JP2022016077A - 微細藻類の脂質蓄積量の測定装置及び微細藻類の脂質蓄積量の測定方法 - Google Patents

微細藻類の脂質蓄積量の測定装置及び微細藻類の脂質蓄積量の測定方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2022016077000001
【課題】 簡易かつ正確に、微細藻類に含まれる脂質を測定可能な微細藻類の脂質蓄積量の測定装置を提供する。
【解決手段】 微細藻類を含む流体が流されるフローセルと、フローセルに励起光を照射する励起光光源と、励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器と、励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、散乱光の強度から、微細藻類の大きさを計算し、葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさと、から微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算し、かつ蛍光密度から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する、演算部と、を備える微細藻類の脂質蓄積量の測定装置を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、微細藻類の脂質蓄積量の測定装置及び微細藻類の脂質蓄積量の測定方法に関する。
大気中の二酸化炭素を資源化し得る観点から、微細藻類が光合成能を利用して生成し、蓄積する脂質（脂肪酸エステル等）をバイオ燃料として利用することに注目されている。微細藻類からバイオ燃料を製造する際には、微細藻類を培養し、適切なタイミングで培養を終了し、微細藻類又は微細藻類を含む流体から脂質を取り出す。適切なタイミングとは、培養プロセス全体で脂質の収量が最大になるところであり得る。
多数の微細藻類の合計の脂質蓄積量の把握は、培養プロセス管理において必要である。また、１個の微細藻類あたりの脂質蓄積量の把握は、培養効率を判断し、培養プロセスの条件を決定するために重要である。微細藻類を効率よく培養するために、培地成分濃度、培養液の温度、培養液のｐＨ、培養液中の溶存酸素、微細藻類による二酸化炭素吸収量などの培養プロセスの条件が計測され、監視される。微細藻類内の脂質の蓄積量を調べる従来の方法としては、微細藻類を含む流体をサンプリングして、脂質を抽出して秤量する方法が提案されている。また、微細藻類内の脂質の蓄積量を調べる別の方法としては、微細藻類の脂質を蛍光色素で染色して、蛍光顕微鏡で微細藻類を観察する方法が提案されている（例えば、非特許文献１参照。）。一方、多数の微細藻類を含有する懸濁液の色調の変化から、微細藻類の脂質の蓄積量を定量することも提案されている（例えば、特許文献１参照。）。
特開２０１７－３４７５号公報
Kawamura, K et al. "Determining of the optimal cultivation strategy for microalgae for biodiesel production using flow cytometric monitoring and mathematical modeling," (2018) Biomass and Bioenergy, 117, 24-31. Mayama, M et al. "Three-dimentional ultrastructural study of oil and astaxanthin accumulation during encystment in the green alga Haematococcus pluvialis," (2013) PLOS ONE, 8, e53618.
しかしながら、微細藻類の脂質を抽出して秤量する方法では、抽出操作が煩雑で手間がかかり、多くのサンプルを処理できない。また、微細藻類の脂質を蛍光色素で染色する方法では、染色のための前処理が必要で手間がかかる。また、蛍光色素は、安全面で取り扱いに注意が必要であり、染色剤を含む廃液の処理も煩雑である。
また、多数の微細藻類を含有する懸濁液の色調の変化から微細藻類の脂質の蓄積量を定量する方法では、多数の微細藻類の合計の脂質蓄積量を測定できるものの、１個の微細藻類の脂質の蓄積量を精度よく測定できない。これは、特許文献１では、細胞量と強い相関があるＧ（Ｇｌｅｅｎ）成分が、油含有量の増加とともに減少するため、正確な細胞量が測定し難いことによる。また、非特許文献２では、微細藻類が生成して蓄積する脂質は、葉緑体等の細胞小器官の細胞膜が変化したものであることが報告されている。
そこで、本発明は、簡易かつ迅速に、微細藻類に含まれる脂質を観察可能な微細藻類の脂質蓄積量の測定装置及び微細藻類の脂質蓄積量の測定方法を提供することを目的の一つとする。
本発明の態様によれば、（ａ）微細藻類を含む流体が流されるフローセルと、（ｂ）フローセルに励起光を照射する励起光光源と、（ｃ）励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器と、（ｄ）励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、（ｅ）散乱光の強度から、微細藻類の大きさを計算し、葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさと、から微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算し、かつ蛍光密度から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する、演算部と、を備える、微細藻類の脂質蓄積量の測定装置が提供される。微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光は、赤色光であってもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、演算部は、蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算し、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、演算部は、更に、単位時間内にフローセルを通過した流体の体積と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から微細藻類の濃度を計算し、微細藻類あたりの脂質蓄積量と、微細藻類の濃度と、から微細藻類の脂質の濃度を計算してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、演算部は、微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度が所定の判別値を超えときに、微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、培養を終了するタイミングであるとの判別に基づいて、出力部が、微細藻類を含む流体の供給源での培養を停止する命令を与えてもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、演算部は、微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度に基づいて微細藻類の状態を評価して、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、培養条件を調節するタイミングであるとの判別に基づいて、出力部が、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節する命令を与えてもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、記憶部が、検出される葉緑体の自家蛍光の強度と、散乱光の強度とを時系列的に記録してもよい。また、記憶部が、更に、算出される微細藻類あたりの脂質蓄積量と微細藻類の脂質の濃度とを時系列的に記録してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置において、表示部が、算出される微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度を表示してもよい。
また、本発明の態様によれば、（ａ）微細藻類を含む流体をフローセルに流すことと、（ｂ）フローセルに励起光を照射することと、（ｃ）励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出することと、（ｄ）励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出することと、（ｅ）散乱光の強度から、微細藻類の大きさを計算することと、（ｆ）葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさと、から微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算することと、（ｇ）蛍光密度から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、を含む、微細藻類の脂質蓄積量の測定方法が提供される。微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光は、赤色光であってもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、蛍光密度から、一定の濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することを更に含んでもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、単位時間内にフローセルを通過した流体の体積と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から微細藻類の濃度を計算することと、微細藻類あたりの脂質蓄積量と、微細藻類の濃度と、から微細藻類の脂質の濃度を計算することと、を更に含んでもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度が所定の判別値を超えときに、微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、培養を終了するタイミングであるとの判別に基づいて、微細藻類を含む流体の供給源での培養を停止する命令を与えてもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度に基づいて微細藻類の状態を評価して、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、培養条件を調節するタイミングであるとの判別に基づいて、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節する命令を与えてもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、検出される葉緑体の自家蛍光の強度と、散乱光の強度とを時系列的に記録してもよい。更に、算出される微細藻類あたりの脂質蓄積量と微細藻類の脂質の濃度とを時系列的に記録してもよい。
上記の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法において、算出される微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度を表示してもよい。
また、本発明の態様によれば、（ａ）微細藻類を含む流体をフローセルに流すことと、フローセルに励起光を照射することと、（ｂ）励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出することと、（ｃ）励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出することと、（ｄ）散乱光の強度から、微細藻類の大きさを計算することと、(ｅ)単位時間内にフローセルを通過した流体の体積と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から微細藻類の濃度を計算することと、（ｆ）葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさとから微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算することと、（ｇ）蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蓄積量を計算することと、（ｈ）一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、（ｉ）微細藻類あたりの脂質蓄積量と、微細藻類の濃度と、から微細藻類の脂質の濃度を計算することと、（ｊ）微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度が所定の判別値を超えたときに、微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別することと、（ｋ）培養を終了するタイミングであるとの判別に基づいて、微細藻類の培養を終了することと、を含む、微細藻類の培養制御方法が提供される。微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光は、赤色光であってもよい。
上記の微細藻類の培養制御方法は、微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度に基づいて、微細藻類の状態を評価して、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別することと、培養条件を調節するタイミングであると判別に基づいて、微細藻類を含む流体の供給源の培養条件を調節することと、を更に含んでもよい。
上記の微細藻類の培養制御方法において、検出される葉緑体の自家蛍光の強度と、散乱光の強度とを時系列的に記録してもよい。また、記憶部が、更に、算出される微細藻類あたりの脂質蓄積量と微細藻類の脂質の濃度とを時系列的に記録してもよい。
上記の微細藻類の培養制御方法において、算出される微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は微細藻類の脂質の濃度を表示してもよい。
本発明によれば、簡易かつ迅速に微細藻類に含まれる脂質を観察可能な微細藻類の脂質蓄積量の測定装置及び微細藻類の脂質蓄積量の測定方法を提供可能である。
図１は、実施形態に係る微細藻類の脂質蓄積量の測定装置の模式図である。 図２は、実施形態に係る微細藻類の培養制御方法を示すフローチャートである。 図３は、実施形態に係る、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量に対する、葉緑体の蛍光密度の関係を示すグラフである。 図４は、パターン（Ａ）及び（Ｂ）の微細藻類の培養の進行を示す図である。
以下に本発明の実施形態を説明する。ただし、本開示の一部をなす記述及び図面は、本発明を限定するものであると理解するべきではない。本開示から当業者には様々な代替技術及び運用技術が明らかになるはずであり、本発明はここでは記載していない様々な実施形態等を包含するということを理解すべきである。
以下、本発明の実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。
実施の形態に係る微細藻類の脂質蓄積量の測定装置は、図１に示すように、微細藻類を含む流体が流されるフローセル４０と、フローセル４０に励起光を照射する励起光光源１０と、励起光を照射された微細藻類の脂質で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器１０２と、微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器１０３と、散乱光の強度から、微細藻類の大きさを計算し、葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさと、から微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算し、かつ蛍光密度から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する、演算部３００と、を備える。演算部３００は、例えば、中央演算処理装置（ＣＰＵ）等からなる。微細藻類に含まれる脂質は、オイルボディとも呼ばれる。
励起光光源１０は、フローセル４０中を流れる液体に向けて、広帯域波長の励起光を照射する。励起光光源１０としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）及びレーザが使用可能である。励起光は、例えば、波長が４５０ｎｍから４９５ｎｍの青色光である。ただし、励起光の波長及び色は、これらに限定されない。紫色光のように、青色光以外の可視光線であってもよいし、紫外線であってもよい。励起光の波長帯域は、バンドパスフィルタ等のフィルタによって設定されてもよい。励起光は、例えば、フローセル４０内において焦点を結ぶ。励起光光源１０には、励起光光源１０に電力を供給する光源部１１が接続されている。光源部１１には、光源部１１に供給される電力を制御して、励起光光源１０を制御する光源制御部１２が接続されている。
フローセル４０は、励起光に対して透明であり、例えば石英等からなる。フローセル４０は、微細藻類が概ね１個ずつ内部を流れる程度の内径を有する。フローセル４０は、例えば丸管形状、或いは角管形状を有する。フローセル４０内部を流れる液体は、励起光を横切る。
微細藻類は、例えば大きさが数μｍから数十μｍの単細胞生物である藻類である。微細藻類は、植物プランクトンとも呼ばれることがある。また、例えば、微細藻類は、炭化水素を産生する。微細藻類の例としては、ボトリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ ｂｒａｕｎｉｉ）、オーランチオキトリウム（Ａｕｒａｎｔｉｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、シュードコリシスティス（Ｐｓｅｕｄｏｃｈｏｒｉｃｙｓｔｉｓ ｅｌｌｉｐｓｏｉｄｅａ）、イカダモ（Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ，Ｄｅｓｍｏｄｅｓｍｕｓ）、クロレラ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）、ドナリエラ（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ）、スピルリナ（Ａｒｔｈｒｏｓｐｉｒａ，Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）、ナンノクロロプシス（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ）、ヘマトコッカス（Ｈａｅｍａｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びＭｉｃｒｏｃｙｓｔｉｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ等が挙げられる。
フローセル４０に流される微細藻類は、予め、蛍光色素で染色されてない。フローセル４０は、微細藻類が培養されている培養槽５０に配管を通して連結されており、培養槽５０から経時的に微細藻類がフローセル４０に送られてもよい。培養槽５０は、フローセルを流れる微細藻類を含む流体の供給源である。フローセル４０を流れ終えた微細藻類は、例えば、配管を通して装置外に廃液される。或いは、フローセル４０を流れ終えた微細藻類は、配管を介して後述する培養槽５０に戻されてもよい。
フローセル４０は、例えば、希釈部５１と送液部５２とを介して、微細藻類が培養されている培養槽５０に接続されている。フローセル４０内には、例えば、培養槽５０で培養中の微細藻類を含む流体が定期的に流れてもよい。或いは、フローセル４０内には、培養槽５０で培養中の微細藻類を含む流体が少量ずつサンプリングされて流れてもよい。培養槽５０には、流体を希釈する希釈部５１が接続されている。希釈部５１は、培養槽５０からの流体に水を加え、フローセル４０内を流れる流体の微細藻類の濃度を調節する。希釈部５１には、希釈した流体を一定流量でフローセル４０に送液する送液部５２が接続されている。送液部５２には、送液部５２がフローセル４０に送液する流体の流量を制御する送液制御部５３が接続されている。
フローセル４０の中を流れる液体に微細藻類が含まれると、励起光を照射された微細藻類の葉緑体は、概ね、波長６５０ｎｍから７３０ｎｍの赤色光である自家蛍光を発する。葉緑体の自家蛍光の波長ピークは、概ね、６８０ｎｍから７００ｎｍである。葉緑体が発した自家蛍光の強度は、微細藻類に含まれる葉緑体の大きさを反映している。更に、励起光を照射された微細藻類において、ミー散乱により、散乱光が生じる。散乱光の強度は、１個の微細藻類全体の大きさを反映している。ここで、「大きさ」とは、例えば直径、面積、又は体積である。例えば、微細藻類及び葉緑体のそれぞれの形状が粒子に近似できる場合は、「大きさ」とは、粒径であってもよい。
図１に示すように、受光部１００は、蛍光検出器１０２と散乱光検出器１０３とを備えている。微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器１０２は、微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を受光する受光素子２０を備える。受光素子２０の前には、吸収フィルタ等の、受光素子２０で受光可能な光の波長帯域を設定するフィルタを配置してもよい。受光素子２０としては、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサ等の固体撮像素子及びフォトダイオード等の内部光電効果型（光起電力効果）光センサや、光電子増倍管等の外部光電効果型光センサ等が使用可能である。受光素子２０は、葉緑体で生じた自家蛍光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。受光素子２０には、受光素子２０で生じた電流を増幅する増幅器が接続されていてもよい。増幅器には、増幅器に電力を供給する増幅器電源が接続されていてもよい。
また、受光素子２０には、受光素子２０で生じた電気信号の大きさに基づき、受光素子２０が受光した葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出する光強度算出装置２１が接続されている。光強度算出装置２１は、例えば、検出した自家蛍光のスペクトルの面積に基づいて、葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出する。光強度算出装置２１は、画像解析ソフトウェアによって、葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出してもよい。また、或いは、光強度算出装置２１は、増幅器で増幅された電流の大きさに基づき、葉緑体で生じた自家蛍光の強度を算出してもよい。光強度算出装置２１には、記憶部２００が接続されている。記憶部２００には、光強度算出装置２１が算出した葉緑体で生じた自家蛍光の強度が保存される。
散乱光検出器１０３は、散乱光を受光する散乱光受光素子３０を備える。散乱光受光素子３０としては、電荷結合素子（ＣＣＤ）イメージセンサ等の固体撮像素子及びフォトダイオード等の内部光電効果（光起電力効果）型光センサや、光電子増倍管等の外部光電効果型光センサ等が使用可能であり、光を受光すると、光エネルギーを電気エネルギーに変換する。散乱光受光素子３０には、散乱光受光素子３０で生じた電流を増幅する増幅器が接続されていてもよい。増幅器には、増幅器に電力を供給する増幅器電源が接続されていてもよい。
また、散乱光受光素子３０には、散乱光受光素子３０で生じた電気信号の大きさに基づき、散乱光受光素子３０が受光した散乱光の強度を算出する光強度算出装置３１が接続されている。光強度算出装置３１は、例えば、検出した散乱光のスペクトルの面積に基づいて、散乱光の強度を算出する。光強度算出装置３１は、画像解析ソフトウェアによって、散乱光の強度を算出してもよい。また、或いは、光強度算出装置３１は、増幅器で増幅された電流の大きさに基づき、散乱光の強度を算出してもよい。光強度算出装置３１には、記憶部２００が接続されている。記憶部２００には、光強度算出装置３１が算出した散乱光の強度が保存される。
フローセル４０内を液体が流れると、励起光光源１０が励起光を照射し、蛍光検出器１０２が、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度を測定し、記憶部２００に保存する。また、散乱光検出器１０３が、微細藻類で生じた散乱光を測定し、散乱光の光強度を記憶部２００に保存する。同時に検出された自家蛍光と、散乱光と、は、同一個体の微細藻類由来とみなしうる。更に、散乱光と、葉緑体の自家蛍光と、が同時に検出された場合、１個の微細藻類が励起光を横切ったとみなしうる。従って、散乱光と、葉緑体の自家蛍光と、が同時に検出された回数から、フローセル４０を通過した微細藻類の数を計測することが可能となる。
記憶部２００は、微細藻類の葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の散乱光の強度と、を保存する。更に、記憶部２００は、１個の微細藻類で生じた散乱光の強度と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度と、の情報に、検出日時等の時間情報を付加して、時系列的に保存してもよい。
例えば、一定の期間、微細藻類で生じた散乱光の強度と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度と、の測定を繰り返すことにより、記憶部２００に、微細藻類で生じた散乱光の強度と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度と、の情報が蓄積され、微細藻類で生じた散乱光の強度の時間変化と、微細藻類の脂質が発した自家蛍光の強度の時間変化と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度の時間変化と、が記録される。
記憶部２００には、演算部３００が接続されている。演算部３００は、大きさ計算部３０１を備えている。大きさ計算部３０１は、微細藻類で生じた散乱光の強度に基づき、微細藻類の大きさを算出する。大きさ計算部３０１は、予め取得した、散乱光の強度と、微細藻類の大きさと、の関係に基づき、微細藻類の大きさを算出してもよい。記憶部２００は、大きさ計算部３０１が算出した微細藻類の大きさの時間変化を記録してもよい。
演算部３００は、定量部３０２を備えている。定量部３０２は、単位時間内にフローセル４０を通過した流体の体積と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から、微細藻類の濃度を計算する。定量部３０２は、更に、単位時間内にフローセル４０を通過した流体の体積と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の強度と、から、微細藻類の量を計算してもよい。例えば、定量部３０２は、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数を横軸にとり、各検出シグナルの強度を縦軸にとって、各検出シグナルの強度と、検出シグナルの数との関係式の積分値を、微細藻類の量として算出する。また、定量部３０２は、微細藻類の量を、単位時間内にフローセル４０を通過した流体の体積で除して、単位流体あたりの微細藻類の濃度を計算する。例えば、定量部３０２は、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数を、単位時間内にフローセル４０を通過した流体の体積で除して、微細藻類の濃度を計算する。記憶部２００は、定量部３０２が計算した微細藻類の量と濃度の時間変化を記録してもよい。
演算部３００は、比算出部３０３を備えている。比算出部３０３は、微細藻類の葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさと、から微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算する。例えば、比算出部３０３は、個々の微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の強度を記憶部２００から読み出す。また、比算出部３０３は、微細藻類の大きさを記憶部２００から読み出す。更に、比算出部３０３は、葉緑体が発した自家蛍光の強度を、微細藻類の大きさで除して、微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度（蛍光密度）を算出する。なお、比算出部３０３は、微細藻類の大きさに代えて、微細藻類で生じた散乱光の強度を記憶部２００から読み出して、その値から蛍光密度を算出してもよい。上述したように、葉緑体が発した自家蛍光の強度は、微細藻類の葉緑体の大きさを反映している。そのため、蛍光密度は、個々の微細藻類全体の体積あたりの葉緑体の大きさを反映する。記憶部２００は、比算出部３０３が計算した蛍光密度の時間変化を記録してもよい。
演算部３００は、脂質量算出部３０４を備えている。脂質量算出部３０４は、蛍光密度から、（１個の）微細藻類あたりの脂質蓄積量（以下、収率とも称する）を計算する。
例えば、記憶部２００は、予め取得した、微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度(蛍光密度)と、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量との関係式を記録している。当該関係式の一例に関して、詳しくは後述する。例えば、脂質量算出部３０４は、個々の微細藻類の蛍光密度を記憶部２００から読み出す。また、脂質量算出部３０４は、上記関係式を記憶部２００から読み出す。例えば、脂質量算出部３０４は、比算出部３０３が算出した蛍光密度から、上記関係式に基づいて、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する。更に、脂質量算出部３０４は、算出した一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を、当該一定濃度で除して、（１個の）微細藻類あたりの脂質蓄積量（収率）を計算する。
更に、脂質量算出部３０４は、算出した（１個の）微細藻類あたりの脂質蓄積量と、上記微細藻類の濃度と、から前記微細藻類の脂質の濃度（以下、収量とも称する）を計算してもよい。微細藻類の脂質の濃度は、微細藻類を含む流体の体積あたりの脂質蓄積量である。例えば、脂質量算出部３０４は、定量部３０２が算出した微細藻類の濃度を記憶部２００から読み出す。また、脂質量算出部３０４は、算出した（１個の）微細藻類あたりの脂質蓄積量（収率）と、上記微細藻類の濃度とを乗じて、微細藻類の脂質の濃度を算出してもよい。
記憶部２００は、脂質量算出部３０４が計算した、収量と収率の時間変化を記録してもよい。更に、記憶部２００は、脂質量算出部３０４が計算した、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量の時間変化を記録してもよい。
上述する、微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度（蛍光密度）（Ｙ）と、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（Ｘ）との関係式は、例えば、以下の累乗関数の（１）式で表される。
Ｙ＝ａＸ-ｂ …（１）
Ｙ：微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度（蛍光密度）
Ｘ：一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（脂質の蛍光剤による蛍光強度相当）
ａ，ｂ：実験により決定される係数
一例では、当該（１）式は、後述する実験例の条件では、ａ＝４１７９．５、ｂ＝０．８７９であって、図３に示すグラフになる。
微細藻類は、一般的に、培養初期においては、細胞分裂が活発であり、微細藻類に占める脂質の大きさが小さく、葉緑体の大きさが大きい。しかし、培養時間が経過するにつれて、細胞分裂の頻度が低下すると、微細藻類内部における脂質の生成が進み、微細藻類内に脂質が蓄積される。微細藻類の脂質は、葉緑体等の細胞小器官の膜から生成されるため、微細藻類内の脂質の蓄積に伴って、葉緑体の量は減少する。このように、微細藻類の大きさに対する脂質及び葉緑体の大きさは、微細藻類の状態によって変化する。
発明者らは、この関係に着目し、微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度（蛍光密度）から、微細藻類あたりの脂質蓄積量（収率）を算出しえることを見出した。図３のグラフでは、蛍光密度（Ｙ）が大きいほど、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（Ｘ）が小さいことがわかる。一方、蛍光密度（Ｙ）が小さいほど、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（Ｘ）が大きいことがわかる。一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量と、微細藻類あたりの脂質蓄積量とは、比例関係にある。
例えば、脂質量算出部３０４は、蛍光密度から、上記関係式に基づいて、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することが適切か、予め判定することが好ましい。
例えば、脂質量算出部３０４は、細胞の大きさの時間変化を記憶部２００から読み出す。また、脂質量算出部３０４は、蛍光密度の時間変化を記憶部２００から読み出す。次に、脂質量算出部３０４は、細胞の大きさの時間変化から、細胞の大きさの増加率（ΔＤ）を算出する。また、脂質量算出部３０４は、蛍光密度の時間変化から、蛍光密度の減少率（ΔＦＬ）を算出する。次に、算出したΔＤとΔＦＬの値と、検量線作成時にあらかじめ測定していた細胞の大きさの増加率（ΔＤ０）と蛍光密度の減少率（ΔＦＬ０）とを以下の式にあてはめて、判定目安値（Ｋ）を算出する。
Ｋ＝（ΔＤ―ΔＤ０）／（ΔＦＬ―ΔＦＬ０） …（２）
次に、適切な判定目安値（Ｋ）の範囲は、記憶部２００に記憶していてもよい。適切な判定目安値（Ｋ）の範囲は、例えばＫ≧０である。これは、上記式では、脂肪産生ではなく細胞肥大に向かったとき、Ｋは負の値をとると考えられるためである。或いは、あらかじめ繰り返し実験によって得られた値の平均値、及び標準偏差（σ）から、平均値±３σの範囲である。これは、Ｋの値がこの範囲にあるとき、目的の生育モードにあると判断し得るためである。例えば、Ｋ値の値が上記範囲内にある場合、当該関係式を使用して、蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を算出することが適切であると判定できる。一方、Ｋの値が上記範囲外にある場合、当該関係式を使用して、蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することは不適であると判別することができる。
上述するように、微細藻類の脂質は、葉緑体等の細胞小器官の膜から生成されるため、微細藻類内の脂質の蓄積に伴って、葉緑体の量は減少する。上記関係式は、その関係を利用して、蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算するものである。しかしながら、微細藻類内部の栄養が、微細藻類内の脂質の蓄積に使用されず、微細藻類の細胞肥大に多く使用される場合、上記関係式により蛍光密度から脂質蓄積量を算出することが適切ではない場合がある。
図４の（Ａ），（Ｂ）は、微細藻類の培養が進行する２つのパターンを説明する図である。パターン（Ｂ）は、理想的な、微細藻類の培養の進行を示す。パターン（Ｂ）は、例えば、図３のような関係式を作成時の微細藻類の培養の進行に対応している。パターン（Ａ）は、微細藻類の培養の進行に伴って、パターン（Ｂ）よりも細胞肥大する、微細藻類の培養の進行を示す。パターン（Ａ）では、（ａ－１）、（ａ－２）、（ａ―３）の順に培養が進行している。パターン（Ｂ）では、（ｂ－１）、（ｂ－２）、（ｂ―３）の順に培養が進行している。ここで、蛍光密度（微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度）は、（ａ－１）及び（ｂ－１）、（ａ－２）及び（ｂ－２）、（ａ－３）及び（ｂ－３）で同一となる。しかしながら、パターンＡでは、パターンＢと比較して、培養に伴って微細藻類の細胞が肥大しているため、細胞内部の栄養が消費され脂質蓄積量が小さいと想定される。そのため、パターン（Ｂ）の培養の進行は、パターン（Ａ）の培養の進行と比較して好ましい。
このように、蛍光密度の値が同じであっても、細胞の大きさの時間変化を加味することで、細胞の状態がわかる。脂質量算出部３０４は、判定目安値Ｋの値が範囲内にあるか、予め判定した後、上記関係式を適用することでより正確に脂質蓄積量を算出することができる。
当該関係式は、以下の手順で予め作成される。
まず、測定対象となる微細藻類と、同一種類、同一株の微細藻類を用意し、常法により前培養及び本培養を行う。前培養及び本培養の培養条件は、例えば、測定対象となる微細藻類の培養条件と同一条件で行う。本培養を一定期間（１～２週間程度）行って、１日経過後から１～２日ごとに、培養液をサンプリングする。サンプリングした培養液は、一定濃度（例えば、ＯＤ６８０＝１０）の本培養した微細藻類を含む懸濁液として再調製する。この際、本培養した微細藻類を遠心して、上澄みの培地を取り除き、細胞ペレットを分離する。次に、分離した細胞ペレットにリン酸緩衝生理食塩水に懸濁して濃度調節する。濃度調節した懸濁液は、２つに分注する。分注した懸濁液は、下記測定をそれぞれ行う。
一方の濃度調節した懸濁液は、脂質標識蛍光色素を含む蛍光試薬溶液によって染色する。蛍光試薬溶液は、例えば、脂質標識蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３を１ｍｇ／ｍＬで含むエタノール溶液である。蛍光試薬溶液は、例えば、０．２％濃度で添加する。次に、蛍光分光光度計によって、この蛍光染色した懸濁液を分析し、一定濃度（ＯＤ６８０＝１０）の微細藻類あたりの脂質の蛍光剤による蛍光強度を測定する。励起光としては、例えば、波長４９３ｎｍのレーザ光が使用される。一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蛍光剤による蛍光強度は、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を反映している。予め取得した、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蛍光剤による蛍光強度と、脂質の蓄積量との関係から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を算出できる。
他方の濃度調節した懸濁液は、フローサイトメトリーの原理を用いた微生物分析装置（例えば、ＩＭＤ－Ｗ(登録商標)、アズビル株式会社製）によって、個々の微細藻類で生じた散乱光の強度と、葉緑体で生じた自家蛍光の強度とを測定する。次に、測定した微細藻類の散乱光の強度と、葉緑体で生じた自家蛍光の強度とから、微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度（蛍光密度）を計算する。この際、細胞の大きさの増加率（ΔＤ）及び蛍光密度の減少率（ΔＦＬ）から判定目安値Ｋを算出し、その平均値と標準偏差σを記憶しておくことが好ましい。
次に、上記測定結果を、横軸を一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（脂質の蛍光剤による蛍光強度相当）（Ｘ）、縦軸を蛍光密度（Ｙ）として、それぞれプロットする。プロットした結果を、上記（１）式で示される累乗近似の式で、カーブフィッティングする。その結果、上記（１）式のａとｂの係数を決定する。この式により、蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を算出する。
演算部３００は、評価部３０５を更に備えていてもよい。評価部３０５は、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量（収率）及び／又は微細藻類の脂質の濃度（収量）に基づいて前記微細藻類の状態を評価する。
例えば、収率及び／又は収量が所定の判別値(例えば、予定収率と予定収量)を超えた場合、評価部３０５は、微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別する。或いは、評価部３０５は、微細藻類が、脂質を抽出するのに適した状態であり、微細藻類から脂質を抽出するタイミングであると評価してもよい。収率と収量の所定の判別値は、微細藻類の種類、培養条件、抽出される脂質の用途等に応じて、適宜設定されうる。収率と収量が、所定の判別値を超えた後、培養槽から微細藻類を回収し、微細藻類から脂質を抽出するとよい。
また、評価部３０５は、収率及び／又は収量に基づいて、微細藻類の状態を評価して、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。例えば、評価部３０５は、収率と収量が所定の判別値（例えば、予定収率と予定収量）を満たさない場合、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。例えば、評価部３０５は、収率と収量の時間変化を読み出し、その増加率が少ない場合、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。当該微細藻類を含む流体の供給源は、例えば、培養槽５０である。培養条件を調節は、好ましくは、培養槽５０における培養効率を増加して、培養条件を最適化するように行われる。例えば、評価部３０５は、収率と収量が所定の判別値を満たさない場合、当該流体の供給源での培養条件を最適化するように、調節するタイミングであると評価してもよい。
また、評価部３０５は、脂質量算出部３０４での当該関係式を使用して一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することは不適であると判別に基づいて、微細藻類の状態を評価して、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。培養条件を調節は、好ましくは、培養槽５０における培養効率を増加して、培養条件を最適化するように行われる。例えば、培養条件の調節は、培養槽５０の培地成分を添加して、栄養が細胞肥大に使用され難く、脂質蓄積に使用されるように行われる。
当該流体の供給源での培養条件とは、培養槽内の培養液の培地成分濃度、培養液の溶存酸素濃度、運転条件（温度条件、光条件、通気条件等）等である。収率と収量の所定の判別値は、微細藻類の種類、培養条件、抽出される脂質の用途等に応じて、適宜設定されうる。培養を終了するタイミングであるとの判別と、微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであるとの判別とに使用される、収率と収量の予定の判別値は、同じであってもよく、後者の方が小さくてもよい。
演算部３００には、表示部４０１が接続されている。表示部４０１は、例えば、記憶部２００に保存されている、収率及び／又は収量の時間変化を表示する。また、表示部４０１は、記憶部２００に保存されている、微細藻類で生じた散乱光の強度の時間変化と、微細藻類の葉緑体が発した自家蛍光の時間変化と、を表示する。更に、表示部４０１は、記憶部２００に保存されている、微細藻類の大きさの時間変化を表示する。
更に、表示部４０１は、評価部３０５の判定結果を表示してもよい。例えば、評価部３０５は、収率及び／又は収量が目標値に到達したと判定した場合、収量及び／又は収量が目標値に到達したことを表すメッセージ、音、及び信号等を発してもよい。表示部４０１としては、ディスプレイ、スピーカ、及びプリンタ等を使用してもよい。
演算部３００は、大きさ計算部３０１、定量部３０２、比算出部３０３、脂質量算出部３０４、及び評価部３０５の計算結果を、フローセル４０に接続された微細藻類を含む流体の供給源（培養槽５０）の培養条件を制御する培養コントローラ６０に出力する出力部５０１に接続されていてもよい。
出力部５０１は、例えば、評価部３０５の判定結果、すなわち微細藻類の培養を終了のタイミングであるとの判定に基づいて、培養コントローラ６０に培養槽５０での培養を停止する命令を与える。出力部５０１は、例えば、評価部３０５での判定結果、すなわち培養条件を調節するタイミングであるとの判定に基づいて、培養コントローラ６０に培養槽５０での培養条件を調節する命令を与える。
培養コントローラ６０は、例えば、出力部５０１からの微細藻類の培養を停止する命令に基づいて、培養槽５０における微細藻類の培養を停止する。また、培養コントローラ６０は、出力部５０１からの培養条件を調節する命令に基づいて、培養槽５０の培養条件を調節する。培養条件の調節とは、例えば、培地成分濃度を調節するために培地成分を添加すること、温度条件、光条件、通気条件、培養時間等の運転条件を変更すること、である。培養条件の調節は、例えば、培養効率を増加させて、培養条件を最適化するように行われる。
なお、微細藻類の脂質蓄積量の測定装置は、出力部５０１を備えなくてもよい。装置の使用者は、表示部４０１に表示される算出結果又は判定結果に基づいて、手動で培養コントローラ６０を操作して、培養の停止又は培養条件の調節を行ってもよい。
以上説明した実施形態に係る微細藻類の脂質蓄積量の測定装置は、予め蛍光染色をすることなく、個々の微細藻類に含まれる葉緑体が発する自家蛍光を検出し、微細藻類に含まれる脂質の蓄積量を測定することが可能である。例えば、大量の微細藻類を培養している場合、全ての微細藻類を蛍光染色することは容易ではない。これに対し、実施形態に係る微細藻類の脂質蓄積量の測定装置を用いれば、フローセルに微細藻類を連続的に流すことにより、微細藻類に含まれる脂質の蓄積量を経時的に測定することが可能となる。また、微細藻類の脂質蓄積量の測定装置を用いれば、収量と共に収率を精度よく測定できるため、培養終了のタイミングを把握するだけでなく、培養効率を把握して培養条件を最適化することができる。
また、微細藻類の脂質の自家蛍光によって脂質蓄積量を把握する方法も考えられるが微細藻類の脂質の自家蛍光は、脂質の種類によって自家蛍光を発するものと発しないものが存在する。実施形態に係る微細藻類の脂質蓄積量の測定装置は、葉緑体の自家蛍光を測定し、その測定値に基づいて、脂質の蓄積量を算出するため、脂質の種類によらず、容易かつ正確に脂質の蓄積量を判定することができる。
また、実施形態に係る微細藻類の装置によれば、葉緑体で生じた自家蛍光の時間変化を測定することにより、微細藻類あたりの脂質の蓄積量の時間変化、微細藻類の脂質の濃度の時間変化を計算することができ、その計算結果から微細藻類の培養を制御することも可能となる。
図２は、実施形態に係る微細藻類の培養制御方法（微細藻類の脂質蓄積量の測定方法を含む）を示すフローチャートである。
まず、培養槽５０内で、微細藻類の培養を開始する（工程Ｓ０）。
続いて、微細藻類を含む流体をフローセル４０に流して、励起光光源１０によってフローセル４０に励起光を照射する（工程Ｓ１）。
続いて、蛍光検出器１０２によって、工程Ｓ１で励起光を照射された微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する。また。散乱光検出器１０３によって、工程Ｓ１で励起光を照射された微細藻類で生じた散乱光を検出する。また、大きさ計算部３０１は、検出された散乱光の強度から、微細藻類の大きさを計算する。また、定量部３０２は、単位時間内にフローセルを通過した流体の体積と、単位時間内に発せられた微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から微細藻類の濃度を計算する（工程Ｓ２）。
続いて、比算出部３０３が、工程Ｓ２で計算された葉緑体の自家蛍光の強度と、微細藻類の大きさと、から微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算する（工程Ｓ３）。
続いて、脂質量算出部３０４は、工程Ｓ３で計算された蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する。この際、予め作成された蛍光密度と、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量との関係式を使用し得る（上記（１）式参照）。この際、細胞の大きさの時間変化と、蛍光密度の時間変化とから、上記（２）式により判定目安値（Ｋ）を計算し、上記関係式に基づいて、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することが適切か、予め判定することが好ましい。また、脂質量算出部３０４が、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蓄積量から、微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する。また、脂質量算出部３０４が、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蓄積量（収率）と、工程Ｓ３で計算された微細藻類の濃度とから微細藻類の脂質の濃度（収量）を計算する（工程Ｓ４）。
続いて、評価部３０５は、工程Ｓ４で計算された収率が所定の判別値（例えば、培養終了時の予定収率）を超えているか判別する（工程Ｓ５）。収率が培養終了時の予定収率を超えない場合、培養槽５０での微細藻類の培養を継続し、予定収率を超えるまで、断続的又は継続的に培養液をサンプリングして、工程Ｓ１～工程Ｓ５を繰り替えして行う。
続いて、工程Ｓ５で収率が培養終了時の予定収率を超える場合、評価部３０５は、工程Ｓ４で計算された収量が所定の判別値（例えば、培養終了時の予定収量）を超えているか判別する(工程Ｓ６)。収量が培養終了時の予定収量を超えない場合、培養槽５０での微細藻類の培養を継続し、予定収量を超えるまで、断続的又は継続的に培養液をサンプリングして、工程Ｓ１～工程Ｓ６を繰り替えして行う。
続いて、工程Ｓ６で収量が培養終了時の予定収量を超える場合、評価部３０５は、微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別する。続いて、評価部３０５の上記判別に基づいて、出力部５０１は、培養コントローラ６０に培養を終了する命令を与える。培養コントローラ６０は、上記命令に基づいて、培養槽５０での微細藻類の培養を終了する（工程Ｓ７）。
上記微細藻類の培養制御方法の工程Ｓ５において、評価部３０５は、更に、収率に基づいて微細藻類の状態を評価して、培養槽５０での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。例えば、収率が所定の判別値（例えば、培養終了時の予定収率）を超えない場合、評価部３０５は、微細藻類の培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。続いて、評価部３０５の上記判別に基づいて、出力部５０１は、培養コントローラ６０に培養条件の調節の命令を与える。培養コントローラ６０は、上記命令に基づいて、培養槽５０での培養条件を調節する。当該培養条件の調節は、例えば、培養効率を増加して、培養条件を最適化するように行われる。続いて、調節された培養条件にて培養槽５０での微細藻類の培養を継続し、所定の判別値(例えば、予定収率)を超えるまで、断続的又は継続的に培養液をサンプリングして、工程Ｓ１～工程Ｓ５を繰り替えして行う。
また、上記微細藻類の培養制御方法の工程Ｓ６において、評価部３０５は、更に、収量に基づいて微細藻類の状態を評価して、培養槽５０での培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。例えば、収量が所定の判別値（例えば、培養終了時の予定収量）を超えない場合、評価部３０５は、微細藻類の培養条件を調節するタイミングであると判別してもよい。続いて、評価部３０５の当該判別結果に基づいて、出力部５０１は培養コントローラ６０に培養条件の調節の命令を与える。培養コントローラ６０は、上記命令に基づいて、培養槽５０での培養条件を調節する。当該培養条件の調節とは、例えば、培養効率を増加して、培養条件を最適化するように行われる。続いて、調節された培養条件にて培養槽５０での微細藻類の培養を継続し、所定の判別値（例えば、予定収量）を超えるまで、断続的又は継続的に培養液をサンプリングして、工程Ｓ１～工程Ｓ６を繰り替えして行う。
以上説明した実施形態に係る微細藻類の培養制御方法は、微細藻類の脂質蓄積量の測定装置について説明したものと同様の効果を得ることができる。特に、微細藻類の培養制御方法を用いれば、収量と共に収率を精度よく測定できるため、培養効率を把握し、培養終了のタイミングを判別するだけでなく、培養条件を最適化することができる。
（実験例）
クロレラ（Chlorella vulgaris Beijerinck）を培養容器に分注し、以下の条件で前培養した。
培地：２００ｍＬ ＴＡＰ液体培地（培養容器中）
温度条件：２３℃
通気条件：Ｎ２：Ｏ２：ＣＯ２＝７７：２０：３の混合ガスを２０ｍＬ／分で通気
光条件：蛍光灯による光照射（１０時間照射及び１４時間非照射の繰り返し）
培養時間：７日間
上記前培養の後、培養容器を遠心して、上澄みの培地を取り除いた。培養容器には、２００ｍＬのｄＮ－ＴＡＰ液体培地を加え、培地交換した。ｄＮ－ＴＡＰは、窒素欠乏ＴＡＰ液体培地であり、ＴＡＰ液体培地から塩化アンモニウムを除去した液体培地である。
次に、培地交換したクロレラを、培地と培養時間以外は上述する前培養と同様の条件で本培養した。
次に、ビーク波長が５０３ｎｍの脂質標識蛍光色素であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標）４９３／５０３を用意し、エタノールで希釈して１ｍｇ／ｍＬの蛍光試薬溶液を調整した。次に、上記本培養の後、試験管を５０００ｒｐｍで３分間遠心して、上澄みの培地を取り除いて、細胞ペレットを分離した。次に、分離した細胞ペレットにリン酸緩衝生理食塩水を加えて、再懸濁させた。この際、懸濁液は、波長６８０ｎｍの光学濃度（ＯＤ６８０値）が１０になるように懸濁した（ＯＤ６８０＝１０）。
次に、培養したクロレラを含む懸濁液に、上記調製した蛍光試薬溶液を０．２％濃度で添加して、クロレラをＢＯＤＩＰＹ（登録商標）で染色した。次に、この蛍光染色した懸濁液を測定セルに入れ、測定セルを蛍光分光光度計（ＦＰ－８５００、日本分光社製）に設置した。次に、蛍光分光光度計により、測定セルに励起光を照射して、微細藻類の脂質で生じた蛍光剤による蛍光強度を測定した。励起光は、キセノンランプを光源とし、分光器で波長４９３ｎｍの光を照射した。検出は、分光器により、５０８ｎｍの波長の蛍光を検出した。測定値は、一定濃度（ＯＤ６８０＝１０）の微細藻類あたりの脂質の蛍光剤による蛍光強度を与える。ここで、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蛍光剤による蛍光強度は、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蓄積量を反映している。
一方、リアルタイム微生物ディテクタ（ＩＭＤ－Ｗ(登録商標)、アズビル株式会社製）を用意した。ＩＭＤ－Ｗは、フローセル内を流れる微生物に励起光を照射し、微生物で生じる散乱孔と蛍光を測定可能な装置である。励起光は、波長３７５ｎｍのレーザ光であった。検出蛍光用のバンドパスフィルタには、６８５±２０ｎｍの透過波長域のものを使用した。ＩＭＤ－Ｗで、培養したクロレラで生じた散乱光の強度と、葉緑体で生じた自家蛍光の強度と、をフローサイトメトリーの原理により測定した。培養液には、脱イオン水（ＤＷ）を適当量添加して濃度調節して測定した。
本培養は、２週間行って、１日経過後から１～２日ごとにサンプリングした。サンプリングした培養液について、上記蛍光染色による脂質の蛍光強度の測定、上記葉緑体の自家蛍光強度の測定、散乱光強度の測定を行った。
次に、上記測定結果を、横軸を一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（脂質の蛍光剤による蛍光強度相当）（Ｘ）、縦軸を蛍光密度（Ｙ）として、プロットする。そのプロットを、上記（１）式で示される累乗近似の式で、カーブフィッティングする。その結果、上記（１）式のａとｂの係数が決定する。上記実験条件では、ａは４１７９.５であり、ｂは０．８７９であった。ここで、プロットと上記近似式との間の平均二乗誤差（ＭＳＥ）は１０.４４１であり、相関係数Ｒ２は０８６２であった。これらの値から、プロットと上記近似式とは、十分な相関関係があることがわかる。
上述するように、この式により、蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量（脂質の蛍光剤による蛍光強度相当）を算出できる。
なお、本発明の実施形態について、具体的に説明したが、本発明はこれらの実施の形態及び実施例に限定されるものではなく、本発明の技術的思想に基づく種々の変更が可能である。
１０ 励起光光源
１１ 光源部
１２ 光源制御部
２０ 蛍光受光素子
２１ 光強度算出装置
３０ 散乱光受光素子
３１ 光強度算出装置
４０ フローセル
５０ 培養槽
５１ 希釈部
５２ 送液部
５３ 送液制御部
６０ 培養コントローラ
１００ 受光部
１０２ 蛍光検出器
１０３ 散乱光検出器
２００ 記憶部
３００ 演算部
３０１ 大きさ計算部
３０２ 定量部
３０３ 比算出部
３０４ 脂質量算出部
３０５ 評価部
４０１ 表示部
５０１ 出力部

Claims (15)

  1. 微細藻類を含む流体が流されるフローセルと、
    前記フローセルに励起光を照射する励起光光源と、
    前記励起光を照射された前記微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出する蛍光検出器と、
    前記励起光を照射された前記微細藻類で生じた散乱光を検出する散乱光検出器と、
    前記散乱光の強度から、前記微細藻類の大きさを計算し、
    前記葉緑体の自家蛍光の強度と、前記微細藻類の大きさと、から前記微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算し、かつ
    前記蛍光密度から、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する、演算部と、
    を備える、微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  2. 前記演算部は、前記蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算し、
    前記一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量から、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算する、
    請求項１に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  3. 前記演算部は、更に、
    単位時間内に前記フローセルを通過した流体の体積と、前記単位時間内に発せられた前記微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から前記微細藻類の濃度を計算し、
    前記微細藻類あたりの脂質蓄積量と、前記微細藻類の濃度と、から前記微細藻類の脂質の濃度を計算する、
    請求項２に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  4. 前記演算部は、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は前記微細藻類の脂質の濃度が所定の判別値を超えときに、前記微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別する、請求項３に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  5. 前記培養を終了するタイミングであるとの判別に基づいて、前記微細藻類を含む流体の供給源での培養を停止する命令を与える出力部を更に備える、請求項４に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  6. 前記演算部は、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は前記微細藻類の脂質の濃度に基づいて前記微細藻類の状態を評価して、前記微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別する、請求項３～５のいずれか１つに記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  7. 前記培養条件を調節するタイミングであるとの判別に基づいて、前記微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節する命令を与える出力部を更に備える、請求項６に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  8. 検出される前記葉緑体の自家蛍光の強度と、前記散乱光の強度とを時系列的に記録する記憶部を更に備える、請求項１～７のいずれか１つに記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  9. 前記記憶部は、更に、算出される前記微細藻類あたりの脂質蓄積量と前記微細藻類の脂質の濃度とを時系列的に記録する、請求項８に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  10. 算出される前記微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は前記微細藻類の脂質の濃度を表示する表示部を更に備える、請求項１～９のいずれか１つに記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定装置。
  11. 微細藻類を含む流体をフローセルに流すことと、
    前記フローセルに励起光を照射することと、
    前記励起光を照射された前記微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出することと、
    前記励起光を照射された前記微細藻類で生じた散乱光を検出することと、
    前記散乱光の強度から、前記微細藻類の大きさを計算することと、
    前記葉緑体の自家蛍光の強度と、前記微細藻類の大きさと、から前記微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算することと、
    前記蛍光密度から、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、
    を含む、微細藻類の脂質蓄積量の測定方法。
  12. 前記蛍光密度から、一定の濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、
    前記一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量から、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、
    を更に含む、請求項１１に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法。
  13. 単位時間内に前記フローセルを通過した流体の体積と、前記単位時間内に発せられた前記微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から前記微細藻類の濃度を計算することと、
    前記微細藻類あたりの脂質蓄積量と、前記微細藻類の濃度と、から前記微細藻類の脂質の濃度を計算することと、
    を更に含む、請求項１１又は１２に記載の微細藻類の脂質蓄積量の測定方法。
  14. 微細藻類を含む流体をフローセルに流すことと、
    前記フローセルに励起光を照射することと、
    前記励起光を照射された前記微細藻類の葉緑体で生じた自家蛍光を検出することと、
    前記励起光を照射された前記微細藻類で生じた散乱光を検出することと、
    前記散乱光の強度から、前記微細藻類の大きさを計算することと、
    単位時間内に前記フローセルを通過した流体の体積と、前記単位時間内に発せられた前記微細藻類の散乱光の検出シグナルの数と、から前記微細藻類の濃度を計算することと、
    前記葉緑体の自家蛍光の強度と、前記微細藻類の大きさと、から前記微細藻類の大きさあたりの葉緑体の自家蛍光の強度である蛍光密度を計算することと、
    前記蛍光密度から、一定濃度の微細藻類あたりの脂質の蓄積量を計算することと、
    前記一定濃度の微細藻類あたりの脂質蓄積量から、前記微細藻類あたりの脂質蓄積量を計算することと、
    前記微細藻類あたりの脂質蓄積量と、前記微細藻類の濃度と、から前記微細藻類の脂質の濃度を計算することと、
    前記微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は前記微細藻類の脂質の濃度が所定の判別値を超えたときに、前記微細藻類の培養を終了するタイミングであると判別することと、
    前記培養を終了するタイミングであるとの判別に基づいて、前記微細藻類の培養を終了することと、
    を含む、微細藻類の培養制御方法。
  15. 前記微細藻類あたりの脂質蓄積量及び／又は前記微細藻類の脂質の濃度に基づいて、前記微細藻類の状態を評価して、前記微細藻類を含む流体の供給源での培養条件を調節するタイミングであると判別することと、
    前記培養条件を調節するタイミングであると判別に基づいて、前記微細藻類を含む流体の供給源の培養条件を調節することと、
    を更に含む、請求項１４に記載の微細藻類の培養制御方法。
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