TW202413631A - 用於基因體編輯之組成物及方法 - Google Patents
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Abstract
本發明揭示用於使用腦膜炎奈瑟氏球菌(
Neisseria meningitidis, Nme) CRISPR/Cas9系統進行離體基因體編輯之組成物及方法。本揭示案提供用於例如過繼性細胞轉移療法中的包含遺傳修飾的經工程改造之細胞。
Description
本揭示案係關於使用腦膜炎奈瑟氏球菌(
Neisseria meningitidis) CRISPR/Cas9系統之基因體編輯。
下調內源性T細胞受體(TCR) α及β單元、MHC I類及MHC II類基因座之能力對於許多體內及離體效用至關重要，例如，當使用同種異體細胞(源自供體)用於移植或例如用於在體外產生不活化T細胞之細胞群體時。具體而言，將同種異體細胞轉移至個體中引起細胞療法領域之極大興趣。由於接受者個體免疫細胞之排斥問題，同種異體細胞之使用受到限制，該等免疫細胞將所移植之細胞識別為外來細胞並發動攻擊。為了避免免疫排斥之問題，基於細胞之療法集中於使用個體自身細胞作為用於療法之細胞來源之自體方法，該方法耗時且成本高。
通常，同種異體細胞之免疫排斥由供體及接受者之間之主要組織相容性複合物(MHC)分子之失配引起。在人類群體內，MHC分子以各種形式存在，包括例如任何給定MHC基因之諸多遺傳變異體，亦即，編碼不同形式之MHC蛋白之對偶基因。MHC分子之主要類別稱為MHC I類及MHC II類。MHC I類分子(例如人類中之HLA-A、HLA-B及HLA-C)在所有有核細胞上表現且呈現抗原以活化細胞毒性T細胞(CD8+ T細胞或CTL)。MHC II類分子(例如人類中之HLA-DP、HLA-DQ及HLA-DR)僅在某些細胞類型(例如B細胞、樹突細胞及巨噬細胞)上表現且呈現抗原以活化輔助性T細胞(CD4+ T細胞或Th細胞)，該等輔助性T細胞進而向B細胞提供信號以產生抗體。
例如，個體間MHC對偶基因之微小差異可引起接受者中之T細胞變得活化。在T細胞發育期間，個體之T細胞庫對自身之MHC分子耐受，但識別另一個體之MHC分子之T細胞可在循環中持續存在，且稱為同種異體反應性T細胞。同種異體反應性T細胞可變得活化，例如，由於體內存在另一個體之表現MHC分子之細胞，引起例如移植物抗宿主病及移植排斥。
用於降低同種異體細胞對排斥之易感性之方法及組成物引人關注，包括例如降低細胞之MHC蛋白表現以避免接受者T細胞反應。在實踐中，對同種異體細胞進行遺傳修飾以用於移植至個體中之能力受到需要多重基因體編輯以減少所有MHC蛋白之表現、同時避免其他有害之接受者免疫反應之阻礙。舉例而言，雖然耗乏MHC I類蛋白之策略可減少CTL之活化，但表面上缺少MHC I類之細胞易由免疫系統之自然殺手(NK)細胞溶解，此乃因NK細胞活化受MHC I類特異性抑制受體調控。因此，已證明安全地降低或消除MHC I類之表現具有挑戰性。亦已證明出於包括低編輯效率及低細胞存活率之原因，耗乏MHC II類分子之基因體編輯策略係困難的，特別在某些細胞類型中，從而阻礙作為細胞療法之實際應用。
因此，需要改良之方法及組成物來修飾細胞以克服接受者免疫排斥之問題及與產生用於移植之更安全細胞所需之多重遺傳修飾相關的技術困難。本揭示案提供使用腦膜炎奈瑟氏球菌CRISPR/Cas9系統之基因體編輯。NmeCas9比釀膿鏈球菌(
Streptococcus pyogenes) Cas9 (SpyCas9)小，使NmeCas9適於基於信使RNA (mRNA)之遞送方法。NmeCas9具有有利特異性及低脫靶裂解速率。
經工程改造之細胞包含HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA (II類主要組織相容性複合物反式活化因子)中之遺傳修飾，該遺傳修飾可用於細胞療法中。本揭示案進一步提供藉由對HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因進行遺傳修飾來降低或消除細胞中內源性T細胞受體、MHC I類或II類蛋白之表面表現的組成物及方法。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞降低經工程改造之細胞中HLA-A蛋白之表面表現的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞降低經工程改造之細胞中TRAC蛋白之表面表現的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞降低經工程改造之細胞中TRBC蛋白之表面表現的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞降低經工程改造之細胞中MHC II類蛋白之表面表現的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。
相關申請案之交叉參考
本申請案根據35 USC 119(e)主張2022年6月16日提出申請之美國臨時申請案第63/352,990號之權益，該美國臨時申請案之內容以全文引用之方式併入本文。
序列表
本申請案含有序列表，其係以XML檔案格式以電子方式提交，且其特此以全文引用之方式併入。該XML檔案創建於2023年6月13日，命名為「01155-0055-00PCT_SL.xml」，且大小為20,586,099位元組。
本揭示案提供經工程改造之細胞，以及用於對細胞進行遺傳修飾以製備經工程改造之細胞及經工程改造之細胞群體的方法及組成物，其可用於例如過繼細胞轉移(ACT)療法。本文所提供之本揭示案藉由提供用於對HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA或AAVS1基因座進行遺傳修飾以降低細胞表面上HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類蛋白表現之方法及組成物來克服先前技術方法之某些障礙。在一些實施例中，本揭示案提供由於HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因之遺傳修飾而具有降低或消除之HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞。在一些實施例中，本揭示案提供用於降低或消除HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類蛋白表現之組成物及方法，以及用於進一步降低細胞對免疫排斥之易感性之組成物及方法。舉例而言，在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由遺傳修飾HLA-A基因來降低或消除HLA-A蛋白之表面表現。在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由遺傳修飾TRAC基因來降低或消除TRAC蛋白之表面表現。在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由遺傳修飾TRBC1基因來降低或消除TRBC1蛋白之表面表現。在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由遺傳修飾TRBC2基因來降低或消除TRBC2蛋白之表面表現。在一些實施例中，該等方法及組成物包括藉由遺傳修飾CIITA來降低或消除MHC II類蛋白之表面表現。藉由本文所揭示之方法產生的經工程改造之細胞組成物具有期望性質，包括例如降低之MHC分子表現、降低之體外及體內免疫原性、增加之存活以及增加之與更大移植個體之遺傳相容性。
術語「約」或「大約」意指由熟習此項技術者確定的特定值之可接受誤差，此部分地端視量測或確定該值之方式；或實質上不影響所述標的物之性質或在此項技術可接受之公差內(例如，在10%、5%、2%或1%以內)之變化程度。因此，除非有相反指示，否則在以下說明書及所附申請專利範圍中闡述之數字參數為近似值，其可端視所尋求獲得之期望性質而變化。至少，而非試圖將等同原則之應用限制在申請專利範圍之範疇內，各數字參數應該至少根據報告之有效數字之數目且藉由應用普通舍入技術來解釋。
本文提供以下編號之實施例：
實施例1係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個核苷酸。
實施例2係如實施例1之經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自表1中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸，或其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內由指導RNA靶向之至少一個核苷酸，該指導RNA包含SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80中任一者之指導序列。
實施例3係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
實施例4係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
實施例5係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
實施例6係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
實施例7係如實施例1-6中任一項之經工程改造之細胞，其中該HLA-A表現係藉由結合至HLA-A基因體靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：該等基因體坐標選自chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494，或選自chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
實施例8係如實施例1-7中任一項之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表1中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
實施例9係如實施例1-8中任一項之經工程改造之細胞，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
實施例10係如實施例1-9中任一項之經工程改造之細胞，其中該細胞係HLA-B同型接合的且係HLA-C同型接合的。
實施例11係一種組成物，其包含HLA-A指導RNA及視情況RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv.包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v.來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi.與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例12係一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含HLA-A指導RNA及視情況RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv.包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v.來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi.與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例13係一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中HLA-A蛋白之表面表現之方法，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含HLA-A指導RNA及視情況RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含：i.選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之指導序列；ii.選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii.與選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv.包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v.來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi.與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例14係如實施例11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 66、61、13、55、70及71中任一者之指導序列。
實施例15係如實施例11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 61、66、13、17、55及70中任一者之指導序列。
實施例16係如實施例11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 61之序列。
實施例17係如實施例11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 66之序列。
實施例18係一種細胞群體，其包含如實施例1-10中任一項之經工程改造之細胞、或藉由如實施例12-17中任一項之方法或藉由使用如實施例11之組成物產生的經工程改造之細胞。
實施例19係一種醫藥組成物，其包含(a)如實施例1-10中任一項之經工程改造之細胞；藉由如實施例12-17中任一項之方法或藉由使用如實施例11之組成物產生的經工程改造之細胞；或(b)如實施例18之細胞群體。
實施例20係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個核苷酸。
實施例21係如實施例20之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表2中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸，或其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內由指導RNA靶向之至少一個核苷酸，該指導RNA包含SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120中任一者之指導序列。
實施例22係如實施例20或21之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；或chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698。
實施例23係如實施例20或21之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547481-22547505內之至少一個核苷酸。
實施例24係如實施例20或21之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547471-22547495內之至少一個核苷酸。
實施例25係如實施例20或21之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547470-22547494內之至少一個核苷酸。
實施例26係如實施例20或21之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547462-22547486內之至少一個核苷酸。
實施例27係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC表現，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549或chr14:22547674-22547698。
實施例28係如實施例20-27中任一項之經工程改造之細胞，其中該TRAC表現係藉由結合至TRAC靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該TRAC靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549或chr14:22547674-22547698。
實施例29係一種組成物，其包含：a)包含指導序列之TRAC指導RNA，該指導序列i)靶向TRAC基因體靶序列；或ii)引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRAC基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)，該TRAC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549或chr14:22547674-22547698。
實施例30係一種組成物，其包含：(a) TRAC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRAC指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例31係如實施例30之組成物，其用於改變細胞中TRAC基因座內之DNA序列。
實施例32係如實施例30之組成物，其用於降低或消除細胞中TRAC蛋白之表現。
實施例33係一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含：(a) TRAC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRAC指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例34係一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中TRAC蛋白之表面表現之方法，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含：(a) TRAC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRAC指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例35係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 111、107、101、102及103中任一者之指導序列。
實施例36係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 107之序列。
實施例37係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 111之序列。
實施例38係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 117之序列。
實施例39係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 118之序列。
實施例40係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 119之序列。
實施例41係如實施例29-34中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 120之序列。
實施例42係一種細胞群體，其包含如實施例20-28中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如請求項29或30之組成物或如實施例33-41中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之該細胞群體係CD3-細胞。
實施例43係一種細胞群體，其包含如實施例20-28中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例29或30之組成物或藉由如實施例33-41中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，或如實施例42之細胞群體，其中大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之該群體缺少內源性T細胞受體。
實施例44係一種細胞群體，其包含如實施例20-28中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例29或30之組成物或藉由如實施例33-41中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，或如實施例42或43之細胞群體，其中相對於未改變之相同細胞群體，該群體中該TRAC基因之該表現已降低至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、或至少約98%或至少約99%。
實施例45係一種醫藥組成物，其包含如實施例20-28中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例29或30之組成物或藉由如實施例33-41中任一項之方法產生的經工程改造之細胞、或如實施例42-44中任一項之細胞群體。
實施例46係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現，其包含TRBC基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr7: 142791756-142802543內之至少一個核苷酸。
實施例47係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現，其包含TRBC基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543，或其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內由指導RNA靶向之至少一個核苷酸，該指導RNA包含SEQ ID NO: 215、201-214及216-265中任一者之指導序列。
實施例48係如實施例46或47之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表3中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
實施例49係如實施例46或47之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
實施例50係如實施例46或47之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
實施例51係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC表現，其包含人類TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含以下基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721；或(c) chr7:142801104-142802543。
實施例52係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC表現，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
實施例53係一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC表現，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
實施例54係如實施例46-53中任一項之經工程改造之細胞，其中該TRBC表現係藉由結合至TRBC靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該TRBC靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
實施例55係如實施例46-54中任一項之經工程改造之細胞，其中該TRBC表現係藉由結合至TRBC靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該TRBC靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
實施例56係一種組成物，其包含：(a) TRBC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRBC指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；iii)與選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv)包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例57係如實施例56之組成物，其用於改變細胞中TRBC基因座內之DNA序列。
實施例58係如實施例56之組成物，其用於降低或消除細胞中TRBC蛋白之表現。
實施例59係一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) TRBC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRBC指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；iii)與選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv)包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例60係一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中TRBC蛋白之表面表現之方法，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) TRBC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRBC指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；iii)與選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv)包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例61係如實施例56-60中任一項之方法或組成物，其中該TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、216、223、224、229、230、246、259及260中任一者之指導序列。
實施例62係如實施例56-61中任一項之方法或組成物，其中該TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、216、224、229、246、259及260中任一者之指導序列。
實施例63係如實施例56-62中任一項之方法或組成物，其中該TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、259及260中任一者之指導序列。
實施例64係一種細胞群體，其包含如實施例46-55中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例56之組成物或藉由如實施例59-63中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之該細胞群體係CD3-細胞。
實施例65係一種細胞群體，其包含如實施例46-55中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例56之組成物或藉由如實施例59-63中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之該群體缺少內源性T細胞受體。
實施例66係一種細胞群體，其包含如實施例46-55中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例56之組成物或藉由如實施例59-63中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中相對於未改變之相同細胞群體，該群體中該TRBC基因之該表現已降低至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%。
實施例67係一種醫藥組成物，其包含(a)如實施例46-55中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例56之組成物或藉由如實施例59-63中任一項之方法產生的經工程改造之細胞、或(b)如實施例64-66中任一項之細胞群體。
實施例68係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
實施例69係如實施例68之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表4中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
實施例70係如實施例68之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913或chr16:10907504-10907528。
實施例71係如實施例68之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521或chr16:10907508-10907532。
實施例72係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現，其包含CIITA基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10907504-10907528。
實施例73係一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現，其包含CIITA基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532。
實施例74係如實施例68-73中任一項之經工程改造之細胞，其中該MHC II類表現係藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或chr16:10907504-10907528。
實施例75係如實施例68-74中任一項之經工程改造之細胞，其中該MHC II類表現係藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521或chr16:10907508-10907532。
實施例76係一種組成物，其包含：(a) CIITA指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該CIITA指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例77係如實施例76之組成物，其用於改變細胞中CIITA基因內之DNA序列。
實施例78係如實施例76之組成物，其用於降低或消除細胞中CIITA之表現。
實施例79係一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) CIITA指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該CIITA指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例80係一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中MHC II類蛋白之表面表現之方法，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) CIITA指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該CIITA指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例81係如實施例76-80中任一項之方法或組成物，其中該CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301、422、302、320、321、324、326、327、332、354、361、372、400、408、414、415、419、420、428、431、432、434、451、455、458、462、463、464、468中任一者之指導序列。
實施例82係如實施例76-81中任一項之方法或組成物，其中該CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 538中任一者之指導序列。
實施例83係如實施例76-81中任一項之方法或組成物，其中該CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301、422、302、320、372、414、419、462及463中任一者之指導序列。
實施例84係一種細胞群體，其包含如實施例68-75中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例76之組成物或藉由如實施例79-83中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之該細胞群體係MHC II類分子陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例85係一種細胞群體，其包含如實施例68-75中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例76之組成物或藉由如實施例79-83中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中大於約50%、大於約55%、大於約60%、大於約65%、大於約70%、大於約75%、大於約80%、大於約85%、大於約90%、大於約95%、大於約98%或大於約99%之該細胞群體對MHC II類分子為陰性，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
實施例86係一種細胞群體，其包含如實施例68-75中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例76之組成物或藉由如實施例79-83中任一項之方法產生的經工程改造之細胞，其中相對於未改變之相同細胞群體，該群體中MHC II類分子之該表現已降低至少約50%、至少約55%、至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約95%、至少約98%或至少約99%。
實施例87係一種醫藥組成物，其包含(a)如實施例68-75中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如實施例76之組成物或藉由如實施例79-83中任一項之方法產生的經工程改造之細胞、或(b)如實施例84-86中任一項之細胞群體。
實施例88係一種經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr19: 55115151- 55116209。
實施例89係如實施例88之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表5中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
實施例90係如實施例88之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。
實施例91係一種經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。
實施例92係如實施例88-91中任一項之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾由結合至AAVS1基因體靶序列之基因體編輯系統誘導，該AAVS1基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。
實施例93係一種組成物，其包含：a)包含指導序列之AAVS1指導RNA，該指導序列i)靶向AAVS1基因體靶序列；或ii)引導RNA指導之DNA結合劑誘導AAVS1基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)，該AAVS1基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。
實施例94係一種組成物，其包含：a) AAVS1指導RNA (gRNA)及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該AAVS1指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 601-774之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；iii)與選自SEQ ID NO: 601-774之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv)包含表5中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例95係一種製備經工程改造之人類細胞之方法，其包括使細胞與以下接觸：(a) AAVS1指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該AAVS1指導RNA包含：i)選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列；ii)選自SEQ ID NO: 601-774之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；iii)與選自SEQ ID NO: 601-774之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；iv)包含表5中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；v)來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
實施例96係如實施例93-95中任一項之方法或組成物，其中該AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 611、620、622、626、627、628、629、632、633、634、656、659、660、661、673、691、692、730、734及746中任一者之指導序列。
實施例97係如實施例1-96中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸。
實施例98係如實施例1-97中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少5個、6個、7個、8個、9個或10個鄰接核苷酸。
實施例99係如實施例1-98中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該基因體靶序列包含該等基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。
實施例100係如實施例1-99中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該基因體靶序列包含該等基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。
實施例101係如實施例1-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該基因體靶序列包含該等基因體坐標內之至少17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個或24個鄰接核苷酸。
實施例102係如實施例1-101中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含插入/缺失。
實施例103係如實施例1-102中任一項之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含異源編碼序列之插入。
實施例104係如實施例1-103中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少一個A至G之取代。
實施例105係如實施例1-104中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少一個C至T之取代。
實施例106係如實施例1-105中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞具有CIITA基因中之遺傳修飾。
實施例107係如實施例1-106中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞於該細胞之表面上具有降低之TRAC蛋白表現。
實施例108係如實施例1-107中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞於該細胞之表面上具有降低之TRBC蛋白表現。
實施例109係如實施例1-108中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞於該細胞之表面上具有降低之MHC II類分子表現。
實施例110係如實施例1-109中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造之細胞係免疫細胞。
實施例111係如實施例1-110中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係原代細胞。
實施例112係如實施例1-111中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造之細胞係單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突細胞或顆粒球。
實施例113係如實施例1-112中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造之細胞係淋巴球。
實施例114係如實施例1-113中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係T細胞。
實施例115係如實施例1-114中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係CD8+ T細胞。
實施例116係如實施例1-114中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係CD4+ T細胞。
實施例117係如實施例1-113中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係自然殺手(NK)細胞。
實施例118係如實施例1-113中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係巨噬細胞。
實施例119係如實施例1-113中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係B細胞。
實施例120係如實施例1-113中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係血漿B細胞。
實施例121係如實施例1-113中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係記憶B細胞。
實施例122係如實施例1-109中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係幹細胞。
實施例123係如實施例1-109中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係前驅細胞。
實施例124係如實施例1-109中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係HSC。
實施例125係如實施例1-109中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係iPSC。
實施例126係如實施例1-121中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係經活化細胞。
實施例127係如實施例1-121中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係未經活化細胞。
實施例128係如實施例18之群體或如實施例19之醫藥組成物，其中該細胞群體係至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99% HLA-A陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例129係如實施例42-44及64-66中任一項之群體或如實施例45或67之醫藥組成物，其中該細胞群體係至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%內源性TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例130係如實施例84-86中任一項之群體或如實施例87之醫藥組成物，其中該細胞群體係至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5% HLA-DP、DQ、DR陰性，如藉由流式細胞術所量測。
實施例131係如實施例18之群體或如實施例19之醫藥組成物，其中至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%之該細胞群體包含該HLA-A基因中之該遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
實施例132係如實施例42-44中任一項之群體或如實施例45之醫藥組成物，其中至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之該細胞群體包含該TRAC基因中之該遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
實施例133係如實施例64-66中任一項之群體或如實施例67之醫藥組成物，其中至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之該細胞群體包含該TRBC基因中之該遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
實施例134係如實施例84-86中任一項之群體或如實施例87之醫藥組成物，其中至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%之該細胞群體包含該CIITA基因中之該遺傳修飾，如藉由次世代定序(NGS)所量測。
實施例135係如實施例1-134中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係同種異體細胞。
實施例136係如實施例1-135中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係原代細胞。
實施例137係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係CD4+ T細胞。
實施例138係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係CD8+ T細胞。
實施例139係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係記憶T細胞。
實施例140係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係B細胞。
實施例141係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係血漿B細胞。
實施例142係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係記憶B細胞。
實施例143係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係自然殺手(NK)細胞。
實施例144係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係巨噬細胞。
實施例145係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係幹細胞。
實施例146係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係多潛能幹細胞(PSC)。
實施例147係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係造血幹細胞(HSC)。
實施例148係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係誘導性多潛能幹細胞(iPSC)。
實施例149係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係間質幹細胞(MSC)。
實施例150係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係神經幹細胞(NSC)。
實施例151係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係角膜緣幹細胞(LSC)。
實施例152係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係前驅細胞，例如內皮前驅細胞或神經前驅細胞。
實施例153係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係組織特異性原代細胞。
實施例154係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係選自：軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。
實施例155係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係經活化細胞。
實施例156係如實施例1-136中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係未經活化細胞。
實施例157係如實施例1-156中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該等細胞係用基因體編輯系統進行工程改造。
實施例158係如實施例7-157中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
實施例159係如實施例158之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9 (NmeCas9)。
實施例160係如實施例159之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該NmeCas9係Nme1Cas9、Nme2Cas9或Nme3Cas9。
實施例161係如實施例158-160中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑具有雙股內核酸酶活性。
實施例162係如實施例158-161中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑具有切口酶活性。
實施例163係如實施例158-161中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑包含dCas9 DNA結合結構域。
實施例164係如實施例158-160中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係A至G鹼基編輯子。
實施例165係如實施例158-160中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係C至T鹼基編輯子。
實施例166係如實施例158-165中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。
實施例167係如實施例158之經工程改造之細胞，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9切口酶。
實施例168係如實施例1-167中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該指導RNA於載體中提供給該細胞。
實施例169係如實施例1-168中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該RNA指導之DNA結合劑於載體中，視情況於與該指導RNA相同之載體中提供給該細胞。
實施例170係如實施例1-169中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該外源核酸於載體中提供給該細胞。
實施例171係如實施例168-170中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係病毒載體。
實施例172係如實施例168-170中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係非病毒載體。
實施例173係如實施例168-171中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係慢病毒載體。
實施例174係如實施例168-171中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係逆轉錄病毒載體。
實施例175係如實施例168-171中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係AAV。
實施例176係如實施例1-175中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該指導RNA於脂質核酸組裝組成物中，視情況於與RNA指導之DNA結合劑相同之脂質核酸組裝組成物中提供給該細胞。
實施例177係如實施例1-176中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該外源核酸於脂質核酸組裝組合物中提供給該細胞。
實施例178係如實施例176或177之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該脂質核酸組裝組成物係脂質奈米粒子(LNP)。
實施例179係如實施例1-178中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該外源核酸整合至該細胞之該基因體中。
實施例180係如實施例1-179中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中藉由同源重組(HR)將該外源核酸整合至該細胞之該基因體中。
實施例181係如實施例1-180中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該外源核酸整合至該細胞之該基因體之安全港基因座中。
實施例182係如實施例1-181中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該指導RNA係單指導RNA。
實施例183係如實施例182之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該單指導RNA包含該指導序列之3’處的SEQ ID NO: 900之核苷酸序列。
實施例184係如實施例182或183之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該單指導RNA包含指導區域及保守區域，其中該保守區域包含以下之一或多者：(a)縮短之重複/反重複區域，其中該縮短之重複/反重複區域缺少2-24個核苷酸，其中(i)，相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸37-48及53-64中之一或多者且視情況一或多個核苷酸37-64經取代；且(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65；或(b)縮短之髮夾1區域，其中該縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸，其中(i)相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸82-86及91-95中之一或多者且視情況一或多個位置82-96經取代；且(ii)核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96；或(c)縮短之髮夾2區域，其中該縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸，其中(i)相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸113-121及126-134中之一或多者且視情況一或多個核苷酸113-134經取代；且(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135；其中相對於SEQ ID NO: 900，視情況缺失一或兩個核苷酸144-145；其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
實施例185係如實施例1-184中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該指導RNA包含至少一種修飾。
實施例186係如實施例185之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該修飾包含選自以下之經修飾之核苷酸：2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵聯或反向無鹼基修飾之核苷酸。
實施例187係如實施例1-186中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該gRNA包含5’末端修飾、該重複/反重複區域中之修飾、該髮夾1區域中之修飾、該髮夾2區域中之修飾或3’末端修飾。
實施例188係如實施例187之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該5’末端修飾包含至少一個PS鍵聯，且其中存在以下情形中之一或多者：i.存在一個PS鍵聯，且該鍵聯在第一個核苷酸與第二個核苷酸之間；ii.前三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯；iii.前四個核苷酸中之任一或多者之間存在PS鍵聯；及iv前五個核苷酸中之任一或多者之間存在PS鍵聯。
實施例189係如實施例187或188之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該5’末端修飾進一步包含至少一個經2’-OMe、2’-O-moe、反向無鹼基或2’-F修飾之核苷酸。
實施例190係如實施例187-189中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該5’末端修飾包含：i.前1-4個核苷酸中一或多者之修飾，其中該修飾係PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2’-OMe、2’-O-moe或2’-F；ii.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對第一個核苷酸之修飾，及視情況存在的一或兩個與3’尾之下一核苷酸或第一個核苷酸之PS鍵聯；iii.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對第一個或第二個核苷酸之修飾，及視情況一或多個PS鍵聯；iv.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對第一個、第二個或第三個核苷酸之修飾，及視情況一或多個PS鍵聯；v.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對第一個、第二個、第三個或第四個核苷酸之修飾，及視情況一或多個PS鍵聯。
實施例191係如實施例187-180中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該3’末端修飾包含至少一個PS鍵聯，且其中存在以下情形中之一或多者：i.存在一個PS鍵聯，且該鍵聯在最後一個核苷酸與第二至最後一個核苷酸之間；ii.後三個核苷酸之間存在兩個PS鍵聯；及iii.後四個核苷酸中之任一或多者之間存在PS鍵聯。
實施例192係如191之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該3’末端修飾進一步包含至少一個經2’-OMe、2’-O-moe、反向無鹼基或2’-F修飾之核苷酸。
實施例193係如192之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該3’末端修飾包含：i.後1-4個核苷酸中一或多者之修飾，其中該修飾係PS鍵聯、反向無鹼基核苷酸、2’-OMe、2’-O-moe或2’-F；ii.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對最後一個核苷酸之修飾，及視情況存在的一或兩個與3’尾之下一核苷酸或第一個核苷酸之PS鍵聯；iii.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對最後一個或第二個至最後一個核苷酸之修飾，及視情況一或多個PS鍵聯；iv.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對最後一個、第二個至最後一個或第三個至最後一個核苷酸之修飾，及視情況一或多個PS鍵聯；v.用2’-OMe、2’-O-moe或2’-F對最後一個、第二個至最後一個或第四個至最後一個核苷酸之修飾，及視情況一或多個PS鍵聯。
實施例194係如193之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其進一步包含含有經2’-O-Me修飾之核苷酸之3’尾。
實施例195係如實施例1-194中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該指導RNA包含5’末端修飾或3’末端修飾。
實施例196係如實施例1-195中任一項之方法或組成物，其中該指導RNA包含：
指導序列，其中該指導序列包含：在前4個核苷酸1-4處經2'-O-Me修飾之核苷酸；核苷酸1-2、2-3及3-4之間之PS鍵聯；以及在該指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處經2'-O-Me修飾之核苷酸；縮短之重複/反重複區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63，包含：在核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處經2'-O-Me修飾之核苷酸；縮短之髮夾1區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，包含：在核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處經2'-O-Me修飾之核苷酸；在該縮短之髮夾1區域與該縮短之髮夾2區域之間之核苷酸101處經2'-O-Me修飾之核苷酸；縮短之髮夾2區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135，包含：在核苷酸104、110、111、122-125、142及143處經2'-O-Me修飾之核苷酸，核苷酸141-142及142-143之間之PS鍵聯，其中相對於SEQ ID NO: 900，視情況缺失一或兩個核苷酸144-145。
實施例197係如實施例1-196中任一項之方法或組成物，其中該指導RNA包含SEQ ID NO: 904-909、911、995-997及1081-1089中任一者之經修飾核苷酸。
實施例198係如實施例1-197中任一項之方法或組成物，其中該指導RNA包含SEQ ID NO: 995之經修飾核苷酸。
實施例199係如實施例1-198中任一項之方法或組成物，其中該指導RNA包含SEQ ID NO: 1083之經修飾核苷酸。
實施例200係如實施例1-199中任一項之方法或組成物，其中指導RNA係根據SEQ ID NO: 904-909、911及995-997中任一者之模式來修飾，其中該模式中之每一N係任何天然或非天然核苷酸，其中該等N共同係表1-5之任一指導序列。
實施例201係如實施例1-200中任一項之方法或組成物，其中指導RNA係根據SEQ ID NO: 995之模式來修飾，其中該模式中之每一N係任何天然或非天然核苷酸，其中該等N共同係表1-5之任一指導序列。
實施例202係一種向有需要之個體投與如實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物的方法。
實施例203係一種向個體投與如實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體或醫藥組成物作為過繼性細胞轉移(ACT)療法的方法。
實施例204係一種治療疾病或病症之方法，其包括向有需要之個體投與如請實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體或醫藥組成物的方法。
實施例205係如實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於作為過繼性細胞轉移(ACT)療法向個體投與。
實施例206係如實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於治療患有癌症之個體。
實施例207係如實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於治療患有感染性疾病之個體。
實施例208係如實施例1-10、18-28、42-55、64-75、84-92及97-195中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於治療患有自體免疫疾病之個體。
I. 定義
除非另外陳述，否則如本文所用之以下術語及片語意欲具有以下含義：
如本文所用之術語「或其組合」係指該術語之前所列術語之所有排列及組合。舉例而言，「A、B、C或其組合」意欲包括以下中之至少一者：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，且若順序在特定背景下重要，則亦包括BA、CA、CB、ACB、CBA、BCA、BAC或CAB。繼續該實例，明確包括含有一或多個項目或術語之重複之組合，諸如BB、AAA、AAB、BBC、CBBA、CABA等。除非自上下文顯而易見，否則熟習此項技術者將理解，通常對任何組合中之項目或術語之數目無限制。
如本文所用，術語「套組」係指一組包裝之有關組分，諸如一或多種多核苷酸或組成物及一或多種有關材料，諸如遞送裝置(例如，注射器)、溶劑、溶液、緩衝液、說明書或乾燥劑。
如本文所用，「同種異體」細胞係指源自與接受者個體相同之物種的供體個體之細胞，其中供體個體及接受者個體具有遺傳相異性，例如，在一或多個基因座處不相同之基因。因此，例如，細胞對於欲投與該細胞之個體而言係同種異體的。如本文所用，自供體中移出或分離的、將不會重新引入原始供體中之細胞視為同種異體細胞。
如本文所用，「自體」細胞係指源自相同個體之細胞，隨後將該材料重新引入該個體。因此，例如，若將細胞自個體中移出且接著將其重新引入同一個體中，則將該細胞視為自體的。
如本文所用，「
CIITA」或「CIITA」或「C2TA」係指「II類主要組織相容性複合物反式活化因子」之核酸序列或蛋白序列；人類基因具有登錄號NC_000016.10 (範圍10866208..10941562)，參考GRCh38.p13。細胞核中之CIITA蛋白充當MHC II類基因轉錄之正調控物且係MHC II類蛋白表現所需。
如本文所用，「MHC」或「一或多種MHC分子」或「MHC蛋白」或「一或多種MHC複合物」係指主要組織相容性複合物分子(或複數)，且包括例如MHC I類及MHC II類分子。在人類中，MHC分子稱為「人類白血球抗原」複合物或「HLA分子」或「HLA蛋白」。術語「MHC」及「HLA」之使用並不意欲限制；如本文所用，術語「MHC」可用於指代人類MHC分子，亦即HLA分子。因此，術語「MHC」及「HLA」在本文中可互換使用。
本文在HLA-A蛋白之背景下使用之術語「HLA-A」係指MHC I類蛋白分子，其係由重鏈(由HLA-A基因編碼)及輕鏈(亦即，β-2微球蛋白)組成之異二聚體。如本文在核酸之背景下使用之術語「HLA-A」或「HLA-A基因」係指編碼HLA-A蛋白分子重鏈之基因。HLA-A基因亦稱為「HLA I類組織相容性，A α鏈」；人類基因具有登錄號NC_000006.12 (29942532..29945870)。已知HLA-A基因在群體中有數千種不同的型式(亦稱為「對偶基因」) (且個體可能會得到HLA-A基因之兩種不同的對偶基因)。可在IPD-IMGT/HLA: https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/處訪問HLA-A對偶基因之公共資料庫，包括序列資訊。HLA-A之所有對偶基因皆由術語「HLA-A」及「HLA-A基因」涵蓋。
如本文在核酸之背景下使用之「HLA-B」係指編碼HLA-B蛋白分子重鏈之基因。HLA-B基因亦稱為「HLA I類組織相容性，B α鏈」；人類基因具有登錄號NC_000006.12 (31353875..31357179)。
如本文在核酸之背景下使用之「HLA-C」係指編碼HLA-C蛋白分子重鏈之基因。HLA-C基因亦稱為「HLA I類組織相容性，C α鏈」；人類基因具有登錄號NC_000006.12 (31268749..31272092)。
如本文在TRAC蛋白之背景下使用之術語「TRAC」係指T細胞受體α鏈。如本文在核酸之背景下使用之「TRAC」係指編碼T細胞受體α鏈之基因。人類野生型TRAC序列可在以下處獲得：NCBI Gene ID: 28755；Ensembl: ENSG00000277734。T細胞受體α恆定區、TCRA、IMD7、TRCA及TRA係TRAC之基因同義詞。
術語「TRBC」(或「TRBC1/2」)用於指代「T細胞受體β鏈」之核酸序列或胺基酸序列，例如TRBC1及TRBC2。如本文在TRBC蛋白之背景下使用之術語「TRBC1」及「TRBC2」係指包含T細胞受體β鏈之兩種同源蛋白。如本文在核酸之背景下使用之「TRBC1」及「TRBC2」係指編碼T細胞受體β鏈之基因。人類野生型TRBC1序列可在以下處獲得：NCBI Gene ID: 28639；Ensembl: ENSG00000211751。T細胞受體β恆定區、V_segment轉譯產物、BV05S1J2.2、TCRBC1及TCRB係TRBC1之基因同義詞。人類野生型TRBC2序列可在以下處獲得：NCBI Gene ID: 28638；Ensembl: ENSG00000211772。T細胞受體β恆定區、V_segment轉譯產物及TCRBC2係TRBC2之基因同義詞。
如本文所用，術語「AAVS1」係指根據hg38在chr19:50900000-58617616處之基因體位置。
如本文所用，術語「在基因體坐標內」包括給定基因體坐標範圍之邊界。舉例而言，若給出chr6:29942854- chr6:29942913，則涵蓋坐標chr6:29942854- chr6:29942913。在本申請案通篇，所參考之基因體坐標基於來自基因體參考聯盟(Genome Reference Consortium)之人類基因體GRCh38 (亦稱為hg38)組裝體中的基因體注釋，可在國家生物技術資訊中心網站處獲得。用於在一種組裝體與另一組裝體之間轉換基因體坐標之工具及方法係此項技術中已知的，且可用於將本文所提供之基因體坐標轉換為人類基因體之另一組裝體中之對應坐標，包括轉換為由相同機構或使用相同算法生成的更早組裝體(例如，自GRCh38至GRCh37)，以及由不同機構或算法生成的組裝體之轉換(例如，自GRCh38至NCBI33，由國際人類基因體定序聯盟(International Human Genome Sequencing Consortium)生成)。此項技術中已知之可用方法及工具包括但不限於NCBI Genome Remapping Service，可在國家生物技術資訊中心網站獲得；UCSC LiftOver，可在UCSC Genome Brower網站獲得；以及Assembly Converter，可在Ensembl.org網站獲得。
如本文所用，術語「同型接合」係指具有特定基因之兩個相同對偶基因。
如本文所用，術語「個體」意欲包括可在其中誘發免疫反應之活生物體，包括例如哺乳動物、靈長類動物、人類。
「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於指包含核苷或核苷類似物之多聚體化合物，其具有沿主鏈連接在一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物，包括習知RNA、DNA、混合RNA-DNA及作為其類似物之聚合物。核酸「主鏈」可由多種鍵聯組成，包括以下中之一或多者：糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如2’甲氧基或2’鹵化物取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習知鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如，經修飾之尿苷，諸如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷等)；肌苷；嘌呤或嘧啶之衍生物(例如，N
4-甲基去氧鳥苷、去氮雜-或氮雜-嘌呤、去氮雜-或氮雜-嘧啶、在5或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如，5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O
6-甲基鳥嘌呤、4-硫代嘧啶、4-胺基嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O
4-烷基嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。關於一般論述，參見The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams等人編,第11版, 1992)。核酸可包括一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈不包括針對聚合物之一或多個位置之含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包含習知RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包括習知組分及取代二者(例如，具有2’甲氧基鍵聯之習知鹼基，或含有習知鹼基及一或多種鹼基類似物二者之聚合物)。核酸包括「鎖核酸」(LNA)，一種含有一或多個LNA核苷酸單體之類似物，該一或多個LNA核苷酸單體具有鎖定於模擬RNA之糖構形中之二環呋喃糖單元，其增強對互補RNA及DNA序列之雜交親和力(Vester及Wengel, 2004,
Biochemistry43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分，且可因RNA中尿嘧啶或其類似物之存在及DNA中胸腺嘧啶或其類似物之存在而不同。
「指導RNA」、「gRNA」及簡稱「指導」在本文中可互換使用，係指例如將RNA指導之DNA結合劑引導至靶DNA之指導，且可為單指導RNA或crRNA與trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。例示性gRNA包括經修飾或未經修飾形式之II類Cas核酸酶指導RNA。crRNA與trRNA可締合為單一RNA分子(單指導RNA，sgRNA)，或在兩個分開RNA股(雙指導RNA，dgRNA)中。「指導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然存在之序列，或與天然存在之序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。
如本文所用，「指導序列」係指指導RNA內之序列，該序列與靶序列互補且起到藉由RNA指導DNA結合劑將指導RNA引導至靶序列以進行結合或修飾(例如，裂解)之作用。「指導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔序列」。指導序列之長度可為19、20、21、22、23或24或25個核苷酸，例如，在腦膜炎奈瑟氏球菌之情況下。在一些實施例中，Nme Cas9指導序列包含選自SEQ ID NO: 2-80、101-120、201、265、301、302、304-576或601-774之序列之至少22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，靶序列例如在基因中或在染色體上，且與指導序列互補。在一些實施例中，指導序列與其對應靶序列之間的互補性或一致性程度係至少80%、85%、90%或95%。舉例而言，在一些實施例中，指導序列包含選自SEQ ID NO: 2-80、101-120、201、265、301、302、304-576或601-774之序列之24個鄰接核苷酸序列。在一些實施例中，指導序列與靶區域可為100%互補或一致的。在其他實施例中，指導序列與靶區域可含有至少一個失配，亦即不一致或不互補之一個核苷酸，端視參考序列而定。舉例而言，指導序列及靶序列可含有1-2個、較佳不超過1個失配，其中靶序列之總長度係19、20、21、22、23或24或更多個核苷酸。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1-2個失配，其中指導序列包含至少24個核苷酸或更多個。在一些實施例中，指導序列及靶區域可含有1-2個失配，其中指導序列包含24個核苷酸。亦即，指導序列與靶區域可形成具有鹼基對或更多個之雙鏈體區域。在某些實施例中，雙鏈體區域可包括1-2個失配，使得指導股與靶序列不完全互補。失配位置在此項技術中係已知的，如例如以下中所提供：PAM遠端失配往往比PAM近端匹配更好耐受。其他位置之失配容差在此項技術中係已知的(參見例如Edraki等人, 2019. Mol. Cell, 73:1-13)。
RNA指導之DNA結合劑之靶序列包括基因體DNA之正股及負股(亦即給定序列及該序列之反向互補序列)，乃因RNA指導之DNA結合劑之核酸受質係雙股核酸。因此，當將指導序列稱為「與靶序列互補」時，應理解指導序列可引導指導RNA結合至靶序列之反向互補序列。因此，在一些實施例中，在指導序列結合靶序列之反向互補序列的情況下，除了在指導序列中用U取代T以外，指導序列與靶序列(例如，不包括PAM之靶序列)之某些核苷酸一致。
如本文所用，「RNA指導之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物，或該複合物之DNA結合次單元，其中DNA結合活性係序列特異性的且端視PAM之存在及指導RNA之序列而定。例示性RNA指導之DNA結合劑包括Cas裂解酶/切口酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。「Cas核酸酶」亦稱為「Cas蛋白」，涵蓋Cas裂解酶、Cas切口酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切口酶及dCas DNA結合劑包括III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2次單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3次單元及2類Cas核酸酶。
如本文所用，「2類Cas核酸酶」係具有RNA指導之DNA結合活性之單鏈多肽。2類Cas核酸酶包括2類Cas裂解酶/切口酶(例如，Spy Cas9之H840A、D10A或N863A變異體，以及Nme Cas9 (例如，Nme2 Cas9)之D16A及H588A)，其進一步具有RNA指導之DNA裂解酶或切口酶活性；以及2類dCas DNA結合劑，其中裂解酶/切口酶活性係不活化的。2類Cas核酸酶包括例如Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9(例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白，Zetsche等人,
Cell, 163: 1-13 (2015)與Cas9同源，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列以引用方式全部併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。參見，例如Makarova等人,
Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人,
Molecular Cell,60:385-397 (2015)。
已自腦膜炎奈瑟氏球菌獲得若干Cas9異種同源物(Esvelt等人, NAT. METHODS,第10卷, 2013, 1116 - 1121；Hou等人, PNAS,第110卷, 2013,第15644 - 15649頁) (Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9)。Nme2Cas9異種同源物在哺乳動物細胞中高效地發揮作用，識別N4CC PAM，且可用於與同源gRNA之體內編輯(Ran等人, NATURE,第520卷, 2015,第186 - 191頁；Kim等人, NAT. COMMUN.,第8卷, 2017,第14500頁)。Nme2Cas9可為特異性及選擇性的，例如能夠進行低脫靶編輯(Lee等人，MOL. THER.,第24卷, 2016,第645 - 654頁；Kim等人, 2017)。亦參見例如WO/2020081568 (例如，第28及42頁)，其闡述Nme2Cas9 D16A切口酶，該文獻之內容特此以全文引用之方式併入。在全文中，「NmeCas9」或「Nme Cas9」係通用的，且涵蓋任何類型之NmeCas9，包括Nme1Cas9、Nme2Cas9及Nme3Cas9。
Cas9分子之例示性核苷酸及多肽序列提供於表7中。用於鑑別編碼Cas9多肽序列之替代核苷酸序列(包括替代的天然存在之變異體)的方法係此項技術中已知的。亦考慮與Cas9核酸序列或編碼本文所提供之胺基酸序列的核酸序列中之任一者具有至少75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的序列。
如本文所用，術語「編輯子」係指包含能夠在DNA序列內進行修飾之多肽的因子。在一些實施例中，編輯子係裂解酶，諸如Cas9裂解酶。在一些實施例中，編輯子能夠使DNA分子內的鹼基去胺，且其可稱為鹼基編輯子。在一些實施例中，編輯子能夠使DNA中之胞嘧啶(C)去胺。在一些實施例中，編輯子係融合蛋白，其包含融合至胞苷去胺酶的RNA指導之切口酶。在一些實施例中，編輯子為融合蛋白，其包含融合至APOBEC3A去胺酶(A3A)的RNA指導之切口酶。在一些實施例中，編輯子包含融合至APOBEC3A去胺酶(A3A)之Cas9切口酶。在一些實施例中，編輯子為融合蛋白，其包含融合至胞苷去胺酶及UGI的RNA指導之切口酶。在一些實施例中，編輯子缺少UGI。
如本文所用，「胞苷去胺酶」意指能夠具有胞苷去胺酶活性之多肽或多肽複合物，其催化胞苷或去氧胞苷之水解去胺，通常產生尿苷或去氧尿苷。胞苷去胺酶涵蓋胞苷去胺酶超家族中之酶，且特別是APOBEC家族之酶(APOBEC1、APOBEC2、APOBEC4及APOBEC3酶亞組)、活化誘導之胞苷去胺酶(AID或AICDA)及CMP去胺酶(參見，例如Conticello等人, Mol. Biol. Evol. 22:367-77, 2005；Conticello, Genome Biol. 9:229, 2008；Muramatsu等人, J. Biol. Chem. 274: 18470-6, 1999)；Carrington等人, Cells 9:1690 (2020))。在一些實施例中，涵蓋任何已知胞苷去胺酶或APOBEC蛋白之變異體。變異體包括具有與野生型蛋白相差一或若干個突變(亦即取代、缺失、插入) (諸如一或多個單點取代)之序列的蛋白。例如，可使用縮短之序列，例如藉由缺失N末端、C末端或內部胺基酸，較佳在該序列之C末端處的一至四個胺基酸。如本文所用，術語「變異體」係指與參考序列同源之對偶基因變異體、剪接變異體及天然或人工突變體。變異體為「功能性的」，乃因其顯示出DNA編輯之催化活性。
如本文所用，術語「APOBEC3A」係指胞苷去胺酶，諸如由人類A3A基因表現之蛋白。APOBEC3A具有催化DNA編輯活性。已闡述APOBEC3A之胺基酸序列(UniPROT登錄ID：p31941)且在本文中包括為SEQ ID NO: 827。在一些實施例中，APOBEC3A蛋白係人類APOBEC3A蛋白或野生型蛋白。變異體包括具有與野生型APOBEC3A蛋白相差一或若干個突變(亦即取代、缺失、插入) (諸如一或多個單點取代)之序列的蛋白。例如，可使用縮短之APOBEC3A序列，例如藉由缺失N末端、C末端或內部胺基酸，較佳在該序列之C末端處的一至四個胺基酸。如本文所用，術語「變異體」係指與APOBEC3A參考序列同源之對偶基因變異體、剪接變異體及天然或人工突變體。變異體為「功能性的」，乃因其顯示出DNA編輯之催化活性。在一些實施例中，APOBEC3A (諸如人類APOBEC3A)具有野生型胺基酸位置57 (如野生型序列中所編號)。在一些實施例中，APOBEC3A (諸如人類APOBEC3A)在胺基酸位置57 (如野生型序列中所編號)處具有天冬醯胺酸。
如本文所用，「切口酶」係在雙股DNA中產生單股斷裂(亦稱為「切口」)，亦即切割DNA雙螺旋之一股但不切割另一股之酶。如本文所用，「RNA指導之DNA切口酶」意指具有DNA切口酶活性之多肽或多肽複合物，其中DNA切口酶活性係序列特異性的且端視RNA之序列而定。例示性RNA指導之DNA切口酶包括Cas切口酶。2類Cas切口酶包括HNH或RuvC催化結構域不活化之多肽，例如Cas9 (例如，SpyCas9之H840A、D10A或N863A變異體或NmeCas9之D16A變異體)。腦膜炎奈瑟氏球菌之HNH或HNH樣核酸酶結構域或RuvC或RuvC樣結構域中之例示性胺基酸取代包括Nme2Cas9 D16A (HNH切口酶)及Nme2Cas9 H588A (RuvC切口酶)。Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如，N497A、R661A、Q695A、Q926A變異體)、HypaCas9 (例如，N692A、M694A、Q695A、H698A變異體)、eSPCas9(1.0) (例如，K810A、K1003A、R1060A變異體)及eSPCas9(1.1) (例如，K848A、K1003A、R1060A變異體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白，Zetsche等人, Cell, 163: 1-13 (2015)與Cas9同源，且含有RuvC樣蛋白結構域。Zetsche之Cpf1序列以引用方式全部併入。參見例如Zetsche，表S1及S3。「Cas9」涵蓋釀膿鏈球菌(Spy) Cas9、本文所列Cas9之變異體及其等同物。參見，例如Makarova等人, Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人, Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文所用，術語「融合蛋白」係指包含來自至少兩種不同蛋白之蛋白結構域之雜合多肽。一種蛋白可位於融合蛋白之胺基末端(N末端)部分或羧基端(C末端)蛋白處，由此分別形成「胺基末端融合蛋白」或「羧基末端融合蛋白」。本文所提供之任何蛋白皆可藉由此項技術中已知之任何方法產生。舉例而言，本文所提供之蛋白可經由重組蛋白表現及純化產生，此尤其適於包含肽連接體之融合蛋白。重組蛋白之表現及純化方法係熟知的，且包括Green及Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))中所述之彼等方法，該文獻之全部內容以引用方式併入本文。
如本文所用，術語「連接體」係指連接兩個毗鄰分子或部分之化學基團或分子。通常，連接體位於兩個基團、分子或其他部分之間或兩側，且經由共價鍵彼此相連。在一些實施例中，連接體係一個胺基酸或複數個胺基酸(例如，肽或蛋白)，諸如16個胺基酸殘基之「XTEN」連接體或其變異體(參見，例如實例；及Schellenberger等人A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接體包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 930)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 931)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 932)。在一些實施例中，連接體係包含一或多個選自SEQ ID NO: 933-994之序列之肽連接體。
如本文所用，術語「尿嘧啶糖基化酶抑制劑」或「UGI」係指能夠抑制尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)鹼基切除修復酶之蛋白。
如本文所用，基因之「開放閱讀框」或「ORF」係指由一系列密碼子組成之序列，該等密碼子指定基因編碼之蛋白之胺基酸序列。ORF以起始密碼子(例如，DNA中之ATG，或RNA中之AUG)開始且以終止密碼子(例如，DNA中之TAA、TAG或TGA，或RNA中之UAA、UAG或UGA)結束。
如本文所用，「核糖核蛋白」(RNP)或「RNP複合物」係指指導RNA連同RNA指導之DNA結合劑，諸如Cas核酸酶，例如，Cas裂解酶、Cas切口酶或dCas DNA結合劑(例如，Cas9)。在一些實施例中，指導RNA將RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas9)指導至靶序列，且指導RNA與靶序列雜交且該劑結合至該靶序列；在劑係裂解酶或切口酶之情況下，結合後可進行裂解或切口。
如本文所用，若第一序列與第二序列之比對顯示整個第二序列之X%或更多位置與第一序列匹配，則認為第一序列「包含與第二序列具有至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包含與序列AAG具有100%一致性之序列，此乃因由於與第二序列之所有三個位置皆存在匹配，因此比對將給出100%一致性。RNA與DNA之間之差異(通常係尿苷交換為胸苷，或反之亦然)及核苷類似物(諸如經修飾之尿苷)之存在不導致多核苷酸之間之一致性或互補性差異，只要相關核苷酸(諸如胸苷、尿苷或經修飾之尿苷)具有相同互補序列(例如，對於胸苷、尿苷或經修飾之尿苷全部，為腺苷；另一個實例係胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，二者皆具有鳥苷或經修飾之鳥苷作為互補序列)。因此，例如，認為序列5’-AXG (其中X係任何經修飾之尿苷，諸如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)與AUG 100%一致，原因在於二者與同一序列(5’-CAU)完全互補。例示性比對演算法係在此項技術中眾所周知的Smith-Waterman及Needleman-Wunsch演算法。熟習此項技術者將理解選擇哪一種演算法及參數設置適於欲比對之給定序列對；對於具有大體上類似長度且預期胺基酸一致性＞50%或核苷酸一致性＞75%的序列，EBI在www.ebi.ac.uk網路伺服器上提供之Needleman-Wunsch演算法介面之帶有默認設置之Needleman-Wunsch演算法通常係適當的。
「信使RNA」或「mRNA」在本文中用於指代多核苷酸且包含可轉譯成多肽(亦即，可用作藉由核糖體及胺基醯化tRNA進行轉譯之受質)之開放閱讀框。mRNA可包含如下文所提供之一或多種修飾。
如本文所用，「遺傳修飾」係DNA水準之變化，例如由CRISPR/Cas9 gRNA及Cas9系統誘導。遺傳修飾可包含插入、缺失或取代(亦即，鹼序列取代，亦即突變)，通常在所界定之序列或基因體基因座內。遺傳修飾改變DNA之核酸序列。遺傳修飾可在單一核苷酸位置處。遺傳修飾可在多個核苷酸處，例如2、3、4、5或更多個核苷酸，通常彼此非常接近，例如鄰接核苷酸。遺傳修飾可在編碼序列(例如外顯子序列)中。遺傳修飾可在剪接位點處，亦即足夠靠近剪接受體位點或剪接供體位點以破壞剪接。遺傳修飾可包括插入並非基因體基因座內源之核苷酸序列，例如插入異源開放閱讀框或基因之編碼序列。如本文所用，遺傳修飾可用於阻止在基因體基因座之遺傳修飾之前具有內源性全長蛋白之胺基酸序列的全長蛋白之轉譯。阻止內源性全長蛋白或基因產物之轉譯包括阻止任何長度之蛋白或基因產物之轉譯。可阻止內源性全長蛋白之轉譯，例如，藉由導致過早終止密碼子之生成的框移突變或藉由無意義突變之生成。可藉由破壞剪接來阻止內源性全長蛋白之轉譯。可藉由插入異源編碼序列來阻止內源性全長蛋白之轉譯。例如，當內源性全長蛋白含有不合意突變時，可藉由在一或多個位置處做出改變來改變內源性全長蛋白編碼序列以提供與細胞中存在之內源序列不同的經修飾全長編碼序列(例如點突變之校正)來阻止內源性全長蛋白之轉譯。可藉由改變內源性全長蛋白之剪接以藉由選擇性剪接產生不同蛋白來阻止內源性全長蛋白之轉譯。
如本文所用，「插入/缺失」係指由諸多核苷酸組成之插入或缺失突變，該等核苷酸例如在靶核酸中之雙股斷裂(DSB)位點處插入、缺失或缺失及插入。如本文所用，當插入/缺失形成導致插入時，插入係在DSB位點處之隨機插入且可或可不由模板序列引導或基於模板序列。
如本文所用，「異源編碼序列」係指已作為外源來源引入細胞內之編碼序列(例如，插入基因體基因座(諸如安全港基因座，包括TCR基因座)處)。亦即，所引入之編碼序列至少就其插入位點而言係異源的。自該異源編碼序列基因表現之多肽稱為「異源多肽」。異源編碼序列可為天然存在的或經工程改造的，且可為野生型或變異體。異源編碼序列可包括不同於編碼異源多肽之序列之核苷酸序列(例如，內部核糖體進入位點)。異源編碼序列可為作為野生型或變異體(例如，突變體)在基因體中天然存在之編碼序列。舉例而言，儘管細胞含有所關注之編碼序列(作為野生型或作為變異體)，但相同編碼序列或其變異體可作為外源來源引入，用於例如在高度表現之基因座處表現。異源編碼序列亦可為非天然存在於基因體中之編碼序列，或表現非天然存在於基因體中之異源多肽的編碼序列。「異源編碼序列」、「外源編碼序列」及「轉殖基因」可互換使用。在一些實施例中，異源編碼序列或轉殖基因包括外源核酸序列，例如，核酸序列對於接受者細胞而言不是內源的。在一些實施例中，異源編碼序列或轉殖基因包括外源核酸序列，例如，非天然存在於接受者細胞中之核酸序列。舉例而言，異源編碼序列相對於其插入位點且相對於其接受者細胞可為異源的。
如本文所用，細胞上蛋白之「降低或消除」之表現係指相對於未經修飾之細胞，蛋白表現之部分或完全喪失。在一些實施例中，蛋白在細胞上之表面表現係藉由流式細胞術來量測且相對於未經修飾之細胞具有「降低」或「消除」之表面表現，如藉由在用針對該蛋白之相同抗體染色後螢光信號之減少所證明。相對於未經修飾之細胞具有藉由流式細胞術「降低」或「消除」之蛋白表面表現的細胞可稱為對該蛋白之表現為「陰性」，如藉由類似於用同型對照抗體染色之細胞之螢光信號所證明。可藉由此項技術之其他已知技術與熟習此項技術者已知之適當對照來量測蛋白表現之「降低」或「消除」。
如本文所用，「敲低」係指例如與未經編輯之靶序列之表現相比，特定基因產物(例如蛋白、mRNA或二者)表現之降低。可藉由偵測來自樣品(諸如所關注之組織、流體或細胞群體)之蛋白之總細胞量來量測蛋白之敲低。其亦可藉由量測用於蛋白之替代物、標記物或活性來量測。用於量測mRNA敲低之方法係已知的，且包括分析自所關注樣品分離之mRNA。在一些實施例中，「敲低」可指特定基因產物表現之一些損失，例如mRNA轉錄量之減少或由細胞或細胞群體(包括體內群體，諸如在組織中發現之群體)所表現之蛋白量的減少。
如本文所用，「敲除」係指細胞中特定基因或特定蛋白表現之喪失。敲除可導致低於分析之偵測水準之表現降低。可藉由偵測細胞、組織或細胞群體中蛋白之細胞總量來量測敲除。
如本文所用，「靶序列」或「基因體靶序列」係指靶基因中與gRNA之指導序列具有互補性之核酸序列。靶序列與指導序列之相互作用指導RNA指導之DNA結合劑以便在靶序列內結合，且可能在靶序列內產生切口或裂解(端視劑之活性而定)。
如本文所用，「治療」係指對個體之疾病或病症之任何投與或施加治療劑，且包括抑制疾病、阻止其發展、緩解疾病之一或多種症狀、治癒疾病或預防疾病之一或多種症狀，包括症狀之復發。
現在將詳細參考本發明之某些實施例，其實例在附圖中圖解說明。儘管結合所示實施例闡述了本發明，但應當理解，其並不意欲將本發明限制於彼等實施例。相反，本發明意欲涵蓋可包括在如隨附申請專利範圍及所包括之實施例所界定的本發明內之所有替代、修改及等同物。
在詳細闡述本教示之前，應理解本揭示案不限於特定組成物或過程步驟，乃因其可變化。應注意，除非上下文另有明確說明，否則如在本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，單數形式「一(a/an)」及「該(the)」包括複數個指示物。因此，舉例而言，提及「一種偶聯物」包括複數種偶聯物且提及「一個細胞」包括複數個細胞及諸如此類。
數值範圍包括定義範圍之數字。慮及有效數字及與量測相關之誤差，將量測值及可量測值理解為近似值。此外，「包含(comprise)」、「包含(comprises)」、「包含(comprising)」、「含有(contain)」、「含有(contains)」、「含有(containing)」、「包括(include)」、「包括(includes)」及「包括(including)」之使用不意欲具有限制性。應理解，前述一般描述及詳細描述二者皆僅係例示性及解釋性的，且並不限制教示。
除非在說明書中特別註明，否則說明書中列舉「包含」各種組分之實施例亦視為「由所列舉組分組成」或「基本上由所列舉組分組成」；說明書中列舉「由各種組分組成」之實施例亦視為「包含」所列舉組分或「基本上由所列舉組分組成」；且說明書中列舉「基本上由各種組分組成」之實施例亦視為「由所列舉組分組成」或「包含」所列舉組分(該互換性不適用於該等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另有明確說明，否則術語「或」係在包含性之意義上使用，亦即等同於「及/或」。
本文所用之部分標題僅出於組織目的，而不應視為以任何方式限制期望標的物。倘若以引用方式併入之任何材料與本說明書中定義之任何術語或本說明書之任何其他明確內容相矛盾，則以本說明書為準。雖然結合各種實施例闡述了本教示，但並不意欲將本教示限制於該等實施例。相反，本教示涵蓋各種替代、修改及等同物，如熟習此項技術者將瞭解。
II. 經遺傳修飾之細胞 A. 經工程改造之細胞組成物
本揭示案提供經工程改造之細胞組成物，其相對於如本文所揭示之未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A、HLA-B、TRAC、TRBC及/或MHC II類之表面表現。在一些實施例中，經工程改造之細胞組成物包含HLA-A、HLA-B、TRAC、TRBC及/或CIITA基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之細胞組成物包含HLA-A、HLA-B及CIITA基因中每一者中之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，具有降低之HLA-A、HLA-B、TRAC、TRBC及/或MHC II類表現的經工程改造之細胞可用於過繼性細胞轉移療法。在一些實施例中，經工程改造之細胞在細胞之基因體中包含額外遺傳修飾，以產生期望用於同種異體移植目的之細胞。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；及chr6:29944470-29944494或(b) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至HLA-A基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的HLA-A之表面表現，該HLA-A基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494或(b) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至HLA-A基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的HLA-A之表面表現，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至HLA-A基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的HLA-A之表面表現，該HLA-A基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494或(b) chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。在一些實施例中，HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自基因體坐標chr14:22547462-22551621內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自基因體坐標chr14:22547505-22551621內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr14:22547462-22551621內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568及chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRAC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRAC之表面表現，該TRAC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568及chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRAC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRAC之表面表現，該TRAC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRAC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRAC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRAC之表面表現，該TRAC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568及chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，TRAC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRAC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142791756- 142802543。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721；或(c) chr7:142801104-142802543。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721；或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721；或(c) chr7:142801104-142802543。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRBC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRBC之表面表現，該TRBC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRBC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRBC之表面表現，該TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRBC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRBC之表面表現，該TRBC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRBC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRBC之表面表現，該TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRBC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRBC之表面表現，該TRBC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。在一些實施例中，TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至TRBC基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的TRBC之表面表現，該TRBC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。在一些實施例中，TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRBC基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因座中之遺傳修飾，其中該修飾包含以下基因體坐標之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標之至少一個核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；及chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913；及chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標之至少一個核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913；或chr16:10907504-10907528。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913；或chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913；或chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913；或chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913；或chr16:10907504-10907528。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的MHC II類之表面表現，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913或chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的MHC II類之表面表現，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的MHC II類之表面表現，該CIITA基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的MHC II類之表面表現，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913或chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統降低或消除的MHC II類之表面表現，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。在一些實施例中，CIITA基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，CIITA基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含來自基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，經工程改造之細胞包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。在一些實施例中，經工程改造之細胞包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其包含AAVS1基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少6、7、8、9或10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有AAVS1中之遺傳修飾，該遺傳修飾由結合至AAVS1基因體靶序列之基因體編輯系統誘導，該AAVS1基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有AAVS1中之遺傳修飾，該遺傳修飾由結合至AAVS1基因體靶序列之基因體編輯系統誘導，該AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。
在一些實施例中，提供經工程改造之細胞，其具有AAVS1中之遺傳修飾，該遺傳修飾由結合至AAVS1基因體靶序列之基因體編輯系統誘導，該AAVS1基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030。在一些實施例中，AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標內之至少15個鄰接核苷酸。在一些實施例中，基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas9蛋白，諸如腦膜炎奈瑟氏球菌。
在一些實施例中，對於每一給定的基因體坐標範圍，範圍可涵蓋在指定坐標之任一端之+/-10個核苷酸。對於每一給定的基因體坐標範圍，該範圍可涵蓋該範圍之任一端之+/-5個核苷酸。舉例而言，若給出chr16:10923222-10923242，則在一些實施例中，基因體靶序列或遺傳修飾可落入chr16:10923212-10923252內。
在一些實施例中，給定的基因體坐標範圍可包含兩條DNA股(即，正(+)股及負(-)股)上之靶序列。
本文進一步闡述HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA及AAVS1基因中之遺傳修飾。
在一些實施例中，HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA或AAVS1基因座中之遺傳修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺中之任一者或多者。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRAC基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC1之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC1基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC2之表面表現的經工程改造之細胞，其包含TRBC2基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因中之遺傳修飾，其中該細胞相對於未經修飾之細胞進一步具有降低或消除之內源性TCR蛋白之表現。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因中之遺傳修飾，其中該細胞進一步包含外源核酸，且相對於未經修飾之細胞進一步具有降低或消除之內源性TCR蛋白之表現。在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因中之遺傳修飾，其中該細胞進一步具有降低或消除之MHC I類之表面表現，且其中該細胞相對於未經修飾之細胞進一步具有降低或消除之內源性TCR蛋白之表現。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因中之遺傳修飾，其中該細胞進一步包含外源核酸，且其中該細胞進一步具有降低或消除之MHC I類之表面表現，且其中該細胞相對於未經修飾之細胞進一步具有降低或消除之內源性TCR蛋白之表現。在一些實施例中，經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表現。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現的經工程改造之細胞，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該修飾包含基因體坐標chr16:10902662-chr16:10923285內之外顯子之至少一個核苷酸，且其中該細胞進一步包含外源核酸，且其中該細胞進一步具有降低或消除之HLA-A之表面表現，且其中該細胞相對於未經修飾之細胞進一步具有降低或消除之內源性TCR蛋白之表現。在一些實施例中，經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，經工程改造之細胞包含HLA-A基因中之遺傳修飾。在一些實施例中，經工程改造之細胞包含降低經工程改造之細胞表面上HLA-A蛋白表現之遺傳修飾。
經工程改造之細胞可為本文所揭示之任何例示性細胞類型。在一些實施例中，經工程改造之細胞係免疫細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係造血幹細胞(HSC)。在一些實施例中，經工程改造之細胞係誘導性多潛能幹細胞(iPSC)。在一些實施例中，經工程改造之細胞係單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突細胞或顆粒球。在一些實施例中，經工程改造之細胞係單核球。在一些實施例中，經工程改造之細胞係巨噬細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係肥大細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係樹突細胞。
在一些實施例中，經工程改造之細胞係顆粒球。在一些實施例中，經工程改造之細胞係淋巴球。在一些實施例中，經工程改造之細胞係T細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係CD4+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係CD8+ T細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係記憶T細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係B細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係血漿B細胞。在一些實施例中，經工程改造之細胞係記憶B細胞。
在一些實施例中，本揭示案提供包含本文所揭示之任一種經工程改造之細胞之醫藥組成物。在一些實施例中，醫藥組成物包含本文所揭示之任一種經工程改造之細胞之群體。在一些實施例中，細胞群體係至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或至少99.5%對表面抗原(例如，HLA-A、MHC II類(HLA-DP、DQ、DR)或內源性TCR)為陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少65%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少70%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少80%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少90%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少91%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少92%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少93%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少94%陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少95%內源性TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少97%內源性TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少98%內源性TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。在一些實施例中，經工程改造之細胞群體係至少99%內源性TCR蛋白陰性，如藉由流式細胞術所量測。
在一些實施例中，提供向有需要之個體投與本文所揭示之經工程改造之細胞或醫藥組成物的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之細胞或醫藥組成物作為ACT療法的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之細胞或醫藥組成物作為用於癌症之治療的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之細胞或醫藥組成物作為用於自體免疫疾病之治療的方法。在一些實施例中，提供向個體投與本文所揭示之經工程改造之細胞或醫藥組成物作為用於感染性疾病之治療的方法。
B. 用於降低或消除 HLA-A 、 TRAC 、 TRBC 及 MHC II 類之表面表現之方法及組成物
本揭示案提供藉由對HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因進行遺傳修飾，相對於未經修飾之細胞降低或消除細胞上HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類蛋白之表面表現的方法及組成物。所得經遺傳修飾之細胞在本文中亦可稱為經工程改造之細胞。在一些實施例中，已經遺傳修飾之(或經工程改造之)細胞可為使用本文所提供之方法或組成物進行進一步遺傳修飾之起始細胞。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，具有降低之HLA-A、TRAC、TRBC或MHC II類表現之細胞可用於過繼性細胞轉移療法。在一些實施例中，將HLA-A、TRAC、TRBC或CIITA基因之編輯與額外遺傳修飾組合，以產生期望用於同種異體移植目的之細胞。
在一些實施例中，該等方法包括降低或消除細胞之表現上HLA-A蛋白之表面表現，包括使細胞與包含HLA-A指導RNA之組成物接觸，該HLA-A指導RNA包含靶向HLA-A基因體靶序列之指導序列，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。在一些實施例中，該等方法包括製備經工程改造之細胞，該經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，該方等法包括使該細胞與包含HLA-A指導RNA之組成物接觸，該HLA-A指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對細胞進行遺傳修飾以降低或消除HLA-A蛋白之表面表現，包括使該細胞與包含HLA-A指導RNA之組成物接觸，該HLA-A指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對HLA-A進行遺傳修飾，包括使細胞與包含HLA-A指導RNA之組成物接觸，該HLA-A指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括誘導HLA-A中之DSB或單股斷裂(SSB)，包括使細胞與包含HLA-A指導RNA之組成物接觸，該HLA-A指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括降低細胞中之HLA-A蛋白之表現，包括向細胞遞送組成物，包括使細胞與包含HLA-A指導RNA之組成物接觸，該HLA-A指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上HLA-A蛋白之表現。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，降低細胞表面上HLA-A蛋白表現之方法包括使細胞與本文所揭示之任一或多種HLA-A指導RNA接觸。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，提供包含HLA-A指導RNA之組成物，該HLA-A指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該組成物進一步包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，提供一種組成物，該組成物包含：a) HLA-A指導RNA (gRNA)，其包含i)選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 2-80之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 2-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA (gRNA)係單指導RNA。
在一些實施例中，提供製備相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現的經工程改造之細胞的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，該組成物包含HLA-A指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 1、13、55、61、66、70及71。在一些實施例中，該組成物包含HLA-A指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 13、55、61、66、70及71。在一些實施例中，該組成物包含HLA-A指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 13、17、55、61、66及70。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞降低經工程改造之細胞中HLA-A蛋白之表面表現的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。
在一些實施例中，該組成物進一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對HLA-A基因體靶序列生成胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對HLA-A基因體靶序列生成腺苷(A)至鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供藉由本文所述之方法產生的經工程改造之細胞。在一些實施例中，藉由本文所述之方法及組成物產生的經工程改造之細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之HLA-A表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之HLA-A蛋白表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之HLA-A水準。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞表現HLA-A蛋白之截短形式。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞不產生可偵測之HLA-A蛋白。在一些實施例中，與未經修飾之細胞相比，經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之HLA-A表現、降低之HLA-A蛋白或降低之HLA-A水準。在一些實施例中，如在含有CD4+ T細胞之體外細胞培養分析中所量測，與未經修飾之細胞相比，藉由本文所揭示之方法產生的經工程改造之細胞誘發來自CD4+ T細胞之降低反應。
在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，該等方法包括降低或消除細胞之表現上TRAC蛋白之表面表現，包括使細胞與包含TRAC指導RNA之組成物接觸，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括製備經工程改造之細胞，該經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現，該方等法包括使該細胞與包含TRAC指導RNA之組成物接觸，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對細胞進行遺傳修飾以降低或消除TRAC蛋白之表面表現，包括使該細胞與包含TRAC指導RNA之組成物接觸，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對TRAC進行遺傳修飾，包括使細胞與包含TRAC指導RNA之組成物接觸，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括誘導TRAC中之DSB或單股斷裂(SSB)，包括使細胞與包含TRAC指導RNA之組成物接觸，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括降低細胞中之TRAC蛋白之表現，包括向細胞遞送組成物，包括使細胞與包含TRAC指導RNA之組成物接觸，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRAC蛋白之表現。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，降低細胞表面上TRAC蛋白表現之方法包括使細胞與本文所揭示之任一或多種TRAC指導RNA接觸。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，提供包含TRAC指導RNA之組成物，該TRAC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該組成物進一步包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRAC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，提供一種組成物，該組成物包含：a) TRAC指導RNA (gRNA)，其包含i)選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 101-120之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 101-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA (gRNA)係單指導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，提供製備相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現的經工程改造之細胞的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，該組成物包含TRAC指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 101、102、103、105、107、109、111及115。在一些實施例中，該組成物包含TRAC指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 101、102、103、107及111。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞降低經工程改造之細胞中TRAC蛋白之表面表現的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。
在一些實施例中，該組成物進一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對TRAC基因體靶序列生成胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對TRAC基因體靶序列生成腺苷(A)至鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供藉由本文所述之方法產生的經工程改造之細胞。在一些實施例中，藉由本文所述之方法及組成物產生的經工程改造之細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之TRAC表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之TRAC蛋白表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之TRAC水準。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞表現TRAC蛋白之截短形式。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞不產生可偵測之TRAC蛋白。在一些實施例中，與未經修飾之細胞相比，經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之TRAC表現、降低之TRAC蛋白或降低之TRAC水準。在一些實施例中，如在含有CD4+ T細胞之體外細胞培養分析中所量測，與未經修飾之細胞相比，藉由本文所揭示之方法產生的經工程改造之細胞誘發來自CD4+ T細胞之降低反應。
在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。
在一些實施例中，該等方法包括降低或消除細胞之表現上TRBC蛋白之表面表現，包括使細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自chr7:142791756- 142802543之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法包括降低或消除細胞之表現上TRBC蛋白之表面表現，包括使細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括製備經工程改造之細胞，該經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現，該方等法包括使該細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對細胞進行遺傳修飾以降低或消除TRBC蛋白之表面表現，包括使該細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對TRBC進行遺傳修飾，包括使細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括誘導TRBC中之DSB或單股斷裂(SSB)，包括使細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括降低細胞中之TRBC蛋白之表現，包括向細胞遞送組成物，包括使細胞與包含TRBC指導RNA之組成物接觸，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上TRBC蛋白之表現。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，降低細胞表面上TRBC蛋白表現之方法包括使細胞與本文所揭示之任一或多種TRBC指導RNA接觸。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，提供包含TRBC指導RNA之組成物，該TRBC指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，該組成物進一步包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，TRBC指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。
在一些實施例中，提供一種組成物，該組成物包含：a) TRBC指導RNA (gRNA)，其包含i)選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 201-265之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 201-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA係單指導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，該組成物進一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對TRBC基因體靶序列生成胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對TRBC基因體靶序列生成腺苷(A)至鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供藉由本文所述之方法產生的經工程改造之細胞。在一些實施例中，藉由本文所述之方法及組成物產生的經工程改造之細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之TRBC表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之TRBC蛋白表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之TRBC水準。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞表現TRBC蛋白之截短形式。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞不產生可偵測之TRBC蛋白。在一些實施例中，與未經修飾之細胞相比，經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之TRBC表現、降低之TRBC蛋白或降低之TRBC水準。在一些實施例中，如在含有CD4+ T細胞之體外細胞培養分析中所量測，與未經修飾之細胞相比，藉由本文所揭示之方法產生的經工程改造之細胞誘發來自CD4+ T細胞之降低反應。
在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，該經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
在一些實施例中，提供相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現的經工程改造之細胞，該經工程改造之細胞包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
在一些實施例中，提供製備相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現的經工程改造之細胞的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，該組成物包含TRBC指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 215、216、223、224、229、230、246、259及260。在一些實施例中，該組成物包含TRBC指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 215、216、224、229、246、259及260。在一些實施例中，該組成物包含TRBC指導RNA，該指導RNA包含SEQ ID NO: 215、259及260中任一者之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括降低或消除細胞之表現上MHC II類蛋白之表面表現，包括使細胞與包含CIITA指導RNA之組成物接觸，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶結構域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括製備經工程改造之細胞，該經工程改造之細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現，該方等法包括使該細胞與包含CIITA指導RNA之組成物接觸，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對細胞進行遺傳修飾以降低或消除MHC II類蛋白之表面表現，包括使該細胞與包含CIITA指導RNA之組成物接觸，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對CIITA進行遺傳修飾，包括使細胞與包含CIITA指導RNA之組成物接觸，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括誘導CIITA中之DSB或單股斷裂(SSB)，包括使細胞與包含CIITA指導RNA之組成物接觸，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括降低細胞中之CIITA蛋白之表現，包括向細胞遞送組成物，包括使細胞與包含CIITA指導RNA之組成物接觸，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，由此降低細胞(亦即，經工程改造之細胞)之表面上MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，降低細胞表面上MHC II類蛋白表現之方法包括使細胞與本文所揭示之任一或多種CIITA指導RNA接觸。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，提供包含CIITA指導RNA之組成物，該CIITA指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，該組成物進一步包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，CIITA指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，提供一種組成物，該組成物包含：a) CIITA指導RNA (gRNA)，其包含i)選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA係單指導RNA (sgRNA)。
在一些實施例中，提供製備相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現的經工程改造之細胞的方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，該組成物包含CIITA指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 301-302、320-321、324、326、327、332、354、361、372、400、415、419-420、422、428、431、432、434、451、455、458、462-464及468。在一些實施例中，該組成物包含CIITA指導RNA，該指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 301、302、320、372、414、419、422及462-463。
在一些實施例中，該組成物進一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對CIITA基因體靶序列生成胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對CIITA基因體靶序列生成腺苷(A)至鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供藉由本文所述之方法產生的經工程改造之細胞。在一些實施例中，藉由本文所述之方法及組成物產生的經工程改造之細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之MHC II類表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞具有降低之CIITA蛋白表現。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之CIITA水準。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞表現CIITA蛋白之截短形式。在一些實施例中，該等方法產生包含經工程改造之細胞之組成物，該經工程改造之細胞不產生可偵測之CIITA蛋白。在一些實施例中，與未經修飾之細胞相比，經工程改造之細胞在細胞核中具有降低之MHC II類表現、降低之CIITA蛋白或降低之CIITA水準。在一些實施例中，如在含有CD4+ T細胞之體外細胞培養分析中所量測，與未經修飾之細胞相比，藉由本文所揭示之方法產生的經工程改造之細胞誘發來自CD4+ T細胞之降低反應。
在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現，且其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，該等方法包括製備經工程改造之細胞，包括使該細胞與包含AAVS1指導RNA之組成物接觸，該AAVS1指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，AAVS1指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對細胞進行遺傳修飾，包括使該細胞與包含AAVS1指導RNA之組成物接觸，該AAVS1指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，AAVS1指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括對AAVS1進行遺傳修飾，包括使細胞與包含AAVS1指導RNA之組成物接觸，該AAVS1指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，AAVS1指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括誘導AAVS1中之DSB或單股斷裂(SSB)，包括使細胞與包含AAVS1指導RNA之組成物接觸，該AAVS1指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係釀膿鏈球菌Cas9。在一些實施例中，AAVS1指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，該等方法包括向細胞遞送組成物，包括使細胞與包含AAVS1指導RNA之組成物接觸，該AAVS1指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該等方法進一步包括使細胞與RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸接觸。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，AAVS1指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，對AAVS1基因進行遺傳修飾之方法包括使細胞與本文所揭示之任一或多種AAVS1指導RNA接觸。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，提供包含AAVS1指導RNA之組成物，該AAVS1指導RNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，該組成物進一步包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9。在一些實施例中，AAVS1指導RNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9指導RNA。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶區域。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3A去胺酶(A3A)及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，提供一種組成物，該組成物包含：a) AAVS1指導RNA (gRNA)，其包含i)選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列；或ii)選自SEQ ID NO: 601-774之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或iii)與選自SEQ ID NO: 601-774之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或iv)包含表5中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或v)來自(iv)之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或vi)與選自(v)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，AAVS1指導RNA (gRNA)係單指導RNA。
在一些實施例中，提供製備經工程改造之細胞之方法，該方法包括使細胞與本文所提供之任何實施例之組成物接觸。在一些實施例中，該組成物包含AAVS1指導RNA，該指導RNA包含來自以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 611、620、622、626、627、628、629、632、633、634、656、659、660、661、673、691、692、730、734及746。
在一些實施例中，該組成物進一步包含尿嘧啶糖基化酶抑制劑(UGI)。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對AAVS1基因體靶序列生成胞嘧啶(C)至胸腺嘧啶(T)之轉化。在一些實施例中，該組成物包含RNA指導之DNA結合劑，該RNA指導之DNA結合劑針對AAVS1基因體靶序列生成腺苷(A)至鳥嘌呤(G)之轉化。
在一些實施例中，提供藉由本文所述之方法產生的經工程改造之細胞。在一些實施例中，藉由本文所述之方法及組成物產生的經工程改造之細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，如在含有CD4+ T細胞之體外細胞培養分析中所量測，與未經修飾之細胞相比，藉由本文所揭示之方法產生的經工程改造之細胞誘發來自CD4+ T細胞之降低反應。
在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少5個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供藉由本文所揭示之方法或組成物產生的經工程改造之細胞，其中該細胞包含遺傳修飾，該遺傳修飾包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代。在一些實施例中，本文所揭示之組成物進一步包含醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，提供由包含醫藥學上可接受之載劑的本文所揭示之組成物產生之細胞。在一些實施例中，提供包含本文所揭示之細胞之組成物。
C. HLA-A 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於降低細胞表面上之HLA-A蛋白表現之HLA-A指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至HLA-A基因體靶序列且可在本文中稱為「HLA-A指導RNA」。在一些實施例中，HLA-A指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類HLA-A基因體靶序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含HLA-A指導RNA，該HLA-A指導RNA包含靶向HLA-A基因體靶序列之指導序列，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含HLA-A指導RNA，該HLA-A指導RNA包含靶向HLA-A基因體靶序列之指導序列，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含HLA-A指導RNA，該HLA-A指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導HLA-A基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該HLA-A指導RNA靶向HLA-A基因體靶序列，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含HLA-A指導RNA，該HLA-A指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導HLA-A基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該HLA-A指導RNA靶向HLA-A基因體靶序列，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，該等方法及組成物揭示HLA-A指導RNA，該HLA-A指導RNA引導RNA指導之DNA結合劑誘導HLA-A基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)。在一些實施例中，該等方法及組成物揭示引導RNA指導之DNA結合劑在HLA-A基因體靶序列中進行切割之HLA-A指導RNA。在RNA指導之DNA切割劑係Cas9之實施例中，切割出現在原型間隔物毗鄰模體(PAM)序列之第三個鹼基處。
在一些實施例中，提供包含本文所述之HLA-A指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含HLA-A單指導RNA (sgRNA)之組成物，該HLA-A sgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之HLA-A sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含HLA-A雙指導RNA (dgRNA)之組成物，該HLA-A dgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之HLA-A dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，TRAC gRNA包含選自SEQ ID NO: 2-80中任一者之指導序列。例示性HLA-A指導序列與對應指導RNA序列2-80示於下表1 (SEQ ID NO: 2-80)中。
表1. 例示性HLA-A指導序列
| 指導ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1002-1080) | 例示性指導RNA 修飾序列(SEQ ID NO: 2002-2080) | 基因體坐標(hg38) |
| G028854 | 2 | CCUGGGUCUGGUCCUCCCCAUCCC | CCUGGGUCUGGUCCUCCCCAUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmGGUmCmUGmGUmCCUCCmCCAUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944223-29944247 |
| G028855 | 3 | GUGGAGACCAGGCCUGCAGGGGAU | GUGGAGACCAGGCCUGCAGGGGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mGmAGAmCmCAmGGmCCUGCmAGGGmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944264-29944288 |
| G028856 | 4 | CCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCCC | CCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mUmGUCmCmUGmGGmUCUGGmUCCUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944229-29944253 |
| G028857 | 5 | UCCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCC | UCCGUGUCCUGGGUCUGGUCCUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mGmUGUmCmCUmGGmGUCUGmGUCCmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944230-29944254 |
| G028858 | 6 | CACAUGGCAGGUGUAUCUCUGCUC | CACAUGGCAGGUGUAUCUCUGCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmUGGmCmAGmGUmGUAUCmUCUGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944327-29944351 |
| G028859 | 7 | UGCUGCACAUGGCAGGUGUAUCUC | UGCUGCACAUGGCAGGUGUAUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mUmGCAmCmAUmGGmCAGGUmGUAUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944332-29944356 |
| G028860 | 8 | CCGCACGAACUGCGUGUCGUCCAC | CCGCACGAACUGCGUGUCGUCCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mCmACGmAmACmUGmCGUGUmCGUCmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942830-29942854 |
| G028861 | 9 | CGCACGAACUGCGUGUCGUCCACG | CGCACGAACUGCGUGUCGUCCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mAmCGAmAmCUmGCmGUGUCmGUCCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942829-29942853 |
| G028862 | 10 | GUGCGCUGCAGCGUCUCCUUCCCG | GUGCGCUGCAGCGUCUCCUUCCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mCmGCUmGmCAmGCmGUCUCmCUUCmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943511-29943535 |
| G028863 | 11 | CCGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCC | CCGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mAmGGAmUmGGmCCmGUCAUmGGCGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942547-29942571 |
| G028864 | 12 | CGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCCC | CGAGGAUGGCCGUCAUGGCGCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mA*mGmGAUmGmGCmCGmUCAUGmGCGCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942548-29942572 |
| G028865 | 13 | AAGGUUCCAUCCCCUGCAGGCCUG | AAGGUUCCAUCCCCUGCAGGCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mGmUUCmCmAUmCCmCCUGCmAGGCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944266-29944290 |
| G028866 | 14 | AGACCAGGCCUGCAGGGGAUGGAA | AGACCAGGCCUGCAGGGGAUGGAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mCmCAGmGmCCmUGmCAGGGmGAUGmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944268-29944292 |
| G028867 | 15 | ACUUCUGGAAGGUUCCAUCCCCUG | ACUUCUGGAAGGUUCCAUCCCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mU*mUmCUGmGmAAmGGmUUCCAmUCCCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944274-29944298 |
| G028868 | 16 | CGAUGAAGCGGGGCUCCCCGCGGC | CGAUGAAGCGGGGCUCCCCGCGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mA*mUmGAAmGmCGmGGmGCUCCmCCGCmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942795-29942819 |
| G028869 | 17 | UCCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGG | UCCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mGmUGUmCmCCmGGmCCCGGmCCGCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942785-29942809 |
| G028870 | 18 | CCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGGG | CCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mUmGUCmCmCGmGCmCCGGCmCGCGmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942786-29942810 |
| G028871 | 19 | CAGACGCCGAGGAUGGCCGUCAUG | CAGACGCCGAGGAUGGCCGUCAUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mAmCGCmCmGAmGGmAUGGCmCGUCmAUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942541-29942565 |
| G028872 | 20 | CCAGACGCCGAGGAUGGCCGUCAU | CCAGACGCCGAGGAUGGCCGUCAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmACGmCmCGmAGmGAUGGmCCGUmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942540-29942564 |
| G028873 | 21 | AGACGCCGAGGAUGGCCGUCAUGG | AGACGCCGAGGAUGGCCGUCAUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mCmGCCmGmAGmGAmUGGCCmGUCAmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942542-29942566 |
| G028874 | 22 | CUGUCGAACCGCACGAACUGCGUG | CUGUCGAACCGCACGAACUGCGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mUmCGAmAmCCmGCmACGAAmCUGCmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942838-29942862 |
| G028875 | 23 | UCGUGCGGUUCGACAGCGACGCCG | UCGUGCGGUUCGACAGCGACGCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mG*mUmGCGmGmUUmCGmACAGCmGACGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942852-29942876 |
| G028876 | 24 | CCAUCCCCAUCGUGGGCAUCAUUG | CCAUCCCCAUCGUGGGCAUCAUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmCCCmCmAUmCGmUGGGCmAUCAmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944517-29944541 |
| G028877 | 25 | UCCUCUGGCUCGCGGCGUCGCUGU | UCCUCUGGCUCGCGGCGUCGCUGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmCUGmGmCUmCGmCGGCGmUCGCmUGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942858-29942882 |
| G028878 | 26 | CUCUGGUUGUAGUAGCCGCGCAGG | CUCUGGUUGUAGUAGCCGCGCAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mUmGGUmUmGUmAGmUAGCCmGCGCmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942988-29943012 |
| G028879 | 27 | ACCUGGGGACCCUGCGCGGCUACU | ACCUGGGGACCCUGCGCGGCUACUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mUmGGGmGmACmCCmUGCGCmGGCUmACUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942984-29943008 |
| G028880 | 28 | CGCUCUGGUUGUAGUAGCCGCGCA | CGCUCUGGUUGUAGUAGCCGCGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mUmCUGmGmUUmGUmAGUAGmCCGCmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942990-29943014 |
| G028881 | 29 | GCUCUGGUUGUAGUAGCCGCGCAG | GCUCUGGUUGUAGUAGCCGCGCAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mCmUGGmUmUGmUAmGUAGCmCGCGmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942989-29943013 |
| G028882 | 30 | UAUUUUUUUCUAUAGUGUGAGACA | UAUUUUUUUCUAUAGUGUGAGACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mU*mUmUUUmUmUCmUAmUAGUGmUGAGmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945435-29945459 |
| G028883 | 31 | ACGCCUACGACGGCAAGGAUUACA | ACGCCUACGACGGCAAGGAUUACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mG*mCmCUAmCmGAmCGmGCAAGmGAUUmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943342-29943366 |
| G028884 | 32 | UUUGUUCUACCCCAGGCAGUGACA | UUUGUUCUACCCCAGGCAGUGACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mU*mGmUUCmUmACmCCmCAGGCmAGUGmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945218-29945242 |
| G028885 | 33 | UUUUGUUCUACCCCAGGCAGUGAC | UUUUGUUCUACCCCAGGCAGUGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mU*mUmGUUmCmUAmCCmCCAGGmCAGUmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945217-29945241 |
| G028886 | 34 | AGCGACCACAGCUCCAGUGAUCAC | AGCGACCACAGCUCCAGUGAUCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mGmACCmAmCAmGCmUCCAGmUGAUmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944558-29944582 |
| G028887 | 35 | GAGCUCCGUGUCCUGGGUCUGGUC | GAGCUCCGUGUCCUGGGUCUGGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mCmUCCmGmUGmUCmCUGGGmUCUGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944234-29944258 |
| G028888 | 36 | UCCACGAGCUCCGUGUCCUGGGUC | UCCACGAGCUCCGUGUCCUGGGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mAmCGAmGmCUmCCmGUGUCmCUGGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944239-29944263 |
| G028889 | 37 | ACGAGCUCCGUGUCCUGGGUCUGG | ACGAGCUCCGUGUCCUGGGUCUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mG*mAmGCUmCmCGmUGmUCCUGmGGUCmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944236-29944260 |
| G028890 | 38 | CGAGCUCCGUGUCCUGGGUCUGGU | CGAGCUCCGUGUCCUGGGUCUGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mA*mGmCUCmCmGUmGUmCCUGGmGUCUmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944235-29944259 |
| G028891 | 39 | GCAGGCCUGGUCUCCACGAGCUCC | GCAGGCCUGGUCUCCACGAGCUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mA*mGmGCCmUmGGmUCmUCCACmGAGCmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944251-29944275 |
| G028892 | 40 | UCCCCUGCAGGCCUGGUCUCCACG | UCCCCUGCAGGCCUGGUCUCCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mCmCUGmCmAGmGCmCUGGUmCUCCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944257-29944281 |
| G028893 | 41 | AUCCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGG | AUCCGUGUCCCGGCCCGGCCGCGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mC*mCmGUGmUmCCmCGmGCCCGmGCCGmCGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942784-29942808 |
| G028894 | 42 | CCUUCCCGUUCUCCAGGUAUCUGC | CCUUCCCGUUCUCCAGGUAUCUGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mUmCCCmGmUUmCUmCCAGGmUAUCmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943495-29943519 |
| G028895 | 43 | CCGUUCUCCAGGUAUCUGCGGAGC | CCGUUCUCCAGGUAUCUGCGGAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mUmUCUmCmCAmGGmUAUCUmGCGGmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943490-29943514 |
| G028896 | 44 | ACCUGCCAUGUGCAGCAUGAGGGU | ACCUGCCAUGUGCAGCAUGAGGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mUmGCCmAmUGmUGmCAGCAmUGAGmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944345-29944369 |
| G028897 | 45 | CACCUGCCAUGUGCAGCAUGAGGG | CACCUGCCAUGUGCAGCAUGAGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mCmUGCmCmAUmGUmGCAGCmAUGAmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944344-29944368 |
| G028898 | 46 | ACCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGAC | ACCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mUmGGCmAmGCmGGmGAUGGmGGAGmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944219-29944243 |
| G028899 | 47 | CACUGACCUGGCAGCGGGAUGGGG | CACUGACCUGGCAGCGGGAUGGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmGACmCmUGmGCmAGCGGmGAUGmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944214-29944238 |
| G028900 | 48 | CCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGACC | CCUGGCAGCGGGAUGGGGAGGACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmGCAmGmCGmGGmAUGGGmGAGGmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944220-29944244 |
| G028901 | 49 | CCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGG | CCAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmCUCmAmGGmGUmGAGGGmGCUUmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944366-29944390 |
| G028902 | 50 | UGGCCGUCAUGGCGCCCCGAACCC | UGGCCGUCAUGGCGCCCCGAACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmCGUmCmAUmGGmCGCCCmCGAAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942554-29942578 |
| G028903 | 51 | AUGUCCGCCGCGGUCCAAGAGCGC | AUGUCCGCCGCGGUCCAAGAGCGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mG*mUmCCGmCmCGmCGmGUCCAmAGAGmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943379-29943403 |
| G028904 | 52 | GGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCUC | GGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mAmCCCmGmUGmCGmCUGCAmGCGUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943518-29943542 |
| G028905 | 53 | GGGAAGGAGACGCUGCAGCGCACG | GGGAAGGAGACGCUGCAGCGCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mAmAGGmAmGAmCGmCUGCAmGCGCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943518-29943542 |
| G028906 | 54 | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGCAGGA | GCGGGCGCCGUGGAUAGAGCAGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mG*mGmGCGmCmCGmUGmGAUAGmAGCAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942895-29942919 |
| G028907 | 55 | UCCUGCUCUAUCCACGGCGCCCGC | UCCUGCUCUAUCCACGGCGCCCGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmGCUmCmUAmUCmCACGGmCGCCmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942889-29942913 |
| G028908 | 56 | CCCCUGGUACCCGUGCGCUGCAGC | CCCCUGGUACCCGUGCGCUGCAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mCmUGGmUmACmCCmGUGCGmCUGCmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943523-29943547 |
| G028909 | 57 | UGGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCU | UGGUACCCGUGCGCUGCAGCGUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mUmACCmCmGUmGCmGCUGCmAGCGmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943519-29943543 |
| G028910 | 58 | CAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGGC | CAUCUCAGGGUGAGGGGCUUGGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mU*mCmUCAmGmGGmUGmAGGGGmCUUGmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944365-29944389 |
| G028911 | 59 | ACGCAGUUCGUGCGGUUCGACAGC | ACGCAGUUCGUGCGGUUCGACAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mG*mCmAGUmUmCGmUGmCGGUUmCGACmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942845-29942869 |
| G028912 | 60 | CGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCAG | CGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mCmCAGmGmUCmUGmGGUCAmGGGCmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942595-29942619 |
| G028913 | 61 | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUC | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmCACmCmCGmCCmCAGGUmCUGGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942609-29942633 |
| G028914 | 62 | CCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCA | CCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mCmCCAmGmGUmCUmGGGUCmAGGGmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942596-29942620 |
| G028915 | 63 | CCCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCC | CCCGCCCAGGUCUGGGUCAGGGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mGmCCCmAmGGmUCmUGGGUmCAGGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942597-29942621 |
| G028916 | 64 | CAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGAU | CAGCGACGCCGCGAGCCAGAGGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mCmGACmGmCCmGCmGAGCCmAGAGmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942865-29942889 |
| G028917 | 65 | CGCGAGCCAGAGGAUGGAGCCGCG | CGCGAGCCAGAGGAUGGAGCCGCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mGmAGCmCmAGmAGmGAUGGmAGCCmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942874-29942898 |
| G028918 | 66 | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCU | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mCmUAUmCmCAmCGmGCGCCmCGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29942891-29942915 |
| G028919 | 67 | CACAUCAGAGCCCUGGGCACUGUC | CACAUCAGAGCCCUGGGCACUGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmUCAmGmAGmCCmCUGGGmCACUmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945232-29945256 |
| G028920 | 68 | CAGACCCAGGACACGGAGCUCGUG | CAGACCCAGGACACGGAGCUCGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mAmCCCmAmGGmACmACGGAmGCUCmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944243-29944267 |
| G028921 | 69 | CCAGGACACGGAGCUCGUGGAGAC | CCAGGACACGGAGCUCGUGGAGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmGACmAmCGmGAmGCUCGmUGGAmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944248-29944272 |
| G028922 | 70 | CUCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGA | CUCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mUmGGGmAmAAmAGmAGGGGmAAGGmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944471-29944495 |
| G028923 | 71 | UCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGAG | UCUGGGAAAAGAGGGGAAGGUGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mGmGGAmAmAAmGAmGGGGAmAGGUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944470-29944494 |
| G028924 | 72 | AGACGCUGCAGCGCACGGGUACCA | AGACGCUGCAGCGCACGGGUACCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mCmGCUmGmCAmGCmGCACGmGGUAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943525-29943549 |
| G028925 | 73 | UCCUUUUCUAUCUGUGGGAAGAAA | UCCUUUUCUAUCUGUGGGAAGAAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmUUUmCmUAmUCmUGUGGmGAAGmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 不可用。與人類基因體之不完全比對。 |
| G028926 | 74 | CACUGCCUGGGGUAGAACAAAAAC | CACUGCCUGGGGUAGAACAAAAACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmGCCmUmGGmGGmUAGAAmCAAAmAACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29945209-29945233 |
| G028927 | 75 | ACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGU | ACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mAmCCAmGmAGmCGmAGGCCmGGUGmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943008-29943032 |
| G028928 | 76 | CUACAACCAGAGCGAGGCCGGUGA | CUACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mA*mCmAACmCmAGmAGmCGAGGmCCGGmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943006-29943030 |
| G028929 | 77 | UACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAG | UACAACCAGAGCGAGGCCGGUGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mAmACCmAmGAmGCmGAGGCmCGGUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943007-29943031 |
| G028930 | 78 | CCAGAGCGAGGCCGGUGAGUGACC | CCAGAGCGAGGCCGGUGAGUGACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmAGCmGmAGmGCmCGGUGmAGUGmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943012-29943036 |
| G028933 | 79 | CCAUCCCGCUGCCAGGUCAGUGUG | CCAUCCCGCUGCCAGGUCAGUGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmCCCmGmCUmGCmCAGGUmCAGUmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29944206-29944230 |
| G028934 | 80 | GUAUCUGCGGAGCCACUCCACGCA | GUAUCUGCGGAGCCACUCCACGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mA*mUmCUGmCmGGmAGmCCACUmCCACmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr6:29943479-29943503 |
在本申請案通篇中，術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。在本申請案通篇中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示利用硫代磷酸酯(PS)鍵連接至下一(例如，3')核苷酸之核苷酸。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含選自SEQ ID NO: 2-80之指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列係選自SEQ ID NO: 2-80之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 2-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 2-80之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 1中所列基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自
表 1中所列範圍的5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，HLA-A指導RNA可包含選自以下之基因體坐標內之10個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494；包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含
表 1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列與選自以下序列之序列至少95%、90%或85%一致，該序列係包含
表 1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 1中所列基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 1中所列基因體坐標之至少24個鄰接核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 3。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 4。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 5。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 6。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 7。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 8。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 9。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 10。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 11。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 12。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 13。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 14。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 15。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 16。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 17。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 18。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 19。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 20。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 21。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 22。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 23。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 24。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 25。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 26。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 27。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 28。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 29。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 30。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 31。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 32。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 33。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 34。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 35。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 36。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 37。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 38。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 39。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 40。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 41。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 42。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 43。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 44。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 45。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 46。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 47。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 48。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 49。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 50。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 51。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 52。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 53。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 54。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 55。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 56。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 57。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 58。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 59。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 60。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 61。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 62。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 63。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 64。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 65。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 66。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 67。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 68。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 69。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 70。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 71。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 72。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 73。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 74。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 75。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 76。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 77。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 78。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 79。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 80。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 13、55、61、66及70-71。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含表1中所列之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2-80中任一者之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 61或66之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 61之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 61之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 2-80中任一者之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 61或66之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 61之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 66之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 1002-1080中任一者之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 1061或1066之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 1061之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 1066之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2002-2080、3001及3002中任一者之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2061、2066、3001及3002中任一者之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2061之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 2066之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 3001之序列。在一些實施例中，HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 3002之序列。
在一些實施例中，HLA-A指導RNA係單指導RNA (sgRNA)，其包含表1中所列任一sgRNA序列之序列。
本文提供HLA-A指導RNA之額外實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
1. 對 HLA-A 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中HLA-A基因之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。在一些實施例中，對HLA-A之遺傳修飾降低或消除經遺傳修飾之細胞(或經工程改造之細胞)表面上HLA-A蛋白之表現。遺傳修飾涵蓋由與基因體編輯系統(例如，由Cas9及HLA-A指導RNA產生之編輯子群體，或由BC22及HLA-A指導RNA產生之編輯子群體)接觸而產生之修飾群體。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自表1中所列之任何基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944470-29944494。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944470-29944494。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺中之任一者或多者。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含插入/缺失，該插入/缺失通常在此項技術中定義為小於1000鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含導致靶序列中之框移突變之插入/缺失。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，對HLA-A之修飾包含由併入模板核酸引起之核苷酸插入、缺失或取代中之一或多種。在一些實施例中，對HLA-A之修飾並非瞬時的。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物使用RNA指導之DNA結合劑(例如，Cas酶)修飾細胞中之HLA-A基因。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑在HLA-A基因內切割，其中HLA-A指導RNA靶向包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內至少10個鄰接核苷酸之HLA-A基因體靶序列。
在一些實施例中，對HLA-A之遺傳修飾導致利用框外終止密碼子。在一些實施例中，對HLA-A之遺傳修飾導致剪接期間之外顯子跳躍。在一些實施例中，對HLA-A之遺傳修飾導致細胞之降低之HLA-A蛋白表現。在一些實施例中，對HLA-A之修飾導致細胞表面上降低或消除之HLA-A蛋白表現。
在一些實施例中，細胞表面上之HLA-A表現由於對HLA-A之遺傳修飾而降低。在一些實施例中，細胞表面上之HLA-A表現由於對HLA-A之遺傳修飾而缺失。
2. HLA-A 指導 RNA 之功效
可藉由此項技術中可用之技術來確定HLA-A指導RNA之功效，該等技術評估靶細胞中指導RNA之編輯效率、HLA-A mRNA之水準或HLA-A蛋白之水準。在一些實施例中，可藉由與未經修飾之細胞比較(或「相對於未經修飾之細胞」)來確定細胞表面上HLA-A蛋白之降低或消除。亦可將經工程改造之細胞或細胞群體與未經修飾之細胞群體進行比較。
「一種未經修飾之細胞」(或「多種未經修飾之細胞」)係指實驗或測試中相同細胞類型之一種對照細胞(或多種對照細胞)，其中「未經修飾之」對照細胞尚未與HLA-A指導接觸(亦即未經工程改造之細胞)。因此，一種未經修飾之細胞(或多種細胞)可為未與指導RNA接觸之細胞、或已與不靶向HLA-A之指導RNA接觸之細胞。
在一些實施例中，藉由量測靶細胞表面上HLA-A蛋白之降低或消除來確定HLA-A指導RNA之功效。在一些實施例中，藉由流式細胞術(例如，利用針對HLA-A2/HLA-A3之抗體)量測HLA-A蛋白表現。在一些實施例中，該細胞群體相對於未經修飾之細胞群體經富集(例如，藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% HLA-A陰性。在一些實施例中，該細胞群體相對於未經修飾之細胞群體未經富集(例如，藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% HLA-A陰性。
在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少65% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少70% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少80% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少90% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少91% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少92% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少93% HLA-A陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少94% HLA-A陰性。
[0001] 在一些實施例中，可藉由量測體外或體內免疫細胞(例如，CD8+ T細胞)對經遺傳修飾之靶細胞之反應來確定有效HLA-A指導RNA。舉例而言，來自CD8+ T細胞之降低反應指示有效之HLA-A指導RNA。可藉由量測CD8+ T細胞活化反應(例如CD8+ T細胞增殖、活化標記物之表現及/或細胞介素產生(IL-2、IFN-γ、TNF-α))之分析(例如，流式細胞術、ELISA)來評價CD8+ T細胞反應。可在體外或體內評估CD8+ T細胞反應。在一些實施例中，可藉由在體外共培養經遺傳修飾之細胞與CD8+T細胞來評價CD8+ T細胞反應。在一些實施例中，可在體內模型(例如，囓齒動物模型)中評價CD8+ T細胞活性。在體內模型中，例如，經遺傳修飾之細胞可與CD8+ T細胞一起投與；經遺傳修飾之細胞之存活指示避免CD8+ T細胞裂解之能力。在一些實施例中，該等方法產生包含在CD8+ T細胞存在下在體內存活大於1、2、3、4、5或6週或更長之細胞之組成物。在一些實施例中，該等方法產生包含在CD8+ T細胞存在下在體內存活至少一週至六週之細胞之組成物。在一些實施例中，該等方法產生包含在CD8+ T細胞存在下在體內存活至少兩至四週之細胞之組成物。在一些實施例中，該等方法產生包含在CD8+ T細胞存在下在體內存活至少四至六週之細胞之組成物。在一些實施例中，該等方法產生包含在CD8+ T細胞存在下在體內存活超過六週之細胞之組成物。
HLA-A指導RNA之功效亦可藉由編輯後細胞之存活來評估。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少兩週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少三週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少四週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少五週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少十二週。可使用標準技術(包括例如藉由細胞死亡之量度、藉由流式細胞術活/死染色或細胞增殖)來量測經遺傳修飾之細胞之活力。
D. TRAC 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於降低細胞表面上之TRAC蛋白表現之TRAC指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至TRAC基因體靶序列且可在本文中稱為「TRAC指導RNA」。在一些實施例中，TRAC指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類TRAC基因體靶序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRAC指導RNA，該TRAC指導RNA包含靶向TRAC基因體靶序列之指導序列，該TRAC基因體靶序列包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRAC指導RNA，該TRAC指導RNA包含靶向TRAC基因體靶序列之指導序列，該TRAC基因體靶序列包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRAC指導RNA，該TRAC指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRAC基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該TRAC指導RNA靶向TRAC基因體靶序列，該TRAC基因體靶序列包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRAC指導RNA，該TRAC指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRAC基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該TRAC指導RNA靶向TRAC基因體靶序列，該TRAC基因體靶序列包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，該等方法及組成物揭示TRAC指導RNA，該TRAC指導RNA引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRAC基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)。在一些實施例中，該等方法及組成物揭示引導RNA指導之DNA結合劑在TRAC基因體靶序列中進行切割之TRAC指導RNA。在RNA指導之DNA切割劑係Cas9之實施例中，切割或「切割位點」出現在原型間隔物毗鄰模體(PAM)序列之第三個鹼基處。
在一些實施例中，提供包含本文所述之TRAC指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含TRAC單指導RNA (sgRNA)之組成物，該TRAC sgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之TRAC sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含TRAC雙指導RNA (dgRNA)之組成物，該TRAC dgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之TRAC dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，TRAC gRNA包含選自SEQ ID NO: 101-120中任一者之指導序列。例示性TRAC指導序列與對應指導RNA序列101-120示於下表2 (SEQ ID NO: 101-120)中。
表2. 例示性TRAC指導序列.
| 指導ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1101-1120) | 例示性指導RNA 修飾序列(SEQ ID NO: 2101-2120) | 基因體坐標(hg38) |
| G021469 | 101 | AUAUCCAGAACCCUGACCCUGCCG | AUAUCCAGAACCCUGACCCUGCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mA*mUmCCAmGmAAmCCmCUGACmCCUGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547505-22547529 |
| G021481 | 102 | GCCGUGUACCAGCUGAGAGACUCU | GCCGUGUACCAGCUGAGAGACUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mGmUGUmAmCCmAGmCUGAGmAGACmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547525-22547549 |
| G028935 | 103 | CAGGCCACAGCACUGUUGCUCUUG | CAGGCCACAGCACUGUUGCUCUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mGmCCAmCmAGmCAmCUGUUmGCUCmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547674-22547698 |
| G028936 | 104 | CCCAGCCCAGGUAAGGGCAGCUUU | CCCAGCCCAGGUAAGGGCAGCUUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mAmGCCmCmAGmGUmAAGGGmCAGCmUUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547768-22547792 |
| G028937 | 105 | GUCUUACCUGUUUCAAAGCUUUUC | GUCUUACCUGUUUCAAAGCUUUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mC*mUmUACmCmUGmUUmUCAAAmGCUUmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22549665-22549689 |
| G028938 | 106 | CUUUGAAACAGGUAAGACAGGGGU | CUUUGAAACAGGUAAGACAGGGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mUmGAAmAmCAmGGmUAAGAmCAGGmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22549671-22549695 |
| G028939 | 107 | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAA | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mA*mGmGUUmCmGUmAUmCUGUAmAAACmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550544-22550568 |
| G028940 | 108 | UUACAGAUACGAACCUAAACUUUC | UUACAGAUACGAACCUAAACUUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mA*mCmAGAmUmACmGAmACCUAmAACUmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550550-22550574 |
| G028941 | 109 | UUGAAAGUUUAGGUUCGUAUCUGU | UUGAAAGUUUAGGUUCGUAUCUGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mG*mAmAAGmUmUUmAGmGUUCGmUAUCmUGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550552-22550576 |
| G028942 | 110 | ACUUUCAAAACCUGUCAGUGAUUG | ACUUUCAAAACCUGUCAGUGAUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mU*mUmUCAmAmAAmCCmUGUCAmGUGAmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550568-22550592 |
| G028943 | 111 | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCC | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mA*mAmCCUmGmUCmAGmUGAUUmGGGUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550574-22550598 |
| G028944 | 112 | UGUCAGUGAUUGGGUUCCGAAUCC | UGUCAGUGAUUGGGUUCCGAAUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mU*mCmAGUmGmAUmUGmGGUUCmCGAAmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550580-22550604 |
| G028945 | 113 | GGGUUCCGAAUCCUCCUCCUGAAA | GGGUUCCGAAUCCUCCUCCUGAAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mUmUCCmGmAAmUCmCUCCUmCCUGmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550591-22550615 |
| G028946 | 114 | AAGGCCCCUCACCUCAGCUGGACC | AAGGCCCCUCACCUCAGCUGGACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mGmCCCmCmUCmACmCUCAGmCUGGmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550652-22550676 |
| G028947 | 115 | AGCUUCAAGGCCCCUCACCUCAGC | AGCUUCAAGGCCCCUCACCUCAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mUmUCAmAmGGmCCmCCUCAmCCUCmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22550658-22550682 |
| G028948 | 116 | AUUCCAGAUCUGCAAGAUUGUAAG | AUUCCAGAUCUGCAAGAUUGUAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mU*mCmCAGmAmUCmUGmCAAGAmUUGUmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22551597-22551621 |
| G021475 | 117 | AACCCUGAUCCUCUUGUCCCACAG | AACCCUGAUCCUCUUGUCCCACAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mC*mCmCUGmAmUCmCUmCUUGUmCCCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547481-22547505 |
| G021476 | 118 | AUCAUGUCCUAACCCUGAUCCUCU | AUCAUGUCCUAACCCUGAUCCUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mC*mAmUGUmCmCUmAAmCCCUGmAUCCmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547471-22547495 |
| G021477 | 119 | GAUCAUGUCCUAACCCUGAUCCUC | GAUCAUGUCCUAACCCUGAUCCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mU*mCmAUGmUmCCmUAmACCCUmGAUCmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547470-22547494 |
| G021478 | 120 | GGAAAUGAGAUCAUGUCCUAACCC | GGAAAUGAGAUCAUGUCCUAACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mAmAUGmAmGAmUCmAUGUCmCUAAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547462-22547486 |
在本申請案通篇中，術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。在本申請案通篇中，術語A*、C*、U*或G*可用於表示利用硫代磷酸酯(PS)鍵連接至下一(例如，3')核苷酸之核苷酸。
在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 101-120之指導序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列係選自SEQ ID NO: 101-120之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 101-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 101-120之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 2中所列基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自
表 2中所列範圍的5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，TRAC指導RNA可包含選自以下之基因體坐標內之10個鄰接核苷酸：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598；包括該等範圍之邊界核苷酸。作為另一實例，TRAC指導RNA可包含選自以下之基因體坐標內之10個鄰接核苷酸：chr14:22547481-22547505；chr14:22547471-22547495；chr14:22547470-22547494或chr14:22547462-22547486；包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含
表 2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列與選自以下序列之序列至少95%、90%或85%一致，該序列係包含
表 2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 2中所列基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 2中所列基因體坐標之至少24個鄰接核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 101。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 102。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 103。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 104。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 105。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 106。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 107。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 108。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 109。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 110。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 111。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 112。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 113。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 114。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 115。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 116。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 117。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 118。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 119。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 120。
在一些實施例中，TRAC指導RNA包含選自以下之核苷酸：SEQ ID NO: 101-103、107、111、117或118。
在一些實施例中，TRAC指導RNA包含表2中所列之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 101-120中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 107、111及117-120中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 107之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 111之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 117之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 118之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 119之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 120之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 101-120中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 107、111及117-120中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 107之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 111之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 117之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 118之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 119之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 120之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1101-1120中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1107、1111及1117-1120中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1107之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1111之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1117之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1118之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1119之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 1120之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2101-2120、3003及3004中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2107、2111、2117-2120、3003及3004中任一者之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2107之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2111之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2117之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2118之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2119之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 2120之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 3003之序列。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 3004之序列。
在一些實施例中，TRAC指導RNA係單指導RNA (sgRNA)，其包含表2中所列任一sgRNA序列之序列。
本文提供TRAC指導RNA之額外實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
1. 對 TRAC 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中TRAC基因之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。在一些實施例中，對TRAC之遺傳修飾降低或消除經遺傳修飾之細胞(或經工程改造之細胞)表面上TRAC蛋白之表現。遺傳修飾涵蓋由與基因體編輯系統(例如，由Cas9及TRAC指導RNA產生之編輯子群體，或由BC22及TRAC指導RNA產生之編輯子群體)接觸而產生之修飾群體。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自表2中所列任何基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr14:22547481-22547505；chr14:22547471-22547495；chr14:22547470-22547494或chr14:22547462-22547486。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698；chr14:22550544-22550568或chr14:22550574-22550598。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr14:22547481-22547505；chr14:22547471-22547495；chr14:22547470-22547494或chr14:22547462-22547486。
在一些實施例中，對TRAC之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺中之任一者或多者。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對TRAC之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對TRAC之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含插入/缺失，該插入/缺失通常在此項技術中定義為小於1000鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含導致靶序列中之框移突變之插入/缺失。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含由併入模板核酸引起之核苷酸插入、缺失或取代中之一或多種。在一些實施例中，對TRAC之修飾包含在靶序列中插入供體核酸。在一些實施例中，對TRAC之修飾並非瞬時的。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物使用RNA指導之DNA結合劑(例如，Cas酶)修飾細胞中之TRAC基因。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑在TRAC基因內切割，其中TRAC指導RNA靶向包含chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621之至少10個鄰接核苷酸之TRAC基因體靶序列。
在一些實施例中，對TRAC之遺傳修飾導致利用框外終止密碼子。在一些實施例中，對TRAC之遺傳修飾導致剪接期間之外顯子跳躍。在一些實施例中，對TRAC之遺傳修飾導致細胞之降低之TRAC蛋白表現。在一些實施例中，對TRAC基因之修飾導致細胞表面上降低或消除之TRAC蛋白表現。
在一些實施例中，細胞表面上之TRAC表現由於對TRAC之遺傳修飾而降低。在一些實施例中，細胞表面上之TRAC表現由於對TRAC之遺傳修飾而缺失。
2. TRAC 指導 RNA 之功效
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，確定TRAC gRNA之功效。在一些實施例中，TRAC gRNA與RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白，例如Cas9)一起表現。在一些實施例中，TRAC gRNA經遞送至或表現於已穩定表現RNA指導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之細胞株中。在一些實施例中，將TRAC gRNA作為RNP之一部分遞送至細胞中。在一些實施例中，將TRAC gRNA連同編碼RNA指導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的mRNA一起遞送至細胞中。
如本文所述，使用本文所揭示之RNA指導之DNA核酸酶及TRAC指導RNA可導致DNA中之雙股斷裂，此可在由細胞機制修復後產生插入/缺失(插入/缺失)突變形式之錯誤。許多由插入/缺失引起之突變改變閱讀框或引入過早終止密碼子，且因此產生非功能性蛋白。
在一些實施例中，基於體外模型來確定特定TRAC gRNA之功效。在一些實施例中，體外模型係穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，體外模型係周邊血單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，體外模型係T細胞，諸如原代人類T細胞。關於使用原代細胞，可使用市售原代細胞來提供實驗之間更大的一致性。在一些實施例中，在體外模型(例如，在T細胞中)中發生缺失或插入之脫靶位點之數目係例如藉由分析來自用Cas9 mRNA及指導RNA在體外轉染之細胞的基因體DNA來確定。在一些實施例中，該確定包括分析來自用Cas9 mRNA、TRAC指導RNA及供體寡核苷酸在體外轉染之細胞的基因體DNA。工作實例中提供該等確定之例示性程序，其中使用HEK293細胞、PBMC及人類CD3
+T細胞。
在一些實施例中，在用於gRNA選擇過程之多個體外細胞模型中確定特定TRAC gRNA之功效。在一些實施例中，實施資料與所選TRAC gRNA之細胞株比較。在一些實施例中，實施多細胞模型中的交叉篩選。
在一些實施例中，藉由TRAC之插入/缺失百分比來量測TRAC指導RNA之功效。在一些實施例中，將TRAC之編輯百分比與達成TRAC蛋白產物敲低所必需之插入/缺失百分比進行比較。
在一些實施例中，藉由T細胞受體(TCR)之降低或消除之表現來量測指導RNA之功效。在實施例中，T細胞受體(TCR)組分之降低或消除之表現包括TRAC之降低或消除之表現。在一些實施例中，TCR之該組分之該降低或消除之表現係將一或多種(例如一或兩種，例如一種)針對該TCR之該組分的本文所述之TRAC gRNA分子引入該細胞中的結果。在實施例中，藉由流式細胞術來量測該降低或消除之TCR組分之表現，例如如本文中所述。
在一些實施例中，藉由靶細胞類型(諸如T細胞)基因體內脫靶序列處的插入/缺失之數目及/或頻率來量測TRAC指導RNA之功效。在一些實施例中，提供有效的指導RNA，其以極低頻率(例如，＜ 5%)在細胞群體中及/或相對於靶位點處插入/缺失之生成頻率在脫靶位點處產生插入/缺失。因此，本揭示案提供在靶細胞類型(例如，T細胞)中不展現脫靶插入/缺失形成或在細胞群體中及/或相對於靶位點處插入/缺失之生成頻率產生＜ 5%之脫靶插入/缺失形成頻率的指導RNA。在一些實施例中，本揭示案提供在靶細胞類型(例如，T細胞)中不展現任何脫靶插入/缺失形成之指導RNA。在一些實施例中，提供例如如藉由本文所述之一或多種方法所評價在少於5個脫靶位點處產生插入/缺失的指導RNA。在一些實施例中，提供例如如藉由本文所述之一或多種方法所評價在少於或等於4、3、2或1個脫靶位點處產生插入/缺失的指導RNA。在一些實施例中，一或多個脫靶位點不出現在靶細胞(例如，肝細胞)基因體中之蛋白編碼區中。
在一些實施例中，偵測基因編輯事件(諸如靶DNA中之形成插入/缺失(「插入/缺失」)突變及同源定向修復(HDR)事件)利用帶有標記引子之線性擴增及分離經標記擴增產物(下文稱為「LAM-PCR」或「線性擴增(LA)」方法)。
在一些實施例中，藉由包含基因表現之蛋白產物的功能性蛋白複合物之水準來量測指導RNA之功效。在一些實施例中，藉由TCR表現之流式細胞術分析來量測指導RNA之功效，藉由流式細胞術分析經編輯的活細胞群體之TCR損失。
E. TRBC 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於降低細胞表面上之TRBC1蛋白或TRBC2蛋白或二者之表現之TRBC指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至TRBC1基因體靶序列且可在本文中稱為「TRBC1指導RNA」。在一些實施例中，TRBC1指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類TRBC1基因體靶序列。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至TRBC2基因體靶序列且可在本文中稱為「TRBC2指導RNA」。在一些實施例中，TRBC2指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類TRBC2基因體靶序列。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至TRBC1基因體靶序列及TRBC2基因體靶序列且可在本文中稱為「TRBC1/2指導RNA」。在一些實施例中，TRBC1/2指導RNA將RNA指導之DNA結合劑指導至人類TRBC1基因體靶序列及人類TRBC2基因體靶序列。在一些實施例中，TRBC1指導RNA可含有與TRBC2基因體靶序列之失配，但TRBC1指導RNA仍可將RNA指導之DNA結合劑引導至TRBC2基因體靶序列。在一些實施例中，TRBC2指導RNA可含有與TRBC1基因體靶序列之失配，但TRBC2指導RNA仍可將RNA指導之DNA結合劑引導至TRBC1基因體靶序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC1指導RNA，該TRBC1指導RNA包含靶向TRBC1基因體靶序列之指導序列，該TRBC1基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142791862-142793149內之至少10個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC1指導RNA，該TRBC1指導RNA包含靶向TRBC1基因體靶序列之指導序列，該TRBC1基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142791862-142793149內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC2指導RNA，該TRBC2指導RNA包含靶向TRBC2基因體靶序列之指導序列，該TRBC2基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142801104-142802543內之至少10個核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC2指導RNA，該TRBC2指導RNA包含靶向TRBC2基因體靶序列之指導序列，該TRBC2基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142801104-142802543內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC1指導RNA，該TRBC1指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRBC1基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該TRBC1指導RNA靶向TRBC1基因體靶序列，該TRBC1基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142791862-142793149內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC1指導RNA，該TRBC1指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRBC1基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該TRBC1指導RNA靶向TRBC1基因體靶序列，該TRBC1基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142791862-142793149內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC2指導RNA，該TRBC2指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRBC2基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該TRBC2指導RNA靶向TRBC2基因體靶序列，該TRBC2基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142801104-142802543內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含TRBC2指導RNA，該TRBC2指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRBC2基因中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)之指導序列，其中該TRBC2指導RNA靶向TRBC2基因體靶序列，該TRBC2基因體靶序列包含基因體坐標chr7:142801104-142802543內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，該等方法及組成物揭示TRBC1指導RNA，該TRBC1指導RNA引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRBC1或TRBC2基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)。在一些實施例中，該等方法及組成物揭示引導RNA指導之DNA結合劑在TRBC1或TRBC2基因體靶序列中進行切割之TRBC1或TRBC2指導RNA。在RNA指導之DNA切割劑係Cas9之實施例中，切割或「切割位點」出現在原型間隔物毗鄰模體(PAM)序列之第三個鹼基處。
在一些實施例中，提供包含本文所述之TRBC指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含TRBC1單指導RNA (sgRNA)之組成物，該TRBC1 sgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr7:142791862-142793149內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之TRBC1 sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含TRBC2單指導RNA (sgRNA)之組成物，該TRBC2 sgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr7:142801104-142802543內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之TRBC2 sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含TRBC1雙指導RNA (dgRNA)之組成物，該TRBC1 dgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr7:142791862-142793149內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之TRBC1 dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含TRBC2雙指導RNA (dgRNA)之組成物，該TRBC2 dgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr7:142801104-142802543內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之TRBC2 dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
[0002] 在一些實施例中，TRBC gRNA包含選自SEQ ID NO: 201-265中任一者之指導序列。例示性TRBC指導序列與對應指導RNA序列201-265示於下表3 (SEQ ID NO: 201-265)中。
表 3. 例示性 TRBC1 及 TRBC2 指導序列 .
| 指導ID | 指導序列之SEQ ID NO | 靶標 | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1201-1265) | 例示性指導RNA 修飾序列(SEQ ID NO: 2201-2265) | 基因體坐標(hg38) |
| G028952 | 201 | TRBC1 | CACGGACCCGCAGCCCCUCAAGGA | CACGGACCCGCAGCCCCUCAAGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mGmGACmCmCGmCAmGCCCCmUCAAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791862-142791886 |
| G028953 | 202 | TRBC1 | ACGGACCCGCAGCCCCUCAAGGAG | ACGGACCCGCAGCCCCUCAAGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mG*mGmACCmCmGCmAGmCCCCUmCAAGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791863-142791887 |
| G028968 | 203 | TRBC1 | GACGAGUGGACCCAGGAUAGGGCC | GACGAGUGGACCCAGGAUAGGGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mC*mGmAGUmGmGAmCCmCAGGAmUAGGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792010-142792034 |
| G028969 | 204 | TRBC1 | UGGACCCAGGAUAGGGCCAAACCC | UGGACCCAGGAUAGGGCCAAACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mAmCCCmAmGGmAUmAGGGCmCAAAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792016-142792040 |
| G028970 | 205 | TRBC1 | GGACCCAGGAUAGGGCCAAACCCG | GGACCCAGGAUAGGGCCAAACCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mCmCCAmGmGAmUAmGGGCCmAAACmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792017-142792041 |
| G028977 | 206 | TRBC1 | CCCUGCUUUCUUUCAGACUGUGGC | CCCUGCUUUCUUUCAGACUGUGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mUmGCUmUmUCmUUmUCAGAmCUGUmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792505-142792529 |
| G028978 | 207 | TRBC1 | GACUGUGGCUUUACCUCGGGUAAG | GACUGUGGCUUUACCUCGGGUAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mC*mUmGUGmGmCUmUUmACCUCmGGGUmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792520-142792544 |
| G028979 | 208 | TRBC1 | ACUGUGGCUUUACCUCGGGUAAGU | ACUGUGGCUUUACCUCGGGUAAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mU*mGmUGGmCmUUmUAmCCUCGmGGUAmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792521-142792545 |
| G028980 | 209 | TRBC1 | UGGCUUUACCUCGGGUAAGUAAGC | UGGCUUUACCUCGGGUAAGUAAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmUUUmAmCCmUCmGGGUAmAGUAmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792525-142792549 |
| G028981 | 210 | TRBC1 | UACCUCGGGUAAGUAAGCCCUUCC | UACCUCGGGUAAGUAAGCCCUUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mCmUCGmGmGUmAAmGUAAGmCCCUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792531-142792555 |
| G028982 | 211 | TRBC1 | AGGAAGGGCUUACUUACCCGAGGU | AGGAAGGGCUUACUUACCCGAGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mAmAGGmGmCUmUAmCUUACmCCGAmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792532-142792556 |
| G028983 | 212 | TRBC1 | CGGGUAAGUAAGCCCUUCCUUUUC | CGGGUAAGUAAGCCCUUCCUUUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mG*mGmUAAmGmUAmAGmCCCUUmCCUUmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792536-142792560 |
| G028984 | 213 | TRBC1 | GGGUAAGUAAGCCCUUCCUUUUCC | GGGUAAGUAAGCCCUUCCUUUUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mUmAAGmUmAAmGCmCCUUCmCUUUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792537-142792561 |
| G028985 | 214 | TRBC1 | UGCCAACAGUGUCCUACCAGCAAG | UGCCAACAGUGUCCUACCAGCAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mCmAACmAmGUmGUmCCUACmCAGCmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792682-142792706 |
| G028986 | 215 | TRBC1 | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUG | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mUmCCUmAmCCmAGmCAAGGmGGUCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792690-142792714 |
| G028987 | 216 | TRBC1 | UCCUACCAGCAAGGGGUCCUGUCU | UCCUACCAGCAAGGGGUCCUGUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmACCmAmGCmAAmGGGGUmCCUGmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792693-142792717 |
| G028989 | 217 | TRBC1 | ACCAUGGCCAUCAACACAAGGGCG | ACCAUGGCCAUCAACACAAGGGCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mAmUGGmCmCAmUCmAACACmAAGGmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792776-142792800 |
| G028990 | 218 | TRBC1 | CCAUGGUAAGCAGGAGGGCAGGAU | CCAUGGUAAGCAGGAGGGCAGGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mUmGGUmAmAGmCAmGGAGGmGCAGmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792793-142792817 |
| G028991 | 219 | TRBC1 | GGUCAAGAGAAAGGAUUUCUGAAG | GGUCAAGAGAAAGGAUUUCUGAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mCmAAGmAmGAmAAmGGAUUmUCUGmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142793119-142793143 |
| G028992 | 220 | TRBC1 | GUCAAGAGAAAGGAUUUCUGAAGG | GUCAAGAGAAAGGAUUUCUGAAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mC*mAmAGAmGmAAmAGmGAUUUmCUGAmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142793120-142793144 |
| G028993 | 221 | TRBC1 | GGCUGCCUUCAGAAAUCCUUUCUC | GGCUGCCUUCAGAAAUCCUUUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mC*mUmGCCmUmUCmAGmAAAUCmCUUUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142793125-142793149 |
| G028949 | 222 | TRBC1/2 | CCCACACCCAAAAGGCCACACUGG | CCCACACCCAAAAGGCCACACUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mAmCACmCmCAmAAmAGGCCmACACmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791756-142791780 |
| G028950 | 223 | TRBC1/2 | ACCCAAAAGGCCACACUGGUGUGC | ACCCAAAAGGCCACACUGGUGUGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mCmAAAmAmGGmCCmACACUmGGUGmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791761-142791785 |
| G028951 | 224 | TRBC1/2 | UCCUUCCCAUUCACCCACCAGCUC | UCCUUCCCAUUCACCCACCAGCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mUmUCCmCmAUmUCmACCCAmCCAGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791820-142791844 |
| G028954 | 225 | TRBC1/2 | GACCCGCAGCCCCUCAAGGAGCAG | GACCCGCAGCCCCUCAAGGAGCAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mC*mCmCGCmAmGCmCCmCUCAAmGGAGmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791866-142791890 |
| G028955 | 226 | TRBC1/2 | ACCCGCAGCCCCUCAAGGAGCAGC | ACCCGCAGCCCCUCAAGGAGCAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mCmGCAmGmCCmCCmUCAAGmGAGCmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791867-142791891 |
| G028956 | 227 | TRBC1/2 | CUCAAGGAGCAGCCCGCCCUCAAU | CUCAAGGAGCAGCCCGCCCUCAAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mAmAGGmAmGCmAGmCCCGCmCCUCmAAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791878-142791902 |
| G028957 | 228 | TRBC1/2 | AGCCCGCCCUCAAUGACUCCAGAU | AGCCCGCCCUCAAUGACUCCAGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mCmCGCmCmCUmCAmAUGACmUCCAmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791888-142791912 |
| G028958 | 229 | TRBC1/2 | CGGCCACCUUCUGGCAGAACCCCC | CGGCCACCUUCUGGCAGAACCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mG*mCmCACmCmUUmCUmGGCAGmAACCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791939-142791963 |
| G028959 | 230 | TRBC1/2 | GGGGGUUCUGCCAGAAGGUGGCCG | GGGGGUUCUGCCAGAAGGUGGCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mGmGUUmCmUGmCCmAGAAGmGUGGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791939-142791963 |
| G028960 | 231 | TRBC1/2 | CGGGGGUUCUGCCAGAAGGUGGCC | CGGGGGUUCUGCCAGAAGGUGGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mG*mGmGGUmUmCUmGCmCAGAAmGGUGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791940-142791964 |
| G028961 | 232 | TRBC1/2 | CCUUCUGGCAGAACCCCCGCAACC | CCUUCUGGCAGAACCCCCGCAACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mUmCUGmGmCAmGAmACCCCmCGCAmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791945-142791969 |
| G028962 | 233 | TRBC1/2 | UGGUUGCGGGGGUUCUGCCAGAAG | UGGUUGCGGGGGUUCUGCCAGAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mUmUGCmGmGGmGGmUUCUGmCCAGmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142791946-142791970 |
| G028963 | 234 | TRBC1/2 | CUGGGUCCACUCGUCAUUCUCCGA | CUGGGUCCACUCGUCAUUCUCCGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mGmGUCmCmACmUCmGUCAUmUCUCmCGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792001-142792025 |
| G028964 | 235 | TRBC1/2 | CCUGGGUCCACUCGUCAUUCUCCG | CCUGGGUCCACUCGUCAUUCUCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmGGUmCmCAmCUmCGUCAmUUCUmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792002-142792026 |
| G028965 | 236 | TRBC1/2 | GAGAAUGACGAGUGGACCCAGGAU | GAGAAUGACGAGUGGACCCAGGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mAmAUGmAmCGmAGmUGGACmCCAGmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792004-142792028 |
| G028966 | 237 | TRBC1/2 | UGACGAGUGGACCCAGGAUAGGGC | UGACGAGUGGACCCAGGAUAGGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mA*mCmGAGmUmGGmACmCCAGGmAUAGmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792009-142792033 |
| G028967 | 238 | TRBC1/2 | GCCCUAUCCUGGGUCCACUCGUCA | GCCCUAUCCUGGGUCCACUCGUCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mCmUAUmCmCUmGGmGUCCAmCUCGmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792009-142792033 |
| G028971 | 239 | TRBC1/2 | AGGCCUGGGGUAGAGCAGGUGAGU | AGGCCUGGGGUAGAGCAGGUGAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mCmCUGmGmGGmUAmGAGCAmGGUGmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792062-142792086 |
| G028972 | 240 | TRBC1/2 | AGGCCCCACUCACCUGCUCUACCC | AGGCCCCACUCACCUGCUCUACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mCmCCCmAmCUmCAmCCUGCmUCUAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792069-142792093 |
| G028973 | 241 | TRBC1/2 | GAGCAGGUGAGUGGGGCCUGGGGA | GAGCAGGUGAGUGGGGCCUGGGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mCmAGGmUmGAmGUmGGGGCmCUGGmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792074-142792098 |
| G028974 | 242 | TRBC1/2 | UCCCCAGGCCCCACUCACCUGCUC | UCCCCAGGCCCCACUCACCUGCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mCmCAGmGmCCmCCmACUCAmCCUGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792074-142792098 |
| G028975 | 243 | TRBC1/2 | CUCCCCAGGCCCCACUCACCUGCU | CUCCCCAGGCCCCACUCACCUGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mCmCCAmGmGCmCCmCACUCmACCUmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792075-142792099 |
| G028976 | 244 | TRBC1/2 | UCUCCCCAGGCCCCACUCACCUGC | UCUCCCCAGGCCCCACUCACCUGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mCmCCCmAmGGmCCmCCACUmCACCmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792076-142792100 |
| G028988 | 245 | TRBC1/2 | ACCAGCAAGGGGUCCUGUCUGCCA | ACCAGCAAGGGGUCCUGUCUGCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mAmGCAmAmGGmGGmUCCUGmUCUGmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142792697-142792721 |
| G027904 | 246 | TRBC2 | CCACACCCAAAAGGCCACAC | CCACACCCAAAAGGCCACACGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGUGCU | mC*mC*mA*CACCCAAAAGGCCACACGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | chr7:142801104-142801124 |
| G028994 | 247 | TRBC2 | CACAGACCCGCAGCCCCUCAAGGA | CACAGACCCGCAGCCCCUCAAGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmGACmCmCGmCAmGCCCCmUCAAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801209-142801233 |
| G028995 | 248 | TRBC2 | ACAGACCCGCAGCCCCUCAAGGAG | ACAGACCCGCAGCCCCUCAAGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mGmACCmCmGCmAGmCCCCUmCAAGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801210-142801234 |
| G028996 | 249 | TRBC2 | UGGACCCAGGAUAGGGCCAAACCU | UGGACCCAGGAUAGGGCCAAACCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mAmCCCmAmGGmAUmAGGGCmCAAAmCCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801363-142801387 |
| G028997 | 250 | TRBC2 | GGACCCAGGAUAGGGCCAAACCUG | GGACCCAGGAUAGGGCCAAACCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mCmCCAmGmGAmUAmGGGCCmAAACmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801364-142801388 |
| G028998 | 251 | TRBC2 | GCCAAACCUGUCACCCAGAUCGUC | GCCAAACCUGUCACCCAGAUCGUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mAmAACmCmUGmUCmACCCAmGAUCmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801378-142801402 |
| G028999 | 252 | TRBC2 | CCUGUCACCCAGAUCGUCAGCGCC | CCUGUCACCCAGAUCGUCAGCGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmUCAmCmCCmAGmAUCGUmCAGCmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801384-142801408 |
| G029000 | 253 | TRBC2 | CCCUGUUUUCUUUCAGACUGUGGC | CCCUGUUUUCUUUCAGACUGUGGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mUmGUUmUmUCmUUmUCAGAmCUGUmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801927-142801951 |
| G029001 | 254 | TRBC2 | UGUUUUCUUUCAGACUGUGGCUUC | UGUUUUCUUUCAGACUGUGGCUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mU*mUmUUCmUmUUmCAmGACUGmUGGCmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801930-142801954 |
| G029002 | 255 | TRBC2 | UGGCUUCACCUCCGGUAAGUGAGU | UGGCUUCACCUCCGGUAAGUGAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmUUCmAmCCmUCmCGGUAmAGUGmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801947-142801971 |
| G029003 | 256 | TRBC2 | AGGAGAGACUCACUUACCGGAGGU | AGGAGAGACUCACUUACCGGAGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mAmGAGmAmCUmCAmCUUACmCGGAmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142801954-142801978 |
| G029004 | 257 | TRBC2 | CUGUUGACAAGAACAGAGCAUGUA | CUGUUGACAAGAACAGAGCAUGUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mUmUGAmCmAAmGAmACAGAmGCAUmGUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802080-142802104 |
| G029005 | 258 | TRBC2 | UGUCAACAGAGUCUUACCAGCAAG | UGUCAACAGAGUCUUACCAGCAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mU*mCmAACmAmGAmGUmCUUACmCAGCmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802095-142802119 |
| G029006 | 259 | TRBC2 | GAGUCUUACCAGCAAGGGGUCCUG | GAGUCUUACCAGCAAGGGGUCCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mUmCUUmAmCCmAGmCAAGGmGGUCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802103-142802127 |
| G029007 | 260 | TRBC2 | UCUUACCAGCAAGGGGUCCUGUCU | UCUUACCAGCAAGGGGUCCUGUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mUmACCmAmGCmAAmGGGGUmCCUGmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802106-142802130 |
| G029008 | 261 | TRBC2 | ACCAUGGCCAUCAGCACGAGGGCA | ACCAUGGCCAUCAGCACGAGGGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mAmUGGmCmCAmUCmAGCACmGAGGmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802189-142802213 |
| G029009 | 262 | TRBC2 | UCUCUUCCACAGGUCAAGAGAAAG | UCUCUUCCACAGGUCAAGAGAAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mCmUUCmCmACmAGmGUCAAmGAGAmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802490-142802514 |
| G029010 | 263 | TRBC2 | UCAAGAGAAAGGAUUCCAGAGGCU | UCAAGAGAAAGGAUUCCAGAGGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mAmGAGmAmAAmGGmAUUCCmAGAGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802503-142802527 |
| G029011 | 264 | TRBC2 | AGCUAGCCUCUGGAAUCCUUUCUC | AGCUAGCCUCUGGAAUCCUUUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mUmAGCmCmUCmUGmGAAUCmCUUUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802507-142802531 |
| G029012 | 265 | TRBC2 | GGAUGGUUUUGGAGCUAGCCUCUG | GGAUGGUUUUGGAGCUAGCCUCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mUmGGUmUmUUmGGmAGCUAmGCCUmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr7:142802519-142802543 |
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。術語A*、C*、U*或G*可用於表示利用硫代磷酸酯(PS)鍵連接至下一(例如，3')核苷酸之核苷酸。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 201-265之指導序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列係選自SEQ ID NO: 201-265之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 201-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 201-265之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 3中所列基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自
表 3中所列範圍的5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，TRBC指導RNA可包含選自以下基因體坐標內之10個鄰接核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714及chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；及chr7:142791939-142791963；chr7:142791756-142791780；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-142802130；包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含
表 3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列與選自以下序列之序列至少95%、90%或85%一致，該序列係包含
表 3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 3中所列基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 3中所列基因體坐標之至少24個鄰接核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 201。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 202。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 203。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 204。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 205。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 206。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 207。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 208。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 209。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 210。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 211。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 212。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 213。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 214。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 215。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 216。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 217。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 218。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 219。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 220。在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含SEQ ID NO: 221。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 222。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 223。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 224。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 225。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 226。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 227。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 228。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 229。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 230。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 231。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 232。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 233。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 234。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 235。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 236。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 237。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 238。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 239。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 240。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 241。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 242。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 243。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 244。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO. 245。
在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 246。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 247。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 248。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 249。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 250。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 251。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 252。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 253。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 254。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 255。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 256。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 257。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 258。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 259。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 260。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 261。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 262。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 263。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 264。在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO. 265。
在一些實施例中，TRBC1指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 215-216。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含選自SEQ ID NO: 223-224及229-230之核苷酸。
在一些實施例中，TRBC2指導RNA包含SEQ ID NO: 246及259-260中任一者之指導序列。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、259及260中任一者之指導序列。
在一些實施例中，TRBC指導RNA包含表3中所列之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 201-265中任一者之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 201-265中任一者之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 215之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 1201-1265中任一者之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 1215之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 2201-2265及3005中任一者之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 2215或3005之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 2215之序列。在一些實施例中，TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 3005之序列。
在一些實施例中，TRBC指導RNA係單指導RNA (sgRNA)，其包含表3中所列任一sgRNA序列之序列。
本文提供TRBC指導RNA之額外實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
1. 對 TRBC 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中TRBC1基因之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。在一些實施例中，對TRBC1之遺傳修飾降低或消除經遺傳修飾之細胞(或經工程改造之細胞)表面上TRBC1蛋白之表現。遺傳修飾涵蓋由與基因體編輯系統(例如，由Cas9及TRBC1指導RNA產生之編輯子群體，或由BC22及TRBC1指導RNA產生之編輯子群體)接觸而產生之修飾群體。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中TRBC2基因之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。在一些實施例中，對TRBC2之遺傳修飾降低或消除經遺傳修飾之細胞(或經工程改造之細胞)表面上TRBC2蛋白之表現。遺傳修飾涵蓋由與基因體編輯系統(例如，由Cas9及TRBC2指導RNA產生之編輯子群體，或由BC22及TRBC2指導RNA產生之編輯子群體)接觸而產生之修飾群體。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149或(b) chr7:142801104-142802543。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自表3中所列之任何基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142792690-142792714及chr7:142792693-142792717。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714及chr7:142792693-142792717。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714及chr7:142792693-142792717。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963及chr7:142791756-142791780。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963及chr7:142791756-142791780。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963及chr7:142791756-142791780。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-142802130。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-142802130。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-142802130。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr7:142792690-142792714及chr7:142792693-142792717；(b) chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963及chr7:142791756-142791780；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-142802130。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
在一些實施例中，對TRBC之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺中之任一者或多者。在一些實施例中，對TRBC之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對TRBC之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對TRBC之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對TRBC之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對TRBC之修飾包含插入/缺失，該插入/缺失通常在此項技術中定義為小於1000鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對TRBC之修飾包含導致靶序列中之框移突變之插入/缺失。在一些實施例中，對TRBC之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，對TRBC之修飾包含由併入模板核酸引起之核苷酸插入、缺失或取代中之一或多種。在一些實施例中，對TRBC之修飾並非瞬時的。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物使用RNA指導之DNA結合劑(例如，Cas酶)修飾細胞中之TRBC基因。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑在TRBC1基因內切割，其中TRBC1指導RNA靶向包含chr7:142791862-142793149之至少10個鄰接核苷酸之TRBC1基因體靶序列。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑在TRBC2基因內切割，其中TRBC3指導RNA靶向包含chr7:142801104-142802543內之至少10個鄰接核苷酸之TRBC2基因體靶序列。
在一些實施例中，對TRBC之遺傳修飾導致利用框外終止密碼子。在一些實施例中，對TRBC之遺傳修飾導致剪接期間之外顯子跳躍。在一些實施例中，對TRBC1之遺傳修飾導致細胞之降低或消除之TRBC1蛋白表現。在一些實施例中，對TRBC1基因之修飾導致細胞表面上降低或消除之TRBC1蛋白表現。在一些實施例中，對TRBC2之遺傳修飾導致細胞之降低或消除之TRBC2蛋白表現。在一些實施例中，對TRBC2基因之修飾導致細胞表面上消除之TRBC2蛋白表現。
在一些實施例中，細胞表面上之TRBC1表現由於對TRBC1之遺傳修飾而降低。在一些實施例中，細胞表面上之TRBC1表現由於對TRBC1之遺傳修飾而缺失。
在一些實施例中，細胞表面上之TRBC2表現由於對TRBC2之遺傳修飾而降低。在一些實施例中，細胞表面上之TRBC2表現由於對TRBC2之遺傳修飾而缺失。
2. TRBC 指導 RNA 之功效
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，確定TRBC gRNA之功效。在一些實施例中，TRBC gRNA與RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白，例如Cas9)一起表現。在一些實施例中，TRBC gRNA經遞送至或表現於已穩定表現RNA指導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之細胞株中。在一些實施例中，將TRBC gRNA作為RNP之一部分遞送至細胞中。在一些實施例中，將TRBC gRNA連同編碼RNA指導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的mRNA一起遞送至細胞中。
如本文所述，使用本文所揭示之RNA指導之DNA核酸酶及TRBC指導RNA可導致DNA中之雙股斷裂，此可在由細胞機制修復後產生插入/缺失(插入/缺失)突變形式之錯誤。許多由插入/缺失引起之突變改變閱讀框或引入過早終止密碼子，且因此產生非功能性蛋白。
在一些實施例中，基於體外模型來確定特定TRBC gRNA之功效。在一些實施例中，體外模型係穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，體外模型係周邊血單核細胞(PBMC)。在一些實施例中，體外模型係T細胞，諸如原代人類T細胞。關於使用原代細胞，可使用市售原代細胞來提供實驗之間更大的一致性。在一些實施例中，在體外模型(例如，在T細胞中)中發生缺失或插入之脫靶位點之數目係例如藉由分析來自用Cas9 mRNA及指導RNA在體外轉染之細胞的基因體DNA來確定。在一些實施例中，該確定包括分析來自用Cas9 mRNA、TRBC指導RNA及供體寡核苷酸在體外轉染之細胞的基因體DNA。工作實例中提供該等確定之例示性程序，其中使用HEK293細胞、PBMC及人類CD3
+T細胞。
在一些實施例中，在用於gRNA選擇過程之多個體外細胞模型中確定特定TRBC gRNA之功效。在一些實施例中，實施資料與所選TRBC gRNA之細胞株比較。在一些實施例中，實施多細胞模型中的交叉篩選。
在一些實施例中，藉由TRBC之插入/缺失百分比來量測TRBC指導RNA之功效。在一些實施例中，將TRBC之編輯百分比與達成TRBC蛋白產物敲低所必需之插入/缺失百分比進行比較。
在一些實施例中，藉由T細胞受體(TCR)之降低或消除之表現來量測指導RNA之功效。在實施例中，T細胞受體(TCR)組分之降低或消除之表現包括TRBC之降低或消除之表現。在一些實施例中，TCR之該組分之該降低或消除之表現係將一或多種(例如一或兩種，例如一種)針對該TCR之該組分的本文所述之TRBC gRNA分子引入該細胞中的結果。在實施例中，藉由流式細胞術來量測該降低或消除之TCR組分之表現，例如如本文中所述。
在一些實施例中，藉由靶細胞類型(諸如T細胞)基因體內脫靶序列處的插入/缺失之數目及/或頻率來量測TRBC指導RNA之功效。在一些實施例中，提供有效的指導RNA，其以極低頻率(例如，＜ 5%)在細胞群體中及/或相對於靶位點處插入/缺失之生成頻率在脫靶位點處產生插入/缺失。因此，本揭示案提供在靶細胞類型(例如，T細胞)中不展現脫靶插入/缺失形成或在細胞群體中及/或相對於靶位點處插入/缺失之生成頻率產生＜ 5%之脫靶插入/缺失形成頻率的指導RNA。在一些實施例中，本揭示案提供在靶細胞類型(例如，T細胞)中不展現任何脫靶插入/缺失形成之指導RNA。在一些實施例中，提供例如如藉由本文所述之一或多種方法所評價在少於5個脫靶位點處產生插入/缺失的指導RNA。在一些實施例中，提供例如如藉由本文所述之一或多種方法所評價在少於或等於4、3、2或1個脫靶位點處產生插入/缺失的指導RNA。在一些實施例中，一或多個脫靶位點不出現在靶細胞(例如，肝細胞)基因體中之蛋白編碼區中。
在一些實施例中，偵測基因編輯事件(諸如靶DNA中之形成插入/缺失(「插入/缺失」)突變及同源定向修復(HDR)事件)利用帶有標記引子之線性擴增及分離經標記擴增產物(下文稱為「LAM-PCR」或「線性擴增(LA)」方法)。
在一些實施例中，藉由包含基因表現之蛋白產物的功能性蛋白複合物之水準來量測指導RNA之功效。在一些實施例中，藉由TCR表現之流式細胞術分析來量測指導RNA之功效，藉由流式細胞術分析經編輯的活細胞群體之TCR損失。
F. CIITA 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於降低細胞表面上之MHC II類蛋白表現之CIITA指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至CIITA基因體靶序列且可在本文中稱為「CIITA指導RNA」。在一些實施例中，CIITA指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類CIITA基因體靶序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含CIITA指導RNA，該CIITA指導RNA包含靶向CIITA基因體靶序列之指導序列，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含CIITA指導RNA，該CIITA指導RNA包含靶向CIITA基因體靶序列之指導序列，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含CIITA指導RNA，該CIITA指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑在CIITA基因中進行切割之指導序列，其中該CIITA指導RNA靶向CIITA基因體靶序列，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含CIITA指導RNA，該CIITA指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑在CIITA基因中進行切割之指導序列，其中該CIITA指導RNA靶向CIITA基因體靶序列，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，該等方法及組成物揭示CIITA指導RNA，該CIITA指導RNA引導RNA指導之DNA結合劑誘導CIITA基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)。在一些實施例中，該等方法及組成物揭示引導RNA指導之DNA結合劑在CIITA基因體靶序列中進行切割之CIITA指導RNA。在RNA指導之DNA切割劑係Cas9之實施例中，切割或「切割位點」出現在原型間隔物毗鄰模體(PAM)序列之第三個鹼基處。
在一些實施例中，提供包含本文所述之CIITA指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含CIITA單指導RNA (sgRNA)之組成物，該CIITA sgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，提供包含本文所述之CIITA sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含CIITA雙指導RNA (dgRNA)之組成物，該CIITA dgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，提供包含本文所述之CIITA dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
例示性CIITA指導序列示於下
表 4中。
表 4. 例示性 CIITA 指導序列 .
| 指導ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1301 、1302 、1304-1576) | 例示性指導RNA 修飾序列(SEQ ID NO: 2301 、2302 、2304-2576 及3016-3205) | SEQ ID NO | 基因體坐標(hg38) |
| G026584 | 301 | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCA | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mAmAGUmAmCCmCUmACAGGmAGGAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2301 | chr16:10907504-10907528 |
| G026585 | 302 | AGUACCCUACAGGAGGACCAGUUC | AGUACCCUACAGGAGGACCAGUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mU*mAmCCCmUmACmAGmGAGGAmCCAGmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2302 | chr16:10907508-10907532 |
| G029013 | 304 | UACCUGUCAGAGCCCCAAGGUAAA | UACCUGUCAGAGCCCCAAGGUAAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mCmUGUmCmAGmAGmCCCCAmAGGUmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2304 | chr16:10877363-10877387 |
| G029014 | 305 | UUUACCUUGGGGCUCUGACAGGUA | UUUACCUUGGGGCUCUGACAGGUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mU*mAmCCUmUmGGmGGmCUCUGmACAGmGUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2305 | chr16:10877363-10877387 |
| G029015 | 306 | UUUUACCUUGGGGCUCUGACAGGU | UUUUACCUUGGGGCUCUGACAGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mU*mUmACCmUmUGmGGmGCUCUmGACAmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2306 | chr16:10877364-10877388 |
| G029016 | 307 | GCCUGGGAGGGAAGACAAUGCUCA | GCCUGGGAGGGAAGACAAUGCUCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mUmGGGmAmGGmGAmAGACAmAUGCmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2307 | chr16:10895259-10895283 |
| G029017 | 308 | UCUUCCCUCCCAGGCAGCUCACAG | UCUUCCCUCCCAGGCAGCUCACAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mUmCCCmUmCCmCAmGGCAGmCUCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2308 | chr16:10895268-10895292 |
| G029018 | 309 | UCCCUCCCAGGCAGCUCACAGUGU | UCCCUCCCAGGCAGCUCACAGUGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mCmUCCmCmAGmGCmAGCUCmACAGmUGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2309 | chr16:10895271-10895295 |
| G029019 | 310 | CUCACAGUGUGCCACCAUGGAGUU | CUCACAGUGUGCCACCAUGGAGUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mAmCAGmUmGUmGCmCACCAmUGGAmGUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2310 | chr16:10895285-10895309 |
| G029020 | 311 | UCACAGUGUGCCACCAUGGAGUUG | UCACAGUGUGCCACCAUGGAGUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mCmAGUmGmUGmCCmACCAUmGGAGmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2311 | chr16:10895286-10895310 |
| G029021 | 312 | CACAGUGUGCCACCAUGGAGUUGG | CACAGUGUGCCACCAUGGAGUUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmGUGmUmGCmCAmCCAUGmGAGUmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2312 | chr16:10895287-10895311 |
| G029022 | 313 | GAAGAGAUUGAGCUCUACUCAGGU | GAAGAGAUUGAGCUCUACUCAGGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mA*mGmAGAmUmUGmAGmCUCUAmCUCAmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2313 | chr16:10895406-10895430 |
| G029023 | 314 | ACCUGAGUAGAGCUCAAUCUCUUC | ACCUGAGUAGAGCUCAAUCUCUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mUmGAGmUmAGmAGmCUCAAmUCUCmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2314 | chr16:10895406-10895430 |
| G029024 | 315 | GAGAUUGAGCUCUACUCAGGUGGG | GAGAUUGAGCUCUACUCAGGUGGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mAmUUGmAmGCmUCmUACUCmAGGUmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2315 | chr16:10895409-10895433 |
| G029025 | 316 | AUUGAGCUCUACUCAGGUGGGCCC | AUUGAGCUCUACUCAGGUGGGCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mU*mGmAGCmUmCUmACmUCAGGmUGGGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2316 | chr16:10895412-10895436 |
| G029026 | 317 | UUGAGCUCUACUCAGGUGGGCCCU | UUGAGCUCUACUCAGGUGGGCCCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mG*mAmGCUmCmUAmCUmCAGGUmGGGCmCCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2317 | chr16:10895413-10895437 |
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| G029064 | 355 | ACACCUGGCUUCCAGUGCUUCAGG | ACACCUGGCUUCCAGUGCUUCAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mCmCUGmGmCUmUCmCAGUGmCUUCmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2355 | chr16:10901538-10901562 |
| G029065 | 356 | CAGCCCACCUGCCCUGCACACCUG | CAGCCCACCUGCCCUGCACACCUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mCmCCAmCmCUmGCmCCUGCmACACmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2356 | chr16:10901555-10901579 |
| G029066 | 357 | CACAGCCCACUUCCUCACAGCUGA | CACAGCCCACUUCCUCACAGCUGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmGCCmCmACmUUmCCUCAmCAGCmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2357 | chr16:10902017-10902041 |
| G029067 | 358 | ACAGCCCACUUCCUCACAGCUGAG | ACAGCCCACUUCCUCACAGCUGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mGmCCCmAmCUmUCmCUCACmAGCUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2358 | chr16:10902018-10902042 |
| G029068 | 359 | CUGCCUGCGCUGUUCAACCAGGAG | CUGCCUGCGCUGUUCAACCAGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mCmCUGmCmGCmUGmUUCAAmCCAGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2359 | chr16:10902114-10902138 |
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| G029070 | 361 | CGCUGUUCAACCAGGAGCCAGCCU | CGCUGUUCAACCAGGAGCCAGCCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mUmGUUmCmAAmCCmAGGAGmCCAGmCCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2361 | chr16:10902121-10902145 |
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| G029072 | 363 | GCCUCCGGCCAGAUGCGCCUGGAG | GCCUCCGGCCAGAUGCGCCUGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mUmCCGmGmCCmAGmAUGCGmCCUGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2363 | chr16:10902141-10902165 |
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| G029078 | 369 | UCUCCCUGAGGGACCCAUCCAGUU | UCUCCCUGAGGGACCCAUCCAGUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mCmCCUmGmAGmGGmACCCAmUCCAmGUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2369 | chr16:10902691-10902715 |
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| G029088 | 379 | UCACCAUGGUAGAUGAAUAUACUG | UCACCAUGGUAGAUGAAUAUACUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mCmCAUmGmGUmAGmAUGAAmUAUAmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2379 | chr16:10902781-10902805 |
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| G029099 | 390 | AGGUGAGGUGCCCCAGGCCAGCCA | AGGUGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mUmGAGmGmUGmCCmCCAGGmCCAGmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2390 | chr16:10903728-10903752 |
| G029100 | 391 | GGUGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAA | GGUGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mGmAGGmUmGCmCCmCAGGCmCAGCmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2391 | chr16:10903729-10903753 |
| G029101 | 392 | GUGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAAG | GUGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mAmGGUmGmCCmCCmAGGCCmAGCCmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2392 | chr16:10903730-10903754 |
| G029102 | 393 | UGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAAGU | UGAGGUGCCCCAGGCCAGCCAAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mA*mGmGUGmCmCCmCAmGGCCAmGCCAmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2393 | chr16:10903731-10903755 |
| G029103 | 394 | GGUGCCCCAGGCCAGCCAAGUACC | GGUGCCCCAGGCCAGCCAAGUACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mGmCCCmCmAGmGCmCAGCCmAAGUmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2394 | chr16:10903734-10903758 |
| G029104 | 395 | GUGCCCCAGGCCAGCCAAGUACCC | GUGCCCCAGGCCAGCCAAGUACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mG*mCmCCCmAmGGmCCmAGCCAmAGUAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2395 | chr16:10903735-10903759 |
| G029105 | 396 | AAGUACCCCCUCCCAGUGGAUUCA | AAGUACCCCCUCCCAGUGGAUUCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mUmACCmCmCCmUCmCCAGUmGGAUmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2396 | chr16:10903751-10903775 |
| G029106 | 397 | CCUCCCGAGCAAACAUGACAGGUA | CCUCCCGAGCAAACAUGACAGGUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mCmCCGmAmGCmAAmACAUGmACAGmGUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2397 | chr16:10903874-10903898 |
| G029107 | 398 | CUCCCGAGCAAACAUGACAGGUAA | CUCCCGAGCAAACAUGACAGGUAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mCmCGAmGmCAmAAmCAUGAmCAGGmUAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2398 | chr16:10903875-10903899 |
| G029108 | 399 | CAAACAUGACAGGUAAGGACCCUU | CAAACAUGACAGGUAAGGACCCUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mA*mAmCAUmGmACmAGmGUAAGmGACCmCUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2399 | chr16:10903883-10903907 |
| G029109 | 400 | UUGUGCUCUGGAGAUGGAGAAGCA | UUGUGCUCUGGAGAUGGAGAAGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mG*mUmGCUmCmUGmGAmGAUGGmAGAAmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2400 | chr16:10904726-10904750 |
| G029110 | 401 | GCUUCUCCAUCUCCAGAGCACAAG | GCUUCUCCAUCUCCAGAGCACAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mUmCUCmCmAUmCUmCCAGAmGCACmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2401 | chr16:10904727-10904751 |
| G029111 | 402 | CUUCUCCAUCUCCAGAGCACAAGA | CUUCUCCAUCUCCAGAGCACAAGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mCmUCCmAmUCmUCmCAGAGmCACAmAGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2402 | chr16:10904728-10904752 |
| G029112 | 403 | UUCUCCAUCUCCAGAGCACAAGAC | UUCUCCAUCUCCAGAGCACAAGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mC*mUmCCAmUmCUmCCmAGAGCmACAAmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2403 | chr16:10904729-10904753 |
| G029113 | 404 | UCUCCAUCUCCAGAGCACAAGACG | UCUCCAUCUCCAGAGCACAAGACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mCmCAUmCmUCmCAmGAGCAmCAAGmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2404 | chr16:10904730-10904754 |
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| G029115 | 406 | CAUCUCCAGAGCACAAGACGUCCC | CAUCUCCAGAGCACAAGACGUCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mU*mCmUCCmAmGAmGCmACAAGmACGUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2406 | chr16:10904734-10904758 |
| G029116 | 407 | AGAGCACAAGACGUCCCCCACCCA | AGAGCACAAGACGUCCCCCACCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mGmCACmAmAGmACmGUCCCmCCACmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2407 | chr16:10904741-10904765 |
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| G029119 | 410 | CCAGGCCAUUUUGGAAGCUUGUUG | CCAGGCCAUUUUGGAAGCUUGUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmGCCmAmUUmUUmGGAAGmCUUGmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2410 | chr16:10904789-10904813 |
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| G029122 | 413 | CCUUUGCAGAGCCGGUGGAGCAGU | CCUUUGCAGAGCCGGUGGAGCAGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mUmUGCmAmGAmGCmCGGUGmGAGCmAGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2413 | chr16:10906489-10906513 |
| G029123 | 414 | UAGAACUGCUCCACCGGCUCUGCA | UAGAACUGCUCCACCGGCUCUGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mG*mAmACUmGmCUmCCmACCGGmCUCUmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2414 | chr16:10906493-10906517 |
| G029124 | 415 | UACCGCUCACUGCAGGACACGUAU | UACCGCUCACUGCAGGACACGUAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mCmGCUmCmACmUGmCAGGAmCACGmUAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2415 | chr16:10906515-10906539 |
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| G029126 | 417 | UCACUGCAGGACACGUAUGGUGCC | UCACUGCAGGACACGUAUGGUGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mCmUGCmAmGGmACmACGUAmUGGUmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2417 | chr16:10906521-10906545 |
| G029127 | 418 | AGGACACGUAUGGUGCCGAGCCCG | AGGACACGUAUGGUGCCGAGCCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mAmCACmGmUAmUGmGUGCCmGAGCmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2418 | chr16:10906528-10906552 |
| G029128 | 419 | GCCCAGUCCGGGGUGGCCAGUUCC | GCCCAGUCCGGGGUGGCCAGUUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mCmAGUmCmCGmGGmGUGGCmCAGUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2419 | chr16:10906631-10906655 |
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| G029137 | 428 | GCUCACUGCCCCAGCCCAAUAGCU | GCUCACUGCCCCAGCCCAAUAGCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mCmACUmGmCCmCCmAGCCCmAAUAmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2428 | chr16:10906770-10906794 |
| G029138 | 429 | AAGCCCAGGCCCGGCUCACUGCCC | AAGCCCAGGCCCGGCUCACUGCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mCmCCAmGmGCmCCmGGCUCmACUGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2429 | chr16:10906783-10906807 |
| G029139 | 430 | CAAGCCCAGGCCCGGCUCACUGCC | CAAGCCCAGGCCCGGCUCACUGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mA*mGmCCCmAmGGmCCmCGGCUmCACUmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2430 | chr16:10906784-10906808 |
| G029140 | 431 | GCCACAAGCCCAGGCCCGGCUCAC | GCCACAAGCCCAGGCCCGGCUCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mAmCAAmGmCCmCAmGGCCCmGGCUmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2431 | chr16:10906788-10906812 |
| G029141 | 432 | GGCCACAAGCCCAGGCCCGGCUCA | GGCCACAAGCCCAGGCCCGGCUCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mC*mCmACAmAmGCmCCmAGGCCmCGGCmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2432 | chr16:10906789-10906813 |
| G029142 | 433 | CGGCCACAAGCCCAGGCCCGGCUC | CGGCCACAAGCCCAGGCCCGGCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mG*mG*mCmCACmAmAGmCCmCAGGCmCCGGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2433 | chr16:10906790-10906814 |
| G029143 | 434 | UUCCCCAGUACGACUUUGUCUUCU | UUCCCCAGUACGACUUUGUCUUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mC*mCmCCAmGmUAmCGmACUUUmGUCUmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2434 | chr16:10906816-10906840 |
| G029144 | 435 | UCCCCAGUACGACUUUGUCUUCUC | UCCCCAGUACGACUUUGUCUUCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mCmCAGmUmACmGAmCUUUGmUCUUmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2435 | chr16:10906817-10906841 |
| G029145 | 436 | CCCCAGUACGACUUUGUCUUCUCU | CCCCAGUACGACUUUGUCUUCUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mCmAGUmAmCGmACmUUUGUmCUUCmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2436 | chr16:10906818-10906842 |
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| G029177 | 468 | GUCCAACACCCACCGCGGGCCGCA | GUCCAACACCCACCGCGGGCCGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mC*mCmAACmAmCCmCAmCCGCGmGGCCmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2468 | chr16:10907574-10907598 |
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| G029180 | 471 | UCGCCACUCAGAGCCAGCCACAGG | UCGCCACUCAGAGCCAGCCACAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mG*mCmCACmUmCAmGAmGCCAGmCCACmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2471 | chr16:10907648-10907672 |
| G029181 | 472 | UUCGCCACUCAGAGCCAGCCACAG | UUCGCCACUCAGAGCCAGCCACAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mC*mGmCCAmCmUCmAGmAGCCAmGCCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2472 | chr16:10907649-10907673 |
| G029182 | 473 | UUUCGCCACUCAGAGCCAGCCACA | UUUCGCCACUCAGAGCCAGCCACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mU*mCmGCCmAmCUmCAmGAGCCmAGCCmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2473 | chr16:10907650-10907674 |
| G029183 | 474 | AUUUCGCCACUCAGAGCCAGCCAC | AUUUCGCCACUCAGAGCCAGCCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mU*mUmCGCmCmACmUCmAGAGCmCAGCmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2474 | chr16:10907651-10907675 |
| G029184 | 475 | AAGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCA | AAGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mGmAGCmUmCCmCGmCAGUAmCCUAmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2475 | chr16:10907682-10907706 |
| G029185 | 476 | AGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAU | AGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mAmGCUmCmCCmGCmAGUACmCUAGmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2476 | chr16:10907683-10907707 |
| G029186 | 477 | GGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAUU | GGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mGmCUCmCmCGmCAmGUACCmUAGCmAUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2477 | chr16:10907684-10907708 |
| G029187 | 478 | CCAGCCAGUUGUCAUAGGGCCUCU | CCAGCCAGUUGUCAUAGGGCCUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mGmCCAmGmUUmGUmCAUAGmGGCCmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2478 | chr16:10907722-10907746 |
| G029188 | 479 | GCACGCCCUCCAGCCAGUUGUCAU | GCACGCCCUCCAGCCAGUUGUCAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mA*mCmGCCmCmUCmCAmGCCAGmUUGUmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2479 | chr16:10907731-10907755 |
| G029189 | 480 | CUGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCU | CUGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mGmCUGmGmGCmUGmAUCUUmCCAGmCCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2480 | chr16:10907763-10907787 |
| G029190 | 481 | UGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCUC | UGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmUGGmGmCUmGAmUCUUCmCAGCmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 2481 | chr16:10907764-10907788 |
| G023421 | 482 | UACCGCUCACUGCAGGACACGUAU | UACCGCUCACUGCAGGACACGUAUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mA*mC*mCmGCUmCmACmUGmCAGGAmCACGmUAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2482、3016及3111 | chr16:10906515-10906539 |
| G023422 | 483 | CUCACUGCAGGACACGUAUGGUGC | CUCACUGCAGGACACGUAUGGUGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mAmCUGmCmAGmGAmCACGUmAUGGmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2483、3017及3112 | chr16:10906520-10906544 |
| G023423 | 484 | UCACUGCAGGACACGUAUGGUGCC | UCACUGCAGGACACGUAUGGUGCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mCmUGCmAmGGmACmACGUAmUGGUmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2484、3018及3113 | chr16:10906521-10906545 |
| G023424 | 485 | AGGACACGUAUGGUGCCGAGCCCG | AGGACACGUAUGGUGCCGAGCCCGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mAmCACmGmUAmUGmGUGCCmGAGCmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2485、3019及3114 | chr16:10906528-10906552 |
| G023425 | 486 | GGACACGUAUGGUGCCGAGCCCGC | GGACACGUAUGGUGCCGAGCCCGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mCmACGmUmAUmGGmUGCCGmAGCCmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2486、3020及3115 | chr16:10906529-10906553 |
| G023426 | 487 | AUCCUAGUGGAGGUGGAUCUGGUG | AUCCUAGUGGAGGUGGAUCUGGUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mU*mC*mCmUAGmUmGGmAGmGUGGAmUCUGmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2487、3021及3116 | chr16:10906566-10906590 |
| G023427 | 488 | GCAAGAGCCUGGAGCGGGAACUGG | GCAAGAGCCUGGAGCGGGAACUGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mA*mAmGAGmCmCUmGGmAGCGGmGAACmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2488、3022及3117 | chr16:10906615-10906639 |
| G023428 | 489 | CAAGAGCCUGGAGCGGGAACUGGC | CAAGAGCCUGGAGCGGGAACUGGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mA*mA*mGmAGCmCmUGmGAmGCGGGmAACUmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2489、3023及3118 | chr16:10906616-10906640 |
| G023429 | 490 | GGGCAGAACGGCAGCUGGCCCAAG | GGGCAGAACGGCAGCUGGCCCAAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mCmAGAmAmCGmGCmAGCUGmGCCCmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2490、3024及3119 | chr16:10906651-10906675 |
| G023430 | 491 | GCACAGCAAUCACUCGUGUCUCAC | GCACAGCAAUCACUCGUGUCUCACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mA*mCmAGCmAmAUmCAmCUCGUmGUCUmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2491、3025及3120 | chr16:10906723-10906747 |
| G023431 | 492 | CAAUAGCUCUUGCCCUGACCAGCU | CAAUAGCUCUUGCCCUGACCAGCUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mA*mA*mUmAGCmUmCUmUGmCCCUGmACCAmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2492、3026及3121 | chr16:10906754-10906778 |
| G023432 | 493 | CCAAUAGCUCUUGCCCUGACCAGC | CCAAUAGCUCUUGCCCUGACCAGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mAmUAGmCmUCmUUmGCCCUmGACCmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2493、3027及3122 | chr16:10906755-10906779 |
| G023433 | 494 | AGCCGGGCCUGGGCUUGUGGCCGG | AGCCGGGCCUGGGCUUGUGGCCGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mCmGGGmCmCUmGGmGCUUGmUGGCmCGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2494、3028及3123 | chr16:10906791-10906815 |
| G023434 | 495 | CAGAGAAGACAAAGUCGUACUGGG | CAGAGAAGACAAAGUCGUACUGGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mAmGAAmGmACmAAmAGUCGmUACUmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2495、3029及3124 | chr16:10906819-10906843 |
| G023435 | 496 | AGUACGACUUUGUCUUCUCUGUCC | AGUACGACUUUGUCUUCUCUGUCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mU*mAmCGAmCmUUmUGmUCUUCmUCUGmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2496、3030及3125 | chr16:10906822-10906846 |
| G023436 | 497 | AGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGGCA | AGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGGCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mAmGAUmCmCUmGCmAGGCCmAUAGmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2497、3031及3126 | chr16:10906874-10906898 |
| G023437 | 498 | GCCUAUGGCCUGCAGGAUCUGCUC | GCCUAUGGCCUGCAGGAUCUGCUCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mUmAUGmGmCCmUGmCAGGAmUCUGmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2498、3032及3127 | chr16:10906875-10906899 |
| G023438 | 499 | GAGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGGC | GAGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mCmAGAmUmCCmUGmCAGGCmCAUAmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2499、3033及3128 | chr16:10906875-10906899 |
| G023439 | 500 | CCUAUGGCCUGCAGGAUCUGCUCU | CCUAUGGCCUGCAGGAUCUGCUCUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mAmUGGmCmCUmGCmAGGAUmCUGCmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2500、3034及3129 | chr16:10906876-10906900 |
| G023440 | 501 | AGAGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGG | AGAGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mGmCAGmAmUCmCUmGCAGGmCCAUmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2501、3035及3130 | chr16:10906876-10906900 |
| G023441 | 502 | AAGAGCAGAUCCUGCAGGCCAUAG | AAGAGCAGAUCCUGCAGGCCAUAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mAmGCAmGmAUmCCmUGCAGmGCCAmUAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2502、3036及3131 | chr16:10906877-10906901 |
| G023442 | 503 | GCCUGCAGGAUCUGCUCUUCUCCC | GCCUGCAGGAUCUGCUCUUCUCCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mUmGCAmGmGAmUCmUGCUCmUUCUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2503、3037及3132 | chr16:10906882-10906906 |
| G023443 | 504 | GGAUCUGCUCUUCUCCCUGGGCCC | GGAUCUGCUCUUCUCCCUGGGCCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mUmCUGmCmUCmUUmCUCCCmUGGGmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2504、3038及3133 | chr16:10906889-10906913 |
| G023444 | 505 | CACUCGUGGCGGCCGAUGAGGUUU | CACUCGUGGCGGCCGAUGAGGUUUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmCGUmGmGCmGGmCCGAUmGAGGmUUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2505、3039及3134 | chr16:10906918-10906942 |
| G023445 | 506 | UGAGGUUUUCAGCCACAUCUUGAA | UGAGGUUUUCAGCCACAUCUUGAAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mA*mGmGUUmUmUCmAGmCCACAmUCUUmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2506、3040及3135 | chr16:10906934-10906958 |
| G023446 | 507 | UGAAGAGACCUGACCGCGUUCUGC | UGAAGAGACCUGACCGCGUUCUGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mA*mAmGAGmAmCCmUGmACCGCmGUUCmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2507、3041及3136 | chr16:10906954-10906978 |
| G023447 | 508 | UCGAGGAGCUGGAAGCGCAAGAUG | UCGAGGAGCUGGAAGCGCAAGAUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mG*mAmGGAmGmCUmGGmAAGCGmCAAGmAUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2508、3042及3137 | chr16:10906993-10907017 |
| G023448 | 509 | AGAUGGCUUCCUGCACAGCACGUG | AGAUGGCUUCCUGCACAGCACGUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mUmGGCmUmUCmCUmGCACAmGCACmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2509、3043及3138 | chr16:10907012-10907036 |
| G023449 | 510 | UGGCCGGCCUUUUCCAGAAGAAGC | UGGCCGGCCUUUUCCAGAAGAAGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmCGGmCmCUmUUmUCCAGmAAGAmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2510、3044及3139 | chr16:10907077-10907101 |
| G023450 | 511 | UUCCAGAAGAAGCUGCUCCGAGGU | UUCCAGAAGAAGCUGCUCCGAGGUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mU*mC*mCmAGAmAmGAmAGmCUGCUmCCGAmGGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2511、3045及3140 | chr16:10907088-10907112 |
| G023451 | 512 | UCCAGAAGAAGCUGCUCCGAGGUU | UCCAGAAGAAGCUGCUCCGAGGUUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mAmGAAmGmAAmGCmUGCUCmCGAGmGUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2512、3046及3141 | chr16:10907089-10907113 |
| G023452 | 513 | AGAAGAAGCUGCUCCGAGGUUGCA | AGAAGAAGCUGCUCCGAGGUUGCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mAmGAAmGmCUmGCmUCCGAmGGUUmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2513、3047及3142 | chr16:10907092-10907116 |
| G023453 | 514 | AGAAGCUGCUCCGAGGUUGCACCC | AGAAGCUGCUCCGAGGUUGCACCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mAmGCUmGmCUmCCmGAGGUmUGCAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2514、3048及3143 | chr16:10907095-10907119 |
| G023454 | 515 | CUCCGAGGUUGCACCCUCCUCCUC | CUCCGAGGUUGCACCCUCCUCCUCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mCmGAGmGmUUmGCmACCCUmCCUCmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2515、3049及3144 | chr16:10907103-10907127 |
| G023455 | 516 | AGGUUGCACCCUCCUCCUCACAGC | AGGUUGCACCCUCCUCCUCACAGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mUmUGCmAmCCmCUmCCUCCmUCACmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2516、3050及3145 | chr16:10907108-10907132 |
| G023456 | 517 | CUGGUCCAGAGCCUGAGCAAGGCC | CUGGUCCAGAGCCUGAGCAAGGCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mGmUCCmAmGAmGCmCUGAGmCAAGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2517、3051及3146 | chr16:10907148-10907172 |
| G023457 | 518 | UGGUCCAGAGCCUGAGCAAGGCCG | UGGUCCAGAGCCUGAGCAAGGCCGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mUmCCAmGmAGmCCmUGAGCmAAGGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2518、3052及3147 | chr16:10907149-10907173 |
| G023458 | 519 | AGCAAGGCCGACGCCCUAUUUGAG | AGCAAGGCCGACGCCCUAUUUGAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mAmAGGmCmCGmACmGCCCUmAUUUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2519、3053及3148 | chr16:10907163-10907187 |
| G023459 | 520 | GACGCCCUAUUUGAGCUGUCCGGC | GACGCCCUAUUUGAGCUGUCCGGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mA*mC*mGmCCCmUmAUmUUmGAGCUmGUCCmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2520、3054及3149 | chr16:10907172-10907196 |
| G023460 | 521 | AAGCCGGACAGCUCAAAUAGGGCG | AAGCCGGACAGCUCAAAUAGGGCGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mCmCGGmAmCAmGCmUCAAAmUAGGmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2521、3055及3150 | chr16:10907174-10907198 |
| G023461 | 522 | GAGCUGUCCGGCUUCUCCAUGGAG | GAGCUGUCCGGCUUCUCCAUGGAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mCmUGUmCmCGmGCmUUCUCmCAUGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2522、3056及3151 | chr16:10907184-10907208 |
| G023462 | 523 | AGCUGUCCGGCUUCUCCAUGGAGC | AGCUGUCCGGCUUCUCCAUGGAGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mUmGUCmCmGGmCUmUCUCCmAUGGmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2523、3057及3152 | chr16:10907185-10907209 |
| G023463 | 524 | UCAGGGAUGACAGAGCACCAAGAC | UCAGGGAUGACAGAGCACCAAGACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mGmGGAmUmGAmCAmGAGCAmCCAAmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2524、3058及3153 | chr16:10907244-10907268 |
| G023464 | 525 | CAGAGCACCAAGACAGAGCCCUGA | CAGAGCACCAAGACAGAGCCCUGAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mA*mG*mAmGCAmCmCAmAGmACAGAmGCCCmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2525、3059及3154 | chr16:10907254-10907278 |
| G023465 | 526 | AGCACCAAGACAGAGCCCUGACGC | AGCACCAAGACAGAGCCCUGACGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mC*mAmCCAmAmGAmCAmGAGCCmCUGAmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2526、3060及3155 | chr16:10907257-10907281 |
| G023466 | 527 | GGGACCGGCCACUUCUUCUCAGUC | GGGACCGGCCACUUCUUCUCAGUCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mAmCCGmGmCCmACmUUCUUmCUCAmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2527、3061及3156 | chr16:10907287-10907311 |
| G023467 | 528 | GGCCACUUCUUCUCAGUCACAGCC | GGCCACUUCUUCUCAGUCACAGCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mC*mCmACUmUmCUmUCmUCAGUmCACAmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2528、3062及3157 | chr16:10907293-10907317 |
| G023468 | 529 | ACAGCCCUACUUUGUGCCGGGCAG | ACAGCCCUACUUUGUGCCGGGCAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mGmCCCmUmACmUUmUGUGCmCGGGmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2529、3063及3158 | chr16:10907317-10907341 |
| G023469 | 530 | UGCCGGGCAGUGUGCCAGCUCUCA | UGCCGGGCAGUGUGCCAGCUCUCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mCmGGGmCmAGmUGmUGCCAmGCUCmUCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2530、3064及3159 | chr16:10907331-10907355 |
| G023470 | 531 | GCCGGGCAGUGUGCCAGCUCUCAG | GCCGGGCAGUGUGCCAGCUCUCAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mGmGGCmAmGUmGUmGCCAGmCUCUmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2531、3065及3160 | chr16:10907332-10907356 |
| G023471 | 532 | CCUCCACGCUCACGGGACUCUAUG | CCUCCACGCUCACGGGACUCUAUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mCmCACmGmCUmCAmCGGGAmCUCUmAUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2532、3066及3161 | chr16:10907392-10907416 |
| G023472 | 533 | UCACGGGACUCUAUGUCGGCCUGC | UCACGGGACUCUAUGUCGGCCUGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mCmGGGmAmCUmCUmAUGUCmGGCCmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2533、3067及3162 | chr16:10907401-10907425 |
| G023473 | 534 | UGGGAGCUGGGCCGCAGACAUCAA | UGGGAGCUGGGCCGCAGACAUCAAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mGmAGCmUmGGmGCmCGCAGmACAUmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2534、3068及3163 | chr16:10907484-10907508 |
| G023474 | 535 | GGGAGCUGGGCCGCAGACAUCAAA | GGGAGCUGGGCCGCAGACAUCAAAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mAmGCUmGmGGmCCmGCAGAmCAUCmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2535、3069及3164 | chr16:10907485-10907509 |
| G023475 | 536 | GCAGACAUCAAAGUACCCUACAGG | GCAGACAUCAAAGUACCCUACAGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mA*mGmACAmUmCAmAAmGUACCmCUACmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2536、3070及3165 | chr16:10907497-10907521 |
| G023476 | 537 | AUCAAAGUACCCUACAGGAGGACC | AUCAAAGUACCCUACAGGAGGACCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mU*mC*mAmAAGmUmACmCCmUACAGmGAGGmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2537、3071及3166 | chr16:10907503-10907527 |
| G023477 | 538 | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCA | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mAmAGUmAmCCmCUmACAGGmAGGAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2538、3072及3167 | chr16:10907504-10907528 |
| G023478 | 539 | AGUACCCUACAGGAGGACCAGUUC | AGUACCCUACAGGAGGACCAGUUCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mU*mAmCCCmUmACmAGmGAGGAmCCAGmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2539、3073及3168 | chr16:10907508-10907532 |
| G023479 | 540 | UCCGCAGACGUGAGGACCUGGGCG | UCCGCAGACGUGAGGACCUGGGCGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mC*mC*mGmCAGmAmCGmUGmAGGACmCUGGmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2540、3074及3169 | chr16:10907535-10907559 |
| G023480 | 541 | GGACCUGGGCGAUGGCCAAAGGCU | GGACCUGGGCGAUGGCCAAAGGCUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mCmCUGmGmGCmGAmUGGCCmAAAGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2541、3075及3170 | chr16:10907548-10907572 |
| G023481 | 542 | GGGCGAUGGCCAAAGGCUUAGUCC | GGGCGAUGGCCAAAGGCUUAGUCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mCmGAUmGmGCmCAmAAGGCmUUAGmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2542、3076及3171 | chr16:10907554-10907578 |
| G023482 | 543 | GGCGAUGGCCAAAGGCUUAGUCCA | GGCGAUGGCCAAAGGCUUAGUCCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mC*mGmAUGmGmCCmAAmAGGCUmUAGUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2543、3077及3172 | chr16:10907555-10907579 |
| G023483 | 544 | CGCGGGCCGCAGAGUCCGAGCUGG | CGCGGGCCGCAGAGUCCGAGCUGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mG*mC*mGmGGCmCmGCmAGmAGUCCmGAGCmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2544、3078及3173 | chr16:10907587-10907611 |
| G023484 | 545 | GCGGGCCGCAGAGUCCGAGCUGGC | GCGGGCCGCAGAGUCCGAGCUGGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mG*mGmGCCmGmCAmGAmGUCCGmAGCUmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2545、3079及3174 | chr16:10907588-10907612 |
| G023485 | 546 | CGGGCCGCAGAGUCCGAGCUGGCC | CGGGCCGCAGAGUCCGAGCUGGCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mG*mG*mGmCCGmCmAGmAGmUCCGAmGCUGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2546、3080及3175 | chr16:10907589-10907613 |
| G023486 | 547 | UGAGUGGCGAAAUCAAGGACAAGG | UGAGUGGCGAAAUCAAGGACAAGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mA*mGmUGGmCmGAmAAmUCAAGmGACAmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2547、3081及3176 | chr16:10907662-10907686 |
| G023487 | 548 | GAGUGGCGAAAUCAAGGACAAGGA | GAGUGGCGAAAUCAAGGACAAGGAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mUmGGCmGmAAmAUmCAAGGmACAAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2548、3082及3177 | chr16:10907663-10907687 |
| G023488 | 549 | AAAUCAAGGACAAGGAGCUCCCGC | AAAUCAAGGACAAGGAGCUCCCGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mA*mA*mUmCAAmGmGAmCAmAGGAGmCUCCmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2549、3083及3178 | chr16:10907671-10907695 |
| G023489 | 550 | AAGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCA | AAGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mGmAGCmUmCCmCGmCAGUAmCCUAmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2550、3084及3179 | chr16:10907682-10907706 |
| G023490 | 551 | AGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAU | AGGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mAmGCUmCmCCmGCmAGUACmCUAGmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2551、3085及3180 | chr16:10907683-10907707 |
| G023491 | 552 | GGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAUU | GGAGCUCCCGCAGUACCUAGCAUUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mGmCUCmCmCGmCAmGUACCmUAGCmAUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2552、3086及3181 | chr16:10907684-10907708 |
| G023492 | 553 | GCCCUAUGACAACUGGCUGGAGGG | GCCCUAUGACAACUGGCUGGAGGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mCmUAUmGmACmAAmCUGGCmUGGAmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2553、3087及3182 | chr16:10907726-10907750 |
| G023493 | 554 | UGCCACGCUUUCUGGCUGGGCUGA | UGCCACGCUUUCUGGCUGGGCUGAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mCmACGmCmUUmUCmUGGCUmGGGCmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2554、3088及3183 | chr16:10907752-10907776 |
| G023494 | 555 | ACGCUUUCUGGCUGGGCUGAUCUU | ACGCUUUCUGGCUGGGCUGAUCUUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mC*mG*mCmUUUmCmUGmGCmUGGGCmUGAUmCUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2555、3089及3184 | chr16:10907756-10907780 |
| G023495 | 556 | CUUUCUGGCUGGGCUGAUCUUCCA | CUUUCUGGCUGGGCUGAUCUUCCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mUmCUGmGmCUmGGmGCUGAmUCUUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2556、3090及3185 | chr16:10907759-10907783 |
| G023496 | 557 | CUGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCU | CUGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mGmCUGmGmGCmUGmAUCUUmCCAGmCCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2557、3091及3186 | chr16:10907763-10907787 |
| G023497 | 558 | UGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCUC | UGGCUGGGCUGAUCUUCCAGCCUCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mU*mG*mG*mCmUGGmGmCUmGAmUCUUCmCAGCmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2558、3092及3187 | chr16:10907764-10907788 |
| G023498 | 559 | GGAGCCCUACUCGGGCCAUCGGCG | GGAGCCCUACUCGGGCCAUCGGCGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mGmCCCmUmACmUCmGGGCCmAUCGmGCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2559、3093及3188 | chr16:10907802-10907826 |
| G023499 | 560 | ACAGGAAGCAGAAGGUGCUUGCGA | ACAGGAAGCAGAAGGUGCUUGCGAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mGmGAAmGmCAmGAmAGGUGmCUUGmCGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2560、3094及3189 | chr16:10907839-10907863 |
| G023500 | 561 | GCUUGCGAGGUACCUGAAGCGGCU | GCUUGCGAGGUACCUGAAGCGGCUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mUmGCGmAmGGmUAmCCUGAmAGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2561、3095及3190 | chr16:10907855-10907879 |
| G023501 | 562 | GAAUUUGGCAGCACGUGGUACAGG | GAAUUUGGCAGCACGUGGUACAGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mA*mA*mUmUUGmGmCAmGCmACGUGmGUACmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2562、3096及3191 | chr16:10907950-10907974 |
| G023502 | 563 | AAUUUGGCAGCACGUGGUACAGGA | AAUUUGGCAGCACGUGGUACAGGAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mA*mU*mUmUGGmCmAGmCAmCGUGGmUACAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2563、3097及3192 | chr16:10907951-10907975 |
| G023503 | 564 | AUUUGGCAGCACGUGGUACAGGAG | AUUUGGCAGCACGUGGUACAGGAGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mU*mU*mUmGGCmAmGCmACmGUGGUmACAGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2564、3098及3193 | chr16:10907952-10907976 |
| G023504 | 565 | CCGGCCGCCUCUCUUUUCUGGGCA | CCGGCCGCCUCUCUUUUCUGGGCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mGmCCGmCmCUmCUmCUUUUmCUGGmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2565、3099及3194 | chr16:10907980-10908004 |
| G023505 | 566 | CCUCUCUUUUCUGGGCACCCGCCU | CCUCUCUUUUCUGGGCACCCGCCUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mCmUCUmUmUUmCUmGGGCAmCCCGmCCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2566、3100及3195 | chr16:10907987-10908011 |
| G023506 | 567 | CCUCCUGAUGCACAUGUACUGGGC | CCUCCUGAUGCACAUGUACUGGGCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mCmCUGmAmUGmCAmCAUGUmACUGmGGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2567、3101及3196 | chr16:10908015-10908039 |
| G023507 | 568 | GCCUUGGAGGCGGCGGGCCAAGAC | GCCUUGGAGGCGGCGGGCCAAGACGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mUmUGGmAmGGmCGmGCGGGmCCAAmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2568、3102及3197 | chr16:10908042-10908066 |
| G023508 | 569 | CCUUGGAGGCGGCGGGCCAAGACU | CCUUGGAGGCGGCGGGCCAAGACUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mUmGGAmGmGCmGGmCGGGCmCAAGmACUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2569、3103及3198 | chr16:10908043-10908067 |
| G023509 | 570 | AGGCGGCGGGCCAAGACUUCUCCC | AGGCGGCGGGCCAAGACUUCUCCCGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mCmGGCmGmGGmCCmAAGACmUUCUmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2570、3104及3199 | chr16:10908049-10908073 |
| G023510 | 571 | CGGCGGGCCAAGACUUCUCCCUGG | CGGCGGGCCAAGACUUCUCCCUGGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mG*mG*mCmGGGmCmCAmAGmACUUCmUCCCmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2571、3105及3200 | chr16:10908052-10908076 |
| G023511 | 572 | CCCUGGACCUCCGCAGCACUGGCA | CCCUGGACCUCCGCAGCACUGGCAGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mUmGGAmCmCUmCCmGCAGCmACUGmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2572、3106及3201 | chr16:10908070-10908094 |
| G023512 | 573 | CCUGGACCUCCGCAGCACUGGCAU | CCUGGACCUCCGCAGCACUGGCAUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmGACmCmUCmCGmCAGCAmCUGGmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2573、3107及3202 | chr16:10908071-10908095 |
| G023513 | 574 | CUGGACCUCCGCAGCACUGGCAUU | CUGGACCUCCGCAGCACUGGCAUUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mGmACCmUmCCmGCmAGCACmUGGCmAUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2574、3108及3203 | chr16:10908072-10908096 |
| G023514 | 575 | GGGAGCCUCGUGGGACUCAGCUGU | GGGAGCCUCGUGGGACUCAGCUGUGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mAmGCCmUmCGmUGmGGACUmCAGCmUGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2575、3109及3204 | chr16:10908111-10908135 |
| G023515 | 576 | GGAGCCUCGUGGGACUCAGCUGUG | GGAGCCUCGUGGGACUCAGCUGUGGUUGUAGCUCCCUCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mGmCCUmCmGUmGGmGACUCmAGCUmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | 2576、3110及3205 | chr16:10908112-10908136 |
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。術語A*、C*、U*或G*可用於表示利用硫代磷酸酯(PS)鍵連接至下一(例如，3')核苷酸之核苷酸。如本文所用，「(L1)」係指具有約15-21個原子(例如，約18個原子)之橋接長度之內部連接體，如下文所述，例如參見表28。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之指導序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列係選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 301、302、304-576之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 4中所列基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自
表 4中所列範圍的5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，CIITA指導RNA可包含選自以下之基因體坐標內之10個鄰接核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527及chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913及chr16:10907504-10907528；包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含
表 4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列與選自以下序列之序列至少95%、90%或85%一致，該序列係包含
表 4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 4中所列基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 4中所列基因體坐標之至少24個鄰接核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 302。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 304。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 305。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 306。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 307。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 308。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 309。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 310。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 311。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 312。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 313。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 314。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 315。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 316。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 317。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 318。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 319。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 320。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 321。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 322。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 323。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 324。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 325。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 326。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 327。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 328。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 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497。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 498。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 499。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 500。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 501。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 502。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 503。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 504。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 505。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 506。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 507。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 508。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 509。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 510。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 511。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 512。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 513。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 514。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 515。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 516。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 517。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 518。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 519。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 520。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 521。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 522。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 523。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 524。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 525。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 526。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 527。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 528。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 529。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 530。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 531。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 532。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 533。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 534。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 535。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 536。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 537。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 538。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 539。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 540。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 541。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 542。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 543。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 544。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 545。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 546。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 547。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 548。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 549。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 550。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 551。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 552。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 553。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 554。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 555。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 556。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 557。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 558。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 559。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 560。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 561。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 562。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 563。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 564。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 565。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 566。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 567。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 568。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 569。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 570。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 571。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 572。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 573。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 574。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 575。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 576。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 301-302、320-321、324、326-327、332、354、361、372、400、408、414-415、419-420、422、428、431-432、434、451、455、458、462-464、468、504及538。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301-302、320、372、414、419、422及462-463中任一者之指導序列。
在一些實施例中，CIITA指導RNA包含表4中所列之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301、302、304-576中任一者之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301或422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 301、302、304-576中任一者之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 301或422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 301之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 1301、1302、1304-1576中任一者之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 1301或1422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 1301之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 1422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 2301、2302、2304-2576、3006及3007中任一者之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 2301、2422、3006及3007中任一者之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 2301之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 2422之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 3006之序列。在一些實施例中，CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 3007之序列。
在一些實施例中，CIITA指導RNA係單指導RNA (sgRNA)，其包含表4中所列任一sgRNA序列之序列。
本文提供CIITA指導RNA之額外實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
1. 對 CIITA 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中CIITA基因座之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。此乃因CIITA蛋白調控MHC II類之表現，在一些實施例中，對CIITA之遺傳修飾改變CIITA蛋白之產生，且由此降低經遺傳修飾之細胞(或經工程改造之細胞)表面上MHC II類蛋白之表現。遺傳修飾涵蓋由與基因體編輯系統(例如，由Cas9及CIITA指導RNA產生之編輯子群體，或由BC22及CIITA指導RNA產生之編輯子群體)接觸而產生之修飾群體。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自表4中所列任何基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527及chr16:10907574-10907598。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10906889-10906913及chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527及chr16:10907574-10907598。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527及chr16:10907574-10907598。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906643-10906667；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527及chr16:10907574-10907598。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10906643-10906667；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；及chr16:10907508-10907532。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10906889-10906913及chr16:10907504-10907528。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr16:10906889-10906913及chr16:10907504-10907528。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr16:10906889-10906913及chr16:10907504-10907528。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物修飾細胞中之CIITA基因座，其中對CIITA之修飾包含外源核酸之插入。在一些實施例中，外源核酸係蛋白編碼基因。由外源核酸編碼之蛋白可由細胞表現。
在一些實施例中，對CIITA之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺中之任一者或多者。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對CIITA之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對CIITA之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含插入/缺失，該插入/缺失通常在此項技術中定義為小於1000鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含導致靶序列中之框移突變之插入/缺失。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之取代。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含由併入模板核酸引起之核苷酸插入、缺失或取代中之一或多種。在一些實施例中，對CIITA之修飾包含在靶序列中插入供體核酸。在一些實施例中，對CIITA之修飾並非瞬時的。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物使用RNA指導之DNA結合劑(例如，Cas酶)修飾細胞中之CIITA基因座。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑在CIITA基因內切割，其中CIITA指導RNA靶向包含選自以下之基因體坐標內至少10個鄰接核苷酸之CIITA基因體靶序列：(a) chr16:10877363-10907788及(b) chr16:10906515-10908136。
在一些實施例中，對CIITA之遺傳修飾產生截短形式之CIITA蛋白。在一些實施例中，截短之CIITA蛋白不結合至GTP。在一些實施例中，截短之CIITA蛋白不定位於細胞核。在一些實施例中，與野生型CIITA蛋白之與調控MHC II類表現有關之活性相比，CIITA蛋白(例如，CIITA蛋白之截短形式)具有受損之活性。在一些實施例中，細胞表面上之MHC II類表現由於受損CIITA蛋白活性而降低。在一些實施例中，細胞表面上之MHC II類表現由於受損CIITA蛋白活性而缺失。
2. CIITA 指導 RNA 之功效
可藉由此項技術中可用之技術來確定CIITA指導RNA之功效，該等技術評估靶細胞中指導RNA之編輯效率、CIITA蛋白或mRNA之水準或MHC II類之水準。在一些實施例中，可藉由與未經修飾之細胞比較(或「相對於未經修飾之細胞」)來確定細胞表面上MHC II類蛋白之降低或消除。亦可將經工程改造之細胞或細胞群體與未經修飾之細胞群體進行比較。
在一些實施例中，藉由量測細胞中CIITA蛋白之水準來確定CIITA指導RNA之功效。可藉由例如細胞裂解物及西方墨點(western blot)，利用抗CIITA抗體來偵測CIITA蛋白之水準。在一些實施例中，藉由量測細胞核中CIITA蛋白之水準來確定CIITA指導RNA之功效。在一些實施例中，藉由量測細胞中CIITA mRNA之水準來確定CIITA指導RNA之功效。可藉由例如RT-PCR來偵測CIITA mRNA之水準。在一些實施例中，與未經修飾之細胞相比，靶細胞中CIITA蛋白或CIITA mRNA水準之降低指示有效之CIITA指導RNA。
「一種未經修飾之細胞」(或「多種未經修飾之細胞」)係指實驗或測試中相同細胞類型之一種對照細胞(或多種對照細胞)，其中「未經修飾之」對照細胞尚未與CIITA指導接觸(亦即未經工程改造之細胞)。因此，一種未經修飾之細胞(或多種細胞)可為未與指導RNA接觸之細胞、或已與不靶向CIITA之指導RNA接觸之細胞。
在一些實施例中，藉由量測靶細胞之MHC II類蛋白表現之降低或消除來確定CIITA指導RNA之功效。CIITA蛋白作為反式活化因子發揮作用，活化MHC II類啟動子，且對於MHC II類蛋白之表現至關重要。在一些實施例中，可在靶細胞之表面上偵測到MHC II類蛋白之表現。在一些實施例中，藉由流式細胞術量測MHC II類蛋白表現。在一些實施例中，針對MHC II類蛋白之抗體(例如，抗HLA-DR、-DQ、-DP)可用於偵測MHC II類蛋白之表現，例如藉由流式細胞術。在一些實施例中，與未經修飾之細胞(或未經修飾之細胞群體)相比，細胞(或細胞群體)表面上MHC II類蛋白之降低或消除指示有效之CIITA指導RNA。在一些實施例中，已藉由流式細胞術確定與對MHC II類蛋白為陰性之特定CIITA指導RNA及RNA指導之DNA結合劑接觸之細胞(或細胞群體)指示有效之CIITA指導RNA。
在一些實施例中，使用本文所揭示之方法及組成物降低或消除細胞群體中之MHC II類蛋白表現。在一些實施例中，該細胞群體相對於未經修飾之細胞群體經富集(例如，藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% MHC II類陰性。在一些實施例中，該細胞群體相對於未經修飾之細胞群體未經富集(例如，藉由FACS或MACS)且如藉由流式細胞術所量測係至少65%、70%、80%、90%、91%、92%、93%或94% MHC II類陰性。
在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少65% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少70% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少80% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少90% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少91% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少92% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少93% MHC II類陰性。在一些實施例中，如藉由流式細胞術所量測，細胞群體相對於未經修飾之細胞群體係至少94% MHC II類陰性。
在一些實施例中，可藉由量測體外或體內免疫細胞(例如，CD4+ T細胞)對經遺傳修飾之靶細胞之反應來確定有效CIITA指導RNA。可藉由量測CD4+ T細胞活化反應(例如CD4+ T細胞增殖、活化標記物之表現及/或細胞介素產生(IL-2、IL-12、IFN-γ))之分析(例如，流式細胞術、ELISA)來評價CD4+ T細胞反應。可在體外細胞培養分析中評價CD4+ T細胞之反應，其中將經遺傳修飾之細胞與包含CD4+ T細胞之細胞共培養。舉例而言，可將經遺傳修飾之細胞例如與PBMC、包含CD4+ T細胞之經純化CD3+ T細胞、經純化CD4+ T細胞或CD4+ T細胞株共培養。可將自經遺傳修飾之細胞誘發之CD4+ T細胞反應與自未經修飾之細胞誘發之反應進行比較。來自CD4+ T細胞之降低反應指示有效之CIITA指導RNA。
CIITA指導RNA之功效亦可藉由編輯後細胞之存活來評估。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至六週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少一週至十二週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少兩週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少三週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少四週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少五週。在一些實施例中，細胞在編輯後存活至少六週。可使用標準技術(包括例如藉由細胞死亡之量度、藉由流式細胞術活/死染色或細胞增殖)來量測經遺傳修飾之細胞之活力。
G. AAVS1 指導 RNA
本文所提供之方法及組成物揭示可用於在AAVS1基因座內產生插入位點之AAVS1指導RNA。在一些實施例中，該等指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至AAVS1基因體靶序列且可在本文中稱為「AAVS1指導RNA」。在一些實施例中，AAVS1指導RNA將RNA指導之DNA結合劑引導至人類AAVS1基因體靶序列。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含AAVS1指導RNA，該AAVS1指導RNA包含靶向AAVS1基因體靶序列之指導序列，該AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標chr19: 55115151- 55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含AAVS1指導RNA，該AAVS1指導RNA包含靶向AAVS1基因體靶序列之指導序列，該AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標chr19: 55115151-55116209內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含AAVS1指導RNA，該AAVS1指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑在AAVS1基因中進行切割之指導序列，其中該AAVS1指導RNA靶向AAVS1基因體靶序列，該AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標chr19: 55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物包含AAVS1指導RNA，該AAVS1指導RNA包含引導RNA指導之DNA結合劑在AAVS1基因中進行切割之指導序列，其中該AAVS1指導RNA靶向AAVS1基因體靶序列，該AAVS1基因體靶序列包含基因體坐標chr19: 55115151-55116209內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，該等方法及組成物揭示AAVS1指導RNA，該AAVS1指導RNA引導RNA指導之DNA結合劑誘導AAVS1基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)。在一些實施例中，該等方法及組成物揭示引導RNA指導之DNA結合劑在AAVS1基因體靶序列中進行切割之AAVS1指導RNA。在RNA指導之DNA切割劑係Cas9之實施例中，切割或「切割位點」出現在原型間隔物毗鄰模體(PAM)序列之第三個鹼基處。
在一些實施例中，提供包含本文所述之AAVS1指導RNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含AAVS1單指導RNA (sgRNA)之組成物，該AAVS1 sgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19: 55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之AAVS1 sgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，提供包含AAVS1雙指導RNA (dgRNA)之組成物，該AAVS1 dgRNA包含靶向基因體靶標之指導序列，該基因體靶標包含基因體坐標chr19: 55115151-55116209內之至少10個鄰接核苷酸。在一些實施例中，提供包含本文所述之AAVS1 dgRNA及RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸的組成物。
在一些實施例中，AAVS1 gRNA包含選自SEQ ID NO: 601-774中任一者之指導序列。例示性AAVS1指導序列示於下表5中。
表5. 例示性AAVS1指導序列.
| 指導ID | 指導序列之SEQ ID NO | 指導序列 | 例示性指導RNA 全序列(SEQ ID NO: 1601-1774) | 例示性指導RNA 修飾序列(SEQ ID NO: 2601-2774) | 基因體坐標(hg38) |
| G025808 | 601 | AUAUCCAGAACCCUGACCCUGCCG | AUAUCCAGAACCCUGACCCUGCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mA*mUmCCAmGmAAmCCmCUGACmCCUGmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547505-22547529 |
| G025809 | 602 | CCCACAGAUAUCCAGAACCCUGAC | CCCACAGAUAUCCAGAACCCUGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mAmCAGmAmUAmUCmCAGAAmCCCUmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547498-22547522 |
| G025810 | 603 | UUGUCCCACAGAUAUCCAGAACCC | UUGUCCCACAGAUAUCCAGAACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mG*mUmCCCmAmCAmGAmUAUCCmAGAAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547494-22547518 |
| G025811 | 604 | CUUGUCCCACAGAUAUCCAGAACC | CUUGUCCCACAGAUAUCCAGAACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mGmUCCmCmACmAGmAUAUCmCAGAmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547493-22547517 |
| G025812 | 605 | AUCCUCUUGUCCCACAGAUAUCCA | AUCCUCUUGUCCCACAGAUAUCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mC*mCmUCUmUmGUmCCmCACAGmAUAUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547488-22547512 |
| G025813 | 606 | GAUCCUCUUGUCCCACAGAUAUCC | GAUCCUCUUGUCCCACAGAUAUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mU*mCmCUCmUmUGmUCmCCACAmGAUAmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547487-22547511 |
| G025814 | 607 | AACCCUGAUCCUCUUGUCCCACAG | AACCCUGAUCCUCUUGUCCCACAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mC*mCmCUGmAmUCmCUmCUUGUmCCCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547481-22547505 |
| G025815 | 608 | GCCGUGUACCAGCUGAGAGACUCU | GCCGUGUACCAGCUGAGAGACUCUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mGmUGUmAmCCmAGmCUGAGmAGACmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr14:22547525-22547549 |
| G025816* | 609 | AAGAGAAAGGGAGUAGAGGCGGCC | AAGAGAAAGGGAGUAGAGGCGGCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mAmGAAmAmGGmGAmGUAGAmGGCGmGCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115151-55115175 |
| G025817 | 610 | AGUAGAGGCGGCCACGACCUGGUG | AGUAGAGGCGGCCACGACCUGGUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mU*mAmGAGmGmCGmGCmCACGAmCCUGmGUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115162-55115186 |
| G025818 | 611 | CCACGACCUGGUGAACACCUAGGA | CCACGACCUGGUGAACACCUAGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mCmGACmCmUGmGUmGAACAmCCUAmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115173-55115197 |
| G025819 | 612 | GACGCACCAUUCUCACAAAGGGAG | GACGCACCAUUCUCACAAAGGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mC*mGmCACmCmAUmUCmUCACAmAAGGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115195-55115219 |
| G025820 | 613 | CUCACAAAGGGAGUUUUCCACACG | CUCACAAAGGGAGUUUUCCACACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mAmCAAmAmGGmGAmGUUUUmCCACmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115206-55115230 |
| G025821 | 614 | UCACAAAGGGAGUUUUCCACACGG | UCACAAAGGGAGUUUUCCACACGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mA*mCmAAAmGmGGmAGmUUUUCmCACAmCGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115207-55115231 |
| G025822 | 615 | CACAAAGGGAGUUUUCCACACGGA | CACAAAGGGAGUUUUCCACACGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmAAGmGmGAmGUmUUUCCmACACmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115208-55115232 |
| G025823 | 616 | ACAAAGGGAGUUUUCCACACGGAC | ACAAAGGGAGUUUUCCACACGGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mAmAGGmGmAGmUUmUUCCAmCACGmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115209-55115233 |
| G025824 | 617 | CAAAGGGAGUUUUCCACACGGACA | CAAAGGGAGUUUUCCACACGGACAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mA*mAmGGGmAmGUmUUmUCCACmACGGmACAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115210-55115234 |
| G025825 | 618 | AGGGAGUUUUCCACACGGACACCC | AGGGAGUUUUCCACACGGACACCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mG*mGmAGUmUmUUmCCmACACGmGACAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115213-55115237 |
| G025826 | 619 | GUUUUCCACACGGACACCCCCCUC | GUUUUCCACACGGACACCCCCCUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mU*mU*mUmUCCmAmCAmCGmGACACmCCCCmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115218-55115242 |
| G025827 | 620 | CACACGGACACCCCCCUCCUCACC | CACACGGACACCCCCCUCCUCACCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mAmCGGmAmCAmCCmCCCCUmCCUCmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115224-55115248 |
| G025828 | 621 | ACACGGACACCCCCCUCCUCACCA | ACACGGACACCCCCCUCCUCACCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mA*mCmGGAmCmACmCCmCCCUCmCUCAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115225-55115249 |
| G025829 | 622 | GGACACCCCCCUCCUCACCACAGC | GGACACCCCCCUCCUCACCACAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mA*mCmACCmCmCCmCUmCCUCAmCCACmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115229-55115253 |
| G025830 | 623 | GCCCUGCCAGGACGGGGCUGGCUA | GCCCUGCCAGGACGGGGCUGGCUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mCmUGCmCmAGmGAmCGGGGmCUGGmCUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115251-55115275 |
| G025831 | 624 | GGUGAAGAGCCAAAGUUAGAACUC | GGUGAAGAGCCAAAGUUAGAACUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mGmAAGmAmGCmCAmAAGUUmAGAAmCUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115337-55115361 |
| G025832* | 625 | UCUUGGGAAGUGUAAGGAAGCUGC | UCUUGGGAAGUGUAAGGAAGCUGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mUmGGGmAmAGmUGmUAAGGmAAGCmUGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115404-55115428 |
| G025833 | 626 | GCUGCAGCACCAGGAUCAGUGAAA | GCUGCAGCACCAGGAUCAGUGAAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mU*mGmCAGmCmACmCAmGGAUCmAGUGmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115423-55115447 |
| G025834 | 627 | ACCAGGAUCAGUGAAACGCACCAG | ACCAGGAUCAGUGAAACGCACCAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mAmGGAmUmCAmGUmGAAACmGCACmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115431-55115455 |
| G025835 | 628 | GGUUCUGGGAGAGGGUAGCGCAGG | GGUUCUGGGAGAGGGUAGCGCAGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mU*mUmCUGmGmGAmGAmGGGUAmGCGCmAGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115477-55115501 |
| G025836 | 629 | GAGGGUAGCGCAGGGUGGCCACUG | GAGGGUAGCGCAGGGUGGCCACUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mG*mGmGUAmGmCGmCAmGGGUGmGCCAmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115487-55115511 |
| G025837 | 630 | GCCACUGAGAACCGGGCAGGUCAC | GCCACUGAGAACCGGGCAGGUCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mC*mC*mAmCUGmAmGAmACmCGGGCmAGGUmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115504-55115528 |
| G025838 | 631 | CCACUGAGAACCGGGCAGGUCACG | CCACUGAGAACCGGGCAGGUCACGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mA*mCmUGAmGmAAmCCmGGGCAmGGUCmACGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115505-55115529 |
| G025839 | 632 | CACUGAGAACCGGGCAGGUCACGC | CACUGAGAACCGGGCAGGUCACGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mUmGAGmAmACmCGmGGCAGmGUCAmCGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115506-55115530 |
| G025840* | 633 | ACUGAGAACCGGGCAGGUCACGCA | ACUGAGAACCGGGCAGGUCACGCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mU*mGmAGAmAmCCmGGmGCAGGmUCACmGCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115507-55115531 |
| G025841* | 634 | AACCGGGCAGGUCACGCAUCCCCC | AACCGGGCAGGUCACGCAUCCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mC*mCmGGGmCmAGmGUmCACGCmAUCCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115513-55115537 |
| G025842 | 635 | ACCGGGCAGGUCACGCAUCCCCCC | ACCGGGCAGGUCACGCAUCCCCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mGmGGCmAmGGmUCmACGCAmUCCCmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115514-55115538 |
| G025843 | 636 | GGGCAGGUCACGCAUCCCCCCCUU | GGGCAGGUCACGCAUCCCCCCCUUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mCmAGGmUmCAmCGmCAUCCmCCCCmCUUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115517-55115541 |
| G025844 | 637 | GGCAGGUCACGCAUCCCCCCCUUC | GGCAGGUCACGCAUCCCCCCCUUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mC*mAmGGUmCmACmGCmAUCCCmCCCCmUUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115518-55115542 |
| G025845 | 638 | CCUUCCCUCCCACCCCCUGCCAAG | CCUUCCCUCCCACCCCCUGCCAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mUmCCCmUmCCmCAmCCCCCmUGCCmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115537-55115561 |
| G025846 | 639 | CUUCCCUCCCACCCCCUGCCAAGC | CUUCCCUCCCACCCCCUGCCAAGCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mCmCCUmCmCCmACmCCCCUmGCCAmAGCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115538-55115562 |
| G025847 | 640 | CCCCCUGCCAAGCUCUCCCUCCCA | CCCCCUGCCAAGCUCUCCCUCCCAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mCmCUGmCmCAmAGmCUCUCmCCUCmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115549-55115573 |
| G025848 | 641 | GAUCCUCUCUGGCUCCAUCGUAAG | GAUCCUCUCUGGCUCCAUCGUAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mA*mU*mCmCUCmUmCUmGGmCUCCAmUCGUmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115574-55115598 |
| G025849 | 642 | AGAGGUUCUGGCAAGGAGAGAGAU | AGAGGUUCUGGCAAGGAGAGAGAUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mG*mA*mGmGUUmCmUGmGCmAAGGAmGAGAmGAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115606-55115630 |
| G025850 | 643 | GGGGGUGUGUCACCAGAUAAGGAA | GGGGGUGUGUCACCAGAUAAGGAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mG*mG*mG*mGmGUGmUmGUmCAmCCAGAmUAAGmGAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115643-55115667 |
| G025851 | 644 | CAAUAUCAGGAGACUAGGAAGGAG | CAAUAUCAGGAGACUAGGAAGGAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mA*mUmAUCmAmGGmAGmACUAGmGAAGmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115696-55115720 |
| G025852 | 645 | AUGGGGCUUUUCUGUCACCAAUCC | AUGGGGCUUUUCUGUCACCAAUCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mU*mG*mGmGGCmUmUUmUCmUGUCAmCCAAmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115731-55115755 |
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| G025854 | 647 | UUCUGUCACCAAUCCUGUCCCUAG | UUCUGUCACCAAUCCUGUCCCUAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mC*mUmGUCmAmCCmAAmUCCUGmUCCCmUAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55115740-55115764 |
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| G025967 | 761 | CCCCGUCUCCCUGGCUUUAGCCAC | CCCCGUCUCCCUGGCUUUAGCCACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mC*mCmGUCmUmCCmCUmGGCUUmUAGCmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116102-55116126 |
| G025968 | 762 | AAGUACCCCGUCUCCCUGGCUUUA | AAGUACCCCGUCUCCCUGGCUUUAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mA*mG*mUmACCmCmCGmUCmUCCCUmGGCUmUUAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116107-55116131 |
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| G025970 | 764 | UCUGGACAACCCCAAAGUACCCCG | UCUGGACAACCCCAAAGUACCCCGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mC*mU*mGmGACmAmACmCCmCAAAGmUACCmCCGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116121-55116145 |
| G025971 | 765 | UUCUGGACAACCCCAAAGUACCCC | UUCUGGACAACCCCAAAGUACCCCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mU*mC*mUmGGAmCmAAmCCmCCAAAmGUACmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116122-55116146 |
| G025972 | 766 | CCGUUUUUCUGGACAACCCCAAAG | CCGUUUUUCUGGACAACCCCAAAGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mG*mUmUUUmUmCUmGGmACAACmCCCAmAAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116128-55116152 |
| G025973 | 767 | ACCGUUUUUCUGGACAACCCCAAA | ACCGUUUUUCUGGACAACCCCAAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mA*mC*mC*mGmUUUmUmUCmUGmGACAAmCCCCmAAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116129-55116153 |
| G025974 | 768 | CACCGUUUUUCUGGACAACCCCAA | CACCGUUUUUCUGGACAACCCCAAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mA*mC*mCmGUUmUmUUmCUmGGACAmACCCmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116130-55116154 |
| G025975 | 769 | UGCAUCAUCACCGUUUUUCUGGAC | UGCAUCAUCACCGUUUUUCUGGACGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mU*mG*mC*mAmUCAmUmCAmCCmGUUUUmUCUGmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116138-55116162 |
| G025976 | 770 | CUGCAUCAUCACCGUUUUUCUGGA | CUGCAUCAUCACCGUUUUUCUGGAGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mG*mCmAUCmAmUCmACmCGUUUmUUCUmGGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116139-55116163 |
| G025977 | 771 | CCUGCAUCAUCACCGUUUUUCUGG | CCUGCAUCAUCACCGUUUUUCUGGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mC*mU*mGmCAUmCmAUmCAmCCGUUmUUUCmUGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116140-55116164 |
| G025978 | 772 | CUCCCCUUCUUGUAGGCCUGCAUC | CUCCCCUUCUUGUAGGCCUGCAUCGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mCmCCUmUmCUmUGmUAGGCmCUGCmAUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116156-55116180 |
| G025979 | 773 | CUUGCGUCCCGCCUCCCCUUCUUG | CUUGCGUCCCGCCUCCCCUUCUUGGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mU*mGmCGUmCmCCmGCmCUCCCmCUUCmUUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116168-55116192 |
| G025980 | 774 | CUCCGACGGAUGUCUCCCUUGCGU | CUCCGACGGAUGUCUCCCUUGCGUGUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | mC*mU*mC*mCmGACmGmGAmUGmUCUCCmCUUGmCGUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | chr19:55116185-55116209 |
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含選自SEQ ID NO: 601-774之指導序列。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含指導序列，該指導序列係選自SEQ ID NO: 601-774之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 601-774之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含與選自SEQ ID NO: 601-774之序列至少95%一致之指導序列。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 5中所列基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸。如本文所用，基因體坐標之至少10個鄰接核苷酸±10個核苷酸意指例如基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸，其中基因體坐標包括來自
表 5中所列範圍的5’方向上之10個核苷酸及3’方向上之10個核苷酸。舉例而言，AAVS1指導RNA可包含選自以下之基因體坐標內之10個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930或chr19:55116006-55116030；包括該等範圍之邊界核苷酸。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含指導序列，該指導序列係包含
表 5中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含指導序列，該指導序列與選自以下序列之序列至少95%、90%或85%一致，該序列係包含
表 5中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列的至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 5中所列基因體坐標之至少15個鄰接核苷酸±10個核苷酸。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含指導序列，該指導序列包含
表 5中所列基因體坐標之至少24個鄰接核苷酸±10個核苷酸。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 601。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 602。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 603。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 604。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 605。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 606。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 607。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 608。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 609。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 610。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 611。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 612。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 613。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 614。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 615。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 616。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 617。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 618。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 619。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 620。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 621。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 622。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 623。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 624。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 625。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 626。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 627。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 628。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 629。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 630。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 631。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 632。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 633。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 634。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 635。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 636。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 637。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 638。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 639。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 640。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 641。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 642。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 643。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 644。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 645。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 646。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 647。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 648。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 649。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 650。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 651。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 652。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 653。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 654。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 655。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 656。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 657。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 658。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 659。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 660。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 661。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 662。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 663。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 664。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 665。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 666。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 667。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 668。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 669。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 670。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 671。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 672。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 673。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 674。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 675。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 676。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 677。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 678。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 679。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 680。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 681。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 682。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 683。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 684。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 685。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 686。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 687。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 688。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 689。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 690。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 691。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 692。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 693。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 694。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 695。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 696。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 697。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 698。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 699。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 700。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 701。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 702。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 703。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 704。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 705。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 706。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 707。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 708。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 709。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 710。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 711。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 712。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 713。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 714。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 715。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 716。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 717。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 718。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 719。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 720。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 721。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 722。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 723。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 724。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 725。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 726。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 727。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 728。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 729。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 730。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 731。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 732。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 733。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 734。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 735。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 736。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 737。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 738。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 739。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 740。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 741。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 742。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 743。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 744。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 745。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 746。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 747。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 748。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 749。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 750。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 751。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 752。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 753。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 754。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 755。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 756。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 757。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 758。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 759。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 760。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 761。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 762。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 763。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 764。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 765。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 766。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 767。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 768。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 769。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 770。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 771。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 772。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 773。在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含SEQ ID NO: 774。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 611、620、622、626-629、632-634、656、659-661、673、691-692、730、734及746。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 611、620、622、627-629、636、656、659-661及673。
在一些實施例中，AAVS1指導RNA包含以下中任一者之指導序列：SEQ ID NO: 692、709、730、734、746、748、760-761及763。
本文提供AAVS1指導RNA之額外實施例，包括例如對指導RNA之例示性修飾。
1. 對 AAVS1 之遺傳修飾
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞中AAVS1基因座之至少一個核苷酸進行遺傳修飾。遺傳修飾涵蓋由與基因體編輯系統(例如，由Cas9及AAVS1指導RNA產生之編輯子群體，或由BC22及AAVS1指導RNA產生之編輯子群體)接觸而產生之修飾群體。
在一些實施例中，遺傳修飾包含基因體坐標chr19:55115151-55116209內之至少一個核苷酸。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自表5中所列之任何基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930及chr19:55116006-55116030。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930及chr19:55116006-55116030。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930及chr19:55116006-55116030。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr19:55115518-55115542；chr19:55115517-55115541；chr19:55115504-55115528；chr19:55115514-55115538；chr19:55115477-55115501；chr19:55115276-55115300；chr19:55116026-55116050；chr19:55116084-55116108；chr19:55116045-55116069；chr19:55115933-55115957；chr19:55115218-55115242及chr19:55115696-55115720；或(b) chr19:55115579-55115603；chr19:55116006-55116030；chr19:55115863-55115887；chr19:55116098-55116122；chr19:55115710-55115734及chr19:55116014-55116038。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr19:55115518-55115542；chr19:55115517-55115541；chr19:55115504-55115528；chr19:55115514-55115538；chr19:55115477-55115501；chr19:55115276-55115300；chr19:55116026-55116050；chr19:55116084-55116108；chr19:55116045-55116069；chr19:55115933-55115957；chr19:55115218-55115242及chr19:55115696-55115720；或(b) chr19:55115579-55115603；chr19:55116006-55116030；chr19:55115863-55115887；chr19:55116098-55116122；chr19:55115710-55115734及chr19:55116014-55116038。在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：(a) chr19:55115518-55115542；chr19:55115517-55115541；chr19:55115504-55115528；chr19:55115514-55115538；chr19:55115477-55115501；chr19:55115276-55115300；chr19:55116026-55116050；chr19:55116084-55116108；chr19:55116045-55116069；chr19:55115933-55115957；chr19:55115218-55115242及chr19:55115696-55115720；或(b) chr19:55115579-55115603；chr19:55116006-55116030；chr19:55115863-55115887；chr19:55116098-55116122；chr19:55115710-55115734及chr19:55116014-55116038。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：chr19:55115218-55115242；chr19:55115477-55115501；chr19:55115504-55115528；chr19:55115513-55115537；chr19:55115514-55115538；chr19:55115517-55115541；chr19:55115518-55115542；chr19:55115549-55115573；chr19:55115574-55115598；chr19:55115606-55115630；chr19:55115933-55115957；chr19:55116026-55116050；chr19:55116045-55116069；chr19:55116084-55116108；chr19:55115276-55115300；chr19:55115509-55115533；chr19:55115579-55115603；chr19:55115863-55115887；chr19:55115906-55115930及chr19:55116006-55116030。
在一些實施例中，遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個插入/缺失、至少一個C至T之取代或至少一個A至G之取代：(a) chr19:55115518-55115542；chr19:55115517-55115541；chr19:55115504-55115528；chr19:55115514-55115538；chr19:55115477-55115501；chr19:55115276-55115300；chr19:55116026-55116050；chr19:55116084-55116108；chr19:55116045-55116069；chr19:55115933-55115957；chr19:55115218-55115242及chr19:55115696-55115720；或(b) chr19:55115579-55115603；chr19:55116006-55116030；chr19:55115863-55115887；chr19:55116098-55116122；chr19:55115710-55115734及chr19:55116014-55116038。
在一些實施例中，對AAVS1之修飾包含靶序列中至少一個核苷酸之插入、缺失、取代或去胺中之任一者或多者。在一些實施例中，對AAVS1之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之插入。在一些實施例中，對AAVS1之修飾包含靶序列中1、2、3、4或5個或更多個核苷酸之缺失。在其他實施例中，對AAVS1之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之插入。在其他實施例中，對AAVS1之修飾包含靶序列中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個或更多個核苷酸之缺失。在一些實施例中，對AAVS1之修飾包含插入/缺失，該插入/缺失通常在此項技術中定義為小於1000鹼基對(bp)之插入或缺失。在一些實施例中，對AAVS1之修飾包含在靶序列中插入供體核酸。在一些實施例中，對AAVS1之修飾並非瞬時的。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物使用RNA指導之DNA結合劑(例如，Cas酶)修飾細胞中之AAVS1基因座。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑在AAVS1基因內切割，其中AAVS1指導RNA靶向包含chr19:55115151-55116209之至少10個鄰接核苷酸之AAVS1基因體靶序列。
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物修飾細胞中之AAVS1基因座，其中對AAVS1之修飾包含外源核酸之插入。在一些實施例中，外源核酸係蛋白編碼基因。由外源核酸編碼之蛋白可由細胞表現。
H. 例示性細胞類型
在一些實施例中，本文所揭示之方法及組成物對細胞進行遺傳修飾。在一些實施例中，細胞係同種異體細胞。在一些實施例中，細胞係人類細胞。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞稱為經工程改造之細胞。經工程改造之細胞係指包含經工程改造之遺傳修飾(例如已與基因體編輯系統接觸且藉由基因體編輯系統進行遺傳修飾)之細胞(或細胞後代)。術語「經工程改造之細胞」及「經遺傳修飾之細胞」在全文中可互換使用。經工程改造之細胞可為本文所揭示之任何例示性細胞類型。
在一些實施例中，細胞係免疫細胞。如本文所用，「免疫細胞」係指免疫系統之細胞，包括例如淋巴球(例如，T細胞、B細胞、自然殺手細胞(「NK細胞」及NKT細胞或iNKT細胞))、單核球、巨噬細胞、肥大細胞、樹突細胞或顆粒球(例如，嗜中性球、嗜酸性球及嗜鹼性球)。在一些實施例中，細胞係原代免疫細胞。在一些實施例中，免疫系統細胞可選自CD3
+、CD4
+及CD8
+T細胞、調控性T細胞(Treg)、B細胞、NK細胞及樹突細胞(DC)。在一些實施例中，免疫細胞係同種異體的。
在一些實施例中，細胞係淋巴球。在一些實施例中，細胞係適應性免疫細胞。在一些實施例中，細胞係T細胞。在一些實施例中，細胞係B細胞。在一些實施例中，細胞係NK細胞。在一些實施例中，淋巴球係同種異體的。
如本文所用，T細胞可定義為表現T細胞受體(「TCR」或「αβTCR」或「γδTCR」)之細胞，然而在一些實施例中，T細胞之TCR可經遺傳修飾以降低其表現(例如，藉由對TRAC或TRBC基因進行遺傳修飾)，因此蛋白CD3之表現可用作藉由標準流式細胞術方法鑑別T細胞之標記物。CD3係與TCR締合之多次單元傳訊複合物。因此，T細胞可稱為CD3+。在一些實施例中，T細胞係表現CD3+標記物及CD4+或CD8+標記物之細胞。在一些實施例中，T細胞係同種異體的。
在一些實施例中，T細胞表現糖蛋白CD8且因此藉由標準流式細胞術方法係CD8+且可稱為「細胞毒性」T細胞。在一些實施例中，T細胞表現糖蛋白CD4且因此藉由標準流式細胞術方法係CD4+且可稱為「輔助」T細胞。CD4+ T細胞可分化成子集，且可稱為Th1細胞、Th2細胞、Th9細胞、Th17細胞、Th22細胞、T調控性(「Treg」)細胞或T濾泡性輔助細胞(「Tfh」)。每一CD4+子集皆釋放特定細胞介素，該等細胞介素可具有促炎或抗炎功能、存活或保護功能。可藉由CD4+或CD8+選擇方法自個體中分離T細胞。
在一些實施例中，T細胞係記憶T細胞。在體內，記憶T細胞已遇抗原。記憶T細胞可位於次級淋巴器官(中央記憶T細胞)或最近受感染之組織(效應記憶T細胞)中。記憶T細胞可為CD8+ T細胞。記憶T細胞可為CD4+ T細胞。
如本文所用，「中央記憶T細胞」可定義為有抗原經歷之T細胞，且例如可表現CD62L及CD45RO。中央記憶T細胞可偵測為CD62L+及CD45RO+，由於中央記憶T細胞亦表現CCR7，因此可藉由標準流式細胞術方法偵測為CCR7+。
如本文所用，「早期幹細胞記憶T細胞」(或「Tscm」)可定義為表現CD27及CD45RA之T細胞，且因此藉由標準流式細胞術方法係CD27+及CD45RA+。Tscm不表現CD45同功型CD45RO，因此若藉由標準流式細胞術方法針對該同功型染色，則Tscm將進一步係CD45RO-。因此，CD45RO- CD27+細胞亦係早期幹細胞記憶T細胞。Tscm細胞進一步表現CD62L及CCR7，因此可藉由標準流式細胞術方法偵測為CD62L+及CCR7+。已顯示早期幹細胞記憶T細胞與細胞療法產品的增加之持久性及治療功效相關。
在一些實施例中，細胞係B細胞。如本文所用，「B細胞」可定義為表現CD19或CD20或B細胞成熟抗原(「BCMA」)之細胞，且因此B細胞藉由標準流式細胞術方法係CD19+、或CD20+、或BCMA+。藉由標準流式細胞術方法，B細胞對CD3及CD56進一步為陰性。B細胞可為漿細胞。B細胞可為記憶B細胞。B細胞可為幼稚B細胞。B細胞可為IgM+，或具有類別轉換之B細胞受體(例如，IgG+或IgA+)。在一些實施例中，B細胞係同種異體的。
在一些實施例中，細胞係單核細胞，諸如來自骨髓或周邊血。在一些實施例中，細胞係周邊血單核細胞(「PBMC」)。在一些實施例中，細胞係PBMC，例如淋巴球或單核球。在一些實施例中，細胞係周邊血淋巴球(「PBL」)。在一些實施例中，單核細胞係同種異體的。
包括用於ACT或組織再生療法中之細胞，諸如幹細胞、前驅細胞及原代細胞。幹細胞，例如，包括多潛能幹細胞(PSC)；誘導性多潛能幹細胞(iPSC)；胚胎幹細胞(ESC)；間質幹細胞(MSC，例如，自骨髓(BM)、周邊血(PB)、胎盤、臍帶(UC)或脂肪分離)；造血幹細胞(HSC；例如自BM或UC分離)；神經幹細胞(NSC)；組織特異性祖幹細胞(TSPSC)；及角膜緣幹細胞(LSC)。前驅細胞及原代細胞包括單核細胞(MNC，例如，自BM或PB分離)；內皮前驅細胞(EPC，例如自BM、PB及UC分離)；神經前驅細胞(NPC)；組織特異性原代細胞或由其衍生之細胞(TSC)，包括軟骨細胞、肌細胞及角質細胞。亦包括用於器官或組織移植之細胞，諸如胰島細胞、心肌細胞、甲狀腺細胞、胸腺細胞、神經元細胞、皮膚細胞及視網膜細胞。
在一些實施例中，細胞係人類細胞，諸如自人類個體分離之細胞。在一些實施例中，自人類供體PBMC或leukopak分離細胞。在一些實施例中，細胞來自患有疾患、病症或疾病之個體。在一些實施例中，細胞來自具有艾司坦-巴爾病毒(Epstein Barr Virus) (「EBV」)之人類供體。
在一些實施例中，離體實施該等方法。如本文所用，「離體」係指能夠將細胞轉移至個體中之體外方法，例如作為ACT療法。在一些實施例中，離體方法係涉及ACT療法細胞或細胞群體之體外方法。
在一些實施例中，細胞係來自細胞株。在一些實施例中，細胞株源自人類個體。在一些實施例中，細胞株係類淋巴母細胞細胞株(「LCL」)。細胞可經冷凍保存及解凍。細胞先前可能未經冷凍保存。
在一些實施例中，細胞係來自細胞庫。在一些實施例中，對細胞進行遺傳修飾且接著將其轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將細胞自個體中取出，離體遺傳修飾，且轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經遺傳修飾之細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將經遺傳修飾之免疫細胞群體轉移至細胞庫中。在一些實施例中，將包含第一及第二亞群的經遺傳修飾之免疫細胞群體轉移至細胞庫中，其中第一及第二亞群具有至少一個共同遺傳修飾及至少一個不同遺傳修飾。
III. 基因體編輯系統之詳情
在一些實施例中，基因體編輯系統係CRISPR/Cas系統，包括例如包含指導序列及RNA指導之DNA結合劑之CRISPR指導RNA，且進一步闡述於本文中。CRISPR/Cas系統方法及其中供使用之組成物之進一步描述係此項技術中已知的。參見例如2021年12月10日提出申請之PCT/US2021/062922及2021年11月3日提出申請之美國臨時申請案第63/275,425號，該等申請案中每一者之內容特此以全文引用之方式併入。
A. CRISPR 指導 RNA
本文提供可用於修飾靶序列之指導序列，例如，使用包含所揭示之指導序列之指導RNA與RNA指導之DNA結合劑(例如，CRISPR/Cas系統)。靶向HLA-A、TRAC、TRBC及CIITA之指導序列示於表1-5 (SEQ ID NO: 2-80、101-120、201-265、301、302、304-576及601-774)中，該等指導RNA所靶向之基因體坐標亦如此。
在一些實施例中，本文所提供之gRNA包含指導區域(指導序列)及保守區域，該保守區域包含重複/反重複區域、髮夾1區域及髮夾2區域，其中重複/反重複區域、髮夾1區域及髮夾2區域中之一或多者縮短。在一些實施例中，gRNA係腦膜炎奈瑟氏球菌Cas9 (NmeCas9) gRNA。
在一些實施例中，指導RNA包含經修飾之sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包含表1-5、6、7及7A-7B中所提供的經修飾sgRNA序列之任一種修飾模式。在一些實施例中，保守區域包含表7B中經修飾之保守區域Nme指導RNA模體中之任一者，且其中保守區域係指導區域(指導序列)之3’。在一些實施例中，保守區域包含含有SEQ ID NO: 1081-1089中任一者之修飾序列，且其中保守區域係指導區域(指導序列)之3’。在一些實施例中，指導RNA包含選自SEQ ID NO:904-909、911及995-997中任一者之核苷酸序列，其中N共同表示本文所揭示之任何指導序列，包括表1-5中所提供之指導序列。在某些實施例中，N共同表示與表1-5中所提供之任一指導序列至少80%、85%、90%、95%或100%一致或互補之指導序列。在某些實施例中，N共同表示表1-5中所提供之任一個指導序列。在某些實施例中，當N共同代表指導序列時，在(N)
20-25內，(N)
20-25中之每一N皆可獨立地經修飾，例如用2’-OMe修飾進行修飾，視情況進一步用PS修飾進行，特別在1、2或3個末端核苷酸處。在某些實施例中，(N)
20-25具有以下序列及修飾模式：mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNN。
NmeCas9單指導RNA (Nme sgRNA)之例示性保守區域示於表6 (SEQ ID NO: 900)中。第一列顯示核苷酸之編號；第二列顯示例示性序列；且第三(及第四)列顯示區域。關於sgRNA之「縮短」係指其保守區域缺少表6中所示之至少一個核苷酸，如下文所詳細論述。
在一些實施例中，指導RNA係包含保守部分之Nme sgRNA，該保守部分包含重複/反重複區域、髮夾1區域及髮夾2區域，其中重複/反重複區域、髮夾1區域及髮夾2區域中之一或多者縮短。在一些實施例中，本文所述之sgRNA進一步包含指導區域及保守區域，其中該保守區域包含以下之一或多者：(a)縮短之重複/反重複區域，其中該縮短之重複/反重複區域缺少2-24個核苷酸，其中(i)，相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸37-48及53-64中之一或多者且視情況一或多個核苷酸37-64經取代；且(ii)核苷酸36藉由至少2個核苷酸連接至核苷酸65；或(b)縮短之髮夾1區域，其中該縮短之髮夾1缺少2-10個、視情況2-8個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸82-86及91-95中之一或多者且視情況一或多個位置82-96經取代；且核苷酸81藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸96；或(c)縮短之髮夾2區域，其中該縮短之髮夾2缺少2-18個、視情況2-16個核苷酸，其中(i)相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸113-121及126-134中之一或多者且視情況一或多個核苷酸113-134經取代；且(ii)核苷酸112藉由至少4個核苷酸連接至核苷酸135；其中相對於SEQ ID NO: 900，視情況缺失一或兩個核苷酸144-145；且其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA係sgRNA。
在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸1-4係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸5、8、9、11、13、18及22係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸1-5、8、9、11、13、18及22係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，在指導序列中，核苷酸1藉由硫代磷酸酯(PS)鍵聯連接至核苷酸2，核苷酸2藉由PS鍵聯連接至核苷酸3，且/或核苷酸3藉由PS鍵聯連接至核苷酸4。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 900缺失一或兩個核苷酸144-145。
在一些實施例中，保守區域之至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，gRNA之重複/反重複區域係缺少2-24個核苷酸之縮短之重複/反重複區域，例如，上文編號實施例或表1-6中所指示或本文別處所述之任何重複/反重複區域，其可與本文所述之任何縮短之髮夾1區域或髮夾2區域組合，包括但不限於上文編號之實施例中所指示及表1-6之序列中所表示或本文別處所述之組合。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 900，一或多個位置49-52、87-90或122-125經取代。在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 900，全部位置49-52、87-90或122-125經取代。在一些實施例中，表1-6中所提供或本文所述之3'尾缺失。
在一些實施例中，gRNA之縮短之重複/反重複區域缺少18個核苷酸。在一些實施例中，gRNA之縮短之重複/反重複區域缺少22個核苷酸。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由6個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由7個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由8個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由9個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38、41-48、53-60及63。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由6個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，相對於SEQ ID NO: 700缺失核苷酸38-48及53-63，且核苷酸36藉由核苷酸37、49-52及64連接至核苷酸65。
在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在一些實施例中，在gRNA之縮短之重複/反重複區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38、41-48、53-60及63，且核苷酸36藉由核苷酸37、39、40、49-52、61、62及64連接至核苷酸65。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 900缺失縮短之重複/反重複區域之上莖的所有核苷酸38-48及核苷酸53-63。
在一些實施例中，相對於SEQ ID NO: 900缺失縮短之重複/反重複區域之上莖的所有核苷酸39-48及核苷酸53-62，且取代核苷酸38及63。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有14個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有15個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有16個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有17個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有18個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有19個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有20個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之重複/反重複區域中，核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係經2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，在縮短之重複/反重複區域與縮短之髮夾1區域之間，核苷酸76藉由PS鍵聯連接至核苷酸77。
在一些實施例中，縮短之髮夾1區域缺少2個核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾1區域缺少21個核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾1區域缺少2個核苷酸，且相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91。在一些實施例中，縮短之髮夾1區域缺少2個核苷酸，且相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸85及92。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區域中，核苷酸81藉由12個核苷酸連接至核苷酸96。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區域中，核苷酸81藉由12個核苷酸連接至核苷酸96。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，且核苷酸81藉由核苷酸82-85、87-90及92-95連接至核苷酸96。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸85及92，且核苷酸81藉由核苷酸82-84、86-91及93-95連接至核苷酸96。
在一些實施例中，縮短之髮夾1區域具有長度為7個鹼基對之核苷酸之雙鏈體部分。在一些實施例中，縮短之髮夾1區域具有長度為8個鹼基對之核苷酸之雙鏈體部分。
在縮短之髮夾1區域之莖中，有長度為七個鹼基配對之核苷酸。在一些實施例中，缺失縮短之髮夾1區域之核苷酸85-86及核苷酸91-92。
在一些實施例中，縮短之髮夾1區域具有13個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾1區域中，核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係經2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，在縮短之髮夾1區域與縮短之髮夾2區域之間，核苷酸101係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係經2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，縮短之髮夾2缺少18個核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾2具有24個核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾2中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134。在一些實施例中，縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，且相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區域中，核苷酸112藉由4個核苷酸連接至核苷酸135。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134且核苷酸112藉由核苷酸122-125連接至核苷酸135。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區域中，相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135。在一些實施例中，縮短之髮夾2區域缺少18個核苷酸，且相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有28個核苷酸之長度。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域具有32個核苷酸之長度。
在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域之上莖包含不超過一個鹼基對。在一些實施例中，縮短之重複/反重複區域之上莖包含不超過三個鹼基對。
在一些實施例中，縮短之髮夾2區域具有8個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾2區域具有9個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，縮短之髮夾2區域具有13個經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區域中，核苷酸104、110、111、122-125、142及143係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，在縮短之髮夾2區域中，核苷酸104、106-111、122-125、142及143係經修飾之核苷酸。在一些實施例中，經修飾之核苷酸係經2'-O-Me修飾之核苷酸。
在一些實施例中，在縮短之髮夾2區域中，核苷酸141藉由PS鍵聯連接至核苷酸142，且/或核苷酸142藉由PS鍵聯連接至核苷酸143。
在一些實施例中，指導RNA (gRNA)包含指導區域及保守區域，該保守區域包含：
(a) 縮短之重複/反重複區域，其中該縮短之重複/反重複區域相對於SEQ ID NO: 900缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 缺失核苷酸38-48及53-63；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；
(b) 縮短之髮夾1區域，其中該縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91或缺失核苷酸85及92；及
(c) 縮短之髮夾2區域，其中該縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134；且其中相對於SEQ ID NO: 900，缺失核苷酸144-145；其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，指導RNA (gRNA)包含指導區域及保守區域，該保守區域包含：
(a) 縮短之重複/反重複區域，其中該縮短之重複/反重複區域相對於SEQ ID NO: 900缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 缺失核苷酸38、41-48、53-60及63；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；
(b) 縮短之髮夾1區域，其中該縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 700缺失核苷酸86及91或缺失核苷酸85及92；
(c) 縮短之髮夾2區域，其中該縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134；且
其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸144-145；
其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含指導區域及保守區域，該保守區域包含以下之一或多者： (a) 縮短之重複/反重複區域，其中該縮短之重複/反重複區域相對於SEQ ID NO: 900缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 缺失核苷酸37-48及53-64；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；或
(b) 縮短之髮夾1區域，其中該縮短之髮夾1缺少2個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91或缺失核苷酸85及92；或
(c) 縮短之髮夾2區域，其中該縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134；且
其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸144-145；
其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在其他實施例中，縮短之重複/反重複區域，其中縮短之重複/反重複區域相對於SEQ ID NO: 900缺少22個核苷酸。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO: 3011)之序列連接至核苷酸65。
在一些實施例中，先前實施例之指導RNA (gRNA)包含指導區域及保守區域，該保守區域包含： (a) 縮短之重複/反重複區域，其中該縮短之重複/反重複區域缺少18-22個核苷酸，其中
(i) 相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸37-48及53-64；且
(ii) 核苷酸36藉由6-10個核苷酸連接至核苷酸65；
(b) 縮短之髮夾1區域，其中該縮短之髮夾1相對於SEQ ID NO: 900缺少2個核苷酸，其中缺失核苷酸86及91或缺失核苷酸85及92；
(c) 縮短之髮夾2區域，其中該縮短之髮夾2缺少18個核苷酸，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸113-121及126-134；且
(d) 其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸144-145；
其中至少10個核苷酸係經修飾之核苷酸。
在其他實施例中，縮短之重複/反重複區域，其中縮短之重複/反重複區域相對於SEQ ID NO: 900缺少22個核苷酸。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UGAAAC之序列連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由10個核苷酸連接至核苷酸65。在其他實施例中，核苷酸36藉由包含核苷酸序列UUCGAAAGAC (SEQ ID NO: 3011)之序列連接至核苷酸65。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含： 指導序列，其包含：
在前四個核苷酸1-4處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間之PS鍵聯；及
在該指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63，其包含：
在核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
該縮短之重複/反重複區域與該縮短之髮夾1區域之間的核苷酸76-77之間之PS鍵聯；
縮短之髮夾1區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，其包含：
在核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
在該縮短之髮夾1區域與該縮短之髮夾2區域之間之核苷酸101處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135，其包含：
在核苷酸104、110、111、122-125、142及143處經2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間之PS鍵聯，
其中相對於SEQ ID NO: 900視情況缺失一或兩個核苷酸144-145。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含： 指導序列，其包含：
在前四個核苷酸1-4處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間之PS鍵聯；及
在該指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63，其包含：
在核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，其包含：
在核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
在該縮短之髮夾1區域與該縮短之髮夾2區域之間之核苷酸101處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135，其包含：
在核苷酸104、110、111、122-125、142及143處經2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間之PS鍵聯，
其中相對於SEQ ID NO: 900視情況缺失一或兩個核苷酸144-145。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含： 指導序列，其包含：
在前四個核苷酸1-4處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間之PS鍵聯；及
在該指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63，其包含：
在核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
該縮短之重複/反重複區域與該縮短之髮夾1區域之間的核苷酸76-77之間之PS鍵聯；
縮短之髮夾1區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，其包含：
在核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
在該縮短之髮夾1區域與該縮短之髮夾2區域之間之核苷酸101處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135，其包含：
在核苷酸104、106-111、122-125、142及143處經2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間之PS鍵聯，
其中相對於SEQ ID NO: 900視情況缺失一或兩個核苷酸144-145。
在一些實施例中，提供指導RNA (gRNA)，該gRNA包含： 指導序列，其包含：
在前四個核苷酸1-4處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
核苷酸1-2、2-3及3-4之間之PS鍵聯；及
在該指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之重複/反重複區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63，其包含：
在核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾1區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，其包含：
在核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
在該縮短之髮夾1區域與該縮短之髮夾2區域之間之核苷酸101處經2'-O-Me修飾之核苷酸；
縮短之髮夾2區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135，其包含：
在核苷酸104、106-111、122-125、142及143處經2'-O-Me修飾之核苷酸，
核苷酸141-142及142-143之間之PS鍵聯，
其中相對於SEQ ID NO: 900視情況缺失一或兩個核苷酸144-145。
在一些實施例中，NmeCas9 sgRNA包含本文所揭示之任一Nme Cas9指導序列及額外核苷酸以形成crRNA，該crRNA例如在其3’末端具有跟隨指導序列之以下例示性支架核苷酸序列：GUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA (SEQ ID NO: 899)。
在一些實施例中，NmeCas9 sgRNA包含本文所揭示之任一指導序列及額外核苷酸以形成crRNA，該crRNA在其3’末端具有跟隨指導序列之以下核苷酸序列：(N)
20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU (SEQ ID NO: 901)；
(N)
20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGU
GCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU (SEQ ID NO: 902)；
(N)
20-25GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU (SEQ ID NO: 903)
其中除非另有說明，否則A、C、G、U及N分別係腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任何核糖核苷酸。在一些實施例中，N等於24。在一些實施例中，N等於25。
在一些實施例中，sgRNA包含保守區域，該保守區域包含5’至3’定向上之以下序列中之一者：GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU (SEQ ID NO: 906)；或
mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 1082)；或
SEQ ID NO: 1081-1089中任一者，其中除非另有說明，否則A、C、G、U及N分別係腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、尿嘧啶及任何核糖核苷酸。m指示2’O-甲基修飾，且*指示核苷酸之間之硫代磷酸酯鍵聯。
在某些實施例中，指導序列之長度為20-25個核苷酸((N)
20-25)，其中每一核苷酸可經獨立地修飾。在某些實施例中，指導之5’末端之核苷酸1-3中之每一者經獨立地修飾。在某些實施例中，指導之5’末端之核苷酸1-3中之每一者經2’-OMe修飾獨立地修飾。在某些實施例中，指導之5’末端之核苷酸1-3中之每一者獨立地經與毗鄰核苷酸殘基之硫代磷酸酯鍵聯修飾。在某些實施例中，指導之5’末端之核苷酸1-3中之每一者獨立地經2’-OMe修飾及與毗鄰核苷酸殘基之硫代磷酸酯鍵聯修飾。
在某些實施例中，sgRNA，諸如包含例示性NmeCas9 sgRNA之sgRNA，進一步包括3’尾，例如1、2、3、4或更多個核苷酸之3’尾。在某些實施例中，尾包括一或多個經修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾之核苷酸選自：2’-O-甲基(2’-OMe)修飾之核苷酸、2’-O-(2-甲氧基乙基) (2’-O-moe)修飾之核苷酸、2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸、核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵聯及反向無鹼基修飾之核苷酸或其組合。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括2’-OMe修飾之核苷酸。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括核苷酸之間之PS鍵聯。在某些實施例中，經修飾之核苷酸包括經2’-OMe修飾之核苷酸及核苷酸之間之PS鍵聯。
在一些實施例中，指導RNA係經化學修飾之指導RNA。在一些實施例中，指導RNA係經化學修飾之單指導RNA。經化學修飾之指導RNA可包含如
表 1-5中所示之一或多種修飾。經化學修飾之指導RNA可包含SEQ ID NO: 904-909、911、995-997及1081-1089中任一者之一或多個經修飾核苷酸。
在一些實施例中，指導RNA係包含SEQ ID NO: 904-909、911、995-997及1081-1089中任一者中所示修飾模式之sgRNA。
在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 907中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 907之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 907之序列或與SEQ ID NO: 907至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 995中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 995之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 995之序列或與SEQ ID NO: 995至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 996中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 996之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 996之序列或與SEQ ID NO: 996至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 997中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 997之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 997之序列或與SEQ ID NO: 997至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。
在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1082中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1082之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1082之序列或與SEQ ID NO: 1082至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1083中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1083之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1083之序列或與SEQ ID NO: 1083至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1084中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1084之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1084之序列或與SEQ ID NO: 1084至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1085中所示之修飾模式。在一些實施例中，指導RNA包含sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1085之經修飾核苷酸，包括本文所揭示之指導序列。在一些實施例中，指導RNA係sgRNA，該sgRNA包含SEQ ID NO: 1085之序列或與SEQ ID NO: 1085至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之序列。
指導RNA可進一步包含trRNA。在本文所述之每一組成物及方法實施例中，crRNA及trRNA可締合為單一RNA (sgRNA)或可在分開RNA (dgRNA)上。在sgRNA之背景下，crRNA及trRNA組分可共價連接，例如，經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵。在一些實施例中，crRNA或trRNA序列可稱為指導RNA之「支架」或「保守部分」。
在本文所述之組成物、用途及方法實施例中之每一者中，指導RNA可包含兩個RNA分子作為「雙指導RNA」或「dgRNA」。dgRNA包含含有crRNA之第一RNA分子及包含trRNA之第二RNA分子，該crRNA包含例如
表 1-5中所示之指導序列。第一與第二RNA分子可不共價連接，但可經由crRNA與trRNA之部分之間的鹼基配對形成RNA雙鏈體。
在本文所述之組成物、用途及方法實施例中之每一者中，指導RNA可包含單一RNA分子作為「單指導RNA」或「sgRNA」。sgRNA可包含共價連接至trRNA之crRNA (或其一部分)，該crRNA包含
表 1中所示之指導序列。sgRNA可包含
表 1-5中所示之指導序列之20、21、22、23或24個鄰接核苷酸。在一些實施例中，crRNA與trRNA經由連接體共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA及trRNA之部分之間的鹼基配對而形成莖環結構。在一些實施例中，crRNA與trRNA經由一或多個不為磷酸二酯鍵之鍵共價連接。
在一些實施例中，trRNA可包含全部或部分源自天然存在之CRISPR/Cas系統之trRNA序列。在一些實施例中，trRNA包含截短之或修飾之野生型trRNA。trRNA之長度端視所用之CRISPR/Cas系統而定。在一些實施例中，trRNA包含或由以下組成：55、60、65、70、75、80、85、90、100或超過100個核苷酸。在一些實施例中，trRNA可包含某些二級結構，諸如例如一或多個髮夾或莖環結構，或一或多個凸起結構。
在一些實施例中，提供包含一或多種指導RNA之組成物，該指導RNA包含
表 1-5中任一者之指導序列。
在一個態樣中，提供包含指導RNA之組成物，該指導RNA包含與
表 1-5中之任何核酸至少90%或95%一致之指導序列。
在其他實施例中，提供一種組成物，其包含至少一個(例如，至少兩個) gRNA，該等gRNA包含選自
表 1-5中所示之任兩個或更多指導序列之指導序列。在一些實施例中，該組成物包含至少兩個gRNA，各自包含與
表 1-5中所示之任何核酸至少90%或95%一致之指導序列。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別(例如，雜交至) HLA-A中之靶序列。舉例而言，HLA-A靶序列可藉由所提供的包含指導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)可藉由指導RNA引導至HLA-A中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交且RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)將靶序列裂解。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別(或雜交至) TRAC中之靶序列。舉例而言，TRAC靶序列可藉由所提供的包含指導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)可藉由指導RNA引導至TRAC中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交且RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)將靶序列裂解。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別(例如，雜交至) TRBC1中之靶序列。舉例而言，TRBC1靶序列可藉由所提供的包含指導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)可藉由指導RNA引導至TRBC1中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交且RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)將靶序列裂解。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別(例如，雜交至) TRBC2中之靶序列。舉例而言，TRBC2靶序列可藉由所提供的包含指導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)可藉由指導RNA引導至TRBC2中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交且RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)將靶序列裂解。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別(例如，雜交至) CIITA中之靶序列。舉例而言，CIITA靶序列可藉由所提供的包含指導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)可藉由指導RNA引導至CIITA中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交且RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)將靶序列裂解。
在一些實施例中，本發明之指導RNA組成物經設計以識別(例如，雜交至) AAVS1中之靶序列。舉例而言，AAVS1靶序列可藉由所提供的包含指導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)可藉由指導RNA引導至AAVS1中之靶序列，其中指導RNA之指導序列與靶序列雜交且RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas裂解酶)將靶序列裂解。
在一些實施例中，一或多種指導RNA之選擇係基於HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA或AAVS1內之靶序列來確定。在一些實施例中，該組成物包含一或多個指導序列，該等指導序列包含與根據來自人類參考基因體hg38之坐標，表1-5中所示之對應基因體區域互補之指導序列。其他實施例之指導序列可與HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA或AAVS1內緊鄰表1-5中任一者中所列基因體坐標之序列互補。舉例而言，其他實施例之指導序列可與包含表1-5中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列互補。
不受任何特定理論束縛，靶基因某些區域中之修飾(例如，由插入/缺失引起之框移突變，作為核酸酶介導之DSB的結果而發生)可能比其他區域中之突變更不能容許，因此，DSB之位置係可能產生的蛋白敲低之量或類型之重要因素。在一些實施例中，與靶基因內之靶序列互補或具有互補性之gRNA用於將RNA指導之DNA結合劑引導至靶基因中之特定位置。
在一些實施例中，Nme指導序列與HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA或AAVS1基因中存在之靶序列之反向互補序列至少90%或95%或100%一致。在一些實施例中，靶序列可與指導RNA之指導序列互補。在一些實施例中，Nme指導RNA之指導序列與其對應靶序列之間的互補性或一致性程度係至少80%、85%、90%或95%；或100%。在一些實施例中，靶序列與gRNA之指導序列可100%互補或一致。
在一些實施例中，靶序列與Nme gRNA之指導序列可含有至少一個失配。舉例而言，靶序列及gRNA之指導序列可含有1或2個、不太較佳3或4個失配，其中指導序列之總長度係24個核苷酸。在一些實施例中，靶序列及gRNA之指導序列可含有1-2個失配，其中指導序列係24個核苷酸。
在一些實施例中，Nme指導序列包含選自SEQ ID NO: 2-80、101-120、201-265、301、302、304-576及601-774之序列之至少21、22、23或24個鄰接核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之組成物或調配物包含含有開放閱讀框(ORF)之mRNA，該開放閱讀框編碼RNA指導之DNA結合劑，諸如如本文所述之Cas核酸酶。在一些實施例中，提供、使用或投與包含編碼RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas核酸酶)之ORF的mRNA。
在一些實施例中，gRNA經化學修飾。包含一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾之」gRNA或「經化學修飾之」gRNA，以闡述一或多種非天然或天然存在組分或組態之存在，該等組分或組態用於代替或補充規範A、G、C及U殘基。經修飾之核苷及核苷酸可包括以下中之一或多者：(i)改變，例如，置換磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或兩個非連接磷酸氧或一或多個連接磷酸氧(例示性主鏈修飾)；(ii)改變，例如，置換核糖之成分，例如核糖上之2'羥基(例示性糖修飾)；(iii)用「去磷酸化」連接體批量置換磷酸部分(例示性主鏈修飾)；(iv)天然存在之核鹼基之修飾或置換，包括用非規範核鹼基(例示性鹼基修飾)；(v)核糖-磷酸主鏈之置換或修飾(例示性主鏈修飾)；(vi)修飾寡核苷酸之3'末端或5'末端，例如末端磷酸基團之去除、修飾或置換或部分、帽或連接體之偶聯(此類3'或5'帽修飾可包含糖或主鏈修飾)；及(vii)糖之修飾或置換(例示性糖修飾)。
可組合化學修飾，諸如上文所列之彼等，以提供經修飾之gRNA，其包含可具有二個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)。舉例而言，經修飾之殘基可具有經修飾之糖及經修飾之核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每一鹼基皆經修飾，例如，所有鹼基皆具有經修飾之磷酸基團，諸如硫代磷酸酯基團。在某些實施例中，gRNA分子之所有或實質上所有磷酸基團經硫代磷酸酯基團置換。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之5'末端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA在RNA之3’末端處或附近包含至少一個經修飾之殘基。
在一些實施例中，gRNA包含一個、兩個、三個或更多個經修飾之殘基。在一些實施例中，經修飾之gRNA中至少5% (例如，至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之位置係經修飾之核苷或核苷酸。
在主鏈修飾之一些實施例中，經修飾殘基之磷酸基團可藉由用不同取代基置換一或多個氧來修飾。此外，經修飾之殘基，例如存在於經修飾核酸中之經修飾殘基，可包括用如本文所述之經修飾磷酸基團對未經修飾磷酸部分之全部置換。在一些實施例中，磷酸主鏈之主鏈修飾可包括導致不帶電荷之連接體或具有不對稱電荷分佈之帶電荷連接體之改變。
經修飾之磷酸基團之實例包括硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼酸磷酸鹽、硼酸磷酸酯、膦酸氫酯、胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。
亦可構築可模擬核酸之支架，其中磷酸酯連接體及核糖由核酸酶抗性核苷或核苷酸替代物置換。該等修飾可包含主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可由替代主鏈束縛。實例可包括但不限於嗎啉代、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷替代物。
經修飾之核苷及經修飾之核苷酸可包括對糖基團之一或多種修飾，亦即糖修飾。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如經許多不同「氧基」或「去氧」取代基置換。在一些實施例中，對2'羥基之修飾可增強核酸之穩定性，此乃因羥基不再能經去質子化以形成2'-烷氧離子。2'羥基修飾之實例可包括烷氧基或芳氧基(OR，其中「R」可為例如，烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，O(CH
2CH
2O)
nCH
2CH
2OR，其中R可為例如H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其用氟化物置換2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基可例如藉由C
1-
6伸烷基或C
1-6伸雜烷基橋連接至同一核糖之4'碳，其中例示性橋可包括亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺少C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包括甲氧基乙基(MOE)、(OCH
2CH
2OCH
3，例如PEG衍生物)。
「去氧」2'修飾可包括氫(
亦即去氧核糖，
例如，在部分dsRNA之突出部分)；鹵基(
例如，溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為
例如NH
2；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH
2CH
2NH)
nCH2CH
2-胺基(其中胺基可
例如如本文所述)、-NHC(O)R (其中R可為
例如烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷硫基烷基；硫代烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經
例如如本文所述之胺基取代。
糖修飾可包含糖基團，該糖基團亦可含有一或多個具有與核糖中相應碳之立體化學組態相反之立體化學組態的碳。因此，經修飾之核酸可包括含有
例如阿拉伯糖作為糖之核苷酸。經修飾之核酸亦可包括無鹼基糖。該等無鹼基糖亦可在一或多個組成糖原子處進一步修飾。經修飾之核酸亦可包括一或多種呈L形式之糖，
例如L-核苷。
可併入經修飾核酸中之本文所述經修飾核苷及經修飾核苷酸可包括經修飾之鹼基，亦稱為核鹼基。核鹼基之實例包括但不限於腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。該等核鹼基可經修飾或完全置換以提供可併入經修飾核酸中之經修飾殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包括例如鹼基之天然存在及合成衍生物。
在採用雙指導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者皆可含有修飾。該等修飾可在crRNA或tracr RNA之一端或兩端。在包含sgRNA之實施例中，sgRNA之一端或兩端處之一或多個殘基可經化學修飾，或整個sgRNA可經化學修飾。某些實施例包含5'末端修飾。某些實施例包含3'末端修飾。在某些實施例中，gRNA分子之單股突出端中之一或多個或所有核苷酸係去氧核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA包含2018年6月14日公開之WO2018/107028 A1中所揭示的修飾模式之一，該案之內容特此以全文引用之方式併入。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已用2’-O-Me修飾之核苷酸。術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示已經2’-F取代之核苷酸。「*」可用於描繪PS修飾。術語A*、C*、U*或G*可用於表示利用PS鍵連接至下一(例如，3’)核苷酸之核苷酸。術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」可用於表示已經2’-O-Me取代且利用PS鍵連接至下一(例如，3’)核苷酸之核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA包含一或多個內部連接體。如本文所用，「內部連接體」闡述在指導RNA內連接兩個核苷酸之非核苷酸區段。若gRNA含有間隔區，則內部連接體位於間隔區之外(例如，在gRNA之支架或保守區域中)。內部連接體之長度可端視例如連接體置換之核苷酸數目及連接體在gRNA中之位置。含有連接體之例示性gRNA揭示於2022年12月15日公開之WO 2022/261292 A1中，該文獻之內容特此以全文引用之方式併入。
本文所揭示之gRNA可包含內部連接體。通常，可使用與gRNA之功能相容之任何內部連接體。可能期望連接體具有一定程度之撓性。在一些實施例中，內部連接體包含至少兩個、三個、四個、五個、六個或更多個路徑上(on-pathway)單鍵。若一個鍵係5’及3’位置連接至連接體之兩個核苷酸之間鍵之最短路徑的一部分，則該鍵在路徑上。
如本文所用，內部連接體之長度可由其橋接長度界定。如本文所用，內部連接體之「橋接長度」係指路徑上自連接體之第一個原子(結合至前一核苷酸之3’取代基，諸如氧或磷酸酯)至連接體之最後一個原子(結合至後一核苷酸之5’取代基，諸如氧或磷酸酯) (例如，在下文所述的式(I)結構中自-至#)之最短原子鏈中的原子之距離或數目。下表中提供各種連接體之近似預測橋接長度。
以原子數計之例示性預測連接體長度、乙二醇單元數、假定乙二醇單體為約3.7埃而以埃計之近似連接體長度及用於取代髮夾結構之至少整個環部分之適宜位置提供於下
表 28中。兩個核苷酸之取代需要至少約11埃之連接體長度。至少3個核苷酸之取代需要至少約16埃之連接體長度。
表 28
| 原子數 | 乙二醇單元數 | 以埃計之近似長度 | 用於完整環取代之適宜位置 |
| 3 | 1 | 3.7 | 重複-反重複(當不存在莖時，對於環及莖二者而言) |
| 6 | 2 | 7.4 | 重複-反重複(當不存在莖時，對於環及莖二者而言) |
| 9 | 3 | 11.1 | 重複-反重複(當不存在莖時，對於環及莖二者而言)，連結部(Nexus) |
| 12 | 4 | 14.8 | 連結部 |
| 15 | 5 | 18.5 | 重複-反重複、髮夾1、髮夾2 |
| 18 | 6 | 22.2 | 重複-反重複、髮夾1、髮夾2 |
| 21 | 7 | 25.9 | 重複-反重複、髮夾1、髮夾2 |
| 24 | 8 | 29.6 | 重複-反重複、髮夾1、髮夾2 |
| 27 | 9 | 33.3 | 重複-反重複、髮夾1、髮夾2 |
| 30 | 10 | 37 | 重複-反重複、髮夾1、髮夾2 |
在一些實施例中，內部連接體包含式(I)之結構：
~-L0-L1-L2-#
(I)
其中：
~指示與前一核苷酸之3’取代基之鍵；
#指示與後一核苷酸之5’取代基之鍵；
L0為空或C
1-3脂族；
L1係-[E
1-(R
1)]
m-，其中
每一R
1獨立地為C
1-5脂族基團，視情況經1或2個E
2取代，
每一E
1及E
2獨立地為氫鍵受體，或各自獨立地選自環烴及雜環烴，且
每一m係1、2、3、4、5、6、7、8、9或10；且
L2為空、C
1-3脂族基，或係氫鍵受體。
在一些實施例中，L1包含一或多個-CH
2CH
2O-、-CH
2OCH
2-或-OCH
2CH
2-單元(「乙二醇次單元」)。在一些實施例中，-CH
2CH
2O-、-CH
2OCH
2-或-OCH
2CH
2-單元之數目在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10之範圍內。
在一些實施例中，m係1、2、3、4或5。在一些實施例中，m係1、2或3。在一些實施例中，m係6、7、8、9或10。
在一些實施例中，L0為空。在一些實施例中，L0係-CH
2-或-CH
2CH
2-。
在一些實施例中，L2為空。在一些實施例中，L2係-O-、-S-或C
1-3脂族基。在一些實施例中，L2係-O-。在一些實施例中，L2係-S-。在一些實施例中，L2係-CH
2-或-CH
2CH
2-。
在本文之表中，L1及L2視情況分別係如下C9及C18：
在某些實施例中，內部連接體具有約3-30個原子、視情況12-21個原子之橋接長度，且連接體取代gRNA之至少2個核苷酸。在某些實施例中，內部連接體具有約6-18個原子、視情況約6-12個原子之橋接長度，且連接體取代gRNA之至少2個核苷酸。在某些實施例中，內部連接體取代2-12個核苷酸。
在一些實施例中，指導RNA包含SEQ ID NO: 900之核酸序列，包括本文別處所揭示之修飾。
表 29顯示gRNA結構及種類與可能的內部連接體數目及位置之各種實施例。
表 29.
| gRNA 結構 | 類型 | 內部連接體數目 | 內部連接體之位置 |
| 重複/反重複；Hp1；Hp2 | Nme | 3 | 所有重複/反重複；Hp1；Hp2 |
| 重複/反重複；Hp1；Hp2 | Nme | 2 | 重複/反重複；Hp1；Hp2中之任兩者 |
| 重複/反重複；Hp1；Hp2 | Nme | 1 | 重複/反重複；Hp1；Hp2中之任一者 |
在某些實施例中，內部連接體在gRNA之重複-反重複區域中。在某些實施例中，內部連接體取代gRNA之重複-反重複區域之至少4個核苷酸。在某些實施例中，內部連接體取代Nme Cas9 gRNA之重複-反重複區域中之環，該環對應於SEQ ID NO: 900中之核苷酸49-52。
在某些實施例中，內部連接體在gRNA之髮夾區域中。在某些實施例中，內部連接體取代gRNA之髮夾區域之至少4個核苷酸。在某些實施例中，內部連接體取代Nme Cas9 gRNA之髮夾1區域中之環，該環對應於SEQ ID NO: 900中之核苷酸87-90。在某些實施例中，內部連接體取代Nme Cas9 gRNA之髮夾2區域中的至少4個核苷酸之環，該環對應於SEQ ID NO: 900中之核苷酸122-125。在某些實施例中，內部連接體取代Nme Cas9 gRNA之髮夾1區域中之環，該環對應於SEQ ID NO: 900中之核苷酸87-90，且取代Nme Cas9 gRNA之髮夾2區域中的至少4個核苷酸之環，該環對應於SEQ ID NO: 900中之核苷酸122-125。
表6. 例示性NmeCas9 sgRNA (SEQ ID NO: 900)
B. 核糖核蛋白複合物
| 1-24 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 | |
| NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN | G | U | U | G | U | A | G | C | U | C | C | C | U | U | U | C | U | C | A | U | U | U | C | G | |
| 下部莖 | 上部莖 | ||||||||||||||||||||||||
| 指導區域 | 重複/ 反重複區域 |
| 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | 55 | 56 | 57 | 58 | 59 | 60 | 61 | 62 | 63 | 64 | 65 | 66 | 67 | 68 | 69 | 70 | 71 | 72 | 73 | 74 | 75 | 76 | 77 |
| G | A | A | A | C | G | A | A | A | U | G | A | G | A | A | C | C | G | U | U | G | C | U | A | C | A | A | U | A |
| 環 | 上部莖 | 下部莖 | ||||||||||||||||||||||||||
| 重複/ 反重複區域 |
| 78 | 79 | 80 | 81 | 82 | 83 | 84 | 85 | 86 | 87 | 88 | 89 | 90 | 91 | 92 | 93 | 94 | 95 | 96 | 97 | 98 | 99 | 100 | 101 | 102 | 103 | 104 | 105 | 106 | 107 | 108 |
| A | G | G | C | C | G | U | C | U | G | A | A | A | A | G | A | U | G | U | G | C | C | G | C | A | A | C | G | C | U | C |
| 莖 | 環 | 莖(96：未配對) | 下部莖 | 凸起 | ||||||||||||||||||||||||||
| 髮夾1 | 髮夾2 |
| 109 | 110 | 111 | 112 | 113 | 114 | 115 | 116 | 117 | 118 | 119 | 120 | 121 | 122 | 123 | 124 | 125 | 126 | 127 | 128 | 129 | 130 | 131 | 132 | 133 | 134 |
| U | G | C | C | C | C | U | U | A | A | A | G | C | U | U | C | U | G | C | U | U | U | A | A | G | G |
| 上部莖 | 環 | 上部莖 | |||||||||||||||||||||||
| 髮夾2 |
| 135 | 136 | 137 | 138 | 139 | 140 | 141 | 142 | 143 | 144 | 145 |
| G | G | C | A | U | C | G | U | U | U | A |
| 上部莖 | 凸起 | 下部莖 | ||||||||
| 髮夾2 | 尾 |
在一些實施例中，本揭示案提供組成物，其包含一或多種gRNA，該一或多種gRNA包含一或多個來自
表 1-5之指導序列；及RNA指導之DNA結合劑，例如，核酸酶，諸如Cas核酸酶，諸如Cas9。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱為雙股內核酸酶活性。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包括腦膜炎奈瑟氏球菌及此項技術中已知之其他原核生物之II型CRISPR系統之彼等，及其經修飾(例如，經工程改造或突變體)型式。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas切口酶。在一些實施例中，RNA指導之切口酶經修飾或衍生自Cas蛋白，諸如2類Cas核酸酶(其可為例如II型Cas核酸酶)。2類Cas核酸酶包括例如Cas9蛋白及其修飾。
在一些實施例中，Cas核酸酶係來自腦膜炎奈瑟氏球菌之Cas9核酸酶。
在一些實施例中，Cas切口酶係來自腦膜炎奈瑟氏球菌之Cas9核酸酶之切口酶形式。參見例如WO/2020081568，其闡述Nme2Cas9 D16A切口酶融合蛋白。
在一些實施例中，gRNA與RNA指導之DNA結合劑一起稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑係Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA連同Cas核酸酶一起稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包含II型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白。在一些實施例中，gRNA連同Cas9一起稱為Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域裂解非靶DNA股，且HNH結構域裂解DNA之靶股。在一些實施例中，Cas9蛋白包含超過一個RuvC結構域或超過一個HNH結構域。在一些實施例中，Cas9蛋白係野生型Cas9。在組成物、用途及方法實施例中之每一者中，Cas誘導靶DNA中之雙股斷裂。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白之一個結構域或區域由不同蛋白之一部分置換。在一些實施例中，Cas核酸酶結構域可經來自不同核酸酶(諸如Fok1)之結構域置換。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾之核酸酶。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑具有單股切口酶活性，亦即可切割一條DNA股以產生單股斷裂，亦稱為「切口」。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含Cas切口酶。切口酶係在dsDNA中產生切口之酶，亦即，切割DNA雙螺旋之一條股但不切割另一條股。在一些實施例中，Cas切口酶係Cas核酸酶(例如，上文所論述之Cas核酸酶)之一種型式，其中核酸內切活性位點不活化，例如，藉由催化結構域中之一或多個改變(例如，點突變)。關於Cas切口酶及例示性催化結構域改變之論述，參見例如美國專利第8,889,356號。在一些實施例中，Cas切口酶(諸如Cas9切口酶)具有不活化之RuvC或HNH結構域。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑經修飾以僅含有一個功能性核酸酶結構域。舉例而言，劑蛋白可經修飾而使得一個核酸酶結構域突變或完全或部分缺失以降低其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有活性降低之RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性RuvC結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有活性降低之HNH結構域之切口酶。在一些實施例中，使用具有無活性HNH結構域之切口酶。
在一些實施例中，Cas蛋白核酸酶結構域內之保守胺基酸經取代以降低或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可包含RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之胺基酸取代。腦膜炎奈瑟氏球菌之HNH或HNH樣核酸酶結構域或RuvC或RuvC樣結構域中之例示性胺基酸取代包括Nme2Cas9D16A (HNH切口酶)及Nme2Cas9H588A (RuvC切口酶)。
在一些實施例中，編碼切口酶之mRNA與分別同靶序列之有義股及反義股互補之一對指導RNA組合提供。在該實施例中，指導RNA將切口酶引指至靶序列且藉由在靶序列之相反股上生成切口(亦即，雙切口)而引入DSB。在一些實施例中，使用雙切口可改良特異性且降低脫靶效應。在一些實施例中，將切口酶與靶向相反DNA股之兩個單獨指導RNA一起使用以在靶DNA中產生雙切口。在一些實施例中，切口酶與兩個單獨指導RNA一起使用，該兩個指導RNA經選擇為密切接近以在靶DNA中產生雙切口。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑缺少裂解酶及切口酶活性。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含dCas DNA結合多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，但基本上缺少催化(裂解酶/切口酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽係dCas9多肽。在一些實施例中，缺少裂解酶及切口酶活性之RNA指導之DNA結合劑或dCas DNA結合多肽為Cas核酸酶(例如，上文論述之Cas核酸酶)之型式，其中其核酸內切活性位點經不活化，例如，藉由其催化結構域中之一或多個改變(例如，點突變)。參見，例如US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含一或多個異源功能結構域(例如，係或包含融合多肽)。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含APOBEC3去胺酶。在一些實施例中，APOBEC3去胺酶係APOBEC3A (A3A)。在一些實施例中，A3A係人類A3A。在一些實施例中，A3A係野生型A3A。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含去胺酶及RNA指導之切口酶。在一些實施例中，mRNA進一步包含連接體以將編碼A3A之序列連接至編碼RNA指導之切口酶之序列。在一些實施例中，連接體係有機分子、基團、聚合物或化學部分。在一些實施例中，連接體係肽連接體。在一些實施例中，肽連接體係具有至少1個、至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個、至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少40個、至少50個或更多個胺基酸之任何胺基酸延伸。在一些實施例中，肽連接體係16個殘基之「XTEN」連接體或其變異體(參見，例如實例及Schellenberger等人A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。
在一些實施例中，肽連接體係16個殘基之「XTEN」連接體或其變異體(參見，例如實例及Schellenberger等人A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat. Biotechnol. 27, 1186-1190 (2009))。在一些實施例中，XTEN連接體包含序列SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 930)、SGSETPGTSESA (SEQ ID NO: 931)或SGSETPGTSESATPEGGSGGS (SEQ ID NO: 932)。
在一些實施例中，肽連接體包含(GGGGS)
n(SEQ ID NO: 998)、(G)
n、(EAAAK)
n(SEQ ID NO: 935)、(GGS)
n、SGSETPGTSESATPES (SEQ ID NO: 930)模體(
參見，例如，Guilinger J P, Thompson D B, Liu D R. Fusion of catalytically inactive Cas9 to FokI nuclease improves the specificity of genome modification.
Nat. Biotechnol.2014; 32(6): 577-82；其全部內容以引用方式併入本文)或(XP)
n模體或該等中任何項之組合，其中n獨立地為1與30之間之整數(SEQ ID NO: 3012)。參見WO2015089406，例如第[0012]段，其全部內容以引用方式併入本文。
在一些實施例中，肽連接體包含一或多個選自SEQ ID NO: 930-994之序列。
在一些實施例中，異源功能結構域可促進RNA指導之DNA結合劑轉運至細胞核中。舉例而言，異源功能結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與2、3或4個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與一個NLS融合。當使用一個NLS時，NLS可連接在RNA指導之DNA結合劑序列之N末端或C末端。在一些實施例中，NLS不連接至C末端。其亦可插入RNA指導之DNA結合劑序列內。在某些情況下，至少兩個NLS係相同的(例如，兩個SV40 NLS)。在某些實施例中，RNA指導之DNA結合劑中存在至少兩個不同的NLS。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑融合至在羧基末端連接之兩個SV40 NLS序列。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個NLS在N末端連接且一個NLS在C末端連接。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單部分序列，諸如例如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 3013)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 923)。在一些實施例中，NLS可為二分序列，諸如核質蛋白之NLS，KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 924)。在特定實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 3013) NLS可在RNA指導之DNA結合劑之C末端連接。一或多個連接體視情況包括在融合位點處。在一些實施例中，NLS包含一或多個選自SEQ ID NO: 912-924之序列。
在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑包含編輯子。例示性編輯子係BC22n，其包括藉由XTEN連接體融合至
NmeD16A Cas9切口酶之智人(
H. sapiens) APOBEC3A，以及編碼BC22n之mRNA。提供編碼NmeCas9 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)。
在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠改變RNA指導之DNA結合劑之細胞內半衰期。在一些實施例中，可增加RNA指導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑之半衰期可減少。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠增加RNA指導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可能能夠降低RNA指導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源功能結構域可充當用於蛋白降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白降解可由蛋白水解酶介導，該等蛋白水解酶諸如例如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶。在一些實施例中，異源功能結構域可包含PEST序列。在一些實施例中，RNA指導之DNA結合劑可藉由添加泛素或多泛素鏈來修飾。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包括小泛素樣修飾劑(SUMO)、泛素交叉反應蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關修飾劑-1 (URM1)、神經元前驅物細胞表現之發育下調蛋白-8(NEDD8，在釀酒酵母(
S. cerevisiae)中亦稱為Rub1)、人類白血球抗原F相關(FAT10)、自噬-8 (ATG8)及自噬-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊修飾劑-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源功能結構域可為標記物結構域。標記物結構域之非限制性實例包括螢光蛋白、純化標籤、抗原決定基標籤及報告基因序列。在一些實施例中，標記物結構域可為螢光蛋白。適宜螢光蛋白之非限制性實例包括綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midorishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed-Monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任何其他適宜螢光蛋白。在其他實施例中，標記物結構域可為純化標籤或抗原決定基標籤。非限制性例示性標籤包括麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、幾丁質結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis (SEQ ID NO: 3014)、8xHis (SEQ ID NO: 3015)、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚-His及鈣調蛋白。非限制性例示性報告基因包括谷胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯黴素乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在額外實施例中，異源功能結構域可將RNA指導之DNA結合劑靶向特定的細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源功能結構域可將RNA指導之DNA結合劑靶向粒腺體。
在其他實施例中，異源功能結構域可為效應結構域，諸如編輯子結構域。當將RNA指導之DNA結合劑引導至其靶序列時，例如，當Cas核酸酶由gRNA引導至靶序列時，效應物(諸如編輯子結構域)可修飾或影響靶序列。在一些實施例中，效應物(諸如編輯子結構域)可選自核酸結合結構域、核酸酶結構域(例如，非Cas核酸酶結構域)、表觀遺傳修飾結構域、轉錄活化結構域或轉錄阻遏物結構域。在一些實施例中，異源功能結構域係核酸酶，諸如FokI核酸酶。參見例如美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源功能結構域為轉錄活化物或阻遏物。參見，例如Qi等人, 「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,」
Cell152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人, 「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,」
Nat. Methods10:973-6 (2013)；Mali等人, 「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,」
Nat. Biotechnol.31:833-8 (2013)；Gilbert等人, 「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,」
Cell154:442-51 (2013)。因此，RNA指導之DNA結合劑基本上變為轉錄因子，其可使用指導RNA引導以結合期望靶序列。
C. 指導 RNA 之功效之確定
在一些實施例中，當與形成RNP之其他組分(例如，RNA指導之DNA結合劑)一起遞送或表現時，確定指導RNA之功效。在一些實施例中，指導RNA與RNA指導之DNA結合劑(諸如Cas蛋白，例如Cas9)一起表現。在一些實施例中，指導RNA經遞送至或表現於已穩定表現RNA指導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)之細胞株中。在一些實施例中，將指導RNA作為RNP之一部分遞送至細胞中。在一些實施例中，將指導RNA連同編碼RNA指導之DNA核酸酶(諸如Cas核酸酶或切口酶，例如Cas9核酸酶或切口酶)的mRNA一起遞送至細胞中。
如本文所述，使用本文所揭示之RNA指導之DNA核酸酶及指導RNA可導致DSB、SSB或導致DNA或前mRNA中之核酸修飾之位點特異性結合，此可在由細胞機制修復後產生插入/缺失(插入/缺失)突變形式之錯誤。許多由插入/缺失引起之突變改變閱讀框，引入過早終止密碼子或誘導外顯子跳躍，且因此產生非功能性蛋白。
在一些實施例中，基於體外模型來確定特定指導RNA之功效。在一些實施例中，體外模型係T細胞株。在一些實施例中，體外模型係HEK293 T細胞。在一些實施例中，體外模型係穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，體外模型係類淋巴母細胞細胞株。在一些實施例中，體外模型係原代人類T細胞。在一些實施例中，體外模型係原代人類B細胞。在一些實施例中，體外模型係原代人類周邊血淋巴球。在一些實施例中，體外模型係原代人類周邊血單核細胞。
在一些實施例中，在體外模型中發生缺失或插入之脫靶位點之數目係例如藉由分析來自用Cas9 mRNA及指導RNA在體外轉染之細胞的基因體DNA來確定。在一些實施例中，該確定包括分析來自用Cas9 mRNA、指導RNA及供體寡核苷酸在體外轉染之細胞的基因體DNA。下文工作實例中提供該等確定之例示性程序。
在一些實施例中，在用於指導RNA選擇過程之多個體外細胞模型中確定特定gRNA之功效。在一些實施例中，實施資料與所選指導RNA之細胞株比較。在一些實施例中，實施多細胞模型中的交叉篩選。
在一些實施例中，基於體內模型來確定特定指導RNA之功效。在一些實施例中，體內模型係囓齒動物模型。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現靶基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現
HLA-A基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類
HLA-A基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現
HLA-B基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類
HLA-B基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現
TRAC基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類
TRAC基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現
TRBC1基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類
TRBC1基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類
TRBC2基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現
TRBC2基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現
CIITA基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒動物模型係表現人類
CIITA基因之小鼠。在一些實施例中，體內模型係非人類靈長類動物，例如食蟹獼猴。
在一些實施例中，藉由中靶裂解效率來評價指導RNA之功效。在一些實施例中，藉由靶位置(例如，HLA-A、TRAC、TRBC、CIITA或AAVS1)處之編輯百分比來量測指導RNA之功效。在一些實施例中，深度定序可用於鑑別由基因體編輯引入之修飾(例如，插入、缺失)之存在。可自次世代定序「NGS」計算插入/缺失百分比。
在一些實施例中，藉由靶細胞類型基因體內脫靶序列處的插入/缺失之數目或頻率來量測指導RNA之功效。在一些實施例中，提供有效的指導RNA，其以極低頻率(例如，＜ 5%)在細胞群體中或相對於靶位點處插入/缺失之生成頻率在脫靶位點處產生插入/缺失。因此，本揭示案提供在靶細胞類型(例如，T細胞或B細胞)中不展現脫靶插入/缺失形成或在細胞群體中或相對於靶位點處插入/缺失之生成頻率產生＜ 5%之脫靶插入/缺失形成頻率的指導RNA。在一些實施例中，本揭示案提供在靶細胞類型(例如，T細胞或B細胞)中不展現任何脫靶插入/缺失形成的指導RNA。在一些實施例中，提供例如如藉由本文所述之一或多種方法所評價在少於5個脫靶位點處產生插入/缺失的指導RNA。在一些實施例中，提供例如如藉由本文所述之一或多種方法所評價在少於或等於4、3、2或1個脫靶位點處產生插入/缺失的指導RNA。在一些實施例中，一或多個脫靶位點不出現在靶細胞(例如，T細胞或B細胞)基因體之蛋白編碼區中。
在一些實施例中，使用線性擴增來偵測基因體編輯事件，諸如靶DNA中之形成插入/缺失(「插入/缺失」)突變、易位及同源定向修復(HDR)事件。舉例而言，可使用利用唯一序列標記之引子及分離標記之擴增產物之線性擴增(下文稱為「UnIT」或「唯一識別碼標記(Unique Identifier Tagmentation)」方法)。
在一些實施例中，藉由靶細胞類型內染色體重排之數目來量測指導RNA之功效。Kromatid dGH分析可用於偵測染色體重排，包括例如易位、相互易位、向脫靶染色體之易位、缺失(亦即，由於編輯事件而導致片段在細胞複製循環期間丟失之染色體重排)。在一些實施例中，靶細胞類型具有少於10個、少於8個、少於5個、少於4個、少於3個、少於2個或少於1個染色體重排。在一些實施例中，靶細胞類型不具有染色體重排。
D. gRNA 組成物之遞送
脂質奈米粒子(LNP)係用於遞送核苷酸及蛋白貨物之熟知手段，且可用於遞送本文所揭示之指導RNA、組成物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP將核酸、蛋白或核酸連同蛋白一起遞送。
在一些實施例中，本發明包含用於將本文所揭示之任一種gRNA遞送至個體之方法，其中將gRNA調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含含有所揭示之任一種gRNA及LNP之組成物。在一些實施例中，該組成物進一步包含Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，LNP包含陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包含(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸酯) (脂質A)或另一可電離脂質。參見例如WO/2017/173054之脂質及其中所述之參考文獻。在一些實施例中，LNP包含約4.5、5.0、5.5、6.0或6.5之莫耳比之陽離子脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)。在一些實施例中，術語陽離子及可電離在LNP脂質之背景下係可互換的，例如，其中可電離脂質端視pH而定係陽離子的。
在一些實施例中，LNP包含脂質組分，且脂質組分包含：約35 mol%脂質A；約15 mol%中性脂質(例如，二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC))；約47.5 mol%輔助脂質(例如，膽固醇)；及約2.5 mol%之隱形脂質(例如，1,2-二肉荳蔻醯基-外消旋-甘油-3-甲基聚氧乙二醇2000 (PEG2k-DMG))，且其中LNP組成物之N/P比為約3-7。
在一些實施例中，本文所揭示之gRNA調配為用於製備用於治療疾病或病症之藥劑之LNP。
電穿孔係用於遞送貨物之熟知手段，且任何電穿孔方法皆可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA。在一些實施例中，電穿孔可用於遞送本文所揭示之任一種gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包含用於將本文所揭示之任一種gRNA遞送至離體細胞之方法，其中將gRNA調配為LNP或不調配為LNP。在一些實施例中，LNP包含gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，單獨或在一或多種載體上編碼的本文所述之指導RNA組成物經調配在脂質奈米粒子中或經由脂質奈米粒子投與；參見，例如，WO/2017/173054及WO 2019/067992，其內容特此以全文引用之方式併入。
在某些實施例中，本發明包含DNA或RNA載體，其編碼包含本文所述之任一或多個指導序列之任何指導RNA。在一些實施例中，除了指導RNA序列之外，載體進一步包含不編碼指導RNA之核酸。不編碼指導RNA之核酸包括但不限於啟動子、強化子、調控序列及編碼RNA指導之DNA核酸酶(其可為核酸酶，諸如Cas9)之核酸。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA或crRNA與trRNA之一或多個核苷酸序列。在一些實施例中，載體包含編碼sgRNA之一或多個核苷酸序列及編碼RNA指導之DNA核酸酶(其可為Cas核酸酶，諸如Cas9)之mRNA。在一些實施例中，載體包含編碼crRNA、trRNA之一或多個核苷酸序列及編碼RNA指導之DNA核酸酶(其可為Cas蛋白，諸如Cas9)之mRNA。在一個實施例中，Cas9來自腦膜炎奈瑟氏球菌(亦即，Nme Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包含指導序列或由指導序列組成，該指導序列兩側係來自天然存在之CRISPR/Cas系統的重複序列之全部或一部分。包含crRNA、trRNA或crRNA及trRNA或由其組成之核酸可進一步包含載體序列，其中載體序列包含不與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起天然發現之核酸或由其組成。
IV. 治療方法及用途
本文所述之任何經工程改造之細胞及組成物皆可用於治療如本文所述之多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，經遺傳修飾之細胞(經工程改造之細胞)或經遺傳修飾之細胞(經工程改造之細胞)群體及組成物可用於治療多種疾病及病症之方法中。在一些實施例中，涵蓋治療本文所述之任一種疾病或病症之方法，其包括投與本文所述之任一或多種組成物。
在一些實施例中，本文所述之方法及組成物可用於治療需要遞送治療劑之疾病或病症。在一些實施例中，本發明提供在個體中提供免疫療法之方法，該方法包括向個體投與有效量的如本文所述之經工程改造之細胞(或經工程改造之細胞群體)，例如，任何上述細胞態樣及實施例之細胞。
在一些實施例中，該等方法包括向個體投與包含本文所述經工程改造之細胞之組成物作為過繼性細胞轉移療法。在一些實施例中，經工程改造之細胞係同種異體細胞。
在該等方法之一些實施例中，該等方法包括在向個體投與有效量的如本文所述之經工程改造之細胞(或多種經工程改造之細胞)，例如任何上述細胞態樣及實施例之細胞之前，投與淋巴球耗乏劑或免疫抑制劑。在另一態樣中，本發明提供製備經工程改造之細胞(例如，經工程改造之細胞群體)之方法。
免疫療法係藉由活化或抑制免疫系統來治療疾病。將設計成誘發或放大免疫反應之免疫療法歸類為活化免疫療法。已證實基於細胞之免疫療法可有效治療一些癌症。免疫效應細胞諸如淋巴球、巨噬細胞、樹突細胞、自然殺手細胞、細胞毒性T淋巴球(CTL)、T輔助細胞、B細胞或其前驅細胞諸如造血幹細胞(HSC)或誘導性多潛能幹細胞(iPSC)可經程式化以因應腫瘤細胞表面表現上之異常抗原來起作用。因此，癌症免疫療法允許免疫系統之組分破壞腫瘤或其他癌細胞。亦已證實基於細胞之免疫療法可有效治療自體免疫疾病或移植排斥。免疫效應細胞(諸如調控性T細胞(Treg)或間質幹細胞)可經編程以因應正常組織表面上表現之自身抗原或移植抗原起作用。
在一些實施例中，本發明提供製備經工程改造之細胞(例如，經工程改造之細胞群體)之方法。經工程改造之細胞群體可用於免疫療法。
在一些實施例中，本發明提供治療有需要之個體之方法，該方法包括投與藉由本文所述之製備細胞之方法(例如，製備細胞之方法之任何上述態樣及實施例之方法)製備的經工程改造之細胞。
在一些實施例中，經工程改造之細胞可用於治療癌症、感染性疾病、炎性疾病、自體免疫疾病、心血管疾病、神經疾病、眼科疾病、腎臟疾病、肝臟疾病、肌肉骨骼疾病、紅血球疾病或移植排斥。在一些實施例中，經工程改造之細胞可用於細胞移植，例如至心臟、肝臟、肺、腎臟、胰臟、皮膚或腦。(
參見，例如，Deuse等人, Nature Biotechnology 37:252-258 (2019)。)
在一些實施例中，經工程改造之細胞可用作包含同種異體幹細胞療法之細胞療法。在一些實施例中，細胞療法包含誘導性多潛能幹細胞(iPSC)。可誘導iPSC分化成其他細胞類型，包括例如β胰島細胞、神經元及血細胞。在一些實施例中，細胞療法包含造血幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包含可發育成骨、軟骨、肌肉及脂肪細胞之間質幹細胞。在一些實施例中，幹細胞包含眼部幹細胞。在一些實施例中，同種異體幹細胞移植包含同種異體骨髓移植。在一些實施例中，幹細胞包含多潛能幹細胞(PSC)。在一些實施例中，幹細胞包含誘導性胚胎幹細胞(ESC)。
在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造之細胞，其中投與係注射。在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造之細胞，其中投與係血管內注射或輸注。在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造之細胞，其中投與係單一劑量。
在一些實施例中，該等方法提供減少用本文所揭示之組成物治療的個體疾病相關之體徵或症狀。在一些實施例中，個體具有持續超過一週的對用本文所揭示之組成物治療之反應。在一些實施例中，個體具有持續超過兩週的對用本文所揭示之組成物治療之反應。在一些實施例中，個體具有持續超過三週的對用本文所揭示之組成物治療之反應。在一些實施例中，個體具有持續超過一個月的對用本文所揭示之組成物治療之反應。
在一些實施例中，該等方法提供向個體投與經工程改造之細胞，且其中該個體對所投與之細胞具有反應，該反應包含與藉由細胞療法治療之疾病相關的體徵或症狀之減少。在一些實施例中，個體具有持續超過一週之反應。在一些實施例中，個體具有持續超過一個月之反應。在一些實施例中，個體具有持續至少1-6週之反應。
V. 表 7 ：額外序列
*本表中所揭示之指導序列可未經修飾，經表中所示之例示性修飾模式修飾，或經本文所揭示或此項技術中可用之不同修飾模式修飾。
VI. 表 7A. 額外例示性指導 RNA
VII. 表 7B. 例示性修飾之保守區域 Nme 指導 RNA 模體
實例
| 描述 | SEQ ID NO | 序列 | |||
| HLA-A釀膿鏈球菌指導G000529 | 801 | mG*mG*mC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | |||
| HLA-A對照指導G018995 | 802 | mA*mC*mA*GCGACGCCGCGAGCCAGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G027891) | 803 | mU*mU*mC*AAAACCUGUCAGUGAUUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCACGAAAGGGCACCGAGUCGGmU*mG*mC*mU | |||
| TRAC對照指導(G023516) | 804、3206及3207 | mG*mC*mC*mGmUGUmAmCCmAGmCUGAGmAGACmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmU(L1)mCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmC(L1)mGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCC(L1)GGCAUCGmU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021470) | 805 | mC*mC*mC*mAmCAGmAmUAmUCmCAGAAmCCCUmGACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021471) | 806 | mU*mU*mG*mUmCCCmAmCAmGAmUAUCCmAGAAmCCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021472) | 807 | mC*mU*mU*mGmUCCmCmACmAGmAUAUCmCAGAmACCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021473) | 808 | mA*mU*mC*mCmUCUmUmGUmCCmCACAGmAUAUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021474) | 809 | mG*mA*mU*mCmCUCmUmUGmUCmCCACAmGAUAmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021475) | 810 | mA*mA*mC*mCmCUGmAmUCmCUmCUUGUmCCCAmCAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| TRAC對照指導(G021481) | 811 | mG*mC*mC*mGmUGUmAmCCmAGmCUGAGmAGACmUCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 編碼Sp. Cas9之ORF | 812 | ATGgaggccTcccccgccTccggcccccggcaccTgaTggacccccacaTcTTcaccTccAACTTCAACAACggcATCggccggCACAAGaccTACCTGTGCTACgaggTggagcggCTGGACAACggcaccTccgTgAAGATGGACCAGCACcggggcTTCCTGCACAACCAGgccAAGAACCTGCTGTGCggcTTCTACggccggCACgccgagCTGcggTTCCTGGACCTGgTgcccTccCTGCAGCTGGACcccgccCAGATCTACcgggTgaccTGGTTCATCTccTGGTcccccTGCTTCTccTGGggcTGCgccggcgaggTgcgggccTTCCTGCAGgagAACaccCACgTgcggCTGcggATCTTCgccgcccggATCTACGACTACGACcccCTGTACAAGgaggccCTGCAGATGCTGcggGACgccggcgccCAGgTgTccATCATGaccTACGACgagTTCAAGCACTGCTGGGACaccTTCgTgGACCACCAGggcTGCcccTTCCAGcccTGGGACggcCTGGACgagCACTccCAGgccCTGTccggccggCTGcgggccATCCTGCAGAACCAGggcAACTccggcTccgagacccccggcaccTccgagTccgccacccccgagTccgacaagaagTacTccaTcggccTggCcaTcggcaccaacTccgTgggcTgggccgTgaTcaccgacgagTacaaggTgcccTccaagaagTTcaaggTgcTgggcaacaccgaccggcacTccaTcaagaagaaccTgaTcggcgcccTgcTgTTcgacTccggcgagaccgccgaggccacccggcTgaagcggaccgcccggcggcggTacacccggcggaagaaccggaTcTgcTaccTgcaggagaTcTTcTccaacgagaTggccaaggTggacgacTccTTcTTccaccggcTggaggagTccTTccTggTggaggaggacaagaagcacgagcggcaccccaTcTTcggcaacaTcgTggacgaggTggccTaccacgagaagTaccccaccaTcTaccaccTgcggaagaagcTggTggacTccaccgacaaggccgaccTgcggcTgaTcTaccTggcccTggcccacaTgaTcaagTTccggggccacTTccTgaTcgagggcgaccTgaaccccgacaacTccgacgTggacaagcTgTTcaTccagcTggTgcagaccTacaaccagcTgTTcgaggagaaccccaTcaacgccTccggcgTggacgccaaggccaTccTgTccgcccggcTgTccaagTcccggcggcTggagaaccTgaTcgcccagcTgcccggcgagaagaagaacggccTgTTcggcaaccTgaTcgcccTgTcccTgggccTgacccccaacTTcaagTccaacTTcgaccTggccgaggacgccaagcTgcagcTgTccaaggacaccTacgacgacgaccTggacaaccTgcTggcccagaTcggcgaccagTacgccgaccTgTTccTggccgccaagaaccTgTccgacgccaTccTgcTgTccgacaTccTgcgggTgaacaccgagaTcaccaaggccccccTgTccgccTccaTgaTcaagcggTacgacgagcaccaccaggaccTgacccTgcTgaaggcccTggTgcggcagcagcTgcccgagaagTacaaggagaTcTTcTTcgaccagTccaagaacggcTacgccggcTacaTcgacggcggcgccTcccaggaggagTTcTacaagTTcaTcaagcccaTccTggagaagaTggacggcaccgaggagcTgcTggTgaagcTgaaccgggaggaccTgcTgcggaagcagcggaccTTcgacaacggcTccaTcccccaccagaTccaccTgggcgagcTgcacgccaTccTgcggcggcaggaggacTTcTaccccTTccTgaaggacaaccgggagaagaTcgagaagaTccTgaccTTccggaTccccTacTacgTgggcccccTggcccggggcaacTcccggTTcgccTggaTgacccggaagTccgaggagaccaTcacccccTggaacTTcgaggaggTggTggacaagggcgccTccgcccagTccTTcaTcgagcggaTgaccaacTTcgacaagaaccTgcccaacgagaaggTgcTgcccaagcacTcccTgcTgTacgagTacTTcaccgTgTacaacgagcTgaccaaggTgaagTacgTgaccgagggcaTgcggaagcccgccTTccTgTccggcgagcagaagaaggccaTcgTggaccTgcTgTTcaagaccaaccggaaggTgaccgTgaagcagcTgaaggaggacTacTTcaagaagaTcgagTgcTTcgacTccgTggagaTcTccggcgTggaggaccggTTcaacgccTcccTgggcaccTaccacgaccTgcTgaagaTcaTcaaggacaaggacTTccTggacaacgaggagaacgaggacaTccTggaggacaTcgTgcTgacccTgacccTgTTcgaggaccgggagaTgaTcgaggagcggcTgaagaccTacgcccaccTgTTcgacgacaaggTgaTgaagcagcTgaagcggcggcggTacaccggcTggggccggcTgTcccggaagcTgaTcaacggcaTccgggacaagcagTccggcaagaccaTccTggacTTccTgaagTccgacggcTTcgccaaccggaacTTcaTgcagcTgaTccacgacgacTcccTgaccTTcaaggaggacaTccagaaggcccaggTgTccggccagggcgacTcccTgcacgagcacaTcgccaaccTggccggcTcccccgccaTcaagaagggcaTccTgcagaccgTgaaggTggTggacgagcTggTgaaggTgaTgggccggcacaagcccgagaacaTcgTgaTcgagaTggcccgggagaaccagaccacccagaagggccagaagaacTcccgggagcggaTgaagcggaTcgaggagggcaTcaaggagcTgggcTcccagaTccTgaaggagcaccccgTggagaacacccagcTgcagaacgagaagcTgTaccTgTacTaccTgcagaacggccgggacaTgTacgTggaccaggagcTggacaTcaaccggcTgTccgacTacgacgTggaccacaTcgTgccccagTccTTccTgaaggacgacTccaTcgacaacaaggTgcTgacccggTccgacaagaaccggggcaagTccgacaacgTgcccTccgaggaggTggTgaagaagaTgaagaacTacTggcggcagcTgcTgaacgccaagcTgaTcacccagcggaagTTcgacaaccTgaccaaggccgagcggggcggccTgTccgagcTggacaaggccggcTTcaTcaagcggcagcTggTggagacccggcagaTcaccaagcacgTggcccagaTccTggacTcccggaTgaacaccaagTacgacgagaacgacaagcTgaTccgggaggTgaaggTgaTcacccTgaagTccaagcTggTgTccgacTTccggaaggacTTccagTTcTacaaggTgcgggagaTcaacaacTaccaccacgcccacgacgccTaccTgaacgccgTggTgggcaccgcccTgaTcaagaagTaccccaagcTggagTccgagTTcgTgTacggcgacTacaaggTgTacgacgTgcggaagaTgaTcgccaagTccgagcaggagaTcggcaaggccaccgccaagTacTTcTTcTacTccaacaTcaTgaacTTcTTcaagaccgagaTcacccTggccaacggcgagaTccggaagcggccccTgaTcgagaccaacggcgagaccggcgagaTcgTgTgggacaagggccgggacTTcgccaccgTgcggaaggTgcTgTccaTgccccaggTgaacaTcgTgaagaagaccgaggTgcagaccggcggcTTcTccaaggagTccaTccTgcccaagcggaacTccgacaagcTgaTcgcccggaagaaggacTgggaccccaagaagTacggcggcTTcgacTcccccaccgTggccTacTccgTgcTggTggTggccaaggTggagaagggcaagTccaagaagcTgaagTccgTgaaggagcTgcTgggcaTcaccaTcaTggagcggTccTccTTcgagaagaaccccaTcgacTTccTggaggccaagggcTacaaggaggTgaagaaggaccTgaTcaTcaagcTgcccaagTacTcccTgTTcgagcTggagaacggccggaagcggaTgcTggccTccgccggcgagcTgcagaagggcaacgagcTggcccTgcccTccaagTacgTgaacTTccTgTaccTggccTcccacTacgagaagcTgaagggcTcccccgaggacaacgagcagaagcagcTgTTcgTggagcagcacaagcacTaccTggacgagaTcaTcgagcagaTcTccgagTTcTccaagcgggTgaTccTggccgacgccaaccTggacaaggTgcTgTccgccTacaacaagcaccgggacaagcccaTccgggagcaggccgagaacaTcaTccaccTgTTcacccTgaccaaccTgggcgcccccgccgccTTcaagTacTTcgacaccaccaTcgaccggaagcggTacaccTccaccaaggaggTgcTggacgccacccTgaTccaccagTccaTcaccggccTgTacgagacccggaTcgaccTgTcccagcTgggcggcgacggcggcggcTcccccaagaagaagcggaaggTgTgA | |||
| 編碼Sp. Cas9之ORF | 813 | ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG | |||
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| Sp. Cas9之胺基酸序列 | 818 | MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGGGSPKKKRKV | |||
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| 編碼Nme2Cas9鹼基編輯子之mRNA | 822 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGAGGCCUCCCCCGCCUCCGGCCCCCGGCACCUGAUGGACCCCCACAUCUUCACCUCCAACUUCAACAACGGCAUCGGCCGGCACAAGACCUACCUGUGCUACGAGGUGGAGCGGCUGGACAACGGCACCUCCGUGAAGAUGGACCAGCACCGGGGCUUCCUGCACAACCAGGCCAAGAACCUGCUGUGCGGCUUCUACGGCCGGCACGCCGAGCUGCGGUUCCUGGACCUGGUGCCCUCCCUGCAGCUGGACCCCGCCCAGAUCUACCGGGUGACCUGGUUCAUCUCCUGGUCCCCCUGCUUCUCCUGGGGCUGCGCCGGCGAGGUGCGGGCCUUCCUGCAGGAGAACACCCACGUGCGGCUGCGGAUCUUCGCCGCCCGGAUCUACGACUACGACCCCCUGUACAAGGAGGCCCUGCAGAUGCUGCGGGACGCCGGCGCCCAGGUGUCCAUCAUGACCUACGACGAGUUCAAGCACUGCUGGGACACCUUCGUGGACCACCAGGGCUGCCCCUUCCAGCCCUGGGACGGCCUGGACGAGCACUCCCAGGCCCUGUCCGGCCGGCUGCGGGCCAUCCUGCAGAACCAGGGCAACUCCGGCUCCGAGACCCCCGGCACCUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGCAGCGUUCAAACCAAAUCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGCCAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGCUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGUGACUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG | |||
| 由SEQ ID NO: 821編碼之UGI之開放閱讀框 | 824 | ATGACCAACCTGTCCGACATCATCGAGAAGGAGACCGGCAAGCAGCTGGTGATCCAGGAGTCCATCCTGATGCTGCCCGAGGAGGTGGAGGAGGTGATCGGCAACAAGCCCGAGTCCGACATCCTGGTGCACACCGCCTACGACGAGTCCACCGACGAGAACGTGATGCTGCTGACCTCCGACGCCCCCGAGTACAAGCCCTGGGCCCTGGTGATCCAGGACTCCAACGGCGAGAACAAGATCAAGATGCTGTCCGGCGGCTCCAAGCGGACCGCCGACGGCTCCGAGTTCGAGTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGAGTGATAG | |||
| 編碼Nme2 Cas9之MRNA | 825 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG | |||
| 編碼帶有Hibit標籤之Nme2 Cas9之mRNA | 826 | GGGAAGCUCAGAAUAAACGCUCAACUUUGGCCGGAUCUGCCACCAUGGACGGCUCCGGCGGCGGCUCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGUGGAGGACAAGCGGCCCGCCGCCACCAAGAAGGCCGGCCAGGCCAAGAAGAAGAAGGGCGGCUCCGGCGGCGGCGCCGCCUUCAAGCCCAACCCCAUCAACUACAUCCUGGGCCUGGACAUCGGCAUCGCCUCCGUGGGCUGGGCCAUGGUGGAGAUCGACGAGGAGGAGAACCCCAUCCGGCUGAUCGACCUGGGCGUGCGGGUGUUCGAGCGGGCCGAGGUGCCCAAGACCGGCGACUCCCUGGCCAUGGCCCGGCGGCUGGCCCGGUCCGUGCGGCGGCUGACCCGGCGGCGGGCCCACCGGCUGCUGCGGGCCCGGCGGCUGCUGAAGCGGGAGGGCGUGCUGCAGGCCGCCGACUUCGACGAGAACGGCCUGAUCAAGUCCCUGCCCAACACCCCCUGGCAGCUGCGGGCCGCCGCCCUGGACCGGAAGCUGACCCCCCUGGAGUGGUCCGCCGUGCUGCUGCACCUGAUCAAGCACCGGGGCUACCUGUCCCAGCGGAAGAACGAGGGCGAGACCGCCGACAAGGAGCUGGGCGCCCUGCUGAAGGGCGUGGCCAACAACGCCCACGCCCUGCAGACCGGCGACUUCCGGACCCCCGCCGAGCUGGCCCUGAACAAGUUCGAGAAGGAGUCCGGCCACAUCCGGAACCAGCGGGGCGACUACUCCCACACCUUCUCCCGGAAGGACCUGCAGGCCGAGCUGAUCCUGCUGUUCGAGAAGCAGAAGGAGUUCGGCAACCCCCACGUGUCCGGCGGCCUGAAGGAGGGCAUCGAGACCCUGCUGAUGACCCAGCGGCCCGCCCUGUCCGGCGACGCCGUGCAGAAGAUGCUGGGCCACUGCACCUUCGAGCCCGCCGAGCCCAAGGCCGCCAAGAACACCUACACCGCCGAGCGGUUCAUCUGGCUGACCAAGCUGAACAACCUGCGGAUCCUGGAGCAGGGCUCCGAGCGGCCCCUGACCGACACCGAGCGGGCCACCCUGAUGGACGAGCCCUACCGGAAGUCCAAGCUGACCUACGCCCAGGCCCGGAAGCUGCUGGGCCUGGAGGACACCGCCUUCUUCAAGGGCCUGCGGUACGGCAAGGACAACGCCGAGGCCUCCACCCUGAUGGAGAUGAAGGCCUACCACGCCAUCUCCCGGGCCCUGGAGAAGGAGGGCCUGAAGGACAAGAAGUCCCCCCUGAACCUGUCCUCCGAGCUGCAGGACGAGAUCGGCACCGCCUUCUCCCUGUUCAAGACCGACGAGGACAUCACCGGCCGGCUGAAGGACCGGGUGCAGCCCGAGAUCCUGGAGGCCCUGCUGAAGCACAUCUCCUUCGACAAGUUCGUGCAGAUCUCCCUGAAGGCCCUGCGGCGGAUCGUGCCCCUGAUGGAGCAGGGCAAGCGGUACGACGAGGCCUGCGCCGAGAUCUACGGCGACCACUACGGCAAGAAGAACACCGAGGAGAAGAUCUACCUGCCCCCCAUCCCCGCCGACGAGAUCCGGAACCCCGUGGUGCUGCGGGCCCUGUCCCAGGCCCGGAAGGUGAUCAACGGCGUGGUGCGGCGGUACGGCUCCCCCGCCCGGAUCCACAUCGAGACCGCCCGGGAGGUGGGCAAGUCCUUCAAGGACCGGAAGGAGAUCGAGAAGCGGCAGGAGGAGAACCGGAAGGACCGGGAGAAGGCCGCCGCCAAGUUCCGGGAGUACUUCCCCAACUUCGUGGGCGAGCCCAAGUCCAAGGACAUCCUGAAGCUGCGGCUGUACGAGCAGCAGCACGGCAAGUGCCUGUACUCCGGCAAGGAGAUCAACCUGGUGCGGCUGAACGAGAAGGGCUACGUGGAGAUCGACCACGCCCUGCCCUUCUCCCGGACCUGGGACGACUCCUUCAACAACAAGGUGCUGGUGCUGGGCUCCGAGAACCAGAACAAGGGCAACCAGACCCCCUACGAGUACUUCAACGGCAAGGACAACUCCCGGGAGUGGCAGGAGUUCAAGGCCCGGGUGGAGACCUCCCGGUUCCCCCGGUCCAAGAAGCAGCGGAUCCUGCUGCAGAAGUUCGACGAGGACGGCUUCAAGGAGUGCAACCUGAACGACACCCGGUACGUGAACCGGUUCCUGUGCCAGUUCGUGGCCGACCACAUCCUGCUGACCGGCAAGGGCAAGCGGCGGGUGUUCGCCUCCAACGGCCAGAUCACCAACCUGCUGCGGGGCUUCUGGGGCCUGCGGAAGGUGCGGGCCGAGAACGACCGGCACCACGCCCUGGACGCCGUGGUGGUGGCCUGCUCCACCGUGGCCAUGCAGCAGAAGAUCACCCGGUUCGUGCGGUACAAGGAGAUGAACGCCUUCGACGGCAAGACCAUCGACAAGGAGACCGGCAAGGUGCUGCACCAGAAGACCCACUUCCCCCAGCCCUGGGAGUUCUUCGCCCAGGAGGUGAUGAUCCGGGUGUUCGGCAAGCCCGACGGCAAGCCCGAGUUCGAGGAGGCCGACACCCCCGAGAAGCUGCGGACCCUGCUGGCCGAGAAGCUGUCCUCCCGGCCCGAGGCCGUGCACGAGUACGUGACCCCCCUGUUCGUGUCCCGGGCCCCCAACCGGAAGAUGUCCGGCGCCCACAAGGACACCCUGCGGUCCGCCAAGCGGUUCGUGAAGCACAACGAGAAGAUCUCCGUGAAGCGGGUGUGGCUGACCGAGAUCAAGCUGGCCGACCUGGAGAACAUGGUGAACUACAAGAACGGCCGGGAGAUCGAGCUGUACGAGGCCCUGAAGGCCCGGCUGGAGGCCUACGGCGGCAACGCCAAGCAGGCCUUCGACCCCAAGGACAACCCCUUCUACAAGAAGGGCGGCCAGCUGGUGAAGGCCGUGCGGGUGGAGAAGACCCAGGAGUCCGGCGUGCUGCUGAACAAGAAGAACGCCUACACCAUCGCCGACAACGGCGACAUGGUGCGGGUGGACGUGUUCUGCAAGGUGGACAAGAAGGGCAAGAACCAGUACUUCAUCGUGCCCAUCUACGCCUGGCAGGUGGCCGAGAACAUCCUGCCCGACAUCGACUGCAAGGGCUACCGGAUCGACGACUCCUACACCUUCUGCUUCUCCCUGCACAAGUACGACCUGAUCGCCUUCCAGAAGGACGAGAAGUCCAAGGUGGAGUUCGCCUACUACAUCAACUGCGACUCCUCCAACGGCCGGUUCUACCUGGCCUGGCACGACAAGGGCUCCAAGGAGCAGCAGUUCCGGAUCUCCACCCAGAACCUGGUGCUGAUCCAGAAGUACCAGGUGAACGAGCUGGGCAAGGAGAUCCGGCCCUGCCGGCUGAAGAAGCGGCCCCCCGUGCGGUCCGAGUCCGCCACCCCCGAGUCCGUGUCCGGCUGGCGGCUGUUCAAGAAGAUCUCCUAGCUAGCACCAGCCUCAAGAACACCCGAAUGGAGUCUCUAAGCUACAUAAUACCAACUUACACUUUACAAAAUGUUGUCCCCCAAAAUGUAGCCAUUCGUAUCUGCUCCUAAUAAAAAGAAAGUUUCUUCACAUUCUCUCGAGAAAAAAAAAAAAUGGAAAAAAAAAAAACGGAAAAAAAAAAAAGGUAAAAAAAAAAAAUAUAAAAAAAAAAAACAUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACGUAAAAAAAAAAAACUCAAAAAAAAAAAAGAUAAAAAAAAAAAACCUAAAAAAAAAAAAUGUAAAAAAAAAAAAGGGAAAAAAAAAAAACGCAAAAAAAAAAAACACAAAAAAAAAAAAUGCAAAAAAAAAAAAUCGAAAAAAAAAAAAUCUAAAAAAAAAAAACGAAAAAAAAAAAACCCAAAAAAAAAAAAGACAAAAAAAAAAAAUAGAAAAAAAAAAAAGUUAAAAAAAAAAAACUGAAAAAAAAAAAAUUUAAAAAAAAAAAAUCUAG | |||
| 僅野生型NmeCas9指導RNA保守部分 | 899 | GUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA | |||
| 野生型NmeCas9指導RNA | 900 | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUGUAGCUCCCUUUCUCAUUUCGGAAACGAAAUGAGAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCUGAAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCCCUUAAAGCUUCUGCUUUAAGGGGCAUCGUUUA | |||
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 901 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | |||
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 902 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGAAACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU | |||
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 903 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUGGAAACCCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUUUAUU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 904 | mN*mNNNNNNNNmNNNmNNNNNNNNNNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 905 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 906 | GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體(101聚物) | 907 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 908 | (N) 20-25GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 909 | GUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 縮短/未經修飾之NmeCas9指導RNA模體 | 910 | (N) 20-25GUUGUAGCUCCCUUCGAAAGACCGUUGCUACAAUAAGGCCGUCGAAAGAUGUGCCGCAACGCUCUGCCUUCUGGCAUCGUU | |||
| 縮短/修飾之NmeCas9指導RNA模體(105聚物) | 911 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 例示性NLS 1 | 912 | LAAKRSRTT | |||
| 例示性NLS 2 | 913 | QAAKRSRTT | |||
| 例示性NLS 3 | 914 | PAPAKRERTT | |||
| 例示性NLS 4 | 915 | QAAKRPRTT | |||
| 例示性NLS 5 | 916 | RAAKRPRTT | |||
| 例示性NLS 6 | 917 | AAAKRSWSMAA | |||
| 例示性NLS 7 | 918 | AAAKRVWSMAF | |||
| 例示性NLS 8 | 919 | AAAKRSWSMAF | |||
| 例示性NLS 9 | 920 | AAAKRKYFAA | |||
| 例示性NLS 10 | 921 | RAAKRKAFAA | |||
| 例示性NLS 11 | 922 | RAAKRKYFAV | |||
| 替代性SV40 NLS | 923 | PKKKRRV | |||
| 核質蛋白NLS | 924 | KRPAATKKAGQAKKKK | |||
| 例示性XTEN | 930 | SGSETPGTSESATPES | |||
| 例示性XTEN | 931 | SGSETPGTSESA | |||
| 例示性XTEN | 932 | SGSETPGTSESATPEGGSGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 933 | GGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 934 | GGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 935 | EAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 936 | SEGSA | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 937 | SEGSAGTST | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 938 | GGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 939 | GGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 940 | EAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 941 | EAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 942 | SEGSAGTSTESEGSA | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 943 | GGGGSGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 944 | GGGGSGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 945 | GGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 946 | EAAAKGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 947 | EAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 948 | SEGSAGTSTESEGSAGTSTE | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 949 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 950 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 951 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 952 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 953 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 954 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 955 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 956 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 957 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 958 | EAAAKEAAAKGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 959 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 960 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 961 | SEGSAGTSTESEGSAGTSTESEGSA | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 962 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 963 | GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 964 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 965 | GGGGSGGGGSGGGGSEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 966 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 967 | GGGGSGGGGSEAAAKGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 968 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 969 | GGGGSGGGGSEAAAKEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 970 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 971 | GGGGSEAAAKGGGGSGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 972 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 973 | GGGGSEAAAKGGGGSEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 974 | GGGGSEAAAKEAAAKGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 975 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 976 | GGGGSEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 977 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 978 | EAAAKGGGGSGGGGSGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 979 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 980 | EAAAKGGGGSGGGGSEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 981 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGSGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 982 | EAAAKGGGGSEAAAKGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 983 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 984 | EAAAKGGGGSEAAAKEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 985 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 986 | EAAAKEAAAKGGGGSEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 987 | EAAAKEAAAKEAAAKGGGGSEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 988 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKGGGGS | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 989 | EAAAKEAAAKEAAAKEAAAKEAAAK | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 990 | GTKDSTKDIPETPSKD | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 991 | GRDVRQPEVKEEKPES | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 992 | EGKSSGSGSESKSTAG | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 993 | TPGSPAGSPTSTEEGT | |||
| 例示性連接體之胺基酸序列 | 994 | GSEPATSGSETPGTST | |||
| 例示性經修飾之Nme指導sgRNA | 995 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 例示性經修飾之Nme指導sgRNA | 996 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 例示性經修飾之Nme指導sgRNA | 997 | mN*mN*mN*mNmNNNmNmNNmNNmNNNNNmNNNNmNNNmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | |||
| 指導ID | 靶標 | 指導序列 | 例示性指導RNA修飾序列 | 基因體坐標(hg38) |
| G034202 | HLA-A | GCUCUAUCCACGGCGCCCGCGGCU (SEQ ID NO: 66) | mG*mC*mU*mCmUAUmCmCAmCGmGCGCCmCGCGmGCUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3001) | chr6:29942891-29942915 |
| G034617 | HLA-A | CACUCACCCGCCCAGGUCUGGGUC (SEQ ID NO: 61) | mC*mA*mC*mUmCACmCmCGmCCmCAGGUmCUGGmGUCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3002) | chr6:29942609-29942633 |
| G034982 | TRAC | AAAACCUGUCAGUGAUUGGGUUCC (SEQ ID NO: 111) | mA*mA*mA*mAmCCUmGmUCmAGmUGAUUmGGGUmUCCmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3003) | chr14:22550574-22550598 |
| G034981 | TRAC | UUAGGUUCGUAUCUGUAAAACCAA (SEQ ID NO: 107) | mU*mU*mA*mGmGUUmCmGUmAUmCUGUAmAAACmCAAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3004) | chr14:22550544-22550568 |
| G034618 | TRBC1 | GUGUCCUACCAGCAAGGGGUCCUG (SEQ ID NO: 215) | mG*mU*mG*mUmCCUmAmCCmAGmCAAGGmGGUCmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3005) | chr7:142792690-142792714 |
| G034201 | CIITA | UCAAAGUACCCUACAGGAGGACCA (SEQ ID NO: 301) | mU*mC*mA*mAmAGUmAmCCmCUmACAGGmAGGAmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3006) | chr16:10907504-10907528 |
| G034619 | CIITA | AGCUGCCGUUCUGCCCAGUCCGGG (SEQ ID NO: 422) | mA*mG*mC*mUmGCCmGmUUmCUmGCCCAmGUCCmGGGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3007) | chr16:10906643-10906667 |
| G032794 | HLA-B | UCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGAG (SEQ ID NO: 828) | mU*mC*mU*mGmGGAmAmAGmGAmGGGGAmAGAUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2828) | chr6:31355222-31355246 |
| G034208 | HLA-B | UCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGAG (SEQ ID NO: 828) | mU*mC*mU*mGmGGAmAmAGmGAmGGGGAmAGAUmGAGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3008) | chr6:31355222-31355246 |
| G032795 | HLA-B | CUCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGA (SEQ ID NO: 829) | mC*mU*mC*mUmGGGmAmAAmGGmAGGGGmAAGAmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2829) | chr6:31355221-31355245 |
| G034209 | HLA-B | CUCUGGGAAAGGAGGGGAAGAUGA (SEQ ID NO: 829) | mC*mU*mC*mUmGGGmAmAAmGGmAGGGGmAAGAmUGAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3009) | chr6:31355221-31355245 |
| G032806 | HLA-B | UCCCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCA (SEQ ID NO: 830) | mU*mC*mC*mCmAGAmGmCCmGUmCUUCCmCAGUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2830) | chr6:31355205-31355229 |
| G034211 | HLA-B | UCCCAGAGCCGUCUUCCCAGUCCA (SEQ ID NO: 830) | mU*mC*mC*mCmAGAmGmCCmGUmCUUCCmCAGUmCCAmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 3010) | chr6:31355205-31355229 |
| G021557 | VEGFA | GCAUGGGCAGGGGCUGGGGUGCAC (SEQ ID NO: 831) | mG*mC*mA*mUmGGGmCmAGmGGmGCUGGmGGUGmCACmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2831) | chr6:43774288-43774312 |
| G021558 | VEGFA | GAAUGGCAGGCGGAGGUUGUACUG (SEQ ID NO: 832) | mG*mA*mA*mUmGGCmAmGGmCGmGAGGUmUGUAmCUGmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2832) | chr6:43780852-43780876 |
| G021567 | VEGFA | GUGAGCAGGCACCUGUGCCAACAU (SEQ ID NO: 833) | mG*mU*mG*mAmGCAmGmGCmACmCUGUGmCCAAmCAUmGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU (SEQ ID NO: 2833) | chr6:43781113-43781137 |
| 聚物數 | 保守部分之經修飾核苷酸序列 | SEQ ID NO |
| 101 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGCmAmAmCmGCUCUmGmCCmUmUmCmUGmGCmAmUC*mG*mU*mU | 1081 |
| 101 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1082 |
| 101 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1083 |
| 101 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1084 |
| 101 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmGmAmAmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1085 |
| 105 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1086 |
| 105 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGCUCUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1087 |
| 105 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAU*AAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1088 |
| 105 | mGUUGmUmAmGmCUCCCmUmUmCmGmAmAmAmGmAmCmCGUUmGmCUAmCAAUAAGmGmCCmGmUmCmGmAmAmAmGmAmUGUGCmCGmCAAmCGmCmUmCmUmGmCCmUmUmCmUGGCAUCG*mU*mU | 1089 |
提供以下實例以說明某些所揭示之實施例，且不應解釋為以任何方式限制本揭示案之範疇。
實例 1. 一般方法
通常，除非另有說明，否則整個實例中所用的標識為「GXXXXXX」之指導RNA係指89-nt或101-nt修飾之sgRNA格式，諸如本文所提供之表中所示之彼等。
1.1 次世代定序 ( 「 NGS 」 ) 及中靶裂解效率分析 .
根據製造商方案，使用QuickExtract™ DNA提取溶液(Lucigen，目錄號QE09050)提取基因體DNA。
為了定量確定基因體中靶位置之編輯效率，利用深度定序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失之存在。圍繞所關注之基因(例如，HLA-A)內之靶位點設計PCR引子，且擴增所關注之基因體區域。按照此項技術中之標準進行引子序列設計。
根據製造商方案(Illumina)實施額外PCR以添加用於定序之化學物質。將擴增子在Illumina MiSeq或NextSeq儀器上定序。在消除品質分數低的讀段之後，將讀段與人類參考基因體(例如，hg38)比對。將與所關注之靶區域重疊的讀段與局部基因體序列重新比對以改良比對。接著計算野生型讀段之數目與含有C至T突變、C至A/G突變或插入/缺失的讀段之數目。在以預測的Cas9裂解位點為中心之20 bp區域中對插入及缺失進行評分。插入/缺失百分比定義為在20 bp評分區域內插入或缺失一或多個鹼基的定序讀段之總數除以包括野生型的定序讀段之總數。在40 bp區域中對C至T突變或C至A/G突變進行評分，該40 bp區域包括20 bp sgRNA靶序列上游之10 bp及下游之10 bp。C至T編輯百分比定義為在40 bp區域內具有一或多個C至T突變的定序讀段之總數除以包括野生型的定序讀段之總數。類似地計算C至A/G突變之百分比。
1.2 mRNA 之體外轉錄 ( 「 IVT 」 )
使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶，藉由體外轉錄生成含有N1-甲基假U之經加帽及多腺苷酸化之mRNA。藉由於37℃下與XbaI在以下條件下培育2小時而將含有T7啟動子、轉錄序列及多腺苷酸化序列之質體DNA線性化：200 ng/μL質體、2 U/μL XbaI (NEB)及1x反應緩衝液。藉由於65℃下加熱反應20 min使XbaI不活化。自酶及緩衝鹽中純化線性化質體。藉由在以下條件下於37℃下培育1.5-4小時來實施生成經修飾mRNA之IVT反應：50 ng/μL線性化質體；GTP、ATP、CTP及N1-甲基假UTP (Trilink)各2-5 mM；10-25 mM ARCA (Trilink)；5 U/μL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/μL鼠RNase抑制劑(NEB)；0.004 U/μL無機大腸桿菌焦磷酸酶(NEB)；及1x反應緩衝液。添加TURBO DNase (ThermoFisher)至最終濃度為0.01 U/μL，且將反應物再培育30分鐘以去除DNA模板。根據製造商方案，使用MegaClear轉錄清理套組(ThermoFisher)或RNeasy Maxi套組(Qiagen)純化mRNA。或者，藉助沈澱方案純化mRNA，在一些情況下，之後進行基於HPLC之純化。簡言之，在DNA酶消化後，使用LiCl沈澱、乙酸銨沈澱及乙酸鈉沈澱純化mRNA。對於HPLC純化之mRNA，在LiCl沈澱及重建後，藉由RP-IP HPLC純化mRNA (參見例如Kariko等人Nucleic Acids Research, 2011,第39卷,第21 e142號)。將選擇用於彙集之級分合併且藉由如上文所述乙酸鈉/乙醇沈澱來脫鹽。在又一替代方法中，用LiCl沈澱方法純化mRNA，之後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm處之吸光度(Nanodrop)確定RNA濃度，且藉由毛細管電泳以生物分析儀(Agilent)分析轉錄物。
釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA係自編碼根據SEQ ID NO: 812-817 (參見表7中之序列)之開放閱讀框的質體DNA中生成的。當SEQ ID NO: 812-817在下文中關於RNA提及時，應理解T應置換為U (其為如上文所述之N1-甲基假尿苷)。用於實例中之信使RNA包括5’帽及3’多腺苷酸化區域，例如，最多100個核苷酸，且由
表7中之SEQ ID NO: 812-817標識。
1.3 T 細胞製備
健康人類供體血球分離術係商購獲得的(Hemacare)，且將細胞洗滌，再懸浮於CliniMACS® PBS/EDTA緩衝液(Miltenyi Biotec目錄130-070-525)中且在MultiMACS™ Cell 24 Separator Plus裝置(Miltenyi Biotec)中處理。使用人類Straight from Leukopak® CD4/CD8 MicroBead套組(Miltenyi Biotec目錄130-122-352)，經由陽性選擇分離T細胞。將T細胞等分且冷凍保存於Cryostor® CS10 (StemCell Technologies，目錄07930)中以供將來使用。在解凍後，將T細胞以1.0 x 10
6個細胞/mL之密度平鋪於由以下構成之T細胞生長培養基(TCGM)中：CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充劑(ThermoFisher目錄A1048501)，其含有2.5%或5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)、1X青黴素-鏈黴素、1X Glutamax、10 mM HEPES，進一步補充有200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄200-02)、5 ng/ml重組人類介白素7 (Peprotech，目錄200-07)及5 ng/ml重組人類介白素15 (Peprotech，目錄200-15)。將T細胞在T細胞生長培養基中靜置24小時，此時將其用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec，目錄130-111-160)活化。在電穿孔之前，將T細胞活化48小時。
1.4 RNA 電穿孔
將靶向特定基因之指導RNA自其儲存板中移出，且於95℃下變性2分鐘，接著於室溫下培育5分鐘。在T細胞活化後48小時，將T細胞收穫，以500 g離心5分鐘，且以12.5 x 10^
6個T細胞/mL之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza目錄編號V4SP-3960)中。用最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中之1 x 10
5個T細胞、20 ng/µL BC22n mRNA、20 ng/µL UGI mRNA及20 pmol sgRNA製備BC22n電穿孔混合物。將混合物轉移至96孔Nucleofector™板(Lonza目錄編號V4SP-3960)之對應孔中。使用製造商之脈波碼，使用Lonza shuttle 96w將細胞以一式兩份電穿孔。在電穿孔後立即將細胞於37℃下在80 µL不含細胞介素之TCGM中恢復15分鐘。隨後在每孔進一步補充有2X細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄200-02)、5 ng/ml重組人類介白素7 (Peprotech，目錄200-07)及5 ng/ml重組人類介白素15 (Peprotech，目錄200-15))之TCGM中培養電穿孔之T細胞。將板於37℃下培育。在電穿孔後第4天，收集經編輯之T細胞用於NGS分析。將補充有1X細胞介素(200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄200-02)、5 ng/ml重組人類介白素7 (Peprotech，目錄200-07)及5 ng/ml重組人類介白素15 (Peprotech，目錄200-15)之新鮮CTS Optimizer培養基(ThermoFisher目錄A1048501)添加至剩餘細胞中且於37℃下培育。在電穿孔後第7天，收集經編輯之T細胞用於流式細胞術分析。
1.5 sgRNA 稀釋系列之 RNA 電穿孔
在P3電穿孔緩衝液中製備含有靶向所關注基因之sgRNA之溶液及含有編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID No: 822)之mRNA及編碼UGI之mRNA (SEQ ID No. 821)之溶液。將單指導RNA自其儲存板中移出，於95℃下變性2分鐘且於室溫下培育5分鐘。在活化後48小時，將T細胞收穫、離心且以12.5x10^6個T細胞/mL之濃度再懸浮於P3電穿孔緩衝液(Lonza目錄編號V4SP-3960)中。自5 µM之最終濃度開始，將每一sgRNA於P3電穿孔緩衝液中以1:2 (v/v)連續稀釋。隨後，將1 x 10^5個T細胞、20 ng/µL BC22n mRNA及20 ng/µL UGI mRNA添至最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中連續稀釋之sgRNA中。將所得混合物以一式兩份轉移至96孔Nucleofector™板。使用製造商之脈波碼將細胞電穿孔。在電穿孔後立即將細胞於37℃下在80 µL不含細胞介素之TCGM中恢復15分鐘。在恢復後，將80 µL電穿孔之T細胞轉移至含有每孔補充有400 U/mL重組人類白細胞介素-2 (Peprotech，目錄200-02)、10 ng/ml重組人類白細胞介素7 (Peprotech，目錄200-07)及10 ng/ml重組人類白細胞介素15 (Peprotech，目錄200-15)之80 µL TCGM之96孔板中。將板於37℃下培育4天。在編輯後第4天，將T細胞以1:4 (v/v)實施繼代培養，且在編輯後第7天，收集T細胞用於流式細胞術分析。
1.6 脂質奈米粒子調配物
一般而言，將脂質奈米粒子(LNP)組分以不同莫耳比溶解於100%乙醇中。將RNA貨物(例如，Cas9或編輯子mRNA及sgRNA)溶解在25 mM檸檬酸鹽、100 mM NaCl (pH 5.0)中，導致RNA貨物之濃度為大約0.45 mg/mL。所用LNP含有可電離脂質((9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯，亦稱為3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸酯)，本文亦稱為脂質A、膽固醇、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)及1,2-二肉豆蔻醯-外消旋-甘油-3-甲氧基聚乙二醇-2000 (PEG2K-DMG) (目錄編號GM-020，來自NOF, Tokyo, Japan)，莫耳比為35脂質A: 47.5膽固醇: 15 DSPC: 2.5 PEG2k-DMG。用莫耳比為約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)調配LNP。在一些情況下，用單一RNA種類(諸如mRNA或gRNA)製備LNP。在一些情況下，用mRNA與指導RNA之混合物製備LNP。
使用錯流技術製備LNP，該技術利用乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液及一體積之水進行碰撞噴射混合。首先，藉助混合四通(cross)將乙醇中之脂質與兩體積之RNA溶液混合。接著，藉助直插式三通使第四股水流與四通之出口流混合(參見WO 2016/010840，圖2)。將LNP於室溫下保持至少1小時，且進一步用水稀釋(大約1:1 v/v)。將經稀釋之LNP緩衝液交換為50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)，且視需要藉由此項技術中已知之方法濃縮。接著使用0.2 μm無菌過濾器將所得混合物過濾。對最終LNP實施表徵以確定封裝效率、多分散指數及平均粒徑。將最終LNP儲存在4℃或-80℃下直至進一步使用。
實例 2 ：具有 Nme2 BC22n 之 HLA-A 指導 RNA 之篩選
藉由評估MHC I表面蛋白之兩種對偶基因型式(HLA-A2及HLA-A3)之損失，針對在T細胞中之編輯功效來篩選設計用於破壞HLA-A基因之指導RNA。供體具有A*02:01:01G及03:01:01G之異型接合HLA-A表型。在藉由電穿孔使用Nme2鹼基編輯子系統及每一測試指導在HLA-A位點進行編輯後，藉由流式細胞術確定HLA-A2及A3雙陰性T細胞之百分比(「A2-/A3-%」)。
2.1 T 細胞製備及用 RNA 電穿孔進行編輯
如實例1中所述製備且活化來自單一供體(編號808)之T細胞。如實例1及本文中所述，用靶向HLA-A之sgRNA、編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)對T細胞進行電穿孔。
2.2 流式細胞術
在電穿孔後第7天，藉由流式細胞術對經編輯之T細胞進行表型分析，以確定HLA-A2及HLA-A3蛋白之表現。簡言之，將T細胞與於細胞染色緩衝液中以1:100稀釋的針對CD3之抗體(BioLegend，目錄編號316314)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄編號317434)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄編號301046)、針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄編號C36628)、針對HLA A2之抗體(BioLegend，目錄編號343306)及針對HLA A3之抗體(Fisher Scientific，目錄編號501122330)及以1:200稀釋的針對HLA B7之抗體(Milteny Biotech，目錄編號130-120-234)之混合物於4℃下培育30 min。隨後將細胞洗滌且再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中。接著將細胞在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo™軟體包進行分析。將T細胞基於大小、形狀、活力及CD8陽性進行閘控。
表8及圖1A顯示在HLA-A基因座進行編輯後對HLA-A2及HLA-A3為雙陰性之細胞之平均百分比。就所選指導而言對HLA-A2及HLA-B3為雙陰性或單陰性之細胞之百分比，以及所選指導相對於HLA-B對HLA-A之指導特異性示於圖1B及圖1C中。
表 8-在HLA-A基因座進行編輯後為HLA-A陰性(對HLA-A2及HLA-A3為雙陰性)之T細胞之平均百分比
實例 3 ： 所選 HLA-A Nme2 指導之劑量反應曲線 (DRC)
| 指導ID | HLA A2/A3 -ve% | 指導ID | HLA A2/A3 -ve% | ||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
| G028854 | 0.63 | 0.47 | 2 | G028894 | 60.6 | 4.38 | 2 |
| G028855 | 14.15 | 0.64 | 2 | G028895 | 1.02 | 0.1 | 2 |
| G028856 | 0.62 | 0.01 | 2 | G028896 | 5.39 | 0.61 | 2 |
| G028857 | 1.32 | 0.35 | 2 | G028897 | 0.37 | 0 | 2 |
| G028858 | 5.17 | 0.45 | 2 | G028898 | 0.28 | 0.15 | 2 |
| G028859 | 4.51 | 0.59 | 2 | G028899 | 52.5 | 5.09 | 2 |
| G028860 | 1.49 | 0.3 | 2 | G028900 | 19.5 | 2.12 | 2 |
| G028861 | 4.26 | 0.18 | 2 | G028901 | 27.45 | 0.49 | 2 |
| G028862 | 0.21 | 0.04 | 2 | G028902 | 22.85 | 0.64 | 2 |
| G028863 | 0.08 | 0 | 2 | G028903 | 55.5 | 3.54 | 2 |
| G028864 | 0.16 | 0.05 | 2 | G028904 | 1.92 | 0.02 | 2 |
| G028865 | 75.45 | 0.78 | 2 | G028905 | 6.86 | 0.88 | 2 |
| G028866 | 42.6 | 1.7 | 2 | G028906 | 5.88 | 0.64 | 2 |
| G028867 | 11.6 | 1.41 | 2 | G028907 | 91.1 | 2.26 | 2 |
| G028868 | 0.84 | 0.27 | 2 | G028908 | 8.82 | 0.08 | 2 |
| G028869 | 38.3 | 2.4 | 2 | G028909 | 1.05 | 0.23 | 2 |
| G028870 | 2.59 | 0.28 | 2 | G028910 | 2.43 | 1.03 | 2 |
| G028871 | 0.19 | 0.03 | 2 | G028911 | 0.02 | 0.03 | 2 |
| G028872 | 0.07 | 0.03 | 2 | G028912 | 18.3 | 4.67 | 2 |
| G028873 | 0.03 | 0.01 | 2 | G028913 | 91.15 | 2.76 | 2 |
| G028874 | 28.65 | 1.48 | 2 | G028914 | 30.25 | 2.62 | 2 |
| G028875 | 0.37 | 0.14 | 2 | G028915 | 8.47 | 1.39 | 2 |
| G028876 | 0.57 | 0.05 | 2 | G028916 | 0.59 | 0.21 | 2 |
| G028877 | 10.9 | 0.57 | 2 | G028917 | 0.01 | 0.01 | 2 |
| G028878 | 3.59 | 0.01 | 2 | G028918 | 81.4 | 2.69 | 2 |
| G028879 | 1.73 | 0.23 | 2 | G028919 | 0.49 | 0.44 | 2 |
| G028880 | 0.41 | 0.01 | 2 | G028920 | 22.4 | 2.69 | 2 |
| G028881 | 0.06 | 0.03 | 2 | G028921 | 2.12 | 0.31 | 2 |
| G028882 | 0.04 | 0.01 | 2 | G028922 | 87.5 | 6.51 | 2 |
| G028883 | 0.27 | 0.01 | 2 | G028923 | 67.45 | 13.51 | 2 |
| G028884 | 0.01 | 0.01 | 2 | G028924 | 46.2 | 3.39 | 2 |
| G028885 | 0 | 0.01 | 2 | G028925 | 0.07 | 0.06 | 2 |
| G028886 | 2.83 | 1.07 | 2 | G028926 | 0.07 | 0.03 | 2 |
| G028887 | 0.84 | 0.62 | 2 | G028927 | 0.86 | 0.06 | 2 |
| G028888 | 11.25 | 0.21 | 2 | G028928 | 8.48 | 0.93 | 2 |
| G028889 | 0.91 | 0.07 | 2 | G028929 | 2.9 | 0.32 | 2 |
| G028890 | 1.15 | 0.23 | 2 | G028930 | 0.08 | 0.11 | 2 |
| G028891 | 25.7 | 1.84 | 2 | G028933 | 8.31 | 1.34 | 2 |
| G028892 | 5.53 | 0.28 | 2 | G028934 | 27.7 | 1.7 | 2 |
| G028893 | 1.57 | 0.18 | 2 |
進行滴定實驗，以藉由評估MHC I表面蛋白之一種對偶基因型式(HLA-A2)之損失來評價設計用於破壞HLA-A基因座之sgRNA之編輯功效。藉由用固定濃度的編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)滴定每一sgRNA，為每一sgRNA生成八點劑量反應曲線，以在T細胞中進行電穿孔。接著擴增T細胞且藉由流式細胞術進行表型分析，以確定每一測試之sgRNA之編輯效率。
如實例1中所述製備T細胞。藉由實例1中所述之mRNA電穿孔方法，用連續稀釋之sgRNA編輯T細胞。在編輯後第7天，藉由流式細胞術對經編輯之T細胞進行表型分型以確定HLA-A2蛋白表現。簡言之，將T細胞轉移至U形底板，以500 g旋轉5分鐘且再懸浮於100 µL含有以下染色試劑之FAC緩衝液(具有2% FBS及2 mM EDTA之PBS)中：1:100 (v/v)稀釋之PerCP/Cy5.5抗人類CD3 (BioLegend，目錄317434)、1:100 (v/v)稀釋之BV421抗人類CD4 (BioLegend，目錄317434)、1:100 (v/v)稀釋之BV785抗人類CD8 (BioLegend，目錄301046)、1:100 (v/v)稀釋之PE抗人類HLA-A2 (BioLegend公司，目錄343306)、1:200稀釋之FITC抗人類-HLA-B7 (Miltenyi Biotec公司，目錄130-120-234)及1:100稀釋之Viakrome 808 (Beckman Coulter目錄C36628)。將T細胞於4℃下於染色溶液中培育30分鐘，洗滌且使用100 µL FACS緩衝液再懸浮。接著將T細胞在Beckman Coulter Cytoflex LX流式細胞儀上處理，且使用FlowJo™軟體包進行分析。將T細胞基於大小、奇異性、活力及CD8陽性進行閘控。
表 9及
圖 2顯示對HLA-A2表現為陰性之CD8+ T細胞之百分比。
表9 -鹼基編輯後CD8
+HLA-A2
-T細胞之平均百分比
實例 4 ：具有 Nme2 鹼基編輯系統之 TRAC 指導 RNA 之篩選
| 指導 | G028907 | G028913 | G028869 | ||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均 CD8 + 細胞 % | SD CD8 + 細胞 % | N | 平均 CD8 + 細胞 % | SD CD8 + 細胞 % | N | 平均 CD8 + 細胞 % | SD CD8 + 細胞 % | N | ||
| 5 | 98.65 | 0.07 | 2 | 97.20 | 0.42 | 2 | 70.55 | 0.49 | 2 | ||
| 2.5 | 98.25 | 0.21 | 2 | 96.15 | 0.07 | 2 | 61.75 | 0.92 | 2 | ||
| 1.25 | 97.40 | 0.14 | 2 | 93.30 | 0.00 | 2 | 43.75 | 1.91 | 2 | ||
| 0.625 | 95.70 | 0.42 | 2 | 90.85 | 0.92 | 2 | 25.45 | 0.92 | 2 | ||
| 0.313 | 92.40 | 0.00 | 2 | 85.55 | 1.77 | 2 | 14.55 | 0.92 | 2 | ||
| 0.078 | 80.20 | 3.25 | 2 | 68.25 | 3.75 | 2 | 6.20 | 0.33 | 2 | ||
| 0 | 54.45 | 2.05 | 2 | 42.70 | 1.13 | 2 | 3.19 | 0.40 | 2 | ||
| EC50 | 0.07038 | 0.08998 | 0.9213 | ||||||||
| 指導 | G028922 | G028918 | G028865 | ||||||||
| sgRNA (µg/mL) | 平均 CD8 + 細胞 % | SD CD8 + 細胞 % | N | 平均 CD8 + 細胞 % | SD CD8 + 細胞 % | N | 平均 CD8 + 細胞 % | SD CD8 + 細胞 % | N | ||
| 5 | 98.65 | 0.21 | 2 | 92.15 | 0.07 | 2 | 90.95 | 1.06 | 2 | ||
| 2.5 | 95.00 | 0.99 | 2 | 89.45 | 1.20 | 2 | 90.20 | 1.27 | 2 | ||
| 1.25 | 74.90 | 2.12 | 2 | 87.25 | 1.06 | 2 | 87.20 | 0.42 | 2 | ||
| 0.625 | 54.20 | 0.42 | 2 | 83.40 | 0.71 | 2 | 81.35 | 1.34 | 2 | ||
| 0.313 | 36.80 | 0.85 | 2 | 72.05 | 0.64 | 2 | 75.45 | 1.06 | 2 | ||
| 0.078 | 18.60 | 0.42 | 2 | 48.80 | 0.85 | 2 | 55.60 | 2.26 | 2 | ||
| 0 | 8.73 | 0.02 | 2 | 24.65 | 1.20 | 2 | 34.30 | 1.56 | 2 | ||
| EC50 | 0.6028 | 0.1429 | 0.09631 | ||||||||
藉由經由流式細胞術評估CD3細胞表面表現之損失及藉由NGS評估編輯頻率，針對在T細胞中之Nme2鹼基編輯功效篩選TRAC指導RNA。CD3係T細胞受體複合物之細胞表面組分，且其在細胞表面之存在用作TRAC蛋白表現之替代標記物。
4.1 T細胞製備及用RNA電穿孔進行編輯
如實例1中所述製備且活化T細胞。如實例1及本文中所述，用靶向TRAC之sgRNA、編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)對T細胞進行電穿孔。
4.2 流式細胞術及 NGS 定序如實例1中所述製備來自單一供體(編號3786)之T細胞。如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用靶向TRAC基因座之sgRNA編輯T細胞。在電穿孔後第4天，如實例1中所述對經編輯之T細胞樣品進行PCR及NGS分析。在電穿孔後第7天，藉由流式細胞術對T細胞進行表型分型。簡言之，將T細胞與於細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄編號420201)中以1:100稀釋的針對CD3之抗體(BioLegend，目錄編號316314)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄編號317434)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄編號301046)、針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄編號C36628)之混合物於4°C下培育30分鐘。隨後將細胞洗滌且再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中。接著將細胞在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo™軟體包進行分析。將T細胞基於大小、形狀、活力、CD8及CD3表現進行閘控。表10及圖3A顯示CD3陰性T細胞之平均百分比。平均編輯百分比示於表10及圖3B中。
表 10-CD3陰性T細胞之平均百分比；作為NGS總讀段之百分比的TRAC基因座之平均編輯百分比。N=4表示兩個技術重複，各有兩個引子組。
實例 5 ： 所選 TRAC Nme2 指導之劑量反應曲線 (DRC)
| 指導ID | CD3 -ve% | C 至T% | C 至A/G% | 插入/ 缺失% | ||||||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | |
| G021469 | 93.25 | 1.20 | 2 | 94.59 | 0.81 | 4 | 2.83 | 0.64 | 4 | 0.72 | 0.09 | 4 |
| G021481 | 95.50 | 1.56 | 2 | 93.52 | 0.31 | 4 | 2.59 | 0.14 | 4 | 1.75 | 0.22 | 4 |
| G028935 | 93.75 | 1.20 | 2 | 95.22 | 0.34 | 4 | 1.67 | 0.35 | 4 | 1.65 | 0.14 | 4 |
| G028936 | 2.66 | 0.73 | 2 | 50.63 | 5.08 | 4 | 1.26 | 0.37 | 4 | 2.48 | 0.35 | 4 |
| G028937 | 46.25 | 8.13 | 2 | 88.13 | 2.82 | 4 | 2.04 | 1.03 | 4 | 0.87 | 0.57 | 4 |
| G028938 | 9.93 | 0.24 | 2 | 26.77 | 3.16 | 4 | 0.91 | 0.06 | 4 | 0.35 | 0.05 | 4 |
| G028939 | 93.10 | 0.99 | 2 | 95.12 | 0.97 | 4 | 1.28 | 0.18 | 4 | 0.55 | 0.08 | 4 |
| G028940 | 1.28 | 0.01 | 2 | 7.76 | 0.85 | 4 | 1.22 | 0.10 | 4 | 0.21 | 0.06 | 4 |
| G028941 | 11.95 | 0.21 | 2 | 95.88 | 1.30 | 4 | 0.92 | 0.19 | 4 | 0.39 | 0.07 | 4 |
| G028942 | 30.75 | 5.73 | 2 | 50.37 | 4.35 | 4 | 1.47 | 0.24 | 4 | 0.21 | 0.08 | 4 |
| G028943 | 93.65 | 5.44 | 2 | 92.43 | 3.16 | 4 | 1.94 | 0.62 | 4 | 1.80 | 0.33 | 4 |
| G028944 | 1.25 | 0.19 | 2 | 1.42 | 0.10 | 4 | 0.73 | 0.11 | 4 | 0.12 | 0.04 | 4 |
| G028945 | 9.89 | 1.86 | 2 | 46.15 | 5.94 | 4 | 1.01 | 0.07 | 4 | 0.58 | 0.11 | 4 |
| G028946 | 4.29 | 0.11 | 2 | 41.35 | 2.67 | 4 | 0.88 | 0.45 | 4 | 0.66 | 0.10 | 4 |
| G028947 | 1.05 | 0.08 | 2 | 95.68 | 1.72 | 4 | 1.83 | 1.65 | 4 | 0.63 | 0.05 | 4 |
| G028948 | 0.27 | 0.19 | 2 | 1.83 | 0.14 | 4 | 0.56 | 0.07 | 4 | 0.20 | 0.09 | 4 |
進行滴定實驗，以藉由評估CD3細胞表面表現之損失來評價靶向TRAC基因座之所選sgRNA之編輯功效。CD3係T細胞受體複合物之細胞表面組分，且其在細胞表面之存在用作TRAC蛋白表現之替代標記物。藉由使用電穿孔在T細胞中用固定濃度之Nme2 BC22n (SEQ ID NO: 822)及UGI mRNA132 (SEQ ID NO: 821)滴定每一sgRNA，為每一sgRNA生成八點劑量反應曲線。接著擴增T細胞且藉由流式細胞術進行表型分析，以確定每一測試之sgRNA之編輯效率。
如實例1中所述製備T細胞。如實例1中所述，藉由mRNA電穿孔，用連續稀釋之靶向TRAC之sgRNA編輯T細胞。在編輯後第7天，如實例4中所述，藉由流式細胞術對經編輯之T細胞進行表型分析以確定CD3表現。將T細胞基於大小、奇異性、活力及CD8陽性進行閘控。表11及圖4顯示對CD3表現為陰性之CD8+ T細胞之百分比。
表 11- 在 TRAC 基因座處進行鹼基編輯後之 CD3 陰性 T 細胞平均百分比
實例 6 ：具有 Nme2 BC22n 之 TRBC 1 及 2 指導 RNA 之篩選
| G021469 | G021481 | ||||||
| CD8+ 之CD3-% | CD8+ 之CD3-% | ||||||
| sgRNA (uM) | Ave | SD | N | sgRNA (uM) | Ave | SD | N |
| 5.00 | 95.40 | 0.00 | 2.00 | 5.00 | 97.35 | 0.21 | 2 |
| 2.50 | 92.20 | 0.85 | 2.00 | 2.50 | 94.15 | 0.21 | 2 |
| 1.25 | 88.45 | 2.90 | 2.00 | 1.25 | 85.6 | 0.42 | 2 |
| 0.63 | 78.55 | 3.46 | 2.00 | 0.63 | 74.75 | 1.48 | 2 |
| 0.31 | 64.80 | 1.84 | 2.00 | 0.31 | 54.75 | 4.45 | 2 |
| 0.16 | 47.90 | 0.42 | 2.00 | 0.16 | 39.9 | 1.27 | 2 |
| 0.08 | 25.40 | 5.37 | 2.00 | 0.08 | 22.05 | 0.64 | 2 |
| 0.00 | 0.47 | 0.34 | 2.00 | 0.00 | 0.375 | 0.06 | 2 |
| G028935 | G028939 | ||||||
| CD8+ 之CD3-% | CD8+ 之CD3-% | ||||||
| sgRNA (uM) | Ave | SD | N | sgRNA (uM) | Ave | SD | N |
| 5.00 | 94.60 | 0.14 | 2.00 | 5.00 | 97.7 | 0.42 | 2 |
| 2.50 | 92.10 | 0.14 | 2.00 | 2.50 | 92.65 | 1.20 | 2 |
| 1.25 | 90.05 | 0.07 | 2.00 | 1.25 | 88.35 | 0.49 | 2 |
| 0.63 | 88.15 | 1.20 | 2.00 | 0.63 | 79.55 | 1.06 | 2 |
| 0.31 | 87.75 | 0.78 | 2.00 | 0.31 | 73.35 | 3.04 | 2 |
| 0.16 | 79.90 | 1.27 | 2.00 | 0.16 | 51.8 | 3.39 | 2 |
| 0.08 | 67.20 | 1.13 | 2.00 | 0.08 | 36.05 | 5.02 | 2 |
| 0.00 | 0.46 | 0.23 | 2.00 | 0.00 | 0.22 | 0.03 | 2 |
| G028943 | |||||||
| CD8+ 之CD3-% | |||||||
| sgRNA (uM) | Ave | SD | N | ||||
| 5.00 | 97.50 | 0.71 | 2 | ||||
| 2.50 | 95.55 | 0.64 | 2 | ||||
| 1.25 | 91.95 | 3.46 | 2 | ||||
| 0.63 | 91.10 | 2.97 | 2 | ||||
| 0.31 | 85.40 | 0.71 | 2 | ||||
| 0.16 | 70.05 | 2.33 | 2 | ||||
| 0.08 | 50.10 | 0.28 | 2 | ||||
| 0.00 | 0.40 | 0.04 | 2 |
在藉由mRNA遞送進行TRBC編輯後，藉由經由流式細胞術評估CD3細胞表面表現之損失及藉由NGS評估編輯功效，針對在T細胞中之編輯功效篩選靶向TRBC 1及/或TRBC 2之指導RNA。CD3係T細胞受體複合物之細胞表面組分，且其在細胞表面之存在用作TRBC蛋白表現之替代標記物。
6.1 T 細胞製備及用 RNA 電穿孔進行編輯
如實例1中所述製備且活化T細胞。如實例1及本文中所述，用靶向TRBC之sgRNA、編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)對T細胞進行電穿孔。
6.2 流式細胞術及 NGS 定序
如實例1中所述製備來自單一供體(編號3786)之T細胞。如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用靶向TRBC1及/或TRBC2基因座之sgRNA編輯T細胞。在電穿孔後第4天，如實例1中所述對經編輯之T細胞樣品進行PCR及NGS分析。在電穿孔後第7天，藉由流式細胞術對T細胞進行表型分型。簡言之，將T細胞與於細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄編號420201)中以1:100稀釋的針對CD3之抗體(BioLegend，目錄編號316314)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄編號317434)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄編號301046)及針對Viakrome之抗體(Immunotech，目錄編號C36628)之混合物於4°C下培育30分鐘。隨後將細胞洗滌且再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中。接著將細胞在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo™軟體包進行分析。將T細胞基於大小、形狀、活力、CD8及CD3表現進行閘控。
表 12及
圖 5A顯示CD3-T細胞之平均百分比。TRBC 1及/或2基因座處之編輯百分比示於表12及圖5B中。
表 12-CD3陰性T細胞之平均百分比；作為NGS總讀段之百分比的TRBC基因座之平均編輯百分比。「ND」指示無資料。N=4表示兩個技術重複，各有兩個引子組。
實例 7 ： 所選 TRBC Nme2 指導之劑量反應曲線 (DRC)
| 指導ID | CD3 -ve% | C 至T% | C 至A/G% | 插入/ 缺失% | 基因靶標 | ||||||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | ||
| G028952 | 9.65 | 1.06 | 2 | 14.08 | 1.30 | 4 | 0.84 | 0.50 | 4 | 0.36 | 0.06 | 4 | TRBC1 |
| G028953 | 15.30 | 0.99 | 2 | 46.47 | 4.15 | 4 | 1.82 | 0.48 | 4 | 0.61 | 0.12 | 4 | TRBC1 |
| G028968 | 19.45 | 2.05 | 2 | 38.11 | 8.64 | 4 | 1.29 | 0.21 | 4 | 0.74 | 0.04 | 4 | TRBC1 |
| G028969 | 3.41 | 0.49 | 2 | 17.85 | 9.69 | 4 | 0.63 | 0.39 | 4 | 0.15 | 0.05 | 4 | TRBC1 |
| G028970 | 29.30 | 3.54 | 2 | 71.73 | 5.73 | 4 | 1.59 | 0.33 | 4 | 0.54 | 0.08 | 4 | TRBC1 |
| G028977 | 0.99 | 0.07 | 2 | 23.09 | 16.10 | 4 | 0.90 | 1.04 | 4 | 0.49 | 0.59 | 4 | TRBC1 |
| G028978 | 1.67 | 0.25 | 2 | 43.93 | 5.74 | 4 | 1.46 | 0.09 | 4 | 0.82 | 0.24 | 4 | TRBC1 |
| G028979 | 5.32 | 0.29 | 2 | 90.62 | 2.52 | 4 | 2.11 | 0.18 | 4 | 2.32 | 0.28 | 4 | TRBC1 |
| G028980 | 2.41 | 0.00 | 2 | 37.84 | 1.93 | 4 | 1.57 | 0.28 | 4 | 0.36 | 0.10 | 4 | TRBC1 |
| G028981 | 1.08 | ND | 1 | 65.21 | 5.04 | 4 | 1.99 | 0.24 | 4 | 0.55 | 0.03 | 4 | TRBC1 |
| G028982 | 15.60 | 0.14 | 2 | 89.82 | 1.24 | 4 | 3.90 | 0.33 | 4 | 3.30 | 0.57 | 4 | TRBC1 |
| G028983 | 1.42 | 0.35 | 2 | 65.07 | 2.82 | 4 | 4.05 | 0.28 | 4 | 5.47 | 0.59 | 4 | TRBC1 |
| G028984 | 0.22 | 0.08 | 2 | 18.19 | 1.46 | 4 | 1.92 | 0.32 | 4 | 1.14 | 0.17 | 4 | TRBC1 |
| G028985 | 5.78 | 0.12 | 2 | 47.94 | 1.02 | 4 | 1.77 | 0.22 | 4 | 0.45 | 0.15 | 4 | TRBC1 |
| G028986 | 92.30 | 4.53 | 2 | 91.48 | 1.28 | 4 | 3.58 | 0.49 | 4 | 1.83 | 0.17 | 4 | TRBC1 |
| G028987 | 68.85 | 4.45 | 2 | 82.47 | 2.97 | 4 | 2.65 | 0.14 | 4 | 0.59 | 0.16 | 4 | TRBC1 |
| G028989 | 19.00 | 0.57 | 2 | 92.81 | 0.70 | 4 | 3.76 | 0.30 | 4 | 1.43 | 0.16 | 4 | TRBC1 |
| G028990 | 0.73 | 0.25 | 2 | 79.63 | 2.77 | 4 | 1.72 | 0.21 | 4 | 0.75 | 0.19 | 4 | TRBC1 |
| G028991 | 0.31 | 0.26 | 2 | 9.78 | 0.55 | 4 | 0.58 | 0.21 | 4 | 0.10 | 0.03 | 4 | TRBC1 |
| G028992 | 0.19 | 0.08 | 2 | 3.26 | 0.29 | 4 | 0.45 | 0.30 | 4 | 0.10 | 0.04 | 4 | TRBC1 |
| G028993 | 0.16 | 0.16 | 2 | 7.36 | 0.89 | 4 | 1.57 | 1.38 | 4 | 0.56 | 0.42 | 4 | TRBC1 |
| G028949 | 62.95 | 6.43 | 2 | 65.32 | 3.28 | 4 | 2.23 | 0.26 | 4 | 0.98 | 0.14 | 4 | TRBC1/2 |
| G028950 | 65.60 | 4.38 | 2 | 63.75 | 44.44 | 4 | 1.13 | 1.30 | 4 | 0.40 | 0.47 | 4 | TRBC1/2 |
| G028951 | 70.90 | 1.27 | 2 | 69.08 | 46.09 | 4 | 1.25 | 0.83 | 4 | 1.87 | 1.25 | 4 | TRBC1/2 |
| G028954 | 1.48 | ND | 1 | 7.84 | 0.83 | 4 | 1.25 | 0.75 | 4 | 0.16 | 0.06 | 4 | TRBC1/2 |
| G028955 | 0.50 | 0.13 | 2 | 2.35 | 0.43 | 4 | 1.05 | 0.57 | 4 | 0.11 | 0.05 | 4 | TRBC1/2 |
| G028956 | 20.00 | 1.98 | 2 | 80.04 | 3.44 | 4 | 1.82 | 0.32 | 4 | 1.04 | 0.19 | 4 | TRBC1/2 |
| G028957 | 2.09 | 0.39 | 2 | 13.49 | 0.63 | 4 | 1.17 | 0.31 | 4 | 0.23 | 0.06 | 4 | TRBC1/2 |
| G028958 | 69.40 | 0.14 | 2 | 89.79 | 0.26 | 4 | 2.25 | 0.16 | 4 | 2.67 | 0.31 | 4 | TRBC1/2 |
| G028959 | 2.86 | 0.49 | 2 | 5.62 | 0.62 | 4 | 1.32 | 0.30 | 4 | 0.12 | 0.05 | 4 | TRBC1/2 |
| G028960 | 42.50 | 4.24 | 2 | 42.76 | 0.36 | 4 | 1.74 | 0.44 | 4 | 0.25 | 0.08 | 4 | TRBC1/2 |
| G028961 | 1.27 | 0.04 | 2 | 1.64 | 0.43 | 4 | 0.46 | 0.08 | 4 | 0.12 | 0.04 | 4 | TRBC1/2 |
| G028962 | 0.65 | 0.20 | 2 | 6.58 | 2.20 | 4 | 1.12 | 0.57 | 4 | 0.14 | 0.06 | 4 | TRBC1/2 |
| G028963 | 11.65 | 2.19 | 2 | 11.55 | 1.59 | 4 | 0.97 | 0.49 | 4 | 0.25 | 0.05 | 4 | TRBC1/2 |
| G028964 | 23.10 | 1.84 | 2 | 21.45 | 0.91 | 4 | 1.09 | 0.59 | 4 | 0.32 | 0.05 | 4 | TRBC1/2 |
| G028965 | 40.35 | 5.59 | 2 | 61.42 | 3.81 | 4 | 2.10 | 0.15 | 4 | 4.12 | 0.40 | 4 | TRBC1/2 |
| G028966 | 18.00 | 4.67 | 2 | 26.83 | 8.93 | 4 | 1.00 | 0.11 | 4 | 0.78 | 0.46 | 4 | TRBC1/2 |
| G028967 | 21.30 | 2.55 | 2 | 19.82 | 0.85 | 4 | 0.63 | 0.17 | 4 | 0.17 | 0.09 | 4 | TRBC1/2 |
| G028971 | 1.14 | 0.01 | 2 | 25.06 | 3.88 | 4 | 0.49 | 0.06 | 4 | 0.42 | 0.14 | 4 | TRBC1/2 |
| G028972 | 16.85 | 2.05 | 2 | 67.14 | 4.73 | 4 | 2.15 | 1.09 | 4 | 1.63 | 0.27 | 4 | TRBC1/2 |
| G028973 | 4.88 | 0.30 | 2 | 90.36 | 2.03 | 4 | 1.35 | 0.19 | 4 | 0.98 | 0.14 | 4 | TRBC1/2 |
| G028974 | 3.05 | 0.15 | 2 | 83.09 | 1.63 | 4 | 2.11 | 0.75 | 4 | 1.58 | 0.12 | 4 | TRBC1/2 |
| G028975 | 1.01 | 0.04 | 2 | 18.72 | 2.39 | 4 | 1.49 | 0.34 | 4 | 0.60 | 0.12 | 4 | TRBC1/2 |
| G028976 | 0.97 | 0.18 | 2 | 31.70 | 1.75 | 4 | 1.66 | 0.39 | 4 | 0.86 | 0.20 | 4 | TRBC1/2 |
| G028988 | 9.14 | 0.85 | 2 | 87.16 | 3.83 | 4 | 2.33 | 0.27 | 4 | 0.51 | 0.08 | 4 | TRBC1/2 |
| G028994 | 17.70 | 3.82 | 2 | 30.45 | 3.67 | 4 | 1.30 | 0.53 | 4 | 0.54 | 0.06 | 4 | TRBC2 |
| G028995 | 25.45 | 2.47 | 2 | 49.38 | 1.71 | 4 | 1.61 | 0.50 | 4 | 0.64 | 0.03 | 4 | TRBC2 |
| G028996 | 1.64 | 0.28 | 2 | 5.61 | 2.70 | 4 | 0.41 | 0.14 | 4 | 0.19 | 0.06 | 4 | TRBC2 |
| G028997 | 17.00 | 0.85 | 2 | 57.64 | 25.79 | 4 | 1.16 | 0.35 | 4 | 0.54 | 0.17 | 4 | TRBC2 |
| G028998 | 4.13 | 1.70 | 2 | 20.02 | 4.05 | 4 | 2.11 | 0.71 | 4 | 0.24 | 0.08 | 4 | TRBC2 |
| G028999 | 1.51 | 0.12 | 2 | 5.33 | 0.63 | 4 | 1.88 | 2.00 | 4 | 0.16 | 0.03 | 4 | TRBC2 |
| G029000 | 0.58 | 0.06 | 2 | 4.08 | 0.41 | 4 | 0.79 | 0.25 | 4 | 0.32 | 0.08 | 4 | TRBC2 |
| G029001 | 0.25 | 0.01 | 2 | 0.60 | 0.05 | 4 | 0.48 | 0.04 | 4 | 0.11 | 0.03 | 4 | TRBC2 |
| G029002 | 8.26 | 0.19 | 2 | 73.39 | 0.87 | 4 | 1.13 | 0.26 | 4 | 0.73 | 0.05 | 4 | TRBC2 |
| G029003 | 35.00 | 0.28 | 2 | 93.20 | 0.57 | 4 | 1.43 | 0.17 | 4 | 3.78 | 0.38 | 4 | TRBC2 |
| G029004 | 34.20 | 2.12 | 2 | 44.18 | 0.76 | 4 | 1.66 | 0.18 | 4 | 0.35 | 0.07 | 4 | TRBC2 |
| G029005 | 5.40 | 0.40 | 2 | 40.16 | 2.70 | 4 | 1.34 | 0.18 | 4 | 0.48 | 0.06 | 4 | TRBC2 |
| G029006 | 88.15 | 2.76 | 2 | 89.41 | 0.89 | 4 | 3.49 | 0.58 | 4 | 4.54 | 0.26 | 4 | TRBC2 |
| G029007 | 60.55 | 0.64 | 2 | 88.74 | 2.32 | 4 | 2.40 | 0.77 | 4 | 0.84 | 0.23 | 4 | TRBC2 |
| G029008 | 48.55 | 1.48 | 2 | 95.20 | 0.44 | 4 | 1.56 | 0.26 | 4 | 2.05 | 0.23 | 4 | TRBC2 |
| G029009 | 0.95 | 0.22 | 2 | 68.27 | 2.76 | 4 | 2.26 | 0.91 | 4 | 12.78 | 0.16 | 4 | TRBC2 |
| G029010 | 1.42 | 0.25 | 2 | 61.68 | 1.86 | 4 | 1.78 | 0.12 | 4 | 1.13 | 0.10 | 4 | TRBC2 |
| G029011 | 0.25 | 0.01 | 2 | 12.47 | 1.05 | 4 | 2.16 | 0.42 | 4 | 0.18 | 0.02 | 4 | TRBC2 |
| G029012 | 0.17 | 0.01 | 2 | 47.87 | 2.46 | 4 | 2.07 | 0.15 | 4 | 0.22 | 0.05 | 4 | TRBC2 |
進行滴定實驗，以藉由評估CD3細胞表面表現之損失來評價設計用於破壞一或兩個TRBC基因之所選sgRNA的編輯功效。CD3係T細胞受體複合物之細胞表面組分，且其在細胞表面之存在用作TRBC蛋白表現之替代標記物。藉由使用電穿孔在T細胞中用固定濃度的編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 1821)滴定每一sgRNA，為每一sgRNA生成八點劑量反應曲線。接著擴增T細胞且藉由流式細胞術進行表型分析，以確定每一測試之sgRNA之編輯效率。
如實例1中所述製備T細胞。如實例1及表13中所述，藉由mRNA電穿孔，用連續稀釋之靶向TRBC之sgRNA編輯T細胞。在編輯後第7天，如實例4中所述，藉由流式細胞術對經編輯之T細胞進行表型分析以確定CD3表現之損失。將T細胞基於大小、奇異性、活力及CD8陽性進行閘控。表13及圖6顯示對CD3表現為陰性之CD8+ T細胞之百分比。
如實例1中所述製備T細胞。如實例1中所述，藉由mRNA電穿孔，用連續稀釋之靶向TRBC之sgRNA編輯T細胞。在編輯後第7天，如實例3中所述，藉由流式細胞術對經編輯之T細胞進行表型分析以確定CD3表現之損失。將T細胞基於大小、奇異性、活力及CD8陽性進行閘控。表13及圖6顯示對CD3表現為陰性之CD8+ T細胞之百分比。
表 13- 在不同劑量之 TRBC sgRNA 下為 CD3 陰性之 CD8 陽性細胞之百分比
實例 8 ： 具有 Nme2 BC22n 及 Nme2 Cas9 之 CIITA 指導 RNA 之篩選 8.1 具有 Nme2 BC22n 之 CIITA sgRNA 之篩選
| G028986 | |||
| CD8+ 之 CD3-% | |||
| sgRNA (uM) | Ave | SD | N |
| 5.00 | 96.75 | 0.07 | 2 |
| 2.50 | 88.15 | 0.35 | 2 |
| 1.25 | 70.85 | 1.63 | 2 |
| 0.63 | 56 | 3.25 | 2 |
| 0.31 | 34.35 | 1.48 | 2 |
| 0.16 | 20 | 0.28 | 2 |
| 0.08 | 10.16 | 1.05 | 2 |
| 0.00 | 0.36 | 0.06 | 2 |
| G029006 | |||
| CD8+ 之 CD3-% | |||
| sgRNA (uM) | Ave | SD | N |
| 5.00 | 95.05 | 0.35 | 2 |
| 2.50 | 82.75 | 0.21 | 2 |
| 1.25 | 68.35 | 8.27 | 2 |
| 0.63 | 55.05 | 4.60 | 2 |
| 0.31 | 37.55 | 2.33 | 2 |
| 0.16 | 19.7 | 1.13 | 2 |
| 0.08 | 13.1 | 1.13 | 2 |
| 0.00 | 0.43 | 0.00 | 2 |
| G029007 | |||
| CD8+ 之 CD3-% | |||
| sgRNA (uM) | Ave | SD | N |
| 5.00 | 65.65 | 0.07 | 2 |
| 2.50 | 52.55 | 1.34 | 2 |
| 1.25 | 36.3 | 0.57 | 2 |
| 0.63 | 22.6 | 0.71 | 2 |
| 0.31 | 10.4 | 0.42 | 2 |
| 0.16 | 4.565 | 0.49 | 2 |
| 0.08 | 3.21 | 1.09 | 2 |
| 0.00 | 0.335 | 0.05 | 2 |
在藉由mRNA遞送進行CIITA編輯後，藉由經由NGS評估HLA DP、DQ、DR細胞表面表現之損失及編輯，針對在T細胞中之編輯功效篩選CIITA指導RNA。HLA-DP、DR及DQ係細胞表面蛋白，其表現需要轉錄因子CIITA且因此其在細胞表面處之存在係CIITA蛋白表現之替代標記物。
8.1.1 T 細胞製備及用 RNA 電穿孔進行編輯
如實例1中所述製備且活化來自單一供體(編號3786)之T細胞。如實例1及本文中所述，用靶向CIITA之sgRNA、編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)對T細胞進行電穿孔。
8.1.2 流式細胞術及 NGS 定序
如實例1中所述製備T細胞。如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用靶向CIITA基因座之sgRNA編輯T細胞。在電穿孔後第4天，如實例1中所述對經編輯之T細胞樣品進行PCR及NGS分析。在電穿孔後第7天，如實例1中所述，藉由流式細胞術對T細胞進行表型分型，不同之處在於所用抗體混合物針對於細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄編號420201)中以1:100稀釋之CD3 (BioLegend，目錄編號316314)、CD4 (BioLegend，目錄編號317434)、CD8 (BioLegend，目錄編號301046)、Viakrome (Immunotech，目錄編號C36628)及以1:50稀釋之HLA II-DR、DP、DQ (BioLegend，目錄編號361706)。將T細胞基於大小、形狀、活力、CD8及HLA II-DR、DP、DQ表現進行閘控。
表 14及
圖 7A顯示具有HLA-DP、DQ、DR表現損失之CD3 T細胞之平均百分比。CIITA基因座處之編輯百分比示於
表 14及
圖 7B 中。
表 14- HLA II-DP、DR、DQ陰性細胞之平均百分比；作為NGS總讀段之百分比的CIITA基因座之平均編輯百分比
8.2. 具有 Nme2 Cas9 之 CIITA 指導 RNA 之篩選
| 指導ID | HLA DP 、DR 、DQ-ve% | C 至T% | C 至A/G% | 插入/ 缺失% | ||||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | 平均值 | SD | 平均值 | SD | N | |
| G029013 | 34.40 | 4.95 | 2 | 18.75 | 1.90 | 0.60 | 0.11 | 0.13 | 0.07 | 3 |
| G029014 | 54.60 | 5.80 | 2 | 96.18 | 0.32 | 1.71 | 0.05 | 0.78 | 0.15 | 3 |
| G029015 | 44.85 | 0.07 | 2 | 88.66 | 1.75 | 1.40 | 0.08 | 0.42 | 0.09 | 3 |
| G029016 | 37.05 | 7.99 | 2 | 3.20 | 0.50 | 0.23 | 0.17 | 0.02 | 0.02 | 3 |
| G029017 | 41.75 | 12.66 | 2 | 90.90 | 1.36 | 0.55 | 0.01 | 7.28 | 1.08 | 3 |
| G029018 | 45.05 | 4.74 | 2 | 46.49 | 0.66 | 0.41 | 0.09 | 3.13 | 0.17 | 3 |
| G029019 | 44.70 | 4.81 | 2 | 59.06 | 0.13 | 0.42 | 0.04 | 0.30 | 0.05 | 3 |
| G029020 | 37.85 | 3.46 | 2 | 40.66 | 0.14 | 0.52 | 0.15 | 0.31 | 0.04 | 3 |
| G029021 | 31.35 | 1.91 | 2 | 31.25 | 1.13 | 0.38 | 0.06 | 0.17 | 0.04 | 3 |
| G029022 | 38.60 | 0.42 | 2 | 5.70 | 1.01 | 0.44 | 0.36 | 0.21 | 0.27 | 3 |
| G029023 | 38.90 | 3.68 | 2 | 14.55 | 0.94 | 0.77 | 0.11 | 0.03 | 0.04 | 3 |
| G029024 | 29.75 | 4.17 | 2 | 12.24 | 0.41 | 0.23 | 0.04 | 0.06 | 0.03 | 3 |
| G029025 | 41.05 | 5.30 | 2 | 12.60 | 0.73 | 0.32 | 0.06 | 0.35 | 0.15 | 3 |
| G029026 | 49.35 | 1.34 | 2 | 5.75 | 0.66 | 0.24 | 0.06 | 0.04 | 0.03 | 3 |
| G029027 | 54.25 | 2.90 | 2 | 1.45 | 0.07 | 0.30 | 0.06 | 0.75 | 0.14 | 3 |
| G029028 | 50.50 | 0.71 | 2 | 68.54 | 3.78 | 2.29 | 0.09 | 6.12 | 0.59 | 3 |
| G029029 | 88.00 | 2.69 | 2 | 78.07 | 3.53 | 0.97 | 0.36 | 0.18 | 0.10 | 3 |
| G029030 | 77.85 | 1.48 | 2 | 87.88 | 0.43 | 0.57 | 0.23 | 0.60 | 0.03 | 3 |
| G029031 | 62.70 | 0.42 | 2 | 75.45 | 1.67 | 0.15 | 0.06 | 0.05 | 0.00 | 3 |
| G029032 | 49.60 | 2.12 | 2 | 2.41 | 0.30 | 0.17 | 0.12 | 0.17 | 0.23 | 3 |
| G029033 | 69.60 | 1.84 | 2 | 58.57 | 3.90 | 0.49 | 0.14 | 1.09 | 0.58 | 3 |
| G029034 | 50.90 | 6.08 | 1 | 16.00 | 2.53 | 0.38 | 0.28 | 0.10 | 0.06 | 3 |
| G029035 | 75.00 | 8.91 | 2 | 69.61 | 3.67 | 0.40 | 0.15 | 1.75 | 0.31 | 3 |
| G029036 | 71.65 | 14.78 | 2 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 3 |
| G029037 | 41.85 | 8.27 | 2 | 33.36 | 3.21 | 0.58 | 0.18 | 0.93 | 0.12 | 3 |
| G029038 | 56.00 | 2.55 | 2 | 6.63 | 3.25 | 0.31 | 0.13 | 0.01 | 0.02 | 3 |
| G029039 | 50.15 | 1.20 | 2 | 12.85 | 18.84 | 1.01 | 1.16 | 0.00 | 0.00 | 3 |
| G029040 | 55.50 | 0.57 | 2 | 36.13 | 12.71 | 0.30 | 0.24 | 0.01 | 0.02 | 3 |
| G029041 | 70.00 | 2.97 | 2 | 29.51 | 1.69 | 0.51 | 0.16 | 0.11 | 0.02 | 3 |
| G029042 | 52.10 | 0.85 | 2 | 14.95 | 2.44 | 0.45 | 0.04 | 0.03 | 0.00 | 3 |
| G029043 | 52.65 | 4.45 | 2 | 8.31 | 0.36 | 0.43 | 0.18 | 0.05 | 0.02 | 3 |
| G029044 | 54.40 | 1.13 | 2 | 3.50 | 0.04 | 0.47 | 0.13 | 0.07 | 0.05 | 3 |
| G029045 | 48.30 | 1.56 | 2 | 5.11 | 0.72 | 0.24 | 0.09 | 0.04 | 0.03 | 3 |
| G029046 | 60.60 | 2.83 | 2 | 85.08 | 2.95 | 1.26 | 0.24 | 0.58 | 0.11 | 3 |
| G029047 | 48.00 | 5.80 | 2 | 91.28 | 2.37 | 1.44 | 0.43 | 2.26 | 0.66 | 3 |
| G029048 | 56.35 | 3.32 | 2 | 77.44 | 0.57 | 1.31 | 0.68 | 1.76 | 0.63 | 3 |
| G029049 | 41.15 | 8.56 | 2 | 7.42 | 0.23 | 0.09 | 0.04 | 1.55 | 2.65 | 3 |
| G029050 | 59.15 | 4.74 | 2 | 19.53 | 0.87 | 0.17 | 0.07 | 0.02 | 0.02 | 3 |
| G029051 | 51.60 | 5.66 | 2 | 9.63 | 0.80 | 0.15 | 0.05 | 0.07 | 0.03 | 3 |
| G029052 | 52.60 | 1.98 | 2 | 5.81 | 0.21 | 0.29 | 0.04 | 0.20 | 0.06 | 3 |
| G029053 | 49.25 | 1.48 | 2 | 0.37 | 0.07 | 0.20 | 0.06 | 0.16 | 0.23 | 3 |
| G029054 | 47.60 | 11.03 | 2 | 3.23 | 0.11 | 0.14 | 0.03 | 0.04 | 0.04 | 3 |
| G029055 | 50.10 | 8.77 | 2 | 2.06 | 0.27 | 0.10 | 0.06 | 0.02 | 0.01 | 3 |
| G029056 | 62.45 | 2.76 | 2 | 79.87 | 3.36 | 0.79 | 0.08 | 1.87 | 0.15 | 3 |
| G029057 | 53.20 | 3.82 | 2 | 4.50 | 0.24 | 0.26 | 0.12 | 0.03 | 0.01 | 3 |
| G029058 | 51.95 | 5.16 | 2 | 0.91 | 0.15 | 0.12 | 0.03 | 0.26 | 0.18 | 3 |
| G029059 | 52.55 | 6.29 | 2 | 1.25 | 0.11 | 0.21 | 0.06 | 0.29 | 0.23 | 3 |
| G029060 | 43.25 | 3.46 | 2 | 0.45 | 0.11 | 0.18 | 0.10 | 0.22 | 0.17 | 3 |
| G029061 | 41.30 | 8.63 | 1 | 27.96 | 2.63 | 0.33 | 0.15 | 0.55 | 0.11 | 3 |
| G029062 | 57.55 | 0.21 | 2 | 65.48 | 5.49 | 1.08 | 0.15 | 4.29 | 2.51 | 3 |
| G029063 | 72.90 | 0.71 | 2 | 63.82 | 6.02 | 1.43 | 0.25 | 0.19 | 0.07 | 3 |
| G029064 | 50.15 | 4.31 | 2 | 8.25 | 1.52 | 0.38 | 0.07 | 0.60 | 0.30 | 3 |
| G029065 | 45.90 | 2.12 | 2 | 19.00 | 1.71 | 1.61 | 0.46 | 0.41 | 0.37 | 3 |
| G029066 | 43.80 | 7.07 | 2 | 1.93 | 0.50 | 0.95 | 0.24 | 0.08 | 0.03 | 3 |
| G029067 | 45.75 | 0.78 | 2 | 2.32 | 0.48 | 0.78 | 0.27 | 0.06 | 0.02 | 3 |
| G029068 | 44.55 | 0.35 | 2 | 3.58 | 0.11 | 0.14 | 0.05 | 0.04 | 0.03 | 3 |
| G029069 | 52.75 | 3.46 | 2 | 32.35 | 0.63 | 0.35 | 0.02 | 0.10 | 0.05 | 3 |
| G029070 | 73.30 | 4.38 | 2 | 92.11 | 0.53 | 1.28 | 0.22 | 0.67 | 0.14 | 3 |
| G029071 | 50.65 | 1.06 | 2 | 35.16 | 2.51 | 0.29 | 0.08 | 0.19 | 0.10 | 3 |
| G029072 | 42.35 | 2.33 | 2 | 1.47 | 0.07 | 0.27 | 0.03 | 0.05 | 0.04 | 3 |
| G029073 | 41.30 | 9.48 | 2 | 46.89 | 2.53 | 0.66 | 0.23 | 0.21 | 0.15 | 3 |
| G029074 | 52.20 | 0.14 | 2 | 48.77 | 3.02 | 0.61 | 0.04 | 0.19 | 0.08 | 3 |
| G029075 | 49.30 | 1.13 | 2 | 12.47 | 1.16 | 0.69 | 0.19 | 0.76 | 0.82 | 3 |
| G029076 | 43.45 | 3.04 | 2 | 17.10 | 0.40 | 0.47 | 0.05 | 0.79 | 0.97 | 3 |
| G029077 | 48.20 | 2.55 | 2 | 6.55 | 1.34 | 0.16 | 0.12 | 0.14 | 0.03 | 3 |
| G029078 | 43.30 | 0.42 | 2 | 9.78 | 0.71 | 1.18 | 0.12 | 0.07 | 0.07 | 3 |
| G029079 | 58.65 | 0.35 | 2 | 56.55 | 3.15 | 1.49 | 0.10 | 0.41 | 0.04 | 3 |
| G029080 | 50.35 | 0.21 | 2 | 11.06 | 0.91 | 1.24 | 0.14 | 0.07 | 0.03 | 3 |
| G029081 | 85.40 | 1.84 | 2 | 69.63 | 4.27 | 1.26 | 0.21 | 0.57 | 0.31 | 3 |
| G029082 | 51.85 | 4.17 | 2 | 9.09 | 2.32 | 1.87 | 0.85 | 0.04 | 0.04 | 3 |
| G029083 | 46.55 | 0.35 | 2 | 6.81 | 2.37 | 1.21 | 0.07 | 0.03 | 0.03 | 3 |
| G029084 | 46.60 | 12.16 | 2 | 35.64 | 9.40 | 0.94 | 0.55 | 0.40 | 0.14 | 3 |
| G029085 | 38.40 | 7.50 | 2 | 92.18 | 1.18 | 1.09 | 0.03 | 1.98 | 0.05 | 3 |
| G029086 | 44.85 | 2.47 | 2 | 7.25 | 0.44 | 0.34 | 0.08 | 0.73 | 0.16 | 3 |
| G029087 | 47.30 | 0.28 | 2 | 17.14 | 1.34 | 0.43 | 0.07 | 0.75 | 0.17 | 3 |
| G029088 | 49.85 | 4.17 | 2 | 30.15 | 3.86 | 0.20 | 0.34 | 0.22 | 0.38 | 3 |
| G029089 | 45.00 | 0.28 | 2 | 2.98 | 0.25 | 0.66 | 0.38 | 0.10 | 0.05 | 3 |
| G029090 | 39.10 | 2.26 | 2 | 8.97 | 0.53 | 0.39 | 0.20 | 0.34 | 0.13 | 3 |
| G029091 | 40.05 | 3.18 | 2 | 25.28 | 4.23 | 3.02 | 2.63 | 0.31 | 0.28 | 3 |
| G029092 | 49.50 | 0.99 | 2 | 90.70 | 4.31 | 3.27 | 2.57 | 3.66 | 0.69 | 3 |
| G029093 | 46.70 | 7.07 | 2 | 0.39 | 0.05 | 2.79 | 2.28 | 0.08 | 0.07 | 3 |
| G029094 | 46.40 | 4.81 | 2 | 11.75 | 0.73 | 0.98 | 0.08 | 0.33 | 0.10 | 3 |
| G029095 | 42.75 | 7.57 | 2 | 3.37 | 0.46 | 0.89 | 0.17 | 0.11 | 0.05 | 3 |
| G029096 | 33.95 | 4.60 | 2 | 19.19 | 4.61 | 0.94 | 0.18 | 0.33 | 0.19 | 3 |
| G029097 | 33.90 | 1.70 | 2 | 85.22 | 0.86 | 1.66 | 0.16 | 6.17 | 0.23 | 3 |
| G029098 | 45.70 | 1.41 | 2 | 55.36 | 3.68 | 0.96 | 0.14 | 0.35 | 0.16 | 3 |
| G029099 | 42.75 | 0.64 | 2 | 11.94 | 1.85 | 1.17 | 0.08 | 0.14 | 0.06 | 3 |
| G029100 | 34.55 | 0.49 | 2 | 4.72 | 0.45 | 1.52 | 0.56 | 0.13 | 0.15 | 3 |
| G029101 | 40.95 | 0.21 | 2 | 1.72 | 0.44 | 1.16 | 0.39 | 0.07 | 0.06 | 3 |
| G029102 | 35.40 | 1.98 | 2 | 0.44 | 0.13 | 0.50 | 0.05 | 0.08 | 0.05 | 3 |
| G029103 | 32.20 | 0.99 | 2 | 2.30 | 0.43 | 0.35 | 0.24 | 0.10 | 0.13 | 4 |
| G029104 | 50.40 | 5.52 | 2 | 34.26 | 1.13 | 0.94 | 0.21 | 0.38 | 0.18 | 4 |
| G029105 | 38.05 | 1.34 | 2 | 93.46 | 0.85 | 1.80 | 0.13 | 3.54 | 0.79 | 4 |
| G029106 | 43.05 | 3.18 | 2 | 24.88 | 0.99 | 0.31 | 0.07 | 0.09 | 0.06 | 4 |
| G029107 | 49.40 | 2.97 | 2 | 39.56 | 2.80 | 0.35 | 0.05 | 0.28 | 0.02 | 4 |
| G029108 | 39.05 | 9.69 | 2 | 31.33 | 5.11 | 0.27 | 0.02 | 0.15 | 0.05 | 4 |
| G029109 | 71.15 | 0.92 | 2 | 89.12 | 9.14 | 8.05 | 8.87 | 0.79 | 0.20 | 4 |
| G029110 | 37.25 | 0.78 | 2 | 53.06 | 3.72 | 1.41 | 0.60 | 0.45 | 0.15 | 4 |
| G029111 | 35.20 | 2.40 | 2 | 43.21 | 4.33 | 1.02 | 0.22 | 0.47 | 0.25 | 4 |
| G029112 | 41.90 | 0.42 | 2 | 4.38 | 0.37 | 0.67 | 0.21 | 0.22 | 0.20 | 4 |
| G029113 | 41.30 | 9.19 | 2 | 11.35 | 0.91 | 0.66 | 0.04 | 0.45 | 0.16 | 4 |
| G029114 | 34.00 | 3.96 | 2 | 8.69 | 0.44 | 0.63 | 0.08 | 0.27 | 0.03 | 4 |
| G029115 | 45.35 | 11.67 | 2 | 50.53 | 1.40 | 0.99 | 0.19 | 2.22 | 0.77 | 4 |
| G029116 | 59.55 | 4.88 | 2 | 31.29 | 2.75 | 0.81 | 0.09 | 0.49 | 0.24 | 4 |
| G029117 | 81.45 | 0.35 | 2 | 91.14 | 1.77 | 2.68 | 1.60 | 0.41 | 0.10 | 4 |
| G029118 | 51.90 | 1.27 | 2 | 16.93 | 0.68 | 1.79 | 0.61 | 0.89 | 0.47 | 4 |
| G029119 | 63.15 | 5.30 | 2 | 46.34 | 0.58 | 1.54 | 0.39 | 0.65 | 0.16 | 4 |
| G029120 | 55.30 | 2.69 | 2 | 12.79 | 0.80 | 0.47 | 0.14 | 0.13 | 0.06 | 4 |
| G029121 | 56.15 | 3.32 | 2 | 16.62 | 0.64 | 0.62 | 0.17 | 0.07 | 0.05 | 4 |
| G029122 | 55.30 | 8.34 | 2 | 3.08 | 1.96 | 0.20 | 0.27 | 0.10 | 0.17 | 4 |
| G029123 | 90.80 | 0.99 | 2 | 89.28 | 0.71 | 0.63 | 0.94 | 0.17 | 0.22 | 4 |
| G029124 | 65.90 | 3.39 | 2 | 43.34 | 6.94 | 0.19 | 0.13 | 0.42 | 0.28 | 4 |
| G029125 | 54.35 | 4.31 | 2 | 11.68 | 3.17 | 0.23 | 0.27 | 0.06 | 0.07 | 4 |
| G029126 | 37.75 | 0.49 | 2 | 12.13 | 1.22 | 0.58 | 0.19 | 0.47 | 0.40 | 4 |
| G029127 | 45.20 | 7.07 | 2 | 5.05 | 1.26 | 0.28 | 0.32 | 0.06 | 0.08 | 4 |
| G029128 | 81.55 | 2.05 | 2 | 88.85 | 2.04 | 0.82 | 0.29 | 2.03 | 0.33 | 4 |
| G029129 | 75.35 | 5.02 | 2 | 51.88 | 0.94 | 0.49 | 0.04 | 0.86 | 0.13 | 4 |
| G029130 | 58.20 | 8.77 | 2 | 18.50 | 1.66 | 0.40 | 0.15 | 1.43 | 0.40 | 4 |
| G029131 | 93.15 | 1.91 | 2 | 93.47 | 1.53 | 0.78 | 0.37 | 1.63 | 0.67 | 4 |
| G029132 | 53.50 | 8.20 | 2 | 4.52 | 0.15 | 0.53 | 0.11 | 0.05 | 0.03 | 4 |
| G029133 | 63.55 | 1.91 | 2 | 44.52 | 1.48 | 1.33 | 0.30 | 0.99 | 0.51 | 4 |
| G029134 | 47.70 | 1.98 | 2 | 7.17 | 1.32 | 1.32 | 0.54 | 0.34 | 0.31 | 4 |
| G029135 | 43.25 | 61.16 | 2 | 85.48 | 1.21 | 1.52 | 0.31 | 10.28 | 1.03 | 4 |
| G029136 | 52.75 | 2.47 | 2 | 10.14 | 0.23 | 1.00 | 0.46 | 0.13 | 0.06 | 4 |
| G029137 | 65.90 | 0.57 | 2 | 50.89 | 1.82 | 1.30 | 0.57 | 0.27 | 0.07 | 4 |
| G029138 | 57.60 | 6.79 | 2 | 38.26 | 1.45 | 2.03 | 0.49 | 0.25 | 0.05 | 4 |
| G029139 | 48.30 | 1.27 | 2 | 16.01 | 0.82 | 1.37 | 1.10 | 0.06 | 0.06 | 4 |
| G029140 | 75.15 | 0.07 | 2 | 47.78 | 3.71 | 1.10 | 0.64 | 0.17 | 0.06 | 4 |
| G029141 | 69.90 | 3.82 | 2 | 34.65 | 1.70 | 0.93 | 0.61 | 0.32 | 0.39 | 4 |
| G029142 | 60.95 | 3.75 | 2 | 15.07 | 1.14 | 0.89 | 0.68 | 0.06 | 0.06 | 4 |
| G029143 | 67.65 | 1.06 | 2 | 36.84 | 1.93 | 0.63 | 0.32 | 0.18 | 0.09 | 4 |
| G029144 | 56.70 | 2.55 | 2 | 5.40 | 0.54 | 0.44 | 0.31 | 0.04 | 0.02 | 4 |
| G029145 | 54.40 | 9.48 | 2 | 0.78 | 0.04 | 0.68 | 0.53 | 0.18 | 0.17 | 4 |
| G029146 | 63.20 | 8.63 | 2 | 63.58 | 3.19 | 0.93 | 0.80 | 1.93 | 0.28 | 4 |
| G029147 | 56.05 | 1.20 | 2 | 10.86 | 0.91 | 0.66 | 0.41 | 0.05 | 0.04 | 4 |
| G029148 | 51.95 | 0.49 | 2 | 1.50 | 0.36 | 0.35 | 0.20 | 0.04 | 0.03 | 4 |
| G029149 | 59.30 | 2.69 | 2 | 3.23 | 0.18 | 0.49 | 0.15 | 0.14 | 0.08 | 4 |
| G029150 | 49.40 | 1.70 | 2 | 46.90 | 1.43 | 1.09 | 0.23 | 0.89 | 0.15 | 4 |
| G029151 | 52.95 | 9.83 | 2 | 9.70 | 0.57 | 0.59 | 0.42 | 0.89 | 0.12 | 4 |
| G029152 | 56.90 | 3.11 | 2 | 1.80 | 0.23 | 1.06 | 1.52 | 3.20 | 3.20 | 4 |
| G029153 | 52.90 | 4.95 | 2 | 0.23 | 0.10 | 0.65 | 0.27 | 0.29 | 0.20 | 4 |
| G029154 | 54.45 | 4.88 | 2 | 1.15 | 0.38 | 0.49 | 0.12 | 0.85 | 0.61 | 4 |
| G029155 | 56.70 | 0.28 | 2 | 14.72 | 1.08 | 0.67 | 0.12 | 0.44 | 0.42 | 4 |
| G029156 | 53.75 | 0.35 | 2 | 6.87 | 0.62 | 0.73 | 0.14 | 0.13 | 0.11 | 4 |
| G029157 | 56.25 | 1.06 | 2 | 3.13 | 0.37 | 0.78 | 0.10 | 0.20 | 0.09 | 4 |
| G029158 | 51.60 | 3.96 | 2 | 7.70 | 0.81 | 1.02 | 0.02 | 0.10 | 0.03 | 4 |
| G029159 | 56.45 | 1.20 | 2 | 8.61 | 0.59 | 1.16 | 0.19 | 0.18 | 0.03 | 4 |
| G029160 | 72.15 | 5.02 | 2 | 50.61 | 2.24 | 3.06 | 2.44 | 1.28 | 0.34 | 4 |
| G029161 | 59.45 | 2.62 | 2 | 1.81 | 0.22 | 0.39 | 0.18 | 0.07 | 0.04 | 4 |
| G029162 | 50.50 | 2.12 | 2 | 17.38 | 1.22 | 0.93 | 0.50 | 3.06 | 2.91 | 4 |
| G029163 | 46.55 | 9.97 | 2 | 11.23 | 0.99 | 0.57 | 0.18 | 0.04 | 0.03 | 4 |
| G029164 | 67.15 | 2.33 | 2 | 58.31 | 3.24 | 0.96 | 0.32 | 0.92 | 0.73 | 4 |
| G029165 | 53.65 | 4.17 | 2 | 0.71 | 0.24 | 0.19 | 0.14 | 0.42 | 0.49 | 4 |
| G029166 | 53.45 | 0.35 | 2 | 29.13 | 1.23 | 0.48 | 0.08 | 0.27 | 0.20 | 4 |
| G029167 | 66.60 | 1.84 | 2 | 32.25 | 1.39 | 1.11 | 0.13 | 0.15 | 0.23 | 4 |
| G029168 | 50.20 | 6.93 | 2 | 1.25 | 0.27 | 0.93 | 0.53 | 0.13 | 0.20 | 4 |
| G029169 | 49.80 | 6.51 | 2 | 0.89 | 1.05 | 0.47 | 0.55 | 0.05 | 0.07 | 4 |
| G029170 | 49.35 | 5.44 | 2 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | |
| G029171 | 84.10 | 0.00 | 2 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.00 | |
| G029172 | 95.20 | 0.42 | 2 | 90.18 | 1.06 | 1.15 | 0.09 | 1.95 | 0.62 | 4 |
| G029173 | 72.50 | 4.95 | 2 | 45.16 | 1.85 | 0.93 | 0.03 | 1.85 | 1.06 | 4 |
| G029174 | 59.55 | 5.59 | 2 | 6.11 | 0.81 | 0.58 | 0.06 | 0.10 | 0.05 | 4 |
| G029175 | 49.80 | 3.25 | 2 | 0.28 | 0.10 | 0.29 | 0.19 | 5.18 | 4.22 | 4 |
| G029176 | 48.35 | 4.88 | 2 | 3.15 | 0.46 | 0.23 | 0.16 | 4.47 | 2.55 | 4 |
| G029177 | 79.80 | 1.41 | 2 | 83.07 | 2.06 | 0.76 | 0.11 | 2.00 | 1.95 | 4 |
| G029178 | 53.80 | 0.85 | 2 | 34.52 | 8.46 | 0.41 | 0.17 | 2.52 | 2.17 | 4 |
| G029179 | 51.45 | 7.14 | 2 | 22.28 | 2.43 | 0.24 | 0.04 | 1.25 | 1.31 | 4 |
| G029180 | 51.75 | 4.88 | 2 | 58.42 | 2.55 | 1.21 | 0.13 | 0.21 | 0.05 | 4 |
| G029181 | 51.15 | 4.88 | 2 | 9.33 | 0.23 | 0.67 | 0.30 | 0.14 | 0.14 | 4 |
| G029182 | 49.95 | 2.76 | 2 | 7.53 | 0.57 | 0.83 | 0.09 | 0.29 | 0.24 | 4 |
| G029183 | 49.20 | 2.12 | 2 | 27.27 | 1.48 | 1.14 | 0.21 | 0.45 | 0.36 | 4 |
| G029184 | 36.70 | 2.83 | 2 | 23.25 | 2.15 | 0.36 | 0.20 | 0.11 | 0.05 | 4 |
| G029185 | 42.00 | 4.81 | 2 | 11.98 | 2.17 | 0.33 | 0.14 | 0.11 | 0.09 | 4 |
| G029186 | 55.05 | 2.76 | 2 | 19.73 | 0.53 | 0.41 | 0.18 | 0.15 | 0.05 | 4 |
| G029187 | 59.60 | 1.56 | 2 | 12.22 | 1.40 | 0.79 | 0.13 | 0.04 | 0.04 | 4 |
| G029188 | 57.50 | 7.21 | 2 | 6.53 | 0.36 | 0.41 | 0.35 | 0.20 | 0.16 | 4 |
| G029189 | 49.20 | 4.38 | 2 | 0.13 | 0.04 | 0.65 | 0.22 | 0.04 | 0.05 | 4 |
| G029190 | 44.05 | 2.76 | 2 | 0.40 | 0.09 | 0.54 | 0.19 | 0.04 | 0.04 | 4 |
在藉由mRNA遞送進行CIITA編輯後，藉由經由流式細胞術評估HLA-DP/DQ/DR細胞表面表現之損失及藉由NGS評估編輯，針對在T細胞中之功效篩選靶向CIITA之額外sgRNA。
8.2.1 T 細胞製備及用 RNA 電穿孔進行編輯
如實例1中所述，在T細胞生長培養基中使用2.5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)製備T細胞。除以下差異之外，如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用靶向CIITA基因之sgRNA對T細胞進行電穿孔。本研究使用編碼Nme2 Cas9之mRNA (SEQ ID No: 826)代替分別編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子及UGI之mRNA。
用最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中之1 x 10^5個T細胞、30 ng/µL Nme2 Cas9 mRNA及40 pmol sgRNA製備Cas9電穿孔混合物。
8.2.2 流式細胞術及 NGS 定序
在電穿孔後第7天，如實例1中所述，收集經編輯之T細胞樣品且進行PCR及NGS分析。在編輯後第13天，藉由流式細胞術對細胞進行表型分析以確定HLA II-DR、DP、DQ蛋白表現。簡言之，將T細胞與於細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄編號420201)中以1:100稀釋的針對CD3之抗體(BioLegend，目錄編號317338)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄編號317434)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄編號301046)、針對Viakrome之抗體(Beckman Coulter，目錄編號C36628)及以1:50稀釋的針對HLA II-DR、DP、DQ之抗體(BioLegend，目錄編號361706)之混合物於4℃下培育30 min以確定HLA-DP、DQ、DR蛋白表現。將T細胞基於大小、形狀、活力、CD3、CD8及HLA II-DR、DP、DQ表現進行閘控。
表 15顯示具有HLA II損失之T細胞之百分比及CIITA基因之平均編輯百分比。圖8顯示左側垂直軸上用Nme2 Cas9編輯之HLA II-DR、DP、DQ陰性細胞之百分比及右側垂直軸上之平均編輯百分比。
表 15- HLA II-DP、DR、DQ陰性細胞之平均百分比；作為NGS總讀段之百分比的CIITA基因座之平均插入/缺失百分比
實例 9 ： 所選 CIITA Nme2 指導之劑量反應曲線 (DRC)
| 指導ID | 插入/ 缺失% | CD8+ 、HLA-DP 、DQ 、DR - | |||
| 平均值 | SD | 平均值 | SD | N | |
| 未經處理 | 40.25 | 0.05 | 2 | ||
| G023421 | 2.55 | 0.25 | 45.2 | 8.1 | 2 |
| G023422 | 1.1 | 0 | 46.4 | 5.1 | 2 |
| G023423 | 1.7 | 0.4 | 47.7 | 1.7 | 2 |
| G023424 | 0.35 | 0.05 | 44.45 | 1.25 | 2 |
| G023425 | 0.65 | 0.55 | 46.25 | 2.95 | 2 |
| G023426 | 7.7 | 2.1 | 50.15 | 1.55 | 2 |
| G023427 | 0.5 | 0.1 | 46.15 | 4.35 | 2 |
| G023428 | 0.15 | 0.05 | 50.4 | 0.4 | 2 |
| G023429 | 0.9 | 0.1 | 48.15 | 2.35 | 2 |
| G023430 | 0.1 | 0 | 50.3 | 1.5 | 2 |
| G023431 | 1.55 | 0.35 | 50.8 | 1.6 | 2 |
| G023432 | 0.15 | 0.05 | 52.45 | 0.85 | 2 |
| G023433 | 0.15 | 0.05 | 46.25 | 0.65 | 2 |
| G023434 | 2.1 | 0.2 | 49.85 | 0.05 | 2 |
| G023435 | 0.65 | 0.05 | 52.05 | 0.85 | 2 |
| G023436 | 0.35 | 0.05 | 53.5 | 1.4 | 2 |
| G023437 | 0.9 | 0.1 | 52.1 | 0.1 | 2 |
| G023438 | 0.15 | 0.15 | 53.15 | 1.35 | 2 |
| G023439 | 0.1 | 0 | 51.05 | 0.25 | 2 |
| G023440 | 0.35 | 0.15 | 54.35 | 1.05 | 2 |
| G023441 | 25.4 | 1.1 | 59.7 | 4.3 | 2 |
| G023442 | 0.2 | 0 | 57.75 | 1.55 | 2 |
| G023443 | 18.65 | 0.25 | 69.15 | 15.05 | 2 |
| G023444 | 28.15 | 6.05 | 58.65 | 1.85 | 2 |
| G023445 | 2.45 | 0.35 | 55.25 | 0.15 | 2 |
| G023446 | 0.9 | 0.3 | 49.15 | 0.55 | 2 |
| G023447 | 0.35 | 0.15 | 54.45 | 3.75 | 2 |
| G023448 | 0.2 | 0 | 51.5 | 0.6 | 2 |
| G023449 | 0 | 0 | 53.6 | 3 | 2 |
| G023450 | 0.1 | 0 | 54 | 2.3 | 2 |
| G023451 | 0.15 | 0.05 | 51.05 | 2.75 | 2 |
| G023452 | 0.55 | 0.15 | 52.75 | 2.45 | 2 |
| G023453 | 0.1 | 0 | 52.85 | 3.55 | 2 |
| G023454 | 0.35 | 0.15 | 55.65 | 4.35 | 2 |
| G023455 | 0.25 | 0.05 | 53.3 | 4.2 | 2 |
| G023456 | 12.8 | 2 | 56 | 3 | 2 |
| G023457 | 0.35 | 0.05 | 55.85 | 3.75 | 2 |
| G023458 | 1 | 0.3 | 52 | 3.2 | 2 |
| G023459 | 1.3 | 0.4 | 51.15 | 3.05 | 2 |
| G023460 | 0.45 | 0.05 | 53.75 | 1.35 | 2 |
| G023461 | 0.45 | 0.05 | 53.25 | 1.65 | 2 |
| G023462 | 1.05 | 0.15 | 52.2 | 4 | 2 |
| G023463 | 0.2 | 0 | 51.15 | 3.95 | 2 |
| G023464 | 6.6 | 1 | 54.1 | 1 | 2 |
| G023465 | 0.05 | 0.05 | 52.45 | 0.45 | 2 |
| G023466 | 0.2 | 0.2 | 51.2 | 2.7 | 2 |
| G023467 | 0.2 | 0 | 54.75 | 2.45 | 2 |
| G023468 | 3.25 | 0.15 | 58.3 | 3.9 | 2 |
| G023469 | 1.6 | 0.1 | 56.85 | 4.55 | 2 |
| G023470 | 0.1 | 0 | 54.25 | 2.95 | 2 |
| G023471 | 0.55 | 0.25 | 53.65 | 4.05 | 2 |
| G023472 | 0.1 | 0 | 53.2 | 1.7 | 2 |
| G023473 | 2.5 | 1 | 57.2 | 2.3 | 2 |
| G023474 | 0.6 | 0.1 | 57.65 | 1.75 | 2 |
| G023475 | 12.75 | 1.05 | 58.65 | 2.25 | 2 |
| G023476 | 10.9 | 1.3 | 58.25 | 1.05 | 2 |
| G023477 | 93.8 | 1.1 | 80.45 | 3.95 | 2 |
| G023478 | 52.75 | 5.95 | 64.9 | 2.2 | 2 |
| G023479 | 13.75 | 2.05 | 58.85 | 0.25 | 2 |
| G023480 | 0.1 | 0 | 55.5 | 1.2 | 2 |
| G023481 | 0.2 | 0 | 54.8 | 1.4 | 2 |
| G023482 | 0.5 | 0.4 | 52.8 | 2.1 | 2 |
| G023483 | 0.1 | 0 | 53.35 | 2.65 | 2 |
| G023484 | 0.1 | 0 | 59.7 | 8.4 | 2 |
| G023485 | 0.25 | 0.05 | 50.2 | 0.2 | 2 |
| G023486 | 4.5 | 0.2 | 52.45 | 0.65 | 2 |
| G023487 | 0.4 | 0.1 | 52.85 | 3.35 | 2 |
| G023488 | 1.4 | 0.2 | 52 | 2.7 | 2 |
| G023489 | 0.15 | 0.05 | 52.85 | 2.35 | 2 |
| G023490 | 0.15 | 0.15 | 53.2 | 1.8 | 2 |
| G023491 | 1 | 0.2 | 53.45 | 0.95 | 2 |
| G023492 | 40.25 | 12.05 | 59.6 | 0.8 | 2 |
| G023493 | 0.8 | 0.4 | 56.7 | 0.9 | 2 |
| G023494 | 0.3 | 0.2 | 51.55 | 2.35 | 2 |
| G023495 | 1.5 | 1.3 | 53.25 | 1.05 | 2 |
| G023496 | 0.1 | 0 | 52.05 | 3.15 | 2 |
| G023497 | 0.05 | 0.05 | 52.85 | 0.35 | 2 |
| G023498 | 0.1 | 0 | 53 | 0.9 | 2 |
| G023499 | 0.4 | 0 | 53.65 | 4.05 | 2 |
| G023500 | 4.2 | 0.3 | 53.7 | 3 | 2 |
| G023501 | 3.1 | 0.1 | 51.95 | 2.35 | 2 |
| G023502 | 3.95 | 0.35 | 53.95 | 0.95 | 2 |
| G023503 | 2.95 | 0.05 | 53.5 | 3.5 | 2 |
| G023504 | 0.25 | 0.05 | 51.7 | 1.6 | 2 |
| G023505 | 4.1 | 0.1 | 52.9 | 1 | 2 |
| G023506 | 1.95 | 0.15 | 49.8 | 0.9 | 2 |
| G023507 | 1.3 | 1 | 53.2 | 3.4 | 2 |
| G023508 | 0.1 | 0 | 53.15 | 5.35 | 2 |
| G023509 | 0.15 | 0.05 | 51.85 | 0.85 | 2 |
| G023510 | 0.15 | 0.05 | 53.8 | 0.3 | 2 |
| G023511 | 0.25 | 0.05 | 51.75 | 0.25 | 2 |
| G023512 | 0.1 | 0 | 51.75 | 2.65 | 2 |
| G023513 | 0.1 | 0 | 53.85 | 2.35 | 2 |
| G023514 | 0.35 | 0.05 | 53.1 | 2.1 | 2 |
| G023515 | 0.1 | 0 | 51.95 | 0.95 | 2 |
進行滴定實驗，以藉由經由流式細胞術評估HLA DP、DQ、DR細胞表面表現之損失及藉由NGS評估CIITA處之編輯頻率來評價設計用於破壞CIITA基因之所選sgRNA的編輯功效。HLA-DP、DR及DQ係細胞表面蛋白，其表現需要轉錄因子CIITA且因此其在細胞表面處之存在係CIITA蛋白表現之替代標記物。
藉由使用電穿孔在T細胞中用固定濃度的編碼Nme2 BC22n之mRNA (SEQ ID NO: 822)及編碼UGI之mRNA (SEQ ID NO: 821)滴定每一sgRNA，為每一sgRNA生成八點劑量反應曲線。接著擴增T細胞且藉由流式細胞術進行表型分析，以確定每一測試之sgRNA之編輯效率。
如實例1中所述製備單一供體(編號808)之T細胞。如實例1中所述，藉由mRNA電穿孔，用連續稀釋之靶向CIITA之sgRNA (0、0.94、1.88、3.75、7.5、15、30或60 pmol)編輯T細胞。在編輯後第4天，如實例1中所述，收集T細胞樣品且進行PCR及NGS分析。在編輯後第7天，如實例8中所述，藉由流式細胞術對T細胞進行表型分析以確定HLA-DP、DQ、DR表現。將T細胞基於大小、奇異性、活力及CD8陽性進行閘控。表16及圖9A顯示NGS編輯結果。表16及圖9B顯示對HLA-DP、DQ、DR表現為陰性之CD8+ T細胞之百分比
表16
實例 10 ：具有 Nme2Cas9 之 AAVS1 指導之篩選
| G029029 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 90.74% | 1.38% | 2 | 1.62% | 0.27% | 2 | 0.43% | 0.08% | 2 | 91.95 | 1.77 | 2 |
| 30 | 42.49% | 0.45% | 2 | 1.70% | 0.22% | 2 | 0.15% | 0.04% | 2 | 69.45 | 1.20 | 2 |
| 15 | 25.50% | 2.00% | 2 | 1.64% | 0.17% | 2 | 0.11% | 0.05% | 2 | 58.1 | 3.25 | 2 |
| 7.5 | 13.63% | 0.29% | 2 | 1.96% | 0.12% | 2 | 0.05% | 0.00% | 2 | 52.7 | 0.99 | 2 |
| 3.75 | 7.08% | 0.37% | 2 | 1.58% | 0.16% | 2 | 0.07% | 0.00% | 2 | 50.35 | 2.33 | 2 |
| 1.88 | 3.08% | 0.13% | 2 | 1.49% | 0.20% | 2 | 0.04% | 0.00% | 2 | 45.2 | 2.40 | 2 |
| 0.94 | 1.46% | 0.34% | 2 | 1.42% | 0.19% | 2 | 0.03% | 0.01% | 2 | 47.15 | 1.48 | 2 |
| 0 | 0.04% | 0.00% | 2 | 2.51% | 1.11% | 2 | 0.03% | 0.02% | 2 | 45.3 | 4.81 | 2 |
| G029081 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 87.77% | 0.42% | 2 | 1.29% | 0.03% | 2 | 1.05% | 0.22% | 2 | 92.15 | 1.48 | 2 |
| 30 | 36.59% | 1.71% | 2 | 1.06% | 0.11% | 2 | 0.42% | 0.03% | 2 | 66.85 | 2.33 | 2 |
| 15 | 21.90% | 1.00% | 2 | 0.86% | 0.11% | 2 | 0.19% | 0.03% | 2 | 56.2 | 2.55 | 2 |
| 7.5 | 10.56% | 0.50% | 2 | 0.90% | 0.02% | 2 | 0.17% | 0.01% | 2 | 52.8 | 0.85 | 2 |
| 3.75 | 5.17% | 0.57% | 2 | 1.04% | 0.04% | 2 | 0.06% | 0.01% | 2 | 50.7 | 1.70 | 2 |
| 1.88 | 2.39% | 0.07% | 2 | 0.86% | 0.01% | 2 | 0.04% | 0.00% | 2 | 49.15 | 1.77 | 2 |
| 0.94 | 1.01% | 0.06% | 2 | 0.76% | 0.10% | 2 | 0.02% | 0.01% | 2 | 46.35 | 0.92 | 2 |
| 0 | 0.10% | 0.01% | 2 | 0.90% | 0.06% | 2 | 0.02% | 0.01% | 2 | 50.6 | 2.55 | 2 |
| G029123 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 97.68% | 0.04% | 2 | 0.47% | 0.66% | 2 | 0.46% | 0.01% | 2 | 95.45 | 0.07 | 2 |
| 30 | 53.86% | 0.40% | 2 | 0.19% | 0.27% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 72.5 | 1.70 | 2 |
| 15 | 31.51% | 2.00% | 2 | 0.23% | 0.33% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 62.8 | 3.25 | 2 |
| 7.5 | 16.83% | 2.14% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 56.25 | 0.35 | 2 |
| 3.75 | 7.72% | 2.36% | 2 | 0.56% | 0.21% | 2 | 0.18% | 0.25% | 2 | 52.35 | 0.07 | 2 |
| 1.88 | 3.37% | 0.94% | 2 | 0.34% | 0.48% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 48.4 | 0.14 | 2 |
| 0.94 | 0.39% | 0.05% | 2 | 0.18% | 0.25% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 48.9 | 0.85 | 2 |
| 0 | 0.00% | 0.00% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 0.00% | 0.00% | 2 | 47.3 | 3.25 | 2 |
| G029128 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 94.41% | 0.63% | 2 | 0.50% | 0.08% | 2 | 2.61% | 0.21% | 2 | 86.6 | 1.98 | 2 |
| 30 | 61.36% | 0.04% | 2 | 0.47% | 0.07% | 2 | 1.57% | 0.13% | 2 | 67.6 | 1.98 | 2 |
| 15 | 41.10% | 1.11% | 2 | 0.26% | 0.01% | 2 | 1.11% | 0.11% | 2 | 64.3 | 3.39 | 2 |
| 7.5 | 24.54% | 0.03% | 2 | 0.23% | 0.06% | 2 | 1.05% | 0.08% | 2 | 56.4 | 1.70 | 2 |
| 3.75 | 11.39% | 0.16% | 2 | 0.17% | 0.04% | 2 | 0.72% | 0.03% | 2 | 52.85 | 0.49 | 2 |
| 1.88 | 4.88% | 0.50% | 2 | 0.17% | 0.02% | 2 | 0.67% | 0.08% | 2 | 50.1 | 0.99 | 2 |
| 0.94 | 1.90% | 0.02% | 2 | 0.15% | 0.00% | 2 | 0.63% | 0.06% | 2 | 49.85 | 0.21 | 2 |
| 0 | 0.20% | 0.01% | 2 | 0.16% | 0.07% | 2 | 0.60% | 0.06% | 2 | 46.45 | 1.20 | 2 |
| G029131 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 94.92% | 0.02% | 2 | 1.48% | 0.09% | 2 | 1.86% | 0.22% | 2 | 95.3 | 0.99 | 2 |
| 30 | 79.21% | 2.08% | 2 | 1.49% | 0.07% | 2 | 1.24% | 0.02% | 2 | 86.75 | 4.74 | 2 |
| 15 | 64.70% | 2.53% | 2 | 1.03% | 0.15% | 2 | 0.65% | 0.32% | 2 | 79.85 | 0.21 | 2 |
| 7.5 | 41.12% | 2.09% | 2 | 1.32% | 0.35% | 2 | 0.38% | 0.02% | 2 | 70.3 | 0.57 | 2 |
| 3.75 | 23.58% | 0.18% | 2 | 1.20% | 0.06% | 2 | 0.27% | 0.05% | 2 | 60.1 | 1.70 | 2 |
| 1.88 | 11.88% | 0.04% | 2 | 1.20% | 0.14% | 2 | 0.23% | 0.09% | 2 | 55.15 | 1.06 | 2 |
| 0.94 | 4.51% | 0.14% | 2 | 1.05% | 0.11% | 2 | 0.15% | 0.01% | 2 | 50.2 | 1.56 | 2 |
| 0 | 0.26% | 0.04% | 2 | 1.07% | 0.15% | 2 | 0.10% | 0.02% | 2 | 44.95 | 0.49 | 2 |
| G029171 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 81.24% | 3.07% | 2 | 1.68% | 0.07% | 2 | 0.80% | 0.15% | 2 | 94.4 | 1.98 | 2 |
| 30 | 26.12% | 2.63% | 2 | 1.70% | 0.16% | 2 | 0.21% | 0.08% | 2 | 63.25 | 3.46 | 2 |
| 15 | 15.27% | 1.25% | 2 | 1.81% | 0.12% | 2 | 0.29% | 0.07% | 2 | 56.95 | 0.35 | 2 |
| 7.5 | 8.44% | 0.58% | 2 | 1.43% | 0.01% | 2 | 0.21% | 0.08% | 2 | 53.6 | 0.28 | 2 |
| 3.75 | 4.16% | 0.26% | 2 | 1.78% | 0.11% | 2 | 0.17% | 0.05% | 2 | 53.9 | 2.12 | 2 |
| 1.88 | 2.45% | 0.10% | 2 | 1.67% | 0.03% | 2 | 0.20% | 0.00% | 2 | 51 | 4.10 | 2 |
| 0.94 | 1.49% | 0.23% | 2 | 2.86% | 2.01% | 2 | 0.78% | 0.82% | 2 | 50.75 | 2.76 | 2 |
| 0 | 0.16% | 0.02% | 2 | 1.51% | 0.14% | 2 | 0.18% | 0.01% | 2 | 47.15 | 1.06 | 2 |
| G029172 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 92.73% | 0.76% | 2 | 1.29% | 0.12% | 2 | 2.73% | 0.33% | 2 | 97.2 | 0.28 | 2 |
| 30 | 50.99% | 1.65% | 2 | 0.94% | 0.22% | 2 | 6.70% | 0.11% | 2 | 75.45 | 2.19 | 2 |
| 15 | 28.49% | 1.14% | 2 | 0.96% | 0.02% | 2 | 8.41% | 0.22% | 2 | 64.8 | 2.83 | 2 |
| 7.5 | 15.76% | 0.07% | 2 | 0.69% | 0.07% | 2 | 7.58% | 0.46% | 2 | 59.55 | 0.35 | 2 |
| 3.75 | 7.75% | 0.38% | 2 | 0.77% | 0.21% | 2 | 7.21% | 0.59% | 2 | 55.95 | 0.78 | 2 |
| 1.88 | 3.11% | 0.18% | 2 | 0.75% | 0.04% | 2 | 8.28% | 0.66% | 2 | 50.45 | 5.44 | 2 |
| 0.94 | 0.88% | 0.05% | 2 | 1.26% | 0.75% | 2 | 24.29% | 23.82% | 2 | 49.45 | 3.61 | 2 |
| 0 | 0.08% | 0.02% | 2 | 0.60% | 0.19% | 2 | 7.52% | 0.26% | 2 | 46.2 | 0.99 | 2 |
| G026584 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 95.17% | 0.99% | 2 | 1.26% | 0.25% | 2 | 2.17% | 0.03% | 2 | 99.05 | 0.07 | 2 |
| 30 | 84.51% | 1.04% | 2 | 1.59% | 0.03% | 2 | 1.86% | 0.12% | 2 | 93.45 | 0.07 | 2 |
| 15 | 70.25% | 0.04% | 2 | 1.26% | 0.05% | 2 | 1.92% | 0.01% | 2 | 86.35 | 2.47 | 2 |
| 7.5 | 49.19% | 2.18% | 2 | 1.19% | 0.32% | 2 | 1.29% | 0.07% | 2 | 76.45 | 2.05 | 2 |
| 3.75 | 27.90% | 2.71% | 2 | 0.84% | 0.15% | 2 | 0.92% | 0.24% | 2 | 66.15 | 0.92 | 2 |
| 1.88 | 10.85% | 0.07% | 2 | 1.01% | 0.14% | 2 | 0.93% | 0.19% | 2 | 52.75 | 7.00 | 2 |
| 0.94 | 3.17% | 0.16% | 2 | 1.11% | 0.06% | 2 | 1.21% | 0.03% | 2 | 49.4 | 1.56 | 2 |
| 0 | 0.08% | 0.03% | 2 | 1.01% | 0.26% | 2 | 1.35% | 0.53% | 2 | 43 | 2.83 | 2 |
| G026585 | ||||||||||||
| C＞T | C＞A/G | 插入/ 缺失 | CD8+ 之HLA II-DP 、DQ 、DR-% | |||||||||
| sgRNA (pmol) | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N | Ave | SD | N |
| 60 | 86.56% | 0.77% | 2 | 1.17% | 0.01% | 2 | 9.62% | 0.42% | 2 | 96.35 | 1.06 | 2 |
| 30 | 49.55% | 0.28% | 2 | 1.23% | 0.02% | 2 | 5.08% | 0.37% | 2 | 74.3 | 3.25 | 2 |
| 15 | 29.91% | 0.35% | 2 | 1.13% | 0.27% | 2 | 3.10% | 0.05% | 2 | 65.15 | 3.61 | 2 |
| 7.5 | 16.67% | 0.14% | 2 | 1.08% | 0.03% | 2 | 1.72% | 0.11% | 2 | 57.2 | 1.13 | 2 |
| 3.75 | 8.49% | 0.35% | 2 | 1.01% | 0.09% | 2 | 1.10% | 0.05% | 2 | 51.85 | 6.43 | 2 |
| 1.88 | 3.16% | 0.60% | 2 | 1.07% | 0.09% | 2 | 0.64% | 0.19% | 2 | 51.15 | 4.31 | 2 |
| 0.94 | 1.04% | 0.15% | 2 | 0.95% | 0.02% | 2 | 0.52% | 0.11% | 2 | 45.95 | 2.19 | 2 |
| 0 | 0.05% | 0.05% | 2 | 0.95% | 0.11% | 2 | 0.40% | 0.05% | 2 | 47.9 | 2.69 | 2 |
在藉由mRNA遞送進行AAVS1編輯後，藉由經由NGS評估編輯，針對在T細胞中之編輯功效篩選靶向AAVS1之指導RNA。
T細胞製備及用RNA電穿孔進行編輯
如實例1中所述，在T細胞生長培養基中使用2.5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)製備單供體(編號613)之T細胞。如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用靶向AAVS1基因之sgRNA對T細胞進行電穿孔，但有以下例外。
本研究使用編碼Nme2 Cas9之mRNA (SEQ ID No: 825)代替分別編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子及UGI之mRNA。用最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中之1 x 10^5個T細胞、30 ng/µL Nme2Cas9 mRNA及40 pmol sgRNA製備Nme2 Cas9電穿孔混合物。在電穿孔後第7天，如實例1中所述，對DNA樣品進行PCR及後續NGS分析。
表 17顯示Nme2Cas9指導在AAVS1基因處之平均插入/缺失百分比。圖10A-圖10B顯示AAVS1基因處表示為插入/缺失頻率之編輯。
表 17-作為總NGS讀段之百分比的AAVS1基因座處之平均插入/缺失百分比
實例 11 ：具有 Nme2Cas9 之 AAVS1 指導之劑量反應
| 指導ID | 平均值 | SD | 指導ID | 平均值 | SD | N |
| G025808 | 0.6 | 0 | G025894 | 95.9 | 4.1 | 2 |
| G025809 | 0.25 | 0.05 | G025895 | 0.15 | 0.05 | 2 |
| G025810 | 2.3 | 0.3 | G025896 | 20.1 | 10.3 | 2 |
| G025811 | 4.25 | 0.45 | G025897 | 99.75 | 0.05 | 2 |
| G025812 | 0.2 | 0 | G025898 | 99.55 | 0.05 | 2 |
| G025813 | 0.3 | 0.1 | G025899 | 39.5 | 9.4 | 2 |
| G025814 | 0.45 | 0.05 | G025900 | 54.1 | 41.9 | 2 |
| G025815 | 0.3 | 0 | G025901 | 16.3 | 13.4 | 2 |
| G025816 | 0 | 0 | G02502 | 52.75 | 1.55 | 2 |
| G025817 | 0.9 | 0.1 | G025903 | 2.7 | 0.2 | 2 |
| G025818 | 65.55 | 2.25 | G025904 | 2.7 | 1.1 | 2 |
| G025819 | 0.35 | 0.05 | G025905 | 0.5 | 0 | 2 |
| G025820 | 1.1 | 0 | G025906 | 0.4 | 0 | 2 |
| G025821 | 3.8 | 0.3 | G025907 | 0.1 | 0 | 2 |
| G025822 | 41.7 | 3.8 | G025908 | 16.9 | 3.1 | 2 |
| G025823 | 0.35 | 0.05 | G025909 | 2.95 | 0.35 | 2 |
| G025824 | 11.25 | 3.95 | G025910 | 1.45 | 0.15 | 2 |
| G025825 | 3.95 | 1.55 | G025911 | 12.3 | 0.5 | 2 |
| G025826 | 1.25 | 0.65 | G025912 | 2.75 | 0.35 | 2 |
| G025827 | 89.3 | 2.6 | G025913 | 1.85 | 0.15 | 2 |
| G025828 | 32.05 | 2.95 | G025914 | 3.7 | 0.4 | 2 |
| G025829 | 98.1 | 1 | G025915 | 24.75 | 2.25 | 2 |
| G025830 | 48.45 | 5.65 | G025916 | 1.4 | 0.2 | 2 |
| G025831 | 39 | 3.9 | G025917 | 3.25 | 0.65 | 2 |
| G025832 | 52.9 | 5.1 | G025918 | 6.15 | 0.85 | 2 |
| G025833 | 82.15 | 3.55 | G025919 | 4.7 | 0.4 | 2 |
| G025834 | 89.75 | 0.75 | G025920 | 0.25 | 0.05 | 2 |
| G025835 | 92 | 0.8 | G025921 | 1.15 | 0.35 | 2 |
| G025836 | 98.55 | 0.05 | G025922 | 0.75 | 0.25 | 2 |
| G025837 | 37.35 | 0.15 | G025923 | 10.9 | 1.1 | 2 |
| G025838 | 1.7 | 0.7 | G025924 | 1.05 | 0.05 | 2 |
| G025839 | 99.2 | 0.3 | G025925 | 0.2 | 0 | 2 |
| G025840 | 68.55 | 11.45 | G025926 | 2.5 | 0.2 | 2 |
| G025841 | 97.45 | 0.45 | G025927 | 0.2 | 0 | 2 |
| G025842 | 3.45 | 0.05 | G025928 | 0.2 | 0 | 2 |
| G025843 | 43 | 2.7 | G025929 | 39.1 | 5 | 2 |
| G025844 | 0.1 | 0 | G025930 | 0.8 | 0.1 | 2 |
| G025845 | 13.5 | 0.6 | G025931 | 1.1 | 0.2 | 2 |
| G025846 | 0.9 | 0.1 | G025932 | 9.7 | 1.2 | 2 |
| G025847 | 0.55 | 0.15 | G025933 | 29.6 | 3.3 | 2 |
| G025848 | 3.9 | 0.3 | G025934 | 0.5 | 0 | 2 |
| G025849 | 38.4 | 0.3 | G025935 | 4.15 | 0.75 | 2 |
| G025850 | 6.7 | 0.2 | G025936 | 85.1 | 1.2 | 2 |
| G025851 | 1 | 0 | G025937 | 15.5 | 0.6 | 2 |
| G025852 | 0.15 | 0.05 | G025938 | 1.25 | 0.35 | 2 |
| G025853 | 0.25 | 0.05 | G025939 | 2.75 | 0.55 | 2 |
| G025854 | 15.85 | 0.05 | G025940 | 98.3 | 0.6 | 2 |
| G025855 | 27.4 | 2.3 | G025941 | 0.1 | 0 | 2 |
| G025856 | 0.95 | 0.05 | G025942 | 0.25 | 0.05 | 2 |
| G025857 | 4.9 | 0.2 | G025943 | 0.25 | 0.05 | 2 |
| G025858 | 0.3 | 0 | G025944 | 0.15 | 0.05 | 2 |
| G025859 | 1.55 | 0.15 | G025945 | 2.2 | 0.3 | 2 |
| G025860 | 0.2 | 0 | G025946 | 1.6 | 0.2 | 2 |
| G025861 | 0.25 | 0.05 | G025947 | 0.2 | 0 | 2 |
| G025862 | 0.15 | 0.05 | G025948 | 1.1 | 0.1 | 2 |
| G025863 | 88.6 | 1.4 | G025949 | 3.45 | 0.55 | 2 |
| G025864 | 10.55 | 0.55 | G025950 | 0.2 | 0 | 2 |
| G025865 | 2.7 | 0.1 | G025951 | 0.35 | 0.05 | 2 |
| G025866 | 98.35 | 0.05 | G025952 | 82.2 | 1.9 | 2 |
| G025867 | 98.75 | 0.05 | G025953 | 9.25 | 0.65 | 2 |
| G025868 | 89.85 | 0.05 | G025954 | 19.2 | 3.3 | 2 |
| G025869 | 3.1 | 0.1 | G025955 | 7.5 | 1.1 | 2 |
| G025870 | 15.45 | 2.15 | G025956 | 0.55 | 0.05 | 2 |
| G025871 | 0.3 | 0 | G025957 | 1 | 0.1 | 2 |
| G025872 | 4.15 | 0.05 | G025958 | 0.5 | 0 | 2 |
| G025873 | 9.1 | 0.4 | G025959 | 3.05 | 0.45 | 2 |
| G025874 | 7.15 | 1.15 | G025960 | 0.4 | 0.1 | 2 |
| G025875 | 20.6 | 1.1 | G025961 | 0.95 | 0.05 | 2 |
| G025876 | 25.95 | 4.65 | G025962 | 0.4 | 0.1 | 2 |
| G025877 | 2.2 | 0.2 | G025963 | 0.1 | 0 | 2 |
| G025878 | 0.55 | 0.05 | G025964 | 0.15 | 0.05 | 2 |
| G025879 | 8.25 | 0.25 | G025965 | 0.35 | 0.05 | 2 |
| G025880 | 96.45 | 0.85 | G025966 | 54.5 | 5.4 | 2 |
| G025881 | 1.2 | 0 | G025967 | 32.95 | 2.55 | 2 |
| G025882 | 0.2 | 0 | G025968 | 1.05 | 0.05 | 2 |
| G025883 | 0.6 | 0 | G025969 | 43.9 | 4 | 2 |
| G025884 | 0.3 | 0 | G025970 | 0.9 | 0.3 | 2 |
| G025885 | 1.35 | 0.05 | G025971 | 14 | 2 | 2 |
| G025886 | 0.1 | 0 | G025972 | 1.55 | 0.05 | 2 |
| G025887 | 0.25 | 0.05 | G025973 | 0.95 | 0.05 | 2 |
| G025888 | 0.45 | 0.45 | G025974 | 0.45 | 0.05 | 2 |
| G025889 | 0.3 | 0.1 | G025975 | 0.25 | 0.05 | 2 |
| G025890 | 0.25 | 0.05 | G025976 | 0.65 | 0.05 | 2 |
| G025891 | 48.8 | 3.1 | G025977 | 0.4 | 0 | 2 |
| G025892 | 25.25 | 5.05 | G025978 | 1 | 0.3 | 2 |
| G025893 | 7.3 | 1.1 | G025979 | 15.95 | 1.05 | 2 |
| G025894 | 41.85 | 19.35 | G025980 | 0.1 | 0 | 2 |
| G025895 | 0.35 | 0.05 |
在藉由mRNA遞送進行AAVS1編輯後，藉由經由NGS評估編輯，針對在T細胞中以劑量反應計之編輯功效篩選稀釋系列之AAVS1指導RNA。藉由使用mRNA電穿孔在T細胞中用固定濃度的編碼Nme2 Cas9之mRNA (SEQ ID NO: 825)滴定每一sgRNA，為每一sgRNA生成四點劑量反應曲線。
如實例1中所述，在T細胞生長培養基(TCGM)中使用2.5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)製備且活化單供體(編號613)之T細胞。如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用連續稀釋之靶向AAVS1基因之sgRNA對T細胞進行電穿孔，但有以下例外。本研究使用編碼Nme2 Cas9之mRNA代替分別編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子及UGI之mRNA。用最終體積為20 µL之P3電穿孔緩衝液中之1 x 10^5個T細胞、30 ng/µL Nme2Cas9 mRNA以及40、13.3、4.4及1.5 pmol sgRNA製備Cas9電穿孔混合物。在編輯後第3天，收穫T細胞且如實例1中所述進行PCR及NGS定序。
表 18及
圖 11A- 圖 11B顯示在各種AASV1 sgRNA濃度下之m平均插入/缺失頻率。
表 18 - AAVS1 處之平均插入 / 缺失頻率
實例 12. 具有 Nme2Cas9 或 SpyCas9 之插入指導 RNA 之篩選
| G025836 | G025835 | G025829 | G025834 | |||||||||
| sgRNA (uM) | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N |
| 2.00 | 1.00 | 0.00 | 2 | 0.91 | 0.01 | 2 | 1.00 | 0.00 | 2 | 0.88 | 0.03 | 2 |
| 0.67 | 0.93 | 0.02 | 2 | 0.49 | 0.07 | 2 | 0.87 | 0.03 | 2 | 0.44 | 0.03 | 2 |
| 0.22 | 0.67 | 0.16 | 2 | 0.18 | 0.00 | 2 | 0.25 | 0.02 | 2 | 0.07 | 0.02 | 2 |
| 0.07 | 0.44 | 0.24 | 2 | 0.06 | 0.03 | 2 | 0.12 | 0.04 | 2 | 0.02 | 0.01 | 2 |
| G025827 | G025880 | G025866 | G025868 | |||||||||
| sgRNA (uM) | 平均編輯% | SD | N | 平均編輯% | SD | N | 平均編輯% | SD | N | 平均編輯% | SD | N |
| 2.00 | 0.99 | 0.00 | 2 | 0.97 | 0.00 | 2 | 0.97 | 0.00 | 2 | 0.97 | 0.00 | 2 |
| 0.67 | 0.90 | 0.03 | 2 | 0.93 | 0.04 | 2 | 0.97 | 0.00 | 2 | 0.78 | 0.09 | 2 |
| 0.22 | 0.14 | 0.00 | 2 | 0.16 | 0.05 | 2 | 0.85 | 0.05 | 2 | 0.10 | 0.02 | 2 |
| 0.07 | 0.03 | 0.00 | 2 | 0.03 | 0.01 | 2 | 0.39 | 0.06 | 2 | 0.02 | 0.01 | 2 |
| G025867 | G025863 | G025818 | G025843 | |||||||||
| sgRNA (uM) | 平均編輯% | SD | N | 平均編輯% | SD | N | 平均編輯% | SD | N | 平均編輯% | SD | N |
| 2.00 | 0.97 | 0.01 | 2 | 0.97 | 0.00 | 2 | 0.97 | 0.00 | 2 | 0.95 | 0.00 | 2 |
| 0.67 | 0.97 | 0.01 | 2 | 0.92 | 0.02 | 2 | 0.75 | 0.08 | 2 | 0.52 | 0.08 | 2 |
| 0.22 | 0.73 | 0.08 | 2 | 0.19 | 0.04 | 2 | 0.05 | 0.01 | 2 | 0.05 | 0.02 | 2 |
| 0.07 | 0.26 | 0.05 | 2 | 0.04 | 0.01 | 2 | 0.01 | 0.00 | 2 | 0.01 | 0.00 | 2 |
針對AAV插入重新設計靶向CIITA之所選sgRNA (G023477)，且評價在T細胞中之插入功效。使用Nme2Cas9及編碼插入模板之AAV對細胞進行編輯，該插入模板包括兩側為指導切割位點之同源臂之GFP報告基因。藉由經由流式細胞術量測發光及HLA-DP、DQ、DR表現之缺失來評估插入效率，且藉由NGS評估AAVS1處之編輯。
12.1 T 細胞之 mRNA 電穿孔及 AAV 轉導
如實例1中所述製備且活化來自單一供體(編號613)之T細胞。除以下差異之外，如實例1中所述，使用mRNA電穿孔，用靶向CIITA基因之sgRNA對T細胞進行電穿孔。本研究使用編碼Nme2 Cas9之mRNA (SEQ ID No: 825)代替分別編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子及UGI之mRNA。使用編碼SpCas9 (SEQ ID No: 816)之mRNA來編輯靶向CIITA之指導G028533。用P3緩衝液(Lonza)中之1 x 10^
5個T細胞、600 ng編碼Cas9之mRNA及20皮莫耳sgRNA製備Nme2 Cas9電穿孔混合物。在電穿孔後15分鐘，用AAV轉導T細胞。簡言之，將編碼綠色螢光蛋白的兩側為包圍指導切割位點之同源臂之AAV添加至新平底96孔板中之80 ul CTS Optimizer T細胞生長培養基中補充有，最終感染複數(MOI)為300,000。將電穿孔之T細胞添加至所得板中且於37℃下培育。在電穿孔及轉導後24小時，將細胞以1:2分離至2個U形底板中，其中補加有補充細胞介素之CTS Optimizer培養基。
12.2 流式細胞術及 NGS 定序
在電穿孔後第7天，如實例1中所述，對經編輯之T細胞樣品進行PCR及NGS分析。
在電穿孔後10天，藉由流式細胞術對經編輯之T細胞進行表型分型以確定HLA II-DR、DP、DQ蛋白表現。簡言之，將T細胞與於細胞染色緩衝液(BioLegend，目錄編號420201)中以1:100稀釋的針對CD3之抗體(BioLegend，目錄編號317338)、針對CD4之抗體(BioLegend，目錄編號317434)、針對CD8之抗體(BioLegend，目錄編號301046)、針對Viakrome之抗體(Beckman Coulter，目錄編號C36628)及以1:50稀釋的針對HLA II-DR、DP、DQ之抗體(BioLegend，目錄編號361711)之混合物於4℃下培育30 min。隨後將細胞洗滌且再懸浮於100 µL細胞染色緩衝液中。接著將細胞在Cytoflex流式細胞儀(Beckman Coulter)上處理且使用FlowJo™軟體包進行分析。將T細胞基於大小、形狀、活力以及CD8、HLA II-DR、DP、DQ及GFP表現進行閘控。表19顯示HLA II-DR、DP、DQ陰性細胞、具有GFP之HLA II-DR、DP、DQ陰性細胞佔T細胞之百分比，以及平均插入/缺失頻率百分比。
表 19- HLA II-DP、DR、DQ陰性細胞及HLA-DP、DQ、DR陰性GFP陽性細胞之平均百分比；作為總NGS讀段之百分比的CIITA基因座之平均插入/缺失頻率百分比
實例 13. 具有 Nme2Cas9 之額外 TRAC 指導 RNA 之劑量依賴性
| 指導 | 插入/ 缺失頻率% | MHC II 類陰性% | MHC II 類陰性GFP+% | ||||||
| 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | |
| 未經處理 | 0 | n/a | 1 | 46.5 | n/a | 1 | 0 | 0 | 2 |
| 僅AAV | 0 | n/a | 1 | 47.20 | 0.24 | 2 | 5.05 | 0.50 | 3 |
| G026584 | 0.86 | 0.02 | 3 | 87.10 | 0.82 | 2 | 59.47 | 2.30 | 3 |
| G026588 | 0.98 | 0.002 | 3 | 75.40 | 0.82 | 2 | 14.57 | 14.57 | 3 |
針對在T細胞中之編輯功效篩選靶向TRAC之指導RNA。藉由NGS對每一濃度之sgRNA評估TRAC編輯。如實例1中所述，在T細胞生長培養基(TCGM)中使用2.5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)製備且活化來自單供體之T細胞。如實例1中所述，用靶向TRAC基因座之sgRNA以表20中所列之濃度對T細胞進行電穿孔，但有以下例外。本研究使用30 ng/µL編碼Nme2 Cas9之mRNA代替編碼Nme2 BC22n鹼基編輯子及UGI之mRNA。
在電穿孔後第3天，如實例1中所述，收穫T細胞且進行PCR及後續NGS分析。
表 20及
圖 12顯示在各種TRAC sgRNA濃度下之平均編輯頻率。
表 20-TRAC基因座處之平均編輯頻率
實例 14. 具有 Nme2Cas9 之所選 CIITA 指導 RNA 之劑量依賴性
| sgRNA (uM) | G021475 | G021476 | G021477 | G021478 | ||||||||
| 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | 平均值 | SD | N | |
| 2.00 | 0.95 | 0.01 | 2 | 0.48 | 0.06 | 2 | 0.90 | 0.01 | 2 | 0.66 | 0.08 | 2 |
| 0.40 | 0.59 | 0.05 | 2 | 0.08 | 0.01 | 2 | 0.48 | 0.04 | 2 | 0.10 | 0.03 | 2 |
| 0.08 | 0.13 | 0.03 | 2 | 0.01 | 0.00 | 2 | 0.09 | 0.02 | 2 | 0.02 | 0.01 | 2 |
| 0.02 | 0.02 | 0.00 | 2 | 0.00 | 0.00 | 2 | 0.01 | 0.01 | 2 | 0.01 | 0.00 | 2 |
針對在T細胞中以劑量反應計之編輯功效篩選靶向CIITA之指導RNA。藉由NGS對每一濃度之sgRNA評估CIITA編輯。藉由使用電穿孔在T細胞中用固定濃度的編碼Nme2 Cas9之mRNA滴定每一sgRNA，為每一sgRNA生成五點稀釋系列。
如實例1中所述，自單一供體製備T細胞。如實例1中所述，用編碼Nme2 Cas9之mRNA及靶向CIITA之sgRNA以表21中所列濃度對T細胞進行電穿孔。在編輯後第3天，如實例1中所述收集T細胞樣品並進行PCR及NGS分析。
表 21及
圖 13顯示NGS編輯結果。
表 21. CIITA基因座處之平均編輯頻率.
實例 15. 未經活化之 T 細胞中之劑量反應性分析
| 指導 | sgRNA (uM) | 平均值 | SD | N |
| G023443 | 2 | 0.17 | 0.01 | 4 |
| 0.4 | 0.01 | 0.00 | 4 | |
| 0.08 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.016 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.003 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| G023444 | 2 | 0.19 | 0.01 | 4 |
| 0.4 | 0.02 | 0.01 | 4 | |
| 0.08 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.016 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.003 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| G023477 | 2 | 0.67 | 0.07 | 4 |
| 0.4 | 0.16 | 0.06 | 4 | |
| 0.08 | 0.03 | 0.00 | 4 | |
| 0.016 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.003 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| G023478 | 2 | 0.26 | 0.05 | 4 |
| 0.4 | 0.03 | 0.01 | 4 | |
| 0.08 | 0.01 | 0.00 | 4 | |
| 0.016 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.003 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| G023492 | 2 | 0.23 | 0.05 | 4 |
| 0.4 | 0.02 | 0.01 | 4 | |
| 0.08 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.016 | 0.00 | 0.00 | 4 | |
| 0.003 | 0.00 | 0.00 | 4 |
在脂質奈米粒子(LNP)遞送後，藉由經由NGS或藉由流式細胞術評估編輯頻率，針對在未經活化之T細胞中之編輯功效篩選指導RNA。
15.1 T 細胞製備
在第0天將來自3位供體的經分離、冷凍保存之T細胞在水浴中解凍，且以1 x 10^6個細胞/mL之密度平鋪於含有以下之TCAM培養基中：CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充劑(ThermoFisher目錄A1048501)、1X青黴素-鏈黴素、1X Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄200-02)、5 ng/mL重組人類介白素7 (Peprotech，目錄200-07)、5 ng/mL重組人類介白素15 (Peprotech，目錄200-15)、2.5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)。
1 5.2 T 細胞工程改造
通常如實例1中所述製備LNP。用35脂質A: 47.5膽固醇: 15 DSPC: 2.5 PEG2k-DMG之莫耳比製備本實例中之脂質奈米粒子。用莫耳比為約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)製備LNP。用單一RNA種類調配LNP。將LNP遞送至含有ApoE3 (Peprotech，目錄350-02)之TCAM培養基中之T細胞。
在第1天(解凍後約24小時)，將T細胞離心，再懸浮，且以100,000個細胞/孔平鋪於具有2.5%人類AB血清之50 µL/孔TCGM中。將LNP以1 µg/mL Nme2鹼基編輯子mRNA之總RNA貨物及0.5 µg/mL UGI mRNA之總RNA貨物連同10 µg/mL ApoE3一起應用。將用CIITA G026584調配之LNP及用HLA-A G028918調配之LNP混合且以1.7 µg/mL CIITA G026584及0.7 µg/mL HLA-A G028918之高劑量開始應用於八點2倍連續稀釋系列。未將LNP施加於「未處理」樣品。
在第3天或第4天，用1:100稀釋之Trans Act (Miltenyi Biotec)洗滌並活化細胞。將細胞於37℃下培育，且定期進行細胞分裂並添加新鮮培養基。在第9天，收穫細胞用於藉由流式細胞術分析及NGS分析。對於流式細胞術分析，將細胞在FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA)中洗滌。將細胞在靶向CD4 (Biolegend 317434)之抗體、靶向CD8之抗體(Biolegend 301046)、靶向CD3之抗體(Biolegend 317336)、靶向HLA-A2之抗體(Biolegend 343320)、靶向HLA-A3之抗體(eBioscience, 11-5754-42)、靶向HLA-DR、DP、DQ之抗體(Biolegend 361712)及靶向ViaKrome 808可固定活性染料之抗體(Beckman Coulter, C36628)之混合劑(cocktail)中培育。隨後洗滌T細胞且於Cytoflex儀器(Beckman Coulter)進行分析。使用FlowJo軟體包(v.10.6.1)實施資料分析。將T細胞基於大小、活力、CD4或CD8表現以及
表 22中所示標記物之表現進行閘控。接受約48小時LNP暴露之代表性供體之流式細胞術資料示於
表 22及
圖 14中。類似結果見於所有三個供體以及48小時及72小時LNP暴露期。
表 22. 代表性供體之HLA-A2表面表現為陰性之平均細胞百分比。
| G028918 (µg/mL) | 經處理 | 未經處理 | ||||
| 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | |
| 0.700 | 91.9 | 0.6 | 3 | 1.8 | 0.0 | 1 |
| 0.350 | 92.3 | 0.7 | 3 | 2.8 | 0.0 | 1 |
| 0.175 | 90.5 | 0.4 | 3 | 1.4 | 0.0 | 1 |
| 0.088 | 85.3 | 0.6 | 3 | 2.6 | 0.0 | 1 |
| 0.044 | 75.1 | 1.0 | 3 | 1.6 | 0.0 | 1 |
| 0.022 | 61.1 | 2.9 | 3 | 1.9 | 0.0 | 1 |
| 0.011 | 44.7 | 1.6 | 3 | 2.5 | 0.0 | 1 |
| 0.005 | 33.3 | 2.4 | 3 | 3.8 | 0.0 | 1 |
在48小時LNP暴露之情況下使用0.85 µg/mL G026584及0.35 µg/mL G028918對樣品實施NGS分析。NGS結果示於
表 23及
圖 15中。
表 23.CIITA基因座處之平均編輯百分比.
實例 16. 使用 LNP 之所選指導 RNA 之劑量反應分析
| 樣品 | C 至T | C 至A/G | 插入/ 缺失 | ||||||
| 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | |
| 供體1 | 50.9 | 2.2 | 3 | 8.6 | 1.5 | 3 | 7.5 | 0.5 | 3 |
| 供體2 | 64.5 | 1.2 | 3 | 7.9 | 0.6 | 3 | 5.8 | 0.9 | 3 |
| 供體3 | 52.6 | 0.3 | 2 | 8.4 | 0.8 | 2 | 6.8 | 0.2 | 2 |
| 未經處理 | 0.3 | 0.0 | 2 | 1.3 | 0.1 | 2 | 0.2 | 0.0 | 2 |
在脂質奈米粒子(LNP)遞送後，藉由經由NGS及藉由流式細胞術評估編輯頻率，針對在T細胞中之編輯功效篩選所選HLA-A、TRAC、TRBC1及TRBC2以及指導CIITA RNA。
1 6.1 T 細胞製備及活化
在第0天將來自2位供體的經分離、冷凍保存之T細胞在水浴中解凍，且以1.5 x 10^6個細胞/mL之密度平鋪於含有以下之TCAM培養基中：CTS OpTmizer T細胞擴增SFM及T細胞擴增補充劑(Gibco目錄A3705001)、1X青黴素-鏈黴素、1X Glutamax、10 mM HEPES、200 U/mL重組人類介白素-2 (Peprotech，目錄200-02)、5 ng/mL重組人類介白素7 (Peprotech，目錄200-07)及5 ng/mL重組人類介白素15 (Peprotech，目錄200-15)及2.5%人類AB血清(GeminiBio，目錄100-512)。在第1天(解凍後24小時)，用TransAct™ (1:100稀釋，Miltenyi Biotec)洗滌並活化細胞。
1 6.2 LNP 調配物
通常如實例1.6中所述製備LNP。用35脂質A: 47.5膽固醇: 15 DSPC: 2.5 PEG2k-DMG之莫耳比製備本實例中之脂質奈米粒子。用莫耳比為約6之脂質胺與RNA磷酸酯(N:P)製備LNP。用Nme2BC22 mRNA、UGI mRNA或如表24及表25中所列sgRNA之單一RNA貨物調配LNP。將LNP遞送至含有ApoE3 (Peprotech，目錄350-02)之TCAM培養基中之T細胞。
1 6.3 T 細胞工程改造
在第3天，將T細胞離心，再懸浮，且以100,000個細胞/孔平鋪於具有2.5%人類AB血清之100 µL/孔TCAM中，向該血清中添加100 µL對應LNP調配物。將含有gRNA之LNP調配物以表24中所列之濃度連同1 μg/mL Nme2鹼基編輯子mRNA之總RNA貨物及0.5 μg/mL UGI mRNA之總RNA貨物一起添加至T細胞中。未將LNP施加於「未處理」樣品。
自第4天開始，將細胞分裂，且定期更新培養基。在第7天，收穫一部分細胞用於TRAC、TRBC1、TRBC2及CIITA基因座之定序分析。如實例1中所述實施NGS分析。
表 24及
圖 16A - 圖 16L顯示該等細胞之平均編輯百分比。對於每一指導，來自一位代表性供體之資料示於表24中。
表 24. 平均編輯百分比。「n.d.」指示無資料。
1 6.4 流式細胞術
| sgRNA 劑量(μg/mL) | C 至T | C 至A/G | 插入/ 缺失 | |||||||
| gRNA | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | 平均值 | SD | n | |
| G021469 (TRAC) | 0.0003 | 2.27 | 0.28 | 3 | 0.86 | 0.05 | 3 | 0.33 | 0.08 | 3 |
| 0.0012 | 7.70 | 0.24 | 3 | 0.88 | 0.02 | 3 | 0.24 | 0.05 | 3 | |
| 0.0049 | 25.76 | 1.03 | 3 | 0.87 | 0.03 | 3 | 0.30 | 0.07 | 3 | |
| 0.0195 | 62.68 | 1.69 | 3 | 0.92 | 0.02 | 3 | 0.27 | 0.07 | 3 | |
| 0.0781 | 91.88 | 0.16 | 3 | 1.12 | 0.03 | 3 | 0.52 | 0.08 | 3 | |
| 0.3125 | 96.90 | 0.59 | 3 | 1.12 | 0.07 | 3 | 0.69 | 0.15 | 3 | |
| 1.25 | 97.42 | 0.39 | 3 | 1.24 | 0.02 | 3 | 0.88 | 0.19 | 3 | |
| 5 | 97.01 | 0.40 | 3 | 1.71 | 0.10 | 3 | 0.92 | 0.08 | 3 | |
| G021481 (TRAC) | 0.00008 | 0.83 | 0.15 | 3 | 0.55 | 0.11 | 3 | 0.22 | 0.07 | 3 |
| 0.00031 | 2.57 | 0.49 | 3 | 0.68 | 0.10 | 3 | 0.14 | 0.06 | 3 | |
| 0.00122 | 8.56 | 0.76 | 3 | 0.51 | 0.10 | 3 | 0.19 | 0.08 | 3 | |
| 0.00488 | 29.59 | 1.22 | 3 | 0.56 | 0.09 | 3 | 0.38 | 0.17 | 3 | |
| 0.01953 | 67.99 | 0.88 | 3 | 0.89 | 0.25 | 3 | 0.42 | 0.06 | 3 | |
| 0.07813 | 92.54 | 1.51 | 3 | 0.66 | 0.06 | 3 | 0.58 | 0.18 | 3 | |
| 0.3125 | 97.06 | 0.30 | 3 | 0.71 | 0.02 | 3 | 0.99 | 0.03 | 3 | |
| 1.25 | 96.85 | 0.44 | 3 | 0.93 | 0.07 | 3 | 1.71 | 0.10 | 3 | |
| G028935 (TRAC) | 0.0003 | 10.56 | 0.30 | 3 | 0.83 | 0.06 | 3 | 0.12 | 0.01 | 3 |
| 0.0012 | 33.70 | 1.30 | 3 | 1.05 | 0.06 | 3 | 0.19 | 0.04 | 3 | |
| 0.0049 | 72.47 | 1.20 | 3 | 1.16 | 0.13 | 3 | 0.33 | 0.07 | 3 | |
| 0.0195 | 94.40 | 0.52 | 3 | 1.43 | 0.20 | 3 | 0.42 | 0.10 | 3 | |
| 0.0781 | 96.53 | 0.68 | 3 | 1.78 | 0.25 | 3 | 0.52 | 0.09 | 3 | |
| 0.3125 | 96.50 | 0.86 | 3 | 2.02 | 0.24 | 3 | 0.74 | 0.28 | 3 | |
| 1.25 | 96.32 | 0.28 | 3 | 2.27 | 0.08 | 3 | 1.02 | 0.05 | 3 | |
| 5 | 95.22 | 0.44 | 3 | 2.84 | 0.13 | 3 | 1.49 | 0.12 | 3 | |
| G028939 (TRAC) | 0.0003 | 2.63 | 0.49 | 2 | 1.37 | 0.41 | 2 | 0.20 | 0.02 | 2 |
| 0.0012 | 9.65 | 0.16 | 2 | 1.21 | 0.90 | 2 | 0.13 | 0.02 | 2 | |
| 0.0049 | 29.60 | 1.03 | 2 | 1.42 | 0.69 | 2 | 0.19 | 0.00 | 1 | |
| 0.0195 | 66.33 | 2.98 | 2 | 1.68 | 0.47 | 2 | 0.33 | 0.04 | 2 | |
| 0.0781 | 92.37 | 0.69 | 2 | 1.93 | 0.34 | 2 | 0.60 | 0.30 | 2 | |
| 0.3125 | 94.59 | 0.32 | 2 | 1.65 | 0.91 | 2 | 0.39 | 0.30 | 2 | |
| 1.25 | n.d. | |||||||||
| 5 | 94.89 | 4.17 | 2 | 1.87 | 0.03 | 2 | 0.21 | 0.08 | 2 | |
| G028943 (TRAC) | 0.0003 | 14.74 | 0.27 | 3 | 0.67 | 0.03 | 3 | 0.38 | 0.01 | 3 |
| 0.0012 | 44.84 | 0.69 | 3 | 0.73 | 0.03 | 3 | 0.50 | 0.04 | 3 | |
| 0.0049 | 83.57 | 0.21 | 3 | 0.67 | 0.06 | 3 | 0.61 | 0.10 | 3 | |
| 0.0195 | 97.05 | 0.26 | 3 | 0.72 | 0.12 | 3 | 0.79 | 0.11 | 3 | |
| 0.0781 | 97.65 | 0.48 | 3 | 0.79 | 0.21 | 3 | 0.93 | 0.21 | 3 | |
| 0.3125 | 97.32 | 0.24 | 3 | 0.97 | 0.13 | 3 | 1.26 | 0.22 | 3 | |
| 1.25 | 96.51 | 0.35 | 3 | 1.37 | 0.09 | 3 | 1.82 | 0.34 | 3 | |
| 5 | 95.41 | 0.32 | 3 | 1.92 | 0.24 | 3 | 2.26 | 0.17 | 3 | |
| G028986 (TRBC1) | 0.0003 | 2.31 | 0.41 | 3 | 1.60 | 0.54 | 3 | 0.14 | 0.01 | 3 |
| 0.0012 | 8.20 | 0.37 | 3 | 1.48 | 0.16 | 3 | 0.15 | 0.03 | 3 | |
| 0.0049 | 26.27 | 1.69 | 3 | 1.69 | 0.31 | 3 | 0.26 | 0.08 | 3 | |
| 0.0195 | 62.21 | 0.95 | 3 | 1.73 | 0.13 | 3 | 0.52 | 0.22 | 3 | |
| 0.0781 | 92.08 | 0.61 | 3 | 1.33 | 0.09 | 3 | 0.65 | 0.20 | 3 | |
| 0.3125 | 96.37 | 0.34 | 3 | 1.48 | 0.06 | 3 | 1.12 | 0.46 | 3 | |
| 1.25 | 97.18 | 0.23 | 3 | 1.52 | 0.21 | 3 | 0.98 | 0.11 | 3 | |
| 5 | 96.58 | 0.35 | 3 | 1.77 | 0.14 | 3 | 1.30 | 0.32 | 3 | |
| G029006 (TRBC2) | 0.0003 | 3.00 | 0.73 | 3 | 0.55 | 0.02 | 3 | 0.25 | 0.03 | 3 |
| 0.0012 | 9.04 | 0.86 | 3 | 0.57 | 0.07 | 3 | 0.34 | 0.03 | 3 | |
| 0.0049 | 28.73 | 0.77 | 3 | 0.59 | 0.06 | 3 | 0.89 | 0.03 | 3 | |
| 0.0195 | 67.16 | 0.57 | 3 | 0.77 | 0.14 | 3 | 2.01 | 0.25 | 3 | |
| 0.0781 | 91.90 | 0.42 | 3 | 0.84 | 0.02 | 3 | 3.50 | 0.36 | 3 | |
| 0.3125 | 93.22 | 0.44 | 3 | 0.95 | 0.08 | 3 | 5.04 | 0.49 | 3 | |
| 1.25 | 91.67 | 0.70 | 3 | 1.42 | 0.13 | 3 | 6.27 | 0.41 | 3 | |
| 5 | 91.91 | 0.59 | 3 | 1.73 | 0.16 | 3 | 5.85 | 0.54 | 3 | |
| 0.0003 | 1.38 | 0.35 | 3 | 0.61 | 0.01 | 3 | 0.09 | 0.00 | 3 | |
| G029007 (TRBC2) | 0.0012 | 3.96 | 0.46 | 3 | 0.69 | 0.05 | 3 | 0.11 | 0.01 | 3 |
| 0.0049 | 12.87 | 0.75 | 3 | 0.68 | 0.13 | 3 | 0.16 | 0.03 | 3 | |
| 0.0195 | 38.66 | 0.91 | 3 | 0.95 | 0.32 | 3 | 0.25 | 0.01 | 3 | |
| 0.0781 | 79.87 | 0.93 | 3 | 0.74 | 0.07 | 3 | 0.43 | 0.08 | 3 | |
| 0.3125 | 96.82 | 0.18 | 3 | 0.75 | 0.03 | 3 | 0.62 | 0.06 | 3 | |
| 1.25 | 97.63 | 0.22 | 3 | 1.01 | 0.26 | 3 | 0.73 | 0.09 | 3 | |
| 5 | 97.44 | 0.25 | 3 | 0.93 | 0.12 | 3 | 0.86 | 0.08 | 3 | |
| 0.0003 | 1.30 | 0.06 | 3 | 0.66 | 0.03 | 3 | 0.08 | 0.03 | 3 | |
| 0.0012 | 3.97 | 0.40 | 3 | 0.60 | 0.04 | 3 | 0.10 | 0.01 | 3 | |
| G026584 (CIITA) | 0.0049 | 13.87 | 0.18 | 3 | 0.61 | 0.07 | 3 | 0.10 | 0.04 | 3 |
| 0.0195 | 42.35 | 0.82 | 3 | 0.59 | 0.04 | 3 | 0.17 | 0.04 | 3 | |
| 0.0781 | 82.44 | 0.99 | 3 | 0.64 | 0.05 | 3 | 0.29 | 0.08 | 3 | |
| 0.3125 | 97.03 | 0.60 | 3 | 0.77 | 0.32 | 3 | 0.43 | 0.08 | 3 | |
| 1.25 | 98.01 | 0.10 | 3 | 0.87 | 0.12 | 3 | 0.66 | 0.08 | 3 | |
| 5 | 97.83 | 0.23 | 3 | 0.97 | 0.03 | 3 | 0.68 | 0.06 | 3 | |
| 0.0003 | 0.68 | 0.10 | 3 | 0.27 | 0.04 | 3 | 0.12 | 0.01 | 3 | |
| 0.0012 | 2.19 | 0.28 | 3 | 0.31 | 0.06 | 3 | 0.15 | 0.08 | 3 | |
| G029123 (CIITA) | 0.0049 | 7.60 | 0.52 | 3 | 0.31 | 0.05 | 3 | 0.17 | 0.02 | 3 |
| 0.0195 | 27.13 | 1.24 | 3 | 0.32 | 0.11 | 3 | 0.15 | 0.04 | 3 | |
| 0.0781 | 65.16 | 0.17 | 3 | 0.27 | 0.02 | 3 | 0.18 | 0.05 | 3 | |
| 0.3125 | 94.17 | 0.27 | 3 | 0.30 | 0.05 | 3 | 0.18 | 0.05 | 3 | |
| 1.25 | 98.54 | 0.52 | 3 | 0.41 | 0.13 | 3 | 0.25 | 0.01 | 3 | |
| 5 | 98.37 | 0.22 | 3 | 0.46 | 0.07 | 3 | 0.17 | 0.04 | 3 | |
| 0.0003 | 2.43 | 0.08 | 3 | 0.25 | 0.03 | 3 | 0.15 | 0.03 | 3 | |
| 0.0012 | 7.66 | 0.42 | 3 | 0.24 | 0.03 | 3 | 0.19 | 0.07 | 3 | |
| G029131 (CIITA) | 0.0049 | 24.67 | 0.25 | 3 | 0.34 | 0.08 | 3 | 0.29 | 0.08 | 3 |
| 0.0195 | 60.40 | 0.99 | 3 | 0.32 | 0.07 | 3 | 0.58 | 0.04 | 3 | |
| 0.0781 | 91.11 | 0.39 | 3 | 0.46 | 0.04 | 3 | 0.95 | 0.08 | 3 | |
| 0.3125 | 97.56 | 0.12 | 3 | 0.42 | 0.10 | 3 | 1.27 | 0.06 | 3 | |
| 1.25 | 97.70 | 0.10 | 3 | 0.52 | 0.01 | 3 | 1.53 | 0.09 | 3 | |
| 5 | 97.59 | 0.29 | 3 | 0.71 | 0.02 | 3 | 1.46 | 0.35 | 3 | |
| 0.0003 | 0.46 | 0.07 | 3 | 0.39 | 0.02 | 3 | 0.15 | 0.03 | 3 | |
| 0.0012 | 1.42 | 0.25 | 3 | 0.39 | 0.03 | 3 | 0.14 | 0.07 | 3 | |
| 0.0049 | 5.11 | 0.21 | 3 | 0.43 | 0.03 | 3 | 0.12 | 0.01 | 3 | |
| 0.0195 | 17.07 | 0.41 | 3 | 0.59 | 0.21 | 3 | 0.22 | 0.04 | 3 | |
| G029172 (CIITA) | 0.0781 | 46.68 | 1.19 | 3 | 0.45 | 0.09 | 3 | 0.43 | 0.12 | 3 |
| 0.3125 | 82.18 | 0.17 | 3 | 0.54 | 0.07 | 3 | 0.52 | 0.09 | 3 | |
| 1.25 | 95.09 | 0.61 | 3 | 0.55 | 0.10 | 3 | 0.54 | 0.08 | 3 | |
| 5 | 94.17 | 0.07 | 3 | 0.89 | 0.30 | 3 | 0.62 | 0.20 | 3 |
在第10天，收穫細胞用於藉由流式細胞術分析。對於流式細胞術分析，將細胞在FACS緩衝液(PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA)中洗滌。將細胞在靶向CD3之抗體(Biolegend 317336)、靶向CD4之抗體(Biolegend 300538)、靶向CD8之抗體(Biolegend 301051)、靶向HLA-A2之抗體(Biolegend 343320)、靶向HLA-A3之抗體(Invitrogen, 17-5754-42)、靶向HLA-B7之抗體(Miltenyi Biotec, 130-120-234)、靶向HLA-DR、DP、DQ之抗體(Biolegend 361708)及靶向ViaKrome 808可固定活性染料之抗體(Beckman Coulter, C36628)之混合劑中培育。隨後洗滌T細胞且於Cytoflex儀器(Beckman Coulter)進行分析。使用FlowJo軟體包(v.10.6.1)實施資料分析。將T細胞基於大小、活力、CD8陽性以及
表 25中所示標記物之表現進行閘控。CD8+ T細胞之流式細胞術資料示於
表 25及
圖 17A- 圖 17D 中。CD3-、HLA-A2-/HLA-A3-及HLA-DR、DP、DQ-細胞群體分別指示TRAC、TRBC1或TRBC2；HLA-A；或CIITA之高效破壞。來自一位代表性供體之資料示於表25中。類似結果見於兩位供體中。
表 25.代表性供體中表現表面標記物之CD8+ T細胞之平均百分比。將CIITA指導報告為HLA-DP、DQ、DR-細胞之平均百分比。將HLA-A指導報告為HLA-A2/A3-細胞之平均百分比。將TRAC及TRBC指導報告為CD3-細胞之平均百分比。
實例 17. 脫靶分析 17.1 生化脫靶分析
| 指導 | sgRNA 劑量(ug/ml) | 平均值 | SD | n | 指導 | sgRNA 劑量(ug/ml) | 平均值 | SD | n |
| G026584 CIITA | 0.0003 | 14.8 | 2.5 | 3 | G029123 CIITA | 0.0003 | 14.3 | 3.4 | 3 |
| 0.0012 | 16.3 | 3.7 | 3 | 0.0012 | 16.6 | 3.9 | 3 | ||
| 0.0049 | 20.5 | 4.2 | 3 | 0.0049 | 18.4 | 3.6 | 3 | ||
| 0.0195 | 36.5 | 6.5 | 2 | 0.0195 | 28.1 | 3.4 | 3 | ||
| 0.0781 | 76.5 | 2.6 | 3 | 0.0781 | 50.6 | 2.7 | 3 | ||
| 0.3125 | 96.3 | 0.2 | 3 | 0.3125 | 81.4 | 1.9 | 3 | ||
| 1.25 | 98.8 | 0.3 | 3 | 1.25 | 93.2 | 1.1 | 3 | ||
| 5 | 98.7 | 0.2 | 3 | 5 | 92.6 | 0.3 | 3 | ||
| G029131 CIITA | 0.0003 | 16.2 | 1.7 | 3 | G029172 CIITA | 0.0003 | 13.9 | 0.7 | 3 |
| 0.0012 | 17.5 | 5.0 | 3 | 0.0012 | 13.8 | 1.0 | 3 | ||
| 0.0049 | 25.2 | 3.6 | 3 | 0.0049 | 15.5 | 1.4 | 3 | ||
| 0.0195 | 46.9 | 4.0 | 3 | 0.0195 | 19.5 | 5.2 | 3 | ||
| 0.0781 | 73.7 | 3.3 | 3 | 0.0781 | 45.4 | 2.3 | 3 | ||
| 0.3125 | 88.5 | 1.3 | 3 | 0.3125 | 82.1 | 2.8 | 3 | ||
| 1.25 | 94.6 | 0.7 | 3 | 1.25 | 95.8 | 0.4 | 3 | ||
| 5 | 94.4 | 1.5 | 3 | 5 | 93.1 | 1.5 | 3 | ||
| G028922 HLA-A | 0.0003 | 2.6 | 0.4 | 3 | G028865 HLA-A | 0.0003 | 4.7 | 0.2 | 3 |
| 0.0012 | 2.7 | 0.9 | 3 | 0.0012 | 10.2 | 0.5 | 3 | ||
| 0.0049 | 7.4 | 0.7 | 3 | 0.0049 | 26.1 | 1.1 | 3 | ||
| 0.0195 | 22.6 | 0.8 | 3 | 0.0195 | 56.6 | 1.7 | 3 | ||
| 0.0781 | 58.1 | 1.0 | 3 | 0.0781 | 77.1 | 1.7 | 3 | ||
| 0.3125 | 91.9 | 0.9 | 3 | 0.3125 | 82.5 | 1.1 | 3 | ||
| 1.25 | 99.1 | 0.1 | 3 | 1.25 | 87.5 | 1.1 | 3 | ||
| 5 | 98.3 | 0.6 | 3 | 5 | 89.0 | 0.8 | 3 | ||
| G028869 HLA-A | 0.0003 | 2.4 | 0.8 | 3 | G028907 HLA-A | 0.0003 | 5.8 | 0.3 | 3 |
| 0.0012 | 2.1 | 1.3 | 3 | 0.0012 | 15.4 | 0.2 | 3 | ||
| 0.0049 | 2.7 | 0.2 | 3 | 0.0049 | 39.5 | 2.9 | 3 | ||
| 0.0195 | 7.1 | 0.5 | 3 | 0.0195 | 76.5 | 0.5 | 3 | ||
| 0.0781 | 19.7 | 2.3 | 3 | 0.0781 | 92.4 | 0.4 | 3 | ||
| 0.3125 | 47.9 | 1.4 | 3 | 0.3125 | 95.7 | 0.7 | 3 | ||
| 1.25 | 68.7 | 0.6 | 3 | 1.25 | 97.7 | 0.5 | 3 | ||
| 5 | 66.9 | 0.6 | 3 | 5 | 97.0 | 0.2 | 3 | ||
| G028913 HLA-A | 0.0003 | 4.3 | 0.7 | 3 | G028918 HLA-A | 0.0003 | 4.8 | 0.4 | 3 |
| 0.0012 | 11.8 | 0.7 | 3 | 0.0012 | 10.0 | 1.2 | 3 | ||
| 0.0049 | 33.7 | 0.5 | 3 | 0.0049 | 31.0 | 1.0 | 3 | ||
| 0.0195 | 71.5 | 0.9 | 3 | 0.0195 | 63.4 | 0.2 | 3 | ||
| 0.0781 | 90.8 | 0.9 | 3 | 0.0781 | 88.4 | 1.0 | 3 | ||
| 0.3125 | 95.4 | 0.5 | 3 | 0.3125 | 93.5 | 0.4 | 3 | ||
| 1.25 | 97.3 | 0.6 | 3 | 1.25 | 94.3 | 0.5 | 3 | ||
| 5 | 97.4 | 0.3 | 3 | 5 | 94.5 | 0.1 | 3 | ||
| G029006 TRBC | 0.0003 | 4.2 | 0.8 | 3 | G028986 TRBC | 0.0003 | 3.8 | 1.2 | 3 |
| 0.0012 | 9.0 | 1.3 | 3 | 0.0012 | 7.3 | 0.2 | 3 | ||
| 0.0049 | 25.8 | 0.9 | 3 | 0.0049 | 22.2 | 0.3 | 3 | ||
| 0.0195 | 54.7 | 1.5 | 3 | 0.0195 | 55.1 | 1.1 | 3 | ||
| 0.0781 | 84.8 | 0.7 | 3 | 0.0781 | 89.7 | 1.3 | 3 | ||
| 0.3125 | 96.6 | 0.2 | 3 | 0.3125 | 97.8 | 0.2 | 3 | ||
| 1.25 | 99.1 | 0.2 | 3 | 1.25 | 99.1 | 0.1 | 3 | ||
| 5 | 99.0 | 0.2 | 3 | 5 | 98.8 | 0.1 | 3 | ||
| G029007 TRBC | 0.0003 | 3.3 | 0.4 | 3 | G028943 TRAC | 0.0003 | 17.97 | 6.36 | 3 |
| 0.0012 | 4.7 | 0.7 | 3 | 0.0012 | 36.57 | 0.49 | 3 | ||
| 0.0049 | 12.1 | 1.5 | 3 | 0.0049 | 73.73 | 1.19 | 3 | ||
| 0.0195 | 29.4 | 1.7 | 3 | 0.0195 | 95.03 | 0.32 | 3 | ||
| 0.0781 | 53.4 | 2.0 | 3 | 0.0781 | 99.00 | 0.44 | 3 | ||
| 0.3125 | 61.9 | 0.8 | 3 | 0.3125 | 99.27 | 0.06 | 3 | ||
| 1.25 | 65.5 | 1.1 | 3 | 1.25 | 99.33 | 0.25 | 3 | ||
| 5 | 69.0 | 1.4 | 3 | 5 | 98.97 | 0.42 | 3 | ||
| G021469 TRAC | 0.0003 | 7.04 | 3.60 | 3 | G021481 TRAC | 0.00008 | 2.43 | 0.47 | 3 |
| 0.0012 | 8.84 | 0.27 | 3 | 0.00031 | 3.58 | 0.77 | 3 | ||
| 0.0049 | 24.50 | 1.04 | 3 | 0.00122 | 8.21 | 1.05 | 3 | ||
| 0.0195 | 57.13 | 1.20 | 3 | 0.00488 | 26.03 | 0.35 | 3 | ||
| 0.0781 | 85.10 | 1.35 | 3 | 0.01953 | 62.40 | 2.12 | 3 | ||
| 0.3125 | 92.30 | 2.12 | 3 | 0.07813 | 92.70 | 0.70 | 3 | ||
| 1.25 | 96.90 | 0.26 | 3 | 0.3125 | 99.00 | 0.10 | 3 | ||
| 5 | 97.57 | 0.40 | 3 | 1.25 | 99.47 | 0.21 | 3 | ||
| G028935 TRAC | 0.0003 | 15.60 | 4.65 | 3 | G028939 TRAC | 0.0003 | 7.87 | 3.58 | 3 |
| 0.0012 | 34.63 | 0.83 | 3 | 0.0012 | 15.70 | 0.10 | 3 | ||
| 0.0049 | 70.97 | 2.47 | 3 | 0.0049 | 40.90 | 2.88 | 3 | ||
| 0.0195 | 90.27 | 0.35 | 3 | 0.0195 | 75.90 | 1.28 | 3 | ||
| 0.0781 | 94.17 | 1.00 | 3 | 0.0781 | 92.10 | 0.66 | 3 | ||
| 0.3125 | 95.57 | 0.76 | 3 | 0.3125 | 98.43 | 0.06 | 3 | ||
| 1.25 | 96.63 | 0.25 | 3 | 1.25 | 99.70 | 0.10 | 3 | ||
| 5 | 96.47 | 0.06 | 3 | 5 | 99.53 | 0.06 | 3 |
生化方法(參見，例如Cameron等人,
Nature Methods.6, 600-606; 2017)用於使用分別靶向HLA-A、TRAC、TRBC1及TRBC2以及CIITA之特定指導確定由Nme2Cas9裂解的潛在脫靶基因體位點。使用NA24385基因體DNA (Coriell Institute)連同對照指導篩選
表 26中所示之指導RNA。在生化分析中使用192 nM gRNA及64 nM Nme2Cas9蛋白之指導濃度偵測中靶及潛在脫靶裂解位點之數目，其結果示於
表 26中。
亦藉由此項技術中已知之方法實施消化基因體定序(Digenome sequencing)，以使用Nme2鹼基編輯子發現所選指導之潛在脫靶位點。資料未顯示。
表 26：生化脫靶分析
17.2 潛在脫靶位點之靶向定序
| 指導ID | 靶基因 | 位點 |
| G028865 | HLA-A | 18 |
| G028869 | HLA-A | 11 |
| G028907 | HLA-A | 7 |
| G028913 | HLA-A | 13 |
| G028918 | HLA-A | 4 |
| G028922 | HLA-A | 14 |
| G028935 | TRAC | 4 |
| G028939 | TRAC | 4 |
| G028943 | TRAC | 2 |
| G028986 | TRBC1 | 8 |
| G029006 | TRBC2 | 9 |
| G029007 | TRBC2 | 7 |
| G026584 | CIITA | 6 |
| G029123 | CIITA | 1 |
| G029131 | CIITA | 2 |
| G029172 | CIITA | 4 |
| G021557 | VEGFA | 5 |
| G021558 | VEGFA | 1 |
| G021567 | VEGFA | 2 |
應用兩階段過程來鑑別且接著確認潛在脫靶編輯。在第一階段，將計算脫靶預測方法Cas-OFFinder (Bae等人, 2014)與上述生化脫靶發現分析組合，以鑑別潛在脫靶編輯位點。最後階段藉助使用NGS在基因體編輯細胞中偵測C至T突變，確認潛在脫靶基因座處之編輯。採用基於多重PCR之rhAMPSeq (用於次世代定序之RNase H2依賴性PCR擴增)分析或如實例1中所述之NGS來表徵細胞中之潛在脫靶編輯。
針對兩種T細胞供體以一式三份製備樣品。如實例1中所述製備T細胞。同時用3種LNP處理細胞，用Nme2BC22 mRNA、UGI mRNA或如
表 27中所列所選sgRNA之單一RNA貨物調配每一LNP。通常如實例1中所述製備LNP，脂質莫耳比為35脂質A:47.5膽固醇:15 DSPC:2.5 PEG。將LNP在10 µg/mL人類ApoE3中預培育。用藉由如下RNA重量量測之LNP處理大約50,000個T細胞：100 ng Nme2BC22 mRNA、50 ng UGI mRNA及如
表 27中所示劑量之sgRNA。將細胞於37℃下培育約24小時，接著再懸浮於新鮮培養基中以供進一步生長。在LNP處理後大約96小時(4天)，收穫細胞且通常如實例1中所述或經由rhAmpSeq CRISPR分析系統(IDT)，按照製造商方案，使用細胞裂解物進行NGS分析。NGS分析使用設計成鑑別經預測脫靶位點處之C至T突變百分比之引子。來自兩個供體之潛在脫靶位點定序分析之結果匯總於
表 27中。當平均C至T編輯%與供體匹配之未處理對照相比具有統計學顯著性(P值為0.05或更小)時，將潛在脫靶位點視為具有確認之鹼基編輯。針對達到該等準則之潛在脫靶位點人工檢查經編輯之序列讀段，以確認編輯相關之C至T修復結構。
表 27 ：藉由定序在潛在脫靶位點處進行編輯確認
| 指導 | 靶標 | LNP 劑量(ng) | 所表徵之基因座位點 | 確認鹼基編輯之基因座 |
| G028907 | HLA-A | 23.8 | 7 | 3 |
| G028913 | HLA-A | 31.7 | 6 | 2 |
| G028918 | HLA-A | 28.6 | 4 | 3 |
| G028939 | TRAC | 21.5 | 3 | 0 |
| G028943 | TRAC | 5.8 | 1 | 0 |
| G028986 | TRBC | 37.7 | 7 | 1 |
| G029006 | TRBC | 55.0 | 7 | 3 |
| G026584 | CIITA | 70.6 | 7 | 2 |
| G029131 | CIITA | 96.8 | 1 | 0 |
圖1A顯示在用HLA-A靶向指導編輯後HLA-A2-、HLA-A3- T細胞之百分比分佈。
圖1B顯示在用所選指導編輯後HLA-A2- HLA-A3+ (HLA-A-)、HLA-A+、HLA-A3+ (HLA-A3-)及HLA-A2-、HLA-A3- T細胞之百分比。
圖1C顯示在用所選HLA-A指導編輯後之HLA-B- T細胞百分比。
圖2顯示在用稀釋系列之HLA-A指導編輯後之HLA-A2陰性T細胞百分比。
圖3A顯示在用TRAC指導編輯後CD3-T細胞之百分比分佈。
圖3B顯示TRAC基因座處之編輯百分比。
圖4顯示在用稀釋系列之TRAC指導編輯後之CD3陰性T細胞百分比。
圖5A顯示在用TRBC指導編輯後CD3-T細胞之百分比分佈。
圖5B顯示TRBC基因座處之編輯百分比。
圖6顯示在用稀釋系列之TRBC指導編輯後之CD3陰性T細胞百分比。
圖7A顯示在用CIITA指導編輯後HLA-DP、DQ、DR-T細胞之百分比分佈。
圖7B顯示CIITA基因座處之編輯百分比。
圖8顯示在用CIITA指導編輯後左側垂直軸上HLA II-DR、DP、DQ陰性細胞之百分比及右側垂直軸上之平均編輯百分比。
圖9A顯示在用稀釋系列之CIITA指導編輯後，在CIITA基因座處具有C至T轉化之讀段之百分比。
圖9B顯示在用稀釋系列之CIITA指導編輯後HLA-DP、DQ、DR陰性T細胞之百分比。
圖10A-圖10B顯示AAVS1基因座處表示為插入/缺失(indel)頻率之編輯。
圖11A-圖11B顯示在用稀釋系列之AAVS1指導編輯後AAVS1處之插入/缺失頻率。
圖12顯示各種TRAC sgRNA濃度下之平均編輯頻率。
圖13顯示CIITA基因座處之平均編輯頻率。
圖14顯示HLA-A2表面表現為陰性之T細胞之平均百分比。
圖15顯示CIITA基因座處之平均編輯百分比。
圖16A-圖16L顯示在一系列劑量之所述指導RNA下之平均編輯百分比。
圖17A-圖17D顯示在各種sgRNA濃度下對各別表現標記物為陰性之CD8+ T細胞之平均編輯百分比。
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Claims (108)
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr6:29942540-29945459內之至少一個核苷酸。
- 如請求項1之經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自表1中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸，或其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內由指導RNA靶向之至少一個核苷酸，該指導RNA包含SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80中任一者之指導序列。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A之表面表現，其包含HLA-A基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
- 如請求項1-6中任一項之經工程改造之細胞，其中該HLA-A表現係藉由結合至HLA-A基因體靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該HLA-A基因體靶序列包含基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：該等基因體坐標選自chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29944266-29944290；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495及chr6:29944470-29944494，或選自chr6:29942891-29942915；chr6:29942609-29942633；chr6:29942889-29942913；chr6:29944471-29944495；chr6:29944266-29944290；chr6:29942785-29942809。
- 如請求項1-7中任一項之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表1中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
- 如請求項1-8中任一項之經工程改造之細胞，其中該細胞係HLA-C同型接合的。
- 如請求項1-9中任一項之經工程改造之細胞，其中該細胞係HLA-B同型接合的且係HLA-C同型接合的。
- 一種組成物，其包含HLA-A指導RNA及視情況RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含 i. 選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列之至少19、20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列； iv. 包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v. 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 vi. 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之HLA-A蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含HLA-A指導RNA及視情況RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含 i. 選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列； iv. 包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v. 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 vi. 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中HLA-A蛋白之表面表現之方法，其包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含HLA-A指導RNA及視情況RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該HLA-A指導RNA包含 i. 選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之指導序列； ii. 選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 iii. 與選自SEQ ID NO: 66、61、2-60、62-65、67-80之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列； iv. 包含表1中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v. 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 vi. 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 66、61、13、55、70及71中任一者之指導序列。
- 如請求項11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含SEQ ID NO: 61、66、13、17、55及70中任一者之指導序列。
- 如請求項11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 61之序列。
- 如請求項11-13中任一項之組成物或方法，其中該HLA-A指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 66之序列。
- 一種細胞群體，其包含如請求項1-10中任一項之經工程改造之細胞、或藉由如請求項12-17中任一項之方法產生的經工程改造之細胞。
- 一種醫藥組成物，其包含(a)如請求項1-10中任一項之經工程改造之細胞；藉由如請求項12-17中任一項之方法或藉由使用如請求項11之組成物產生的經工程改造之細胞；或(b)如請求項18之細胞群體。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC之表面表現，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr14:22547505-22551621或chr14:22547462-22551621內之至少一個核苷酸。
- 如請求項20之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表2中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸，或其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內由指導RNA靶向之至少一個核苷酸，該指導RNA包含SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120中任一者之指導序列。
- 如請求項20或21之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；或chr14:22547525-22547549；chr14:22547674-22547698。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC表現，其包含TRAC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549或chr14:22547674-22547698。
- 如請求項20-23中任一項之經工程改造之細胞，其中該TRAC表現係藉由結合至TRAC靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該TRAC靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549或chr14:22547674-22547698。
- 一種組成物，其包含：a)包含指導序列之TRAC指導RNA，該指導序列i)靶向TRAC基因體靶序列；或ii)引導RNA指導之DNA結合劑誘導TRAC基因體靶序列中之雙股斷裂(DSB)或單股斷裂(SSB)，該TRAC基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少10個鄰接核苷酸：chr14:22550574-22550598；chr14:22550544-22550568；chr14:22547505-22547529；chr14:22547525-22547549或chr14:22547674-22547698。
- 一種組成物，其包含：(a) TRAC指導RNA及視情況(b)RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRAC指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之指導序列； ii) 選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 iii) 與選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或 iv) 包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項26之組成物，其用於改變細胞中TRAC基因座內之DNA序列。
- 如請求項26之組成物，其用於降低或消除細胞中TRAC蛋白之表現。
- 一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRAC蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含：(a) TRAC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRAC指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之指導序列； ii) 選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 iii) 與選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或 iv) 包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23或24個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中TRAC蛋白之表面表現之方法，該方法包括使細胞與組成物接觸，該組成物包含：(a) TRAC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRAC指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之指導序列； ii) 選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 iii) 與選自SEQ ID NO: 111、107、101-106、108-110及112-120之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或 iv) 包含表2中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項25-30中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含SEQ ID NO: 111、107、101、102及103中任一者之指導序列。
- 如請求項25-30中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 107之序列。
- 如請求項25-30中任一項之組成物或方法，其中該TRAC指導RNA包含指導序列，該指導序列包含SEQ ID NO: 111之序列。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項20-24中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如請求項25或26之組成物或藉由如請求項25-33中任一項之方法產生的經工程改造之細胞。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現，其包含TRBC基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含基因體坐標chr7: 142791756-142802543內之至少一個核苷酸。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC之表面表現，其包含TRBC基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含以下基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721或(c) chr7:142801104-142802543，或其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內由指導RNA靶向之至少一個核苷酸，該指導RNA包含SEQ ID NO: 215、201-214及216-265中任一者之指導序列。
- 如請求項35或36之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表3中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
- 如請求項35或36之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
- 如請求項35或36之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC表現，其包含人類TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含以下基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr7:142791862-142793149；(b) chr7: 142791756-142792721；或(c) chr7:142801104-142802543。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC表現，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
- 一種經工程改造之人類細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC表現，其包含TRBC基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
- 如請求項35-42中任一項之經工程改造之細胞，其中該TRBC表現係藉由結合至TRBC靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該TRBC靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr7:142792690-142792714或chr7:142792693-142792717；或(b) chr7:142791756-142791780；chr7:142791761-142791785；chr7:142791820-142791844；chr7:142791939-142791963；chr7:142791940-142791964或chr7:142792004-142792028；或(c) chr7:142801104-142801124；chr7:142802103-142802127或chr7:142802106-142802130。
- 如請求項35-43中任一項之經工程改造之細胞，其中該TRBC表現係藉由結合至TRBC靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該TRBC靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr7:142792690-142792714；chr7:142802103-142802127及chr7:142802106-14280213。
- 一種組成物，其包含(a) TRBC指導RNA及視情況(b)RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRBC指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之指導序列； ii) 選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸； iii) 與選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列； iv) 包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項45之組成物，其用於改變細胞中TRBC基因座內之DNA序列。
- 如請求項45之組成物，其用於降低或消除細胞中TRBC蛋白之表現。
- 一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之TRBC蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) TRBC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRBC指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之指導序列； ii) 選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸； iii) 與選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列； iv) 包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中TRBC蛋白之表面表現之方法，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) TRBC指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該TRBC指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之指導序列； ii) 選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸； iii) 與選自SEQ ID NO: 215、201-214及216-265之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列； iv) 包含表3中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列； v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項45-49中任一項之方法或組成物，其中該TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、216、223、224、229、230、246、259及260中任一者之指導序列。
- 如請求項45-50中任一項之方法或組成物，其中該TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、216、224、229、246、259及260中任一者之指導序列。
- 如請求項45-51中任一項之方法或組成物，其中該TRBC指導RNA包含SEQ ID NO: 215、259及260中任一者之指導序列。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項35-44中任一項之經工程改造之細胞、或藉由如請求項46-52中任一項之方法或藉由使用如請求項45之組成物產生的經工程改造之細胞。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現，其包含CIITA基因中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10877363-10907788或(b) chr16:10906515-10908136。
- 如請求項54之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自表4中所列之任一基因體坐標之基因體坐標內之至少一個核苷酸。
- 如請求項54之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10906889-10906913或chr16:10907504-10907528。
- 如請求項54之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之至少一個核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521或chr16:10907508-10907532。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現，其包含CIITA基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或(b) chr16:10907504-10907528。
- 一種經工程改造之細胞，其相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類之表面表現，其包含CIITA基因座中之遺傳修飾，其中該遺傳修飾包含選自以下之基因體坐標內之插入/缺失、C至T之取代或A至G之取代：chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10907477-10907501；及chr16:10907497-10907521；chr16:10907504-10907528；chr16:10907508-10907532。
- 如請求項54-59中任一項之經工程改造之細胞，其中該MHC II類表現係藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：(a) chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10907508-10907532；chr16:10907539-10907559；chr16:10895658-10895682；chr16:10895668-10895692；chr16:10895750-10895774；chr16:10895753-10895777；chr16:10895754-10895778；chr16:10898684-10898708；chr16:10901529-10901553；chr16:10902121-10902145；chr16:10902701-10902725；chr16:10904726-10904750；chr16:10904760-10904784；chr16:10906493-10906517；chr16:10906515-10906539；chr16:10906631-10906655；chr16:10906636-10906660；chr16:10906770-10906794；chr16:10906788-10906812；chr16:10906789-10906813；chr16:10906816-10906840；chr16:10907148-10907172；chr16:10907254-10907278；chr16:10907331-10907355；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521；chr16:10907503-10907527；chr16:10907574-10907598；或chr16:10907504-10907528。
- 如請求項54-60中任一項之經工程改造之細胞，其中該MHC II類表現係藉由結合至CIITA基因體靶序列之基因體編輯系統來降低或消除，該CIITA基因體靶序列包含選自以下之基因體坐標內之至少5個鄰接核苷酸：chr16:10907504-10907528；chr16:10906643-10906667；chr16:10895658-10895682；chr16:10902701-10902725；chr16:10906493-10906517；chr16:10906631-10906655；chr16:10907477-10907501；chr16:10907497-10907521或chr16:10907508-10907532。
- 一種組成物，其包含(a) CIITA指導RNA及視情況(b)RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該CIITA指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之指導序列；或 ii) 選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 iii) 與選自SEQ ID NO：301、422、302-421及423-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或 iv) 包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或 v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項62之組成物，其用於改變細胞中CIITA基因內之DNA序列。
- 如請求項62之組成物，其用於降低或消除細胞中CIITA之表現。
- 一種製備經工程改造之人類細胞之方法，該經工程改造之人類細胞相對於未經修飾之細胞具有降低或消除之MHC II類蛋白之表面表現，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) CIITA指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該CIITA指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之指導序列；或 ii) 選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 iii) 與選自SEQ ID NO：301、422、302-421及423-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或 iv) 包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或 v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 一種相對於未經修飾之細胞降低人類細胞中MHC II類蛋白之表面表現之方法，該方法包括使細胞與以下接觸：(a) CIITA指導RNA及視情況(b) RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸，其中該CIITA指導RNA包含： i) 選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之指導序列；或 ii) 選自SEQ ID NO: 301、422、302-421及423-576之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 iii) 與選自SEQ ID NO：301、422、302-421及423-576之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列；或 iv) 包含表4中所列基因體坐標之10個鄰接核苷酸±10個核苷酸之序列；或 v) 來自(iv)之序列之至少20、21、22、23、24或25個鄰接核苷酸；或 vi) 與選自(iv)之序列至少95%、90%或85%一致之指導序列。
- 如請求項62-66中任一項之方法或組成物，其中該CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301、422、302、320、321、324、326、327、332、354、361、372、400、408、414、415、419、420、428、431、432、434、451、455、458、462、463、464、468中任一者之指導序列。
- 如請求項62-67中任一項之方法或組成物，其中該CIITA指導RNA包含SEQ ID NO: 301、422、302、320、372、414、419、462及463中任一者之指導序列。
- 一種醫藥組成物，其包含如請求項54-61中任一項之經工程改造之細胞、或藉由使用如請求項62之組成物或如請求項65-68中任一項之方法產生的經工程改造之細胞。
- 如請求項1-69中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少2個、至少3個、至少4個、至少5個、至少6個、至少7個、至少8個、至少9個或至少10個鄰接核苷酸。
- 如請求項1-70中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含插入/缺失。
- 如請求項1-71中任一項之經工程改造之細胞，其中該遺傳修飾包含異源編碼序列之插入。
- 如請求項1-72中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少一個A至G之取代。
- 如請求項1-73中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該遺傳修飾包含該等基因體坐標內之至少一個C至T之取代。
- 如請求項1-74中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞具有CIITA基因中之遺傳修飾。
- 如請求項1-75中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞於該細胞之表面上具有降低之TRAC蛋白表現。
- 如請求項1-76中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞於該細胞之表面上具有降低之TRBC蛋白表現。
- 如請求項1-77中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞於該細胞之表面上具有降低之MHC II類分子表現。
- 如請求項1-78中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該經工程改造之細胞係免疫細胞。
- 如請求項1-79中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係幹細胞。
- 如請求項1-80中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係原代細胞。
- 如請求項1-81中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該細胞係幹細胞。
- 如請求項1-82中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該等細胞係用基因體編輯系統進行工程改造。
- 如請求項7-83中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該基因體編輯系統包含RNA指導之DNA結合劑或編碼RNA指導之DNA結合劑之核酸。
- 如請求項84之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑係腦膜炎奈瑟氏球菌( N. meningitidis) Cas9 (NmeCas9)。
- 如請求項84-85中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑具有雙股內核酸酶活性。
- 如請求項84-86中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑具有切口酶活性。
- 如請求項84-86中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或由該核酸編碼之該RNA指導之DNA結合劑包含dCas9 DNA結合結構域。
- 如請求項84-85中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係A至G鹼基編輯子。
- 如請求項84-85中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該RNA指導之DNA結合劑或編碼該RNA指導之DNA結合劑之核酸係C至T鹼基編輯子。
- 如請求項1-90中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該指導RNA於載體中提供給該細胞。
- 如請求項1-91中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該RNA指導之DNA結合劑於載體中，視情況於與該指導RNA相同之載體中提供給該細胞。
- 如請求項1-92中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該外源核酸於載體中提供給該細胞。
- 如請求項91-93中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係病毒載體。
- 如請求項91-93中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該載體係非病毒載體。
- 如請求項1-95中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該指導RNA於脂質核酸組裝組成物中，視情況於與RNA指導之DNA結合劑相同之脂質核酸組裝組成物中提供給該細胞。
- 如請求項1-96中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中將該外源核酸於脂質核酸組裝組合物中提供給該細胞。
- 如請求項96或97之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該脂質核酸組裝組成物係脂質奈米粒子(LNP)。
- 如請求項1-98中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該指導RNA係單指導RNA。
- 如請求項1-99中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其中該指導RNA包含5’末端修飾或3’末端修飾。
- 如請求項1-100中任一項之方法或組成物，其中該指導RNA包含： 指導序列，其中該指導序列包含： 在前四個核苷酸1-4處經2'-O-Me修飾之核苷酸； 核苷酸1-2、2-3及3-4之間之PS鍵聯；及 在該指導序列之核苷酸5、8、9、11、13、18及22處經2'-O-Me修飾之核苷酸； 縮短之重複/反重複區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸38-48及53-63，其包含： 在核苷酸25、29、30、31、32、37、49-52、64、65、69、70及73處經2'-O-Me修飾之核苷酸； 縮短之髮夾1區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸86及91，其包含： 在核苷酸80、81、83、84、85、87-90、92-94及99處經2'-O-Me修飾之核苷酸； 在該縮短之髮夾1區域與該縮短之髮夾2區域之間之核苷酸101處經2'-O-Me修飾之核苷酸； 縮短之髮夾2區域，其中相對於SEQ ID NO: 900缺失核苷酸112-120及127-135，其包含： 在核苷酸104、110、111、122-125、142及143處經2'-O-Me修飾之核苷酸， 核苷酸141-142及142-143之間之PS鍵聯， 其中相對於SEQ ID NO: 900視情況缺失一或兩個核苷酸144-145。
- 一種向有需要之個體投與如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物的方法。
- 一種向個體投與如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體或醫藥組成物作為過繼性細胞轉移(ACT)療法的方法。
- 一種治療疾病或病症之方法，其包括向有需要之個體投與如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體或醫藥組成物的方法。
- 如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於作為過繼性細胞轉移(ACT)療法向個體投與。
- 如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於治療患有癌症之個體。
- 如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於治療患有感染性疾病之個體。
- 如請求項1-10、18-24、34-44、53-61、69及70-100中任一項之經工程改造之細胞、細胞群體、醫藥組成物或方法，其用於治療患有自體免疫疾病之個體。
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| US63/352,990 | 2022-06-16 |
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