JP2017106832A - 微細藻類に含まれる脂質の検出装置及び微細藻類に含まれる脂質の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】簡易かつ正確に、微細藻類に含まれる脂質を検出可能な微細藻類に含まれる脂質の検出装置を提供する。【解決手段】微細藻類を含む流体が流されるフローセル４０と、フローセル４０に励起光を照射する励起光光源１０と、励起光を照射された微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出する第１の蛍光検出器１０２Ａと、を備える微細藻類に含まれる脂質の検出装置。微細藻類に含まれる脂質は、オイルボディとも呼ばれる。微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器１０５と、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部３０１と、をさらに備えていてもよい。【選択図】図１

Description

本発明は分析技術に関し、微細藻類に含まれる脂質の検出装置及び微細藻類に含まれる脂質の検出方法に関する。

微細藻類が内部に蓄積する脂質をバイオ燃料として利用することに関心が集まっている（例えば、特許文献１及び非特許文献１参照。）。微細藻類からバイオ燃料を製造する際には、微細藻類を培養し、微細藻類内部に蓄積された脂質の量が十分になったら、溶媒等を用いて、微細藻類から脂質を抽出する。藻類においては、葉緑素、フィコエリトリン、及びフィコシアンが自家蛍光を発するとの報告はあるものの（例えば、非特許文献２参照。）、脂質が自家蛍光を発するとの報告はない。そのため、微細藻類内の脂質の量を評価する方法としては、微細藻類の脂質を蛍光色素で染色して、蛍光顕微鏡で微細藻類を観察する方法が提案されている。また、多数の微細藻類を含有する懸濁液の色合いから、微細藻類の脂質の含有量を判断することも提案されている（例えば、非特許文献３参照。）。

特開２０１４−１７４０３４号公報

WANG, et al., "Characterization of a green microalga UTEX 2219-4: Effects of photosynthesis and osmotic stress on oil body formation," Botanical Studies (2011) 53: 305-312 斉藤ら、「２波長の蛍光成分同時検出による藍藻のｉｎ ｓｉｔｕ粒径解析計測法の開発」、レーザー研究、第２４巻、第４号、５９−６６ページ Su et al., "Simultaneous Estimation of Chlorophyll a and Lipid Contents in Microalgae by Three-Color Analysis," Biotechnology and Bioengineering, Vol. 99, No. 4, March 1, 2008

個々の微細藻類の脂質を蛍光色素で染色するのは手間がかかる。また、蛍光色素は、安全面で取扱に注意が必要であり、かつ高価である。また、微細藻類を含有する懸濁液の色合いから脂質の含有量を判断する方法では、個々の微細藻類の脂質の含有量を正確に判断できない。そこで、本発明は、簡易かつ正確に、微細藻類に含まれる脂質を検出可能な微細藻類に含まれる脂質の検出装置及び微細藻類に含まれる脂質の検出方法を提供することを目的の一つとする。

本発明者は、鋭意研究の末、微細藻類に励起光を照射すると、微細藻類に含まれる脂質が自家蛍光を発することを見出した。

本発明の態様によれば、（ａ）微細藻類を含む流体が流されるフローセルと、（ｂ）フローセルに励起光を照射する励起光光源と、（ｃ）励起光を照射された微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出する第１の蛍光検出器と、を備える、微細藻類に含まれる脂質の検出装置が提供される。脂質で生じた自家蛍光は、黄色光でありうる。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置が、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部と、をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置が、励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する第２の蛍光検出器と、葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部と、をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置が、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する第２の蛍光検出器と、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部と、をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置が、脂質で生じた自家蛍光の強度に基づき、脂質の大きさを算出する大きさ算出部をさらに備えていてもよい。上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置が、微細藻類で生じた散乱光の強度に基づき、微細藻類の大きさを算出する大きさ算出部をさらに備えていてもよい。上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置が、葉緑体で生じた自家蛍光の強度に基づき、葉緑体の大きさを算出する大きさ算出部をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出装置において、微細藻類が単細胞生物でありうる。また、微細藻類が炭化水素を産生しうる。

また、本発明の態様によれば、（ａ）微細藻類を含む流体をフローセルに流すことと、（ｂ）フローセルに励起光を照射することと、（ｃ）励起光を照射された微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出することと、を備える、微細藻類に含まれる脂質の検出方法が提供される。脂質で生じた自家蛍光が黄色光でありうる。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法が、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出することと、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較することと、をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法が、励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出することと、葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較することと、をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法が、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出することと、励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出することと、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、を比較することと、をさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法が、脂質で生じた自家蛍光の強度に基づき、脂質の大きさを算出することをさらに備えていてもよい。上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法が、微細藻類で生じた散乱光の強度に基づき、微細藻類の大きさを算出することをさらに備えていてもよい。上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法が、葉緑体で生じた自家蛍光の強度に基づき、葉緑体の大きさを算出することをさらに備えていてもよい。

上記の微細藻類に含まれる脂質の検出方法において、微細藻類が単細胞生物でありうる。また、微細藻類が炭化水素を産生しうる。

本発明によれば、簡易かつ正確に、微細藻類に含まれる脂質を検出可能な微細藻類に含まれる脂質の検出装置及び微細藻類に含まれる脂質の検出方法を提供可能である。

本発明の実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置の模式図である。 脂質及び葉緑体を内部に含む微細藻類の模式図である。 脂質及び葉緑体を内部に含む微細藻類の模式図である。 脂質及び葉緑体を内部に含む微細藻類の模式図である。 本発明の参考例１に係る蛍光染色されていないクロレラの顕微鏡画像である。 本発明の参考例１に係る蛍光染色されていないクロレラの自家蛍光の顕微鏡画像である。 本発明の参考例１に係る蛍光染色されていないクロレラの自家蛍光の顕微鏡画像と、自家蛍光の抽出画像である。 本発明の参考例１に係る蛍光染色されていないクロレラの顕微鏡画像に、自家蛍光の抽出画像を重ねた画像である。 本発明の参考例２に係る蛍光染色されたクロレラの顕微鏡画像である。 本発明の参考例２に係る蛍光染色されたクロレラの蛍光の顕微鏡画像である。 本発明の参考例２に係る蛍光染色されたクロレラの蛍光の顕微鏡画像と、自家蛍光の抽出画像である。 本発明の参考例２に係る蛍光染色されたクロレラの顕微鏡画像に、蛍光の抽出画像を重ねた画像である。 本発明の参考例３に係る蛍光染色されていないクロレラの顕微鏡画像である。 本発明の参考例３に係る蛍光染色されていないクロレラの自家蛍光の顕微鏡画像である。 本発明の参考例３に係る蛍光染色されていないクロレラの自家蛍光の顕微鏡画像と、自家蛍光の抽出画像である。 本発明の参考例３に係る蛍光染色されていないクロレラの顕微鏡画像に、自家蛍光の抽出画像を重ねた画像である。 本発明の参考例４に係る蛍光染色されたクロレラの顕微鏡画像である。 本発明の参考例４に係る蛍光染色されたクロレラの蛍光の顕微鏡画像である。 本発明の参考例４に係る蛍光染色されたクロレラの蛍光の顕微鏡画像と、蛍光の抽出画像である。 本発明の参考例４に係る蛍光染色されたクロレラの顕微鏡画像に、蛍光の抽出画像を重ねた画像である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。ただし、本開示の一部をなす記述及び図面は、本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替技術及び運用技術が明らかになるはずであり、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、図１に示すように、微細藻類を含む流体が流されるフローセル４０と、フローセル４０に励起光を照射する励起光光源１０と、励起光を照射された微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出する第１の蛍光検出器１０２Ａと、を備える。微細藻類に含まれる脂質は、オイルボディとも呼ばれる。フローセル４０内を流れる流体は、液体であっても、気体であってもよい。以下においては、流体が液体である例を説明する。

励起光光源１０は、フローセル４０中を流れる液体に向けて、広帯域波長の励起光を照射する。励起光光源１０としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）及びレーザーが使用可能である。励起光は、例えば、波長が４５０ｎｍから４９５ｎｍの青色光である。ただし、励起光の波長及び色は、これらに限定されない。紫色光のように、青色光以外の可視光線であってもよいし、紫外線であってもよい。励起光の波長帯域は、バンドパスフィルター等のフィルターによって設定されてもよい。励起光は、例えば、フローセル４０内において、焦点を結ぶ。励起光光源１０には、励起光光源１０に電力を供給する光源駆動電源１１が接続されている。光源駆動電源１１には、励起光光源１０に供給される電力を制御する電源制御装置１２が接続されている。

フローセル４０は、励起光に対して透明であり、例えば石英等からなる。フローセル４０は、微細藻類が概ね１個ずつ内部を流れる程度の内径を有する。フローセル４０は、例えば丸管形状、あるいは角管形状を有する。フローセル４０内部を流れる液体は、励起光を横切る。

微細藻類は、例えば大きさが数μｍから数十μｍの単細胞生物である藻類である。微細藻類は、植物プランクトンとも呼ばれることがある。また、例えば、微細藻類は、炭化水素を産生する。微細藻類の例としては、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シュードコリシスティス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ，Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、スピルリナ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ，Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等が挙げられる。

フローセル４０の中を流れる液体に微細藻類が含まれると、励起光を照射された微細藻類の脂質は、概ね、波長５４０ｎｍから６２０ｎｍの黄色光である自家蛍光を発する。脂質の自家蛍光の波長ピークは、概ね、５７０ｎｍから５９０ｎｍである。図２に示すように、脂質が発した自家蛍光の強さは、微細藻類に含まれる脂質の大きさを反映している。また、励起光を照射された微細藻類の葉緑体は、概ね、波長６５０ｎｍから７３０ｎｍの赤色光である自家蛍光を発する。葉緑体の自家蛍光の波長ピークは、概ね、６８０ｎｍから７００ｎｍである。葉緑体が発した自家蛍光の強さは、微細藻類に含まれる葉緑体の大きさを反映している。なお、脂質の自家蛍光の励起波長と、葉緑体の自家蛍光の励起波長と、は同じであってもよい。さらに、励起光を照射された微細藻類において、ミー散乱により、散乱光が生じる。散乱光の強さは、１個の微細藻類全体の大きさを反映している。

ここで、「大きさ」とは、例えば直径、面積、又は体積である。例えば、微細藻類、微細藻類内の脂質からなる領域、及び葉緑体のそれぞれの形状が粒子に近似できる場合は、「大きさ」とは、粒径であってもよい。

なお、上記の自家蛍光の波長は、励起光の波長帯域が４６０ｎｍから４９５ｎｍであり、波長５１０ｎｍ未満の光を吸収し５１０ｎｍ以上の光を透過させる吸収フィルターを介したときの値であり、条件によっては変わりうる。しかし、脂質の自家蛍光の波長帯域は、葉緑体の波長帯域より短いという関係は維持される。

図１に示すように、微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出する第１の蛍光検出器１０２Ａは、微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を受光する第１の受光素子２０Ａを備える。第１の受光素子２０Ａの前には、吸収フィルター等の、第１の受光素子２０Ａで受光可能な光の波長帯域を設定するフィルターを配置してもよい。第１の受光素子２０Ａとしては、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサ等の固体撮像素子及びフォトダイオード等の内部光電効果型（光起電力効果）光センサや、光電子増倍管等の外部光電効果型光センサ等が使用可能であり、脂質で生じた自家蛍光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。第１の受光素子２０Ａには、第１の受光素子２０Ａで生じた電流を増幅する増幅器２１Ａが接続されている。増幅器２１Ａには、増幅器２１Ａに電力を供給する増幅器電源２２Ａが接続されている。

また、増幅器２１Ａには、増幅器２１Ａで増幅された電流を受け取り、第１の受光素子２０Ａが受光した脂質で生じた自家蛍光の強度を算出する光強度算出装置２３Ａが接続されている。光強度算出装置２３Ａは、例えば、検出した自家蛍光のスペクトルの面積に基づいて、脂質で生じた自家蛍光の強度を算出する。光強度算出装置２３Ａは、画像解析ソフトウェアによって、脂質で生じた自家蛍光の強度を算出してもよい。またあるいは、光強度算出装置２３Ａは、第１の受光素子２０Ａで生じた電気信号の大きさに基づき、脂質で生じた自家蛍光の強度を算出してもよい。光強度算出装置２３Ａには、光強度算出装置２３Ａが算出した脂質で生じた自家蛍光の強度を保存する光強度記憶装置２４Ａが接続されている。

実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する第２の蛍光検出器１０２Ｂをさらに備えていてもよい。第２の蛍光検出器１０２Ｂは、微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を受光する第２の受光素子２０Ｂを備える。第２の受光素子２０Ｂの前には、吸収フィルター等の、第２の受光素子２０Ｂで受光可能な光の波長帯域を設定するフィルターを配置してもよい。第２の受光素子２０Ｂとしては、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサ等の固体撮像素子及びフォトダイオード等の内部光電効果型（光起電力効果）光センサや、光電子増倍管等の外部光電効果型光センサ等が使用可能であり、葉緑体で生じた自家蛍光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。第２の受光素子２０Ｂには、第２の受光素子２０Ｂで生じた電流を増幅する増幅器２１Ｂが接続されている。増幅器２１Ｂには、増幅器２１Ｂに電力を供給する増幅器電源２２Ｂが接続されている。

また、増幅器２１Ｂには、増幅器２１Ｂで増幅された電流を受け取り、第２の受光素子２０Ｂが受光した葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出する光強度算出装置２３Ｂが接続されている。光強度算出装置２３Ｂは、例えば、検出した自家蛍光のスペクトルの面積に基づいて、葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出する。光強度算出装置２３Ｂは、画像解析ソフトウェアによって、葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出してもよい。またあるいは、光強度算出装置２３Ｂは、第２の受光素子２０Ｂで生じた電気信号の大きさに基づき、葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出してもよい。光強度算出装置２３Ｂには、光強度算出装置２３Ｂが算出した葉緑体で生じた自家蛍光の強度を保存する光強度記憶装置２４Ｂが接続されている。

実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を受光する散乱光検出器１０５をさらに備えていてもよい。散乱光検出器１０５は、散乱光を受光する散乱光受光素子５０を備える。散乱光受光素子５０としては、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサ等の固体撮像素子及びフォトダイオード等の内部光電効果（光起電力効果）型光センサや、光電子増倍管等の外部光電効果型光センサ等が使用可能であり、光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。散乱光受光素子５０には、散乱光受光素子５０で生じた電流を増幅する増幅器５１が接続されている。増幅器５１には、増幅器５１に電力を供給する増幅器電源５２が接続されている。

また、増幅器５１には、増幅器５１で増幅された電流を受け取り、散乱光受光素子５０が受光した散乱光の強度を算出する光強度算出装置５３が接続されている。光強度算出装置５３は、例えば、検出した散乱光のスペクトルの面積に基づいて、散乱光の強度を算出する。光強度算出装置５３は、画像解析ソフトウェアによって、散乱光の強度を算出してもよい。またあるいは、光強度算出装置５３は、散乱光受光素子５０で生じた電気信号の大きさに基づき、散乱光の強度を算出してもよい。光強度算出装置５３には、光強度算出装置５３が算出した散乱光の強度を保存する光強度記憶装置５４が接続されている。

フローセル４０内を液体が流れると、励起光光源１０が励起光を照射し、第１及び第２の蛍光検出器１０２Ａ、１０２Ｂが、それぞれ、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度と、を測定し、時系列的に光強度記憶装置２４Ａ、２４Ｂに保存する。また、散乱光検出器１０５が、微細藻類で生じた散乱光を測定し、散乱光の光強度を時系列的に光強度記憶装置５４に保存する。同時に検出された２つの波長帯域の自家蛍光と、散乱光と、は、同一個体の微細藻類由来とみなしうる。

実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、中央演算処理装置（ＣＰＵ）３００をさらに備える。ＣＰＵ３００は、同時に検出された散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部３０１を備える。

比較部３０１は、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度と、を光強度記憶装置２４Ａ、２４Ｂから読み出す。また、比較部３０１は、微細藻類で生じた散乱光の強度を、光強度記憶装置５４から読み出す。

さらに、比較部３０１は、例えば、散乱光の強度に対する、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度の比を算出する。比較部３０１は、散乱光の強度の値を１００等に正規化し、正規化された散乱光の強度に対する、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度の比を算出してもよい。

また、比較部３０１は、例えば、散乱光の強度に対する、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度の比を算出する。比較部３０１は、正規化された散乱光の強度に対する、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度の比を算出してもよい。

ＣＰＵ３００は、評価部３０２をさらに備えていてもよい。評価部３０２は、微細藻類で生じた散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、を比較した結果から、微細藻類の状態を評価する。

例えば、微細藻類で生じた散乱光の強度に対する、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度の比が所定の判別値より小さい場合、図３に示すように、当該微細藻類における脂質の割合が小さいと評価する。また、微細藻類で生じた散乱光の強度に対する、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度の比が所定の判別値より大きい場合、図４に示すように、当該微細藻類における脂質の割合が大きいと評価する。

さらに、例えば、微細藻類で生じた散乱光の強度に対する、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度の比が所定の判別値より小さい場合、図４に示すように、当該微細藻類における葉緑体の割合が小さいと評価する。また、微細藻類で生じた散乱光の強度に対する、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度の比が所定の判別値より大きい場合、図３に示すように、当該微細藻類における葉緑体の割合が大きいと評価する。

図１に示すＣＰＵ３００は、大きさ算出部３０３をさらに備えていてもよい。大きさ算出部３０３は、微細藻類で生じた散乱光の強度に基づき、微細藻類の大きさを算出する。大きさ算出部３０３は、予め取得した、散乱光の強度と、微細藻類の大きさと、の関係に基づき、微細藻類の大きさを算出してもよい。

また、大きさ算出部３０３は、脂質で生じた自家蛍光の強度に基づき、微細藻類内の脂質の大きさを算出する。大きさ算出部３０３は、予め取得した、脂質の自家蛍光の強度と、脂質の大きさと、の関係に基づき、脂質の大きさを算出してもよい。

さらに、大きさ算出部３０３は、葉緑体で生じた自家蛍光の強度に基づき、微細藻類内の葉緑体の大きさを算出する。大きさ算出部３０３は、予め取得した、葉緑体の自家蛍光の強度と、葉緑体の大きさと、の関係に基づき、脂質の大きさを算出してもよい。

比較部３０１は、大きさ算出部３０３が算出した微細藻類の大きさと、脂質の大きさと、葉緑体の大きさと、を比較してもよい。

ＣＰＵ３００には、出力装置４０１が接続されている。出力装置４０１は、ＣＰＵ３００の算出結果を出力する。出力装置４０１としては、ディスプレイ、スピーカ、及びプリンタ等が使用可能である。

以上説明した実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、予め蛍光染色をすることなく、個々の微細藻類に含まれる脂質を検出することが可能である。例えば、大量の微細藻類を培養している場合、全ての微細藻類を蛍光染色することは容易ではない。これに対し、実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置を用いれば、フローセルに複数の微細藻類を連続的に流すことにより、個々の微細藻類に含まれる脂質を光学的に迅速に検出することが可能となる。

また、実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置は、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較することにより、１個ずつの微細藻類の状態を評価することも可能である。

近年、微細藻類に含まれる脂質をバイオ燃料、医薬品、化粧品、及びサプリメント等として利用する試みがなされている。微細藻類に含まれる脂質の量は、培養条件やその他の環境条件等によって変動し、１個の微細藻類全体の大きさに占める脂質の大きさの割合は、一定ではない。これに対し、微細藻類の脂質を利用する場合は、１個の微細藻類全体の大きさに占める脂質の大きさの割合が大きいことが好ましい。

これに対し、実施の形態に係る微細藻類に含まれる脂質の検出装置によれば、散乱光の強さと、脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較することにより、１個の微細藻類全体の大きさに占める脂質の大きさの割合を把握することが可能となる。そのため、脂質の量が多い微細藻類が生じやすい培養条件やその他の環境条件をスクリーニングすることが可能となる。また、複数の微細藻類から、脂質の量が多い微細藻類をスクリーニングすることも可能となる。

なお、従来、藻類においては、葉緑素、フィコエリトリン、及びフィコシアンが自家蛍光を発するとの報告はあるものの、脂質が自家蛍光を発するとの報告はない。これは、脂質は蛍光染色で調べることが一般化しており、脂質の自家蛍光に注目することがこれまではなく、脂質が自家蛍光を発することが知られていなかったためと考えられる。

（参考例１）
国立研究開発法人国立環境研究所微生物系統保存施設より、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋ、ＮＩＥＳ−２１７０）の分譲を受けた。その後、２５℃の恒温槽内の液体Ｃ培地中で、クロレラを培養した。培養中、クロレラと液体Ｃ培地が入れられた試験管は、１００ｒｐｍでシェーカーされていた。また、培養中、恒温槽内においては、分譲機関の推奨培養条件にしたがって、昼色光の蛍光灯の１０時間の点灯と１４時間の消灯が繰り返された。

培養された蛍光染色されていないクロレラを含む１０μＬの液体Ｃ培地をスライドグラスに垂らし、カバーガラスをかけた。次に、オリンパス株式会社製のＵＩＳ搭載顕微鏡によって、蛍光染色していないクロレラの図５に示す透過顕微鏡画像を撮影した。

その後、スライドグラスを移動することなく、同じ顕微鏡によって、蛍光染色していないクロレラの図６に示す蛍光顕微鏡画像を撮影した。具体的には、励起光光源から広帯域（ＷＩＢ）励起光を発し、バンドパスフィルター（ＢＰ ４６０−４９５）によって、励起光の波長帯域を４６０ｎｍから４９５ｎｍにし、対物レンズを介して蛍光染色していないクロレラに励起光を照射した。励起光を照射された蛍光染色していないクロレラで生じた自家蛍光を、対物レンズ、及び波長５１０ｎｍ未満の光を吸収し５１０ｎｍ以上の光を透過させる吸収フィルター（ＢＡ５１０ＩＦ）を介して、カメラで撮影した。励起光の照射時間（クロレラの露出時間）は、１．０秒であった。なお、励起光に対して、減光（ＮＤ）フィルターは用いなかった。

図７（ａ）に示すクロレラの蛍光顕微鏡画像において、線で囲まれた部分では、主に黄色の自家蛍光が観察された。その他の部分では、主に赤色の自家蛍光が観察された。図７（ｂ）に示すように、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＰｒｏ）を用いて、クロレラの蛍光顕微鏡画像における黄色の自家蛍光が発せられた部分を、黒色で抽出し、その他の部分を白色にした、黄色の自家蛍光の抽出画像を作成した。図５に示す透過顕微鏡画像に、図７（ｂ）に示す黄色の自家蛍光が発せられた部分の抽出画像を重ね合わせると、図８に示すように、透過顕微鏡画像で観察された細胞内組織の形状と、黄色の自家蛍光が発せられた部分の形状と、が一致した。

（参考例２）
ピーク波長が５０３ｎｍの脂質標識蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３を用意し、エタノール中に希釈して、１ｍｇ／ｍＬの蛍光試薬溶液を調整した。次に、参考例１と同じく培養されたクロレラを含む１００μＬの液体Ｃ培地に、０．１μＬの蛍光試薬溶液を添加して、クロレラをＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色した。

参考例１の顕微鏡観察と同日に、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色されたクロレラを含む１０μＬの液体Ｃ培地をスライドグラスに垂らし、カバーガラスをかけた。次に、オリンパス株式会社製のＵＩＳ搭載顕微鏡によって、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色されたクロレラの図９に示す透過顕微鏡画像を撮影した。

その後、スライドグラスを移動することなく、同じ顕微鏡によって、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色されたクロレラの図１０に示す蛍光顕微鏡画像を撮影した。具体的には、広帯域（ＷＩＢ）励起光を発し、バンドパスフィルター（ＢＰ ４６０−４９５）によって、励起光の波長帯域を４６０ｎｍから４９５ｎｍにし、対物レンズを介してＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色されたクロレラに励起光を照射した。励起光を照射されたＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色されたクロレラで生じた蛍光を、対物レンズ、及び波長５１０ｎｍ未満の光を吸収し５１０ｎｍ以上の光を透過させる吸収フィルター（ＢＡ５１０ＩＦ）を介して、カメラで撮影した。励起光の照射時間（クロレラの露出時間）は、０．５秒であった。なお、励起光に対して、平均透過率（Ｔａｖ）が２５％のＮＤフィルターを用いた。

図１１（ａ）に示すクロレラの蛍光顕微鏡画像において、線で囲まれた部分では、主に緑色の蛍光が観察された。その他の部分では、主に赤色の蛍光が観察された。図１１（ｂ）に示すように、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＰｒｏ）を用いて、クロレラの蛍光顕微鏡画像における緑色の蛍光が発せられた部分を、黒色で抽出し、その他の部分を白色にした、緑色の蛍光の抽出画像を作成した。図９に示す透過顕微鏡画像に、図１１（ｂ）に示す緑色の蛍光が発せられた部分の抽出画像を重ね合わせると、図１２に示すように、透過顕微鏡画像で観察された細胞内組織の形状と、緑色の蛍光が発せられた部分の形状と、が一致した。

また、脂質を標識することが既知であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色されたクロレラ内の蛍光が観察された部分の形状と、図８に示す蛍光染色されていないクロレラ内の黄色の自家蛍光が観察された部分の形状と、は、類似していた。このことからも、クロレラ内の脂質が、バンドパスフィルター（ＢＰ ４６０−４９５）及び吸収フィルター（ＢＡ５１０ＩＦ）を用いた場合に黄色で観察される自家蛍光を発することが確認された。

（参考例３）
参考例１と同様に培養された蛍光染色されていないクロレラを含む１０μＬの液体Ｃ培地をスライドグラスに垂らし、カバーガラスをかけた。次に、オリンパス株式会社製のＵＩＳ搭載顕微鏡によって、蛍光染色していないクロレラの図１３に示す透過顕微鏡画像を撮影した。

その後、スライドグラスを移動することなく、同じ顕微鏡によって、蛍光染色していないクロレラの図１４に示す蛍光顕微鏡画像を撮影した。撮影条件は、参考例１の図６と同じである。

図１５（ａ）に示すクロレラの蛍光顕微鏡画像において、線で囲まれた部分では、主に黄色の自家蛍光が観察された。その他の部分では、主に赤色の自家蛍光が観察された。図１５（ｂ）に示すように、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＰｒｏ）を用いて、クロレラの蛍光顕微鏡画像における黄色の自家蛍光が発せられた部分を、黒色で抽出し、その他の部分を白色にした、自家蛍光の抽出画像を作成した。図１３に示す透過顕微鏡画像に、図１５（ｂ）に示す黄色の自家蛍光が発せられた部分の抽出画像を重ね合わせると、図１６に示すように、透過顕微鏡画像で観察された細胞内組織の形状と、黄色の自家蛍光が発せられた部分の形状と、が一致した。

（参考例４）
ピーク波長が６３７ｎｍの脂質標識蛍光色素であるナイルレッドを用意し、アセトン中に希釈して、１ｍｇ／ｍＬの蛍光試薬溶液を調整した。次に、参考例３と同じく培養されたクロレラを含む２００μＬの液体Ｃ培地に、１．０μＬの蛍光試薬溶液を添加して、クロレラをナイルレッドで染色した。

参考例３の顕微鏡観察と同日に、ナイルレッドで染色されたクロレラを含む１０μＬの液体Ｃ培地をスライドグラスに垂らし、カバーガラスをかけた。次に、オリンパス株式会社製のＵＩＳ搭載顕微鏡によって、ナイルレッドで染色されたクロレラの図１７に示す透過顕微鏡画像を撮影した。

その後、スライドグラスを移動することなく、同じ顕微鏡によって、ナイルレッドで染色されたクロレラの図１８に示す蛍光顕微鏡画像を撮影した。具体的には、広帯域（ＷＩＧ）励起光を発し、バンドパスフィルター（ＢＰ ５３０−５５０）によって、励起光の波長帯域を５３０ｎｍから５５０ｎｍにし、対物レンズを介してナイルレッドで染色されたクロレラに励起光を照射した。励起光を照射されたナイルレッドで染色されたクロレラで生じた蛍光を、対物レンズ、及び波長５７５ｎｍ未満の光を吸収し波長５７５ｎｍ以上の光を透過させる吸収フィルター（ＢＡ５７５ＩＦ）を介して、カメラで撮影した。励起光の照射時間（クロレラの露出時間）は、１．０秒であった。なお、励起光に対して、平均透過率（Ｔａｖ）が２５％のＮＤフィルターと、平均透過率（Ｔａｖ）が６％のＮＤフィルターと、を用いた。

図１９（ａ）に示すクロレラの蛍光顕微鏡画像において、主に赤色の蛍光が観察された。図１９（ｂ）に示すように、画像解析ソフト（ＩｍａｇｅＰｒｏ）を用いて、クロレラの蛍光顕微鏡画像における赤色の蛍光が発せられた部分を、黒色で抽出し、その他の部分を白色にした、赤色の蛍光の抽出画像を作成した。図１７に示す透過顕微鏡画像に、図１９（ｂ）に示す赤色の蛍光が発せられた部分の抽出画像を重ね合わせると、図２０に示すように、透過顕微鏡画像で観察された細胞内組織の形状が観察された部分と、赤色の蛍光が発せられた部分の形状と、が一致した。

また、脂質を標識することが既知であるナイルレッドで染色されたクロレラ内の蛍光が観察された部分の形状と、図１６に示した蛍光染色されていないクロレラ内のバンドパスフィルター（ＢＰ ４６０−４９５）及び吸収フィルター（ＢＡ５１０ＩＦ）を用いた場合に黄色で観察される自家蛍光の部分の形状と、は、類似していた。

１０ 励起光光源
１１ 光源駆動電源
１２ 電源制御装置
２０Ａ 第１の受光素子
２０Ｂ 第２の受光素子
２１Ａ、２１Ｂ、５１ 増幅器
２２Ａ、２２Ｂ、５２ 増幅器電源
２３Ａ、２３Ｂ、５３ 光強度算出装置
２４Ａ、２４Ｂ、５４ 光強度記憶装置
４０ フローセル
５０ 散乱光受光素子
１０２Ａ 第１の蛍光検出器
１０２Ｂ 第２の蛍光検出器
１０５ 散乱光検出器
３００ 中央演算処理装置
３０１ 比較部
３０２ 評価部
３０３ 大きさ算出部
４０１ 出力装置

Claims (11)

1. 微細藻類を含む流体が流されるフローセルと、
   前記フローセルに励起光を照射する励起光光源と、
   前記励起光を照射された前記微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器と、
   を備える、微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
2. 前記脂質で生じた自家蛍光が黄色光である、請求項１に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
3. 前記励起光を照射された前記微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、
   前記散乱光の強さと、前記脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部と、
   を更に備える、請求項１又は２に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
4. 前記励起光を照射された前記微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器と、
   前記葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、前記脂質で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部と、
   を更に備える、請求項１又は２に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
5. 前記励起光を照射された前記微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、
   前記励起光を照射された前記微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器と、
   前記散乱光の強さと、前記脂質で生じた自家蛍光の強さと、前記葉緑体で生じた自家蛍光の強さと、を比較する比較部と、
   を更に備える、請求項１又は２に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
6. 前記脂質で生じた自家蛍光の強度に基づき、前記脂質の大きさを算出する大きさ算出部を更に備える、請求項１から５のいずれか１項に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
7. 前記微細藻類で生じた散乱光の強度に基づき、前記微細藻類の大きさを算出する大きさ算出部を更に備える、請求項３又は５に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
8. 前記葉緑体で生じた自家蛍光の強度に基づき、前記葉緑体の大きさを算出する大きさ算出部を更に備える、請求項４又は５に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
9. 前記微細藻類が単細胞生物である、請求項１から８のいずれか１項に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
10. 前記微細藻類が炭化水素を産生する、請求項１から９のいずれか１項に記載の微細藻類に含まれる脂質の検出装置。
11. 微細藻類を含む流体をフローセルに流すことと、
    前記フローセルに励起光を照射することと、
    前記励起光を照射された前記微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出することと、
    を備える、微細藻類に含まれる脂質の検出方法。