JP5910412B2 - 微小粒子分取方法及び微小粒子分取用マイクロチップ - Google Patents

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Description

本技術は、微小粒子分取方法及び微小粒子分取用マイクロチップに関する。より詳しくは、流路を通流する微小粒子から目的とする微小粒子のみを分別して回収する微小粒子分取方法等に関する。
流路内に微小粒子を含むシースフローを形成し、シースフロー中の微小粒子に光を照射して微小粒子から発生する蛍光及び散乱光を検出し、所定の光学特性を示す微小粒子群（ポピュレーション）を分別回収する微小粒子分取装置が知られている。例えば、フローサイトメータでは、サンプル中に含まれる複数種類の細胞を蛍光色素により標識し、各細胞に標識された蛍光色素を光学的に識別することによって、特定の種類の細胞のみを分別、回収することが行われている。
特許文献１及び特許文献２には、プラスチック製及びガラス製などのマイクロチップに形成された流路内にシースフローを形成して分析を行うマイクロチップ型の微小粒子分取装置が開示されている。
特許文献１に開示される微小粒子分取装置は、シースフローが形成された導入流路と該導入流路に連通する分岐流路との分岐部においてレーザ照射により気泡を発生させることで、分岐部におけるシースフローの送流方向を制御するものである。この微小粒子分取装置によれば、分岐部におけるシースフローの送流方向を気泡により制御することで、目的とする微小粒子のみを導入流路から分岐流路へ取り込んで分取することが可能である。
また、特許文献２に開示される微小流体システムは、アクチュエータを用いて流路分岐部におけるシースフローの送流方向を制御することで、目的とする微小粒子の分取を行っている。この微小流体システムにおいて、アクチュエータは、シースフローが形成された導入流路と該導入流路に連通する分岐流路との分岐部に接続されたチャンバを押圧し、チャンバ内の液を押し出すことによって、シースフローの送流方向を変化させている。
特開２００９−１００６９８号公報 特表２００５−５３８７２７号公報
マイクロチップ型の微小粒子分取装置では、分析のさらなる高速化と高精度化のため、流路を通流するシースフローから目的とする微小粒子のみを高速かつ安定して取り出すための技術が求められている。
そこで、本技術は、流路を通流するシースフローから目的とする微小粒子のみを高速かつ安定して取り出すことが可能な微小粒子分取技術を提供することを主な目的とする。
上記課題解決のため、本技術は、主流路を通流する液体中の微小粒子を、前記主流路に連通する分岐流路内に負圧を発生させることにより該分岐流路内に取り込む手順を含み、
該手順において、前記主流路と前記分岐流路との連通口に、前記分岐流路側から前記主流路側へ向かう液体の流れを形成させておく微小粒子分取方法を提供する。前記流れは、前記分岐流路内の前記連通口の近傍に位置して設けられた導入口から前記液体を前記分岐流路内に導入することにより形成できる。前記導入口から前記分岐流路内に導入された前記液体は、前記連通口の方向に向かう逆流と、反対方向に向かう順流と、に分流させてもよい。
この微小粒子分取方法では、前記手順の前後においても、連通口に形成した分岐流路側から主流路側へ向かう液体の流れを維持するようにすることで、分岐流路内に負圧が生じていない間に、主流路内の流体が不必要に分岐流路内へ侵入することを防止できる。
本技術に係る微小粒子分取方法では、前記手順において、前記導入口から前記分岐流路内に導入されて前記連通口に向かって送液される前記液体の流量よりも、前記負圧により前記主流路から前記分岐流路内に吸引される前記液体の流量を大きくする。これにより、前記主流路内の前記微小粒子を、前記連通口から、前記分岐流路内の前記導入口を過ぎる位置まで取り込むことができる。
本技術に係る微小粒子分取方法では、前記手順において、アクチュエータにより前記分岐流路の内空を変形させる力を印加して前記負圧を発生させ、該内空の容積を増大させる。この際、前記負圧は、パルス波形、ステップ波形又はアンダーシュート付ステップ波形の負圧とされる。
また、本技術は、微小粒子を含むサンプル液が導入されるサンプル液導入口と、該サンプル液導入口から導入された前記サンプル液が通流するサンプル液流路と、シース液が導入されるシース液導入口と、該シース液導入口から導入された前記シース液が通流する第一のシース液流路と、前記サンプル液流路と前記第一のシース液流路とが合流する主流路と、該主流路に連通する分岐流路と、前記シース液導入口と前記分岐流路内の前記主流路への連通口の近傍に位置して設けられたシース液排出口とを接続し、前記シース液導入口から導入される前記シース液を前記シース液排出口から前記分岐流路内に送液する第二のシース液流路と、を備える微小粒子分取用マイクロチップを提供する。
本技術に係る微小粒子分取用マイクロチップの前記第二のシース液流路は、前記サンプル液流路、前記第一のシース液流路及び前記主流路と連絡していないことが好ましい。
本技術に係る微小粒子分取用マイクロチップには、表面の前記分岐流路に対応する位置に接触して、接触面に変位を加えるアクチュエータが配置される。また、前記分岐流路には、前記変位によって容積変化を生じる圧力室が構成される。さらに、前記分岐流路における配列順序は、前記連通口、前記シース液排出口及び前記圧力室の順とされる。
本技術に係る微小粒子分取用マイクロチップに前記第一のシース液流路を２つ配する場合、前記シース液導入口は、２つの前記第一のシース液流路の対称中心に設けられることが好ましい。また、本技術に係る微小粒子分取用マイクロチップにおいて、前記分岐流路の前記連通口と反対側の末端は、閉鎖端であってもよいが、特に開放端とすることができる。
本技術において、「微小粒子」には、細胞や微生物、リポソームなどの生体関連微小粒子、あるいはラテックス粒子やゲル粒子、工業用粒子などの合成粒子などが広く含まれるものとする。
生体関連微小粒子には、各種細胞を構成する染色体、リポソーム、ミトコンドリア、オルガネラ(細胞小器官)などが含まれる。細胞には、動物細胞(血球系細胞など)および植物細胞が含まれる。微生物には、大腸菌などの細菌類、タバコモザイクウイルスなどのウイルス類、イースト菌などの菌類などが含まれる。さらに、生体関連微小粒子には、核酸やタンパク質、これらの複合体などの生体関連高分子も包含され得るものとする。また、工業用粒子は、例えば有機もしくは無機高分子材料、金属などであってもよい。有機高分子材料には、ポリスチレン、スチレン・ジビニルベンゼン、ポリメチルメタクリレートなどが含まれる。無機高分子材料には、ガラス、シリカ、磁性体材料などが含まれる。金属には、金コロイド、アルミなどが含まれる。これら微小粒子の形状は、一般には球形であるのが普通であるが、非球形であってもよく、また大きさや質量なども特に限定されない。
本技術により、流路を通流するシースフローから目的とする微小粒子のみを高速かつ安定して取り出すことが可能な微小粒子分取技術が提供される。
本技術の第一実施形態に係る微小粒子分取装置Ａの構成を説明する図である。 微小粒子分取装置Ａに搭載されるマイクロチップ１ａの構成を説明する図である。 マイクロチップ１ａの構成を説明する図である。 マイクロチップ１ａの構成を説明する図である。 マイクロチップ１ａの主流路１５と分取流路１６の分岐部の構成を説明する図である。 マイクロチップ１ａのシース液バイパス流路１８のシース液インレット１３側端の構成を説明する図である。 マイクロチップ１ａのシース液バイパス流路１８の排出口１８１側端の構成を説明する図である。 微小粒子分取装置Ａの分取動作を説明する図である。 マイクロチップ１ａの圧力室１６１の機能を説明する図である。 マイクロチップ１ａの変形例の構成を説明する図である。 主流路１５と分岐流路１６の分岐部において生じ得るサンプル液及びシース液の流れを説明する図である。 分取流路１６の排出口１８１から導入されるシース液の流れを説明する図である。 分取動作時の目的粒子の引き込み位置を説明する図である。 駆動部２３からアクチュエータ３１に印加される電圧の波形を説明する図である。 マイクロチップ１ａの変形例の構成を説明する図である。
以下、本技術を実施するための好適な形態について図面を参照しながら説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本技術の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより本技術の範囲が狭く解釈されることはない。説明は以下の順序で行う。

１．本技術に係る微小粒子分取方法を実施可能な微小粒子分取装置及び微小粒子分取用マイクロチップ
［装置の全体構成］
［マイクロチップの構成］
２．本技術に係る微小粒子分取方法
［分取動作］
［逆流形成］
［駆動信号］
３．本技術に係る微小粒子分取方法の変形例
４．微小粒子分取プログラム
１．本技術に係る微小粒子分取方法を実施可能な微小粒子分取装置及び微小粒子分取用マイクロチップ
［装置の全体構成］
図１は、本技術に係る微小粒子分取方法の実施に適した微小粒子分取装置Ａの構成を説明する図である。また、図２−４は、微小粒子分取装置Ａに搭載されるマイクロチップ１ａの構成を説明する図である。図２は上面図、図３は斜視図、図４は図２中Ｑ−Ｑ断面に対応する断面図である。
微小粒子分取装置Ａは、マイクロチップ１ａと、照射部２１、検出部２２及び駆動部２３とを含んで構成されている。マイクロチップ１ａには、分析対象となる微小粒子を含む液体（サンプル液）が通流される主流路１５が形成されている（図２参照）。また、マイクロチップ１ａの表面には、アクチュエータ３１が配置されている（図３参照）。
照射部２１は、マイクロチップ１ａの主流路１５を通流する微小粒子に光（励起光）を照射する。照射部２１は、励起光を出射する光源と、主流路１５を通流する微小粒子に対して励起光を集光する対物レンズ等を含んで構成される。光源は、分析の目的に応じてレーザダイオード、ＳＨＧレーザ、固体レーザ、ガスレーザ及び高輝度ＬＥＤなどから適宜選択される。照射部２１は、必要に応じて、光源及び対物レンズ以外の光学素子を有していてもよい。
検出部２２は、励起光の照射によって微小粒子から発生する蛍光及び散乱光を検出する。検出部２２は、微小粒子から発生する蛍光及び散乱光を集光する集光レンズと検出器等を含んで構成される。検出器には、ＰＭＴ、フォトダイオード、ＣＣＤ及びＣＭＯＳなどが用いられる。検出部２２は、必要に応じて、集光レンズ及び検出器以外の光学素子を有していてもよい。
検出部２２により検出される蛍光は、微小粒子そのものから発生する蛍光及び微小粒子に標識された蛍光物質等から発生する蛍光であってよい。また、検出部２２により検出される散乱光は、前方散乱光、側方散乱光、レイリー散乱及びミー散乱などの各種散乱光であってよい。
検出部２２により検出された蛍光及び散乱光は、電気信号に変換され、駆動部２３に出力される。駆動部２３は、入力される電気信号に基づいて微小粒子の光学特性を判定する。さらに、駆動部２３は、アクチュエータ３１に電圧を印加し、該電圧を制御することによって所定の特性を満たすと判定された微小粒子を主流路１５から分取流路１６内に取り込むために機能する。駆動部２３の当該機能については後段で詳しく説明する。駆動部２３は、後述する処理を実行するためのプログラムとＯＳが格納されたハードディスク、ＣＰＵ及びメモリなどにより構成される。
［マイクロチップの構成］
図２−４を参照して、マイクロチップ１ａの構成を詳しく説明する。微小粒子を含むサンプル液は、サンプル液インレット１１からサンプル液流路１２に導入される。また、シース液インレット１３からはシース液が導入される。シース液インレット１３から導入されたシース液は、２本のシース液流路１４，１４に分流されて送液される。サンプル液流路１２とシース液流路１４，１４は合流して主流路１５となる。サンプル液流路１２を送液されるサンプル液層流と、シース液流路１４，１４を送液されるシース液層流と、は主流路１５内において合流し、サンプル液層流がシース液層流に挟み込まれたシースフローを形成する（後述の図５Ｃ参照）。
また、シース液インレット１３から導入されたシース液は、シース流路１４とは別個に形成されたシース液バイパス流路１８にも送液される。シース液バイパス流路１８の一端はシース液インレット１３に接続しており、他端は後述する分取流路１６の主流路１５への連通口近傍に接続している（図４参照）。シース液バイパス流路１８のシース液導入端は、シース液インレット１３及びシース液流路１４，１４を含むシース液の通流部位のいずれかの箇所に接続されていればよいが、好ましくはシース液インレット１３に接続される。２つのシース流路１４が幾何学的に対称になる中心位置（すなわち、本実施形態ではシース液インレット１３）にシース液バイパス流路１８を接続することで、２つのシース流路１４へシース液が等流量分配されるようにできる。図４中符号１５６は、主流路１５への分取流路１６の連通口を示し、符号１８１は、シース液バイパス流路１８を送液されるシース液の分取流路１６への排出口を示す。
図２中符号１５ａは、照射部２１により励起光が照射され、検出部２２による蛍光及び散乱光の検出が行われる検出領域を示す。微小粒子は、主流路１５に形成されるシースフロー中に一列に配列した状態で検出領域１５ａに送流され、照射部２１からの励起光により照射される。
主流路１５は、検出領域１５ａの下流において、３つの流路に分岐している。主流路１５の分岐部の構成を図５に示す。主流路１５は、検出領域１５ａの下流において、分取流路１６及び廃棄流路１７，１７の３つの分岐流路と連通している。このうち、分取流路１６は、駆動部２３によって所定の光学特性を満たすと判定された微小粒子（以下、「目的粒子」と称する）が取り込まれる流路である。一方、駆動部２３によって所定の光学特性を満たさないと判定された微小粒子（以下、「非目的粒子」とも称する）は、分取流路１６内に取り込まれることなく、２本の廃棄流路１７のいずれか一方に流れる。
シース液バイパス流路１８は、分取流路１６の主流路１５への連通口１５６の近傍に位置して設けられた排出口１８１に接続されている（図４参照）。シース液インレット１３から導入されるシース液は、排出口１８１から分取流路１６内に導入され、連通口１５６に分取流路１６側から主流路１５側へ向かうシース液の流れを形成する（この流れについては詳しく後述する）。
マイクロチップ１ａは３層の基板層からなり、サンプル液流路１２、シース液流路１４、主流路１５、分取流路１６及び廃棄流路１７は、１層目の基板層ａ１と２層目の基板層ａ２により形成されている（図４参照）。一方、シース液バイパス流路１８は、２層目の基板層ａ２と３層目の基板層ａ３により形成されている。基板層ａ２、ａ３に形成されたシース液バイパス流路１８は、基板層ａ１、ａ２に形成されたサンプル液流路１２、シース液流路１４及び主流路１５と連絡することなく、シース液インレット１３と分取流路１６の排出口１８１とを接続している。シース液バイパス流路１８のシース液インレット１３側端及び排出口１８１側端の構成をそれぞれ図６及び図７に示す。
なお、マイクロチップ１ａの基板層の層構造は、３層に限定されることはないものとする。また、シース液バイパス流路１８の構成も、サンプル液流路１２、シース液流路１４及び主流路１５と交わることなく、シース液インレット１３と分取流路１６の排出口１８１とを接続し得る限り、図に示した構造に限定されない。
目的粒子の分取流路１６内への取り込みは、アクチュエータ３１によって分取流路１６内に負圧を発生させ、この負圧を利用して目的粒子を分取流路１６内に吸い込むことによって行われる。アクチュエータ３１は、ピエゾ素子などの圧電素子とされる。アクチュエータ３１は、マイクロチップ１ａの表面に接触して配置され、分取流路１６に対応する位置に配置されている。より具体的には、アクチュエータ３１は、分取流路１６において内空が拡張された領域として設けられた圧力室１６１に対応する位置に配置されている（図３及び図４参照）。圧力室１６１は、分取流路１６において連通口１５６及び排出口１８１の下流に設けられる。
圧力室１６１の内空は、図２に示されるように平面方向（分取流路１６の幅方向）に拡張されるとともに、図４に示されるように断面方向（分取流路１６の高さ方向）にも拡張されている。すなわち、分取流路１６は、圧力室１６１において幅方向及び高さ方向に拡張されている。換言すると、分取流路１６は、圧力室１６１においてサンプル液及びシース液の流れ方向に対する垂直断面が大きくなるように形成されている。
アクチュエータ３１は、印加される電圧の変化に伴って伸縮力を発生し、マイクロチップ１ａの表面（接触面）を介して分取流路１６内に圧力変化を生じさせる。分取流路１６内の圧力変化に伴って分取流路１６内に流動が生じると、同時に、分取流路１６内の体積が変化する。分取流路１６内の体積は、印加電圧に対応したアクチュエータ３１の変位量によって規定される体積に到達するまで変化する。より具体的には、アクチュエータ３１は、電圧を印加されて伸張した状態においては、圧力室１６１を構成する変位板３１１（図４参照）を押圧して圧力室１６１の体積を小さく維持している。そして、印加される電圧が低下すると、アクチュエータ３１は収縮する方向へ力を発生し、変位板３１１への押圧を弱めることによって圧力室１６１内に負圧を発生させる。
アクチュエータ３１の伸縮力を効率良く圧力室１６１内へ伝達するため、図４に示すように、マイクロチップ１ａの表面を圧力室１６１に対応する位置において陥凹させ、該陥凹内にアクチュエータ３１を配置することが好ましい。これにより、アクチュエータ３１の接触面となる変位板３１１を薄くでき、変位板３１１がアクチュエータ３１の伸縮に伴う押圧力の変化によって容易に変位して、圧力室１６１の容積変化をもたらすようにできる。
図４及び図５中、符号１５６により、主流路１５への分取流路１６の連通口を示す。主流路１５内に形成されたシースフロー中を送流される目的粒子は、連通口１５６から分取流路１６内に取り込まれる。主流路１５から分取流路１６への目的粒子の取り込みを容易にするため、連通口１５６は、図５Ｃに示すように、主流路１５内に形成されるシースフロー中のサンプル液層流Ｓに対応する位置に開口されていることが望ましい。連通口１５６の形状は、特に限定されないが、例えば図５Ａに示すような平面に開口する形状や、図５Ｂに示すように２本の廃棄流路１７の流路壁を切り欠いて開口とする形状を採用できる。
マイクロチップ１ａは、主流路１５等が形成された基板層を貼り合わせて構成できる。
基板層への主流路１５等の形成は、金型を用いた熱可塑性樹脂の射出成形により行うことができる。熱可塑性樹脂には、ポリカーボネート、ポリメタクリル酸メチル樹脂（ＰＭＭＡ）、環状ポリオレフィン、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリプロピレン及びポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）などの従来マイクロチップの材料として公知のプラスチックを採用できる。
２．第一実施形態に係る微小粒子分取装置の動作
［分取動作］
次に、微小粒子分取装置Ａの動作について説明する。
ユーザが分析を開始すると、微小粒子分取装置Ａは、ポンプを駆動して、サンプル液及びシース液をマイクロチップ１ａのサンプル液インレット１１及びシース液インレット１３に送液する。これにより、主流路１５内に、サンプル液層流がシース液層流に挟み込まれたシースフローが形成される。
微小粒子はシースフロー中を一列に配列された状態で検出領域１５ａまで送流され、照射部２１からの励起光によって照射される。励起光の照射により微小粒子から発生する蛍光及び散乱光は、検出部２２によって検出され、電気信号に変換され、駆動部２３に出力される。
駆動部２３は、入力される電気信号に基づいて微小粒子の光学特性を判定する。微小粒子が目的粒子と判定された場合、駆動部２３は、図８Ａ及びＢに示すように、当該目的粒子が検出領域１５ａから分岐部に移動するまでの時間（遅れ時間）を経過した後に、アクチュエータ３１に当該微小粒子を取得するための駆動信号を発生する。その際、必要であれば、アンプを介してアクチュエータ３１を駆動させるようにしてもよい。
具体的には、アクチュエータ３１がピエゾ素子である場合、駆動部２３は、ピエゾ収縮となる電圧を印加し、圧力室１６１の容積を増加させ、分取流路１６の内圧を負圧にすることで、目的粒子を主流路１５内から分取流路１６内へ取り込む。
一方、微小粒子が非目的粒子と判定された場合、駆動部２３は、図８Ｃ及びＤに示すように、アクチュエータ３１に非取得の駆動信号を発生し、次の微小粒子の光学特性判定を行う。なお、非取得の駆動信号を受けたアクチュエータ３１は動作しない。
駆動部２３は、微小粒子の光学特性の判定と、アクチュエータ３１への駆動信号の出力とを分析終了まで繰り返し（図８Ｅ〜Ｆ参照）、目的粒子のみを分取流路１６内に蓄積する（図８Ｆ参照）。分析終了後、分取流路１６内に分別された目的粒子はユーザによって回収される。
分取流路１６内へ引き込まれた目的粒子は、図９Ａに示すように、圧力室１６１内に取り込まれる。図中、符号Ｐは、圧力室１６１内に取り込まれた目的粒子を示し、符号１６２は、圧力室１６１への目的粒子Ｐの取込口を示す。目的粒子Ｐを含むサンプル液及びシース液の流れは、内空が拡張された圧力室１６１に流入する際に噴流（ジェット）となり、流路壁面から剥離する（図９Ａ中矢印参照）。このため、目的粒子Ｐは、取込口１６２から離れて、圧力室１６１の奥まで取り込まれる。
目的粒子を主流路１５から圧力室１６１内にまで引き込むため、圧力室１６１の容積の増大量は、連通口１５６から引込口１６２までの分取流路１６の容積（図４参照）よりも大きくされることが好ましい。また、圧力室１６１の容積の増大量は、目的粒子Ｐを含むサンプル液及びシース液の流れを取込口１６２において流路壁面から剥離させるために十分な負圧を発生するような大きさとされることが好ましい。駆動部２３は、これらの容積増大量に見合った電圧幅のピエゾ収縮信号をアクチュエータ３１に出力する。
分取流路１６の連通口１５６から引込口１６２までの長さは、図１０に示す変形例のように、より短くなるように設計してもよい。連通口１５６から引込口１６２までの長さを短くする程、連通口１５６から引込口１６２までの分取流路１６の容積が小さくなるため、目的粒子を主流路１５から圧力室１６１内にまで引き込むための圧力室１６１の容積の増大量を小さくできる。その結果、アクチュエータ３１への印加電圧幅を小さくでき、効率的な分取動作が可能となる。
このように、目的粒子Ｐを分取流路１６において内空が拡張された圧力室１６１の奥にまで取り込むようにすることで、分取流路１６内の圧力が逆転して正圧になった場合にも、目的粒子Ｐが圧力室１６１から主流路１５側へ再流出することを防止できる。すなわち、図９Ｂに示すように、分取流路１６内が正圧となった場合にも、サンプル液及びシース液が取込口１６２の近傍から広く流出していくため、取込口１６２から離れた位置まで取り込まれた目的粒子Ｐそのものの移動量は小さくなる。このため、目的粒子Ｐは、再流出することなく、圧力室１６１内に保持される。
［逆流形成］
駆動部２３が微小粒子を非目的粒子と判定した場合（非分取動作時）、非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液が分取流路１６内に侵入しないようにすることが好ましい。しかしながら、図１１に示すように、主流路１５を送液されるサンプル液及びシース液の流れ（図中実線矢印参照）は大きな運動量を持つため、連通口１５６から分取流路１６に流入してしまう場合がある。連通口１５６から分取流路１６に流入したサンプル液及びシース液の流れは、分取流路１６内で方向を変え、分取流路１６の流路壁に沿って主流路１５側に流出する（図中点線矢印参照）。
分取流路１６から流路壁に沿って主流路１５側に流出するサンプル液及びシース液の流れは流路壁に拘束されるため遅く、連通口１５６における非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液の滞留を引き起こす。この滞留は、目的粒子及び非目的粒子の分取動作を高速に行うための障害となる。
微小粒子測定装置Ａでは、シース液バイパス流路１８により排出口１８１から分取流路１６内に導入されるシース液が、非分取動作時において非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液が分取流路１６に侵入するのを抑制するために作用する。すなわち、シース液インレット１３から導入されるシース液は、排出口１８１から分取流路１６内に導入され、連通口１５６に分取流路１６側から主流路１５側へ向かうシース液の流れ（以下「逆流」とも称する）を形成する（図１２Ａ参照）。そして、この逆流が、主流路１５から分取流路１６に侵入しようとするサンプル液及びシース液の流れと拮抗することで、サンプル液及びシース液の分取流路１６への侵入が阻止される。
逆流は、主流路１５から分取流路１６に侵入しようとするサンプル液及びシース液の流れの運動量（勢い）に見合った運動量を持つことが好ましい。逆流の運動量は、シース液バイパス流路１８へのシース液の送液量を調節することで制御でき、該送液量はシース液バイパス流路１８の流路径を調節することで制御できる。また、送液量の調節は、シリンジポンプなどの送液手段や、シース液バイパス流路１８に設けた弁などによって行うこともできる。
シース液インレット１３から導入されるシース液のシース液流路１４への流量と、シース液バイパス流路１８への流量との流量比は、両流路の流路抵抗比により決定される。このため、シース液インレット１３へのシース液の導入圧力が変動しても、上記流量比が変動せず、安定した動作が可能である。また、検出領域１５ａにおける微小粒子の通流速度を変えるため、シース液流量の変更が必要になった場合にも、シース液流路１４への流量とシース液バイパス流路１８への流量とを個別に制御する必要がない。
逆流の運動量は、主流路１５から分取流路１６へのサンプル液及びシース液の侵入を完全に抑制可能な大きさとすることが好ましい。ただし、逆流は、必ずしも上記侵入を完全に抑制するものである必要はなく、ある程度軽減するものであれば分取動作の高速化に寄与し得る。上述のように、分取流路１６から流路壁に沿って主流路１５側に流出するサンプル液及びシース液の流れが生じると、連通口１５６における非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液の滞留の要因となる。図１２Ｂに示すように、主流路１５から分取流路１６へのサンプル液及びシース液の侵入をある程度軽減できれば、滞留の要因となる分取流路１６から流路壁に沿って主流路１５側に流出するサンプル液及びシース液の流れの抑制が可能である。
なお、連通口１５６における非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液の滞留を抑制することで、目的粒子及び非目的粒子が流路壁に付着することも防止できる。
逆流は、目的粒子の分取流路１６への引き込み時（分取動作時）にも、連通口１５６に形成されている（図１３Ａ参照）。このため、分取動作時には、逆流を上回る引き込み圧で目的粒子を分取流路１６内に引き込む必要がある（図１３Ｂ参照）。圧力室１６１の容積の増大量は、逆流を上回る引き込み圧を発生させるために十分な大きさとされる。駆動部２３は、この容積増大量に見合った電圧幅のピエゾ収縮信号をアクチュエータ３１に出力する。
さらに、目的粒子は、図１３Ｂに示すように、分取流路１６において排出口１８１を過ぎる位置まで引き込まれる必要がある。分取流路１６への引き込みが不十分であると、シース液バイパス流路１８により排出口１８１から分取流路１６内に導入されるシース液によって形成される逆流によって目的粒子が主流路１５に再流出してしまう場合がある。
排出口１８１を超える位置まで目的粒子を十分に引き込むため、圧力室１６１の容積の増大量は逆流の流量よりも大きくし、負圧により主流路１５から分取流路１６内に吸引されるサンプル液及びシース液の流量が逆流の流量よりも大きくなるようにする。駆動部２３は、この容積増大量に見合った電圧幅のピエゾ収縮信号をアクチュエータ３１に出力する。
［駆動信号］
図１４を参照して、駆動部２３からアクチュエータ３１に印加される電圧の波形（目的粒子を取得する際の駆動信号）を説明する。アクチュエータ３１に印加される電圧の波形は、「パルス波形」（図Ａ）、「ステップ波形」（図Ｂ）及び「アンダーシュート付ステップ波形」（図Ｃ）のいずれであってもよい。
ここで「アンダーシュート付ステップ波形」とは、「ステップ波形」において、ステップ部分よりも電圧値が低くなるアンダーシュート部分が付加された波形を意味する。「アンダーシュート付ステップ波形」は、「ステップ波形」と「パルス波形」との合成波ということもできる。
ステップ波形及びアンダーシュート付ステップ波形における一波形分の電圧値の低下幅は、連通口１５６における逆流を上回る引き込み圧を分取流路１６内に発生させるため、十分な容積増加を圧力室１６１にもたらすように設定される。また、上記低下幅は、負圧により目的粒子を分取流路１６内の排出口１８１を過ぎる位置まで引き込むため、十分な容積増加を圧力室１６１にもたらすように設定される。
アクチュエータ３１に印加される電圧は、アンダーシュート付ステップ波形とすることが好ましい。アンダーシュート付ステップ波形では、信号の発生開始直後において圧力室１６１の体積を大きく増加させることができ、分取流路１６内に大きな負圧を発生させることができる。その結果、アンダーシュート付ステップ波形によれば、目的粒子の引き込み開始直後において、主流路１５内から分取流路１６内へのサンプル液及びシース液の取り込み体積の増加応答を早めることができ、目的粒子の取り込みを迅速に行うことが可能である。
パルス波形の振幅は、ステップ波形及びアンダーシュート付ステップ波形が満たすべき条件に加えて、目的粒子を主流路１５から圧力室１６１内にまで引き込むため及び目的粒子Ｐを含むサンプル液及びシース液の流れを取込口１６２において流路壁面から剥離させるため、十分な容積増加を圧力室１６１にもたらすように設定される。
パルス波形及びアンダーシュート付ステップ波形では、ピエゾ伸張となる波形成分が含まれるため、圧力室１６１の容積が増加し、分取流路１６内に正圧が発生する。また、ステップ波形においても、予期せぬ電圧値の変動によって分取流路１６内に正圧が発生する場合がある。上述のように、目的粒子Ｐは圧力室１６１の奥にまで取り込まれるため、分取流路１６内に正圧が生じても圧力室１６１から主流路１５側へ再流出することがない。
アクチュエータ３１に印加される電圧の波形は、パルス波形を採用することが特に好ましい。ステップ波形及びアンダーシュート付ステップ波形においては、アクチュエータ３１に印加される電圧が０となると、アクチュエータ３１が可動範囲の限界に達し、目的粒子の分取が不能となるため、分取可能な微小粒子の最大数に制限がある。一方、パルス波形では、このような制限がない。
以上のように、本技術に係る微小粒子分取方法によれば、主流路１５と分取流路１６との連通口１５６に逆流を形成させておくことにより、主流路１５から分取流路１６へのサンプル液及びシース液の不適当な侵入を抑制できる。これにより、本技術に係る微小粒子分取方法では、連通口１５６における非目的粒子又はこれを含むサンプル液及びシース液の滞留を防止して、目的粒子及び非目的粒子の分取動作を高速に行うことが可能である。
３．本技術に係る微小粒子分取方法の変形例
上述の例では、シース液バイパス流路１８により排出口１８１から分取流路１６内に導入されるシース液が、主流路１５側へ向かう逆流のみを形成する場合を説明した。この場合、分取流路末端１９（図２参照）を閉鎖端とすればよい。
一方、分取流路末端１９は開放端としてもよい（図１５参照）。この場合、排出口１８１から分取流路１６内に導入されるシース液を、主流路１５側へ向かう逆流と、分取流路末端１９側へ向かう流れ（以下「順流」とも称する）とに分流できる。
駆動部２３からアクチュエータ３１に印加する電圧の制御が予期せず変動した場合、アクチュエータ３１にピエゾ伸張となる電圧を印加されてしまい、分取流路１６内に正圧が発生する場合がある。また、主流路１５及び廃棄流路１７の圧力変動（特に廃棄流路１７の背圧低下）が生じた場合にも、分取流路１６内に正圧が発生する場合がある。このような正圧が発生すると、分取流路１６に一旦取り込んだ目的粒子が再度主流路１５へ流出してしまうおそれがある。
上述の順流を形成させておくことで、分取流路１６内の排出口１８１を過ぎる位置まで引き込まれた目的粒子は、順流によって分取流路１６のさらに奥へと送流される。このため、仮に分取流路１６内が正圧となった場合にも、目的粒子が順流に逆らって主流路１５へ再流出することがなく、目的粒子を分取流路１６内に保持できる。従って、アクチュエータ３１への駆動電圧の制御をロバストな条件で行うことが可能となる。
分取流路末端１９は開放端とする場合、分取流路末端１９から排出される目的粒子を含むサンプル液及びシース液は、分取流路末端１９に接続されたチューブ等によって容器に回収される。回収される目的粒子の希釈を抑制するため、順流の流量は、逆流の流量よりも小さくされることが好ましい。順流及び逆流の流量比は、分取流路１６の流路径を適宜変更することによって調節が可能である。なお、廃棄流路１７に流された非目的粒子は、廃棄流路１７内に蓄積するか、外部に排出すればよい。廃棄流路１７，１７は再度合流させて、非目的粒子の外部への排出口をひとつとする構成としてもよい。
さらに、上述の例では、シース液インレット１３から導入されるシース液をシース液バイパス流路１８によって分取流路１６内に送液し、逆流を形成させる場合を説明した。この場合には、簡略なチップ構造によって逆流を形成できる。しかし、本技術に係る微小粒子分取方法では、主流路１５と分取流路１６との連通口１５６に逆流を形成可能な限りにおいて、逆流を形成するための流体はシース液に限定されない。また、分取流路１６内への流体の送液方法もシース液バイパス流路１８によらず、排出口１８１に直接シリンジポンプ等の送液手段を接続する方法などを採用できる。
４．微小粒子分取プログラム
上述の微小粒子分取装置Ａの駆動部２３には、上述の動作を実行するための微小粒子分取プログラムが格納されている。
プログラムは、ハードディスクに格納・保持され、ＣＰＵ及びＯＳの制御の下でメモリに読み込まれて、上述の分取動作を実行する。プログラムは、コンピュータ読み取り可能な記録媒体に記録されたものとできる。記録媒体としては、コンピュータ読み取り可能な記録媒体であれば特に制限はないが、具体的には、例えば、フレキシブルディスクやＣＤ−ＲＯＭ等の円盤形記録媒体が用いられる。また、磁気テープ等のテープ型記録媒体を用いてもよい。また、一部の処理をＤＳＰ（Digital Signal Processor）、ＡＳＩＣ（Application Specific Integrated Circuit）、ＰＬＤ（Programing Logic Device）、ＦＰＧＡ（Field-Programmable Gate Array）等のハードウェアで構成し、上記ソフトウエアプログラムと連携させて高速処理を行う構成も採用できる。
本技術に係る微小粒子分取方法は以下のような構成をとることもできる。
（１）主流路を通流する液体中の微小粒子を、前記主流路に連通する分岐流路内に負圧を発生させることにより該分岐流路内に取り込む手順を含み、該手順において、前記主流路と前記分岐流路との連通口に、前記分岐流路側から前記主流路側へ向かう液体の流れを形成させておく微小粒子分取方法。
（２）前記手順において、前記分岐流路内の前記連通口の近傍に位置して設けられた導入口から前記液体を前記分岐流路内に導入し、前記流れを形成させる上記（１）記載の微小粒子分取方法。
（３）前記手順において、前記導入口から前記分岐流路内に導入されて前記連通口に向かって送液される前記液体の流量よりも、前記負圧により前記主流路から前記分岐流路内に吸引される前記液体の流量を大きくする上記（２）記載の微小粒子分取方法。
（４）前記手順において、前記主流路内の前記微小粒子を、前記連通口から、前記分岐流路内の前記導入口を過ぎる位置まで取り込む上記（２）又は（３）記載の微小粒子分取方法。
（５）前記手順の前後においても、前記流れを維持する上記（１）〜（４）のいずれかに記載の微小粒子分取方法。
（６）前記手順において、前記導入口から前記分岐流路内に導入された前記液体を、前記連通口の方向に向かう逆流と、反対方向に向かう順流と、に分流する上記（２）〜（５）のいずれかに記載の微小粒子分取方法。
（７）前記手順において、アクチュエータにより前記分岐流路の内空を変形させる力を印加して前記負圧を発生させ、該内空の容積を増大させる上記（１）〜（６）のいずれかに記載の微小粒子分取方法。
（８）前記手順において、前記分岐流路内にパルス波形、ステップ波形又はアンダーシュート付ステップ波形の前記負圧の変化を生じさせる上記（１）〜（７）のいずれかに記載の微小粒子分取方法。
また、本技術に係る微小粒子分取用マイクロチップは以下のような構成をとることもできる。
（９）微小粒子を含むサンプル液が導入されるサンプル液導入口と、該サンプル液導入口から導入された前記サンプル液が通流するサンプル液流路と、シース液が導入されるシース液導入口と、該シース液導入口から導入された前記シース液が通流する第一のシース液流路と、前記サンプル液流路と前記第一のシース液流路とが合流する主流路と、該主流路に連通する分岐流路と、前記シース液導入口と前記分岐流路内の前記主流路への連通口の近傍に位置して設けられたシース液排出口とを接続し、前記シース液導入口から導入される前記シース液を前記シース液排出口から前記分岐流路内に送液する第二のシース液流路と、を備える微小粒子分取用マイクロチップ。
（１０）前記第二のシース液流路は、前記サンプル液流路、前記第一のシース液流路及び前記主流路と連絡していない上記（９）記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
（１１）表面の前記分岐流路に対応する位置に接触して、接触面に変位を加えるアクチュエータが配置されている上記（９）又は（１０）記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
（１２）前記分岐流路に、前記変位によって容積変化を生じる圧力室が構成されている上記（１１）記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
（１３）前記分岐流路における配列順序が、前記連通口、前記シース液排出口及び前記圧力室の順である上記（１２）記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
（１４）前記第一のシース液流路を２つ備え、前記シース液導入口が、２つの前記第一のシース液流路の対称中心に設けられている上記（９）〜（１３）のいずれかに記載の微小粒分取用マイクロチップ。
（１５）前記分岐流路の前記連通口と反対側の末端が、開放端とされている上記（９）〜（１４）のいずれかに記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
Ａ：微小粒子分取装置、ａ１、ａ２、ａ３：基板層、Ｐ：目的粒子、Ｓ：サンプル液層流、Ｔ：シース液層流、１ａ：マイクロチップ、１１：サンプル液インレット、１２：サンプル液流路、１３：シース液インレット、１４：シース液流路、１５：主流路、１５ａ：検出領域、１５６：連通口、１６：分取流路、１６１：圧力室、１６２：取込口、１７：廃棄流路、１８：シース液バイパス流路、１８１：排出口、１９：分取流路末端、２１：照射部、２２：検出部、２３：駆動部、３１：アクチュエータ、３１１：変位板

Claims (7)

  1. 微小粒子を含むサンプル液が導入されるサンプル液導入口と、
    該サンプル液導入口から導入された前記サンプル液が通流するサンプル液流路と、
    シース液が導入されるシース液導入口と、
    該シース液導入口から導入された前記シース液が通流する第一のシース液流路と、
    前記サンプル液流路と前記第一のシース液流路とが合流する主流路と、
    該主流路に連通する分岐流路と、
    前記シース液導入口と、前記分岐流路内の前記主流路への連通口の近傍に位置して設けられたシース液排出口と、を接続し、前記シース液導入口から導入される前記シース液を前記シース液排出口から前記分岐流路内に送液する第二のシース液流路と、
    を備える微小粒子分取用マイクロチップ。
  2. 前記第二のシース液流路は、前記サンプル液流路、前記第一のシース液流路及び前記主流路と連絡していない請求項１記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
  3. 表面の前記分岐流路に対応する位置に接触して、接触面に変位を加えるアクチュエータが配置されている請求項１又は２に記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
  4. 前記分岐流路に、前記変位によって容積変化を生じる圧力室が構成されている請求項３記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
  5. 前記分岐流路における配列順序が、前記連通口、前記シース液排出口及び前記圧力室の順である請求項４記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
  6. 前記第一のシース液流路を２つ備え、
    前記シース液導入口が、２つの前記第一のシース液流路の対称中心に設けられている請求項１〜５のいずれかに記載の微小粒分取用マイクロチップ。
  7. 前記分岐流路の前記連通口と反対側の末端が、開放端とされている請求項１〜６のいずれかに記載の微小粒子分取用マイクロチップ。
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