BR102021015335A2 - Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas - Google Patents

Abstract

A presente invenção consiste em um dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas, em tempo real e de forma não destrutiva, baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz. O dispositivo possibilita estimar os conteúdos celulares de microalgas tais como proteínas, carboidratos e lipídios a partir de modelos empíricos de regressão. A invenção se enquadra nas áreas de biotecnologia, processos industriais, instrumentação eletrônica e sensores.

Description

DISPOSITIVO DE MONITORAMENTO DE COMPONENTES CELULARES DE MICROALGAS CAMPO TÉCNICO DA INVENÇÃO

01. A presente invenção consiste em um dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas, em tempo real, baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz. O dispositivo possibilita estimar os conteúdos celulares de microalgas tais como proteínas, carboidratos e lipídeos a partir de modelos empíricos de regressão. Estes modelos empíricos de regressão correlacionam a fluorescência emitida por proteína específica excitada por fonte de luz, com o teor de componente celular de interesse. As proteínas fluorescentes de microalgas podem ser homólogas ou heterólogas, e elas devem apresentar nível de expressão relacionado, diretamente ou indiretamente, com as vias bioquímicas das microalgas relacionadas com componentes celulares de interesse. O dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas consiste em uma unidade de medição de fluorescência que utiliza fonte de luz para excitar a proteína fluorescente presente na microalga. A fluorescência emitida pela proteína pode ser filtrada, captada por sensor de luz ou tubo fotomultiplicador e convertida em sinal elétrico. O sinal elétrico obtido a partir da fluorescência é utilizado para estimar o teor de um componente ou grupo de componentes celulares da microalga a partir de modelos empíricos de regressão. Os modelos empíricos de regressão utilizados para estimar o teor dos componentes celulares de interesse são obtidos a partir da correlação da fluorescência das proteínas fluorescentes com o teor do componente ou grupo de componentes celulares previamente determinado por métodos físicos, químicos ou biológicos adequados. O dispositivo possibilita a amostragem em tempo real e de forma não destrutiva de cultivo de microalgas, com transmissão remota dos dados, permitindo assim que estratégias de cultivo e colheita de microalgas sejam otimizadas, diminuindo o tempo e custo para determinar os componentes celulares de microalgas. A comunicação sem fio do dispositivo é parelha com as tecnologias sem fio da indústria 4.0, tais como a internet das coisas (do inglês Internet of Things, ΙοΤ) e internet das coisas industrial (do inglês Industrial Internet of Things, ΙΙοΤ). A invenção se enquadra nas áreas de biotecnologia, processos industriais, instrumentação eletrônica e sensores.

ESTADO DA TÉCNICA

02. Microalgas são capazes de crescer em águas impróprias para a irrigação das principais monoculturas utilizadas para a produção de alimentos e biocombustíveis, tais como soja, milho e cana-de-açúcar. Além disso, sistemas para cultivo de microalgas podem ser construídos em regiões que não possuem solo com características físico-químicas adequadas para plantas utilizadas na agricultura convencional. Portanto, as microalgas são consideradas uma alternativa promissora para prover diversos produtos para a crescente população, além de não competir diretamente com a agricultura convencional. As microalgas podem ser utilizadas para a produção de alimentos, rações, biocombustíveis, pigmentos, fármacos, entre outras aplicações.

03. Microalgas são microrganismos dinâmicos que podem modificar seus componentes bioquímicos em resposta a fatores abióticos, tais como 0 estresse salino (ROCHA, D. N. e colab. Combination of trace elements and salt stress in different cultivation modes improves the lipid productivity of Scenedesmus spp. Bioresource Technology, v. 289, 2019). Desta forma, pode-se cultivar microalgas específicas em condições que sejam favoráveis a produção de moléculas de interesse, tais como lipídeos que podem ser utilizados na produção de biodiesel, polissacarídeos que podem ser convertidos a monossacarídeos, pigmentos entre outros. A microalga Chlorella, por exemplo, apresenta elevado acúmulo de lipídios quando cultivada em meios com baixa concentração de nitrogênio (ILLMAN, A.M, SCRAGG, A.H e SHALES, S.W. Increase in Chlorella strains calorific values when grown in low nitrogen medium. Enzyme and Microbial Technology, v. 27, n. 8, p. 631-635, 2000).

04. Os ciclos de cultivo de microalgas variam entre poucos dias a semanas, e estes ciclos de produção de biomassa são curtos quando comparados com as principais culturas utilizadas na agricultura convencional. Portanto, em função do rápido crescimento das microalgas, faz-se necessário o monitoramento em tempo real dos cultivos para que seja produzida biomassa com os componentes celulares desejados, assim como evitar ou corrigir possíveis falhas de sistemas de cultivos de microalgas. Além disso, o monitoramento em tempo real do cultivo de microalgas possibilita a identificação e correção de possíveis problemas tais como contaminações, variações das condições de cultivo e do clima.

05. O monitoramento do cultivo de microalgas baseia-se principalmente na produção de biomassa. A biomassa pode ser diretamente estimada a partir da determinação da concentração de células, massa seca ou massa fresca (SOARES, J. e colab. Scenedesmus sp. cultivation using commercial-grade ammonium sources. Annals of Microbiology, v. 68, n. 1, p. 35-45, 2018). O monitoramento do cultivo de microalgas também pode ser feito de forma indireta, e se baseia na correlação da densidade óptica medida em espectrofotômetro, com a massa seca ou concentração de células de microalga (GRIFFITHS, M. J. e colab. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods, v. 85, n. 2, p. 119-123, 2011). Entretanto, os dispositivos que realizam o monitoramento da produção de massa seca, massa fresca ou concentração de células não estimam a composição de componente celular específico ou grupo de componentes celulares que compõem a biomassa de microalga.

06. Permanece a necessidade de desenvolvimento de um dispositivo de monitoramento de composição de microalgas em tempo real, compatível com tecnologias sem fio da indústria 4.0, tais como a internet das coisas (do inglês Internet of Things, loT) e internet das coisas industrial (do inglês Industrial Internet of Things, ΙΙοΤ). Ο dispositivo deve possibilitar a identificação de possíveis falhas no sistema e nas condições de cultivo em tempo adequado para que a produção de componentes celulares de interesse de microalgas seja favorecida.

07. A determinação dos principais componentes celulares produzidos por microalgas requer etapas de extração e purificação dos componentes celulares, tal como se observa em métodos de determinação de lipídeos (YAO, L. e colab. Microalgae lipid characterization. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 63, n. 6, p. 1773-1787, 2015), polissacarídeos (VAN WYCHEN, S. e LAURENS, L. M. L. Determination of total carbohydrates in algal biomass: laboratory analytical procedure (LAP). United States Department of Energy Office and Energy Efficiency & Renewable Energy. Golden, Colorado, Estados Unidos, 2016), proteínas (MEIJER, E.A. e WIJFFELS, R.H. Development of a fast, reproducible and effective method for the extraction and quantification of proteins of microalgae. Biotechnology Techniques, v. 12, n. 5, p. 353-358, 1998), e pigmentos (GRIFFITHS, M. J. e colab. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods, v. 85, n. 2, p. 119-123, 2011). A detecção e quantificação de componentes celulares de microalgas é realizada utilizando detectores baseados em espectrofotometria, infravermelho, espalhamento de luz, refração de luz, entre outros. Portanto, a determinação dos componentes celulares de microalgas requer uma grande quantidade de insumos, e equipamentos específicos e de alto custo. Além disso, reagentes utilizados na determinação de componentes celulares de microalgas podem apresentar efeitos potenciais à saúde e ao meio ambiente, e requerem o manuseio e o descarte apropriado. Alguns reagentes utilizados na determinação de componentes celulares de microalgas são soluções ácidas concentradas, solventes orgânicos, e fenóis. Desta forma, o presente invento de monitoramento de componentes celulares de microalgas tem por objetivo suprir a necessidade de um dispositivo que seja capaz de determinar componentes celulares de microalgas em tempo real e no local do cultivo de forma não destrutiva, e que também seja capaz realizar a transmissão de dados coletados para centros de controle e supervisão dos cultivos, assim como possibilitar a construção de banco de dados.

08. A automação de cultivos de microalgas faz-se necessária para otimizar a produção de microalgas, reduzir os custos de produção de biomassa, e viabilizar a produção em larga escala destes microrganismos para uso em diferentes aplicações comerciais. O estrito controle das condições de cultivo por meio da automação é essencial para o desenvolvimento de uma cadeia produtiva estável e confiável. Mudanças na dinâmica do cultivo de microalgas podem ocorrer em questão de horas, e demandam tomadas de decisão igualmente rápidas para garantir a eficiência e estabilidade do sistema (FAN, R. e colab. An innovative optical sensor for the online monitoring and control of biomass concentration in a membrane bioreactor system for lactic acid production. Sensors, v. 16, n. 3, p. 411, 2016). A automação pode ser facilitada e otimizada utilizando dispositivos de instrumentação, compatíveis com as tecnologias sem fio da automação 4.0 que permitem o uso de programas adotados por grandes sistemas produtivos industriais.

09. O documento de patente WO 2010/043055 descreve o uso de marcadores biológicos endógenos de fluorescência para determinar parâmetros biológicos de uma célula em um líquido, sendo os marcadores biológicos triptamina, dinucleótido de flavina e adenina, riboflavina, piroxidina, dinucleotídeo de adenina e nicotinamida, fosfato de dinucleotídeo de adenina e nicotinamida, e sanguinarina. Entretanto, o uso dos marcadores biológicos endógenos de fluorescência é restrito a componentes celulares que se correlacionam, direta ou indiretamente com estes marcadores. Portanto, o documento de patente WO 2010/043055 não possibilita determinar parâmetros biológicos que não se correlacionam com marcadores biológicos endógenos de fluorescência específicos.

10. O documento de patente US 2005/0239044 descreve o uso da técnica de fluorescência para o monitoramento em tempo real de microrganismos produtores de hidrogênio, e os parâmetros de fluorescência compreendidos por esta técnica são a fluorescência estável da clorofila em células adaptadas a luz e o nível máximo de fluorescência induzida por pulso de luz saturado em células adaptadas à luz.

11. Os sensores de monitoramento de cultivo de microalgas são baseados em fluorescência ou densidade óptica, e se limitam a determinação da concentração de biomassa ou de células, conforme descrito nos documentos TW201516154, WO2015121987 e DE29607285.

12. O documento de patente WO 2017/004236 descreve um sensor óptico com múltiplos comprimentos de ondas baseado em lasers e fotodiodos para monitoramento do crescimento e densidade óptica de cultivos de microrganismos em tempo real.

13. O documento de patente CN109752351 descreve um método para regular a dosagem de nitrogênio em cultivos de microalgas com base no monitoramento da fluorescência de clorofila em tempo real.

14. O documento de patente KR1878385 descreve um aparelho dotado de uma unidade que mede a fluorescência de ficocianina para estimar a concentração de uma cultura de microalga.

15. O documento de patente US2013030715 consiste de um aparelho e método para monitoramento de microrganismos autotróficos baseado na razão entre concentração de clorofila e densidade óptica.

16. O documento de patente JP2014143921 consiste de um método para determinação do crescimento de microalgas utilizando comprimentos de ondas nas regiões do verde (500 a 570 nanômetros) e vermelho (620 a 740 nanômetros).

17. Portanto, observa-se que dispositivos baseados em fluorescência são majoritariamente desenvolvidos para a detecção da fluorescência de clorofila, que é o principal pigmento fotossintetizante em microalgas. Portanto, existe a carência de um dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas em tempo real e no local do cultivo, que seja dedicado a medição de fluorescência de proteínas fluorescentes.

18. O presente invento se baseia na fluorescência de proteínas para estimar em tempo real o teor de componentes celulares de microalgas. A expressão de uma ampla gama de proteínas fluorescentes, as quais cobrem uma ampla faixa do espectro de luz visível, em microalgas já foi demonstrada como tecnicamente possível (RASALA, B. A. e colab. Expanding the spectral palette of fluorescent proteins for the green microalga Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal, v. 74, n. 4, p. 545-556, 2013). Além disso, a fluorescência de proteínas em células de microalgas pode ser mensurada em equipamento laboratorial adequado como, por exemplo, leitor de fluorescência em microplacas, microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (RASALA, B. A. e colab. Expanding the spectral palette of fluorescent proteins for the green microalga Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal, v. 74, n. 4, p. 545-556, 2013). Portanto, linhagens de microalgas podem ser geneticamente desenvolvidas para expressarem proteínas fluorescentes concomitantemente com proteínas importantes de vias bioquímicas relacionadas com componentes celulares de interesse. De fato, uma das grandes vantagens de métodos baseados em fluorescência reside na possibilidade de expressar uma proteína endógena de interesse juntamente com uma proteína fluorescente para localização de proteínas e estudos funcionais (RASALA, B. A. e colab. Expanding the spectral palette of fluorescent proteins for the green microalga Chlamydomonas reinhardtii. The Plant Journal, v. 74, n. 4, p. 545-556, 2013). As proteínas fluorescentes, ao serem excitadas por uma fonte de luz, que pode ser um comprimento de onda específico ou uma faixa de comprimentos de onda, emitem fluorescência que pode ser convertida por sensor de luz ou tubo fotomultiplicador em sinal elétrico. O sinal produzido pelo sensor de luz ou tubo fotomultiplicador pode ser registrado e correlacionado com componente celular ou grupo de componentes celulares de interesse. Desta forma, a proteína fluorescente exerce a função de reportar a expressão de proteínas de uma via metabólica relacionada com componente celular ou grupos de componentes celulares de interesse, permitindo assim estimar o teor de componente celular ou grupos de componentes celulares a partir de modelos empíricos de regressão. De fato, proteínas fluorescentes já foram utilizadas com sucesso em bactérias para indicar o consumo de carboidratos (LEVEAU, J. H. J. e LINDOW, S. E. Appetite of an epiphyte: quantitative monitoring of bacterial sugar consumption in the phyllosphere. Proceedings of the National Academy of Sciences, v. 98, n. 6, p. 3446-3453, 2001).

19. O presente invento é um dispositivo microcontrolado capaz de estimar em tempo real e de forma não destrutiva a composição de componentes celulares em microalgas que expressam proteínas fluorescentes, sendo a função principal do dispositivo a quantificação da fluorescência emitida por proteínas em tempo real e no local do cultivo, como por exemplo uma fazenda de microalgas. O dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas em tempo real baseado em fluorescência de proteína pode ser aplicado em sistemas de cultivos de microalgas abertos ou fechados, sendo compatível com quaisquer sistemas de cultivos. O dispositivo também é capaz de medir a densidade óptica do cultivo de microalgas, permitindo assim que correlações e normalizações de sinais referentes ao aumento da fluorescência e a densidade óptica sejam realizados. A densidade óptica pode ser correlacionada com a produção de biomassa (GRIFFITHS, M. J. e colab. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods, v. 85, n. 2, p. 119-123, 2011), permitindo assim avaliar se o acúmulo de um componente celular ou grupo de componentes celulares está ocorrendo concomitantemente com a produção de biomassa (Figura 1); ou se o incremento no teor de um componente celular ou grupo de componentes celulares está ocorrendo após a produção de biomassa ter cessado (Figura 2).

20. O dispositivo ainda pode ser utilizado para controle de sistemas de cultivo através da adição de relés conectados a atuadores (válvulas solenoides, bombas peristálticas, resistências elétricas, conjunto de luzes, entre outros). O dispositivo pode controlar aquecedores, dispositivos de agitação, dosadores de nutrientes, iluminação artificial e sistema de colheita de biomassa. Por fim, o dispositivo é capaz de transmitir os dados por meio de redes industriais utilizando cabos ou ondas de rádio para sistemas de aquisição de dados e controle supervisório. O dispositivo foi desenvolvido exclusivamente para linhagens de microalgas que expressam proteínas fluorescentes que desempenham a função de reportar a expressão de proteínas de uma via metabólica relacionada com componente celular ou grupos de componentes celulares de interesse.

DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

21. Figura 1: O gráfico indica que o acúmulo de um componente celular pode ocorrer concomitantemente com a produção de biomassa, e pode ser estimado a partir da fluorescência de proteína que desempenha a função de reportar a expressão de proteínas de uma via metabólica relacionada com o componente celular de interesse. A biomassa pode ser estimada a partir da medição da densidade óptica da suspensão de células.

22. Figura 2: O gráfico indica que o acúmulo de um componente celular pode ocorrer após cessada a produção de biomassa, e pode ser estimado a partir da fluorescência de proteína que desempenha a função de reportar a expressão de proteínas de uma via metabólica relacionada com o componente celular de interesse. A biomassa pode ser estimada a partir da medição da densidade óptica da suspensão de células.

23. Figura 3: Dispositivo de medição de fluorescência com seus componentes: central controladora (1), tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), unidade de medição de fluorescência (3), e unidade de medição de densidade óptica (4).

24. Figura 4: Unidade de medição de fluorescência e seus componentes: tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), laser ou diodo emissor de luz (5), sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), lamínula (7), filtro de emissão (8), e sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9).

25. Figura 5: Unidade de medição de fluorescência e seus componentes: tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), laser ou diodo emissor de luz (5), sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), filtro de emissão (8), e filtro dicroico (10).

26. Figura 6: Unidade de medição de densidade óptica e seus componentes: tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), lamínula (7), diodo emissor de luz (11), sensor de luz (12), e sensor de luz lateral (13).

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

27. O dispositivo proposto é baseado na excitação de proteína fluorescente de microalga por laser ou diodo emissor de luz com comprimento de onda específico ou faixa de comprimentos de onda. A proteína fluorescente pode ser homóloga ou heteróloga, e a proteína fluorescente deve ser, diretamente ou indiretamente, relacionada com via bioquímica de microalga que está envolvida com o componente celular de interesse. Proteína fluorescente, ao ser excitada por fonte de luz utilizando comprimento de onda específico ou faixa de comprimento de onda, emite fluorescência em um maior comprimento de onda específico ou uma faixa de comprimentos de onda do espectro de luz visível. A fluorescência emitida pela proteína excitada por fonte de luz pode ser registrada e relacionada com um componente ou grupo de componentes celulares de microalgas. Modelos empíricos de regressão obtidos a partir desta correlação podem ser utilizados para estimar o teor do componente ou grupo de componentes celulares de interesse em tempo real a partir do registro da fluorescência medida em novos cultivos de microalga. O componente ou grupo de componentes celulares de interesse precisam ser previamente determinados por método físico, químico ou biológico adequado de forma a possibilitar que seja realizada a correlação com proteínas fluorescentes para obtenção dos modelos empíricos de regressão. O dispositivo proposto possui, mas não se limita a um, dois ou três lasers ou diodo de emissão de luz que podem ser utilizados para excitar, mas não se limita a uma, duas, três, quatro ou mais proteínas fluorescentes presentes na microalga.

28. O uso de laser ou diodo emissor de luz com comprimento de onda específico ou faixas de comprimentos de onda possibilita ao dispositivo excitar diferentes proteínas fluorescentes que podem ser expressas em microalgas tais como, mas não se limitam a proteína verde fluorescente de Aequorea victoria, a proteína vermelha fluorescente (mCherry) de Discosoma sp., a proteína amarela fluorescente (Venus) de Aequorea victoria, a proteína laranja fluorescente (tdTomato) de Discosoma sp., a proteína azul fluorescente (TagBFP) de Entacmaea quadricoior, proteína verde fluorescente (bfloGFPa1) de Branchiostoma fioridae, proteína vermelha fluorescente (DsRed1) de Discosoma sp., e a proteína vermelha fluorescente (RFP611) de Entacmaea quadricolor.

29. O dispositivo de quantificação (Figura 3) apresenta uma central microcontroladora das unidades (1), composto por uma tela de cristal líquido retroiluminada e botões para a configuração do sistema. O dispositivo possui unidades de medição de fluorescência que podem ser, mas não se limitam a uma, duas, três, quatro ou mais unidades de medição de fluorescência (3). O dispositivo possui uma unidade de medição de densidade óptica (4). As unidades de medição de fluorescência (3) e densidade óptica (4) estão acopladas a tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2). O dispositivo possui um equipamento de bombeamento de cultura contendo células de microalgas.

30. A unidade de medição de densidade óptica (4) do dispositivo de quantificação (Figura 3) é capaz de medir a densidade óptica da cultura contendo células de microalgas utilizando comprimentos de onda entre 750 e 850 nanometros. Comprimentos de onda entre 750 e 850 nanometros foram previamente reportados como adequados para se correlacionar valores de densidade óptica com o aumento da biomassa em cultivos de microalgas (GRIFFITHS, M. J. e colab. Interference by pigment in the estimation of microalgal biomass concentration by optical density. Journal of Microbiological Methods, v. 85, n. 2, p. 119-123, 2011). Os dados de fluorescência das proteínas excitadas por fonte de luz podem ser normalizados utilizando os dados de densidade óptica utilizando comprimento de onda entre 750 e 850 nanômetros, permitindo assim que modelos empíricos de regressão sejam utilizados para monitorar o aumento do teor do componente ou grupo de componentes celulares em microalgas levando em consideração o aumento da biomassa, desta forma é possível identificar se o aumento do teor de componente ou grupo de componentes celulares é resultado da produção de biomassa (Figura 1) ou resultado de alterações no perfil bioquímico das células após a produção de biomassa da microalga ter cessado (Figura 2). Em geral, o aumento da produção de biomassa de microalgas é resultado de divisão celular ou aumento do volume celular.

31. Em algumas modalidades do presente invento (Figura 4), a unidade de medição de fluorescência (3) é composta por tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), laser ou diodo emissor de luz (5), sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), lamínula (7), filtro de emissão (8), e sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9). O comprimento de onda do laser ou diodo emissor de luz (5) pode ser específico da região do espectro de luz visível entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou faixas de comprimentos de onda na região do espectro de luz visível entre 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 750 nanômetros. Ο filtro de emissão (8) pode permitir a passagem de luz na região do espectro de luz em comprimentos de onda específicos entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou em faixas tais como, mas não limitadas a 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 750 nanômetros. O sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) e 0 sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9) apresentam sensibilidade entre os comprimentos de onda 400 e 950 nanômetros, ou faixa que compreenda esses comprimentos, e operam com tensão de alimentação de 5 volts em corrente contínua.

32. Em algumas modalidades do presente invento (Figura 4), um sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) é colocado no lado oposto ao laser ou diodo emissor de luz (5) para captar a fluorescência que passa pela amostra. O sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) pode, opcionalmente, ser colocado em um compartimento que o protege de luz difusa. A fluorescência que incide sobre o sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) é previamente filtrada utilizando filtro de emissão (8) que é colocado na entrada do compartimento do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6). Outro sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (9) ê colocado perpendicularmente ao laser ou diodo emissor de luz (5) para captar a fluorescência de saída que é refletida por uma lâmina (7) de borossilicato ou material óptico adequado. O sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (9) lateral deve ser posicionado em um ângulo de 45° em relação a lamínula (7).

33. Em algumas modalidades do presente invento (Figura 5), a unidade de medição de fluorescência (3) é composta por tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), laser ou diodo emissor de luz (5), sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), filtro de emissão (8) e filtro dicroico (10). O comprimento de onda do laser ou diodo emissor de luz (5) pode ser específico da região do espectro de luz visível entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou grupos de comprimentos de onda na região do espectro de luz visível entre 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 750 nanômetros. O filtro dicroico (10) deve ser posicionado em um ângulo de 45° em relação ao laser ou diodo emissor de luz (5). O filtro dicroico (10) pode permitir a passagem de luz do laser ou diodo emissor de luz para a amostra com comprimentos de ondas específicos da região do espectro de luz visível entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou grupo de comprimentos de onda da região do espectro de luz visível entre 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 750 nanômetros. Outra função do filtro dicroico (10) é filtrar a passagem de luz da amostra para o sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), com comprimentos de ondas específicos da região do espectro de luz visível entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou grupo de comprimentos de onda da região do espectro de luz visível entre 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 750 nanômetros. O filtro de emissão (8) pode permitir a passagem de luz na região do espectro de luz visível em comprimentos de onda específicos entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou em faixas tais como, mas não limitadas a 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 850 nanômetros. O sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) apresenta sensibilidade entre os comprimentos de onda 400 e 950 nanômetros, ou faixa que compreenda esses comprimentos, e que operam com tensão de alimentação de 5 volts em corrente contínua.

34. Em algumas modalidades do presente invento (Figura 5), um sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) é colocado perpendicularmente ao laser ou diodo emissor de luz (5) para captar a fluorescência emitida pela amostra e refletida pela tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2). A tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2) deve ser adequada para refletir fluorescência. O sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), pode, opcionalmente, ser colocado em um compartimento que o protege de luz difusa. A fluorescência que incide sobre o sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) é previamente filtrada utilizando filtro de emissão (8) que é colocado na entrada do compartimento do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6).

35. Em algumas modalidades do presente invento (Figura 6), a unidade de medição de densidade óptica (4) é composta por tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), lamínula (7), diodo emissor de luz (11) no comprimento de onda de 750 nanômetros, sensor de luz (12), e sensor de luz lateral (13). O sensor de luz (12) e sensor de luz lateral (13) apresentam sensibilidade entre os comprimentos de onda 400 e 950 nanômetros, ou faixa que compreenda esses comprimentos, e operam com tensão de alimentação de 5 volts em corrente contínua. O sensor de luz (12) é colocado do lado oposto ao diodo emissor de luz (11) para captar a intensidade luminosa que passa pela amostra. O sensor de luz lateral (13) é colocado perpendicularmente ao diodo emissor de luz (11) para captar a intensidade luminosa de saída que é refletida por uma lâmina (7) de borossilicato ou material óptico adequado. O sensor de luz lateral (13) deve ser posicionado em um ângulo de 45° em relação a lamínula (7).

36. Em todas as modalidades do presente invento (Figuras 3, 4, 5 e 6) as medidas de fluorescência e densidade óptica são efetuadas em fluxo, ou seja, a amostra é bombeada do cultivo e escoa por uma tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2) de material transparente adequado para análise de fluorescência ou densidade óptica. O fluído pode ser colocado em fluxo na unidade de medição de fluorescência (Figuras 4 e 5) ou densidade óptica (Figura 6) por dispositivos de bombeamento como bomba peristáltica ou similar, a unidade também pode ser submersa de forma a possibilitar o fluxo de microalgas pelo caminho óptico de medição. A tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2) pode possuir diâmetro interno entre, mas não se limita a 1 a 30 milímetros, sendo este diâmetro o caminho óptico da unidade de medição de fluorescência (Figuras 4 e 5) e densidade óptica (Figura 6).

37. A parte estrutural na qual são fixados os componentes do dispositivo (Figuras 3, 4, 5 e 6) é personalizada e impressa utilizando, mas não limitado ao polímero acrilonitrila butadieno estireno ou similar. Uma cobertura de tinta adequada para análises de fluorescência (Figuras 4 e 5) e densidade óptica (Figura 6) pode ser aplicada na parte estrutural de fixação das peças do dispositivo. As placas de circuito impresso são confeccionadas por processo de termotransferência com posterior corrosão química utilizando solução de percloreto de ferro.

38. Controle, aquisição e processamento de dados do dispositivo são feitos por microcontrolador, de 16 bits ou 32 bits, com, mas não limitado a três entradas analógicas, conversores analógicos digitais de 8 bits ou superiores, com, mas não limitado a seis saídas com modulação de largura de pulso de 8 bits ou superior, e interface de comunicação serial RS-232 ou equivalente. Adaptadores RS-232 para porta serial universal (USB), RS-485, RS-422, Wi-Fi IEEE 802.11, Bluetooth®, Wi-Fi IEEE 802.11, Zigbee, redes de telefonia 4G e 5G, ou equivalentes, podem ser utilizados para transmissão dos dados. O dispositivo é alimentado por uma fonte de corrente contínua com tensão entre 7 e 24 volts, e corrente de 2 amperes.

39. O uso do microcontrolador permite a expansão do dispositivo com diversos sensores e equipamentos de controle de cultivos de microalgas. Entre tipos de sensores, podem-se acoplar sensores para quantificação do carbono orgânico ou inorgânico, oxigênio dissolvido, salinidade e pH do cultivo de microalgas. Além disso, pode-se conectar relés ou inversores de frequência para acionamento de atuadores, como bombas e válvulas solenoides para injeção de nutrientes, drenagem biomassa, injeção de meio de cultura, dentre outras possibilidades.

40. O controle de intensidade luminosa do laser ou diodo emissor de luz (5) (Figuras 4 e 5) e do diodo emissor de luz (11) (Figura 6) pode ser feito por modulação de largura de pulso, ou técnicas similares, geradas pelo microcontrolador. Este circuito permite o controle da intensidade luminosa pelo controle da corrente de alimentação do laser ou diodo emissor de luz (5) (Figuras 4 e 5) e do diodo emissor de luz (11) (Figura 6), feito pelo chaveamento do transistor em resposta a modulação de largura de pulso. A filtragem é aplicada junto ao circuito por um filtro passa-baixa com frequência de corte de 7,2 a 50 hertz para atenuar a ondulação da corrente durante o chaveamento.

41. A aquisição de dados do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) (Figuras 4 e 5), do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9) (Figura 4), do sensor de luz (12) (Figura 6), e do sensor de luz lateral (13) (Figura 6) é feita por conversor analógico digital de 8 a 12 bits, integrado ao microcontrolador ou dedicado e conectado por interface de comunicação ao microcontrolador. Um filtro eletrônico passa-baixa com frequência de corte de 7,2 a 50 hertz é aplicado para a atenuação de ruídos entre a saída do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) (Figuras 4 e 5), do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9) (Figura 4), do sensor de luz (12) (Figura 6), e do sensor de luz lateral (13) (Figura 6), e o conversor analógico digital. Para a tradução da resposta do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) (Figuras 4 e 5), do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9) (Figura 4), do sensor de luz (12) (Figura 6), e do sensor de luz lateral (13) (Figura 6), para estimar os valores dos conteúdos celulares ou biomassa da amostra de cultura de microalga, pode-se utilizar modelos empíricos de regressão para a predição de valores com respostas lineares ou não lineares, incluindo redes neurais artificiais, para estimar o conteúdo ou grupo de conteúdos celulares de interesse.

Claims (22)

1. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz caracterizado por compreender central microcontroladora das unidades (1), composto por uma tela de cristal líquido retroiluminada e botões para configuração do sistema; tubulação de entrada e saída de fluxos de cultivos de células de microalgas (2) na qual estão acopladas pelo menos uma unidade de medição de fluorescência (3), pelo menos uma unidade de medição de densidade óptica (4) e equipamento de bombeamento da cultura.
2. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade de medição de fluorescência (3) compreender tubulação para bombeamento de cultura da microalga (2), laser ou diodo emissor de luz (5), sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), lamínula (7), filtro de emissão (8), e sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9).
3. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) ser colocado no lado oposto ao laser ou diodo emissor de luz (5), e poder, opcionalmente, ser colocado em um compartimento para proteção de luz difusa; o filtro de emissão (8) ser colocado na entrada do compartimento de proteção do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), o sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9) ser colocado perpendicularmente ao laser ou diodo emissor de luz (5), e com um ângulo de 45° em relação a lamínula de borossilicato ou material óptico adequado (7).
4. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade de medição de fluorescência (3), alternativamente, compreender tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), laser ou diodo emissor de luz (5), sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), filtro de emissão (8) e filtro dicroico (10).
5. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com as reivindicações 1 e 4, caracterizado por o sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) ser colocado perpendicularmente ao laser ou diodo emissor de luz (5) e poder ser, opcionalmente, colocado em um compartimento de proteção de luz difusa; o filtro de emissão (8) ser colocado na entrada do compartimento do sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6), e o filtro dicroico (10) ser posicionado com um ângulo de 45° em relação ao laser ou diodo emissor de luz (5).
6. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o laser ou diodo emissor de luz (5) possuir comprimentos de onda específicos da região do espectro de luz visível entre 400 e 850 nanômetros com resolução de 1 nanômetro, ou faixas de comprimentos de onda na região do espectro de luz visível entre 400 e 450 nanômetros, entre 450 e 500 nanômetros, entre 500 e 550 nanômetros, entre 550 e 600 nanômetros, entre 600 e 650 nanômetros, entre 650 e 700 nanômetros, ou entre 700 e 750 nanômetros.
7. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a unidade de medição de densidade óptica (4) compreender tubulação para bombeamento de cultura de microalga (2), lamínula (7), diodo emissor de luz (11) no comprimento de onda de 750 nanômetros, sensor de luz (12) e sensor de luz lateral (13).
8. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com as reivindicações 1 e 7, caracterizado por 0 diodo emissor de luz (11) ser colocado do lado oposto do sensor de luz (12) e perpendicular ao sensor de luz lateral (13) que é colocado em um ângulo de 45° em relação a lamínula (7).
9. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por os sensores de luz ou tubos fotomultiplicadores (6, 9, 12 e 13) apresentarem sensibilidade entre os comprimentos de onda 400 e 950 nanômetros, ou faixa que compreenda esses comprimentos, e operarem com tensão de alimentação de 5 volts em corrente contínua.
10. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as medidas de fluorescência e densidade óptica serem efetuadas em fluxo, sendo o fluxo colocado nas unidades de medição de fluorescência (3) e densidade óptica (4) por bomba peristáltica ou similar ou por submersão das unidades (3 e 4).
11. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o tubo para bombeamento de cultura de microalga (2) ser em material transparente adequado para análise de fluorescência ou densidade óptica, com 1 a 30 milímetros de diâmetro.
12. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pela parte estrutural na qual são fixados os componentes do dispositivo ser de acrilonitrila butadieno estireno ou similar, e, opcionalmente, compreender uma cobertura de tinta adequada para análises de fluorescência e densidade óptica.
13. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por as placas de circuito impresso serem confeccionadas por processo de termotransferência com posterior corrosão química utilizando solução de percloreto de ferro.
14. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a central microcontroladora (1) compreender microcontrolador de 16 bits ou 32 bits, com pelo menos três entradas analógicas; conversores analógicos digitais de oito bits ou superior, com pelo menos 6 saídas com modulação de largura de pulso de 8 bits ou superior, e interface de comunicação serial RS-232 ou equivalente.
15. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por ser alimentado por uma fonte de corrente contínua com tensão entre 7 e 24 volts e corrente de 2 amperes.
16. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por poder utilizar sensores para quantificação de carbono orgânico ou inorgânico, oxigênio dissolvido, salinidade e pH do cultivo.
17. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por, opcionalmente, utilizar relés ou inversores de frequência para acionamento de atuadores, como bombas e válvulas solenoides para injeção de nutrientes, drenagem de biomassa e injeção de meio de cultura.
18. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o controle de intensidade luminosa de laser ou diodos emissores de luz (5 e 11) ser feito por modulação de largura de pulso, ou técnicas similares, e pelo controle de corrente de alimentação do laser ou diodos emissores de luz (5 e 11) ser feito por meio do chaveamento do transistor em resposta a modulação de largura do pulso.
19. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por aplicar filtragem junto ao circuito por um filtro passa-baixa com frequência de corte de 7,2 a 50 hertz para atenuar a ondulação da corrente durante o chaveamento.
20. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por utilizar modelos empíricos de regressão para estimar os valores dos conteúdos celulares da amostra de cultura de microalga a partir de sinal de fluorescência gerado por proteína fluorescente que é registrado por sensor de luz ou tubo fotomultiplicador (6) e sensor de luz ou tubo fotomultiplicador lateral (9).
21. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por utilizar modelos empíricos de regressão para estimar a concentração de biomassa da amostra de cultura de microalga a partir do sinal de densidade óptica gerado por sensor de luz (12) e sensor de luz lateral (13).
22. Dispositivo de monitoramento de componentes celulares de microalgas baseado em fluorescência de proteína induzida por laser ou diodo emissor de luz, de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender uso de lasers ou diodos emissores de luz com comprimentos de ondas específicos ou faixas de comprimentos de ondas que possibilita ao dispositivo excitar diferentes proteínas fluorescentes que podem ser expressas em microalgas.

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