JP2019184337A - マイクロチップ、微小粒子測定装置、及び微小粒子測定方法 - Google Patents

マイクロチップ、微小粒子測定装置、及び微小粒子測定方法 Download PDF

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淳志 梶原
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Abstract

【課題】フローサイトメトリーにおいて検出精度を向上させることが可能な技術を提供すること。【解決手段】少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップなどを提供する。【選択図】図１

Description

本技術は、マイクロチップ、微小粒子測定装置、及び微小粒子測定方法に関する。
現在、細胞や微生物などの生体関連に関連する微小粒子の分析には、フローサイトメトリーという技術が利用されている。このフローサイトメトリーは、流路内に送液するシース流に内包されるように流れる微小粒子に光を照射し、個々の微小粒子から発せられた蛍光や散乱光を検出することで、微小粒子の解析や分取を行う分析手法である。このフローサイトメトリーに用いられる装置は、フローサイトメーター（「セルソーター」と称される場合もある）と呼ばれている。
このフローサイトメーターでは、シリコンやガラス製の基板上に化学的又は生物学的分析を行うための領域や流路が設けられたマイクロチップが用いられている。このようなマイクロチップを用いた分析システムは、μ−ＴＡＳ（ｍｉｃｒｏ−ｔｏｔａｌ−ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｙｓｔｅｍ）やラボ・オン・チップ、バイオチップなどと称される。
微小粒子測定技術へのμ−ＴＡＳの応用例として、マイクロチップ上に配設された流路や領域内で微小粒子の特性を光学的、電気的、或いは磁気的に測定する微小粒子測定装置がある。このようなμ−ＴＡＳを応用したフローサイトメーター（マイクロチップ型フローサイトメーター）では、ディスポーザブルユース（使い捨て）が可能なマイクロチップにより流路系を構成することで、測定間でのサンプルのクロスコンタミネーションを防止できるというメリットがある。
例えば、特許文献１には、「微小粒子を含む液体が通流する主流路と、前記微小粒子が取り込まれる捕獲室と負圧が発生する圧力室とが配置され、前記主流路に連通する分取流路と、を備え、前記捕獲室及び前記圧力室における前記液体の流れ方向に対する垂直断面が、前記分取流路の他の部分における前記液体の流れ方向に対する垂直断面よりも大きく形成されているマイクロチップ」が開示されている。
特開２０１７−５８３７５号公報
しかし、従来の励起系と蛍光検出系とが対物レンズを共有する構成の装置の場合には、強い励起光による対物レンズの自家蛍光が蛍光検出系に漏れ込み、Ｓ／Ｎ比を悪化させる原因の一つになることが知られていた。
そこで、本技術では、フローサイトメトリーにおいて検出精度を向上させることが可能な技術を提供することを主目的とする。
本技術では、まず、少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップを提供する。
本技術に係るマイクロチップでは、前記基板層の側面の反対側の側面に光を検出可能な光学検出領域を更に備えていてもよい。この場合、前記複数の基板層の接合面が、前記光学検出領域を避けるように形成されていてもよい。
また、本技術に係るマイクロチップでは、前記光学照射領域が、前記複数の基板層の接合面の片側に設けられていてもよい。
更に、本技術に係るマイクロチップでは、前記マイクロチップの面における前記光学照射領域及び／又は前記光学検出領域の周囲に、切り欠き部を更に備えていてもよい。この場合、前記切り欠き部は、前記マイクロチップの面において左右に設けられていてもよい。また、この場合、左右に設けられた切り欠き部は、前記マイクロチップの正面の中心線に対して非対称であってもよい。
加えて、本技術に係るマイクロチップでは、内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備えていてもよい。この場合、前記反射構造は、光が照射される側面の対面の側面にミラーを有する構造であってもよい。また、この場合、前記ミラーは、所定の散乱角光線に対応した構造であってもよい。
また、本技術では、少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する光照射部と、前記微小粒子からの光を検出する検出部と、を少なくとも備える、微小粒子測定装置も提供する。
本技術に係る微小粒子測定装置では、前記光照射部は、前記マイクロチップ内の流路の流れ方向と平行する側面に対して光を照射してもよい。
また、本技術に係る微小粒子測定装置では、前記検出部は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部と、蛍光を検出する蛍光検出部と、を含み、前記前方散乱光検出部は、前記マイクロチップの側面と同一の方向に位置し、前記蛍光検出部は、前記マイクロチップの側面とは異なる方向に位置していてもよい。この場合、前記前方散乱光検出部と、前記蛍光検出部とは、前記マイクロチップの側面に対して略９０度異なる方向に位置していてもよい。
更に、本技術に係る微小粒子測定装置では、前記検出部は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部と、蛍光を検出する蛍光検出部と、を含み、前記前方散乱光検出部及び前記蛍光検出部は、前記マイクロチップの側面とは異なる方向に位置していてもよい。この場合、前記マイクロチップは、内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備え、前記前方散乱光検出部は、前記反射構造により反射された前方散乱光を検出してもよい。
更に、本技術では、少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する光照射工程と、前記微小粒子からの光を検出する検出工程と、を少なくとも行う、微小粒子測定方法も提供する。
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソーム等の生体関連微小粒子、或いはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子等の合成粒子などが広く含まれ得る。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ（細胞小器官）などが含まれる。細胞には、動物細胞（例えば、血球系細胞など）及び植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌等の細菌類、タバコモザイクウイルス等のウイルス類、イースト菌等の菌類などが含まれる。更に、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体等の生体関連高分子をも包含される。また、工業用粒子は、例えば、有機又は無機高分子材料、金属等であってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレート等が含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料等が含まれる。金属には、金コロイド、アルミ等が含まれる。これらの微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、本技術では、非球形であってもよく、また、その大きさ、質量等も特に限定されない。
本技術によれば、フローサイトメトリーにおいて検出精度を向上させることが可能な技術を提供することが可能である。
なお、ここに記載された効果は、必ずしも限定されるものではなく、本開示中に記載されたいずれかの効果であってもよい。
本技術に係るマイクロチップの第一実施形態を示す上面図である。 図１に示す実施形態のマイクロチップ及び圧力調整部を示す斜視図である。 図１中のＱ−Ｑ線断面図である。 図１に示す実施形態のマイクロチップに形成される主流路と分取流路の分岐部の構成を説明する図である。 図１に示す実施形態のマイクロチップに形成されるシース液バイパス流路のシース液インレット側端の構成を説明する図である。 図１に示す実施形態のマイクロチップに形成されるシース液バイパス流路の排出口側端の構成を説明する図である。 Ａは、マイクロチップの側面から視た光学検出領域付近の構造の一例を示す図であり、Ｂは、該光学検出領域付近の断面図である。 Ａは、図７とは異なる、マイクロチップの側面から視た光学検出領域付近の構造の一例を示す図であり、Ｂは、該光学検出領域付近の断面図である。 Ａは、本技術に係るマイクロチップの第二実施形態を示す上面図であり、Ｂは、光学照射領域及び光学検出領域付近の断面図である。 Ａは、本技術に係るマイクロチップの第三実施形態を示す上面図であり、Ｂは、ミラー付近の断面図の一例を示す図であり、Ｃは、Ｂとは異なる、ミラー付近の断面図の一例を示す図である。 圧力調整部の機能を説明する図である。 主流路と分岐流路の分岐部において生じ得る試料及びシース液の流れを説明する図である。 分取流路の排出口から導入されるシース液の流れを説明する図である。 分取動作時の目標試料の引き込み位置を説明する図である。 本技術に係るマイクロチップの第四実施形態を示す上面図である。 本技術に係る微小粒子測定装置１０の第一実施形態を模式的に示す模式図である。 本技術に係る微小粒子測定装置１０の第二実施形態を模式的に示す模式図である。
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。なお、説明は以下の順序で行う。
１．マイクロチップ１
２．微小粒子測定装置１０
＜第一実施形態＞
（１）光照射部１０１
（２）検出部１０２
（３）その他
＜第二実施形態＞
３．微小粒子測定方法
（１）光照射工程
（２）検出工程
１．マイクロチップ１
本技術に係るマイクロチップ１は、少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域１１５ａを少なくとも備える。以下、本技術に係るマイクロチップ１について、図面を参照しながら詳細に説明する。
図１に示す実施形態のマイクロチップ１では、分取対象とする微小粒子を含む液体（以下、「試料」とも称する）は、試料インレット１１１から試料流路１１２に導入される。また、シース液インレット１１３からはシース液が導入される。シース液インレット１１３から導入されたシース液は、２本のシース液流路１１４に分流されて送液される。試料流路１１２と２本のシース液流路１１４は合流して主流路１１５となる。試料流路１１２を送液される試料層流Ｓと、シース液流路１１４を送液されるシース液層流Ｔと、は主流路１１５内において合流し、試料層流がシース液層流に挟み込まれたシースフローを形成する（後述する図４のＣ参照）。
また、シース液インレット１１３から導入されたシース液は、シース液流路１１４とは別に形成されたシース液バイパス流路１１８にも送液される。シース液バイパス流路１１８の一端はシース液インレット１１３に接続しており、他端は後述する分取流路１１６の主流路１１５への連通口近傍に接続している（図３参照）。シース液バイパス流路１１８のシース液導入端は、シース液インレット１１３及びシース液流路１１４を含むシース液の通流部位のいずれかの箇所に接続されていればよいが、好ましくはシース液インレット１１３に接続される。２つのシース液流路１１４が幾何学的に対称になる中心位置（すなわち、本実施形態ではシース液インレット１１３）にシース液バイパス流路１１８を接続することで、２本のシース液流路１１４へシース液が等流量分配されるようにできる。図３中符号１５６は、主流路１１５への分取流路１１６の連通口を示し、符号１８１は、シース液バイパス流路１１８を送液されるシース液の分取流路１１６への排出口を示す。
主流路１１５は、その下流において、３つの流路に分岐している。主流路１１５の分岐部の構成を図４に示す。主流路１１５は、その下流において、分取流路１１６及び２本の廃棄流路１１７の３つの分岐流路と連通している。このうち、分取流路１１６は、目標とする微小粒子（以下、「目標試料」とも称する）が取り込まれる流路である。目標試料以外の試料（以下、「非目標試料」とも称する）は、分取流路１１６内に取り込まれることなく、２本の廃棄流路１１７のいずれか一方に流れる。
シース液バイパス流路１１８は、分取流路１１６の主流路１１５への連通口１５６の近傍に位置して設けられた排出口１８１に接続されている（図３参照）。シース液インレット１１３から導入されるシース液は、排出口１８１から分取流路１１６内に導入され、連通口１５６に分取流路１１６側から主流路１１５側へ向かうシース液の流れを形成する（この流れについては、後述する）。
マイクロチップ１は、例えば、３層の基板層からなり、試料流路１１２、シース液流路１１４、主流路１１５、分取流路１１６及び廃棄流路１１７は、１層目の基板層ａ１と２層目の基板層ａ２により形成されている（図３参照）。一方、シース液バイパス流路１１８は、２層目の基板層ａ２と３層目の基板層ａ３により形成されている。基板層ａ２、ａ３に形成されたシース液バイパス流路１１８は、基板層ａ１、ａ２に形成された試料流路１１２、シース液流路１１４及び主流路１１５と連絡することなく、シース液インレット１１３と分取流路１１６の排出口１８１とを接続している。シース液バイパス流路１１８のシース液インレット１１３側端及び排出口１８１側端の構成をそれぞれ図５及び６に示す。
なお、本技術において、マイクロチップ１の基板層の層構造は、３層に限定されず、４層、或いはそれ以上とすることもできる。また、シース液バイパス流路１１８の構成も、本実施形態における構造に限定されない。
目標試料の分取流路１１６内への取り込みは、圧力調整部１１０によって分取流路１１６内に負圧を発生させ、この負圧を利用して目標試料を分取流路１１６内に吸い込むことによって行われる。圧力調整部１１０は、例えば、ピエゾ素子などの圧電素子である。圧力調整部１１０は、前記分取流路１１６に対応する位置に配置されている。より具体的には、圧力調整部１１０は、分取流路１１６において内空が拡張された領域として設けられた圧力室１６１に対応する位置に配置されている（図２及び３参照）。圧力室１６１は、分取流路１１６において連通口１５６及び排出口１８１の下流に設けられる。
圧力室１６１の内空は、図１に示されるように、平面方向（分取流路１１６の幅方向）に拡張されるとともに、図３に示されるように、断面方向（分取流路１１６の高さ方向）にも拡張されている。すなわち、分取流路１１６は、圧力室１６１において幅方向及び高さ方向に拡張されている。換言すると、分取流路１１６は、圧力室１６１において分取対象試料及びシース液の流れ方向に対する垂直断面が大きくなるように形成されている。
圧力調整部１１０は、印加される電圧の変化に伴って伸縮力を発生し、マイクロチップ１の表面（接触面）を介して分取流路１１６内に圧力変化を生じさせる。分取流路１１６内の圧力変化に伴って分取流路１１６内に流動が生じると、同時に、分取流路１１６内の体積が変化する。分取流路１１６内の体積は、印加電圧に対応した圧力調整部１１０の変位量によって規定される体積に到達するまで変化する。より具体的には、圧力調整部１１０は、電圧を印加されて伸張した状態においては、圧力室１６１を構成する変位板１０１１（図３参照）を押圧して圧力室１６１の体積を小さく維持している。そして、印加される電圧が低下すると、圧力調整部１１０は収縮する方向へ力を発生し、変位板１０１１への押圧を弱めることによって圧力室１６１内に負圧を発生させる。
圧力調整部１１０の伸縮力を効率良く圧力室１６１内へ伝達するため、図３に示すように、マイクロチップ１の表面を圧力室１６１に対応する位置において陥凹させ、該陥凹内に圧力調整部１１０を配置することが好ましい。これにより、圧力調整部１１０の接触面となる変位板１０１１を薄くでき、変位板１０１１が圧力調整部１１０の伸縮に伴う押圧力の変化によって容易に変位して、圧力室１６１の容積変化をもたらすようにできる。
図３及び４中、符号１５６により、主流路１１５への分取流路１１６の連通口を示す。主流路１１５内に形成されたシースフロー中を送流される目標試料は、連通口１５６から分取流路１１６内に取り込まれる。主流路１１５から分取流路１１６への目標試料の取り込みを容易にするため、連通口１５６は、図４のＣに示すように、主流路１１５内に形成されるシースフロー中の試料層流Ｓに対応する位置に開口されていることが好ましい。連通口１５６の形状は、特に限定されないが、例えば、図４のＡに示すような平面に開口する形状や、図４のＢに示すような２本の廃棄流路１１７の流路壁を切り欠いて開口とする形状などを採用することができる。
マイクロチップ１は、主流路１１５等が形成された基板層を貼り合わせて構成できる。基板層への主流路１１５等の形成は、金型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形により行うことができる。熱可塑性樹脂には、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの、従来マイクロチップの材料として公知のプラスチックを採用することができる。
図１中符号１１５ａは、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して基板層の側面から光が照射される光学照射領域を示す。前記側面とは、好ましくは前記マイクロチップ内の流路の流れ方向と平行する側面である。マイクロチップ１が光学照射領域１１５ａを備えることで、マイクロチップ１の側面から励起光等の光を照射することが可能となる。その結果、対向する側面或いはマイクロチップ１の正面側において、目的とする微小粒子からの前方散乱光（Forward Scatter：ＦＳＣ）を取得することができる。また、蛍光信号（ＦＬ）並びに側方散乱光（Side Scatter：ＳＳＣ）をマイクロチップ１の正面側から取得することができる。これにより、装置側を励起系と蛍光検出系とが対物レンズを共有する構成とする必要がなくなり、強い励起光による対物レンズの自家蛍光が蛍光検出系に漏れ込むことを防ぎ、Ｓ／Ｎ比の悪化などといった現象を回避して、測定精度を向上させることができる。
図１中符号１１５ｂは、基板層の側面の反対側の側面にある、光を検出可能な光学検出領域を示す。光学検出領域では、励起光が照射され、試料から発せされる蛍光及び散乱光等の光の検出が行われる。試料は、主流路１１５に形成されるシースフロー中に一列に配列した状態で送流され、前記励起光により照射される。この光学検出領域１１５ｂを備えることで、光学照射領域１１５ａに照射された励起光などの光に起因する、蛍光、散乱光等の光を可能とし、より測定精度の向上を図ることができる。
本技術では、図７及び８に示すように、前記複数の基板層の接合面が、光学検出領域１１５ｂを避けるように形成されていることが好ましい。なお、図７及び８中、色が異なる２つの丸印は、波長の異なる２つのレーザーの照射を示している。マイクロチップ１は、複数の基板層を貼り合わせた多層構造であるが、その接合面がチップ側面から見て光照射する流路の中心を通る場合には、そこでの反射や散乱により、検出信号の品質を低下させてしまう。したがって、前記複数の基板層の接合面を、光学検出領域１１５ｂを避けるように形成することで、上記反射や散乱を防ぎ、蛍光、散乱光等の光の透過の阻害を回避することができ、測定精度の向上を図ることができる。
なお、マイクロチップ１において、接合面が複数存在する場合には、接合面の間に光学検出領域１１５ｂが設けられていてもよい。
また、光学照射領域１１５ａは、前記複数の基板層の接合面の片側に設けることが好ましい。前述の通り、複数の基板層の接合面が検出信号の品質を低下させるため、このようにすることで、励起光の照射が阻害されることを回避することができ、測定精度の向上を図ることができる。
なお、マイクロチップ１において、接合面が複数存在する場合には、光学照射領域１１５ａの部分のみ２層構造としてもよい。
本技術では、図９に示すように、マイクロチップ１の面における光学照射領域１１５ａ及び／又は光学検出領域１１５ｂの周囲に、切り欠き部を更に備えていることが好ましい。前記複数の基板層の接合面を光学検出領域１１５ｂから逃がした場合であっても、焦点位置まではビーム径が大きく、そのために接合面の影響を受ける可能性がある。このため、光学照射領域１１５ａ及び／又は光学検出領域１１５ｂの周囲に、切り欠き部を設け、影響を受けにくい小径ビームの状態でチップに入射させ、測定精度の向上を図ることができる。
前記切り欠き部の形状は特に限定されず、矩形や半円形等とすることができる。前記切り欠き部の大きさも特に限定されないが、例えば、マイクロチップ１の正面側の横幅を２５ｍｍとした場合、切り欠き部の横幅を２〜３ｍｍの大きさとすることができる。
また、前記切り欠き部は、図９に示すように、マイクロチップ１の面において左右に設けることが好ましい。これにより、上記の影響を受けにくくすることができ、より測定精度の向上を図ることができる。
また、この左右に設けられた切り欠き部は、マイクロチップ１の正面の中心線に対して非対称としてもよい。これにより、光学照射領域１１５ａと光学検出領域１１５ｂを形状により区別することができ、ユーザビリティが向上する。
本技術では、内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備えていることが好ましい。これにより、前方散乱光、蛍光信号、及び側方散乱光を、同一面（マイクロチップ１の正面側）から検出することが可能となり、装置側の検出系をまとめることができる。その結果、装置側の空間利用の自由度を上げることができる。
前記反射構造は、例えば、図１０のＡに示すように、光が照射される側面の対面の側面にミラー１１５ｃを有する構造とすることができる。
ミラー１１５ｃは特に限定されないが、例えば、図１０のＢやＣに示すように、所定の散乱角光線に対応した構造とすることができる。所定の散乱光線に対応した構造としては、例えば、前方散乱光の取得角（例えば、６〜９度）の光を取得するために紙面方向の立ち上げミラーを設定することができる。この光は、例えば、後述する前方散乱光検出部１０２１により検出される。なお、ミラー１１５ｃには、ＡＲコートやＨＲコート等が施されていてもよい。なお、図１０のＡでは、ミラー１１５ｃの個数を２つとしているが、本技術ではこれに限定されない。
以下、図１１〜１４を参照しながらマイクロチップ１の分取動作を説明する。
圧力調整部１１０により分取流路１１６内へ引き込まれた目標試料は、図１１のＡに示すように、圧力室１６１内に取り込まれる。図中、符号Ｐは、圧力室１６１内に取り込まれた目標試料を示し、符号１６２は、圧力室１６１への目標試料Ｐの取込口を示す。目標試料Ｐを含む試料及びシース液の流れは、内空が拡張された圧力室１６１に流入する際に噴流（ジェット）となり、流路壁面から剥離する（図１１のＡ中矢印参照）。このため、目標試料Ｐは、取込口１６２から離れて、圧力室１６１の奥まで取り込まれる。
目標試料を主流路１１５から圧力室１６１内にまで引き込むため、圧力室１６１の容積の増大量は、連通口１５６から引込口１６２までの分取流路１１６の容積（図３参照）よりも大きくされることが好ましい。また、圧力室１６１の容積の増大量は、目標試料Ｐを含む試料及びシース液の流れを取込口１６２において流路壁面から剥離させるために十分な負圧を発生するような大きさとされることが好ましい。
このように、目標試料Ｐを分取流路１１６において内空が拡張された圧力室１６１の奥にまで取り込むようにすることで、分取流路１１６内の圧力が逆転して正圧になった場合にも、目標試料Ｐが圧力室１６１から主流路１１５側へ再流出することを防止できる。すなわち、図１１のＢに示すように、分取流路１１６内が正圧となった場合にも、試料及びシース液が取込口１６２の近傍から広く流出していくため、取込口１６２から離れた位置まで取り込まれた目標試料Ｐそのものの移動量は小さくなる。このため、目標試料Ｐは、再流出することなく、圧力室１６１内に保持される。
前記圧力室１６１内には、非目標試料又はこれを含む試料及びシース液が分取流路１１６内に侵入しないようにすることが好ましい。しかしながら、図１２に示すように、主流路１１５を送液される試料及びシース液の流れ（図１２中実線矢印参照）は大きな運動量を持つため、連通口１５６から分取流路１１６に流入してしまう場合がある。連通口１５６から分取流路１１６に流入した試料及びシース液の流れは、分取流路１１６内で方向を変え、分取流路１１６の流路壁に沿って主流路１１５側に流出する（図１２中点線矢印参照）。
分取流路１１６から流路壁に沿って主流路１１５側に流出する試料及びシース液の流れは流路壁に拘束されるため遅く、連通口１５６における非目標試料又はこれを含む試料及びシース液の滞留を引き起こす。この滞留は、目標試料及び非目標試料の分取動作を高速に行うための障害となる。
これに対して、マイクロチップ１では、シース液バイパス流路１１８により排出口１８１から分取流路１１６内に導入されるシース液が、非分取動作時において非目標試料又はこれを含む試料及びシース液が分取流路１１６に侵入するのを抑制するために作用する。すなわち、シース液インレット１１３から導入されるシース液は、排出口１８１から分取流路１１６内に導入され、連通口１５６に分取流路１１６側から主流路１１５側へ向かうシース液の流れ（以下、「逆流」とも称する）を形成する（図１３のＡ参照）。そして、この逆流が、主流路１１５から分取流路１１６に侵入しようとする試料及びシース液の流れと拮抗することで、試料及びシース液の分取流路１１６への侵入が阻止される。
逆流は、主流路１１５から分取流路１１６に侵入しようとする試料及びシース液の流れの運動量（勢い）に見合った運動量を持つことが好ましい。逆流の運動量は、シース液バイパス流路１１８へのシース液の送液量を調節することで制御でき、該送液量はシース液バイパス流路１１８の流路径を調節することで制御できる。また、送液量の調節は、シリンジポンプなどの送液手段や、シース液バイパス流路１１８に設けた弁などにより行うこともできる。
シース液インレット１１３から導入されるシース液のシース液流路１１４への流量と、シース液バイパス流路１１８への流量との流量比は、両流路の流路抵抗比により決定される。このため、シース液インレット１１３へのシース液の導入圧力が変動しても、上記流量比が変動せず、安定した動作が可能である。また、分取流路１１６における試料の通流速度を変えるため、シース液流量の変更が必要になった場合にも、シース液流路１１４への流量とシース液バイパス流路１１８への流量とを個別に制御する必要がない。
逆流の運動量は、主流路１１５から分取流路１１６への試料及びシース液の侵入を完全に抑制可能な大きさとすることが好ましい。ただし、逆流は、必ずしも上記侵入を完全に抑制するものである必要はなく、ある程度軽減するものであればよい。上記のように、分取流路１１６から流路壁に沿って主流路１１５側に流出する試料及びシース液の流れが生じると、連通口１５６における非目標試料又はこれを含む試料及びシース液の滞留の要因となる。図１３のＢに示すように、主流路１１５から分取流路１１６への試料及びシース液の侵入をある程度軽減できれば、滞留の要因となる分取流路１１６から流路壁に沿って主流路１１５側に流出する試料及びシース液の流れの抑制が可能である。
なお、連通口１５６における非目標試料又はこれを含む試料及びシース液の滞留を抑制することで、目標試料及び非目標試料が流路壁に付着することも防止できる。
逆流は、目標試料の分取流路１１６への引き込み時にも、連通口１５６に形成されている（図１４のＡ参照）。このため、分取動作時には、逆流を上回る引き込み圧で目標試料を分取流路１１６内に引き込む必要がある（図１４のＢ参照）。圧力室１６１の容積の増大量は、逆流を上回る引き込み圧を発生させるために十分な大きさとされる。
更に、目標試料は、図１４のＢに示すように、分取流路１１６において排出口１８１を過ぎる位置まで引き込まれる必要がある。分取流路１１６への引き込みが不十分であると、シース液バイパス流路１８により排出口１８１から分取流路１１６内に導入されるシース液によって形成される逆流によって目標試料が主流路１１５に再流出してしまう場合がある。
排出口１８１を超える位置まで目標試料を十分に引き込むため、圧力室１６１の容積の増大量は逆流の流量よりも大きくし、負圧により主流路１１５から分取流路１１６内に吸引される試料及びシース液の流量が逆流の流量よりも大きくなるようにする。
このようにして形成されたマイクロチップ１により、所望量の目標試料が圧力室１６１へと取り込むことができた後は、圧力室１６１に連結され、かつ、分取流路末端１１９へと目標試料が流れるようになっている（図１参照）。なお、圧力調整部１１０による圧力室１６１の圧力変化を行うことを考慮し、当該圧力室１６１と分取流路末端１１９とは開閉バルブなどによって連結されていることが好ましい。
図１の実施形態のマイクロチップ１では、シース液バイパス流路１１８に対して、シース液インレット１１３が繋がる構成となっているが、シース液バイパス流路１１８をシース液インレット１１３とは繋げず、図１５に示すように、導入路１１８Ａを別に設けるようにしてもよい。この場合、前記シース液インレット１１３からシース液を導入する一方、導入路１１８Ａからは、シース液とは別の溶液（例えば、培養液）を導入することが可能となる。そして、導入路１１８Ａから導入された溶液は、分取流路１１６、圧力室１６１及び分取流路末端１１９を通過する。
このため、圧力室１６１の下流側では、シース液が混入する可能性もあるが、導入路１１８Ａによりシース液よりも培養液が多く存在する環境となるため、マイクロチップ１による分取回収後の目標試料にとっては良い環境を自動的に作成することができる。
また、マイクロチップ１を図１５に示すような構成とした場合、シース液バイパス流路１１８の流量を個別制御することが可能となるため、交換可能なマイクロチップ１において、該マイクロチップ１間で設計上の差（例えば、流路幅や高さのばらつきが大きい場合）があったとしても、シース液バイパス流路１１８の流量制御によって、マイクロチップ１間の設計上の差を考慮した分取条件の最適化を実施することができる。
本技術に係るマイクロチップ１は、分取対象とする微小粒子を含む液体が収容されている収容部や、目標試料が収容される貯留部などが密閉連結等で接続されていてもよい。前記収容部や前記貯留部は、例えば、袋（バッグ）状に形成することができる。前記収容部や前記貯留部が接続されたマイクロチップ１は、閉鎖型セルソーター用の、カートリッジ、ユニット、デバイス、キット、器具などの物品の一部品として流通してもよい。
２．微小粒子測定装置１０
＜第一実施形態＞
図１６は、本技術に係る微小粒子測定装置１０の第一実施形態を模式的に示す模式図である。本実施形態に係る微小粒子測定装置１０は、光照射部１０１と、検出部１０２と、を少なくとも備える。また、必要に応じて、処理部等を備えていてもよい。以下、各部について詳細に説明する。
（１）光照射部１０１
光照射部１０１は、少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップ１の側面から光を照射する。マイクロチップ１は、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
本技術では、マイクロチップ１の側面から光を照射することが可能であるため、励起光と蛍光検出の光路を分離することができ、特に、対物レンズに起因する自家蛍光の大幅な低減が見込まれるため、測定精度を向上させることができる。また、図１６中符号１１０で示した圧力調整部（例えば、ピエゾ素子）側の空間を大きく開けることができるため、空間利用の自由度も向上する。また、分取駆動機構の構造の自由度が上がり、レイアウトの制限を解消することができる。その結果、分取駆動機構の性能向上も見込まれる。
光照射部１０１は、励起光を出射する光源と、主流路１１５を通流する微小粒子に対して励起光を集光する対物レンズ等を含んで構成される。光源には、例えば、レーザーダイオード、ＳＨＧレーザー、固体レーザー、ガスレーザー、高輝度ＬＥＤ等が用いられる。また、光照射部１０１は、必要に応じて、光源及び対物レンズ以外の光学素子を有していてもよい。
微小粒子分析装置１０において、光照射部１０１は、マイクロチップ１内の流路の流れ方向と平行する側面に対して光を照射することが好ましい。これにより、測定精度の向上を図ることができる。
（２）検出部１０２
検出部１０２は、前記微小粒子からの光を検出する。より具体的には、励起光の照射によって微小粒子から発生する蛍光及び散乱光などを検出する。検出部１０２は、微小粒子から発生する蛍光及び散乱光などを集光する集光レンズと検出器等を含んで構成される。検出器には、例えば、ＰＭＴ、フォトダイオード、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ等が用いられる。また、検出部１０２は、必要に応じて、集光レンズ及び検出器以外の光学素子を有していてもよい。
検出部１０２により検出される蛍光は、微小粒子そのものから発生する蛍光及び微小粒子に標識された蛍光物質等から発生する蛍光であってよい。また、検出部１０２により検出される散乱光は、前方散乱光、側方散乱光、レイリー散乱、ミー散乱などの各種散乱光であってよい。
従来の装置においては、蛍光検出系と前方散乱検出系とが、チップの広い面（正面）を挟んで対向することで、空間利用の自由度を下げてしまっていた。その結果、ユーザビリティが低下し、特に、前述した圧力調整部１１０（例えば、ピエゾ素子）といった分取駆動機構の構造及びレイアウトに制限が出てしまっていた。
これに対して、本技術では、検出部１０２は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部１０２１と、蛍光を検出する蛍光検出部１０２２と、を含み、前方散乱光検出部１０２１は、マイクロチップ１の側面と同一の方向に位置し、蛍光検出部１０２２は、マイクロチップ１の側面とは異なる方向に位置することが好ましい。これにより、空間の自由度を更に向上させ、分取駆動機構の構造の自由度が上がり、レイアウトの制限を解消することができる。その結果、分取駆動機構の性能向上も見込まれる。
前方散乱光検出部１０２１は、光源より出射された光（例えば、励起光）を照射された微小粒子から発生する前方散乱光を検出する。前方散乱光は、光源からの光の光軸に対して、一般的に、６〜９度の角度で光を照射された微小粒子から散乱する光であり、主に微小粒子の大きさに関する情報が得られる。
また、この場合、前方散乱光検出部１０２１と、蛍光検出部１０２２とは、マイクロチップ１の側面に対して略９０度異なる方向に位置することが好ましい。このような構成とすることで、より検出精度の向上を図ることができる。
なお、検出部１０２により検出された蛍光及び散乱光は、電気信号に変換され、処理部等に出力される。処理部は、入力される電気信号に基づいて微小粒子の光学特性を判定する。また、処理部は、例えば、圧力調整部１１０に電圧を印加し、該電圧を制御することによって所定の特性を満たすと判定された微小粒子を主流路１１５から分取流路１１６内に取り込むために機能する。
（３）その他
なお、本技術では、本技術に係る微小粒子測定装置１０の各部で行われる機能を、パーソナルコンピュータや、ＣＰＵ等を含む制御部及び記録媒体（例えば、不揮発性メモリ（例えば、ＵＳＢメモリ）、ＨＤＤ、ＣＤ等）等を備えるハードウェア資源にプログラムとして格納し、パーソナルコンピュータや制御部によって機能させることも可能である。
＜第二実施形態＞
図１７は、本技術に係る微小粒子測定装置１０の第二実施形態を模式的に示す模式図である。
本実施形態において、検出部１０２は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部１０２１と、蛍光を検出する蛍光検出部１０２２と、を含み、前方散乱光検出部１０２１及び蛍光検出部１０２２は、マイクロチップ１の側面とは異なる方向に位置するものとすることができる。これにより、図１７に示すように、検出系を一つの方向にまとめることができる。その結果、装置側の空間利用の自由度を上げることができる。
また、この場合、マイクロチップ１は、内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備え、前方散乱光検出部１０２１は、前記反射構造により反射された前方散乱光を検出するものとすることができる。前記反射構造については、前述したものと同様であるため、ここでは説明を割愛する。
なお、本実施形態の微小粒子測定装置１０における上記以外の構成及び効果は、前述した第一実施形態の微小粒子測定装置１０と同様である。
３．微小粒子測定方法
本技術に係る微小粒子測定方法は、光照射工程と、検出工程と、を少なくとも行う。また、必要に応じて、その他の工程が行われてもよい。以下、各工程について詳細に説明する。
（１）光照射工程
光照射工程では、少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する。本光照射工程で行う具体的な方法は、前述した微小粒子測定装置１０の光照射部１０１で行われる方法と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
（２）検出工程
検出工程では、前記微小粒子からの光を検出する。本検出工程で行う具体的な方法は、前述した微小粒子測定装置１０の検出部１０２で行われる方法と同様であるため、ここでは説明を割愛する。
なお、本技術では、以下の構成を取ることもできる。
（１）
少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、
流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップ。
（２）
前記基板層の側面の反対側の側面に光を検出可能な光学検出領域を更に備える、（１）に記載のマイクロチップ。
（３）
前記複数の基板層の接合面が、前記光学検出領域を避けるように形成された、（２）に記載のマイクロチップ。
（４）
前記光学照射領域が、前記複数の基板層の接合面の片側に設けられた、（１）から（３）のいずれかに記載のマイクロチップ。
（５）
前記マイクロチップの面における前記光学照射領域及び／又は前記光学検出領域の周囲に、切り欠き部を更に備える、（２）から（４）のいずれかに記載のマイクロチップ。
（６）
前記切り欠き部は、前記マイクロチップの面において左右に設けられた、（５）に記載のマイクロチップ。
（７）
左右に設けられた切り欠き部は、前記マイクロチップの正面の中心線に対して非対称である、（６）に記載のマイクロチップ。
（８）
内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備える、（１）から（７）のいずれかに記載のマイクロチップ。
（９）
前記反射構造は、光が照射される側面の対面の側面にミラーを有する構造である、（８）に記載のマイクロチップ。
（１０）
前記ミラーは、所定の散乱角光線に対応した構造である、（９）に記載のマイクロチップ。
（１１）
少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する光照射部と、
前記微小粒子からの光を検出する検出部と、
を少なくとも備える、微小粒子測定装置。
（１２）
前記光照射部は、前記マイクロチップ内の流路の流れ方向と平行する側面に対して光を照射する、（１１）に記載の微小粒子測定装置。
（１３）
前記検出部は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部と、蛍光を検出する蛍光検出部と、を含み、
前記前方散乱光検出部は、前記マイクロチップの側面と同一の方向に位置し、
前記蛍光検出部は、前記マイクロチップの側面とは異なる方向に位置する、（１１）又は（１２）に記載の微小粒子測定装置。
（１４）
前記前方散乱光検出部と、前記蛍光検出部とは、前記マイクロチップの側面に対して略９０度異なる方向に位置する、（１３）に記載の微小粒子測定装置。
（１５）
前記検出部は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部と、蛍光を検出する蛍光検出部と、を含み、
前記前方散乱光検出部及び前記蛍光検出部は、前記マイクロチップの側面とは異なる方向に位置する、（１１）に記載の微小粒子測定装置。
（１６）
前記マイクロチップは、内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備え、
前記前方散乱光検出部は、前記反射構造により反射された前方散乱光を検出する、（１５）に記載の微小粒子測定装置。
（１７）
少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する光照射工程と、
前記微小粒子からの光を検出する検出工程と、
を少なくとも行う、微小粒子測定方法。
１：マイクロチップ
１１０：圧力調整部
１１０１：変位板
１１１：試料インレット
１１２：試料流路
１１３：シース液インレット
１１４：シース液流路
１１５：主流路
１１５ａ：光学照射領域
１１５ｂ：光学検出領域
１１５ｃ：ミラー
１１６：分取流路
１１７：廃棄流路
１１８：シース液バイパス流路
１１９：分取流路末端
１５６：主流路１１５への分取流路１１６の連通口
１６１：圧力室
１６２：圧力室１６１への目標試料Ｐの取込口
１８１：シース液バイパス流路１１８を送液されるシース液の分取流路１１６への排出口
Ｓ：試料層流
Ｐ：目標試料
ａ１：１層目の基板層
ａ２：２層目の基板層
ａ３：３層目の基板層
１０：微小粒子測定装置
１０１：検出部
１０２：照射部
１０２１：前方散乱光検出部
１０２２：蛍光検出部
１０２３：側方散乱光検出部

Claims (17)

  1. 少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、
    流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップ。
  2. 前記基板層の側面の反対側の側面に光を検出可能な光学検出領域を更に備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
  3. 前記複数の基板層の接合面が、前記光学検出領域を避けるように形成された、請求項２に記載のマイクロチップ。
  4. 前記光学照射領域が、前記複数の基板層の接合面の片側に設けられた、請求項１に記載のマイクロチップ。
  5. 前記マイクロチップの面における前記光学照射領域及び／又は前記光学検出領域の周囲に、切り欠き部を更に備える、請求項２に記載のマイクロチップ。
  6. 前記切り欠き部は、前記マイクロチップの面において左右に設けられた、請求項５に記載のマイクロチップ。
  7. 左右に設けられた切り欠き部は、前記マイクロチップの正面の中心線に対して非対称である、請求項６に記載のマイクロチップ。
  8. 内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備える、請求項１に記載のマイクロチップ。
  9. 前記反射構造は、光が照射される側面の対面の側面にミラーを有する構造である、請求項８に記載のマイクロチップ。
  10. 前記ミラーは、所定の散乱角光線に対応した構造である、請求項９に記載のマイクロチップ。
  11. 少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する光照射部と、
    前記微小粒子からの光を検出する検出部と、
    を少なくとも備える、微小粒子測定装置。
  12. 前記光照射部は、前記マイクロチップ内の流路の流れ方向と平行する側面に対して光を照射する、請求項１１に記載の微小粒子測定装置。
  13. 前記検出部は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部と、蛍光を検出する蛍光検出部と、を含み、
    前記前方散乱光検出部は、前記マイクロチップの側面と同一の方向に位置し、
    前記蛍光検出部は、前記マイクロチップの側面とは異なる方向に位置する、請求項１１に記載の微小粒子測定装置。
  14. 前記前方散乱光検出部と、前記蛍光検出部とは、前記マイクロチップの側面に対して略９０度異なる方向に位置する、請求項１３に記載の微小粒子測定装置。
  15. 前記検出部は、前方散乱光を検出する前方散乱光検出部と、蛍光を検出する蛍光検出部と、を含み、
    前記前方散乱光検出部及び前記蛍光検出部は、前記マイクロチップの側面とは異なる方向に位置する、請求項１１に記載の微小粒子測定装置。
  16. 前記マイクロチップは、内部に、前方散乱光を反射する反射構造を更に備え、
    前記前方散乱光検出部は、前記反射構造により反射された前方散乱光を検出する、請求項１５に記載の微小粒子測定装置。
  17. 少なくとも１つの基板層に微小粒子を含む液体が通流する流路を含む複数の基板層からなり、流路に通流する流体中に含まれる微小粒子に対して前記基板層の側面から光が照射される光学照射領域を少なくとも備える、マイクロチップの側面から光を照射する光照射工程と、
    前記微小粒子からの光を検出する検出工程と、
    を少なくとも行う、微小粒子測定方法。
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