ１８）に位置する領域である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２１５９４３〜５２１５０４６（ｈｇ１８）に位置する領域である。例示的な一実施形態では、ＨＰＦＨ領域は、Ｃｈｒ１１：５２３４３９０〜５２３８４８６（ｈｇ３８）に位置する領域である。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、参照によりその記載内容全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／０７７３９４に記載の配列を含むガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、ＷＯ２０１７／０７７３９４に記載のガイド配列から選択される配列を含むガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６６，２３２号の表３に記載のガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。
例示的ガイド配列はフランス型ＨＰＦＨに配向した（Ｆｒｅｎｃｈ ＨＰＦＨ；Ｓａｎｋａｒａｎ ＶＧ ｅｔ ａｌ． Ａ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｅｌｅｍｅｎｔ ｎｅｃｅｓｓａｒｙ ｆｏｒ ｆｅｔａｌ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．ＮＥＪＭ（２０１１）３６５：８０７−８１４）。
実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系には、参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年９月２９日に出願された米国仮出願第６２／５６６，２３２号の表４に記載のガイド配列を含むｇＲＮＡが含まれる。
例示的ガイド配列をＨＢＧ１及び／またはＨＢＧ２のプロモーター領域に配向させてよい。
化学修飾ｇＲＮＡ
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡを化学的に修飾する。１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むｇＲＮＡは「修飾」ｇＲＮＡまたは「化学修飾」ｇＲＮＡと呼ばれ、標準残基Ａ、Ｇ、Ｃ、及びＵの代わりに使用されるかまたは追加で使用される天然には生じない成分もしくは構成及び／または天然に生じる成分もしくは構成が１つ以上存在することを表す。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは非標準のヌクレオシドまたはヌクレオチドを用いて合成され、これを本明細書では「修飾」と呼ぶ。修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドには、（ｉ）ホスホジエステル骨格結合におけるリン酸基の非連結酸素のうちの一方もしくは両方及び／またはリン酸基の連結酸素のうち１つ以上の変化、例えば、置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｉ）リボース糖の構成要素、例えば、リボース糖の２’位のヒドロキシルなどの変化、例えば、置換（例示的な糖修飾）、（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーでのリン酸部分の大幅な置換（例示的な骨格修飾）、（ｉｖ）非標準核酸塩基を用いる場合が含まれる、天然に生じる核酸塩基の修飾または置換（例示的な塩基修飾）、（ｖ）リボース−リン酸骨格のの置換または修飾（例示的な骨格修飾）、（ｖｉ）オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基を除去、修飾もしくは置換するか、または部分、キャップもしくリンカーを結合させる修飾（そのような３’または５’のキャップ修飾は糖修飾及び／または骨格修飾を含んでよい）、及び（ｖｉｉ）糖の修飾または置換（例示的な糖修飾）のうち１つ以上が含まれ得る。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは、一部または全部のウリジン位置において修飾ウリジンを含む。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５位において、例えば、ハロゲンまたはＣ１−Ｃ６アルコキシなどで修飾されたウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、１位において、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルなどで修飾されたプソイドウリジンである。修飾ウリジンは、例えば、プソイドウリジン、Ｎ１−メチル−プソイドウリジン、５−メトキシウリジン、５−ヨードウリジン、またはその組み合わせであり得る。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは５−ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンはＮ１−メチル−プソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、Ｎ１−メチルプソイドウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンとＮ１−メチル−プソイドウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、プソイドウリジンと５−ヨードウリジンの組み合わせである。いくつかの実施形態では、修飾ウリジンは、５−ヨードウリジンと５−メトキシウリジンの組み合わせである。
いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、または１００％は修飾ウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は修飾ウリジン、例えば、５−メトキシウリジン、５−ヨードウリジン、Ｎ１−メチルプソイドウリジン、プソイドウリジン、またはその組み合わせである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−メトキシウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％はプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％はＮ１−メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−ヨードウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−メトキシウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１−メチルプソイドウリジンである。いくつかの実施形態では、本開示によるｇＲＮＡのウリジン位置のうち１０％〜２５％、１５〜２５％、２５〜３５％、３５〜４５％、４５〜５５％、５５〜６５％、６５〜７５％、７５〜８５％、８５〜９５％、または９０〜１００％は５−ヨードウリジンであり、残りのウリジン位置はＮ１−メチルプソイドウリジンである。
上掲のような化学修飾を組み合わせて、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の修飾を有し得るヌクレオシド及びヌクレオチド（総称して「残基」と呼ぶ）を含む修飾ｇＲＮＡを得ることができる。例えば、修飾残基は修飾糖及び修飾核酸塩基を有し得る。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡのどの塩基も修飾する、例えば、塩基すべてがホスホロチオアート基などの修飾リン酸基を有する。特定の実施形態では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基の全部または実質的に全部をホスホロチオアート基で置き換える。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの５’末端またはその近傍に少なくとも１つの修飾残基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡは、ＲＮＡの３’末端またはその近傍に少なくとも１つの修飾残基を含む。
いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡは修飾残基を１つ、２つ、３つ、またはそれ以上含む。いくつかの実施形態では、修飾ｇＲＮＡの位置のうち少なくとも５％（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％）は修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドである。
非修飾核酸は、例えば、細胞内または血清中に見られるヌクレアーゼなどによって分解される傾向があり得る。例えば、ヌクレアーゼは核酸のホスホジエステル結合を加水分解することができる。したがって、一態様では、本明細書に記載するｇＲＮＡは、１つ以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含有して、例えば、細胞内または血清中のヌクレアーゼに対する安定性を導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ｇＲＮＡ分子は、インビボでもエキソビボでも細胞集団に導入した場合に低い自然免疫応答を示し得る。用語「自然免疫応答」には、一本鎖核酸などの外来性核酸に対する細胞応答が含まれ、サイトカインの発現及び放出、特にインターフェロンの放出、ならびに細胞死の誘導を行う。
骨格修飾のいくつかの実施形態では、修飾残基のリン酸基は、酸素の１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾することができる。さらに、修飾残基、例えば、修飾核酸に存在する修飾残基には、本明細書に記載する修飾リン酸基での非修飾リン酸部分の大幅な置換が含まれ得る。いくつかの実施形態では、リン酸骨格の骨格修飾には、非荷電リンカーまたは電荷分布が非対称的な荷電リンカーのいずれかをもたらす変化が含まれ得る。
修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオアート、ホスホロセレナート、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、ホスホン酸水素、ホスホロアミダート、ホスホン酸アルキルまたはホスホン酸アリール及びホスホトリエステルが挙げられる。非修飾リン酸基のリン原子はアキラルである。ただし、非架橋酸素のうちの１個を上記の原子または原子団の１つで置き換えることにより、そのリン原子をキラルにすることができる。不斉リン原子は、「Ｒ」立体配置（本明細書ではＲｐ）または「Ｓ」立体配置（本明細書ではＳｐ）のいずれも有することができる。骨格はまた、架橋酸素（すなわち、リン酸基とヌクレオシドを連結する酸素）を窒素（架橋ホスホロアミダート）、硫黄（架橋ホスホロチオアート）及び炭素（架橋メチレンホスホナート）で置き換えることによって修飾することもできる。置き換えは、連結酸素のいずれか、または連結酸素の両方において出現してよい。
特定の骨格修飾では、リン酸基をリン不含のコネクタで置き換えることができる。いくつかの実施形態では、荷電リン酸基を中性部分で置き換えることができる。リン酸基に換わることができる部分の例としては、限定することなく、例えば、メチルホスホナート、ヒドロキシルアミノ、シロキサン、カルボナート、カルボキシメチル、カルバマート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホナート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾ及びメチレンオキシメチルイミノを挙げることができる。
いくつかの実施形態では、本発明は、以下の領域、すなわち、５’末端のヌクレオチド、下部ステム領域、バルジ領域、上部ステム領域、ネクサス領域、ヘアピン１領域、ヘアピン２領域、及び３’末端のヌクレオチドのうち１つ以上の領域内で１つ以上の修飾を含むｓｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、修飾は２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾は２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾はヌクレオチド間のホスホロチオアート（ＰＳ）結合を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端の最初の３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチド、及び３’末端の最後の３ヌクレオチドまたは４ヌクレオチドを修飾する。いくつかの実施形態では、５’末端の最初の４ヌクレオチド、及び３’末端の最後の４ヌクレオチドは、ホスホロチオアート（ＰＳ）結合で連結されている。いくつかの実施形態では、修飾は２’−Ｏ−Ｍｅを含む。いくつかの実施形態では、修飾は２’−Ｆを含む。
いくつかの実施形態では、５’末端の最初の４ヌクレオチド及び３’末端の最後の４ヌクレオチドはＰＳ結合で連結され、５’末端の最初の３ヌクレオチド及び３’末端の最後の３ヌクレオチドは２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、５’末端の最初の４ヌクレオチド及び３’末端の最後の４ヌクレオチドはＰＳ結合で連結され、５’末端の最初の３ヌクレオチド及び３’末端の最後の３ヌクレオチドは２’−Ｆ修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは配列番号７４（ｍＮ＊ｍＮ＊ｍＮ＊ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ）の修飾パターンを含み、ここで、Ｎは天然または非天然の任意のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ｓｇＲＮＡは配列番号７４を含む。特定の実施形態では、ｓｇＲＮＡは、その５’末端の最初の３残基の２’Ｏ−メチル修飾を含み、ＲＮＡの残基１〜２間、残基２〜３間、及び残基３〜４間にホスホロチオアート結合を有する。
鋳型核酸
本明細書に開示する組成物及び方法には鋳型核酸が含まれ得る。鋳型を使用して、Ｃａｓヌクレアーゼの標的部位またはその近傍にて核酸配列を変化させるかまたは挿入してよい。いくつかの実施形態では、方法は、細胞に鋳型を導入することを含む。いくつかの実施形態では、単一の鋳型が提供され得る。他の実施形態では、２つ以上の標的部位にて編集が生じるよう２つ以上の鋳型が提供され得る。例えば、ある細胞の単一遺伝子、またはある細胞の２つの異なる遺伝子を編集するため、異なる鋳型が提供され得る。
いくつかの実施形態では、鋳型を相同組換えで使用してよい。いくつかの実施形態では、相同組換えにより、標的核酸分子内への鋳型配列または鋳型配列の一部の組み込みがもたらされ得る。他の実施形態では、鋳型を、核酸の切断部位でＤＮＡ鎖の侵入が起こる相同組換え修復で使用してよい。いくつかの実施形態では、相同組換え修復により、鋳型配列が、編集された標的核酸分子内に含まれるということがもたらされ得る。さらに別の実施形態では、非相同末端結合によって媒介される遺伝子編集で鋳型を使用してよい。いくつかの実施形態では、鋳型配列には、切断部位近傍の核酸配列に対する類似性は全くない。いくつかの実施形態では、鋳型または鋳型配列の一部を組み込む。いくつかの実施形態では、鋳型には、隣接する末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が含まれる。
いくつかの実施形態では、鋳型は、切断部位のそれぞれ上流及び下流に位置する配列に相補的な、第１のホモロジーアーム及び第２のホモロジーアーム（第１のヌクレオチド配列及び第２のヌクレオチド配列とも呼ばれる）を含んでよい。鋳型が２つのホモロジーアームを含有する場合、各アームは長さが同じであっても異なっていてもよく、ホモロジーアームに挟まれた配列は、ホモロジーアームに挟まれた標的配列と実質的に類似であるかもしくは同一であり得る、または全く無関係の配列であり得る。いくつかの実施形態では、鋳型上の第１のヌクレオチド配列と切断部位の上流の配列との相補性または同一性パーセントの程度、及び鋳型上の第２のヌクレオチド配列と切断部位の下流の配列との相補性または同一性パーセントの程度により、鋳型と標的核酸分子の間の相同組換え、例えば、高忠実度相同組換えなどが可能になり得る。いくつかの実施形態では、相補性の程度は約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、相補性の程度は約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、相補性の程度は少なくとも９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、相補性の程度は１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは約９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは少なくとも９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、同一性パーセントは１００％であってよい。
いくつかの実施形態では、鋳型配列は、標的細胞の内在性配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなってよい。さらに、または別法として、鋳型配列は、標的細胞の外来配列に対応するか、それを含むか、またはそれからなってよい。本明細書で使用する場合、用語「内在性配列」とは、その細胞にとって天然である配列を指す。用語「外来配列」とは、その細胞にとって天然ではない配列、またはその細胞のゲノムにおける天然での位置が別の異なる位置にある配列を指す。いくつかの実施形態では、内在性配列は細胞のゲノム配列であってよい。いくつかの実施形態では、内在性配列は染色体の配列または染色体外の配列であってよい。いくつかの実施形態では、内在性配列は細胞のプラスミド配列であってよい。いくつかの実施形態では、鋳型配列は、切断部位またはその近傍において細胞の内在性配列の一部と実質的に同一であってよいが、少なくとも１つのヌクレオチドの変化を含む。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子を鋳型で編集することにより、標的核酸分子の１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により、標的配列を含む遺伝子により発現されたタンパク質において１つ以上のアミノ酸変化がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により、標的遺伝子により発現されたＲＮＡにおいて１つ以上のヌクレオチド変化がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により、標的遺伝子の発現レベルが変化し得る。いくつかの実施形態では、変異により、標的遺伝子の発現の増大または低下がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により遺伝子ノックダウンがもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により遺伝子ノックアウトがもたらされ得る。いくつかの実施形態では、変異により遺伝子機能の回復がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、切断された標的核酸分子を鋳型で編集することにより、ＤＮＡなどの標的核酸分子エキソン配列、イントロン配列、制御配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列の変化がもたらされ得る。
他の実施形態では、鋳型配列は外来配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、外来配列は、外来性プロモーター配列に機能的に連結された、タンパク質またはＲＮＡをコードする配列を含んでよく、外来配列が標的核酸分子に組み込まれた際に、かかる組み込み配列でコードされたタンパク質またはＲＮＡを細胞が発現することができるようにしてよい。他の実施形態では、外来配列が標的核酸分子内に組み込まれた際、かかる組み込み配列の発現は内在性プロモーター配列によって制御されてよい。いくつかの実施形態では、外来配列は、タンパク質または該タンパク質の一部をコードするｃＤＮＡ配列を提供してよい。さらに別の実施形態では、外来配列は、エキソン配列、イントロン配列、制御配列、転写制御配列、翻訳制御配列、スプライシング部位、または非コード配列を含むかまたはそれからなってよい。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みにより遺伝子機能の回復がもたらされ得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みにより遺伝子ノックインがもたらされ得る。いくつかの実施形態では、外来配列の組み込みにより遺伝子ノックアウトがもたらされ得る。
鋳型は、適切な任意の長さであってよい。いくつかの実施形態では、鋳型は、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、またはそれ以上のヌクレオチド長を含んでよい。鋳型は一本鎖核酸であってよい。鋳型は二本鎖または部分的二本鎖の核酸であり得る。特定の実施形態では、一本鎖鋳型は、２０ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、または２００ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、鋳型は、標的配列（すなわち、「ホモロジーアーム」）を含む標的核酸分子の一部に相補的なヌクレオチド配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、鋳型は、標的核酸分子上の切断部位の上流または下流に位置する配列に相補的なホモロジーアームを含んでよい。
いくつかの実施形態では、鋳型は、末端逆位反復（ＩＴＲ）配列が隣接して含有されるｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡを含有する。いくつかの実施形態では、鋳型は、ベクター、プラスミド、ミニサークル、ナノサークル、またはＰＣＲ産物として提供される。
核酸の精製
いくつかの実施形態では、核酸を精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿、アルコール沈殿、または同等の方法、例えば、本明細書に記載の方法など）を使用して核酸を精製する。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣを用いる方法など、クロマトグラフィーを用いる方法または同等の方法（例えば、本明細書に記載の方法）を使用して核酸を精製する。いくつかの実施形態では、沈殿方法（例えば、ＬｉＣｌ沈殿）及びＨＰＬＣを用いる方法の両方を使用して核酸を精製する。
標的配列
いくつかの実施形態では、本開示のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を標的核酸分子上の標的配列に配向させ、切断してよい。例えば、標的配列は、Ｃａｓヌクレアーゼによって認識され、切断されてよい。特定の実施形態では、Ｃａｓヌクレアーゼの標的配列は、かかるヌクレアーゼの特異的ＰＡＭ配列の近傍に位置する。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡによって標的核酸分子の標的配列にクラス２Ｃａｓヌクレアーゼを配向させ、そこで、ｇＲＮＡは標的配列とハイブリダイズし、クラス２Ｃａｓタンパク質が標的配列を切断してよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡは、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼの特異的ＰＡＭに隣接するかまたはそれを含む標的配列とハイブリダイズし、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼはかかる標的配列を切断する。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの指向性配列に相補的であってよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの指向性配列と、それに対応する、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的配列の部分との相補性の程度は、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの指向性配列と、それに対応する、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的配列の部分との同一性パーセントは、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％であってよい。いくつかの実施形態では、標的の相同性領域は特異的ＰＡＭ配列に隣接している。いくつかの実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの指向性配列と１００％相補的な配列を含んでよい。他の実施形態では、標的配列は、ガイドＲＮＡの指向性配列と比べて少なくとも１つのミスマッチ、欠失、または挿入を含んでよい。
標的配列の長さは使用するヌクレアーゼ系によって異なってよい。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系用のガイドＲＮＡの指向性配列は、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、または５０超のヌクレオチド長を含んでよく、標的配列は対応する長さであり、任意選択でＰＡＭ配列に隣接する。いくつかの実施形態では、標的配列は１５〜２４ヌクレオチド長を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は１７〜２１ヌクレオチド長を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は２０ヌクレオチド長を含んでよい。ニッカーゼを使用する場合、標的配列は、ＤＮＡ分子の反対鎖を切断する一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、ＤＮＡ分子の同じ鎖を切断する一対のニッカーゼによって認識される一対の標的配列を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、１つ以上のＣａｓヌクレアーゼによって認識される標的配列の一部を含んでよい。
標的核酸分子は、細胞にとって内在性または外来性であるどのＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子であってもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸分子は、細胞由来または細胞内のエピソームＤＮＡ、プラスミド、ゲノムＤＮＡ、ウイルスゲノム、ミトコンドリアＤＮＡ、または染色体ＤＮＡであってよい。いくつかの実施形態では、標的核酸分子の標的配列は、ヒト細胞などの細胞由来または細胞内のゲノム配列であってよい。
さらなる実施形態では、標的配列はウイルス配列であってよい。さらなる実施形態では、標的配列は病原体配列であってよい。さらに別の実施形態では、標的配列は合成配列であってよい。さらなる実施形態では、標的配列は染色体配列であってよい。特定の実施形態では、標的配列は転座接合部、例えば、がんに関連した転座を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列はヒト染色体など真核生物の染色体上にあってよい。特定の実施形態では、標的配列は肝臓特異的配列であり、その場合、その配列は肝細胞に発現する。
いくつかの実施形態では、標的配列は遺伝子のコード配列内、遺伝子のイントロン配列内、制御配列内、遺伝子の転写制御配列内、遺伝子の翻訳制御配列内、スプライシング部位または遺伝子間の非コード配列内に位置してよい。いくつかの実施形態では、遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子であってよい。他の実施形態では、遺伝子はノンコーディングＲＮＡ遺伝子であってよい。いくつかの実施形態では、標的配列は疾患関連遺伝子の全部または一部を含んでよい。いくつかの実施形態では、標的配列は、ゲノムの非遺伝子機能部位、例えば、足場部位または遺伝子座制御領域のようなクロマチン組織の側面を制御する部位に位置してよい。
Ｃａｓヌクレアーゼなどのクラス２Ｃａｓヌクレアーゼが関係する実施形態では、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）に隣接してよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、標的配列の３’末端に隣接するかまたはその１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、または４ヌクレオチド以内にあってよい。ＰＡＭの長さ及び配列は、使用するＣａｓタンパク質によって異なってよい。例えば、ＰＡＭは、特定のＣａｓ９タンパク質またはＣａｓ９オルソログについてのコンセンサス配列または特定のＰＡＭ配列から選択してよく、これには、関連開示それぞれが参照により本明細書に組み込まれる、Ｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５２０：１８６−１９１（２０１５）の図１、及びＺｅｔｓｃｈｅ ２０１５の図Ｓ５に開示のものが含まれる。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、または１０ヌクレオチド長であってよい。非限定的な例示的ＰＡＭ配列としては、ＮＧＧ、ＮＧＧＮＧ、ＮＧ、ＮＡＡＡＡＮ、ＮＮＡＡＡＡＷ、ＮＮＮＮＡＣＡ、ＧＮＮＮＣＮＮＡ、ＴＴＮ、及びＮＮＮＮＧＡＴＴが挙げられる（ここで、Ｎは任意のヌクレオチドとして定義され、ＷはＡまたはＴのいずれかとして定義される）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＧＧＮＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＴＴＮであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列はＮＮＡＡＡＡＷであってよい。
脂質製剤
本明細書では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓカーゴが含まれた、ＲＮＡなどの生物学的活性物質用のＬＮＰ製剤のさまざまな実施形態を開示する。そのようなＬＮＰ製剤には、「アミン脂質」または「生分解性脂質」が、任意選択でヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質などのステルス脂質のうち１つ以上と共に含まれる。「脂質ナノ粒子」は、互いに分子間力によって物理的に会合している複数（すなわち２つ以上）の脂質分子を含む粒子を意味する。
アミン脂質
特定の実施形態では、生物学的活性物質を送達するためのＬＮＰ組成物は、リピドＡのアセタール類似体など、リピドＡまたはその同等物として定義される「アミン脂質」を含む。
いくつかの実施形態では、アミン脂質はリピドＡであり、これは（９Ｚ，１２Ｚ）−３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピルオクタデカ−９，１２−ジエノアートであり、３−（（４，４−ビス（オクチルオキシ）ブタノイル）オキシ）−２−（（（（３−（ジエチルアミノ）プロポキシ）カルボニル）オキシ）メチル）プロピル（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエノアートとも呼ばれる。リピドＡは、
Figure 2020537541
 のように表され得る。
リピドＡはＷＯ２０１５／０９５３４０（例えば、８４〜８６頁）に従って合成してよい。特定の実施形態では、アミン脂質はリピドＡと同等物である。
特定の実施形態では、アミン脂質はリピドＡの類似体である。特定の実施形態では、リピドＡ類似体はリピドＡのアセタール類似体である。特定のＬＮＰ組成物では、アセタール類似体はＣ４−Ｃ１２アセタール類似体である。いくつかの実施形態では、アセタール類似体はＣ５−Ｃ１２アセタール類似体である。さらなる実施形態では、アセタール類似体はＣ５−Ｃ１０アセタール類似体である。さらなる実施形態では、アセタール類似体は、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１０、Ｃ１１、及びＣ１２のアセタール類似体から選ばれる。
本明細書に記載するＬＮＰでの使用に好適なアミン脂質及び他の「生分解性脂質」はインビボにおいて生物分解性である。アミン脂質は毒性が低い（例えば、１０ｍｇ／ｋｇ以上の量で動物モデルでの忍容性があり、有害作用がない）。特定の実施形態では、アミン脂質を含むＬＮＰには、アミン脂質の少なくとも７５％が８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内、もしくは４８時間以内、または３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが含まれる。特定の実施形態では、アミン脂質を含むＬＮＰには、ｍＲＮＡまたはｇＲＮＡの少なくとも５０％が８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内、もしくは４８時間以内、または３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、もしくは１０日以内に血漿から消失するものが含まれる。特定の実施形態では、アミン脂質を含むＬＮＰには、例えば、脂質（例えば、アミン脂質）、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）、または他の成分の測定によって、ＬＮＰの少なくとも５０％が８時間以内、１０時間以内、１２時間以内、２４時間以内、もしくは４８時間以内、または３日以内、４日以内、５日以内、６日以内、７日以内、もしくは１０日以内に血漿から消失しているものが含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰの脂質、ＲＮＡ、または核酸成分を脂質に封入した場合と遊離の場合とで測定する。
生分解性脂質としては、例えば、ＷＯ／２０１７／１７３０５４、ＷＯ２０１５／０９５３４０、及びＷＯ２０１４／１３６０８６に記載の生分解性脂質が挙げられる。
脂質クリアランスは、文献に記載のとおり測定してよい。Ｍａｉｅｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｌｉｐｉｄｓ Ｅｎａｂｌｉｎｇ Ｒａｐｉｄｌｙ Ｅｌｉｍｉｎａｔｅｄ Ｌｉｐｉｄ Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｉｃ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２０１３，２１（８），１５７０−７８（「Ｍａｉｅｒ」）を参照のこと。例えば、Ｍａｉｅｒでは、ルシフェラーゼ−指向性ｓｉＲＮＡを含有するＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を０．３ｍｇ／ｋｇにて６〜８週齢雄Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに側尾静脈を介して静脈内ボーラス注射により投与した。投与から０．０８３時間、０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、９６時間、及び１６８時間の後、血液、肝臓、及び脾臓の各試料を採取した。マウスを生理食塩水で灌流してから組織を採取し、血液試料を処理して血漿を得た。全試料を処理し、ＬＣ−ＭＳで分析した。さらに、Ｍａｉｅｒは、ＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ製剤投与後の毒性評価の手法を記載している。例えば、雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに対しルシフェラーゼ−指向性ｓｉＲＮＡを０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、及び１０ｍｇ／ｋｇ（動物５匹／群）にて５ｍＬ／ｋｇの投与容量で単一静脈内ボーラス注射により投与した。２４時間後、約１ｍＬの血液を覚醒動物の頚静脈から得、血清を単離した。投与から７２時間後、全動物を剖検用に安楽死させた。臨床徴候、体重、血清化学検査、臓器重量及び組織病理学の評価を実施した。Ｍａｉｅｒは、ｓｉＲＮＡ−ＬＮＰ製剤を評価するための方法を記載しており、これらの方法を本開示のＬＮＰ組成物の投与に関するクリアランス、薬物動態、及び毒性の評価に適用してよい。
脂質によりクリアランス速度を高めることができる。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は脂質クリアランス速度、例えば、血液、血清、または血漿から脂質が消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、ＲＮＡクリアランス速度、例えば、血液、血清、または血漿からｍＲＮＡまたはｇＲＮＡが消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、血液、血清、または血漿からＬＮＰが消失する速度である。いくつかの実施形態では、クリアランス速度は、肝組織または脾臓組織などの組織からＬＮＰが消失する速度である。特定の実施形態では、クリアランス速度が高いことにより実質的に有害作用のない安全性プロファイルがもたらされる。アミン脂質及び生分解性脂質は、循環中及び組織内でのＬＮＰの蓄積を低下させ得る。いくつかの実施形態では、循環中及び組織内でのＬＮＰの蓄積低下は、実質的に有害作用のない安全性プロファイルをもたらす。
脂質は、それを含んでいる培地のｐＨに応じてイオン化され得る。例えば、わずかに酸性の培地では、アミン脂質などの脂質はプロトン化されてよく、したがって正電荷を帯びてよい。逆に、例えば、血液などのようにｐＨが約７．３５であるわずかに塩基性の培地ではアミン脂質などの脂質はプロトン化されない場合があり、したがって電荷を帯びない場合がある。
脂質が電荷を帯びる能力は、その内因性ｐＫａに関連している。いくつかの実施形態では、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．１〜約７．４の範囲にあってよい。いくつかの実施形態では、生体内で利用可能な本開示の脂質はそれぞれ、独立して、ｐＫａが約５．１〜約７．４の範囲内であってよい。例えば、本開示のアミン脂質は各々独立して、ｐＫａが約５．８〜約６．５の範囲にあってよい。ｐＫａが約５．１〜約７．４の範囲の脂質はカーゴをインビボで、例えば、肝臓などに送達する際に有効である。さらに、ｐＫａが約５．３〜約６．４の範囲の脂質はインビボで、例えば、腫瘍などに送達する際に有効であることが見出されている。例えば、ＷＯ２０１４／１３６０８６を参照のこと。
さらなる脂質
本開示の脂質組成物での使用に好適な「中性脂質」としては、例えば、多種多様な中性脂質、非荷電脂質または両性イオン型脂質などが挙げられる。本開示での使用に好適な中性リン脂質の例としては、５−ヘプタデシルベンゼン−１，３−ジオール（レゾルシン）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＬＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＡＰＣ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジラウリロイルホスファチジルコリン（ｄｉｌａｕｒｙｌｏｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）（ＤＬＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＭＰＰＣ）、１−パルミトイル−２−ミリストイルホスファチジルコリン（ＰＭＰＣ）、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン（ＰＳＰＣ）、１，２−ジアラキドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＢＰＣ）、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン（ＳＰＰＣ）、１，２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、リゾホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジリノレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、リゾホスファチジルエタノールアミン、及びその組み合わせが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、中性リン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）及びジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）からなる群から選択されてよい。別の実施形態では、中性リン脂質はジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）であってよい。
「ヘルパー脂質」としては、ステロイド、ステロール、及びアルキルレソルシノールが挙げられる。本開示での使用に好適なヘルパー脂質としては、コレステロール、５−ヘプタデシルレソルシノール、及びコレステロールヘミスクシナートが挙げられるが、これに限定されるものではない。一実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールであってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールヘミスクシナートであってよい。
「ステルス脂質」は、ナノ粒子がインビボ（例えば、血液中）で存在できる時間の長さを変化させる脂質である。ステルス脂質は、例えば、粒子の凝集抑制及び粒径制御などにより製剤工程の補助となり得る。本明細書で使用するステルス脂質により、ＬＮＰの薬物動態特性が調節され得る。本開示の脂質組成物での使用に好適なステルス脂質としては、脂質部分に連結されている親水性頭部基を有するステルス脂質が挙げられるが、これに限定されるものではない。本開示の脂質組成物での使用に好適なステルス脂質及びそのような脂質の生化学に関する情報は、Ｒｏｍｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２５，Ｎｏ．１，２００８，ｐｇ．５５−７１ ａｎｄ Ｈｏｅｋｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １６６０（２００４）４１−５２に見出すことができる。さらなる適切なＰＥＧ脂質は、例えば、ＷＯ２００６／００７７１２に開示されている。
一実施形態では、ステルス脂質の親水性頭部基は、ＰＥＧ系ポリマーから選択されるポリマー部分を含む。ステルス脂質は脂質部分を含んでよい。いくつかの実施形態では、ステルス脂質はＰＥＧ脂質である。
一実施形態では、ステルス脂質は、ＰＥＧ系ポリマー（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる場合もある）、ポリ（オキサゾリン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（グリセロール）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリアミノ酸、及びポリ［Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド］から選択されるポリマー部分を含む。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ系ポリマー部分（ポリ（エチレンオキシド）と呼ばれる場合もある）を含む。
ＰＥＧ脂質はさらに脂質部分を含む。いくつかの実施形態では、脂質部分はジアシルグリセロールまたはジアシルグリカミドから得ることができ、これには、独立して、アルキル鎖長に約Ｃ４〜約Ｃ４０の飽和もしくは不飽和の炭素原子を含むジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基を含むものが含まれ、ここで、かかる鎖は、例えば、アミドまたはエステルなど、１つ以上の官能基を含んでよい。いくつかの実施形態では、アルキル鎖長は約Ｃ１０からＣ２０を含む。ジアルキルグリセロール基またはジアルキルグリカミド基はさらに１つ以上の置換アルキル基を含むことができる。鎖長は対称でも非対称でもよい。
特に明記しない限り、本明細書で使用する「ＰＥＧ」という用語は、任意のポリエチレングリコールまたは他のポリアルキレンエーテルポリマーを意味する。一実施形態では、ＰＥＧは、任意選択で置換された、エチレングリコールまたはエチレンオキシドの直鎖ポリマーまたは分岐ポリマーである。一実施形態では、ＰＥＧは非置換である。一実施形態では、ＰＥＧは、例えば、１つ以上のアルキル基、アルコキシ基、アシル基、ヒドロキシ基、またはアリール基で置換される。一実施形態では、この用語には、ＰＥＧ−ポリウレタンまたはＰＥＧ−ポリプロピレンなどのＰＥＧ共重合体が含まれ（例えば、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９２）を参照のこと）、別の実施形態では、この用語にはＰＥＧ共重合体を含まない。一実施形態では、ＰＥＧは分子量が約１３０〜約５０，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約３０，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約２０，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約１５，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約１０，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約６，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約５，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約４，０００であり、下位実施形態では約１５０〜約３，０００であり、下位実施形態では約３００〜約３，０００であり、下位実施形態では約１，０００〜約３，０００であり、下位実施形態では約１，５００〜約２，５００である。
特定の実施形態では、ＰＥＧ（例えば、ステルス脂質などの脂質部分または脂質に結合させたもの）は「ＰＥＧ−２Ｋ」であり、「ＰＥＧ ２０００」とも呼ばれ、平均分子量は約２，０００ダルトンである。ＰＥＧ−２Ｋは本明細書では以下の式（Ｉ）
Figure 2020537541
 で表され、ここで、ｎは４５であり、数平均重合度は約４５のサブユニッを含むことを意味する。しかしながら、当該技術分野で公知の他のＰＥＧ実施形態を使用してよく、これには、例えば、数平均重合度が約２３のサブユニット（ｎ＝２３）、及び／または６８のサブユニット（ｎ＝６８）を含む実施形態が含まれる。いくつかの実施形態では、ｎは約３０から約６０であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約３５から約５５であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約４０から約５０であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは約４２から約４８であってよい。いくつかの実施形態では、ｎは４５であってよい。いくつかの実施形態では、Ｒは、Ｈ、置換アルキル、及び非置換アルキルから選択してよい。いくつかの実施形態では、Ｒは非置換アルキルであってよい。いくつかの実施形態では、Ｒはメチルであってよい。
本明細書に記載のいずれの実施形態においても、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ−ジラウロイルグリセロール、ＰＥＧ−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ）（カタログ番号ＧＭ−０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステアロイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＳＰＥ）（カタログ番号ＤＳＰＥ−０２０ＣＮ、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリストイルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、及びＰＥＧ−ジステアロイルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスタ−５−エン−３［ベータ］−オキシ）カルボキサミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［オメガ］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧ）（カタログ番号８８０１５０Ｐ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥ）（カタログ番号８８０１２０Ｃ、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａｂａｍａ，ＵＳＡ）製）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧ；ＧＳ−０２０、ＮＯＦ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）製）、ポリ（エチレングリコール）−２０００−ジメタクリラート（ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡ）、及び１，２−ジステアリルオキシプロピル−３−アミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］（ＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡ）から選択してよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧであってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＳＧであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＳＰＥであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＡであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ−ＤＭＡであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質は、ＷＯ２０１６／０１０８４０（段落［００２４０］から段落［００２４４］まで）において開示されている化合物Ｓ０２７であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＳＡであってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１４であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１６であってよい。いくつかの実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−Ｃ１８であってよい。
ＬＮＰ製剤
ＬＮＰは、（ｉ）生分解性脂質、（ｉｉ）任意選択の中性脂質、（ｉｉｉ）ヘルパー脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質などのステルス脂質を含有してよい。ＬＮＰは、生分解性脂質ならびに中性脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質などのステルス脂質のうち１つ以上を含有してよい。
ＬＮＰは、（ｉ）封入及びエンドソーム脱出のためのアミン脂質、（ｉｉ）安定化のための中性脂質、（ｉｉｉ）安定化兼ヘルパー脂質、及び（ｉｖ）ＰＥＧ脂質などのステルス脂質を含有してよい。ＬＮＰは、アミン脂質、ならびに中性脂質、安定化兼ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質などのステルス脂質のうちの１つ以上を含有してよい。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子、ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ、及びｇＲＮＡのうち１つ以上が含まれるＲＮＡ成分を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物には、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ及びｇＲＮＡがＲＮＡ成分として含まれ得る。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＲＮＡ成分、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びステルス脂質を含んでよい。特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。他の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。さらなる実施形態では、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡまたはリピドＡ同等物、ヘルパー脂質、中性脂質、ステルス脂質、及びガイドＲＮＡを含む。特定の組成物では、アミン脂質はリピドＡである。特定の組成物では、アミン脂質は、リピドＡまたはそのアセタール類似体であり、ヘルパー脂質はコレステロールであり、中性脂質はＤＳＰＣであり、ステルス脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。
特定の実施形態では、脂質組成物は、製剤中の成分脂質のそれぞれのモル比に従って表される。本開示の実施形態は、製剤中の成分脂質のそれぞれのモル比に従って表される脂質組成物を提供する。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約３０モル％〜約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約４０モル％〜約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約４５モル％〜約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５０モル％〜約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５５モル％〜約６０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５０モル％〜約５５モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５０モル％であってよい。一実施形態では、アミン脂質のモル％は約５５モル％であってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのアミン脂質のモル％は、標的モル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのアミン脂質のモル％は、標的モル％の±４モル％、±３モル％、±２モル％、±１．５モル％、±１モル％、±０．５モル％、または±０．２５モル％になる。モル％数値はいずれもＬＮＰ組成物脂質成分に対する割合として与えられる。特定の実施形態では、アミン脂質のモル％についてのＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
一実施形態では、中性脂質のモル％は約５モル％〜約１５モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質のモル％は約７モル％〜約１２モル％であってよい。一実施形態では、中性脂質のモル％は約９モル％であってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチの中性脂質のモル％は、標的中性脂質のモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２０モル％〜約６０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２５モル％〜約５５モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２５モル％〜約５０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約２５モル％〜約４０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約３０モル％〜約５０モル％であってよい。一実施形態では、ヘルパー脂質のモル％は約３０モル％〜約４０モル％であってよい。一実施形態では、脂質成分が１００モル％となるようアミン脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質の濃度に基づいてヘルパー脂質のモル％を調整する。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのヘルパーのモル％は、標的のモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約１モル％〜約１０モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２モル％〜約１０モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２モル％〜約８モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２モル％〜約４モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２．５モル％〜約４モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約３モル％であってよい。一実施形態では、ＰＥＧ脂質のモル％は約２．５モル％であってよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰバッチのＰＥＧ脂質のモル％は、標的ＰＥＧ脂質のモル％の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
特定の実施形態では、カーゴには、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、クラス２Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣａｓ９）をコードするｍＲＮＡ、及びｇＲＮＡもしくはｇＲＮＡをコードする核酸、またはｍＲＮＡとｇＲＮＡの組み合わせが含まれる。一実施形態では、ＬＮＰ組成物はリピドＡまたはその同等物を含んでよい。いくつかの態様では、アミン脂質はリピドＡである。いくつかの態様では、アミン脂質はリピドＡ同等物、例えば、リピドＡの類似体である。特定の態様では、アミン脂質はリピドＡのアセタール類似体である。さまざまな実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、ヘルパー脂質はコレステロールである。特定の実施形態では、中性脂質はＤＳＰＣである。具体的な実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧである。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ脂質を含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＤＭＧを含むＰＥＧ脂質を含む。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ、及びリピドＡのアセタール類似体などリピドＡ同等物から選択される。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物は、リピドＡ、コレステロール、ＤＳＰＣ、及びＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧを含む。
本開示の実施形態はまた、アミン脂質の正電荷のアミン基（Ｎ）と封入されるべき核酸の負電荷のリン酸基（Ｐ）とのモル比に従って表される脂質組成物も提供する。これは、式Ｎ／Ｐで数学的に表され得る。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びヘルパー脂質を含む脂質成分と、核酸成分とを含んでよく、ここで、Ｎ／Ｐ比は約３〜１０である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びヘルパー脂質を含む脂質成分と、ＲＮＡ成分とを含んでよく、ここで、Ｎ／Ｐ比は約３〜１０である。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約５〜７であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約４．５〜８であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約６であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は６±１であってよい。一実施形態では、Ｎ／Ｐ比は約６±０．５であってよい。いくつかの実施形態では、Ｎ／Ｐ比は標的Ｎ／Ｐ比の±３０％、±２５％、±２０％、±１５％、±１０％、±５％、または±２．５％になる。特定の実施形態では、ＬＮＰロット間変動は１５％未満、１０％未満または５％未満になる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分は、ｍＲＮＡ、例えば、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡなどを含んでよい。一実施形態では、ＲＮＡ成分はＣａｓ９ ｍＲＮＡを含んでよい。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むいくつかの組成物では、ＬＮＰはさらにｇＲＮＡなどのｇＲＮＡ核酸を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分はＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ成分はクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。クラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを含む特定の組成物では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物はｇＲＮＡを含んでよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。ｇＲＮＡを含む特定のＬＮＰ組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
一実施形態では、ＬＮＰ組成物はｓｇＲＮＡを含んでよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物はＣａｓ９ ｓｇＲＮＡを含んでよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物はＣｐｆ１ ｓｇＲＮＡを含んでよい。ｓｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、ＬＮＰには、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質が含まれる。ｓｇＲＮＡを含む特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ｓｇＲＮＡを含む他の組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ｓｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物は、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡと、ｓｇＲＮＡであってよいｇＲＮＡとを含む。一実施形態では、ＬＮＰ組成物は、アミン脂質、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含んでよい。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含む特定の組成物では、ヘルパー脂質はコレステロールである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むいくつかの組成物では、中性脂質はＤＳＰＣである。ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを含むさらなる実施形態では、ＰＥＧ脂質はＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１である。特定の実施形態では、アミン脂質は、リピドＡ及びその同等物、例えば、リピドＡのアセタール類似体などから選択される。
特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には、クラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及び少なくとも１つのｇＲＮＡが含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には、ｇＲＮＡとクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約２５：１〜約１：２５の比で含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤には、ｇＲＮＡとクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約１０：１〜約１：１０の比で含まれる。特定の実施形態では、ＬＮＰ製剤には、ｇＲＮＡとクラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約８：１〜約１：８の比で含まれる。本明細書で測定した比は重量基準である。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ製剤には、ｇＲＮＡとクラス２Ｃａｓ ｍＲＮＡなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとが約５：１〜約１：５の比で含まれる。いくつかの実施形態では、比の範囲は、約３：１〜１：３、約２：１〜１：２、約５：１〜１：２、約５：１〜１：１、約３：１〜１：２、約３：１〜１：１、約３：１、約２：１〜１：１である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとｍＲＮＡの比は約３：１または約２：１である。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡとクラス２ＣａｓヌクレアーゼなどのＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡとの比は約１：１である。比は、約２５：１、１０：１、５：１、３：１、１：１、１：３、１：５、１：１０、または１：２５であってよい。
本明細書に開示するＬＮＰ組成物には鋳型核酸が含まれ得る。鋳型核酸を、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、例えば、クラス２ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡなどと共に合剤にしてよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸をガイドＲＮＡと共に合剤にしてよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸を、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの両方と共に合剤にしてよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸を、ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡまたはガイドＲＮＡとは別に製剤化してよい。鋳型核酸をＬＮＰ組成物と共に送達しても、ＬＮＰ組成物とは別に送達してもよい。いくつかの実施形態では、鋳型核酸は、所望の修復機構に応じて一本鎖でも二本鎖でもよい。鋳型は、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡに隣接する配列に対する相同性領域を有してよい。
いくつかの実施形態では、水性ＲＮＡ溶液と有機溶媒系脂質溶液、例えば、１００％エタノールなどとを混合することによってＬＮＰを形成する。適切な溶液または溶媒には、水、ＰＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＮａＣｌ、クエン酸緩衝液、エタノール、クロロホルム、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、メタノール、イソプロパノールが含まれるか、またはそれらを含有してよい。薬理学的に許容される緩衝液を、例えば、ＬＮＰをインビボで投与するためなどに使用してよい。特定の実施形態では、緩衝液を使用して、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ６．５以上に維持する。特定の実施形態では、緩衝液を使用して、ＬＮＰを含む組成物のｐＨをｐＨ７．０以上に維持する。特定の実施形態では、組成物はｐＨが約７．２〜約７．７の範囲である。さらなる実施形態では、組成物はｐＨが約７．３〜約７．７の範囲、または約７．４〜約７．６の範囲である。さらなる実施形態では、組成物はｐＨが約７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、または７．７である。マイクロｐＨプローブで組成物のｐＨを測定してよい。特定の実施形態では、組成物に凍結保護剤が含まれる。凍結保護剤の非限定的な例としては、ショ糖、トレハロース、グリセロール、ＤＭＳＯ、及びエチレングリコールが挙げられる。例示的な組成物には、例えば、ショ糖などの凍結保護剤が最高１０％まで含まれてよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％の凍結保護剤が含まれてよい。特定の実施形態では、ＬＮＰ組成物には約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％のショ糖が含まれてよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物には緩衝液が含まれてよい。いくつかの実施形態では、緩衝液は、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）、Ｔｒｉｓ緩衝液、クエン酸緩衝液、及びその混合物を含んでよい。特定の例示的な実施形態では、緩衝液はＮａＣｌを含む。特定の実施形態では、ＮａＣｌを除外する。ＮａＣｌの例示的な量は、約２０ｍＭから約４５ｍＭに及んでよい。ＮａＣｌの例示的な量は、約４０ｍＭから約５０ｍＭに及んでよい。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの量は約４５ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液はＴｒｉｓ緩衝液である。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約２０ｍＭから約６０ｍＭに及んでよい。Ｔｒｉｓの例示的な量は、約４０ｍＭから約６０ｍＭに及んでよい。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓの量は約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液はＮａＣｌ及びＴｒｉｓを含む。ＬＮＰ組成物の特定の例示的な実施形態では、５％のショ糖と４５ｍＭのＮａＣｌとを溶解させたＴｒｉｓ緩衝液が含有される。他の例示的な実施形態では、組成物は、約５ｗ／ｖ％の量のショ糖、約４５ｍＭのＮａＣｌ、及び約５０ｍＭのｐＨ７．５のＴｒｉｓを含有する。塩、緩衝液、及び凍結保護剤の量は、製剤全体としての浸透圧が維持されるよう変えてよい。例えば、最終浸透圧は４５０ｍＯｓｍ／Ｌ未満に維持してよい。さらなる実施形態では、浸透圧は３５０ｍＯｓｍ／Ｌと２５０ｍＯｓｍ／Ｌの間である。特定の実施形態では最終浸透圧は３００＋／−２０ｍＯｓｍ／Ｌである。
いくつかの実施形態では、マイクロ流体混合、Ｔ−混合、または交差混合を使用する。特定の態様では、流量、合流部サイズ、合流部の位置関係、合流部の形状、管径、溶液、及び／またはＲＮＡ濃度及び脂質濃度を変えてよい。ＬＮＰまたはＬＮＰ組成物を、例えば、透析、接線流ろ過、またはクロマトグラフィーなどにより濃縮または精製してよい。ＬＮＰは、例えば、懸濁液、エマルジョン、または凍結乾燥粉末などとして保存してよい。いくつかの実施形態では、ＬＮＰ組成物を２〜８℃で保存し、特定の態様では、ＬＮＰ組成物を室温で保存する。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物を、例えば、−２０℃または−８０℃などで凍結保存する。他の実施形態では、ＬＮＰ組成物を約０℃〜約−８０℃の範囲の温度で保存する。凍結ＬＮＰ組成物を、使用前に、例えば、氷上、４℃、室温、または２５℃で解凍してよい。凍結ＬＮＰ組成物をさまざまな温度で、例えば、氷上、４℃、室温、２５℃、または３７℃などで維持してよい。
幹細胞、例えば、ＨＳＰＣなどの工学的操作方法；工学的操作をされた幹細胞、例えば、ＨＳＰＣ
本明細書に開示するＬＮＰ組成物は、幹細胞、例えば、ＨＳＰＣなどを、例えば、インビトロでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系遺伝子編集などによって工学的に操作する方法で使用され得る。いくつかの実施形態では、遺伝子操作された細胞集団はＣＤ３４＋細胞集団である。いくつかの実施形態では、インビトロで遺伝子操作されたＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞集団を作製する方法を提供し、かかる方法は、（ａ）ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを送達するためのＬＮＰ組成物と血清因子とをプレインキュベートし、（ｂ）プレインキュベートしたＬＮＰ組成物とＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞集団をインビトロで接触させ、（ｃ）ＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞集団をインビトロで培養し、それにより、遺伝子操作されたＨＳＰＣを作製することを含む。いくつかの実施形態では、方法には、ＨＳＰＣまたはＣＤ３４＋細胞と本明細書に記載のＬＮＰ組成物とを本明細書に記載する送達方法に従って接触させることを伴う。
いくつかの実施形態では、工学的に操作された幹細胞、例えば、ＨＳＰＣなどを提供し、例えば、工学的に操作されたＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団などを提供する。そのような工学的に操作された細胞は本明細書に記載する方法に従って作製される。いくつかの実施形態では、工学的に操作されたＨＳＰＣは、例えば、工学的に操作されたＨＳＰＣの移植後など、対象体内の組織または臓器、例えば、骨髄、血液、または他の組織内に存在する。
本明細書に記載する方法及び細胞のいくつかでは、細胞は、標的配列のヌクレオチドの修飾、例えば、挿入もしくは欠失（「インデル」）または置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個または５個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列にフレームシフト突然変異をもたらすインデルを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、鋳型核酸、例えば、本明細書に記載する鋳型核酸のいずれかの組み込みにより生じたヌクレオチドの挿入、欠失、または置換のうち１つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、工学的に操作された細胞を含む細胞集団、例えば、本明細書に記載する方法に従って工学的に操作された細胞を含む細胞集団を提供する。いくつかの実施形態では、集団は、インビトロで培養された工学的操作をされた細胞を含む。いくつかの実施形態では、集団は、対象体内の組織または臓器、例えば、肝臓などの内部に存在する。いくつかの実施形態では、集団内の細胞のうち少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％またはそれ以上を工学的に操作する。特定の実施形態では、本明細書に開示する方法により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の編集効率（または「編集率」）がもたらされ、これはインデルの検出により定義される。他の実施形態では、本明細書に開示する方法により、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％のＤＮＡ修飾効率がもたらされ、これは、挿入、欠失、置換によるか、または他の方法によるかを問わず、配列変化の検出により定義される。特定の実施形態では、本明細書に開示する方法により、細胞集団における編集効率レベルまたはＤＮＡ修飾効率レベルは、約５％〜約１００％、約１０％〜約５０％、約２０〜約１００％、約２０〜約８０％、約４０〜約１００％、または約４０〜約８０％になる。
本明細書に記載する方法及び細胞のいくつかでは、集団内の細胞は、標的配列における修飾、例えば、インデルまたは置換などを含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個または５個またはそれ以上のヌクレオチドの挿入を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの挿入を含む。他の実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの欠失を含む。いくつかの実施形態では、修飾により標的配列にフレームシフト突然変異がもたらされる。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列にフレームシフト突然変異をもたらすインデルを含む。いくつかの実施形態では、集団の工学的操作された細胞のうち少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％またはそれ以上はフレームシフト突然変異を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個または２５個またはそれ以上のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、標的配列の１個または２個のヌクレオチドの置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾は、鋳型核酸、例えば、本明細書に記載する鋳型核酸のいずれかの組み込みにより生じたヌクレオチドの挿入、欠失、または置換のうち１つ以上を含む。
遺伝子編集方法
本明細書に開示する方法は、幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団におけるインビトロでの遺伝子編集に使用してよい。一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＬＮＰ組成物を幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団に投与してよい。一実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のＬＮＰ組成物は、幹細胞、ＨＳＰＣ、及びＨＳＣ、またはＨＰＣと接触させてよい。一実施形態では、遺伝子操作された細胞は、本明細書に記載する方法に従って細胞をＬＮＰ組成物と接触させることによって作製され得る。いくつかの遺伝子編集方法では、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団は培養で維持される。いくつかの遺伝子編集方法では、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団は患者に移植される。いくつかの実施形態では、遺伝子操作されたＨＳＰＣは、例えば、工学的に操作されたＨＳＰＣの移植後など、患者体内の組織または臓器、例えば、骨髄、血液、または他の組織内に存在する。
いくつかの実施形態では、方法は、幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団を含み、これらは、その細胞を投与される患者に関して自己由来である。いくつかの実施形態では、方法は、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団を含み、これらは、前記細胞を投与される患者に関して同種である。
さまざまな実施形態では、本明細書に記載する方法により、幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集が達成される。いくつかの実施形態では、方法はさらに、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団における遺伝子編集を検出することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子編集は編集率として測定される。いくつかの実施形態では、遺伝子編集はＤＮＡ修飾率として測定される。方法は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％の編集を達成し得る。方法は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％のＤＮＡ修飾を達成し得る。
一実施形態では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡとｇＲＮＡとを含むＬＮＰ組成物を幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団に投与してよい。さらなる実施形態では、鋳型核酸も細胞に導入される。特定の例では、クラス２ＣａｓヌクレアーゼとｓｇＲＮＡとを含むＬＮＰ組成物を細胞に投与してよい。
一実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団の遺伝子を遺伝子ノックアウトが生じるよう編集してよい。一実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団の遺伝子を、例えば、細胞集団などに、遺伝子ノックダウンが生じるよう編集してよい。ノックダウンまたはノックアウトは、標的タンパク質レベルの測定により検出され得る。ノックダウンまたはノックアウトは、標的ＤＮＡの検出により検出され得る。別の実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団の遺伝子を遺伝子修正が生じるよう編集してよい。さらなる実施形態では、ＬＮＰ組成物を使用して、遺伝子挿入を生じさせるよう細胞を編集してよい。
ＬＮＰ組成物は、１つ以上の薬理学的に許容される添加剤と併せた製剤として投与され得る。用語「添加剤」には、本開示の化合物（複数可）以外の任意の成分、他の脂質成分（複数可）及び生物学的活性物質が含まれる。添加剤により、機能的（例えば、薬物放出速度制御）特徴及び／または非機能的（例えば、処理補助または希釈剤）特徴のいずれが製剤に付与されてもよい。どの添加剤を選択するかは、特定の投与方法、添加剤が幹細胞またはＨＳＰＣの培養、及び溶解度と安定性に及ぼす影響、ならびに剤形の性質といった因子によって大きく異なる。
製剤が水性の場合、添加剤は糖（グルコース、マンニトール、ソルビトール等が含まれるが、これに限定されるわけではない）、塩、炭水化物及び緩衝剤（好ましくはｐＨが３〜９）などであるが、一部の用途ではこれらは、滅菌非水溶液を用いるか、または滅菌パイロジェンフリー水（ＷＦＩ）などの適切なビヒクルと併せて使用する乾燥形態としてさらに好適に製剤化されてよい。
本発明は例示実施形態と併せて記載されるが、それらは、本発明を記載の実施形態に限定することを意図するものではないと理解される。むしろ、本発明は、代替案、変更、及び具体的な特徴の同等物を含む同等物のすべてを包含することを意図し、これらは添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲内に含まれ得る。
上述された一般的記載及び詳細な説明の両方、ならびに以下の実施例は例示及び説明するのみであり、教示を限定するものではない。本明細書で使用する項目見出しは構成のみを目的としており、所望の主題を何ら限定するもではないと解釈されるべきである。参照により組み込まれる文献が本明細書で定義した用語と矛盾する場合、本明細書が優先する。本出願に記載されるすべての範囲には、特に断らない限り、端点が包含される。
本出願で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」には、文脈で特に明確に指示されない限り、複数の指示対象が含まれることに留意すべきである。したがって、例えば、「組成物（ａ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」への言及には複数の組成物が含まれ、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」への言及には複数の細胞が含まれ、他も同様である。「または」の使用は包括的なものであり、特に断らない限り、「及び／または」を意味する。
数字範囲には、その範囲を定義する数字が含まれる。測定値及び測定可能な値は、測定に関連する有効数字及び誤差を考慮し、概数であると理解される。用語「約（ａｂｏｕｔ）」または「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」とは、当業者により決定された特定の値について許容される誤差を意味し、値の測定法または決定法によって幾分異なる。範囲の前または列挙されている値の前に「約（ａｂｏｕｔ）」などの修飾語の使用により、範囲の各端点または列挙にある各々の値が修飾を受ける。例えば、「約５０〜５５」では「約５０〜約５５」が包含される。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は限定的なものではない。
上記明細書で特に断りがない限り、明細書中、さまざまな成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という記述がある実施形態は、記述の成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」かまたはそれ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことも意図され、明細書中、さまざまな成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という記述がある実施形態は、記述の成分を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」かまたはそれ「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」ことも意図され、明細書中、さまざまな成分「について（ａｂｏｕｔ）」という記述がある実施形態は、記述の成分「にて（ａｔ）」であることも意図され、また、明細書中、さまざまな成分「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という記述がある実施形態は、記述の成分「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」かまたはそれを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」ことも意図される（このような互換性は請求項内でこれらの用語を使用する際には適用されない）。
実施例１−方法
細胞培養
凍結保存したヒトＣＤ３４＋骨髄細胞をＡｌｌＣｅｌｌｓ（カタログ番号ＡＢＭ０１７Ｆ）またはＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号７０００８）より入手した。解凍し、２０ｍｌのＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０９６５０）で２回洗浄した後、トロンボポエチン（ＴＰＯ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０２９２２）、ヒトＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３ｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８１３７．２）、ヒトインターロイキン−６（Ｉｌ−６、５０ｎｇ／ｍｌ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８１４８．２）、ヒト幹細胞因子（ＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌ、ＳｔｅｍＣｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号７８１５５．２）、及びＳｔｅｍＲｅｇｅｎｉｎ−１（ＳＲ１、０．７５ｕＭ）を含有しているＳｔｅｍＳｐａｎ ＳＦＥＭ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０９６５０）、ならびにペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００ｕｇ／ｍｌのストレプトマイシン、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１５１４０１２２）中で細胞を４８時間培養した。
脂質ナノ粒子（「ＬＮＰ」）製剤
下記で特に明記する場合を除き、脂質ナノ粒子成分を１００％エタノールに以下のモル比：４５モル％（１２．７ｍＭ）の脂質アミン（例えば、リピドＡ）、４４モル％（１２．４ｍＭ）のヘルパー脂質（例えば、コレステロール）、９モル％（２．５３ｍＭ）の中性脂質（例えば、ＤＳＰＣ）、及び２モル％（．５６３ｍＭ）のＰＥＧ脂質（例えば、ＰＥＧ２ｋ−ＤＭＧまたはＰＥＧ２ｋ−Ｃ１１）で溶解させてＬＮＰを製剤化した。Ｎ／Ｐ比（脂質アミンのモル対ＲＮＡのモル）は４．５であった。ＬＮＰ製剤の識別番号は以下のとおりである：ＬＮＰ５２２、ＬＮＰ５２５（ＧＦＰ ｍＲＮＡ）及びＬＮＰ６７０、ＬＮＰ９２６（Ｂ２Ｍ単一ガイド、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）及びＬＮＰ８９９（ＡＡＶＳ１単一ガイド、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡ）。ＲＮＡカーゴを、５０ｍＭの酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）または２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ５．０）に溶解させ、ＲＮＡカーゴの濃度を約０．４５ｍｇ／ｍＬとした。
Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｎａｎｏｓｙｓｔｅｍｓ ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｒ（商標） Ｂｅｎｃｈｔｏｐ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔを製造者の操作手順に従って使用し、脂質とＲＮＡ溶液のマイクロ流体混合によってＬＮＰを生成した。混合中は水性溶媒と有機溶媒の比を２：１に維持しつつ、異なる流量を使用した。混合後、以降の処理に先立ち、ＬＮＰを採取してリン酸緩衝食塩水（ｐＨ７．４）（ＰＢＳ）または５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）（Ｔｒｉｓ）に希釈し（約１：１）、エタノール含量を減少させた。緩衝液の最終交換は１０ｋＤａのＳｌｉｄｅ−ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）Ｇ２ Ｄｉａｌｙｓｉｓ Ｃａｓｓｅｔｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＰＢＳまたはＴｒｉｓ（試料容量の１００倍過剰）に穏やかな撹拌下で４℃にて一晩透析することにより完了した。Ｔｒｉｓ処理した製剤を１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、９０ｍＭの生理食塩水、５％（ｗ／ｖ）のショ糖、ｐＨ７．５（２× ＴＳＳ）に１：１で希釈した。別法として、混合後ＬＮＰを採取して水に希釈し、室温で１時間保持した後、水で２回目の希釈を１：１で行った。ＴＳＳへの最終緩衝液交換をＰＤ−１０脱塩カラム（ＧＥ）で完了させた。必要に応じ、いずれかの処理方法による製剤を、Ａｍｉｃｏｎ １００ｋＤａ遠心式フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で遠心分離にかけて濃縮した。その後、得られる混合物を、０．２μｍ滅菌フィルターを使用してろ過した。得られたろ液は、最終緩衝液がＰＢＳの場合は２〜８℃で保存し、最終緩衝液がＴＳＳの場合は−８０℃で保存した。
ヌクレアーゼｍＲＮＡ及び単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）のインビトロ転写（「ＩＶＴ」）
直鎖状にしたプラスミドＤＮＡ鋳型及びＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを使用してインビトロで転写することにより、キャップ化し、ポリアデニル化したＣａｓ９ ｍＲＮＡを作製した。Ｔ７プロモーター及び１００残基のポリ（Ａ／Ｔ）領域を含有するプラスミドＤＮＡは、以下の２００ｎｇ／μＬのプラスミド、２Ｕ／μＬのＸｂａＩ（ＮＥＢ）、及び１×の反応緩衝液という条件でＸｂａＩと共に３７℃で２時間インキュベートすることにより直鎖状にされた。反応物を６５℃で２０分間加熱してＸｂａＩを不活性化した。直鎖状にしたプラスミドをシリカマキシスピンカラム（Ｅｐｏｃｈ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して酵素及び緩衝塩により精製し、アガロースゲルで分析し、直鎖化を確認した。Ｃａｓ９修飾ｍＲＮＡを作製するためのＩＶＴ反応物を以下の条件で３７℃にて４時間インキュベートした：５０ｎｇ／μＬの直鎖状プラスミド；各２ｍＭずつのＧＴＰ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、及びＮ１−メチルｐｓｅｕｄｏ−ＵＴＰ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；１０ｍＭのＡＲＣＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）；５Ｕ／μＬのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）；１Ｕ／μＬのマウスＲＮａｓｅ阻害剤（ＮＥＢ）；０．００４Ｕ／μＬのＥ．ｃｏｌｉ無機ピロホスファターゼ（ＮＥＢ）；及び１×の反応緩衝液。４時間インキュベーションした後、ＴＵＲＢＯ ＤＮａｓｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を加えて最終濃度０．０１Ｕ／μＬとし、反応物をさらに３０分間インキュベートしてＤＮＡ鋳型を除去した。ＬｉＣｌ沈殿法を使用してＣａｓ９ ｍＲＮＡを精製した。
すべての方法について、転写濃度は２６０ｎｍでの吸光度を測定することにより決定され（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、転写はＢｉｏａｎｌａｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によるキャピラリー電気泳動で分析した。ＳｇＲＮＡを化学合成した。
ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞のＬＮＰトランスフェクション
ＧＦＰ ｍＲＮＡまたはＣａｓ９ ｍＲＮＡのいずれかと、ベータ２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を標的にする単一ガイドとを含有するＬＮＰを５０．０ｎｇ〜８００．０ｎｇの範囲のさまざまな濃度で３０，０００ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞に加え、総容量を１００．０ｕｌとした。ＧＧＣＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＴＣＴというＢ２Ｍ標的配列（配列番号７５）を標的とするｓｇＲＮＡ配列は、ｍＧ＊ｍＧ＊ｍＣ＊ＣＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＣＡＵＣＵＧＵＵＵＵＡＧＡｍＧｍＣｍＵｍＡｍＧｍＡｍＡｍＡｍＵｍＡｍＧｍＣＡＡＧＵＵＡＡＡＡＵＡＡＧＧＣＵＡＧＵＣＣＧＵＵＡＵＣＡｍＡｍＣｍＵｍＵｍＧｍＡｍＡｍＡｍＡｍＡｍＧｍＵｍＧｍＧｍＣｍＡｍＣｍＣｍＧｍＡｍＧｍＵｍＣｍＧｍＧｍＵｍＧｍＣｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ＊ｍＵ（配列番号７６）である。この核酸配列において、Ａ、Ｕ、Ｇ、及びＣはそれぞれアデニン、ウラシル、シトシン、及びグアニンを表し、「ｍ」は２’−Ｏ−メチルのヌクレオチドを示し、「＊」はホスホロチオアート結合を示す。
種属特異的血清試験（ｓｐｅｃｉｅｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｒｕｍ ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｔｒｉｐｌｅ Ｓ試験）では、細胞トランスフェクションに先立ち、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＭＳＥＳＲＭ、ロット番号ＭＳＥ２４５８２１）、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ由来（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＣＹＮＳＲＭ、ロット番号ＣＹＮ１９７４５１）、及びＨ．ｓａｐｉｅｎｓ由来（Ｓｉｇｍａ、プール、Ｈ４５２２〜２０ｍｌ、ロット番号ＳＬＢＲ７６２９Ｖ；ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＨＭＳＲＭ、ロット番号ＢＲＨ１２７８６３８；ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＨＭＳＲＭ、ロット番号ＢＲＨ１２２７９４７）の６．０％血清でＬＮＰを３７℃にて５分間インキュベートした。ヒト組換え型アポリポタンパク質Ｅ３（ＡｐｏＥ３、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１４４−ＡＥ）を、上記と同じインキュベーション条件下、推奨緩衝液においてある濃度範囲（０１．ｕｇ／ｍｌ、１．０ｕｇ／ｍｌ、１０．０ｕｇ／ｍｌ、及び５０．０ｕｇ／ｍｌ）にて使用した。
ＬＮＰをトランスフェクトされたヒトＣＤ３４＋骨髄細胞のフローサイトメトリーの読み取り
ＬＮＰ−ＧＦＰトランスフェクションから２４時間後またはＬＮＰ−Ｂ２Ｍトランスフェクションから５日後に抗体染色用に細胞を採取した。細胞をサンプル培地（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋２ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した後、Ｈｕｍａｎ ＴｒｕＳｔａｉｎ ＦｃＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２３０２）を用いて細胞のブロッキングを室温（ＲＴ）で５分間行った。
以下の表２に示す抗体及び標識を用いて細胞を染色した。
Figure 2020537541
細胞にＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣｙｔｏｆｌｅｘＳを実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用して分析した。
７−ＡＡＤ染色で細胞生存を評価した。ＧＣに富むＤＮＡ領域における７−ＡＡＤのインターカレーションに基づき生細胞の標準化を行い、その後、フローサイトメトリーアッセイで検出を行った。以下の式を用いて細胞生存を算出した。
［（試料１細胞イベント数／試料１ビーズイベント数）＊試料１総添加ビーズ数］／平均｛［（対照１細胞イベント数／対照１ビーズイベント数）＊対照１総添加ビーズ数］、［（対照２細胞イベント数／対照１ビーズイベント数）＊対照２総添加ビーズ数］、…、対照Ｎ｝
この式において、「試料」は、実験期間中、ＬＮＰ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または前者の任意の組み合わせを用いた処理を受けたヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣの任意の集団として定義され、「対照」は、実験期間中、ＬＮＰ、ｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、または前者の任意の組み合わせを用いた処理を受けなかったヒトＣＤ３４＋ ＨＳＰＣの任意の集団として定義される。
次世代シーケンシング（「ＮＧＳ」）及び切断効率分析
ゲノムにおける標的位置での編集効率を定量的に決定するため、ディープ配列決定を利用して、遺伝子編集により導入された挿入及び欠失の存在を同定した。
トランスフェクション後第５日に細胞を採取し、ＰｕｒｅＬｉｎｋ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｍｉｎｉキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｋ１８２００２）を使用してＤＮＡを抽出した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｐ５及びＰ７アダプター配列を含有しているＢ２Ｍ標的遺伝子座用プライマーを使用して、標準的ＰＣＲ反応で目的ゲノム部位を増幅させた。
Ｂ２Ｍ標的部位周辺にＰＣＲプライマーを設計し、目的ゲノム領域を増幅させた。試料調製（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ ｖ２試薬キット、３００サイクル、カタログ番号１５０３３６２４）に試料を供し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置で配列決定を行った。特注パイプラインを使用して目的の標的遺伝子座における編集頻度を分析した。手短に言えば、製造者の操作手順（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従ってさらなるＰＣＲを実施し、配列決定に必要な化学を追加した。アンプリコンの配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ装置で行った。品質スコアの低いものを除去した後、読み取ったものをヒト基準ゲノム（例えば、ｈｇ３８）に対して整列させた。読み取りを含有している結果ファイルを基準ゲノム（ＢＡＭファイル）に対してマッピングし、ここで、目的の標的領域と重複した読み取りを選択し、野生型の読み取り数と挿入、置換、または欠失含有する読み取り数との比を計算した。
編集割合（例えば、「編集効率」または「編集率」）は、野生型などの配列読み取り総数に対する、挿入または欠失を含む配列読み取り総数として与えられる。
製剤分析法
ＬＮＰ製剤を、平均粒径、多分散度（ｐｄｉ）、トータルＲＮＡ含量及びＲＮＡの封入率について分析する。平均粒径及び多分散度は、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ＤＬＳ装置を使用して動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定する。ＤＬＳで測定する前に、ＬＮＰ試料をＰＢＳに３０Ｘ希釈する。平均粒径の強度基準の測定値であるＺ−平均径が数平均径及びｐｄｉと共に報告された。
トータルＲＮＡ濃度及び遊離のＲＮＡの決定には蛍光を基にしたアッセイ（Ｒｉｂｏｇｒｅｅｎ（登録商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する。封入率は、（トータルＲＮＡ−遊離のＲＮＡ）／トータルＲＮＡで算出する。トータルＲＮＡを決定するため０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００を含有している１× ＴＥ緩衝液を用いるか、または遊離のＲＮＡを決定するため１×ＴＥ緩衝液を用いてＬＮＰ試料を適切に希釈する。製剤を作製するために使用され、その後１×ＴＥ緩衝液＋／−０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００に希釈された、開始時のＲＮＡ溶液を使用して標準曲線を作成する。その後、希釈したＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（登録商標）色素（製造者の取扱説明書に従って１ｘＴＥ緩衝液中１００Ｘ）を標準及び試料の各々に加え、光のない状態で室温にて１０分間インキュベートする。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用し、励起、オートカットオフ及び発光波長をそれぞれ４８８ｎｍ、５１５ｎｍ、及び５２５ｎｍに設定して試料の読み取りを行った。適切な標準曲線によりトータルＲＮＡ及び遊離ＲＮＡを決定する。封入率は、（トータルＲＮＡ−遊離のＲＮＡ）／トータルＲＮＡで算出する。同様の手法を使用して、ＤＮＡ系カーゴ成分の封入率を決定してよい。一本鎖ＤＮＡにはＯｌｉｇｒｅｅｎ Ｄｙｅを使用してよく、二本鎖ＤＮＡにはＰｉｃｏｇｒｅｅｎ Ｄｙｅを使用してよい。
実施例２−ＣＤ３４＋骨髄細胞へのＧＦＰの送達
ＰＢＳ最終緩衝液に溶解させたＧＦＰ ｍＲＮＡを用いてＬＮＰを実施例１に記載のように製剤化し、３０，０００ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞に加えて総容量１００．０ｕｌとし、０，５０．０ｎｇ、１００．０ｎｇ、及び２００．０ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡを各種反応で得た。細胞への投与に先立ち、ＬＮＰを、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ由来の６％（ｖ／ｖ）血清（ＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴ、カタログ番号ＭＳＥＳＲＭ、ロット番号ＭＳＥ２４５８２１）と共に３７℃で５分間プレインキュベートした。細胞を実施例１に記載のように培養した。
ヒトＣＤ３４＋細胞へのＬＮＰ添加から２４時間後、フローサイトメトリーでＧＦＰ＋の細胞を定量化した。ＧＦＰ−の対照（図１で「対照」と表記）に対するＧＦＰ＋の細胞集団をＦＩＴＣチャンネル（励起最大４９０、放出最大５２５、レーザーライン４８８）で決定した。ＬＮＰ介在によるＧＦＰ ｍＲＮＡの送達から２４時間後のヒトＣＤ３４＋骨髄細胞の全生細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合を図１に示す。ＬＮＰ組成は以下のとおりである。図１（Ａ）：４５％のリピドＡ、４４％のコレステロール、９％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧ；図１（Ｂ）：４５％のリピドＡ、４５％のコレステロール、９％のＤＳＰＣ、１％のＰＥＧ。生体試料数：ｎ＝３。
ＬＮＰ組成物は、インビトロにおいてＣＤ３４＋骨髄細胞への用量依存的ｍＲＮＡ送達を示す。
実施例３−ＬＮＰのプレインキュベーションは送達を促進する
試験は、ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞にＧＦＰ ｍＲＮＡを効率的に送達するためには、トランスフェクション前に６％マウス血清（ｖ／ｖ）とのインキュベーションがＬＮＰに必要であることを示す。細胞を培養し、ＬＮＰ組成物を以下の変更を行って実施例２に記載のようにトランスフェクトした。
図２Ａは、凍結保存細胞バイアルの解凍直後の第０日にＬＮＰを添加したヒトＣＤ３４＋骨髄試料の全生細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合を示す。５０．０ｎｇ、１００．０ｎｇ、または２００．０ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡを有するＬＮＰを、トランスフェクション前に血清インキュベーションをした場合としない場合の細胞に加えた。
図２Ｂは、凍結保存細胞バイアルの解凍後第２日にＬＮＰを添加したヒトＣＤ３４＋骨髄試料の全生細胞中のＧＦＰ＋細胞の割合を示す。５０．０ｎｇ、１００．０ｎｇ、または２００．０ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡを有するＬＮＰを、トランスフェクション前に血清インキュベーションをした場合としない場合の細胞に加えた。生体試料数：ｎ＝３。
実施例４−ＬＮＰを介したＣａｓ９及びガイドＲＮＡの送達；ＣＤ３４＋骨髄細胞での
遺伝子編集
実施例１に記載のようなｓｇＲＮＡ（Ｇ５２９）及びＣａｓ９ ｍＲＮＡを用いてＬＮＰをＴＳＳ最終緩衝液に重量比１：１にて実施例１に記載のように製剤化した。ＬＮＰ組成は、４５％のリピドＡ、４４％のコレステロール、９％のＤＳＰＣ、２％のＰＥＧであり、Ｎ／Ｐ比は４．５であった。
ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞にトランスフェクトするＬＮＰ送達方法の使用により、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓまたはＭ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの血清割合（ｖ／ｖ）を増大させたプレインキュベーションを利用して、Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとＢ２Ｍ ｓｇＲＮＡとが細胞に効率的に送達された。活性Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を、さまざまな血清を用いてプレインキュベートしたＬＮＰにより送達する。
図３Ａは、トランスフェクトされた細胞のＦＡＣＳ解析を示し、マウス血清（「マウス−Ｓ」）を６％、３０％、及び６０％（ｖ／ｖ）で用いるか、または非ヒト霊長類血清（「Ｃｙｎｏ−Ｓ」）を６％、３０％、及び６０％（ｖ／ｖ）で用いてインキュベートしたＬＮＰ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ（重量基準で１：１）を４００．０ｎｇ）を添加後のＢ２Ｍ陰性細胞の割合を示す。血清とのプレインキュベーションを行わないＬＮＰ（「ＬＮＰのみ」）及び未処理細胞（「対照」）は、効率的送達（Ｂ２Ｍ発現ノックダウンの測定）を示さないものとして使用する。マウスまたは霊長類の血清とプレインキュベーションすることにより、ＣＤ３４＋骨髄細胞におけるＢ２Ｍ発現の効率的ノックダウンが促進される。
図３Ｂは、マウス血清を６％、３０％、及び６０％（ｖ／ｖ）で用いるか、または非ヒト霊長類血清を６％、３０％、及び６０％（ｖ／ｖ）で用いてインキュベートしたＬＮＰ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ（重量基準で１：１）を４００．０ｎｇ）をトランスフェクトしたヒトＣＤ３４＋骨髄細胞について、ＮＧＳで決定したゲノムレベルでの編集頻度を示す。図３（Ａ）に示すように、血清とのプレインキュベーションを行わないＬＮＰ及び未処理細胞は効率的送達を示さない（編集％を測定）。挿入（「Ｉｎ」、薄灰色）及び欠失（「Ｄｅｌ」、黒色）をＹ軸にしてグラフ化され、ＣＤ３４＋細胞における約６０％超、約７０％超、約８０％超及び約９０％超の編集効率を示す。「ＬＮＰのみ」及び「対照」試料はＢ２Ｍ遺伝子座において検出可能なレベルのインデルを示さない。生体試料数：ｎ＝３。
実施例５−単離された血清因子ＡｐｏＥ３とのプレインキュベーション
血清とのプレインキュベーションステップを組換えタンパク質に置き換えることができるか否かを調べるため、Ｃａｓ９及びＢ２Ｍ ｓｇＲＮＡを送達する実施例４に記載のようなＬＮＰを、細胞トランスフェクション前のＬＮＰインキュベーションステップ時にヒト組換えアポリポタンパク質Ｅ３（ＡｐｏＥ３）、マウス血清、または非ヒト霊長類血清とプレインキュベートした。
図４Ａでは、マウス血清（「マウス−Ｓ」）を６％（ｖ／ｖ）で用いるか、非ヒト霊長類血清（「ｃｙｎｏ−Ｓ」）を６％（ｖ／ｖ）で用いるか、またはＡｐｏＥ３を０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ、及び５０．０μｇ／ｍｌで用いてインキュベートしたＬＮＰ（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡとｓｇＲＮＡ（１：１）を４００ｎｇ）を添加後のＢ２Ｍ陰性細胞の割合が示されている。未処理のヒトＣＤ３４＋骨髄細胞は陰性対照（「対照」）として使用する。ＡｐｏＥ３は、ＣＤ３４＋細胞への送達において用量依存的増大を示しており、これはプレインキュベーションステップで使用することができる。
同様に、遺伝子編集は、ＡｐｏＥ３に対する用量依存性の応答を示す。図４Ｂは、マウス血清を６％（ｖ／ｖ）で用いるか、非ヒト霊長類血清を６％（ｖ／ｖ）で用いるか、またはＡｐｏＥ３を０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、１０．０μｇ／ｍｌ、及び５０．０μｇ／ｍｌで用いてインキュベートした４００．０ｎｇのＬＮＰをトランスフェクトしたヒトＣＤ３４＋骨髄細胞について、ＮＧＳで決定したＢ２Ｍ標的の編集割合を示す。未処理のヒトＣＤ３４＋骨髄細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子座において検出可能なレベルのインデルを示さない陰性対照として使用する。生体試料数：ｎ＝３。
実施例６−血清因子とのプレインキュベーション
この実験では、多種多様な異なるアポリポタンパク質を用いてＬＮＰのプレインキュベーションを試験し、ＨＳＰＣ集団におけるＢ２Ｍノックダウンレベル及び編集頻度として測定した、ＡｐｏＥのアイソフォームを用いた場合のインビトロでのＬＮＰ取り込みを示す。トランスフェクションに先立ち、Ｍ．ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓの６％血清（ｖ／ｖ）または以下のアポリポタンパク質をさまざまな濃度で用いてＬＮＰ（識別番号ＬＮＰ９２６）を３７℃で５分間インキュベートした：組換え型ヒトＡｐｏＡ−Ｉ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＲＰ４６９３）、ヒト血漿由来ＡｐｏＢ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ５３５３）、ヒト血漿由来ＡｐｏＣ−Ｉ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ７７８５）、ヒト組換え型ＡｐｏＥ２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＲＰ４７６０）、ヒト組換え型ＡｐｏＥ３（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＲＰ４６９６）、ヒト組換え型ＡｐｏＥ４（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ３２３４）。ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞に対しＬＮＰをトータルＲＮＡカーゴが２００ｎｇという濃度（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと単一ガイドのｗ／ｗ比１：１）で加えた。トランスフェクション後第５日に、上記と同じ抗体を使用してフローサイトメトリーでタンパク質レベルでのＢ２Ｍ発現を決定した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアパッケージを使用してデータ分析を実施した。データは、１つの生体試料（Ｎ＝１）の、反復実験の平均＋／−ＳＤを表す。
図５は、カニクイザル（ｃｙｎｏ）血清、ＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４でプレインキュベートしたＬＮＰをトランスフェクションした後のＣＤ３４＋ＨＳＰＣ集団におけるＢ２Ｍノックダウンを示す。未処理、プレインキュベーションなし、ならびにＡｐｏＡ−Ｉ、ＡｐｏＢ、及びＡｐｏＣ−ＩとのプレインキュベーションではＢ２Ｍノックダウンは生じなかった。この実験において、ＡｐｏＥ２とのＬＮＰプレインキュベーションでは、ＡｐｏＥの他の２つのアイソフォームと比較して低いＢ２Ｍノックダウンが示された。
実施例７−ＬＮＰ曝露の経時変化
この実験では、ＬＮＰ曝露の持続時間を、それが生存率及び編集率に及ぼす影響について試験した。ＡＡＶＳ１を標的にするＣａｓ９ ｍＲＮＡ及びＧ５６２を送達するＬＮＰ８９９を、非ヒト霊長類の６％（ｖ／ｖ）血清と共に３７℃で約５分間プレインキュベートした。ヒトＣＤ３４＋骨髄細胞に対しＬＮＰをトータルＲＮＡカーゴが３００ｎｇという濃度（Ｃａｓ９ ｍＲＮＡと単一ガイドのｗ／ｗ比１：１）で加えた。トランスフェクション後２時間、６時間または２４時間において、細胞を遠心分離にかけ、ＬＮＰを含まない新鮮培地に再懸濁させた。３日目及び８日目にＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログＣ３６９５０）を使用してＣｙｔｏＦＬＥＸＳフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で測定し、細胞生存率を評価した。実施例１に記載のようにＮＧＳにより編集を測定した。表３及び図６Ｂは、形質導入から８日目の編集頻度を示す。表３及び図６Ａは、形質導入から３日目及び８日目の細胞生存率示す。
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配列そのものについては下記配列表を参照のこと。転写産物配列には一般に、ＡＲＣＡと共に使用するための最初の３ヌクレオチドとしてＧＧＧが含まれるか、またはＣｌｅａｎＣａｐ（商標）と共に使用するための最初の３ヌクレオチドとしてＡＧＧが含まれる。したがって、最初の３ヌクレオチドは、ワクシニアのキャッピング酵素などの、他のキャッピング手法と共に使用するために修飾され得る。プロモーター及びポリＡ配列は転写産物配列には含まれない。Ｔ７プロモーター（配列番号３１）のようなプロモーター及び配列番号６３のようなポリＡ配列は、開示の転写産物配列に５’末端及び３’末端でそれぞれ付加することができる。ほとんどのヌクレオチド配列はＤＮＡとして提供されるが、それらはＴをＵに変えることにより容易にＲＮＡに変換可能である。
配列表
以下の配列表は、本明細書に開示する配列の一覧を提供する。ＤＮＡ配列（Ｔを含む）がＲＮＡに関して参照される場合は、ＴをＵに置き換えなければならず（状況に応じて修飾の場合と非修飾の場合がある）、その逆の場合は、逆の置き換えをしなければならないと理解される。
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Claims (99)

  1. 造血幹及び／または前駆細胞（ＨＳＰＣ）またはＨＳＰＣ集団にｍＲＮＡを送達する方法であって、
    ａ．前記ｍＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記ＨＳＰＣまたは前記ＨＳＰＣ集団とをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記ＨＳＰＣまたは前記ＨＳＰＣ集団をインビトロで培養し、
    それにより、前記ＨＳＰＣまたは前記ＨＳＰＣ集団に前記ｍＲＮＡを送達することを含む、前記方法。
  2. ＨＳＰＣにｍＲＮＡを送達する方法であって、
    ａ．前記ｍＲＮＡ及びアミン脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記細胞とをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記ＨＳＰＣをインビトロで培養し、
    それにより、前記ＨＳＰＣに前記ｍＲＮＡを送達することを含む、前記方法。
  3. 幹細胞または幹細胞集団にｍＲＮＡを送達する方法であって、
    ａ．前記ｍＲＮＡを含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記幹細胞集団とをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記幹細胞集団をインビトロで培養し、
    それにより、前記幹細胞集団に前記ｍＲＮＡを送達することを含む、前記方法。
  4. 前記ｍＲＮＡはＣａｓヌクレアーゼをコードする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
  5. ＨＳＰＣにＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを導入する方法であって、
    ａ．前記ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記ＨＳＰＣとをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記ＨＳＰＣを培養し、
    それにより、前記ＨＳＰＣに前記ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを導入することを含む、前記方法。
  6. インビトロで遺伝子操作されたＨＳＰＣを作製する方法であって、
    ａ．ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、アミン脂質、ヘルパー脂質、中性脂質、及びＰＥＧ脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記ＨＳＰＣとをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記ＨＳＰＣをインビトロで培養し、
    それにより、遺伝子操作されたＨＳＰＣを作製することを含む、前記方法。
  7. 幹細胞にＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを導入する方法であって、
    ａ．前記ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及びアミン脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記幹細胞とをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記幹細胞を培養し、
    それにより、前記幹細胞に前記ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ及びｇＲＮＡを導入することを含む、前記方法。
  8. インビトロで遺伝子操作されたＨＳＰＣなどの幹細胞を作製する方法であって、
    ａ．ＣａｓヌクレアーゼｍＲＮＡ、ｇＲＮＡ、及び生分解性脂質を含むＬＮＰ組成物を血清因子とプレインキュベートし、
    ｂ．前記プレインキュベートしたＬＮＰ組成物と前記細胞とをインビトロで接触させ、かつ
    ｃ．前記細胞をインビトロで培養し、
    それにより、遺伝子操作されたＨＳＰＣなどの幹細胞を作製することを含む、前記方法。
  9. 前記ＬＮＰ組成物はさらにｇＲＮＡを含む、請求項４に記載の方法。
  10. 前記Ｃａｓヌクレアーゼはクラス２Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項４〜９のいずれかに記載の方法。
  11. 前記クラス２ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼはＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記クラス２ＣａｓヌクレアーゼはＣｐｆ１ヌクレアーゼである、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記ｇＲＮＡは二重ガイドＲＮＡ（ｄｇＲＮＡ）である、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
  15. 前記ｇＲＮＡは単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である、請求項５〜１３のいずれかに記載の方法。
  16. 前記接触ステップの後で洗浄ステップをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  17. 前記接触ステップは約１分〜約７２時間かかる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  18. 前記接触ステップは約１分〜約２４時間かかる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  19. 前記接触ステップは約２時間〜約２４時間である、請求項１７または１８に記載の方法。
  20. 前記接触ステップは約４時間〜約１２時間である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記接触ステップは約６時間〜約１２時間である、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
  22. トランスフェクション後の細胞生存は少なくとも６０％である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  23. トランスフェクション後の細胞生存は少なくとも７０％である、請求項２２に記載の方法。
  24. トランスフェクション後の細胞生存は少なくとも８０％である、請求項２２に記載の方法。
  25. トランスフェクション後の細胞生存は少なくとも９０％である、請求項２２に記載の方法。
  26. トランスフェクション後の細胞生存は少なくとも９５％である、請求項２２に記載の方法。
  27. 前記血清因子及び前記ＬＮＰ組成物を約３０秒〜一晩プレインキュベートすることをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  28. 約１分〜１時間プレインキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
  29. 約１〜３０分間プレインキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
  30. 約１〜１０分間プレインキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
  31. 約５分間プレインキュベートすることを含む、請求項２７に記載の方法。
  32. ５分±２分間プレインキュベートすることを含む、請求項２７または請求項３１に記載の方法。
  33. 前記プレインキュベートは約４℃にて生じる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  34. 前記プレインキュベートは約２５℃にて生じる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  35. 前記プレインキュベートは約３７℃にて生じる、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  36. 前記プレインキュベートステップは緩衝液を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  37. 前記緩衝液はＨＳＰＣ用培地を含むかまたはそれからなる、請求項３６に記載の方法。
  38. 前記ＬＮＰ組成物を血清とプレインキュベートする、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  39. 前記血清は、哺乳類、マウス、霊長類、またはヒトの血清である、請求項３８に記載の方法。
  40. 前記ＬＮＰ組成物と単離された血清因子とをプレインキュベートする、請求項１〜３７のいずれかに記載の方法。
  41. 前記血清因子はＡｐｏＥである、請求項４０に記載の方法。
  42. 前記血清因子はＡｐｏＥ２、ＡｐｏＥ３、及びＡｐｏＥ４から選ばれる、請求項４０に記載の方法。
  43. 前記ＡｐｏＥはヒト組換えタンパク質である、請求項４０〜４２のいずれかに記載の方法。
  44. 培養ステップは、前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団をＨＳＰＣ培養用緩衝液中で増殖させることを含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  45. 前記接触ステップと培養ステップとで前記培地を変えることをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  46. 前記培養ステップは幹細胞増殖因子を含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  47. 前記ＨＳＰＣは造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項１〜２、４〜６、または８〜４６のいずれかに記載の方法。
  48. 前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団はヒトの細胞または試料である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  49. 前記ｍＲＮＡと前記ガイドＲＮＡ核酸とを単一のＬＮＰ組成物に製剤化する、請求項５〜４８のいずれかに記載の方法。
  50. 前記ｍＲＮＡ及び前記ｇＲＮＡを前記ＬＮＰ組成物に共封入する、請求項５〜４８のいずれかに記載の方法。
  51. 前記ｍＲＮＡ及び前記ｇＲＮＡを別々のＬＮＰに封入する、請求項５〜４８のいずれかに記載の方法。
  52. 前記ｍＲＮＡを第１のＬＮＰ組成物に製剤化し、前記ガイドＲＮＡ核酸を第２のＬＮＰ組成物に製剤化する、請求項５〜４８のいずれかに記載の方法。
  53. 前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を同時に投与する、請求項５２に記載の方法。
  54. 前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を逐次投与する、請求項５２に記載の方法。
  55. 前記プレインキュベーションステップの前に前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を合わせる、請求項５２〜５４のいずれかに記載の方法。
  56. 前記第１及び第２のＬＮＰ組成物を別々にプレインキュベートする、請求項５２〜５４のいずれかに記載の方法。
  57. 前記細胞に鋳型核酸を導入することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  58. 前記ＬＮＰ組成物はＲＮＡ成分と脂質成分とを含み、ここで、前記脂質成分はアミン脂質、中性脂質、ヘルパー脂質、及びステルス脂質を含み、かつ、Ｎ／Ｐ比は約１〜１０である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  59. 前記脂質成分はリピドＡまたはそのアセタール類似体を含む、請求項５８に記載の方法。
  60. 前記脂質成分は、
    約４０〜６０モル％のアミン脂質と、
    約５〜１５モル％の中性脂質と、
    約１．５〜１０モル％のＰＥＧ脂質
    とを含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３〜１０である、請求項５８に記載の方法。
  61. 前記脂質成分は、
    約５０〜６０モル％のアミン脂質と、
    約８〜１０モル％の中性脂質と、
    約２．５〜４モル％のＰＥＧ脂質
    とを含み、ここで、前記脂質成分の残部はヘルパー脂質であり、
    前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３〜８である、請求項５８に記載の方法。
  62. 前記脂質成分は、
    約５０〜６０モル％のアミン脂質と、
    約５〜１５モル％のＤＳＰＣと、
    約２．５〜４モル％のＰＥＧ脂質
    とを含み、ここで、前記脂質成分の残部はコレステロールであり、
    前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は約３〜８である、請求項５６に記載の方法。
  63. 前記脂質成分は、
    ４８〜５３モル％のリピドＡと、
    約８〜１０モル％のＤＳＰＣと、
    １．５〜１０モル％のＰＥＧ脂質
    とを含み、ここで、前記脂質成分の残部はコレステロールであり、
    前記ＬＮＰ組成物のＮ／Ｐ比は３〜８±０．２である、請求項５８に記載の方法。
  64. 前記ＲＮＡは修飾ＲＮＡである、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  65. 前記修飾ＲＮＡは修飾ｍＲＮＡである、請求項６４に記載の方法。
  66. 前記ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、前記オープンリーディングフレームはウリジン含量が、その最小ウリジン含量から、前記最小ウリジン含量の１５０％までの範囲である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  67. 前記ＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含み、ここで、前記オープンリーディングフレームはウリジンジヌクレオチド含量が、その最小ウリジンジヌクレオチド含量から、前記最小ウリジンジヌクレオチド含量の１５０％までの範囲である、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
  68. 前記ＲＮＡは、配列番号１、４、１０、１４、１５、１７、１８、２０、２１、２３、２４、２６、２７、２９、３０、５０、５２、５４、６５、または６６のいずれか１つに対する同一性が少なくとも９０％である配列を含み、ここで、前記ｍＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合因子をコードするオープンリーディングフレームを含む、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
  69. 前記ｇＲＮＡは修飾ｇＲＮＡである、請求項５〜６８のいずれかに記載の方法。
  70. 前記ｇＲＮＡは、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド間のホスホロチオアート（ＰＳ）結合、及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）修飾ヌクレオチドから選ばれる修飾を含む、請求項６９に記載の方法。
  71. 前記ｇＲＮＡは、５’末端の最初の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾を含む、請求項６９または７０に記載の方法。
  72. 前記ｇＲＮＡは、３’末端の最後の５ヌクレオチドの１つ以上における修飾を含む、請求項６９〜７１のいずれかに記載の方法。
  73. 前記ｇＲＮＡは、最初の４ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、請求項６９〜７２のいずれかに記載の方法。
  74. 前記ｇＲＮＡは、最後の４ヌクレオチド間にＰＳ結合を含む、請求項６９〜７３のいずれかに記載の方法。
  75. ５’末端の最初の３ヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項６９〜７４のいずれかに記載の方法。
  76. ３’末端の最後の３ヌクレオチドに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾ヌクレオチドをさらに含む、請求項６９〜７５のいずれかに記載の方法。
  77. 前記ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団はＣＤ３４＋である、請求項１〜２、４〜６、または８〜７６に記載の方法。
  78. 前記ＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団はＣＤ３４＋ＣＤ９０＋である、請求項１〜２、４〜６、または８〜７７に記載の方法。
  79. 先行請求項のいずれかに記載の方法により作製される、工学的に操作された幹細胞または幹細胞集団。
  80. 先行請求項のいずれかに記載の方法により作製される、工学的に操作されたＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団。
  81. 前記工学的に操作されたＨＳＰＣは、例えば、工学的に操作されたＨＳＰＣの移植後などに、患者体内の組織または臓器内、例えば、骨髄、血液、または他の組織内に存在する、請求項７８に記載のＨＳＰＣまたはＨＳＰＣ集団。
  82. 前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団は、前記細胞を投与されるべき患者に関して自己由来である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  83. 前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団は、前記細胞を投与されるべき患者に関して同種である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  84. 前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子編集を達成することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  85. 前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団において遺伝子編集を検出することをさらに含む、先行請求項のいずれかに記載の方法。
  86. 前記遺伝子編集は、編集率またはＤＮＡ修飾率として測定される、請求項８４または８５に記載の方法。
  87. 前記編集率は少なくとも４０％である、請求項８６に記載の方法。
  88. 前記編集率は少なくとも６０％である、請求項８６に記載の方法。
  89. 前記編集率は少なくとも７０％である、請求項８６に記載の方法。
  90. 前記編集率は少なくとも８０％である、請求項８６に記載の方法。
  91. 前記編集率は少なくとも９０％である、請求項８６に記載の方法。
  92. 前記編集率は少なくとも９５％である、請求項８６に記載の方法。
  93. 前記ＤＮＡ修飾率は少なくとも４０％である、請求項８６に記載の方法。
  94. 前記ＤＮＡ修飾率は少なくとも６０％である、請求項８６に記載の方法。
  95. 前記ＤＮＡ修飾率は少なくとも７０％である、請求項８６に記載の方法。
  96. 前記ＤＮＡ修飾率は少なくとも８０％である、請求項８６に記載の方法。
  97. 前記ＤＮＡ修飾率は少なくとも９０％である、請求項８６に記載の方法。
  98. 前記ＤＮＡ修飾率は少なくとも９５％である、請求項８６に記載の方法。
  99. 前記幹細胞、ＨＳＰＣ、またはＨＳＰＣ集団は骨髄試料由来である、先行請求項のいずれかに記載の方法。
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