KR20180081120A - 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치 및 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법 - Google Patents
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Abstract
미세 조류를 포함하는 유체가 흐르는 플로우 셀(40)과, 플로우 셀(40)에 여기광을 조사하는 여기광 광원(10)과, 여기광이 조사된 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제1 형광 검출기(102A)를 구비하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. 미세 조류에 포함되는 지질은 오일 보디라고도 불린다. 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는, 여기광이 조사된 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 산란광 검출기(105)와, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부(301)를 추가로 구비하고 있어도 좋다.
Description
본 발명은 분석 기술에 관한 것이며, 미세 조류(藻類)에 포함되는 지질의 검출 장치 및 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법에 관한 것이다.
미세 조류가 내부에 축적하는 지질을 바이오 연료로서 이용하는 것에 관심이 모이고 있다(예컨대, 특허문헌 1 및 비특허문헌 1 참조.). 미세 조류로부터 바이오 연료를 제조할 때는, 미세 조류를 배양하여, 미세 조류 내부에 축적된 지질의 양이 충분하게 되면, 용매 등을 이용하여 미세 조류로부터 지질을 추출한다. 조류에 있어서는, 엽록소, 피코에리트린 및 피코시안이 자가 형광을 발한다는 보고는 있지만(예컨대, 비특허문헌 2 참조.), 지질이 자가 형광을 발한다는 보고는 없다. 그 때문에, 미세 조류 내의 지질의 양을 평가하는 방법으로서는, 미세 조류의 지질을 형광 색소로 염색하여, 형광현미경으로 미세 조류를 관찰하는 방법이 제안되어 있다. 또한, 다수의 미세 조류를 함유하는 현탁액의 색조로부터 미세 조류의 지질 함유량을 판단하는 것도 제안되어 있다(예컨대, 비특허문헌 3 참조).
비특허문헌 1: WANG, et al., "Characterization of a green microalga UTEX 2219-4: Effects of photosynthesis and osmotic stress on oil body formation," Botanical Studies(2011) 53: 305-312
비특허문헌 2: 사이토 등, 「2 파장의 형광 성분 동시 검출에 의한 남조(藍藻)의 insitu 입경 해석 계측법의 개발」, 레이저연구, 제24권, 제4호, 596 페이지
비특허문헌 3: Su et al., "Simultaneous Estimation of Chlorophyll a and Lipid Contents in Microalgae by Three-Color Analysis," Biotechnology and Bioengineering, Vol. 99, No. 4, March 1, 2008
개개의 미세 조류의 지질을 형광 색소로 염색하는 것은 시간이 걸린다. 또한, 형광 색소는 안전면에서 취급에 주의가 필요하며 또 고가이다. 또한, 미세 조류를 함유하는 현탁액의 색조로부터 지질의 함유량을 판단하는 방법에서는, 개개의 미세 조류의 지질 함유량을 정확하게 판단할 수 없다. 그래서, 본 발명은, 간이하면서 정확하게 미세 조류에 포함되는 지질을 검출할 수 있는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치 및 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법을 제공하는 것을 목적의 하나로 한다.
본 발명자는, 예의 연구한 결과, 미세 조류에 여기광을 조사하면, 미세 조류에 포함되는 지질이 자가 형광을 발하는 것을 알아냈다.
본 발명의 양태에 따르면, (a) 미세 조류를 포함하는 유체가 흐르는 플로우 셀과, (b) 플로우 셀에 여기광을 조사하는 여기광 광원과, (c) 여기광이 조사된 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제1 형광 검출기를 구비하는, 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가 제공된다. 지질에서 생긴 자가 형광은 황색광일 수 있다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가, 여기광이 조사된 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 산란광 검출기와, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부를 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가, 여기광이 조사된 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제2 형광 검출기와, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부를 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가, 여기광이 조사된 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 산란광 검출기와, 여기광이 조사된 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제2 형광 검출기와, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기와 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부를 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가, 지질에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여 지질의 크기를 산출하는 크기 산출부를 추가로 구비하고 있어도 좋다. 상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 기초하여 미세 조류의 크기를 산출하는 크기 산출부를 추가로 구비하고 있어도 좋다. 상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치가, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여 엽록체의 크기를 산출하는 크기 산출부를 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치에 있어서, 미세 조류가 단세포 생물일 수 있다. 또한, 미세 조류가 탄화수소를 산생할 수 있다.
또한, 본 발명의 양태에 따르면, (a) 미세 조류를 포함하는 유체를 플로우 셀에 흘리는 것과, (b)플로우 셀에 여기광을 조사하는 것과, (c) 여기광이 조사된 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 것을 구비하는, 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이 제공된다. 지질에서 생긴 자가 형광이 황색광일 수 있다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이, 여기광이 조사된 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 것과, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 것을 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이, 여기광이 조사된 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 것과, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 것을 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이, 여기광이 조사된 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 것과, 여기광이 조사된 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 것과, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기와 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 것을 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이, 지질에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여 지질의 크기를 산출하는 것을 추가로 구비하고 있어도 좋다. 상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 기초하여 미세 조류의 크기를 산출하는 것을 추가로 구비하고 있어도 좋다. 상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법이, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여 엽록체의 크기를 산출하는 것을 추가로 구비하고 있어도 좋다.
상기한 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법에 있어서, 미세 조류가 단세포 생물일 수 있다. 또한, 미세 조류가 탄화수소를 산생할 수 있다.
본 발명에 따르면, 간이하면서 정확하게 미세 조류에 포함되는 지질을 검출할 수 있는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치 및 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치의 모식도이다.
도 2는 지질 및 엽록체를 내부에 포함하는 미세 조류의 모식도이다.
도 3은 지질 및 엽록체를 내부에 포함하는 미세 조류의 모식도이다.
도 4는 지질 및 엽록체를 내부에 포함하는 미세 조류의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 6은 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상이다.
도 7은 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상과 자가 형광의 추출 화상이다.
도 8은 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상에 자가 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 9는 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 10은 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상이다.
도 11은 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상과 자가 형광의 추출 화상이다.
도 12는 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상에 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 13은 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 14는 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상이다.
도 15는 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상과 자가 형광의 추출 화상이다.
도 16은 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상에 자가 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 17은 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 18은 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상이다.
도 19는 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상과 형광의 추출 화상이다.
도 20은 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상에 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 2는 지질 및 엽록체를 내부에 포함하는 미세 조류의 모식도이다.
도 3은 지질 및 엽록체를 내부에 포함하는 미세 조류의 모식도이다.
도 4는 지질 및 엽록체를 내부에 포함하는 미세 조류의 모식도이다.
도 5는 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 6은 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상이다.
도 7은 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상과 자가 형광의 추출 화상이다.
도 8은 본 발명의 참고예 1에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상에 자가 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 9는 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 10은 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상이다.
도 11은 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상과 자가 형광의 추출 화상이다.
도 12는 본 발명의 참고예 2에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상에 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 13은 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 14는 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상이다.
도 15는 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 자가 형광의 현미경 화상과 자가 형광의 추출 화상이다.
도 16은 본 발명의 참고예 3에 따른 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라의 현미경 화상에 자가 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
도 17은 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상이다.
도 18은 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상이다.
도 19는 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 형광의 현미경 화상과 형광의 추출 화상이다.
도 20은 본 발명의 참고예 4에 따른 형광 염색된 클로렐라의 현미경 화상에 형광의 추출 화상을 겹친 화상이다.
이하에 본 발명의 실시형태를 설명한다. 단, 본 개시의 일부를 이루는 설명 및 도면은 본 발명을 한정하는 것이라고 이해해서는 안 된다. 본 개시로부터 당업자에게는 다양한 대체 기술 및 운용 기술이 분명하게 될 것이며, 본 발명은 여기서는 기재하지 않는 다양한 실시형태 등을 포함한다는 것을 이해하여야 할 것이다.
실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는, 도 1에 도시한 것과 같이, 미세 조류를 포함하는 유체가 흐르는 플로우 셀(40)과, 플로우 셀(40)에 여기광을 조사하는 여기광 광원(10)과, 여기광이 조사된 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제1 형광 검출기(102A)를 구비한다. 미세 조류에 포함되는 지질은 오일 보디라고도 불린다. 플로우 셀(40) 안을 흐르는 유체는 액체라도 기체라도 좋다. 이하에서는 유체가 액체인 예를 설명한다.
여기광 광원(10)은, 플로우 셀(40) 안을 흐르는 액체로 향해서 광대역 파장의 여기광을 조사한다. 여기광 광원(10)으로서는 예컨대 발광 다이오드(LED) 및 레이저를 사용할 수 있다. 여기광은 예컨대 파장이 450 nm에서 495 nm인 청색광이다. 단, 여기광의 파장 및 색은 이들에 한정되지 않는다. 보라색광과 같이, 청색광 이외의 가시광선이라도 좋고, 자외선이라도 좋다. 여기광의 파장 대역은 밴드패스 필터 등의 필터에 의해서 설정되더라도 좋다. 여기광은 예컨대 플로우 셀(40) 내에 있어서 초점을 잇는다. 여기광 광원(10)에는 여기광 광원(10)에 전력을 공급하는 광원 구동 전원(11)이 접속되어 있다. 광원 구동 전원(11)에는 여기광 광원(10)에 공급되는 전력을 제어하는 전원 제어 장치(12)가 접속되어 있다.
플로우 셀(40)은 여기광에 대하여 투명하며, 예컨대 석영 등으로 이루어진다. 플로우 셀(40)은 미세 조류가 대략 1개씩 내부를 흐르는 정도의 내경을 갖는다. 플로우 셀(40)은 예컨대 둥근 관 형상 혹은 각진 관 형상을 갖는다. 플로우 셀(40) 내부를 흐르는 액체는 여기광을 가로지른다.
미세 조류는 예컨대 크기가 수 ㎛에서 수십 ㎛의 단세포 생물인 조류이다. 미세 조류는 식물 플랑크톤이라고도 불리는 경우가 있다. 또한, 예컨대 미세 조류는 탄화수소를 산생한다. 미세 조류의 예로서는, 보트리오코커스·브라우니(Botryococcus braunii), 오우란티오키트륨(Aurantiochytrium), 슈도코리스티스(Pseudochoricystis ellipsoidea), 녹조류(Scenedesmus, Desmodesmus), 클로렐라(Cholorella), 두날리엘라(Dunaliella), 스피루리나(Arthrospira, Spirulina), 유글레나(Euglena), 난노클로로프시스(Nannochloropsis), 해마토코커스(Haematococcus) 및 Microcystis aeruginosa 등을 들 수 있다.
플로우 셀(40)의 안을 흐르는 액체에 미세 조류가 포함되면, 여기광이 조사된 미세 조류의 지질은 대략 파장 540 nm에서 620 nm의 황색광인 자가 형광을 발한다. 지질의 자가 형광의 파장 피크는 대략 570 nm에서 590 nm이다. 도 2에 도시한 것과 같이, 지질이 발한 자가 형광의 세기는 미세 조류에 포함되는 지질의 크기를 반영하고 있다. 또한, 여기광이 조사된 미세 조류의 엽록체는 대략 파장650 nm에서 730 nm의 적색광인 자가 형광을 발한다. 엽록체의 자가 형광의 파장 피크는 대략 680 nm에서 700 nm이다. 엽록체가 발한 자가 형광의 세기는 미세 조류에 포함되는 엽록체의 크기를 반영하고 있다. 또한, 지질의 자가 형광의 여기 파장과 엽록체의 자가 형광의 여기 파장은 동일하여도 좋다. 더욱이, 여기광이 조사된 미세 조류에 있어서 미 산란에 의해 산란광이 생긴다. 산란광의 세기는 1개의 미세 조류 전체의 크기를 반영하고 있다.
여기서 「크기」란 예컨대 직경, 면적 또는 체적이다. 예컨대, 미세 조류, 미세 조류 내의 지질로 이루어지는 영역 및 엽록체의 각각의 형상이 입자에 근사할 수 있는 경우는, 「크기」란 입경이라도 좋다.
또한, 상기한 자가 형광의 파장은, 여기광의 파장 대역이 460 nm에서 495 nm이며, 파장 510 nm 미만의 빛을 흡수하고 510 nm 이상의 빛을 투과시키는 흡수 필터를 매개로 했을 때의 값이며, 조건에 따라서는 변할 수 있다. 그러나, 지질의 자가 형광의 파장 대역은 엽록체의 자가 형광의 파장 대역보다 짧다고 하는 관계는 유지된다.
도 1에 도시한 것과 같이, 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제1 형광 검출기(102A)는 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 수광하는 제1 수광 소자(20A)를 구비한다. 제1 수광 소자(20A)의 앞에는, 흡수 필터 등의, 제1 수광 소자(20A)에서 수광할 수 있는 빛의 파장 대역을 설정하는 필터를 배치하여도 좋다. 제1 수광 소자(20A)로서는, 전하 결합 소자(CCD) 이미지 센서 등의 고체 촬상 소자 및 포토다이오드 등의 내부 광전 효과형(광기전력 효과) 광 센서나 광전자 증배관 등의 외부 광전 효과형 광 센서 등을 사용할 수 있으며, 지질에서 생긴 자가 형광을 수광하면 빛에너지를 전기에너지로 변환한다. 제1 수광 소자(20A)에는 제1 수광 소자(20A)에서 생긴 전류를 증폭하는 증폭기(21A)가 접속되어 있다. 증폭기(21A)에는 증폭기(21A)에 전력을 공급하는 증폭기 전원(22A)이 접속되어 있다.
또한, 증폭기(21A)에는, 증폭기(21A)에서 증폭된 전류를 수취하여, 제1 수광 소자(20A)가 수광한 지질에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출하는 광 강도 산출 장치(23A)가 접속되어 있다. 광 강도 산출 장치(23A)는, 예컨대 검출한 자가 형광의 스펙트럼의 면적에 기초하여, 지질에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출한다. 광 강도 산출 장치(23A)는, 화상 해석 소프트웨어에 의해서, 지질에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출하여도 좋다. 또한 혹은 광 강도 산출 장치(23A)는, 제1 수광 소자(20A)에서 생긴 전기 신호의 크기에 기초하여, 지질에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출하여도 좋다. 광 강도 산출 장치(23A)에는, 광 강도 산출 장치(23A)가 산출한 지질에서 생긴 자가 형광의 강도를 보존하는 광 강도 기억 장치(24A)가 접속되어 있다.
실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는, 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 제2 형광 검출기(102B)를 추가로 구비하고 있어도 좋다. 제2 형광 검출기(102B)는 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 수광하는 제2 수광 소자(20B)를 구비한다. 제2 수광 소자(20B)의 앞에는, 흡수 필터 등의, 제2 수광 소자(20B)에서 수광할 수 있는 빛의 파장 대역을 설정하는 필터를 배치하여도 좋다. 제2 수광 소자(20B)로서는, 전하 결합 소자(CCD) 이미지 센서 등의 고체 촬상 소자 및 포토다이오드 등의 내부 광전 효과형(광기전력 효과) 광 센서나 광전자 증배관 등의 외부 광전 효과형 광 센서 등을 사용할 수 있으며, 엽록체에서 생긴 자가 형광을 수광하면 빛에너지를 전기에너지로 변환한다. 제2 수광 소자(20B)에는 제2 수광 소자(20B)에서 생긴 전류를 증폭하는 증폭기(21B)가 접속되어 있다. 증폭기(21B)에는 증폭기(21B)에 전력을 공급하는 증폭기 전원(22B)이 접속되어 있다.
또한, 증폭기(21B)에는, 증폭기(21B)에서 증폭된 전류를 수취하여, 제2 수광 소자(20B)가 수광한 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출하는 광 강도 산출 장치(23B)가 접속되어 있다. 광 강도 산출 장치(23B)는, 예컨대 검출한 자가 형광의 스펙트럼의 면적에 기초하여, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출한다. 광 강도 산출 장치(23B)는, 화상 해석 소프트웨어에 의해서, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출하여도 좋다. 또한 혹은 광 강도 산출 장치(23B)는, 제2 수광 소자(20B)에서 생긴 전기 신호의 크기에 기초하여, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도를 산출하여도 좋다. 광 강도 산출 장치(23B)에는, 광 강도 산출 장치(23B)가 산출한 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도를 보존하는 광 강도 기억 장치(24B)가 접속되어 있다.
실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는, 여기광이 조사된 미세 조류에서 생긴 산란광을 수광하는 산란광 검출기(105)를 추가로 구비하고 있어도 좋다. 산란광 검출기(105)는 산란광을 수광하는 산란광 수광 소자(50)를 구비한다. 산란광 수광 소자(50)로서는, 전하 결합 소자(CCD) 이미지 센서 등의 고체 촬상 소자 및 포토다이오드 등의 내부 광전 효과(광기전력 효과)형 광 센서나 광전자 증배관 등의 외부 광전 효과형 광 센서 등을 사용할 수 있으며, 빛을 수광하면 빛에너지를 전기에너지로 변환한다. 산란광 수광 소자(50)에는 산란광 수광 소자(50)에서 생긴 전류를 증폭하는 증폭기(51)가 접속되어 있다. 증폭기(51)에는 증폭기(51)에 전력을 공급하는 증폭기 전원(52)이 접속되어 있다.
또한, 증폭기(51)에는, 증폭기(51)에서 증폭된 전류를 수취하여, 산란광 수광 소자(50)가 수광한 산란광의 강도를 산출하는 광 강도 산출 장치(53)가 접속되어 있다. 광 강도 산출 장치(53)는, 예컨대 검출한 산란광의 스펙트럼의 면적에 기초하여, 산란광의 강도를 산출한다. 광 강도 산출 장치(53)는, 화상 해석 소프트웨어에 의해서, 산란광의 강도를 산출하여도 좋다. 또한 혹은 광 강도 산출 장치(53)는, 산란광 수광 소자(50)에서 생긴 전기 신호의 크기에 기초하여, 산란광의 강도를 산출하여도 좋다. 광 강도 산출 장치(53)에는, 광 강도 산출 장치(53)가 산출한 산란광의 강도를 보존하는 광 강도 기억 장치(54)가 접속되어 있다.
플로우 셀(40) 안을 액체가 흐르면, 여기광 광원(10)이 여기광을 조사하여, 제1 및 제2 형광 검출기(102A, 102B)가 각각 미세 조류의 지질이 발한 자가 형광의 강도와 미세 조류의 엽록체가 발한 자가 형광의 강도를 측정하여, 시계열적으로 광 강도 기억 장치(24A, 24B)에 보존한다. 또한, 산란광 검출기(105)가, 미세 조류에서 생긴 산란광을 측정하여, 산란광의 광 강도를 시계열적으로 광 강도 기억 장치(54)에 보존한다. 동시에 검출된 2개의 파장 대역의 자가 형광과 산란광은 동일 개체의 미세 조류 유래라고 간주할 수 있다.
실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는 중앙 연산 처리 장치(CPU)(300)를 추가로 구비한다. CPU(300)는, 동시에 검출된 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기와 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부(301)를 구비한다.
비교부(301)는, 미세 조류의 지질이 발한 자가 형광의 강도와 미세 조류의 엽록체가 발한 자가 형광의 강도를 광 강도 기억 장치(24A, 24B)로부터 독출한다. 또한, 비교부(301)는 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도를 광 강도 기억 장치(54)로부터 독출한다.
더욱이, 비교부(301)는, 예컨대 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 지질이 발한 자가 형광의 강도의 비를 산출한다. 비교부(301)는, 산란광의 강도의 값을 100 등으로 정규화하고, 정규화된 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 지질이 발한 자가 형광의 강도의 비를 산출하여도 좋다.
또한, 비교부(301)는, 예컨대 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 엽록체가 발한 자가 형광의 강도의 비를 산출한다. 비교부(301)는, 정규화된 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 엽록체가 발한 자가 형광의 강도의 비를 산출하여도 좋다.
CPU(300)는 평가부(302)를 추가로 구비하고 있어도 좋다. 평가부(302)는, 미세 조류에서 생긴 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기와 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교한 결과로부터 미세 조류의 상태를 평가한다.
예컨대, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 지질이 발한 자가 형광의 강도의 비가 소정의 판별치보다 작은 경우, 도 3에 도시한 것과 같이, 상기 미세 조류에 있어서의 지질의 비율이 작다고 평가한다. 또한, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 지질이 발한 자가 형광의 강도의 비가 소정의 판별치보다 큰 경우, 도 4에 도시한 것과 같이, 상기 미세 조류에 있어서의 지질의 비율이 크다고 평가한다.
더욱이, 예컨대, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 엽록체가 발한 자가 형광의 강도의 비가 소정의 판별치보다 작은 경우, 도 4에 도시한 것과 같이, 상기 미세 조류에 있어서의 엽록체의 비율이 작다고 평가한다. 또한, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 대한, 미세 조류의 엽록체가 발한 자가 형광의 강도의 비가 소정의 판별치보다 큰 경우, 도 3에 도시한 것과 같이, 상기 미세 조류에 있어서의 엽록체의 비율이 크다고 평가한다.
도 1에 도시하는 CPU(300)는 크기 산출부(303)를 추가로 구비하고 있어도 좋다. 크기 산출부(303)는, 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 기초하여, 미세 조류의 크기를 산출한다. 크기 산출부(303)는, 미리 취득한, 산란광의 강도와 미세 조류의 크기의 관계에 기초하여, 미세 조류의 크기를 산출하여도 좋다.
또한, 크기 산출부(303)는, 지질에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여, 미세 조류 내의 지질의 크기를 산출한다. 크기 산출부(303)는, 미리 취득한, 지질의 자가 형광의 강도와 지질의 크기의 관계에 기초하여, 지질의 크기를 산출하여도 좋다.
더욱이, 크기 산출부(303)는, 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여, 미세 조류 내의 엽록체의 크기를 산출한다. 크기 산출부(303)는, 미리 취득한, 엽록체의 자가 형광의 강도와 엽록체의 크기의 관계에 기초하여, 엽록체의 크기를 산출하여도 좋다.
비교부(301)는, 크기 산출부(303)가 산출한 미세 조류의 크기와 지질의 크기와 엽록체의 크기를 비교하여도 좋다.
CPU(300)에는 출력 장치(401)가 접속되어 있다. 출력 장치(401)는 CPU(300)의 산출 결과를 출력한다. 출력 장치(401)로서는 디스플레이, 스피커 및 프린터 등을 사용할 수 있다.
이상 설명한 실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는, 미리 형광 염색을 하지 않고서 개개의 미세 조류에 포함되는 지질을 검출하는 것이 가능하다. 예컨대 대량의 미세 조류를 배양하고 있는 경우, 모든 미세 조류를 형광 염색하는 것은 용이하지 않다. 이에 대하여, 실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치를 이용하면, 플로우 셀에 복수의 미세 조류를 연속적으로 흘림으로써, 개개의 미세 조류에 포함되는 지질을 광학적으로 신속하게 검출하는 것이 가능하게 된다.
또한, 실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치는, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교함으로써, 1개씩의 미세 조류의 상태를 평가하는 것도 가능하다.
최근, 미세 조류에 포함되는 지질을 바이오 연료, 의약품, 화장품 및 보충물(supplement) 등으로서 이용하는 시도가 이루어지고 있다. 미세 조류에 포함되는 지질의 양은 배양 조건이나 그 밖의 환경 조건 등에 따라 변동되어, 1개의 미세 조류 전체의 크기에 차지하는 지질의 크기의 비율은 일정하지 않다. 이에 대하여, 미세 조류의 지질을 이용하는 경우는, 1개의 미세 조류 전체의 크기에 차지하는 지질의 크기의 비율이 큰 것이 바람직하다.
이에 대하여, 실시형태에 따른 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치에 의하면, 산란광의 세기와 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교함으로써, 1개의 미세 조류 전체의 크기에 차지하는 지질의 크기의 비율을 파악하는 것이 가능하게 된다. 그 때문에, 지질의 양이 많은 미세 조류가 생기기 쉬운 배양 조건이나 그 밖의 환경 조건을 스크리닝하는 것이 가능하게 된다. 또한, 복수의 미세 조류로부터 지질의 양이 많은 미세 조류를 스크리닝하는 것도 가능하게 된다.
또한, 종래 조류에 있어서는, 엽록소, 피코에리트린 및 피코시안이 자가 형광을 발한다는 보고는 있지만, 지질이 자가 형광을 발한다는 보고는 없다. 이것은, 지질은 형광 염색으로 조사하는 것이 일반화되어 있어, 지질의 자가 형광에 주목하는 일이 지금까지는 없고, 지질이 자가 형광을 발하는 것이 알려져 있지 않았기 때문이라고 생각된다.
(참고예 1)
일본 국립연구개발법인 국립환경연구소 미생물계통보존시설로부터, 클로렐라(Chlorella vulgaris Beijerinck, NIES-2170)의 분양을 받았다. 그 후, 25℃의 항온조 내의 액체 C 배지 속에서 클로렐라를 배양했다. 배양 중, 클로렐라와 액체 C 배지가 들어간 시험관은 100 rpm로 쉐이커되고 있었다. 또한, 배양 중, 항온조 내에서는, 분양 기관의 장려 배양 조건에 따라서 낮색광의 형광등의 10시간 점등과 14시간 소등이 반복되었다.
배양된 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라를 포함하는 10 μL의 액체 C 배지를 슬라이드 글래스에 떨어뜨리고 커버 유리를 덮었다. 이어서, 올림푸스가부시키가이샤 제조의 UIS 탑재 현미경에 의해서, 형광 염색하지 않은 클로렐라의 도 5에 도시하는 투과현미경 화상을 촬영했다.
그 후, 슬라이드 글래스를 이동하지 않고서 동일한 현미경에 의해서 형광 염색하지 않은 클로렐라의 도 6에 도시하는 형광현미경 화상을 촬영했다. 구체적으로는, 여기광 광원으로부터 광대역(WIB) 여기광을 발하고, 밴드패스 필터(BP 460-495)에 의해서, 여기광의 파장 대역을 460 nm에서 495 nm로 하고, 대물렌즈를 통해 형광 염색하지 않은 클로렐라에 여기광을 조사했다. 여기광이 조사된 형광 염색하지 않은 클로렐라에서 생긴 자가 형광을, 대물렌즈 및 파장 510 nm 미만의 빛을 흡수하고 510 nm 이상의 빛을 투과시키는 흡수 필터(BA510IF)를 통해 카메라로 촬영했다. 여기광의 조사 시간(클로렐라의 노출 시간)은 1.0초였다. 이 때, 여기광에 대하여 감광(ND) 필터는 이용하지 않았다.
도 7(a)에 도시하는 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서, 선으로 둘러싸인 부분에서는 주로 황색의 자가 형광이 관찰되었다. 그 밖의 부분에서는 주로 적색의 자가 형광이 관찰되었다. 도 7(b)에 도시한 것과 같이, 화상 해석 소프트(ImagePro)를 이용하여, 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서의 황색의 자가 형광이 발생한 부분을 흑색으로 추출하고, 그 밖의 부분을 백색으로 한, 황색의 자가 형광의 추출 화상을 작성했다. 도 5에 도시하는 투과현미경 화상에, 도 7(b)에 도시하는 황색의 자가 형광이 발생된 부분의 추출 화상을 중첩시키면, 도 8에 도시한 것과 같이, 투과현미경 화상에서 관찰된 세포내 조직의 형상과 황색의 자가 형광이 발생한 부분의 형상이 일치했다.
(참고예 2)
피크 파장이 503 nm인 지질 표지 형광 색소인 BODIPY(등록상표) 493/503을 준비하고, 에탄올 중에 희석하여, 1 mg/mL의 형광 시약 용액을 조정했다. 이어서, 참고예 1과 마찬가지로 배양된 클로렐라를 포함하는 100 μL의 액체 C 배지에, 0.1 μL의 형광 시약 용액을 첨가하여, 클로렐라를 BODIPY(등록상표)로 염색했다.
참고예 1의 현미경 관찰과 같은 날에, BODIPY(등록상표)로 염색된 클로렐라를 포함하는 10 μL의 액체 C 배지를 슬라이드 글래스에 떨어뜨리고 커버 유리를 덮었다. 이어서, 올림푸스가부시키가이샤 제조의 UIS 탑재 현미경에 의해서, BODIPY(등록상표)로 염색된 클로렐라의 도 9에 도시하는 투과현미경 화상을 촬영했다.
그 후, 슬라이드 글래스를 이동하지 않고서 동일한 현미경에 의해서, BODIPY(등록상표)로 염색된 클로렐라의 도 10에 도시하는 형광현미경 화상을 촬영했다. 구체적으로는, 광대역(WIB) 여기광을 발하고, 밴드패스 필터(BP 460-495)에 의해서, 여기광의 파장 대역을 460 nm에서 495 nm로 하고, 대물렌즈를 통해 BODIPY(등록상표)로 염색된 클로렐라에 여기광을 조사했다. 여기광이 조사된 BODIPY(등록상표)로 염색된 클로렐라에서 생긴 형광을, 대물렌즈 및 파장 510 nm 미만의 빛을 흡수하고 510 nm 이상의 빛을 투과시키는 흡수 필터(BA510IF)를 통해 카메라로 촬영했다. 여기광의 조사 시간(클로렐라의 노출 시간)은 0.5초였다. 이 때, 여기광에 대하여, 평균 투과율(Tav)이 25%인 ND 필터를 이용했다.
도 11(a)에 도시하는 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서, 선으로 둘러싸인 부분에서는 주로 녹색의 형광이 관찰되었다. 그 밖의 부분에서는 주로 적색의 형광이 관찰되었다. 도 11(b)에 도시한 것과 같이, 화상 해석 소프트(ImagePro)를 이용하여, 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서의 녹색의 형광이 발생한 부분을 흑색으로 추출하고, 그 밖의 부분을 백색으로 한, 녹색의 형광의 추출 화상을 작성했다. 도 9에 도시하는 투과현미경 화상에, 도 11(b)에 도시하는 녹색의 형광이 발생한 부분의 추출 화상을 중첩시키면, 도 12에 도시한 것과 같이 투과현미경 화상에서 관찰된 세포내 조직의 형상과 녹색의 형광이 발생한 부분의 형상이 일치했다.
또한, 지질을 표지하는 것이 이미 알려진 BODIPY(등록상표)로 염색된 클로렐라 내의 형광이 관찰된 부분의 형상과, 도 8에 도시하는 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라 내의 황색의 자가 형광이 관찰된 부분의 형상은 유사했다. 이로부터도 클로렐라 내의 지질이 밴드패스 필터(BP 460-495) 및 흡수 필터(BA510IF)를 이용한 경우에 황색으로 관찰되는 자가 형광을 발하는 것이 확인되었다.
(참고예 3)
참고예 1과 같은 식으로 배양된 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라를 포함하는 10 μL의 액체 C 배지를 슬라이드 글래스에 떨어뜨려 커버 유리를 덮었다. 이어서, 올림푸스가부시키가이샤 제조의 UIS 탑재 현미경에 의해서, 형광 염색하지 않은 클로렐라의 도 13에 도시하는 투과현미경 화상을 촬영했다.
그 후, 슬라이드 글래스를 이동하지 않고서 동일한 현미경에 의해서, 형광 염색하지 않은 클로렐라의 도 14에 도시하는 형광현미경 화상을 촬영했다. 촬영 조건은 참고예 1의 도 6과 같다.
도 15(a)에 도시하는 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서, 선으로 둘러싸인 부분에서는 주로 황색의 자가 형광이 관찰되었다. 그 밖의 부분에서는 주로 적색의 자가 형광이 관찰되었다. 도 15(b)에 도시한 것과 같이, 화상 해석 소프트(ImagePro)를 이용하여, 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서의 황색의 자가 형광이 발생한 부분을 흑색으로 추출하고, 그 밖의 부분을 백색으로 한, 자가 형광의 추출 화상을 작성했다. 도 13에 도시하는 투과현미경 화상에, 도 15(b)에 도시하는 황색의 자가 형광이 발생한 부분의 추출 화상을 중첩시키면, 도 16에 도시한 것과 같이, 투과현미경 화상에서 관찰된 세포내 조직의 형상과 황색의 자가 형광이 발생한 부분의 형상이 일치했다.
(참고예 4)
피크 파장이 637 nm의 지질 표지 형광 색소인 나일레드를 준비하고, 아세톤 중에 희석하여, 1 mg/mL의 형광 시약 용액을 조정했다. 이어서, 참고예 3과 마찬가지로 배양된 클로렐라를 포함하는 200 μL의 액체 C 배지에, 1.0 μL의 형광 시약 용액을 첨가하고, 클로렐라를 나일레드로 염색했다.
참고예 3의 현미경 관찰과 같은 날에, 나일레드로 염색된 클로렐라를 포함하는 10 μL의 액체 C 배지를 슬라이드 글래스에 떨어뜨려 커버 유리를 덮었다. 이어서, 올림푸스가부시키가이샤 제조의 UIS 탑재 현미경에 의해서, 나일레드로 염색된 클로렐라의 도 17에 도시하는 투과현미경 화상을 촬영했다.
그 후, 슬라이드 글래스를 이동하지 않고서 동일한 현미경에 의해서, 나일레드로 염색된 클로렐라의 도 18에 도시하는 형광현미경 화상을 촬영했다. 구체적으로는, 광대역(WIG) 여기광을 발하고, 밴드패스 필터(BP 530-550)에 의해서 여기광의 파장 대역을 530 nm에서 550 nm으로 하고, 대물렌즈를 통해 나일레드로 염색된 클로렐라에 여기광을 조사했다. 여기광이 조사된 나일레드로 염색된 클로렐라에서 생긴 형광을, 대물렌즈 및 파장 575 nm 미만의 빛을 흡수하고 파장 575 nm 이상의 빛을 투과시키는 흡수 필터(BA575IF)를 통해 카메라로 촬영했다. 여기광의 조사 시간(클로렐라의 노출 시간)은 1.0초였다. 이 때, 여기광에 대하여 평균 투과율(Tav)이 25%인 ND 필터와 평균 투과율(Tav)이 6%인 ND 필터를 이용했다.
도 19(a)에 도시하는 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서 주로 적색의 형광이 관찰되었다. 도 19(b)에 도시한 것과 같이, 화상 해석 소프트(ImagePro)를 이용하여, 클로렐라의 형광현미경 화상에 있어서의 적색의 형광이 발생한 부분을 흑색으로 추출하고, 그 밖의 부분을 백색으로 한, 적색의 형광의 추출 화상을 작성했다. 도 17에 도시하는 투과현미경 화상에, 도 19(b)에 도시하는 적색의 형광이 발생한 부분의 추출 화상을 중첩시키면, 도 20에 도시한 것과 같이, 투과현미경 화상에서 관찰된 세포내 조직의 형상과 적색의 형광이 발생한 부분의 형상이 일치했다.
또한, 지질을 표지하는 것이 이미 알려진 나일레드로 염색된 클로렐라 내의 형광이 관찰된 부분의 형상과, 도 16에 도시한 형광 염색되어 있지 않은 클로렐라 내의 밴드패스 필터(BP 460-495) 및 흡수 필터(BA510IF)를 이용한 경우에 황색으로 관찰되는 자가 형광의 부분의 형상은 유사했다.
10: 여기광 광원, 11: 광원 구동 전원, 12: 전원 제어 장치, 20A: 제1 수광 소자, 20B: 제2 수광 소자, 21A, 21B, 51: 증폭기, 22A, 22B, 52: 증폭기 전원, 23A, 23B, 53: 광 강도 산출 장치, 24A, 24B, 54: 광 강도 기억 장치, 40: 플로우 셀, 50: 산란광 수광 소자, 102A: 제1 형광 검출기, 102B: 제2 형광 검출기, 105: 산란광 검출기, 300: 중앙 연산 처리 장치, 301: 비교부, 302: 평가부, 303: 크기 산출부, 401: 출력 장치
Claims (11)
- 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치에 있어서,
미세 조류를 포함하는 유체가 흐르는 플로우 셀과,
상기 플로우 셀에 여기광을 조사하는 여기광 광원과,
상기 여기광이 조사된 상기 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 형광 검출기
를 포함하는, 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항에 있어서,
상기 지질에서 생긴 자가 형광은 황색광인 것인 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 여기광이 조사된 상기 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 산란광 검출기와,
상기 산란광의 세기와 상기 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부
를 더 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 여기광이 조사된 상기 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 형광 검출기와,
상기 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기와 상기 지질에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부
를 더 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 여기광이 조사된 상기 미세 조류에서 생긴 산란광을 검출하는 산란광 검출기와,
상기 여기광이 조사된 상기 미세 조류의 엽록체에서 생긴 자가 형광을 검출하는 형광 검출기와,
상기 산란광의 세기와 상기 지질에서 생긴 자가 형광의 세기와 상기 엽록체에서 생긴 자가 형광의 세기를 비교하는 비교부
를 더 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 지질에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여, 상기 지질의 크기를 산출하는 크기 산출부를 더 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제3항 또는 제5항에 있어서,
상기 미세 조류에서 생긴 산란광의 강도에 기초하여, 상기 미세 조류의 크기를 산출하는 크기 산출부를 더 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제4항 또는 제5항에 있어서,
상기 엽록체에서 생긴 자가 형광의 강도에 기초하여, 상기 엽록체의 크기를 산출하는 크기 산출부를 더 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미세 조류는 단세포 생물인 것인 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 미세 조류는 탄화수소를 산생(産生)하는 것인 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 장치. - 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법에 있어서,
미세 조류를 포함하는 유체를 플로우 셀에 흘리는 단계와,
상기 플로우 셀에 여기광을 조사하는 단계와,
상기 여기광이 조사된 상기 미세 조류의 지질에서 생긴 자가 형광을 검출하는 단계
를 포함하는 미세 조류에 포함되는 지질의 검출 방법.
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