CN112557353B - 一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测方法和装置，检测方法是测量细胞的延迟发光经过短波长滤波片的发光强度I短和经过长波长滤波片的发光强度I长，细胞活力RS＝I短/I长，RS值越大，细胞活力越高，RS值越小，细胞活力越低；所述短波长滤波片的波段范围是300nm～500nm，长波长滤波片的波段范围是500nm～650nm。检测装置则是在检测细胞延迟发光的装置基础上增加不同波长的滤光片。上述方法和装置能够准确检测细胞活力状态，而且不需要外源性标记，也不会对细胞或者操作人员造成损伤，既安全又简便，适合大规模细胞样品的及时检测。
Description
技术领域
本发明涉及细胞活力检测技术领域，具体涉及一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测方法和装置。
背景技术
细胞活力是一个重要的细胞生物学指标。目前，生物医学上主要基于形态学和生物化学方法对细胞活力进行检测。形态学方法方便、直接、可视性强，但一般只能进行定性分析，难以提供定量的检测信息，且分析结果的准确性依赖于实验员的经验，人为因素干扰大。生物化学方法灵敏、准确、特异性强，且利用流式细胞仪、酶标仪、荧光测定仪、分光光度计等可提供定量的检测结果。然而，这些方法往往是侵入性的，其中用到的生化反应、染色、标记等处理手段会改变细胞正常的生长环境和生理功能，甚至破坏细胞结构，造成不可逆的细胞损伤和死亡。此外，这些方法对实验操作技术要求高，检测后的细胞无法继续培养或应用，因此只能进行抽检，不利于大规模细胞样品的及时检测，且长期使用一些生化试剂(如台盼蓝、3H放射性同位素等)会对操作者的健康造成损害。因此，发明一种无外源性标记、非侵入性的细胞活力检测技术具有重要意义。
发明内容
鉴于现有技术中细胞活力检测方法检测准确性低、对细胞和操作人员有损伤、大规模检测受限等问题，本发明提供了一种无外源性标记、非侵入性的细胞活力检测技术。
具体地，本发明通过以下技术方案实现上述目的：
第一方面，本发明提供了一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测方法，测量细胞的延迟发光经过短波长滤波片的发光强度I短和经过长波长滤波片的发光强度I长，细胞活力RS＝I短/I长，RS值越大，细胞活力越高，RS值越小，细胞活力越低；
所述短波长滤波片的波段范围是300nm～500nm，长波长滤波片的波段范围是500nm～650nm。
延迟发光是生物体在接受光照后的再发光过程，即停止光照后，生物体自身会在一定时间内发光。典型的细胞延迟发光信号如图2所示。可以看到，细胞的延迟发光是一个发光强度随时间非线性下降的过程。我们在研究中发现，细胞的延迟发光光谱分布随细胞活力下降会出现连续的“红移”，即短波长的发光强度占总发光强度的比例下降，而长波长的发光强度占总发光强度的比例上升，可通过这一现象反映细胞的活力变化。基于此，上述检测方法分别检测短波长和长波长的发光强度，二者的比值即可反映细胞当时的活力状态。该方法操作简单，无外源标记，也不侵入细胞，且准确性较佳。
优选的，上述细胞活力检测方法中，所述短波长滤波片的波段范围是315-436nm波段和413-500nm波段。
优选的，上述细胞活力检测方法中，所述长波长滤波片的波段范围是572-650nm。
由于延迟发光是一个非稳态的超弱发光过程，采用基于高灵敏光电倍增管的波长扫描方式无法测量发光衰减过程中的光谱分布，而采用基于CCD的光谱测量方式，其灵敏度无法满足测量要求，因此，本发明采用高灵敏光电倍增管结合带通滤光片的方式进行延迟发光光谱测量，然后以延迟发光经过短波长滤波片的发光强度I短和经过长波长滤波片的发光强度I长的比值来表示细胞活力，契合细胞活力下降伴随延迟发光光谱红移的规律，能够真实展示细胞自身生理状态，所以结果方面也更加贴近实际。
上述滤光片波段范围的选择，主要考虑两个因素：1.带通宽度不宜过大或过小，过大导致无法感知光谱分布的变化，过小导致灵敏度不够，本装置所用滤光片的带通宽度约为80nm；2.多个带通滤光片的波段范围合起来可以覆盖紫外和可见波段，即延迟发光的主要光谱分布波段。另外，所选的短波和长波的波段范围具体数值能够更容易地在市面上找到对应滤光片产品而无需单独制作，购买使用更为方便。
第二方面，本发明还提供了一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测装置，包括光源、样品室、光电倍增管和多通道光子计数器，光源通过激发光纤与样品室连接，激发光纤末端设有快门1用于控制光进入样品室，样品室通过集光光纤与光电倍增管连接，集光光纤末端设置快门2用于控制光进入光电倍增管，光电倍增管与多通道光子计数器电连接；其中，在光电倍增管收集光的一端还增设短波长滤波片和长波长滤波片，所述短波长滤波片的波段范围是300nm～500nm，长波长滤波片的波段范围是500nm～650nm。
该装置也是基于上述细胞的延迟发光光谱分布随细胞活力下降会出现连续“红移”的现象，通过给细胞提供光照，再切断光源并消除系统外杂散光的影响后，只有细胞自身的延迟发光经过不同波段的滤波片以后，由光电倍增管收集和测量，得到短波段下和长波段下的两个发光强度值，二者的比值即可反映细胞当时的活力状态。
优选的，上述细胞活力检测装置中，所述短波长滤波片的波段范围是315-436nm波段和413-500nm波段。
优选的，上述细胞活力检测装置中，所述长波长滤波片的波段范围是572-650nm。
优选的，上述细胞活力检测装置中，还包括时序控制器，时序控制器分别与光源、快门1、快门2和多通道光子计数器进行连接，分别控制光源、快门1、快门2和多通道光子计数器的开启和关闭。
优选的，上述细胞活力检测装置中，还包括石英透镜，石英透镜安装在快门1与样品室之间，用于将激发光纤传输过来的光线聚焦至样品室。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
上述方法和装置能够准确检测细胞活力状态，而且不需要外源性标记，也不会对细胞或者操作人员造成损伤，既安全又简便，适合大规模细胞样品的及时检测。
附图说明
图1为基于延迟发光光谱的细胞活力检测装置连接结构示意图；
图2为典型的细胞延迟发光信号；
图3为高、低活力细胞的延迟发光光谱分布对比(*表示t检验p<0.05)；
图4为细胞活力下降过程中延迟发光光谱红移的动态变化，其中，A.台盼蓝检测的细胞存活率随细胞饥饿时间的变化；B.(I315～436+I413～500)/I572～650随细胞饥饿时间的变化。
具体实施方式
下面结合较佳的具体实施例对本发明的技术方案进行详细解释和说明，以使本领域技术人员能够更好地理解本发明并予以实施。
实施例中所使用的细胞均为人脐带间充质干细胞，仅进行示例性解释说明，并不对本发明的方法构成任何限制。
实施例1基于延迟发光光谱的细胞活力检测装置
请参考图1，为一种样式的基于延迟发光光谱的细胞活力检测装置，包括光源、样品室、光电倍增管、多通道光子计数器和时序控制器。
光源通过激发光纤与样品室连接，激发光纤末端设有快门1用于控制光进入样品室，快门1与样品室之间还设置有石英透镜，用于将进入样品室的光聚焦。
样品室通过集光光纤与光电倍增管连接，集光光纤末端设置快门2用于控制光进入光电倍增管，光电倍增管与多通道光子计数器电连接。在光电倍增管收集光的一端还增设短波长滤波片和长波长滤波片。短波长滤光片的透射波段为300nm～500nm，长波长滤光片的透射波段为500nm～650nm。本实施例中，设置短波长滤波片为两块，波段范围分别为315-436nm波段和413-500nm波段，长波长滤波片的波段范围是572-650nm波段。
时序控制器分别与光源、快门1、快门2和多通道光子计数器进行连接，分别控制光源、快门1、快门2和多通道光子计数器的开启和关闭。
多通道光子计数器设有端口用于连接计算机，进行数据输出、接收指令等。
该检测装置的工作过程如下：
初始状态下，快门1与快门2关闭，多通道光子计数器处于待机状态。测量时，首先开启快门1，使细胞接受光源(氙灯)的白光照射(预先设定照射光功率和照射时间)。光照结束时，关闭快门1以切断光源并消除系统外杂散光的影响，同时开启快门2并触发多通道光子计数器，使样品发出的超弱光子被短波长滤波片或长波长滤波片过滤以后被光电倍增管及时地收集，经多通道光子计数器测量，获得短波长的发光强度和长波长的发光强度。当测量结束后，关闭快门2，系统回复到初始状态，下一次测量重复上述过程，再转换另一块滤波片，使样品发出的超弱光子被长波长滤波片或短波长滤波片过滤以后被光电倍增管收集。如此，多个波段依次进行测量，即每测量依次转换一块滤波片，整个系统在时序控制器的电平信号控制下精确、协同地运行。最后统计不同波段下的透射光强度值。
我们定义一个表征细胞活力的参数RS，是上述两个波段的发光强度的比值，其表达式如下：
RS＝I短/I长；
以RS来表征细胞活力，RS值越大，细胞活力越高；反之，RS值越小，细胞活力越低。
实施例2不同活力细胞的延迟发光光谱分布
采用实施例1的检测装置，对高活力细胞(活细胞占比>80％)和低活力细胞(活细胞占比<30％)的延迟发光光谱分布进行测量，结果如图3所示。
细胞活力RS＝I短/I长，分别带入短波长和长波长滤光片的透射光强度值，RS＝I315-436nm+I413-500nm/I572nm～650nm；
可以看到，对比高活力细胞、低活力细胞的延迟发光中315-436nm波段和413-500nm波段的占比出现了显著下降，而572-650nm波段的占比出现了显著上升，这些变化具有统计学意义，表明低活力细胞的延迟发光光谱分布相比高活力细胞出现了“红移”。
实施例3细胞活力下降过程中延迟发光光谱红移的动态变化
选择新鲜细胞(活力100％)，分为两组进行饥饿实验，其中一组使用台盼蓝进行细胞活力变化的检测，另外一组使用实施例1的检测装置和I短/I长进行细胞活力变化的检测。
实验结果参见图2，可以看到，随细胞饥饿时间的延长，细胞的活力出现持续下降(如图4中A所示)。在这一过程中，细胞延迟发光中315-436nm波段和413-500nm波段的强度对572-650nm波段强度的比值出现了单调下降(如图4中B所示)，表明延迟发光光谱红移的程度不断加深。因此，我们采用反映延迟发光光谱红移的参数RS＝I300nm～500nm/I500nm～650nm来表征细胞活力是可行的。
台盼蓝染色作为一种细胞活力标记检测的方法，由于受细胞活力渐变状态(活力不佳但未完全死掉)、染色时间等因素的影响，其检测结果准确度在80％左右。本发明的上述方法能够实时监测细胞的活力状态，相比于台盼蓝染色法，准确性更高一些。
本文中应用了具体个例对发明构思进行了详细阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离该发明构思的前提下，所做的任何显而易见的修改、等同替换或其他改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测方法，其特征在于，测量活细胞的延迟发光经过短波长滤波片的发光强度I短和经过长波长滤波片的发光强度I长，所述短波长滤波片的波段范围是315-436nm波段和413-500nm波段，所述长波长滤波片的波段范围是572-650nm，细胞活力RS= I短 / I长，分别带入短波长和长波长滤光片的透射光强度值，RS =(I315-436nm+I413-500nm) / I572nm~650nm，RS值越大，细胞活力越高，RS值越小，细胞活力越低。
2.一种基于延迟发光光谱的细胞活力检测装置，其特征在于，用于实施权利要求1所述的方法，包括光源、样品室、光电倍增管和多通道光子计数器，光源通过激发光纤与样品室连接，激发光纤末端设有快门1用于控制光进入样品室，样品室通过集光光纤与光电倍增管连接，集光光纤末端设置快门2用于控制光进入光电倍增管，光电倍增管与多通道光子计数器电连接；其中，在光电倍增管收集光的一端还增设短波长滤波片和长波长滤波片，所述短波长滤波片的波段范围是315-436nm波段和413-500nm波段，所述长波长滤波片的波段范围是572-650nm。
3.根据权利要求2所述的细胞活力检测装置，其特征在于，还包括时序控制器，时序控制器分别与光源、快门1、快门2和多通道光子计数器进行连接，分别控制光源、快门1、快门2和多通道光子计数器的开启和关闭。
4.根据权利要求2所述的细胞活力检测装置，其特征在于，还包括石英透镜，石英透镜安装在快门1与样品室之间，用于将激发光纤传输过来的光线聚焦至样品室。
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