JP7271374B2 - 分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置。 - Google Patents

分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置。 Download PDF

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Description

本発明の実施形態は、分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置に関する。
疾患の治療や化粧品の分野において目的物質（薬剤、美容成分等）を細胞に送達する方法として、目的物質を脂質膜に内包した脂質粒子を作製し、それを細胞に接触させる方法がある。
脂質粒子は、例えば、脂質膜の材料となる脂質と、目的物質とを溶液中で混合することによって製造される。製造された粒子群の品質は、目的物質の封入率によって評価されている。封入率は、脂質粒子に内包されずに溶液中に残留した目的物質量を測定し、次の式に代入することによって得られる。
封入率＝（（投入した目的物質全量）－（溶液中に残留した目的物質量））／（投入した目的物質全量）
封入率が高いほど、より多くの目的物質が脂質粒子に内包されたことを示すため、品質が高いとされる。また、封入率が一定になるように品質管理することが推奨されている。
国際公開第２０１５／１６６９８６号 特開２００８－１０６００１号公報
本発明は、より正確且つ簡便に脂質粒子の品質を評価することができる分析方法、分析基体、分析キット及び分析装置を提供することを目的としている。
実施形態に従う分析方法は、脂質粒子群中の目的物質を内包する脂質粒子の存在率を決定する方法である。本方法は、脂質粒子群を含む溶液に光を照射する照射工程、脂質粒子群に含まれる脂質粒子から得られる散乱光を検出し、溶液に含まれる全脂質粒子の個数、目的物質を内包する脂質粒子の個数、及び目的物質を内包しない脂質粒子の個数のうち少なくとも２つを計測する計測工程、並びに計測工程の結果から、式（Ｉ）（目的物質を内包する脂質粒子の存在率＝目的物質を内包する脂質粒子の個数／溶液に含まれる全脂質粒子の個数）により目的物質を内包する脂質粒子の存在率を算出する算出工程を含む。
図１は、実施形態の脂質粒子群の一例を示す模式図である。 図２は、第１実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図３は、第１実施形態の分析方法の一例を示す模式図である。 図４は、第１実施形態の分析装置の一例を示すブロック図である。 図５は、第１実施形態の分析基体の一例を示す平面図である。 図６は、第１実施形態の分析基体の検出装置を示す平面図である。 図７は、第１実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図８は、第１実施形態の分析装置の一例を示すブロック図である。 図９は、第２実施形態の分析方法の一例を示すフローチャートである。 図１０は、第２実施形態における散乱光強度と脂質粒子個数との関係の一例を示すグラフである。 図１１は、例１の実験結果を示すグラフである。 図１２は、例２の実験結果を示すグラフである。
以下に、図面を参照しながら種々の実施形態について説明する。各図は実施形態とその理解を促すための模式図であり、その形状や寸法、比などは実際と異なる箇所があるが、これらは以下の説明と公知の技術を参酌して適宜、設計変更することができる。
・第１実施形態
（分析方法）
第１実施形態の分析方法は、脂質粒子群を含む溶液において、目的物質を内包する脂質粒子の存在率を決定する方法である。
図１に示すように、脂質粒子群１は、複数の脂質粒子４を含む。脂質粒子４は、脂質膜３中に目的物質２を内包する脂質粒子４ａ（以下、「内包粒子」とも称する）及び／又は目的物質２を内包しない脂質粒子４ｂ（以下、「非内包粒子」とも称する）を含み得る。
脂質膜３は、複数の脂質分子が非共有結合で配列してできた脂質膜からなる、略球状の中空体である。
目的物質２は限定されるものではないが、例えば、核酸、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、低分子化合物、抗体又は抗原結合性断片等である。目的物質２は、例えば、医薬（治療薬若しくは診断薬等）、美容成分又は細胞に導入するための遺伝子などであってもよい。
脂質粒子群１に含まれる各脂質粒子４の粒径は、例えば、１μｍ未満が望ましい。脂質粒子の粒径は、例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ）や電気的検知帯法を用いて計測することができる。
脂質粒子群１を含む溶液は、液体中で脂質膜３の材料と目的物質２と（必要に応じて脂質膜３に内包させる他の物質と）を混合することによって得られたものであり得る。或いは、このようにして得られた液体混合物から脂質粒子群１を分離し、他の溶媒に添加したものであってもよい。
当該溶液は、目的物質２を細胞に導入するための試薬、医薬品又は化粧品等であってもよく、或いはこれらの薬、医薬品又は化粧品等を製造する際に得られる製造途中の粗生成物又は製造ロットから一部サンプリングされたもの等であってもよい。
実施形態の分析方法は、図２に示すとおり、例えば、次の工程を含む。
（Ｓ１）脂質粒子群１を含む溶液と、目的物質２と結合して蛍光を生じる色素を含み、且つ脂質膜透過性である第１物質とを混合する混合工程
（Ｓ２）得られた混合物に前記色素から蛍光を生じさせる励起光を照射する照射工程、
（Ｓ３）散乱光を検出し、散乱光が得られた脂質粒子４、即ち、全脂質粒子の個数を計測する第１計測工程
（Ｓ４）蛍光を検出し、蛍光が得られた脂質粒子４、即ち、目的物質２を内包する脂質粒子（内包粒子４ａ）の個数を計測する第２計測工程、並びに
（Ｓ５）計測工程の結果から、式（Ｉ）（内包粒子４ａの存在率＝内包粒子４ａの個数／全脂質粒子の個数）により前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を算出する算出工程。
以下、各工程について図３を用いて詳細に説明する。
混合工程（Ｓ１）において脂質粒子群１を含む溶液と混合する第１物質５は、例えば、目的物質２と結合する結合部位と、色素とを含む。例えば、第１物質５は、２種の物質、例えば、結合部位を含む物質と色素とを連結したものであってもよい。又は、結合部位と色素との両方を含む１種の物質を用いてもよい。そして、第１物質５は全体として脂質膜透過性を有する。
色素は、目的物質２と結合していないときは蛍光を生じず、目的物質２と結合したときに蛍光を生じる物質である。或いは、詳しくは後述するが、色素は、目的物質２と結合したときと結合しないときとで波長の異なる蛍光を生じる物質であってもよい。
第１物質５が脂質膜透過性であることから、第１物質５は内包粒子４ａ及び非内包粒子４ｂの脂質膜３を透過してその中に入り込む。そして、内包粒子４ａにおいては第１物質５と目的物質２とが結合する。
次に、照射工程（Ｓ２）において当該混合物に色素を励起し蛍光を生じさせる励起光を照射する。照射工程（Ｓ２）において照射する光は、脂質粒子４から散乱光を生じさせるとともに、色素を励起し蛍光を生じさせる励起光である。
光の照射により、脂質粒子群１に含まれる脂質粒子４において光が当たって散乱し得る。
したがって、照射工程（Ｓ２）を行いながら、脂質粒子４から得られる散乱光を検出し、散乱光６ａが得られた脂質粒子４の個数を計数することによって、全脂質粒子の個数が得られる（第１計測工程（Ｓ３））。
また、光の照射により、第１物質５の色素が励起される。その結果、内包粒子４ａから蛍光６ｂが得られる。一方、非内包粒子４ｂでは蛍光は生じない。
したがって、照射工程（Ｓ２）を行いながら、蛍光６ｂを検出し、蛍光６ｂが得られた脂質粒子４の個数を計測することによって、内包粒子４ａの個数が得られる（第２計測工程（Ｓ４））。次に、算出工程（Ｓ５）において、全脂質粒子の個数、内包粒子４ａの個数を用いて、例えば、次の式（Ｉ）によって、内包粒子４ａの存在率を算出することができる。
内包粒子の存在率＝内包粒子４ａの個数／全脂質粒子の個数 …（Ｉ）
以上のようにして、内包粒子４ａの存在率を決定することができる。内包粒子４ａの存在率は、脂質粒子群１の品質を評価するための新規の指標となる。
従来は、脂質粒子の品質評価の指標として、脂質粒子に内包されずに溶液中に残留した目的物質量を測定することで得られる封入率を用いていた。例えば、目的物質２が核酸である場合、溶液部分の濁度により残留核酸量を推定する。したがって、この方法は脂質粒子に内包された目的物質の量から脂質粒子群の品質を評価するものであった。
一方で、実施形態の分析方法によれば、全脂質粒子の個数と内包粒子４ａの個数とを直接に計測することができる。本発明者らは、実施形態の内包粒子４ａの存在率の方が細胞への目的物質２の送達効率との相関が高く、一方で従来の封入率は目的物質２の送達効率との相関が低いことを見出した。このことは、目的物質２がどれだけ脂質粒子に内包されているかよりも、目的物質２を内包する粒子の存在率の方が、目的物質２の送達効率に及ぼす影響が大きいことを示している。したがって、実施形態の内包粒子４ａの存在率は、より正確に脂質粒子群１の品質を評価することができる新規の指標となり得る。
また、以上の理由から、脂質粒子群１の製造において従来の封入率が一定となるように品質管理したとしても、内包粒子４ａの存在率が一定であるとは限らないため、細胞への送達効率にはばらつきが生じる可能性がある。一方、実施形態に従う方法により内包粒子４ａの存在率が一定となるように品質管理すれば、細胞への導入効率がより安定した脂質粒子群１を製造することができる。
また、従来のような溶液中に残留した目的物質量の測定は、溶液の組成などによっては正確に測定できるとは限らないが、実施形態の方法によれば、内包粒子４ａの個数を直接計数することができるため、従来と比較してより正確な情報を得ることができる。
以上のことから、実施形態の分析方法によれば、より正確に脂質粒子群１の品質を評価するための新規の指標（内包粒子４ａの存在率）と、それを決定するための簡便な方法が提供される。
以下、実施形態の方法に用いられる各材料や手順の詳細について説明する。
脂質膜３の材料として用いられる脂質分子は、例えば、生体膜の主成分である脂質分子である。脂質分子は、リン脂質又はスフィンゴ脂質、例えば、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン又はセレブロシド、或いはこれらの組み合わせ等である。
脂質膜３は、他の成分を更に含んでもよい。他の成分は、例えば、脂質膜３の酸解離定数を調節する成分、脂質膜３の粒径を制御するための成分、目的物質２の内包量を高めるための成分、脂質膜３を細胞と融合しやすくするための成分、及び／又は目的物質２を細胞に導入しやすくする成分等を含む。
脂質膜３は、脂質単分子膜であってもよいし、脂質二重膜であってもよい。また、脂質粒子は、一層の膜からなっていてもよいし、多重層の膜からなっていてもよい。脂質膜３は、リポソーム、ベシクル又はカプセル等と呼ばれる脂質からなる粒子であってもよい。
目的物質２は、１種類の物質からなってもよいし、複数の物質からなってもよい。
脂質粒子４は、目的物質２の他に更なる物質を内包していてもよく、例えば、目的物質２を脂質膜３に内包しやすくする薬剤、目的物質２の内包量を高める薬剤及び／又は目的物質２を細胞に導入しやすくする薬剤等を含んでもよい。
第１物質５の種類は、目的物質２の種類に応じて選択される。第１物質５は限定されるものではなく、目的物質２と結合する結合部位を有し、当該結合により蛍光を発する色素を有し、脂質膜透過性である何れの物質も用いることができる。
第１物質５として、このような性質が知られているか、若しくは推測される物質、又はその組み合わせを用いてもよい。或いは、第１物質５の候補物質について、目的物質２への結合性又は脂質膜透過性が未知である場合、それらを調査することにより、第１物質５を決定してもよい。
目的物質２への結合性を有するか否かは、例えば、電気泳動、カラムクロマトグラフィー、ドットブロット、表面プラズモン共鳴測定、又は円偏光二色性スペクトル測定等の方法により調査することができる。
脂質膜透過性を有するか否かは、例えば、人工的な膜上に脂質膜３の材料となる脂質を塗布し透過性を測定する並行人工膜透過性試験（parallel artificial membrane permeability assay）や、生細胞を使って細胞内への透過性を測定する方法などによって調査することができる。並行人工膜透過性試験は、脂質を塗布したメンブランフィルターなどの多孔性のシートによって空間が分離された容器の一方の空間を候補物質を含む溶液で満たし、他方の空間を候補分子を含まない溶液で満たし、候補物質が他方の空間に移行するかどうかを調べることにより脂質膜透過性を調査する。ここで用いられる脂質膜は、穴あきがなるべく少ない脂質膜であることが好ましく、脂質は脂質膜３に使用するものと同一であることが好ましい。また、生細胞を使用する方法においては、動物細胞、たとえば、ヒト結腸癌由来の細胞株であるＣｏｃｏ－２などを候補物質と接触させ、顕微鏡等で観察し、細胞膜内で蛍光が観察された場合に脂質膜透過性を有すると判断することができる。
第１物質５の結合部位の種類は限定されるものではなく、目的物質２と水素結合、イオン結合、ファンデル・ワールス力による結合又は疎水性結合等により結合する何れかの結合部位を有する物質等を用いることができる。
例えば、目的物質２が核酸である場合、第１物質５は、核酸結合性染色剤である。核酸結合性染色剤として、例えば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ又はＡｃｃｕＢｌｕｅ等を用いることができる。或いは、第１物質５の結合部位として、目的物質２である核酸とハイブリダイズする配列を有する核酸等を用いることができる。この核酸は、例えば、脂質膜透過能を有するように修飾されている。
目的物質２が抗原である場合、第１物質５の結合部位は、蛍光色素で標識した抗原結合タンパク質であってもよい。抗原結合タンパク質は、例えば、抗体又はその断片であってもよく、脂質膜透過能を有するように修飾され、及び／又は大きさを調節されている。
目的物質２が酵素の基質である場合、第１物質５の結合部位は、対応する酵素又はその結合部位を有する断片等であってもよい。
第１物質５の結合部位は、目的物質２に対応する受容体又はその結合部位を有する断片等であってもよい。
或いは、上記の目的物質２と第１物質５の結合部位との組み合わせは、上記組み合わせの反対であってもよい。例えば、目的物質２が抗原結合タンパク質で、第１物質の結合部位が抗原であってもよい。その他の組み合わせについても同様である。
色素の種類は限定されるものではなく、一般的な蛍光センサなどで検出できる範囲の波長を有するものであればよい。
色素として、目的物質２と第１物質５とが結合したときとしないときとで波長が異なる蛍光を生じる物質を用いることもできる。例えば、目的物質２との結合により蛍光共鳴エネルギー移動（Fluorescence resonance energy transfer：ＦＲＥＴ）が生じ、蛍光波長が変化する色素を用いてもよい。蛍光波長が変化する色素を用いる場合、照射工程（Ｓ２）において照射する励起光は、結合により変化した後の蛍光を励起するものである。その結果、第１計測工程（Ｓ３）において全ての脂質粒子４から散乱光が得られ、第２計測工程（Ｓ４）において内包粒子４ａから蛍光が得られる。
第１計測工程（Ｓ３）は、例えば、照射工程（Ｓ２）を行いながら散乱光を検出できる検出装置（例えば、カメラ、顕微鏡等）で混合工程（Ｓ１）により得られた混合物を撮影して画像化し、画像中の散乱光が得られた箇所を計数する方法により行われてもよい。或いは、流路に脂質粒子群１を流し、流路の特定の領域に励起光を照射し（照射工程（Ｓ２））、その領域で経時的に散乱光を光センサで検出して、散乱光が検出された回数を粒子が通過した回数としてカウントして、脂質粒子の個数を計数してもよい。
第２計測工程（Ｓ４）は、散乱光が蛍光であることを除いて、上記第１計測工程（Ｓ３）と同様の方法で行うことができる。本工程で用いられ得る検出装置は、所望の蛍光波長を検出するためのフィルターを備え得る。
第１計測工程（Ｓ３）及び第２計測工程（Ｓ４）では、必ずしも溶液全体において脂質粒子数を計測する必要はなく、溶液の一部について全脂質粒子の個数及び内包粒子４ａの個数を計測し、その値を代表値として用いて内包率を算出し、それを溶液全体の内包率としてもよい。例えば、溶液の一部を撮影した画像等を用いてもよい。例えば、それらの個数の値から、溶液の単位体積当たりの全脂質粒子の個数及び内包粒子４ａを算出して内包率を算出してもよい。また、溶液の一部について複数回存在率を計測し、その平均値を当該溶液における存在率としてもよい。
上記の照射工程（Ｓ２）、第１計測工程（Ｓ３）及び第２計測工程（Ｓ４）は、例えば、散乱光と蛍光とを両方測定できる装置を用いて一度に行ってもよい。そのような装置として、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）法を用いた装置等を用いることが可能である。
（分析装置・分析基体）
実施形態の分析方法は、分析装置によって行われてもよい。
図４に示す通り、分析装置１０は、例えば分析基体１００と、記憶部２０と、処理部３０と、送液部４０と、表示部５０とを備える。
まず分析基体１００について図５を用いて説明する。図５に示す通り、分析基体１００は、基板１０１と、基板１０１上に設けられ、上流側の端が２つに分岐した流路１０２と、流路１０２の下流側に設けられた検出装置１０３とを備える。分析基体１００はその機能にしたがって３つの部分に分けられる。即ち、分析基体１００は、流路１０２の上流側の端を含む混合部１０４と、流路１０２の下流側の端を含み、検出装置１０３を備える検出部１０６と、混合部１０４と検出部１０６との間に設けられた分離部１０５とからなる。
混合部１０４は、試料注入口１０７と試薬注入口１０８とを有する。試料注入口１０７を有する端から延びる流路１０２ａと、試薬注入口１０８を有する端から延びる流路１０２ｂとが合流して１つの流路１０２つながっている。
試料注入口１０７は、脂質粒子群１を含む溶液を流路１０２内に注入するための開口である。また、試薬注入口１０８は、第１物質５を含む溶液を流路１０２内に注入するための開口である。
流路１０２は、分離部１０５へと続いている。分離部１０５において、流路１０２内には図示しない分離剤が充填されている。分離剤は、そこを通過する脂質粒子４が、その粒径に応じて移動速度を変化させるような材料である。分離剤として、例えば、ナノピラー、ゲル、ナノメッシュ又は多孔質剤等を用いることができる。流路１０２は、更に検出部１０６へと続いている。
検出部１０６は、流路１０２の第１測定領域Ｒに設けられた検出装置１０３を備える。検出装置１０３は、図６に示す通り、流路１０２の少なくとも第１測定領域Ｒ内の脂質粒子群１に励起光１１０を照射するように構成された光源１０９と、第１測定領域Ｒの流路１０２の側面に沿って設けられた散乱光検出部１１１と蛍光検出部１１２とを備える。
散乱光検出部１１１は、流路１０２内の脂質粒子群１の散乱光を検出できるように配置された散乱光センサ（図示せず）、例えばＣＭＯＳイメージセンサを備える。
蛍光検出部１１２は、流路１０２内の脂質粒子群１の散乱光を検出できるように配置された蛍光センサ（図示せず）、例えばＣＭＯＳイメージセンサを備える。例えば、蛍光センサは、流路１０２側にフィルター１１３を備える。
散乱光検出部１１１及び蛍光検出部１１２の配置される場所は、図６に示すような流路１０２を挟んで向かい合うような配置に限定されるものではない。流路１０２内の脂質粒子群１から光が検出できる限り何れの配置であってもよく、例えば、両方が流路１０２の同じ側の側面に沿って設けられており、一方が上流側、他方が下流側に配置されてもよい。
図５に示すように、流路１０２の下流側の末端には排出口１１４が設けられている。
分析基体１００は、分離部１０５を備えなくともよい。しかしながら、分離部１０５を備えることにより、脂質粒子４の粒径の情報も正確に得ることができる。
分析基体１００は、例えば、分析装置１０に抜き差し可能に取り付けられ得る。
次に分析装置１０の他の構成について図４を用いて説明する。
記憶部２０は、分析基体１００と電気的に接続されており、散乱光検出部１１１から得られた散乱光測定データ２１（例えば、脂質粒子群１から得られる散乱光を撮影した画像若しくは映像、散乱光強度及び／又は散乱光が得られた回数等）、蛍光検出部１１２から得られた蛍光測定データ２２（例えば、脂質粒子群１から得られる蛍光を撮影した画像若しくは映像、蛍光強度及び／又は蛍光が得られた回数等）、及び散乱光測定データ２１から全粒子の個数を計測し、蛍光測定データ２２から内包粒子４ａの個数を計測するための個数演算式２３、全粒子個数データ２４、内包粒子個数データ２５、各個数データから内包粒子４ａの存在率を算出するための存在率演算式２６、内包粒子４ａの存在率２７及び／又は各部を制御するためのプログラムＰ等を含む。
処理部３０は、記憶部２０と電気的に接続されており、個数演算部３１及び存在率演算部３２等を備える。個数演算部３１は、例えば、個数演算式２３を用いて散乱光測定データ２１から全粒子の個数を計測し、蛍光測定データ２２から内包粒子４ａの個数を計測する。存在率演算部３２は、例えば、存在率演算式２６を用いて全粒子の個数データ２４及び内包粒子の個数データ２５から内包粒子４ａの存在率を算出する。
表示部５０は、処理部３０と電気的に接続されており、ディスプレイ又はプリンター等を備え得る。
また分析装置１０は、分析装置１０の各操作を開始又は停止するために操作者が入力する入力部（図示せず）を備えてもよい。入力部は、例えば処理部３０と電気的に接続されたボタン、キーボード等を備え、処理部３０は入力された信号に基づいて、各部に指示を送り得る。表示部５０はタッチパネル式の入力部を兼ね備えてもよい。
記憶部２０、処理部３０、表示部５０及び入力部は、コンピュータであってもよい。
送液部４０は、試料貯蔵部、試薬貯蔵部、管及びポンプ等を有する（図示せず）。例えば、試料貯蔵部は、試料注入口１０７と管を介して連結し、脂質粒子群１を含む溶液を貯蔵する。試薬貯蔵部は、試薬注入口１０８と管を介して連結し、第１物質５を含む溶液を貯蔵する試薬貯蔵部を有する。ポンプは、管の何れかの位置に設けられ、各貯蔵部から各溶液をそれぞれ対応する注入口へと送液するように構成される。
次に、分析装置１０を用いた分析方法について説明する。
まず、試料貯蔵部に分析対象である脂質粒子群１を含む溶液を収容しておく。また、試薬貯蔵部に第１物質５を含む溶液を収容しておく。分析基体１００を分析装置１０に取り付けて、送液部４０のポンプを駆動し、試料貯蔵部及び試薬貯蔵部から脂質粒子群１を含む溶液及び第１物質５を含む溶液をそれぞれ試料注入口１０７及び試薬注入口１０８を介して流路１０２に送液する。それにより、脂質粒子群１を含む溶液と第１物質５を含む溶液とが混合される。
脂質粒子群１を含む溶液と、第１物質５とは事前に混合しておいてもよく、その混合物を試料注入口１０７及び／又は試薬注入口１０８から注入してもよい。またその場合は、流路１０２が上流側で分岐せず、注入口を１つ備える分析基体を用いてもよい。
次に、送液部４０によって流路１０２に更なる溶液を注入するか、排出口１１４からの吸引を行うことにより、混合物を分離部１０５を経て検出部１０６に送液する。分離部１０５を通過した脂質粒子は、粒径が小さい順（又は大きい順）で検出部１０６へと流れていく。
次に、検出部１０６の検出装置１０３において、光源１０９から励起光を照射し、散乱光検出部１１１によって流路１０２内の脂質粒子群１から散乱光を測定し、散乱光測定データ２１を得る。また、蛍光検出部１１２によって蛍光を測定し、蛍光測定データ２２を得る。
例えば、分析基体１００は散乱光検出部１１１及び蛍光検出部１１２とそれぞれ接続された図示しないパッドを備え、各パッドから散乱光測定データ２１及び蛍光測定データ２２が取り出され、それらは記憶部２０に格納される。
次に、処理部３０の個数演算部３１において、記憶部２０から散乱光測定データ２１及び個数演算式２３が取り出され個数演算式２３に基づいて全脂質粒子の個数が算出される。全粒子個数データ２４は記憶部２０に格納される。また、記憶部２０から蛍光測定データ２２及び個数演算式２３が取り出され、個数演算式２３に基づいて内包粒子４ａの個数が算出される。内包粒子個数データ２５は記憶部２０に格納される。
次に、処理部３０の存在率演算部３２において、記憶部２０から全粒子の個数データ２４、内包粒子の個数データ２５及び存在率演算式２６が取り出され、内包粒子４ａの存在率２７が算出される。存在率２７は、記憶部２０に格納され、表示部５０に存在率２７が表示される。
上記各手順は、プログラムＰにより自動的に行われてもよいし、本装置の操作者の入力部への手動入力等にしたがって行われてもよい。
分析方法が終了した後、分析基体１００は分析装置１０から取り外され、廃棄され得る。再度分析方法を行う場合は、新しい分析基体１００が用いられ得る。
分析装置は、必ずしも分析基体１００を含む必要はなく、備え付けの試料収容部（例えば、流路）、光源、散乱光センサ及び／又は蛍光センサを含む構成としてもよい。
（分析キット）
第１実施形態によれば、分析基体１００及び第１物質５を含む分析キットが提供される。第１物質５は、例えば、所望の溶媒に含ませた状態で液体として提供される。溶媒は、第１物質５の種類にしたがって選択される。例えば、生理食塩水又は緩衝液等である。或いは、第１物質５は粉末の状態で提供されてもよい。
更なる実施形態において、分析方法は、脂質粒子群の品質を評価する方法であってもよく、前記式（Ｉ）により得られる内包粒子４ａの存在率を指標に脂質粒子群の品質を評価する。
このような分析方法は、図７に示すように、例えば、上記工程（Ｓ１）～（Ｓ５）と、評価工程（Ｓ６）とを含む。評価工程（Ｓ６）では、算出工程（Ｓ５）の結果から得られた存在率を指標に、脂質粒子群の品質を評価する。例えば評価工程（Ｓ６）では、存在率の閾値を予め定めておき、存在率が閾値を超える場合に脂質粒子群１の品質が良好と評価し、閾値以下である場合に脂質粒子群１の品質が不良と評価する。閾値は限定されるものではなく、脂質粒子群１の用途に応じて決定されればよい。
分析装置は、図７に示すような脂質粒子群１の評価工程を更に行うように構成されてもよい。例えば、図８に示すように、そのような分析装置１１では、記憶部２０は存在率閾値２８をさらに備え、処理部３０は評価部３３を更に備える。評価部３３は、存在率２７を存在率閾値２８と比較し、存在率２７が存在率閾値２８よりも高い場合は脂質粒子群１の品質が良好であることを表示部５０に表示し、反対に存在率閾値２８よりも低い場合は、品質が不良であることを表示部５０に表示し得る。
更なる実施形態において、分析装置１０又は分析装置１１は、例えば、脂質粒子群１を製造する装置に取り付けられてもよい。その場合、分析装置１０の送液部４０は、製造ロットから脂質粒子群１を含む溶液の一部をサンプリングして、分析基体１００の試料注入口１０７に注入するサンプリングシステムを含んでもよい。また、処理部３０は、分析装置１０又は分析装置１１で得られた存在率又は品質評価結果に基づいて製造条件パラメータの変更を行う変更部を備え、変更部は、製造装置に条件パラメータの変更の指示を送ってもよい。又は、処理部３０は、存在率又は品質評価結果に基づいて結果の良好な脂質粒子群１を最終製品として出荷準備するラインに送る指示を製造装置に送ってもよい。
以上に説明した分析方法及び分析装置により、より高品質な脂質粒子群を提供することができる。また、脂質粒子群を使用する直前に実施形態の分析方法又は分析装置を用いて脂質粒子群の評価を行うことにより、結果に応じて細胞導入効率を予測することができ、より品質の高い脂質粒子群１を選択して使用することができる。
・第２実施形態
（分析方法）
第２の実施形態に従う分析方法は、蛍光の測定を行わず、散乱光の測定により内包粒子４ａの存在率を決定する。本分析方法は、図９に示すように、次の工程を含む。
（Ｓ１１）脂質粒子群を含む溶液に光を照射する照射工程、
（Ｓ１２）脂質粒子群に含まれる各粒子から得られる散乱光を検出し、溶液に含まれる全脂質粒子の個数、内包粒子４ａの個数、及び非内包粒子４ｂの個数のうち少なくとも２つを計測する計測工程、並びに
（Ｓ１３）計測工程の結果から、式（Ｉ）（内包粒子４ａの存在率＝内包粒子４ａの個数／溶液に含まれる全脂質粒子の個数）により、内包粒子の存在率を算出する算出工程。
以下、各工程について詳細に説明する。
照射工程（Ｓ１１）において照射する光は限定されるものではなく、脂質粒子群１に含まれる各粒子から散乱光が得られるものであればよい。
計測工程（Ｓ１２）においては、例えば、各脂質粒子４から得られる散乱光の強度を検出する。散乱光の強度は、脂質粒子４の密度が高いほど大きくなり得る。内包粒子４ａは非内包粒子４ｂよりも密度が高いため、散乱光の強度がより大きくなり得る。
例えば、散乱光の強度に対する脂質粒子４の個数をグラフにすると、図１０に示すように、２つのピークが得られ得る。散乱光の強度が大きいピークＰ１は、内包粒子４ａに相当するものであり得る。したがって、ピークＰ１に属する粒子個数を内包粒子４ａの個数とすることができる。また、散乱光の強度が小さいピークＰ２は、非内包粒子４ｂに相当するものであり得る。したがって、ピークＰ２に属する粒子個数を非内包粒子４ｂの個数とすることができる。
ピークＰ１に属する粒子個数は、例えば、内包粒子４ａの存在率が既知の基準脂質粒子群を用いて散乱光の強度の閾値を決定しておき、閾値より高い範囲の粒子の数として計測することができる。反対に閾値よりも低い範囲の粒子をピークＰ２に属する非内包粒子４ｂとして計数することができる。
また、散乱光の強度に関わらず、散乱光が得られた脂質粒子４の個数は全脂質粒子の個数を表す。
以上のようにして得られた全脂質粒子の数、内包粒子４ａの個数及び非内包粒子４ｂの個数の３つの個数のうち２つを求めることによって、内包粒子４ａの存在率を計算することができる。したがって、３つの個数のうち少なくとも２つを計測すればよい。
計測工程（Ｓ１２）は、例えば、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ）法によって行うことが可能である。例えば、ＮＴＡ法による解析は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ（商品名、Malvern Panalytical社製）等の市販の計測機器によって行うことが可能である。
算出工程（Ｓ１３）は、第１実施形態の算出工程（Ｓ５）と同様に行うことができる。
この方法によれば、蛍光の検出を行わなくとも内包粒子４ａの存在率を測定することができる。
第２実施形態の分析方法も、上記評価工程（Ｓ６）と同様の評価工程を含んでもよい。
更なる実施形態によれば、計測工程（Ｓ１２）において散乱光を経時的に検出し、散乱光のブラウン運動量を更に測定してもよい。散乱光のブラウン運動量は、粒子の粒径が大きいほど大きくなる。内包粒子４ａの粒径は、非内包粒子４ｂの粒径よりも大きくなり得るため、閾値以上のブラウン運動量の粒子を内包粒子４ａとして計数し、閾値以下のブラウン運動量の粒子を非内包粒子４ｂとして計数してもよい。
更なる実施形態によれば、照射工程（Ｓ１１）の前に脂質粒子群１を含む溶液と第１物質５とを混合してもよい。この場合、検出される散乱光の強度がより高まるため、より感度よく検出することができるため好ましい。
以上に説明した第２実施形態に従う分析方法も、分析基体及び分析装置を用いて行うことが可能である。当該分析方法に用いる分析基体は、蛍光検出部１１２を含まくともよく、それ以外の構成は第１実施形態の分析基体と同様のものを用いることができる。また、個数演算部３１は、例えば、散乱光の強度や粒子のブラウン運動量から、内包粒子４ａの個数、非内包粒子４ｂの個数を計測するように構成されている。
［例］
以下に実施形態の核酸導入キャリアを製造及び使用した例について記載する。
例１．ＤＮＡ内包脂質粒子の個数の測定
ＤＮＡと脂質とを混合し、脂質粒子群を含む溶液を得た。当該溶液に、脂質膜透過性の核酸結合性染色剤（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）を添加した。ＮＴＡ装置（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｐｎａｎａｌｙｔｉｃａｌ製）を用いて粒子にレーザー光（波長４８８ｎｍ）を照射した。照射中に、各脂質粒子からの散乱光と蛍光とを測定し、各光が得られた脂質粒子の個数を計測した。散乱光又は蛍光の強度、粒子のブラウン運動の移動速度（拡散係数Ｄ）から得られた粒径、及び個数の散布図を得た（図１１）。
散乱光又は蛍光強度軸において、主に２つのピーク（Ａ及びＢ）が得られた。蛍光強度は、粒子の密度に相関することから、これはそれぞれＤＮＡ内包粒子及びＤＮＡ非内包粒子を示していると予想された。したがって、脂質膜透過性の核酸結合性染色剤を用いることにより、ＤＮＡ内包粒子及びＤＮＡ非内包粒子の個数を測定できることが明らかとなった。
例２．実施形態の方法と、封入率の測定との比較
レポーター遺伝子を含むＤＮＡを内包した脂質粒子を製造する２つのロット（ロットＡ、ロットＢ）から、それぞれ３回サンプルを採取した（それぞれ、サンプルＡ１、Ａ２、Ａ３、サンプルＢ１、Ｂ２、Ｂ３）。サンプルＡ１～Ａ３及びＢ１～Ｂ３を用いて、ｉ）核酸内包脂質粒子の存在率、ｉｉ）封入率、ｉｉｉ）ＤＮＡ発現率を調査した。
ｉ）は、例１と同様の装置を用いて散乱光が得られた粒子数を全脂質粒子の個数とし、蛍光が得られた粒子数をＤＮＡ内包粒子数として、式（Ｉ）によりＤＮＡ内包粒子数の在率を計算した。
ｉｉ）は、脂質粒子に内包されずに溶液中に残留した核酸量を測定し、封入率＝（（投入核酸量）－（残留核酸量））／（投入核酸量）の式により封入率を求めた。
ｉｉｉ）は、各サンプルを細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）に接触させてＤＮＡを細胞に導入し、レポーター遺伝子からの蛍光値を測定した。
結果を表１、図１２に示す。
Figure 0007271374000001
表１に示す通り、ｉｉｉ）ＤＮＡ発現率は、ロットＡでは２０５３．３であり、ロットＢは８６７８．７であり、ロットＡよりもロットＢの方が高かった。ｉｉ）の封入率は、ロットＡで６２．３、ロットＢで６０．０でほぼ同値であり、ｉｉｉ）の結果と相関しなかった。一方、ｉ）の内包粒子の存在率の指標によれば、ロットＡが２８．０４で、ロットＢが４５．６３であり、ロットＡよりもロットＢの方が高く、ｉｉｉ）のＤＮＡ発現率の結果と相関していた。
これらの結果から、従来の指標であるｉ）封入率は正確に脂質粒子の品質（ＤＮＡの導入効率）を評価できていないことが明らかとなった。一方で、実施形態の方法であるｉｉ）内包粒子の存在率の指標によれば、より正確に脂質粒子の品質を評価できることが明らかとなった。
このことは、脂質粒子の品質（目的物質の導入効率）は、脂質粒子に内包された核酸の量よりも、内包粒子と非内包粒子との割合の方に大きく影響を受けることを示唆している。
例３．色素の種類の検討
例１と同様の方法で、脂質粒子を含む溶液の内包粒子の存在率を測定した。
例１と同様の方法で、核酸結合性染色剤（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）に代えて核酸結合性染色剤（Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎ）を用いて内包粒子の存在率を測定した。
結果を表２に示す。
Figure 0007271374000002
Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎを用いた場合は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎを用いた場合と比較して、内包粒子存在率が低下したが、これは、本実験に用いた蛍光測定装置のフィルターがＥｖａ Ｇｒｅｅｎの蛍光波長を検出するのに適していなかったためと考えられる。したがって、Ｅｖａ Ｇｒｅｅｎの蛍光波長を感度よく検出できる装置を用いれば、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎの結果と同等になるものと思われる。
本発明のいくつかの実施形態を説明したが、これらの実施形態は、例として提示したものであり、発明の範囲を限定することは意図していない。これら新規な実施形態は、その他の様々な形態で実施されることが可能であり、発明の要旨を逸脱しない範囲で、種々の省略、置き換え、変更を行うことができる。これら実施形態やその変形は、発明の範囲や要旨に含まれるとともに、特許請求の範囲に記載された発明とその均等の範囲に含まれる。
以下、出願当初の特許請求の範囲に係る発明を付記する。
［１］
脂質粒子群中の目的物質を内包する脂質粒子の存在率を決定する方法であって、
前記脂質粒子群を含む溶液に光を照射する照射工程、
前記脂質粒子群に含まれる脂質粒子から得られる散乱光を検出し、前記溶液に含まれる全脂質粒子の個数、前記目的物質を内包する脂質粒子の個数、及び前記目的物質を内包しない脂質粒子の個数のうち少なくとも２つを計測する計測工程、並びに
前記計測工程の結果から、式（Ｉ）：
前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率＝前記目的物質を内包する脂質粒子の個数／前記溶液に含まれる全脂質粒子の個数…（Ｉ）
により、前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を算出する算出工程
を含む分析方法。
［２］
前記計測工程は、前記散乱光の強度及び／又はブラウン運動量を指標として、前記目的物質を内包する脂質粒子の個数、及び前記目的物質を内包しない脂質粒子の個数を測定する、
［１］に記載の方法。
［３］
前記照射工程の前に、前記溶液と、前記目的物質と結合して蛍光を生じるか、又は波長が変化した蛍光を生じる色素を含み、且つ脂質膜透過性である第１物質とを混合する混合工程を更に含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］
前記照射工程で照射される光は、前記色素から蛍光を生じさせる励起光であり、
前記計測工程は、前記散乱光を検出し、前記散乱光が得られた前記脂質粒子、即ち、全脂質粒子の個数を計測する第１計測工程、及び蛍光を検出し、前記蛍光が得られた前記脂質粒子、即ち、前記目的物質を内包する前記脂質粒子の個数を計測する第２計測工程を含む、
［３］に記載の方法。
［５］
前記算出工程の結果から得られた前記存在率を指標に、前記脂質粒子群の品質を評価する評価工程を更に含む、［１］～［４］の何れか１つに記載の方法。
［６］
目的物質を内包する脂質粒子を含む脂質粒子群の品質を評価する方法であって、以下の式（Ｉ）：
前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率＝前記目的物質を内包する脂質粒子の個数／前記脂質粒子群に含まれる全脂質粒子の個数…（Ｉ）
により得られる前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を指標に前記脂質粒子群の品質を評価する、分析方法。
［７］
前記目的物質は核酸である、［１］～［６］の何れか１つに記載の方法。
［８］
前記脂質粒子の粒径は、１μｍ未満である、［１］～［７］の何れか１つに記載の方法。
［９］
［１］～［８］の何れか１つに記載の方法に用いる基体であって、
基板と、
前記基板上に設けられ、前記脂質粒子群を上流から下流へ流すための流路と、
前記流路の前記上流側に設けられた、少なくとも前記脂質粒子群を前記流路内に注入するための試料注入口と
前記流路内の前記脂質粒子群に光を当てる光源と、
前記流路の前記下流側に設けられた、前記流路内の前記脂質粒子群からの散乱光を検出する散乱光検出部と
前記流路の下流側に設けられた、前記流路内の前記脂質粒子群からの蛍光を検出する蛍光検出部と
を備える、分析基体。
［１０］
前記流路の上流側に設けられた、前記第１物質を前記流路内に注入するための試薬注入口を更に備える、［９］に記載の分析基体。
［１１］
前記試料注入口と、前記光検出部との間に、分離部をさらに備え、
前記分離部は、前記脂質粒子が流れる順番を粒子径順に変更する、
［９］又は［１０］に記載の分析基体。
［１２］
［９］～［１１］の何れか１つに記載の分析基体と、
前記目的物質と結合して蛍光を生じるか、又は波長が変化した蛍光を生じる色素を含み、且つ脂質膜透過性である第１物質と
を含む分析キット。
［１３］
［１］～［８］の何れか１つに記載の方法に用いる装置であって、
脂質粒子群を含む溶液に光を照射する光源と、
前記脂質粒子から得られる散乱光を検出する散乱光検出部と、
前記脂質粒子から得られる蛍光を検出する蛍光検出部と、
前記散乱光検出部で検出された光の情報から、前記溶液に含まれる全脂質粒子の個数、前記目的物質を内包する脂質粒子の個数、及び前記目的物質を内包しない脂質粒子の個数のうち少なくとも２つを計測し、前記計測の結果から、前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を算出する処理部と
を備える分析装置。
［１４］
［９］～［１１］の何れか１つに記載の分析基体を含み、前記光源と、前記散乱光検出部と、前記蛍光検出部は、前記分析基体に備えられたものである、［１３］に記載の分析装置。
１…脂質粒子群 ２…目的物質 ３…脂質膜 ４…脂質粒子 ４ａ…内包粒子
４ｂ…非内包粒子 ５…第１物質 ６ａ…散乱光 ６ｂ…蛍光 １０…分析装置
１１…分析装置 ２０…記憶部 ３０…処理部 １００…分析基体 １０１…基板
１０２…流路 １０２ａ…流路 １０２ｂ…流路 １０３…検出装置 １０４…混合部
１０５…分離部 １０６…検出部 １０７…試料注入口 １０８…試薬注入口
１０９…光源 １１０…励起光 １１１…散乱光検出部 １１２…蛍光検出部
Ｒ…第１測定領域

Claims (15)

  1. 脂質粒子群中の目的物質を内包する脂質粒子の存在率を決定する方法であって、
    前記脂質粒子群を含む溶液と、前記目的物質と結合状態で蛍光を生じる色素を含み且つ脂質膜透過性である第１物質とを混合する混合工程と、
    得られた混合物に前記色素から前記蛍光を生じさせる励起光を照射する照射工程と、
    前記照射工程により前記混合物から生じる散乱光を検出して前記溶液に含まれる脂質粒子の個数を計測し、前記照射工程により前記混合物から生じる前記蛍光を検出して前記目的物質を内包する脂質粒子の個数を計測する計測工程と、
    前記計測工程で計測された前記目的物質を内包する脂質粒子の個数と前記溶液に含まれる全脂質粒子の個数から前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を算出する算出工程を含む分析方法。
  2. 前記算出工程において、
    前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率は、式（Ｉ）：
    前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率＝前記目的物質を内包する脂質粒子の個数／前記脂質粒子群に含まれる全脂質粒子の個数…（Ｉ）
    により得る請求項１記載の分析方法。
  3. 前記計測工程は、前記散乱光の強度及び／又はブラウン運動量を指標として、前記目的物質を内包する脂質粒子の個数、及び前記目的物質を内包しない脂質粒子の個数を測定する、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記計測工程は、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて前記目的物質を内包する脂質粒子の個数、及び前記目的物質を内包しない脂質粒子の個数を測定する、
    請求項１～３の何れか１項に記載の方法。
  5. 前記計測工程は、前記散乱光を検出する第１計測工程、及び前記蛍光を検出する第２計測工程を含む請求項１～４の何れか１項に記載の方法。
  6. 前記算出工程の結果から得られた前記存在率を指標に、前記脂質粒子群の品質を評価する評価工程を更に含む、請求項１～５の何れか１項に記載の方法。
  7. 前記目的物質は核酸である、請求項１～６の何れか１項に記載の方法。
  8. 前記脂質粒子の粒径は、１μｍ未満である、請求項１～７の何れか１項に記載の方法。
  9. 請求項１～８の何れか１項に記載の方法に用いる基体であって、
    基板と、
    前記基板上に設けられ、前記脂質粒子群を上流から下流へ流すための流路と、
    前記流路の前記上流側に設けられた、少なくとも前記脂質粒子群を前記流路内に注入するための試料注入口と
    前記流路内の前記脂質粒子群に光を当てる光源と、
    前記流路の前記下流側に設けられた、前記流路内の前記脂質粒子群からの散乱光を検出する散乱光検出部と
    前記流路の下流側に設けられた、前記流路内の前記脂質粒子群からの蛍光を検出する蛍光検出部と
    を備える、分析基体。
  10. 前記流路の上流側に設けられた、前記第１物質を前記流路内に注入するための試薬注入口を更に備える、請求項９に記載の分析基体。
  11. 前記試料注入口と、前記散乱光検出部と前記蛍光検出部とを含む検出装置との間に、分離部をさらに備え、
    前記分離部は、前記脂質粒子が流れる順番を粒子径順に変更する、
    請求項９又は１０に記載の分析基体。
  12. 請求項９～１１の何れか１項に記載の分析基体と、
    前記目的物質と結合状態で蛍光を生じるか、又は波長が変化した蛍光を生じる色素を含み、且つ脂質膜透過性である第１物質と
    を含む分析キット。
  13. 請求項１～８の何れか１項に記載の方法に用いる装置であって、
    脂質粒子群を含む溶液と、目的物質と結合状態で蛍光を生じる色素を含み且つ脂質膜透過性である第１物質とを混合した混合物に、前記色素から前記蛍光を生じさせる励起光を照射する光源と、
    前記混合物から生じる散乱光を検出する散乱光検出部と、
    前記混合物から生じる前記蛍光を検出する蛍光検出部と、
    前記散乱光検出部及び前記蛍光検出部で検出された光の情報から、前記溶液に含まれる全脂質粒子の個数、及び前記目的物質を内包する脂質粒子の個数を計測し、前記計測の結果から、前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を算出する処理部と
    を備える分析装置。
  14. 請求項９～１１の何れか１項に記載の分析基体を含み、前記光源と、前記散乱光検出部と、前記蛍光検出部は、前記分析基体に備えられたものである、請求項１３に記載の分析装置。
  15. 目的物質を内包する脂質粒子を含む脂質粒子群の品質を評価する評価方法であって、請求項１～８の何れか１項に記載の方法を用いて測定される前記目的物質を内包する脂質粒子の存在率を指標に前記脂質粒子群の品質を評価する、評価方法。
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