BR112020006256A2 - método in vitro de administração de mrna usando nanopartículas de lipídio - Google Patents

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Anthony Monti
Pooja Kyatsandra Narendra
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Abstract

A presente invenção refere-se a composições e métodos para a introdução de um mRNA em células-tronco, como HSPCs, e para a admi-nistração de componentes de edição de genes a essas células in vitro. Por exemplo, a divulgação se refere à modificação de uma sequência gênica usando um complexo de CRISPR-Cas9 em HSPCs, e métodos e sistemas de administração para atingir tal modificação gênica em HSPCs.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO- DO IN VITRO DE ADMINISTRAÇÃO DE MRNA USANDO NANO- PARTÍCULAS DE LIPÍDIO".
[0001] O presente pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido de Patente Provisório US Nº 62/566.232, depositado em 29 de setembro de 2017, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência na sua totalidade.
[0002] A introdução de alterações genéticas nas células-tronco, incluindo células-tronco hematopoiéticas (HSCs), e sua progênie é de interesse para os métodos de edição e terapia gênica. Células-tronco como HSCs têm capacidades proliferativas perdidas em células madu- ras e progenitores comprometidos, tornando-as particularmente úteis para tecnologias de edição de genes. A capacidade de modificar HSCs e células-tronco in vitro é importante, por exemplo, e são necessários métodos para fornecer agentes biológicos às HSCs e outras células- tronco em cultura. Existe uma necessidade particular de tecnologias de entrega para HSCs humanas em cultura.
[0003] As HSCs são indispensáveis para a produção de sangue ao longo da vida. As HSCs podem sustentar hematopoiese a longo prazo e funcional devido à sua capacidade de se diferenciar para produzir progênie madura de todas as linhagens sanguíneas mieloides e linfoi- des ou de se auto-renovar para substituir as células que se comprome- tem progressivamente com a diferenciação. As HSCs podem ser usa- das para restaurar células sanguíneas e imunológicas em receptores de transplante, em pacientes imunocomprometidos ou em outros paci- entes. Especificamente, o transplante autólogo ou alogênico de HSCs pode ser usado para o tratamento de pacientes com doenças imuno- deficientes e autoimunes herdadas e diversos distúrbios hematopoiéti- cos para reconstituir as linhagens celulares hematopoiéticas e a defe- sa do sistema imunológico.
[0004] Métodos para entregar componentes de sistemas de edição de genes CRISPR/Cas às HSCs em cultura são de particular interes- se. Métodos de entrega de RNAs, incluindo componentes do sistema CRISPR/Cas para culturas de células hematopoiéticas que incluem HSCs são fornecidos neste documento. Os métodos entregam proteí- na ativa às células-tronco, incluindo HSCs, cultivadas in vitro e incluem o contato das células com uma composição de nanopartículas lipídicas (LNP) que fornece um mRNA que codifica a proteína. Além disso, são fornecidos métodos de edição de genes em células-tronco, como HSCs in vitro, e métodos de produção de uma célula manipulada.
[0005] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos de edi- ção de genes nas HSCs in vitroe métodos de produção de uma célula HSC manipulada. Em outras modalidades, é fornecido neste documen- to um método de entrega de um mRNA a uma célula-tronco hemato- poiética e/ou célula progenitora (HSPC) ou a uma população de HSPC. Em algumas modalidades, o método compreende a pré- incubação de um fator sérico com uma composição de LNP compre- endendo o mMRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o contato da população de HSPC ou HSPC com a composição de LNP pré-incubada in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cultura da população HSPC ou HSPC in vitro. Em algumas modalidades, o método resulta na entrega do MRNA à população de HSPC ou HSPC.
[0006] Em algumas modalidades, é proporcionado neste docu- mento um método de introdução de um mRNA da nuclease Cas e um gRNA a uma célula-tronco, por exemplo, um HSPC. Em algumas mo- dalidades, o método compreende a pré-incubação de um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mRNA de Nuclease Cas, um gRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neu-
tro e um lipídio com PEG. Em algumas modalidades, o método com- preende ainda o contato de HSPC com a composição de LNP pré- incubada in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cultura do HSPC. Em algumas modalidades, o método resulta na introdução do MRNA e do gRNA da nuclease Cas no HSPC.
[0007] Em algumas modalidades, é proporcionado neste docu- mento um método de produção de uma célula-tronco geneticamente modificada, por exemplo, HSPC, in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende a pré-incubação de um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mMRNA de Nuclease Cas, um gRNA, um mMRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o contato de HSPC com a composição de LNP pré- incubada in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cultura do HSPC in vitro. Em algumas modalidades, o método resulta na produção de um HSPC geneticamente manipulado.
[0008] Em algumas modalidades, é fornecido um método de en- trega de um mRNA a uma população de HSPC ou HSPC, compreen- dendo a pré-incubação de uma composição de LNP com um fator séri- co, entrando em contato com a célula ou população com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e cultivar a célula ou população in vitro; entregando assim o mMRNA ao HSPC. Em algumas modalidades, o HSPC é um HSC. Em algumas modalidades, os métodos entregam um mRNA, como um MRNA de nuclease Cas, a uma população de HSPC (por exemplo, uma população de células CD34 +). Em certas modalidades, um RNA guia (gRNA), opcionalmente em combinação com um mRNA da nuclease Cas, é entregue às células.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[0009] A Fig. 1 mostra a entrega de MRNA da proteína fluorescen- te verde (GFP) nas células da medula óssea CD34+ usando LNPs.
[0010] A Fig. 2 mostra que a entrega de mMRNA nas células da medula óssea CD34+ depende da pré-incubação com soro.
[0011] As Figs. 3A e 3B mostram edição de B2M nas células da medula óssea CD34+ com pré-incubação de soro, com a Fig. 3A re- presentando a percentagem de células B2M- (nocaute de expressão de proteínas) e a Fig. 3B representando a percentagem de edição al- cançada no experimento.
[0012] As Figs. 4A e 4B mostram entrega eficiente com pré- incubação sérica e pré-incubação com ApoE3. A Fig. 4A representa a percentagem de células B2M- e a Fig. 4B fornece a percentagem de edição alcançada na experiência.
[0013] A Fig. 5 mostra o efeito da pré-incubação de LNP com pre- parações de vários fatores séricos na entrega de LNP às células CD34+.
[0014] As Figs. 6A e 6B mostram dados de viabilidade e edição para células CD34+ que foram expostas ao tratamento com LNP em intervalos variados. A Fig. 68A mostra a viabilidade das células CD34+ após a exposição ao LNP às 2, 6 e 24 horas. A Fig. 6B fornece a per- centagem de dados de edição para os grupos de tratamento de 2,6 e 24 horas.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[0015] A presente invenção fornece métodos de uso de composi- ções de LNP de RNAs, incluindo RNAs de componentes CRISPR/Cas (a "carga"), para entrega in vitro a células CD34+, por exemplo, popu- lações de células contendo HSC. Os métodos podem exibir proprieda- des aprimoradas em comparação com as tecnologias de entrega ante- riores, por exemplo, os métodos fornecem entrega eficiente dos RNAs, enquanto reduzem a morte celular causada pela transfecção.
[0016] Em algumas modalidades, é fornecido neste documento um método de entrega de um mRNA a uma célula-tronco, por exemplo,
uma população de HSPC ou HSPC. Em algumas modalidades, o mé- todo compreende a pré-incubação de um fator sérico com uma com- posição de LNP compreendendo o mMRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o contato da população de HSPC ou HSPC com a composição de LNP pré-incubada in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cultura da popu- lação HSPC ou HSPC in vitro. Em algumas modalidades, o método resulta na entrega do MRNA à população de HSPC ou HSPC. Em al- gumas modalidades, o MRNA codifica uma nuclease Cas.
[0017] Em algumas modalidades, é proporcionado neste docu- mento um método de introdução de um mRNA da nuclease Cas e um gRNA a uma célula-tronco, por exemplo, um HSPC ou uma população HSPC. Em algumas modalidades, o método compreende a pré- incubação de um fator sérico com uma composição de LNP compre- endendo o mMRNA de Nuclease Cas, um gRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em algu- mas modalidades, o método compreende ainda o contato de HSPC com a composição de LNP pré-incubada in vitro. Em algumas modali- dades, o método compreende ainda a cultura do HSPC. Em algumas modalidades, o método resulta na introdução do MRNA e do gRNA da nuclease Cas no HSPC.
[0018] Em algumas modalidades, é proporcionado neste docu- mento um método de produção de uma célula-tronco geneticamente manipulada, por exemplo, HSPC, in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende a pré-incubação de um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mMRNA de Nuclease Cas, um gRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em algumas modalidades, o método compreende ainda o contato de HSPC com a composição de LNP pré-incubada in vitro. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a cultura do HSPC in vitro. Em algumas modalidades, o método resulta na pro- dução de um HSPC geneticamente manipulado.
[0019] Em algumas modalidades, a composição compreende ain- da um gRNA. Em algumas modalidades, o MRNA codifica uma nu- clease Cas de Classe 2. Em certas modalidades, o componente ou carga de RNA inclui uma mRNA da nuclease Cas, como uma mMRNA da nuclease Cas de Classe 2. Em certas modalidades, o componente ou carga de RNA inclui um gRNA do sistema CRISPR/Cas ou ácidos nucleicos que codificam um gRNA. Métodos de edição de genes e mé- todos de produção de células manipuladas também são fornecidos. Métodos in vitro
[0020] Os presentes métodos entregam RNAs para células CD34+ in vitro. "Células CD34+" referem-se às células que expressam em seu marcador CD34 de superfície. As células CD34+ podem ser detecta- das e contadas usando, por exemplo, citometria de fluxo e anticorpos CD34 anti-humanos marcados com fluorescência.
[0021] Em algumas modalidades, é fornecido um método de en- trega de um mMRNA a uma célula-tronco, por exemplo, uma população de HSPC ou HSPC, o método compreendendo (a) pré-incubando um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mMRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG; (b) entrando em contato com a população de HSPC ou HSPC com a composição pré-incubada de LNP in vitro; e (c) cultivan- do a população de HSPC ou de HSPC in vitro; entregando dessa for- ma o mMRNA ao HSPC. Em algumas modalidades, o MRNA codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2. Em alguns aspectos, o MRNA da nuclease Cas da Classe 2 é um mRNA de Cas9 ou um mRNA de Cpf1i. Em certas modalidades, a nuclease Cas da Classe 2 é uma S.pyogenes Cas9. Em algumas modalidades, a com-
posição de LNP compreende ainda um gRNA. Em modalidades adici- onais, os métodos introduzem um mMRNA da nuclease Cas e um gRNA em um HSPC, o método compreendendo (a) pré-incubando um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mRNA da nu- clease Cas, um gRNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipí- dio neutro e um lipídio com PEG; (b) entrando em contato com o HSPC com a composição pré-incubada de LNP in vitro; e (c) cultivan- do o HSPC; introduzindo dessa forma a nuclease Cas e o gRNA no HSPC.
[0022] Em várias modalidades, os gRNAs dos métodos descritos nestes documentos podem ser um RNA de guia duplo (dgRNA) ou um RNA de guia único (sgRNA).
[0023] Em algumas modalidades dos métodos in vitro, a transfec- ção de LNP pode reduzir a morte celular de HSPC ou CD34+ em com- paração com tecnologias conhecidas como eletroporação. Em algu- mas modalidades, a transfecção de LNP pode causar menos de 5%, menos de 10%, menos de 20%, menos de 30% ou menos de 40% de morte celular. Em certas modalidades, a sobrevida de células pós- transfecção é de pelo menos 60%, 70%, 80%, 90% ou 95%.
[0024] As células-tronco são caracterizadas pela capacidade de se auto-renovar e se diferenciar em uma gama diversificada de tipos de células. Os dois tipos amplos de células-tronco de mamíferos são célu- las-tronco embrionárias (ES) e células-tronco adultas. As células- tronco adultas ou células progenitoras podem repor células especiali- zadas. A maioria das células-tronco adultas tem restrição de linhagem e pode ser referida por sua origem tecidual. As linhas de células ES são derivadas do tecido epiblasto da massa celular interna de um blas- tocisto ou embriões em estágio inicial de mórula. As células ES são pluripotentes e dão origem a derivados das três camadas germinais, ou seja, o ectoderma, endoderma e mesoderma. As células-tronco plu-
ripotentes induzidas (iPSCs) são células adultas que foram reprogra- madas geneticamente para um estado semelhante a uma célula-tronco embrionária, sendo forçadas a expressar genes e fatores importantes para manter as propriedades definidoras das células-tronco embrioná- rias. Uma "célula-tronco" pode ser uma ESC, uma iPSC, uma célula progenitora ou um HSPC, por exemplo.
[0025] Os termos "célula-tronco hematopoiética e/ou célula proge- nitora" e "HSPC" são usados de forma intercambiável e se referem a uma população de células compreendendo HSCs e células progenito- ras hematopoiéticas ("HPCs""). Tais células são caracterizadas, por exemplo, como CD34+. Em modalidades exemplares, os HSPCs são isolados da medula óssea. Em outras modalidades exemplares, os HSPCs são isolados do sangue periférico. Em outras modalidades exemplares, os HSPCs são isolados do sangue do cordão umbilical.
[0026] Os HSPCs podem ser derivados da medula óssea, sangue periférico ou sangue do cordão umbilical e podem ser autólogos (as células-tronco do próprio paciente) ou alogênicos (as células-tronco são de um doador).
[0027] O termo "células progenitoras hematopoiéticas" ou "HPCs", conforme usado neste documento, refere-se às células hematopoiéti- cas primitivas que têm uma capacidade limitada de auto-renovação e o potencial de diferenciação de várias linhagens (por exemplo, mieloide, linfoide), diferenciação de linhagem (por exemplo, mieloide ou linfoide) ou diferenciação restrita do tipo celular (por exemplo, progenitor eri- troide), dependendo do posicionamento dentro da hierarquia hemato- poiética (Doulatov et al., Cell Stem Cell 2012).
[0028] O termo "células-tronco hematopoiéticas" ou "HSCs", con- forme usado neste documento, também se refere às células sanguí- neas imaturas com capacidade de se auto-renovar e se diferenciar em células sanguíneas mais maduras que compreendem granulócitos (por exemplo, promielócitos, neutrófilos, eosinófilos, basófilos), eritrócitos (por exemplo, reticulócitos, eritrócitos), trombócitos (por exemplo, me- gacarioblastos, megacariócitos produtores de plaquetas, plaquetas) e monócitos (por exemplo, monócitos, macrófagos). É conhecido na téc- nica que essas células podem ou não incluir células CD34+. As células CD34+ são células imaturas que expressam o marcador de superfície celular CD34. Acredita-se que as células CD34+ incluam uma subpo- pulação de células com as propriedades de células-tronco definidas acima. O transplante de populações de células, como HSPCs que con- têm HSCs multipotentes, pode ser usado para tratar leucemia, linfoma e outros distúrbios.
[0029] As HSCs são células multipotentes que podem dar origem às células progenitoras primitivas (por exemplo, células progenitoras multipotentes) e/ou células progenitoras comprometidas com linhagens hematopoiéticas específicas (por exemplo, células progenitoras linfoi- des). As células-tronco comprometidas com linhagens hematopoiéticas específicas podem ser de linhagem de células T, linhagem de células B, linhagem de células dendríticas, linhagem de células de Langerhans e/ou linhagem de células de macrófagos específicas de tecido linfoide. Além disso, os HSCs também se referem a HSC de longo prazo (LT- HSC) e HSC de curto prazo (ST-HSC). ST-HSCs são mais ativos e mais proliferativos que LT-HSCs. No entanto, o LT-HSC possui auto- renovação ilimitada (isto é, eles sobrevivem ao longo da vida adulta), enquanto o ST-HSC possui autorrenovação limitada (ou seja, eles so- brevivem apenas por um período limitado de tempo). Qualquer um desses HSCs pode ser usado em qualquer um dos métodos descritos neste documento. Opcionalmente, os ST-HSCs são úteis porque são altamente proliferativos e, portanto, aumentam rapidamente o número de HSCs e sua progênie.
[0030] HSCs, HPCs e HSPC s são opcionalmente obtidos de pro-
dutos derivados de sangue. Um produto sanguíneo inclui um produto obtido do corpo ou de um órgão do corpo contendo células de origem hematopoiética. Tais fontes incluem medula óssea, cordão umbilical, sangue periférico (por exemplo, sangue periférico mobilizado, por exemplo, mobilizado com um agente de mobilização como G-CSF ou Plerixafor& (AMD3100)), fígado, timo, linfa e baço. Todos os produtos sanguíneos mencionados acima (por exemplo, nas formas bruta, não fracionada ou fracionada) podem ser enriquecidos para células com características HSC de maneiras conhecidas pelos versados na técnica. Da mesma forma, eles podem ser enriquecidos pelas características da população de HPC e/ou HSPC. Numa modalidade, as HSCs são carac- terizadas como CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-. Nas modalidades, as HSCs são caracterizadas como células CD34+/CD90+/CD49f+. Em modalidades adicionais, as HSCs são caracterizadas como Lineage- CD34+/CD38-/CD90+/CD45RA-. Nas modalidades, as HSCs são ca- racterizadas como células Lineage-CD34+/CD90+/CD49f+, em que "linhagem" significa omitir marcadores para células diferenciadas ter- minalmente, por exemplo, células T, células B etc. Estes podem ser excluídos pela coloração das células com anticorpos contra marcado- res de superfície expressos por células que se comprometeram com uma linhagem hematopoiética. Estes podem incluir, mas não estão limitados a: CD3 (célula T), CD19 (célula B), CD33 (mieloide), CD56 (célula NK), CD235a (células eritroides), CD71 (células eritroides).
[0031] "Enriquecido" quando usado no contexto da população ce- lular refere-se a uma população celular selecionada com base na pre- sença de um ou mais marcadores, por exemplo, CD34+. Uma popula- ção de células, como uma população de células-tronco ou uma popu- lação de HSPC, refere-se a células de mamíferos eucarióticos, prefe- rencialmente humanos, isoladas de fontes biológicas, por exemplo, produtos ou tecidos sanguíneos e derivados de mais de uma célula.
[0032] Durante a pré-incubação, um fator sérico pode entrar em contato com uma composição de LNP, antes da entrega para a célula HSPC in vitro.
[0033] Algumas modalidades dos métodos in vitro compreendem a pré-incubação de um fator sérico e a composição de LNP por cerca de 30 segundos durante a noite. Em algumas modalidades, a etapa de pré-incubação compreende pré-incubar um fator sérico e a composi- ção de LNP por cerca de 1 minuto a 1 hora. Em algumas modalidades, compreende a pré-incubação por cerca de 1-30 minutos. Em outras modalidades, compreende a pré-incubação por cerca de 1-10 minutos. Ainda outras modalidades compreendem a pré-incubação por cerca de minutos. Em certas modalidades, os pontos finais dos intervalos e os valores fornecidos acima podem ser + 0,5, 1, 2, 3 ou 4 minutos.
[0034] Em certas modalidades, a etapa de pré-incubação ocorre a cerca de 4 “C. Em certas modalidades, a etapa de pré-incubação ocor- re a cerca de 25 ºC. Em certas modalidades, a etapa de pré-incubação ocorre a cerca de 37 ºC. A etapa de pré-incubação pode compreender um tampão, como bicarbonato de sódio ou HEPES. Em certas modali- dades, o tampão pode compreender um meio de cultura HSPC. Em modalidades adicionais, o tampão pode consistir em meio de cultura HSPC.
[0035] A pré-incubação de uma composição de LNP com um fator sérico pode compreender pré-incubação com soro, com uma fração sérica ou com um fator sérico isolado. Em algumas modalidades, a composição de LNP é pré-incubada com soro. O soro pode ser de mamífero, camundongo, primata ou soro humano. Em algumas moda- lidades, a composição de LNP é pré-incubada com um fator sérico iso- lado. Em certas modalidades, o fator sérico é uma ApoE. Em certas modalidades, o fator sérico é escolhido entre ApoE2, ApoE3 e ApoE4. Em modalidades adicionais, a ApoE é uma proteína recombinante,
como uma proteína humana recombinante. A ApoE pode ser ApoE3 humana recombinante. Pode ser ApoE4 humano recombinante.
[0036] Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato com a célula-tronco, por exemplo, HSPC ou população de cé- lulas-tronco, por exemplo, população de HSPC, após a etapa de pré- incubação, por exemplo, o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada. Em algumas modalidades, os métodos compre- endem o contato com a população de células-tronco, como a popula- ção de ES ou iPSC após a etapa de pré-incubação, por exemplo, o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato das célu- las com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 1 minuto a cerca de 72 horas. Em algumas modalidades, os métodos compre- endem o contato das células com uma composição de LNP pré- incubada por cerca de 1 hora a cerca de 24 horas. Em algumas moda- lidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 4 horas a cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 4 horas a cerca de 12 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 2 horas a cerca de 12 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 6 horas a cerca de 8 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 6 horas a cerca de 24 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 6 horas a cerca de 24 horas. Em al- gumas modalidades, os métodos compreendem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por cerca de 4 horas a cerca de 12 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreen- dem o contato das células com uma composição de LNP pré-incubada por pelo menos cerca de 0,5, 1, 2, 4, 6, 8, 10 ou 12 horas. Em algumas modalidades, os métodos compreendem uma etapa de lavagem após a etapa de contato. A etapa de lavagem pode compreender meios.
[0037] Em algumas modalidades, os métodos compreendem um MRNA da nuclease Cas. Em algumas modalidades, os métodos com- preendem um mRNA da nuclease Cas de Classe 2. Em algumas mo- dalidades, os métodos compreendem um ácido nucleico de gRNA, como um gRNA. Em certas modalidades, os métodos compreendem pelo menos dois ácidos nucleicos de gRNA. Em modalidades adicio- nais, os métodos compreendem 3 ou mais ácidos nucleicos de gRNA. Em algumas modalidades, um mMRNA, como um mMRNA da nuclease Cas e um gRNA, é formulado em uma única composição de LNP. Em algumas modalidades, os métodos compreendem um mRNA, como um mRNA de nuclease Cas e um ácido nucleico de gRNA que é co- encapsulado na composição de LNP. Em modalidades adicionais, os métodos compreendem um mMRNA e um ácido nucleico de gRNA que são encapsulados separadamente em LNPs. Em certas modalidades, um mRNA é formulado em uma primeira composição de LNP e um ácido nucleico de gRNA é formulado em uma segunda composição de LNP. Em algumas modalidades, a primeira e a segunda composições de LNP são administradas simultaneamente. Em outras modalidades, a primeira e a segunda composições de LNP são administradas se- quencialmente. Em algumas modalidades dos métodosin vitro, a pri- meira e a segunda composições de LNP são combinadas antes da etapa de pré-incubação. Em algumas modalidades, a primeira e a se- gunda composições de LNP são pré-incubadas separadamente.
[0038] Em uma modalidade, uma composição de LNP compreen-
dendo um mRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, pode ser administrada a uma célula ou população de células, como, por exemplo, uma população de HSPC ou HSPC, sepa- radamente da administração de uma composição compreendendo um gRNA. Em uma modalidade, uma composição de LNP compreenden- do um mRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2 e um gRNA, pode ser administrada, como a uma po- pulação de HSPC ou HSPC, separadamente da administração de um ácido nucleico modelo na célula. Em uma modalidade, uma composi- ção de LNP compreendendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, pode ser administrada, como a uma população de HSPC ou HSPC, seguida pela administra- ção sequencial de uma composição de LNP compreendendo um gRNA e, em seguida, um modelo para a célula ou população. Nas mo- dalidades em que uma composição de LNP compreendendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas é administrada antes de uma composição de LNP compreendendo um gRNA, as administrações podem ser separadas por cerca de 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48, ou 72 horas; ou cerca de 1, 2, ou 3 dias.
[0039] Em algumas modalidades dos métodos in vitro descritos neste documento, a população de células-tronco, HSPC ou HSPC po- de ser cultivada in vitro após a transfecção através de LNPs.
[0040] Em algumas modalidades, a população de células-tronco transfectadas, HSPC ou HSPC é expandida em um meio de cultura de células-tronco, como um meio de cultura de HSPC. "Expansão" ou "expandido" no contexto de células refere-se a um aumento no número de um tipo de célula característico, ou tipos de células, de uma popula- ção inicial de células, que pode ou não ser idêntica. As células iniciais usadas para expansão podem não ser as mesmas que as células gera- das a partir da expansão. Algumas modalidades dos métodos in vitro compreendem a cultura da população HSPC ou HSPC em um meio de cultura HSPC. Algumas modalidades compreendem ainda a expansão dos HSPCs em um meio de cultura HSPC que compreende um expansor de células-tronco. Ver, por exemplo, WO2010/059401 (por exemplo, composto do Exemplo 1), WO2013/110198 e WO2017115268, que são incorporados neste documento por referência em relação a compostos adequados para expansão de células-tronco. "Expansor de células- tronco" refere-se a um composto que faz com que células, por exem- plo, HSPCs, HSCs e/ou HPCs proliferem, por exemplo, aumentem em número, a uma taxa mais rápida em relação aos mesmos tipos de cé- lulas ausentes do referido agente. Em um aspecto exemplar, o expan- sor de células-tronco é um inibidor da através do receptor de aril- hidrocarboneto.
[0041] Em modalidades adicionais, os métodos in vitro compreen- dem ainda alterar o meio de cultura entre as etapas de contato e cultu- ra. Em ainda outras modalidades, a etapa de cultura compreende o meio de cultura celular que inclui trombopoietina (Tpo), ligante FIt3 (FIt-3L) e fator de células-tronco humanas (SCF). Em modalidades, o meio de cultura de células inclui ainda interleucina-6 humana (IL-6). Nas modalidades, o meio de cultura de células inclui trombopoietina (Tpo), ligante FIt3 (FIt-3L) e fator de células-tronco humanas (SCF). Carga CRISPR/Cas
[0042] A carga CRISPR/Cas entregue através da formulação de LNP inclui uma molécula de mMRNA que codifica uma proteína de inte- resse. Por exemplo, um mRNA para expressar uma proteína como a proteína fluorescente verde (GFP) e o agente de ligação ao DNA guia- do por RNA, ou uma nuclease Cas, está incluída. São fornecidas com- posições de LNP que incluem um mMRNA de nuclease Cas, por exem- plo, um mRNA da nuclease de Classe 2 que permite a expressão em uma célula de uma proteína Cas9. Além disso, a carga pode conter um ou mais RNAs guia ou ácidos nucleicos que codificam RNAs guia. Um ácido nucleico modelo, por exemplo, para reparo ou recombinação, também pode ser incluído na composição ou um ácido nucleico mode- lo pode ser utilizado nos métodos descritos neste documento.
[0043] "MRNA" refere-se a um polinucleotídeo que não é DNA e que compreende um quadro de leitura aberto que pode ser traduzido em um polipeptídeo (isto é, pode servir como um substrato para tradu- ção por um ribossomo e tRNAs amino-acilados). O MRNA pode com- preender uma estrutura de fosfato-açúcar incluindo resíduos de ribose ou seus análogos, por exemplo, resíduos de 2'-metóxi-ribose. Em al- gumas modalidades, os açúcares de uma estrutura de MRNA fosfato- açúcar consistem essencialmente em resíduos de ribose, resíduos de 2'-metóxi-ribose ou uma combinação destes. Em geral, os MRNAs não contêm uma quantidade substancial de resíduos de timidina (por exemplo, O resíduos ou menos que 30, 20, 10, 5, 4, 3 ou 2 resíduos de timidina; ou menos que 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5%, 0,2% ou 0,1% de timidina). Um mRNA pode conter uridinas modificadas em algumas ou todas as suas posições de uridina. Sistemas Nuclease CRISPR/Cas
[0044] Um componente das formulações divulgadas é um mRNA que codifica o agente de ligação ao DNA guiado por RNA, como uma nuclease Cas.
[0045] Como usado neste documento, um "agente de ligação a DNA guiado por RNA" significa um polipeptídeo ou complexo de poli- peptídeos com atividade de ligação a RNA e DNA, ou uma subunidade de ligação a DNA desse complexo, em que a atividade de ligação a DNA é específica da sequência e depende da sequência do RNA. Agentes de ligação a DNA guiados por RNA exemplificativos incluem cleavases/nickases Cas e suas formas inativadas ("agentes de ligação ao DNA dCas"). "Nuclease Cas", como utilizado neste documento,
abrange agentes de ligação ao DNA cleavases, nickases Cas e dCas. Os agentes de ligação ao DNA cleavases/nickases e dCas incluem um complexo Csm ou Cmr de um sistema CRISPR tipo Ill, a subunidade Cas10, Csm1i ou Cmr2, um complexo em Cascata de um sistema CRISPR tipo |, a subunidade Cas3 e a nucleases Cas de Classe 2. Como utilizado neste documento, uma "nuclease Cas de Classe 2" é um polipeptídeo de cadeia única com atividade de ligação ao DNA guiada por RNA. As nucleases Cas de Classe 2 incluem cleava- ses/nickases Cas da Classe 2 (por exemplo, variantes H840A, D10A ou N863A), que possuem ainda atividade de cleavases ou nickases de DNA guiada por RNA e agentes de ligação de DNA dCas de Classe 2, nas quais a atividade da cleavases/nickases é inativado. As nucleases Cas de Classe 2 incluem, por exemplo, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (por exemplo, variantes N497A, R661A, Q695A, Q926A), HypaCas9 (por exemplo, variantes N692A, M694A, Q695A, H698A), eSPCas9 (1,0) (por exemplo, variantes K810A, K1003A, R1060A) e eSPCas9 (1,1) (por exemplo, variantes K848A, K1003A, R1060A) e suas modificações. A proteína Cpf1, Zetsche et al., Cel/l, 163: 1-13 (2015), é homóloga a Cas9 e contém um domínio de nu- clease semelhante a RuvC. As sequências Cpf1i de Zetsche são incor- poradas por referência na sua totalidade. Veja, Por exemplo, Zetsche, Tabelas S1 e S3. Ver, , Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).
[0046] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA é uma nuclease Cas de Classe 2. Em algumas moda- lidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA possui atividade de cleavase, que também pode ser referida como atividade de endo- nuclease de fita dupla. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA compreende uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2 (que pode ser, por exemplo, uma nuclease
Cas do Tipo Il, V ou VI). As nucleases Cas de Classe 2 incluem, por exemplo, proteínas Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2 e C2c3 e suas modifica- ções. Exemplos de nucleases Cas9 incluem aquelas dos sistemas CRISPR do tipo |l de S. pyogenes, S. aureuse outros procariontes (ver, por exemplo, a lista no próximo parágrafo) e versões modificadas (por exemplo, manipulado ou mutantes). Ver, por exemplo, US2016/ 0312198 A1; US 2016/0312199 A1. Outros exemplos de nucleases Cas incluem um complexo Csm ou Cmr de um sistema CRISPR tipo Ill ou a sua subunidade Cas10, Csm1 ou Cmr2; e um complexo Cascade de um sistema CRISPR tipo | ou a sua subunidade Cas3. Em algumas modalidades, a nuclease Cas pode ser de um sistema Tipo IIA, Tipo IIB ou Tipo IIC. Para discussão de vários sistemas CRISPR e nuclea- ses Cas, ver, por exemplo, Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467- 477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015).
[0047] As espécies exemplares não limitantes das quais a nucle- ase de Cas pode ser derivada incluem Streptococcus pyogenes, Strep- tococcus thermophilus, Streptococcus sp., Staphylococcus aureus, Lis- teria innocua, Lactobacillus gasseri, Francisella novicida, Wolinella succinogenes, Sutterella wadsworthensisó, Gammaproteobacterium, Neisseria meningitidisó, Campylobacter jejuni, Pasteurella multocida, Fibrobacter succinogene, Rhodospirilum rubrum, Nocardiopsis das- sonvillei, Streptomyces pristinaespiralis, Streptomyces viridochromo- genes, Streptomyces viridochromogenes, Streptosporangium roseum, Streptosporangium roseum, Alicyclobacillus acidocaldarius, Bacillus pseudomycoides, Bacillus selenitireducens, Exiguobacterium sibiricum, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus buch- neri, Treponema denticola, Microscilla marina, Burkholderiales bacte- rium, Polaromonas naphthalenivorans, Polaromonas sp., Crocosphae- ra watsonii, Cyanothece sp., Microcystis aeruginosa, Synechococcus sp., Acetohalobium arabaticum, Ammonifex degensii, Caldicelu- losiruptor becscii, Candidatus Desulforudis, Clostridium botulinum, Clostridium difficile, Finegoldia magna, Natranaerobius thermophilus, Pelotomaculum thermopropionicum, Acidithiobacillus caldus, Acidithio- bacillus ferrooxidans, Allochromatium vinosum, Marinobacter sp., Ni- trosococcus halophilus, Nitrosococcus watsoni, Pseudoalteromonas haloplanktis, Ktedonobacter racemifer, Methanohalobium evestigatum, Anabaena variabilisó, Nodularia spumigena, Nostoc sp., Arthrospira maxima, Arthrospira platensis, Arthrospira sp., Lyngbya sp., Microcole- us chthonoplastes, Oscillatoria sp., Petrotoga mobilis, Thermosipho africanus, Streptococcus pasteurianus, Neisseria cinerea, Campylo- bacter lari, Parvibaculum lavamentivorans, Corynebacterium diphthe- ria, Acidaminococcus sp., Lachnospiraceae bacterium ND2006, e Acaryochloris marina.
[0048] Em algumas modalidades, a nuclease Cas é a nuclease Cas9 de Streptococcus pyogenes. Em algumas modalidades, a nu- clease Cas é a nuclease Cas9 de Streptococcus thermophilus. Em al- gumas modalidades, a nuclease Cas é a nuclease Cas9 de Neisseria meningitidis. Em algumas modalidades, a nuclease Cas é a nuclease Cas9 é de Staphylococcus aureus. Em algumas modalidades, a nu- clease Cas é a nuclease Cpf1 de Francisella novicida. Em algumas modalidades, a nuclease Cas é a nuclease Cpf1i de Acidaminococcus sp. Em algumas modalidades, a nuclease Cas é a nuclease Cpf1i da bactéria Lachnospiraceae ND2006. Em outras modalidades, a nu- clease Cas é a nuclease Cpfi de Francisella tularensis, bactéria Lachnospiraceae, Butyrivibrio proteoclasticus, bactéria Peregrinibacte- ria, bactéria Parcubacteria, Smithella, Acidaminococcus, Candidatus Methanoplasma termitum, Eubacterium previraens, Moraxella bovoculi, Moraxella bovoculi ou Porphyromonas macacae. Em certas modalida- des, a nuclease Cas é uma nuclease Cpf1 de um Acidaminococcus ou
Lachnospiraceae.
[0049] O Cas9 do tipo selvagem possui dois domínios de nu- clease: RuvC e HNH. O domínio RuvC quebra a fita de DNA não alvo e o domínio HNH quebra a fita alvo de DNA. Em algumas modalida- des, a nuclease Cas9 compreende mais de um domínio RuvC e/ou mais de um domínio HNH. Em algumas modalidades, a nuclease Cas9 é um Cas9 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, o Cas9 é ca- paz de induzir uma quebra de fita dupla no DNA alvo. Em certas mo- dalidades, a nuclease Cas pode clivar dsDNA, pode clivar uma fita de dsDNA ou pode não ter atividade de cleavase ou nickase de DNA. Uma sequência de aminoácidos Cas9 exemplar é fornecida como SEQ ID NO: 3. Uma sequência exemplar de ORF mRNA de Cas9, que inclui códons de iniciação e parada, é fornecida como SEQ ID NO: 4. Uma sequência de codificação de MRNA Cas9 exemplar, adequada para inclusão em uma proteína de fusão, é fornecida como SEQ ID NO: 10.
[0050] Em algumas modalidades, são utilizadas nucleases quimé- ricas de Cas, em que um domínio ou região da proteína é substituído por uma porção de uma proteína diferente. Em algumas modalidades, um domínio de nuclease Cas pode ser substituído por um domínio de uma nuclease diferente, como Fok1. Em algumas modalidades, uma nuclease Cas pode ser uma nuclease modificada.
[0051] Em outras modalidades, a nuclease Cas pode ser de um sistema CRISPR/Cas Tipo |. Em algumas modalidades, a nuclease Cas pode ser um componente do complexo Cascade de um sistema CRISPR/Cas Tipo |. Em algumas modalidades, a nuclease Cas pode ser uma proteína Cas3. Em algumas modalidades, a nuclease Cas pode ser de um sistema CRISPR/Cas Tipo Ill. Em algumas modalida- des, a nuclease Cas pode ter uma atividade de clivagem de RNA.
[0052] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA possui atividade de nickase de fita simples, ou seja,
pode cortar uma fita de DNA para produzir uma quebra de fita única, também conhecida como "nick." Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA compreende uma nickase Cas. Uma nickase é uma enzima que cria um nick no dsDNA, ou seja, corta uma fita, mas não a outra da dupla hélice do DNA. Em algumas moda- lidades, uma nickase Cas é uma versão de uma nuclease Cas (por exemplo, uma nuclease Cas discutida acima) na qual um sítio ativo endonucleolítico é inativado, por exemplo, por uma ou mais alterações (por exemplo, mutações pontuais) em um domínio catalítico. Ver, por exemplo, Pat. US Nº. 8.889.356 para discussão de nickases Cas e al- terações exemplares no domínio catalítico. Em algumas modalidades, uma nickase Cas como uma nickase Cas9 tem um domínio RuvC ou HNH inativado.
[0053] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA é modificado para conter apenas um domínio de nu- clease funcional. Por exemplo, a proteína do agente pode ser modifi- cada de modo que um dos domínios da nuclease seja mutado ou completamente ou parcialmente deletado para reduzir sua atividade de clivagem de ácido nucleico. Em algumas modalidades, uma nickase é usada tendo um domínio RuvC com atividade reduzida. Em algumas modalidades, uma nickase é usada tendo um domínio RuvC inativo. Em algumas modalidades, uma nickase é usada tendo um domínio HNH com atividade reduzida. Em algumas modalidades, uma nickase é usada tendo um domínio HNH inativo.
[0054] Em algumas modalidades, um aminoácido conservado den- tro de um domínio de nuclease da proteína Cas é substituído para re- duzir ou alterar a atividade da nuclease. Em algumas modalidades, uma nuclease Cas pode compreender uma substituição de aminoáci- dos no domínio da nuclease RuvC ou do tipo RuvC. Substituições de aminoácidos exemplares no domínio nuclease RuvC ou tipo RuvC in-
cluem D10A (com base na proteína Cas9 de S. pyogenes ). Ver, Por exemplo, Zetsche et al. (2015) Cell 22 de outubro: 163 (3): 759-771. Em algumas modalidades, a nuclease Cas pode compreender uma subs- tituição de aminoácidos no domínio da nuclease HNH ou do tipo HNH. Substituições de aminoácidos exemplares no domínio nuclease HNH ou do tipo HNH incluem E762A, H840A, N863A, H983A e D986A (com base na proteína Cas9 de S. pyogenes). Ver, Por exemplo, Zetsche et al. (2015). Outras substituições de aminoácidos exemplares incluem D917A, E1006A e D1255A (com base na sequência de Francisella novicida U112 Cpf1 (FnCpf1) (UniProtKB - AOQ7Q2 (CPF1 FRATN)).
[0055] Em algumas modalidades, um mMRNA que codifica uma nickase é fornecido em combinação com um par de RNAs guia que são complementares às fitas antisense e sense da sequência alvo, respectivamente. Nesta modalidade, os RNAs de guia direcionam a nickase para uma sequência alvo e introduzem um DSB gerando um nick em fitas opostas da sequência alvo (isto é, duplo corte). Em algu- mas modalidades, o uso de duplo corte pode melhorar a especificida- de e reduzir os efeitos fora do alvo. Em algumas modalidades, uma nickase é usada junto com dois RNAs guia separados, direcionando fitas opostas de DNA, para produzir uma nick dupla no DNA alvo. Em algumas modalidades, uma nickase é usada junto com dois RNAs guia separados que são selecionados para estarem próximos para produzir uma nick dupla no DNA alvo.
[0056] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA carece de atividade de cleavase e nickase. Em algu- mas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA com- preende um polipeptídeo de ligação ao DNA dCas. Um polipeptídeo dCas possui atividade de ligação ao DNA, enquanto essencialmente carece de atividade catalítica (cleavase/nickase). Em algumas modali- dades, o polipeptídeo dCas é um polipeptídeo dCas9. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA sem ativi- dade de cleavase e nickase ou o polipeptídeo de ligação a DNA é uma versão de uma nuclease Cas (por exemplo, uma nuclease Cas discutida acima) na qual seus sítios ativos endonucleolíticos são inativados, por exemplo, por uma ou mais alterações (por exemplo, mutações pontuais) em seus domínios catalíticos. Ver, por exemplo, US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1.
[0057] Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA compreende um ou mais domínios funcionais heteró- logos (por exemplo, é ou compreende um polipeptídeo de fusão).
[0058] Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo pode facilitar o transporte do agente de ligação ao DNA guiado por RNA para o núcleo de uma célula. Por exemplo, o domínio funcional heterólogo pode ser um sinal de localização nuclear (NLS). Em algu- mas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com 1-10 NLS(s). Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com 1-5 NLS(s). Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com um NLS. Quando um NLS é usado, o NLS pode ser ligado no terminal N ou no terminal C da sequência do agente de ligação ao DNA guiada por RNA. Também pode ser inserido na se- quência do agente de ligação ao DNA guiado por RNA. Em outras mo- dalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fun- dido com mais de um NLS. Em algumas modalidades, o agente de li- gação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com 2, 3, 4 ou 5 NLSs. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com dois NLSs. Em certas circunstâncias, os dois NLSs podem ser os mesmos (Por exemplo, dois SV40 NLSs) ou diferentes. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA é fundido a duas sequências SV40 NLS ligadas no terminal carbóxi. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com dois NLSs, um ligado no terminal N e um no terminal C. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido com 3 NLSs. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser fundido sem NLS. Em algumas modalidades, o NLS pode ser uma sequência monopartida, como, Por exemplo, o SV40 NLS, PKK- KRKV ou PKKKRRV. Em algumas modalidades, o NLS pode ser uma sequência bipartida, como o NLS da nucleoplasmina, KRPAATK- KAGQAKKKK. Em uma modalidade específica, um único PKKKRKV NLS pode ser ligado no terminal C do agente de ligação ao DNA guia- do por RNA. Um ou mais ligantes são opcionalmente incluídos no sítio de fusão.
[0059] Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo pode ser capaz de modificar a meia-vida intracelular do agente de li- gação ao DNA guiado por RNA. Em algumas modalidades, a meia- vida do agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser aumenta- da. Em algumas modalidades, a meia-vida do agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser reduzida. Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo pode ser capaz de aumentar a estabili- dade do agente de ligação ao DNA guiado por RNA. Em algumas mo- dalidades, o domínio funcional heterólogo pode ser capaz de reduzir a estabilidade do agente de ligação ao DNA guiado por RNA. Em algu- mas modalidades, o domínio funcional heterólogo pode atuar como um peptídeo sinal para degradação de proteínas. Em algumas modalida- des, a degradação da proteína pode ser mediada por enzimas proteolí- ticas, como, por exemplo, proteassomas, proteases lisossômicas ou proteases de calpaína. Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo pode compreender uma sequência PEST. Em algumas modalidades, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA pode ser modificado pela adição de ubiquitina ou uma cadeia de polubiquitina. Em algumas modalidades, a ubiquitina pode ser uma proteína do tipo ubiquitina (UBL). Exemplos não limitativos de proteínas do tipo ubiqui- tina incluem modificador pequeno do tipo ubiquitina (SUMO), proteína reativa cruzada da ubiquitina (UCRP, também conhecida como gene estimulado por interferon (ISG15)), modificador 1 relacionado à ubi- quitina (URM1), proteína 8 desregulada no desenvolvimento expressa em células precursoras dos neurônios (NEDD8, também chamada Rub1 no S. cerevisiae), associada ao antígeno leucocitário humano F (FAT10O), autofagia-8 (ATG8) e -12 (ATG12), Fau proteína do tipo ubi- quitina (FUB1), UBL ancorado na membrana (MUB), modificador 1 de dobra de ubiquitina (UFM1) e proteína 5 do tipo de ubiquitina (UBL5).
[0060] Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo pode ser um domínio marcador. Exemplos não limitativos de domínios marcadores incluem proteínas fluorescentes, marcadores de purifica- ção, marcadores epítopos e sequências de genes repórteres. Em al- gumas modalidades, o domínio marcador pode ser uma proteína fluo- rescente. Exemplos não limitativos de proteínas fluorescentes ade- quadas incluem proteínas fluorescentes verdes (Por exemplo, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Esmeralda, Verde Azami, Verde Azami Monomérico, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), proteínas fluorescentes amarelas (Por exemplo, YFP, EYFP, Citrino, Vênus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), proteínas fluorescentes azuis (Por exem- plo, EBFP, EBFP2, Azurita, mKalamal, GFPuv, safira, safira-T), proteí- nas fluorescentes cianas (Por exemplo, ECFP, cerúleo, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), proteínas fluorescentes vermelhas (Por exemplo, mKate, mKate2, mPlum, monômero DsRed, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-monômero, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, egFP611, eRasberry, mStrawberry, Jred) e proteínas fluores- centes laranja (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Komabira-Mono-
mérica-Orange, mTangerina, tudTomato) ou qualquer outra proteína fluorescente adequada. Em outras modalidades, o domínio do marca- dor pode ser uma tag de purificação e/ou uma tag de epítopo. Tags exemplares não limitantes incluem glutationa-S-transferase (GST), proteína de ligação à quitina (CBP), proteína de ligação à maltose (MBP), tioredoxina (TRX), poli(NANP), tag de purificação por afinidade em tandem (TAP), myc, AcV5, AU1, AUS, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, proteína carreadora de biotina carboxil (BCCP), poli-His e calmodulina. Genes repórter exemplares não limitativos in- cluem glutationa-S-transferase (GST), peroxidase de rábano silvestre (HRP), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), beta-galactosidase, beta- glucuronidase, luciferase ou proteínas fluorescentes.
[0061] Em modalidades adicionais, o domínio funcional heterólogo pode direcionar o agente de ligação ao DNA guiado por RNA para uma organela, tipo de célula, tecido ou órgão específico. Em algumas mo- dalidades, o domínio funcional heterólogo pode direcionar o agente de ligação ao DNA guiado por RNA para mitocôndrias.
[0062] Em outras modalidades, o domínio funcional heterólogo po- de ser um domínio efetor. Quando o agente de ligação ao DNA guiado por RNA é direcionado para sua sequência alvo, Por exemplo, quando uma nuclease Cas é direcionada para uma sequência alvo por um gRNA, o domínio efetor pode modificar ou afetar a sequência alvo. Em algumas modalidades, o domínio efetor pode ser escolhido entre um domínio de ligação de ácido nucleico, um domínio de nuclease (por exemplo, um domínio de nuclease não-Cas), um domínio de modifica- ção epigenética, um domínio de ativação transcricional ou um domínio repressor da transcrição. Em algumas modalidades, o domínio funcio- nal heterólogo é uma nuclease, como uma nuclease Fokl. Ver, por exemplo, Pat. US Nº. 9.023.649. Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo é um ativador ou repressor da transcrição. Veja, por exemplo, Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided plat- form for sequence-specific control of gene expression," Cell 152:1173- 83 (2013); Perez-Pinera et al, "RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors", Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering, "Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., "CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes", Cell 154:442-51 (2013). Como tal, o agente de ligação ao DNA guiado por RNA torna-se essencialmente um fator de transcrição que pode ser direcionado para ligar uma sequência alvo desejada usando um RNA guia. Em certas modalidades, o domínio de modificação do DNA é um domínio de metilação, como um domínio de desmetilação ou metil- transferase. Em certas modalidades, o domínio efetor é um domínio de modificação de DNA, como um domínio de edição de base. Em moda- lidades particulares, o domínio de modificação do DNA é um domínio de edição de ácido nucleico que introduz uma modificação específica no DNA, como um domínio desaminase. Ver, Por exemplo, WO 2015/089406; US 2016/0304846. Os domínios de edição de ácido nu- cleico, domínios desaminase e variantes de Cas9 descritos em WO 2015/089406 e US 2016/0304846 são incorporados por referência neste documento.
[0063] A nuclease pode compreender pelo menos um domínio que interage com um RNA guia ("gRNA"). Além disso, a nuclease pode ser direcionada para uma sequência alvo por um gRNA. Nos sistemas de nuclease Cas de Classe 2, o gRNA interage com a nuclease e com a sequência alvo, de modo que direciona a ligação à sequência alvo. Em algumas modalidades, o gRNA fornece a especificidade para a cliva- gem direcionada, e a nuclease pode ser universal e emparelhada com diferentes gRNAs para clivar diferentes sequências alvo. A nuclease Cas de classe 2 pode emparelhar com uma estrutura de andaime de gRNA dos tipos, ortólogos e espécies exemplares listadas acima. Guia RNA (gRNA)
[0064] Em algumas modalidades da presente invenção, a carga para a formulação de LNP inclui pelo menos um gRNA. O gRNA pode guiar a nuclease Cas ou nuclease Cas de Classe 2 para uma sequên- cia alvo em uma molécula de ácido nucleico alvo. Em algumas modali- dades, um gRNA se liga e fornece especificidade de clivagem por uma nuclease Cas de Classe 2. Em algumas modalidades, o gRNA e a nu- clease Cas podem formar uma ribonucleoproteína (RNP), Por exem- plo, um complexo CRISPR/Cas, como um complexo CRISPR/Cas9. Em algumas modalidades, o complexo CRISPR/Cas pode ser um complexo CRISPR/Cas9 Tipo Il. Em algumas modalidades, o comple- xo CRISPR/Cas pode ser um complexo CRISPR/Cas Tipo V, como um complexo Cpf1/RNA guia. As nucleases Cas e os gRNAs cognatos podem ser emparelhados. As estruturas em andaime de gRNA que se emparelham com cada nuclease Cas de Classe 2 variam com o siste- ma CRISPR/Cas específico.
[0065] "RNA guia", "gRNA" e simplesmente "guia" são usados nes- te documento de forma intercambiável para se referir a um cr»RNA (também conhecido como CRISPR RNA) ou à combinação de um crRNA e um trRNA (também conhecido como tracrRNA). O crRNA e o trRNA podem ser associados como uma única molécula de RNA (RNA guia único, saRNA) ou em duas moléculas de RNA separadas (RNA guia duplo, dgRNA). "RNA guia" ou "gRNA" refere-se a cada tipo. O trRNA pode ser uma sequência que ocorre naturalmente ou uma se- quência de trRNA com modificações ou variações em comparação com as sequências que ocorrem naturalmente.
[0066] Como utilizado neste documento, uma "sequência guia" re-
fere-se a uma sequência dentro de um RNA guia que é complementar a uma sequência alvo e funciona para direcionar um RNA guia para uma sequência alvo para ligação ou modificação (por exemplo, cliva- gem) por um agente de ligação DNA guiado por RNA. Uma "sequência guia" também pode ser referida como "sequência alvo" ou "sequência espaçadora." Uma sequência guia pode ter 20 pares de bases de comprimento, por exemplo, no caso de Streptococcus pyogenes (por exemplo, Spy Cas9) e homólogos/ortólogos Cas9 relacionados. Se- quências mais curtas ou mais longas também podem ser usadas como guias, por exemplo, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24- ou 25- nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência alvo está em um gene ou em um cromossomo, por exemplo, e é com- plementar à sequência guia. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade ou identidade entre uma sequência guia e sua se- quência alvo correspondente pode ser de cerca de 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a sequência guia e a região alvo podem ser 100% complementares ou idênticas. Em outras modalidades, a sequência guia e a região alvo podem conter pelo menos uma incompatibilidade. Por exemplo, a se- quência guia e a sequência alvo podem conter 1, 2, 3 ou 4 desencon- tros, em que o comprimento total da sequência alvo é pelo menos 17, 18, 19, 20 ou mais pares de bases. Em algumas modalidades, a se- quência guia e a região alvo podem conter 1-4 incompatibilidades, on- de a sequência guia compreende pelo menos 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência guia e a região alvo podem conter 1, 2, 3 ou 4 desencontros, em que a sequência guia compreende 20 nucleotídeos.
[0067] As sequências alvo das proteínas Cas incluem as fitas posi- tivas e negativas do DNA genômico (ou seja, a sequência fornecida e o complemento inverso da sequência), pois um substrato de ácido nu-
cleico para uma proteína Cas é um ácido nucleico de fita dupla. Por conseguinte, quando se diz que uma sequência guia é "complementar a uma sequência alvo", deve ser entendido que a sequência guia pode direcionar um RNA guia para se ligar ao complemento reverso de uma sequência alvo. Assim, em algumas modalidades, onde a sequência guia liga o complemento reverso de uma sequência alvo, a sequência guia é idêntica a certos nucleotídeos da sequência alvo (por exemplo, a sequência alvo que não inclui o PAM), exceto a substituição de U por T na sequência guia.
[0068] O comprimento da sequência de direcionamento pode de- pender do sistema CRISPR/Cas e dos componentes utilizados. Por exemplo, diferentes nucleases Cas de Classe 2 de diferentes espécies bacterianas têm diferentes comprimentos ótimos de sequência de di- recionamento. Por conseguinte, a sequência de direcionamento pode compreender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais de 50 nucleo- tídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o comprimento da sequência de direcionamento é O, 1, 2, 3, 4 ou 5 nucleotídeos maior ou menor que a sequência guia de um sistema CRISPR/Cas de ocorrên- cia natural. Em certas modalidades, a nuclease Cas e a estrutura em andaime gRNA serão derivados do mesmo sistema CRISPR/Cas. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento pode compre- ender ou consistir em 18-24 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de direcionamento pode compreender ou consistir em 19-21 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a sequência de direciona- mento pode compreender ou consistir em 20 nucleotídeos.
[0069] Em algumas modalidades, o saRNA é um "sagRNA Cas9" capaz de mediar a clivagem de DNA guiada por RNA por uma proteína Cas9. Em algumas modalidades, o saRNA é um "sgRNA Cpf1" capaz de mediar a clivagem de DNA guiada por RNA por uma proteína Cpf1.
Em certas modalidades, o gRNA compreende um RNA crRNA e tracr suficiente para formar um complexo ativo com uma proteína Cas9 e mediar a clivagem de DNA guiada por RNA. Em certas modalidades, o gRNA compreende um crRNA suficiente para formar um complexo ati- vo com uma proteína Cpf1 e mediar a clivagem de DNA guiada por RNA. Veja Zetsche 2015.
[0070] Certas modalidades da invenção também fornecem ácidos nucleicos, Por exemplo, cassetes de expressão, que codificam o gRNA descrito neste documento. Um "ácido nucleico de RNA guia" é usado neste documento para se referir a um RNA guia (Por exemplo, um sgRNA ou um dgRNA) e um cassete de expressão de RNA guia, que é um ácido nucleico que codifica um ou mais RNAs guia.
[0071] Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode ser uma molécula de DNA. Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codifica um crRNA. Em algumas modalidades, a sequência de nucleotídeos que codifica o crRNA compreende uma sequência de direcionamento flanqueada por toda ou uma porção de uma sequência de repetição de um sistema CRISPR/Cas de ocorrência natural. Em algumas modalidades, o ácido nucleico pode compreender uma sequência de nucleotídeos que codi- fica um RNA tracr. Em algumas modalidades, o crRNA e o RNA tracr podem ser codificados por dois ácidos nucleicos separados. Em outras modalidades, o cr>RNA e o RNA tracr podem ser codificados por um único ácido nucleico. Em algumas modalidades, o cr»RNA e o RNA tracr podem ser codificados por cadeias opostas de um único ácido nucleico. Em outras modalidades, o cr»RNA e o RNA tracr podem ser codificados pela mesma fita de um único ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do gRNA codifica um sgaRNA. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico do gRNA codifica um saRNA da nuclease Cas9. Nas modalidades que se seguem, o ácido nucleico do gRNA codifica um saRNA da nuclease de Cpf1.
[0072] A sequência nucleotídica que codifica o RNA guia pode ser operacionalmente ligada a pelo menos uma sequência de controle transcricional ou regulatória, como um promotor, um 3-UTR ou um 5"- UTR. Em um exemplo, o promotor pode ser um promotor de tRNA, por exemplo, tRNAbJ* ou uma quimera de tRNA. Veja Mefferd et al., RNA. 2015 21:1683-9; Scherer et al., Nucleic Acids Res. 2007 35: 2620
2628. Em certas modalidades, o promotor pode ser reconhecido pela RNA polimerase III (Pol III). Exemplos não limitativos de promotores de Pol Ill também incluem promotores U6 e H1. Em algumas modalida- des, a sequência nucleotídica que codifica o RNA guia pode ser operaci- onalmente ligada a um camundongo ou promotor U6 humano. Em algu- mas modalidades, o ácido nucleico do gRNA é um ácido nucleico modifi- cado. Em certas modalidades, o ácido nucleico de gRNA inclui um nu- cleosídeo ou nucleotídeo modificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do gRNA inclui uma modificação na extremidade 5', por exem- plo, um nucleosídeo ou nucleotídeo modificado para estabilizar e impedir a integração do ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ácido nu- cleico de gRNA compreende um DNA de fita dupla tendo uma modifica- ção na extremidade 5' em cada fita. Em certas modalidades, o ácido nu- cleico do gRNA inclui um didesóxi-T invertido ou um nucleosídeo ou nu- cleotídeo abásico invertido como a modificação da extremidade 5'. Em algumas modalidades, o ácido nucleico do gRNA inclui um marcador como biotina, destiobioteno-TEG, digoxigenina e marcadores fluores- centes, incluindo, por exemplo, FAM, ROX, TAMRA e AlexaFluor.
[0073] Em certas modalidades, mais de um ácido nucleico de gRNA, como um gRNA, pode ser usado com um sistema de nuclease CRISPR/Cas. Cada ácido nucleico de gRNA pode conter uma sequên- cia de direcionamento diferente, de modo que o sistema CRISPR/Cas cliva mais de uma sequência alvo. Em algumas modalidades, um ou mais gRNAs podem ter propriedades iguais ou diferentes, como atividade ou estabilidade dentro de um complexo CRISPR/Cas. Onde mais de um gRNA é usado, cada gRNA pode ser codificado no mesmo ou em dife- rentes ácidos nucleicos de gRNA. Os promotores utilizados para condu- zir a expressão de mais de um gRNA podem ser iguais ou diferentes. RNAs modificados
[0074] Em certas modalidades, as composições de LNP compre- endem RNAs modificados.
[0075] Os nucleosídeos ou nucleotídeos modificados podem estar presentes em um RNA, por exemplo, um gRNA ou mRNA. Um gRNA ou mRNA compreendendo um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados, por exemplo, é chamado de RNA "modificado" para des- crever a presença de um ou mais componentes ou configurações de ocorrência não naturais e/ou naturais que são usados em vez de ou além disso aos resíduos canônicos A, G, C e U. Em algumas modali- dades, um RNA modificado é sintetizado com um nucleosídeo ou nu- cleotídeo não canônico, aqui chamado "modificado."
[0076] Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir um ou mais dos seguintes: (i) alteração, Por exemplo, substituição, de um ou de ambos os oxigênios de fosfato não-ligados e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação na ligação da estrutura prin- cipal fosfodiéster (uma modificação da estrutura principal exemplar); (ii) alteração, Por exemplo, substituição, de um constituinte do açúcar ribose, Por exemplo, do hidroxil 2' no açúcar ribose (uma modificação exemplar no açúcar); (iii) substituição por atacado da fração fosfato por ligantes "defosfo" (uma modificação exemplar da estrutura principal); (iv) modificação ou substituição de uma nucleobase de ocorrência na- tural, incluindo uma nucleobase não canônica (uma modificação de base exemplar); (v) substituição ou modificação da estrutura principal ribose-fosfato (uma modificação exemplar da estrutura principal); (vi)
modificação da extremidade 3' ou da extremidade 5' do oligonucleotí- deo, Por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma fração, cap ou ligante (tais mo- dificações de cap 3' ou 5' podem compreender uma modificação de açúcar e/ou estrutura principal); e (vii) modificação ou substituição do açúcar (uma modificação exemplar do açúcar). Certas modalidades compreendem uma modificação na extremidade 5' de um mMRNA, gRNA ou ácido nucleico. Certas modalidades compreendem uma mo- dificação na extremidade 3' de um MRNA, gRNA ou ácido nucleico. Um RNA modificado pode conter modificações nas extremidades 5' e 3'. Um RNA modificado pode conter um ou mais resíduos modificados em locais não terminais. Em certas modalidades, um gRNA inclui pelo menos um resíduo modificado. Em certas modalidades, um mRNA in- clui pelo menos um resíduo modificado.
[0077] Como utilizado neste documento, uma primeira sequência é considerada "compreendendo uma sequência com pelo menos X% de identidade para" uma segunda sequência se um alinhamento da pri- meira sequência com a segunda sequência mostrar que X% ou mais das posições da segunda sequência em sua totalidade é correspondi- da pela primeira sequência. Por exemplo, a sequência AAGA compre- ende uma sequência com 100% de identidade com a sequência AAG porque um alinhamento daria 100% de identidade, pois existem cor- respondências para todas as três posições da segunda sequência. As diferenças entre RNA e DNA (geralmente a troca de uridina por timidi- na ou vice-versa) e a presença de análogos de nucleosídeos, como uridinas modificadas, não contribuem para diferenças de identidade ou complementaridade entre polinucleotídeos, desde que os nucleotídeos relevantes (como timidina, uridina ou uridina modificada) tenham o mesmo complemento (por exemplo, adenosina para toda timidina, uri- dina ou uridina modificada; outro exemplo é citosina e 5-metilcitosina,
ambas com guanosina ou guanosina modificada como complemento). Assim, por exemplo, a sequência 5:-AXG em que X é qualquer uridina modificada, como pseudouridina,y, Ni-metil pseudouridina ou 5- metoxiuridina, é considerada 100% idêntica à AUG, pois ambas são perfeitamente complementares à mesma sequência (5-CAU). Exem- plos de algoritmos de alinhamento são os algoritmos Smith-Waterman e Needleman-Wunsch, que são bem conhecidos na técnica. Um ver- sado na técnica entenderá que escolha de algoritmo e configurações de parâmetro é apropriada para um determinado par de sequências a serem alinhadas; para sequências de comprimento e identidade ge- ralmente semelhantes e esperadas >50% para aminoácidos ou >75% para nucleotídeos, o algoritmo Needleman-Wunsch com configurações padrão da interface do algoritmo Needleman-Wunsch fornecida pelo EBI no www.ebi.ac.uk servidor web é geralmente apropriado.
mRNAs
[0078] Em algumas modalidades, uma composição ou formulação divulgada compreende um mRNA compreendendo um quadro de leitu- ra aberto (ORF), tal como, por exemplo um ORF que codifica um agente de ligação a DNA guiado por RNA, como uma nuclease Cas ou nuclease Cas de Classe 2, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um mMRNA compreendendo um ORF que codifi- ca um agente de ligação a DNA guiado por RNA, como uma nuclease Cas ou nuclease Cas de Classe 2, é fornecido, usado ou administrado. Em algumas modalidades, o ORF que codifica um agente de ligação ao DNA guiado por RNA é um "agente de ligação ao DNA guiado por RNA modificado ORF" ou simplesmente um "ORF modificado", que é usado como abreviação para indicar que o ORF é modificado em um ou mais das seguintes maneiras: (1) o ORF modificado tem um conte- údo de uridina que varia de seu conteúdo mínimo de uridina a 150% do conteúdo mínimo de uridina; (2) o ORF modificado possui um con-
teúdo de dinucleotídeo de uridina que varia desde seu conteúdo míni- mo de dinucleotídeo de uridina até 150% do conteúdo mínimo de dinu- cleotídeo de uridina; (3) o ORF modificado possui pelo menos 90% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NOs: 1, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ou 66; (4) o ORF mo- dificado consiste em um conjunto de códons dos quais pelo menos 75% dos códons são códons mínimos de uridina para um dado amino- ácido, por exemplo, códons com o menor número de uridinas (geral- mente O ou 1, exceto para um códon para fenilalanina, onde o códon mínimo de uridina possui 2 uridinas); ou (5) o ORF modificado com- preende pelo menos uma uridina modificada. Em algumas modalida- des, o ORF modificado é modificado em pelo menos duas, três ou quatro das maneiras anteriores. Em algumas modalidades, o ORF modificado compreende pelo menos uma uridina modificada e é modi- ficado em pelo menos um, dois, três ou todos os itens (1)-(4) acima.
[0079] "Uridina modificada" é usado neste documento para se re- ferir a um nucleosídeo diferente da timidina com os mesmos aceitado- res de ligação de hidrogênio que a uridina e uma ou mais diferenças estruturais da uridina. Em algumas modalidades, uma uridina modificada é uma uridina substituída, isto é, uma uridina na qual um ou mais substi- tuintes não prótons (por exemplo, alcóxi, como metóxi) tomam o lugar de um próton. Em algumas modalidades, uma uridina modificada é pseu- douridina. Em algumas modalidades, uma uridina modificada é uma pseudouridina substituída, ou seja, uma pseudouridina na qual um ou mais substituintes não prótons (por exemplo, alquil, como metil) tomam o lugar de um próton. Em algumas modalidades, uma uridina modificada é uma uridina substituída, pseudouridina ou pseudouridina substituída.
[0080] "Posição da uridina", conforme utilizado neste documento, refere-se a uma posição em um polinucleotídeo ocupado por uma uri- dina ou uma uridina modificada. Assim, por exemplo, um polinucleotí-
deo no qual "100% das posições de uridina são uridinas modificadas" contém uma uridina modificada em todas as posições que seriam uri- dinas em um RNA convencional (onde todas as bases são bases pa- drão A, U, C ou G) da mesma sequência. A menos que indicado de outra forma, um U em uma sequência polinucleotídica de uma tabela de sequências ou listagem de sequências, ou que acompanha, esta descrição pode ser uma uridina ou uma uridina modificada. Tabela 1. Códons mínimos de uridina [2 JAmreásido — Tesdonminimedeuiáia — [E [asus — GRE
REA AEREAS
[0081] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o ORF mo- dificado pode consistir em um conjunto de códons dos quais pelo me- nos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% dos códons são códons listados na Tabela de códons mínimos de uridina. Em qualquer uma das modalidades anteriores, o ORF modificado pode compreen- der uma sequência com pelo menos 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com qualquer uma das SEQ ID NO: 1,4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ou 66.
[0082] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o ORF mo- dificado pode ter um conteúdo de uridina que varia de seu conteúdo mínimo de uridina a 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% ou 101% do conteúdo míni- mo de uridina.
[0083] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o ORF mo- dificado pode ter um conteúdo de dinucleotídeo de uridina que varia de seu conteúdo mínimo de dinucleotídeo de uridina a 150%, 145%, 140%, 135%, 130%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 104%, 103%, 102% ou 101% do teor mínimo de dinucleotídeo de uridina.
[0084] Em qualquer uma das modalidades anteriores, a ORF mo- dificada pode compreender uma uridina modificada pelo menos em uma, uma pluralidade de, ou todas as posições de uridina. Em algu- mas modalidades, a uridina modificada é uma uridina modificada na posição 5, por exemplo, com um halogênio, metil ou etila. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma pseudouridina modificada na posição 1, por exemplo, com um halogênio, metil ou etila. A uridina modificada pode ser, por exemplo, pseudouridina, N1i-metil-pseudou- ridina, 5-metoxiuridina, 5-iodouridina ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a uridina modificada é 5-metoxiuridina. Em al- gumas modalidades, a uridina modificada é 5-iodouridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é pseudouridina. Em algumas mo-
dalidades, a uridina modificada é N1-metil-pseudouridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de pseudouridi- na e Ni-metil-pseudouridina. Em algumas modalidades, a uridina mo- dificada é uma combinação de pseudouridina e 5-metoxiuridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de N1- metil pseudouridina e 5S-metoxiuridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de 5-iodouridina e Ni-metil- pseudouridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de pseudouridina e 5-metoxiuridina. Em algumas modali- dades, a uridina modificada é uma combinação de 5-iodouridina e 5- metoxiuridina.
[0085] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% das posições de uridina em um MRNA de acordo com a descrição são uridinas modificadas. Em algu- mas modalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55- 65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um mRNA de acordo com a descrição são uridinas modificadas, por exemplo, 5-metoxiuridina, 5-iodouridina, Ni-metil pseudouridina, pseudouridina ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75- 85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um mRNA de acordo com a descrição são 5-metoxiuridina. Em algumas modalida- des, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um mRNA de acordo com a descrição são pseudouridina. Em algumas modalida- des, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um mRNA de acordo com a descrição são N1i-metil pseudouridina. Em algumas modalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%,
65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um MRNA de acordo com a descrição são 5-iodouridina. Em algumas mo- dalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65- 75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um mMRNA de acordo com a descrição são 5-metoxiuridina, e o restante é N1-metil pseudouridina. Em algumas modalidades, 10% -25%, 15- 25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um mRNA de acordo com a descrição são 5-iodouridina e o restante são N1i-metil pseudouridina.
[0086] Em qualquer uma das modalidades anteriores, o ORF mo- dificado pode compreender um conteúdo reduzido de dinucleotídeo de uridina, como o menor conteúdo possível de dinucleotídeo de uridina (UU), por exemplo, um ORF que (a) use um códon mínimo de uridina (como discutido acima) em todas as posições e (b) codifica a mesma sequência de aminoácidos que o ORF fornecido. O conteúdo de dinu- cleotídeo de uridina (UU) pode ser expresso em termos absolutos co- mo a enumeração de dinucleotídeos de UU em um ORF ou em uma base de taxa como a porcentagem de posições ocupadas pelas uridi- nas de dinucleotídeos de uridina (por exemplo, AUUAU teria um con- teúdo de dinucleotídeo de uridina de 40% porque 2 de 5 posições são ocupadas pelas uridinas de um dinucleotídeo de uridina). Os resíduos de uridina modificados são considerados equivalentes às uridinas com o objetivo de avaliar o conteúdo mínimo de dinucleotídeo de uridina.
[0087] Em algumas modalidades, o MRNA compreende pelo me- nos uma UTR de um mRNA de mamífero expresso, como um mMRNA expresso constitutivamente. Um mRNA é considerado constitutivamen- te expresso em um mamífero se for continuamente transcrito em pelo menos um tecido de um mamífero adulto saudável. Em algumas mo- dalidades, o MRNA compreende um 5' UTR, 3' UTR ou 5' e 3' UTRs de um RNA de mamífero expresso, tal como um mRNA de mamífero ex-
presso constitutivamente. O mRNA da actina é um exemplo de um mMRNA expresso constitutivamente.
[0088] Em algumas modalidades, o MRNA compreende pelo me- nos uma UTR da hidroxisteroide 17-beta desidrogenase 4 (HSD17B4 ou HSD), por exemplo, uma 5' UTR da HSD. Em algumas modalida- des, o MRNA compreende pelo menos uma UTR de um mRNA de globina, por exemplo, mRNA de alfa globina humana (HBA), mMRNA de beta globina humana (HBB) ou mRNA de Xenopus laevis beta globina (XBG). Em algumas modalidades, o MRNA compreende um 5' UTR, 3' UTR ou 5' e 3! UTRs de um mRNA de globina, como HBA, HBB ou XBG. Em algumas modalidades, o MRNA compreende uma 5' UTR do hormônio de crescimento bovino, citomegalovírus (CMV), Hba-a1 de camundongo, HSD, um gene da albumina, HBA, HBB ou XBG. Em al- gumas modalidades, o MRNA compreende uma 3' UTR do hormônio de crescimento bovino, citomegalovírus, Hba-a1 de camundongo, HSD, um gene de albumina, HBA, HBB ou XBG. Em algumas modali- dades, o MRNA compreende 5' e 3' UTRs do hormônio de crescimento bovino, citomegalovírus, Hba-a1 de camundongo, HSD, um gene da albumina, HBA, HBB, XBG, proteína de choque térmico 90 (Hsp90), gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH), beta-actina, alfa-tubu- lina, proteína tumoral (p53) ou receptor do fator de crescimento epi- dérmico (EGFR).
[0089] Em algumas modalidades, o MRNA compreende 5' e 3' UTRs que são da mesma fonte, por exemplo, um mRNA expressado constitutivamente como actina, albumina ou globina como HBA, HBB ou XBG.
[0090] Em algumas modalidades, o MRNA não compreende uma 5' UTR, por exemplo, não há nucleotídeos adicionais entre o cap 5' e o códon de iniciação. Em algumas modalidades, o MRNA compreende uma sequência de Kozak (descrita abaixo) entre o cap 5' e o códon de iniciação, mas não possui nenhuma 5' UTR adicional. Em algumas modalidades, o mMRNA não compreende uma 3' UTR, por exemplo, não há nucleotídeos adicionais entre o códon de parada e a tail poli-A.
[0091] Em algumas modalidades, o MRNA compreende uma se- quência de Kozak. A sequência de Kozak pode afetar o início da tra- dução e o rendimento geral de um polipeptídeo traduzido de um mMRNA. Uma sequência de Kozak inclui um códon de metionina que pode funcionar como o códon de iniciação. Uma sequência Kozak mí- nima é NNNRUGN em que pelo menos um dos seguintes é verdadei- ro: o primeiro N é A ou G e o segundo N é G. No contexto de uma se- quência nucleotídica, R significa uma purina (A ou G). Em algumas modalidades, a sequência de Kozak é RNNRUGN, NNNRUGG, RNN- RUGG, RNNAUGN, NNNAUGG ou RNNAUGG. Em algumas modali- dades, a sequência de Kozak é rccRUGg com zero incompatibilidades ou com até uma ou duas incompatibilidades para posições minúsculas. Em algumas modalidades, a sequência de Kozak é rccAUGg com zero incompatibilidades ou com até uma ou duas incompatibilidades para posições minúsculas. Em algumas modalidades, a sequência Kozak é gecRccAUGG com zero incompatibilidades ou com até uma, duas ou três incompatibilidades para posições minúsculas. Em algumas moda- lidades, a sequência de Kozak é gccACccAUG com zero incompatibili- dades ou com até uma, duas, três ou quatro incompatibilidades para posições minúsculas. Em algumas modalidades, a sequência de Ko- zak é GCCACCAUG. Em algumas modalidades, a sequência Kozak é gcegecRecAUGG com zero incompatibilidades ou com até uma, duas, três ou quatro incompatibilidades para posições minúsculas.
[0092] Em algumas modalidades, o MRNA que compreende um ORF que codifica um agente de ligação a DNA guiado por RNA com- preende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com a SEQ ID NO: 43, opcionalmente em que o ORF da SEQ ID NO: 43 (ou seja, SEQ ID NO: 4) é substituído por um ORF alternativo. Em algu- mas modalidades, o MRNA compreende qualquer uma das SEQ ID NOs: 10, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ou 66.
[0093] Em algumas modalidades, o grau de identidade com a se- quência opcionalmente substituída da SEQ ID NO: 43 é de 95%. Em algumas modalidades, o grau de identidade com a sequência opcio- nalmente substituída da SEQ ID NO: 4 é de 98%. Em algumas modali- dades, o grau de identidade com a sequência opcionalmente substituí- da da SEQ ID NO: 43 é de 99%. Em algumas modalidades, o grau de identidade com a sequência opcionalmente substituída da SEQ ID NO: 43 é de 100%.
[0094] Em algumas modalidades, um mMRNA divulgado neste do- cumento compreende um cap 5', como uma Cap0, Cap1 ou Cap2. Um cap 5' é geralmente um ribonucleotídeo de 7-metilguanina (que pode ser modificado ainda mais, conforme discutido abaixo, por exemplo, com relação ao ARCA) ligado através de um 5'-trifosfato à posição 5' do primeiro nucleotídeo da cadeia 5'-a- 3' do MRNA, isto é, o primeiro nucleotídeo cap-proximal. No Capo0, as riboses do primeiro e do se- gundo nucleotídeos cap-proximais do mMRNA compreendem um 2"'- hidroxila. No Cap1, as riboses do primeiro e do segundo nucleotídeos transcritos do MRNA compreendem 2'-metóxi e 2'-hidróxila, respecti- vamente. No Cap?2, as riboses do primeiro e do segundo nucleotídeos cap-proximais do MRNA compreendem um 2'-metóxi. Veja, por exem- plo, Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115. À maioria dos MRNAs eucarióticos endógenos superiores, incluindo os mMRNAs de mamíferos, como os mMRNAs humanos, compreendem Cap1 ou Cap2. Capo e outras estruturas de caps diferentes de Cap1 e Cap2 podem ser imunogênicas em mamíferos, como seres humanos,
devido ao reconhecimento como "não-próprio" por componentes do sistema imunológico inato, como IFIT-1 e IFIT-5, que podem resultar em níveis elevados de citocinas, incluindo interferon tipo |. Os compo- nentes do sistema imunológico inato, como o IFIT-1 e o IFIT-5, tam- bém podem competir com o elF4E pela ligação de um mMRNA com um cap diferente de Cap1 ou Cap2, potencialmente inibindo a tradução do MRNA.
[0095] Um cap pode ser incluído co-transcricionalmente. Por exemplo, ARCA (análogo de tampa anti-reversa; Thermo Fisher Scien- tific Cat. Nº. AM8045) é um análogo de cap que compreende um 3"- metóxi-5'-trifosfato de 7-metilguanina ligado à posição 5' de um ribonu- cleotídeo de guanina que pode ser incorporado in vitro em um transcri- to no início. O ARCA resulta em um cap Cap0 na qual a posição 2' do primeiro nucleotídeo cap-proximal é hidroxila. Ver, por exemplo, Stepinski et al., (2001) "Synthesis and properties of mMRNAs containing the novel “anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG," RNA 7: 1486-1495. A estrutura ARCA é mostrada abaixo. q SHa N À " o d-tio-t-odo o ex, ie o e 56 =
[0096] CleanCap'M AG (m7G(5')ppp(5')(2!OMeA)JpG; TriLink Bio- technologies Cat. Nº. N-7113) ou CleanCap'"Y GG (m7G (5') ppp (5') (2ºOMeG) pG; TriLink Biotechnologies ref. Nº. N-7133) pode ser usado para fornecer uma estrutura Cap1 co-transcricionalmente. As versões 3'-O-metiladas do CleanCap'MAG e CleanCap'VGG também estão disponíveis na TriLink Biotechnologies como Cat. Nºs N-7413 e N- 7433, respectivamente. A estrutura CleanCap'"Y AG é mostrada abai- xo.
NH, » Ay A o. From A |) o Pro O Ab HN AN. Do po v é o CP 1 o ie CM Pb so 30NH,TEA O=a,-0 CX a o oa NO Emi
[0097] Alternativamente, um cap pode ser adicionado a um RNA pós-transcricionalmente. Por exemplo, a enzima de cobertura Vaccinia está disponível comercialmente (New England Biolabs Cat. Nº. M2080S) e possui atividades de RNA trifosfatase e guanililtransferase, fornecidas por sua subunidade D1, e guanina metiltransferase, forne- cidas por sua subunidade D12. Como tal, pode adicionar uma 7- metilguanina a um RNA, de modo a originar Cap0O, na presença de S- adenosilmetionina e GTP. Ver, por exemplo, Guo, P. e Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. e Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479.
[0098] Em algumas modalidades, o MRNA compreende ainda um tail poli-adenilada (poli-A). Em algumas modalidades, o tail poli-A com- preende pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 adeninas, opcionalmente até 300 adeninas. Em algumas modalidades, o tail poli- A compreende 95, 96, 97, 98, 99 ou 100 nucleotídeos de adenina. Em alguns casos, o tail poli-A é "interrompido" com uma ou mais "âncoras" de nucleotídeos não-adenina em um ou mais locais dentro do tail poli- A. Os tails de poli-A podem compreender pelo menos 8 nucleotídeos de adenina consecutivos, mas também compreender um ou mais nu- cleotídeos não-adenina. Como usado neste documento, "nucleotídeos não adeninos" referem-se a nucleotídeos naturais ou não naturais que não compreendem adenina. Os nucleotídeos de guanina, timina e cito-
sina são nucleotídeos não-adenina exemplares. Assim, os tails de poli- A no mMRNA descritos neste documento podem compreender nucleotí- deos de adenina consecutivos localizados 3' a nucleotídeos que codifi- cam um agente de ligação a DNA guiado por RNA ou uma sequência de interesse. Em alguns casos, os tails de poli-A no MRNA compreen- dem nucleotídeos de adenina não consecutivos localizados 3' em nu- cleotídeos que codificam um agente de ligação a DNA guiado por RNA ou uma sequência de interesse, em que nucleotídeos não de adenina interrompem os nucleotídeos de adenina regularmente ou irregular- mente intervalos espaçados.
[0099] Como usado neste documento, "nucleotídeos não adeni- nos" referem-se a nucleotídeos naturais ou não naturais que não com- preendem adenina. Os nucleotídeos de guanina, timina e citosina são nucleotídeos não-adenina exemplares. Assim, os tails de poli-A no mMRNA descritos neste documento podem compreender nucleotídeos de adenina consecutivos localizados 3' a nucleotídeos que codificam um agente de ligação a DNA guiado por RNA ou uma sequência de interesse. Em alguns casos, os tails de poli-A no MRNA compreendem nucleotídeos de adenina não consecutivos localizados 3' em nucleotí- deos que codificam um agente de ligação a DNA guiado por RNA ou uma sequência de interesse, em que nucleotídeos não de adenina in- terrompem os nucleotídeos de adenina regularmente ou irregularmen- te intervalos espaçados.
[00100] Em algumas modalidades, o MRNA é purificado. Em algu- mas modalidades, o mMRNA é purificado usando um método de precipi- tação (Por exemplo, precipitação com LiCI, precipitação com álcool ou um método equivalente, Por exemplo, como descrito neste documen- to). Em algumas modalidades, o mMRNA é purificado usando um méto- do baseado em cromatografia, como um método baseado em HPLC ou um método equivalente (Por exemplo, como descrito neste docu-
mento). Em algumas modalidades, o mRNA é purificado usando um método de precipitação (Por exemplo, precipitação com LiCI) e um mé- todo baseado em HPLC.
[00101] Em algumas modalidades, pelo menos um gRNA é forneci- do em combinação com um mMRNA divulgado neste documento. Em algumas modalidades, um gRNA é fornecido como uma molécula se- parada do MRNA. Em algumas modalidades, um gRNA é fornecido como uma parte, como uma parte de uma UTR, de um mRNA divulga- do neste documento. gRNAs
[00102] Em um aspecto, a presente invenção fornece métodos de entrega de um sistema de edição de genoma (por exemplo, um siste- ma de nuclease de dedo de zinco, um sistema TALEN, um sistema de meganuclease ou um sistema CRISPR/Cas) a uma célula (ou popula- ção de células), para exemplo, um HSPC (ou população de HSPCs), por exemplo, uma célula CD34+ (ou população de células CD34+), em que o resultado é uma célula (ou sua descendência) que aumentou a expressão da hemoglobina fetal (por exemplo, quando a referida célula é diferenciada em um eritrócitos). Divulgadas neste documento são sequências guia úteis para alcançar esse efeito. Nas modalidades, o sistema de edição de genoma compreende um ou mais vetores, por exemplo, mRNA, que codifica os componentes do sistema de edição de genoma. Em outras modalidades, o sistema de edição de genoma compreende um ou mais polipeptídeos. Num aspecto preferido, os mé- todos compreendem a entrega de um sistema CRISPR/Cas. Em mo- dalidades, o sistema CRISPR/Cas compreende um gRNA e uma nu- clease Cas, por exemplo, complexada na forma de um complexo de proteínas ribonucleares (RNP). Em outras modalidades, o sistema CRISPR/Cas compreende um ou mais vetores que codificam um gRNA e/ou uma nuclease Cas. Em outras modalidades, o sistema
CRISPR/Cas compreende um ou mais vetores, por exemplo, mRNA, que codifica uma nuclease de Cas (por exemplo, uma nuclease Cas de Classe 2) e um ou mais gRNAs. Em aspectos, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA descrito em WO2017/115268, cujo con- teúdo é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Em aspectos, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA compreendendo uma sequência guia complementar a uma sequência alvo dentro do gene BCL11a ou de seus elementos reguladores. Em outros aspectos, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA compreendendo uma sequên- cia guia complementar a uma sequência alvo no íntron 2 do gene BCL11a (por exemplo, dentro de uma região do íntron 2 do gene BCL11a no ou próximo a um sítio de ligação GATA1. Em aspectos, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA que compreende uma sequência guia complementar a uma sequência alvo na região do íntron 2 do ge- ne BCL11a de ch2: 60494000 a ch2: 60498000 (de acordo com hg38), por exemplo, dentro de uma região do íntron 2 do gene BCL11a de ch2: 60494250 a ch2: 60496300 (de acordo com hg38). Nas modali- dades, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA compreendendo uma sequência guia listada na Tabela 2 do Pedido Provisório US Nº. 62/566.232, depositado em 29 de setembro de 2017, que é incorpora- do por referência neste documento.
[00103] Sequências guia exemplares de gRNAs que são comple- mentares às sequências alvo dentro do íntron 2 do gene BCL11a. +58, +62 e +55 referem-se aos sítios de hipersensibilidade à DNAse da re- gião intensificadora específica para eritroide, conforme descrito em Bauer et al., Science 2013; 342 (6155): 253-257.
[00104] Em outros aspectos, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA que compreende uma sequência guia complementar a uma se- quência alvo dentro do locus da globina no cromossomo 11. Em um aspecto, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA que compreende uma sequência guia complementar a uma sequência dentro de uma região HPFH. Conforme usado neste documento, o termo "região HPFH" refere-se a um sítio genômico que, quando modificado (por exemplo, mutado ou deletado), causa aumento da produção de HbF nos glóbulos vermelhos adultos e inclui as regiões HPFH identificadas na literatura (consulte, por exemplo, Herança Mendeliana Online no Homem: http://www.omim.org/entry/141749, incorporada por referência neste documento). Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é uma região dentro ou que engloba o aglomerado de genes da beta globina no cromossomo 11p15. Em uma modalidade exemplar, a regi- ão HPFH está dentro ou abrange pelo menos parte do gene delta glo- bina e seus elementos reguladores. Numa modalidade exemplar, a região HPFH é uma região do promotor de HBG1. Em uma modalida- de exemplar, a região HPFH é uma região do promotor de HBG2. Nu- ma modalidade exemplar, a região HPFH é uma região descrita em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814, incorporado por refe- rência neste documento na sua totalidade. Em uma modalidade exem- plar, a região HPFH é o HPFH delecional de ponto de interrupção francês, como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-
814. Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é o HPFH argeli- no, como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Numa modalidade exemplar, a região HPFH é o HPFH do Sri Lanka, como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é o HPFH-3 como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Em uma modali- dade exemplar, a região HPFH é o HPFH-2 como descrito em Sanka- ran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Em uma modalidade, a regi- ão HPFH-1 é o HPFH-3 como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Numa modalidade exemplar, a região HPFH é o HPFH do Sri Lanka (5B)O-thalassemia, como descrito em Sankaran
VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é o HPFH siciliano (5B)O-talassemia, como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é o HPFH Macedônia (5B)O-talassemia, co- mo descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-814. Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é o Kurdish BO-thalassemia HPFH como descrito em Sankaran VG et al. NEJM (2011) 365: 807-
814. Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é a região locali- zada em Chr1i1: 5213874-5214400 (hg918) Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é a região localizada em Chr11: 5215943- 5215046 (hg18). Em uma modalidade exemplar, a região HPFH é a região localizada em Chr11: 5234390-5238486 (hg38). Em modalida- des, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA que compreende uma sequência guia que compreende uma sequência como descrita em WO?2017/077394, cujo conteúdo é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Nas modalidades, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA que compreende uma sequência guia que compreen- de uma sequência selecionada a partir de uma sequência guia do do- cumento WO2017/077394. Nas modalidades, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA compreendendo uma sequência guia listada na Tabela 3 do Pedido Provisório US Nº. 62/566.232, depositado em 29 de se- tembro de 2017, que é incorporado por referência neste documento.
[00105] “Sequências guia exemplares direcionadas ao HPFH fran- cês (HPFH francês; Sankaran VG et al. Um elemento funcional neces- sário para o silenciamento da hemoglobina fetal. NEJM (2011) 365: 807-814.)
[00106] Nas modalidades, o sistema CRISPR/Cas inclui um gRNA compreendendo uma sequência guia listada na Tabela 4 do Pedido Provisório US Nº. 62/566.232, depositado em 29 de setembro de 2017, que é incorporado por referência neste documento.
[00107] Sequências guia exemplares podem ser direcionadas para as regiões promotoras de HBG1 e/ou HBG2. aRNA quimicamente modificado
[00108] Em algumas modalidades, o gRNA é quimicamente modifi- cado. Um gRNA compreendendo um ou mais nucleosídeos ou nucleo- tídeos modificados é chamado de gRNA "modificado" ou gRNA "quimi- camente modificado" para descrever a presença de um ou mais com- ponentes ou configurações que não são naturais e/ou naturais que são usados em vez de ou em além dos resíduos canônicos A, G, Ce U. Em algumas modalidades, um gRNA modificado é sintetizado com um nucleosídeo ou nucleotídeo não canônico, é chamado "modificado" neste documento. Os nucleosídeos e nucleotídeos modificados podem incluir um ou mais dos seguintes: (i) alteração, Por exemplo, substitui- ção, de um ou de ambos os oxigênios de fosfato não-ligados e/ou de um ou mais dos oxigênios de fosfato de ligação na ligação da estrutura principal fosfodiéster (uma modificação da estrutura principal exem- plar); (ii) alteração, Por exemplo, substituição, de um constituinte do açúcar ribose, Por exemplo, do hidroxil 2' no açúcar ribose (uma modi- ficação exemplar no açúcar); (iii) substituição por atacado da fração fosfato por ligantes "defosfo" (uma modificação exemplar da estrutura principal); (iv) modificação ou substituição de uma nucleobase de ocor- rência natural, incluindo uma nucleobase não canônica (uma modifica- ção de base exemplar); (v) substituição ou modificação da estrutura principal ribose-fosfato (uma modificação exemplar da estrutura princi- pal); (vi) modificação da extremidade 3' ou da extremidade 5' do oligo- nucleotídeo, Por exemplo, remoção, modificação ou substituição de um grupo fosfato terminal ou conjugação de uma fração, cap ou ligante (tais modificações de cap 3' ou 5' podem compreender uma modifica- ção de açúcar e/ou estrutura principal); e (vii) modificação ou substitui- ção do açúcar (uma modificação exemplar do açúcar).
[00109] Em algumas modalidades, um gRNA compreende uma uri- dina modificada em algumas ou todas as posições de uridina. Em al- gumas modalidades, a uridina modificada é uma uridina modificada na posição 5, por exemplo, com um halogênio ou C1-C6 alcóxi. Em algu- mas modalidades, a uridina modificada é uma pseudouridina modifica- da na posição 1, por exemplo, com um C1-C6 alquila. A uridina modifi- cada pode ser, por exemplo, pseudouridina, N1-metil-pseudouridina, 5- metoxiuridina, 5-iodouridina ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, a uridina modificada é 5-metoxiuridina. Em algumas mo- dalidades, a uridina modificada é 5-iodouridina. Em algumas modali- dades, a uridina modificada é pseudouridina. Em algumas modalida- des, a uridina modificada é N1-metil-pseudouridina. Em algumas mo- dalidades, a uridina modificada é uma combinação de pseudouridina e N1-metil-pseudouridina. Em algumas modalidades, a uridina modifica- da é uma combinação de pseudouridina e 5-metoxiuridina. Em algu- mas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de N1-metil pseudouridina e 5-metoxiuridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de 5-iodouridina e Ni-metil-pseudou- ridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combi- nação de pseudouridina e 5-metoxiuridina. Em algumas modalidades, a uridina modificada é uma combinação de 5-iodouridina e 5-meto- xiuridina.
[00110] Em algumas modalidades, pelo menos 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são uridinas modificadas. Em algu- mas modalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55- 65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são uridinas modificadas, por exemplo, 5-metoxiuridina, 5-iodouridina, N1-metil pseudouridina, pseu-
douridina ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são 5-metoxiuridina. Em algumas modalidades, 10% - 25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são pseudouridina. Em algumas modalidades, 10% - 25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são N1i-metil pseudouridina. Em algumas modalida- des, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são 5-iodouridina. Em algumas modalida- des, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90-100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descrição são 5-metoxiuridina, e o restante é N1- metil pseudouridina. Em algumas modalidades, 10% -25%, 15-25%, 25-35%, 35-45%, 45-55%, 55-65%, 65-75%, 75-85%, 85-95%, ou 90- 100% das posições de uridina em um gRNA de acordo com a descri- ção são 5-iodouridina e o restante são N1-metil pseudouridina.
[00111] Modificações químicas, como as listadas acima, podem ser combinadas para fornecer gRNAs modificados compreendendo nu- cleosídeos e nucleotídeos (coletivamente "resíduos") que podem ter duas, três, quatro ou mais modificações. Por exemplo, um resíduo modificado pode ter um açúcar modificado e uma nucleobase modifi- cada. Em algumas modalidades, todas as bases de um gRNA são modificadas, Por exemplo, todas as bases têm um grupo fosfato modi- ficado, como um grupo fosforotioato. Em certas modalidades, todos ou substancialmente todos os grupos fosfato de uma molécula de gRNA são substituídos por grupos fosforotioato. Em algumas modalidades,
os gRNAs modificados compreendem pelo menos um resíduo modifi- cado ou próximo da extremidade 5' do RNA. Em algumas modalida- des, os gRNAs modificados compreendem pelo menos um resíduo modificado ou próximo da extremidade 3' do RNA.
[00112] Em algumas modalidades, o gRNA compreende um, dois, três ou mais resíduos modificados. Em algumas modalidades, pelo menos 5% (Por exemplo, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo me- nos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pe- lo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou 100%) das posições em um gRNA modifica- do são nucleosídeos ou nucleotídeos modificados.
[00113] Os ácidos nucleicos não modificados podem ser propensos à degradação, por exemplo, nucleases intracelulares ou aquelas en- contradas no soro. Por exemplo, as nucleases podem hidrolisar as li- gações fosfodiéster do ácido nucleico. Por conseguinte, em um aspec- to, os gRNAs descritos neste documento podem conter um ou mais nucleosídeos ou nucleotídeos modificados, Por exemplo, para introdu- zir estabilidade em relação a nucleases intracelulares ou baseadas em soro. Em algumas modalidades, as moléculas de gRNA modificado descritas neste documento podem exibir uma resposta imune inata reduzida quando introduzidas em uma população de células, tanto in vivo quanto ex vivo. O termo "resposta imune inata" inclui uma respos- ta celular a ácidos nucleicos exógenos, incluindo ácidos nucleicos de fita simples, que envolvem a indução da expressão e liberação de cito- cinas, particularmente os interferons, e a morte celular.
[00114] Em algumas modalidades de uma modificação da estrutura principal, o grupo fosfato de um resíduo modificado pode ser modifica- do substituindo um ou mais dos oxigênios por um substituinte diferen-
te. Além disso, o resíduo modificado, Por exemplo, resíduo modificado presente em um ácido nucleico modificado, pode incluir a substituição por atacado de uma fração fosfato não modificada por um grupo fosfa- to modificado, como descrito neste documento. Em algumas modali- dades, a modificação da estrutura principal da estrutura principal de fosfato pode incluir alterações que resultam em um ligante não carre- gado ou um ligante carregado com distribuição de carga assimétrica.
[00115] Exemplos de grupos fosfato modificados incluem fosforotio- ato, fosforosselenatos, fosfatos de borano, ésteres de borano fosfato, fosfonatos de hidrogênio, fosforamidatos, fosfonatos de alquil ou aril e fosfotriésteres. O átomo de fósforo em um grupo fosfato não modifica- do é aquiral. No entanto, a substituição de um dos oxigênios sem pon- te por um dos átomos ou grupos de átomos acima pode tornar o átomo de fósforo quiral. O átomo de fósforo estereogênico pode possuir a configuração "R" (Rp neste documento) ou a configuração "S" (Sp nes- te documento). A estrutura principal também pode ser modificada pela substituição de um oxigênio em ponte (ou seja, o oxigênio que liga o fosfato ao nucleosídeo), por nitrogênio (fosforamamidatos em ponte), enxofre (fosforotioatos em ponte) e carbono (metilenofosfonatos em ponte). A substituição pode ocorrer no oxigênio de ligação ou em am- bos os oxigênios de ligação.
[00116] O grupo fosfato pode ser substituído por conectores que não contenham fósforo em certas modificações na estrutura principal. Em algumas modalidades, o grupo fosfato carregado pode ser substi- tuído por uma fração neutra. Exemplos de frações que podem substitu- ir o grupo fosfato podem incluir, sem limitação, Por exemplo, fosfonato de metil, hidroxilamino, siloxano, carbonato, carboximetil, carbamato, amida, tioéter, ligante de óxido de etileno, sulfonato, sulfonamida, tio- formacetal, formalcetal, oxima, metilenoimino, metilenometilimino, me- tileno-hidrazo, metilenodimetil-hidrazo e metileno-oximetilimino.
[00117] Em algumas modalidades, a invenção compreende um SgRNA compreendendo uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões: os nucleotídeos no terminal 5'; a região inferior do caule; a região de abaulamento; a região do tronco superior; a região do nexo; a região hairpin 1; a região hairpin 2; e os nucleotí- deos no terminal 3'. Em algumas modalidades, a modificação compre- ende um nucleotídeo modificado em 2'-O-metil (2:-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado em 2'-fluoro (2-F). Em algumas modalidades, a modificação compre- ende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
[00118] Em algumas modalidades, os primeiros três ou quatro nu- cleotídeos no terminal 5' e os últimos três ou quatro nucleotídeos no terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, os quatro pri- meiros nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados a ligações fosforotioato (PS). Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-O-Me. Em algumas moda- lidades, a modificação compreende 2'-F.
[00119] Em algumas modalidades, os quatro primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os quatro últimos nucleotídeos no terminal 3' estão li- gados a uma ligação PS, e os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modifi- cações 2'-O-Me.
[00120] Em algumas modalidades, os quatro primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os quatro últimos nucleotídeos no terminal 3' estão li- gados a uma ligação PS, e os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modifi- cações 2'-F.
[00121] Em algumas modalidades, o saRNA compreende o padrão de modificação de SEQ ID NO: 74: (MN*MN*MN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmMGmMCmMUmMAm
GMAMAMAMUMAmMGMCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAU- CAMAMCMUMUMGMAMAMAMAMAmMGMmMUMGMGMCMAmMCMmMCM- GMAMGMUMCMGMGMUMGMCMU*mMU*mMU*mU), onde N é qualquer nucleotídeo natural ou não natural. Em algumas modalidades, o sgR- NA compreende a SEQ ID NO: 74. Em certas modalidades, o saRNA compreende a modificação 2'O-metil dos três primeiros resíduos na sua extremidade 5', com ligações de fosforotioato entre os resíduos 1- 2, 2-3 e 3-4 do RNA.
Ácido Nucleico Modelo
[00122] As composições e métodos divulgados neste documento podem incluir um ácido nucleico modelo. O modelo pode ser usado para alterar ou inserir uma sequência de ácido nucleico no local ou próximo a um sítio alvo para uma nuclease Cas. Em algumas modali- dades, os métodos compreendem a introdução de um modelo para a célula. Em algumas modalidades, um único modelo pode ser forneci- do. Em outras modalidades, dois ou mais modelos podem ser forneci- dos de modo que a edição possa ocorrer em dois ou mais sítios alvo. Por exemplo, modelos diferentes podem ser fornecidos para editar um único gene em uma célula ou dois genes diferentes em uma célula.
[00123] Em algumas modalidades, o modelo pode ser usado na re- combinação homóloga. Em algumas modalidades, a recombinação homóloga pode resultar na integração da sequência modelo ou de uma porção da sequência modelo na molécula de ácido nucleico alvo. Em outras modalidades, o modelo pode ser usado no reparo direcio- nado à homologia, que envolve a invasão da fita de DNA no sítio da clivagem no ácido nucleico. Em algumas modalidades, o reparo direci- onado à homologia pode resultar na inclusão da sequência modelo na molécula de ácido nucleico alvo editada. Em ainda outras modalida- des, o modelo pode ser usado na edição de genes mediada por junção de extremidade não homóloga. Em algumas modalidades, a sequência modelo não tem semelhança com a sequência de ácido nucleico pró- xima ao sítio de clivagem. Em algumas modalidades, o modelo ou uma porção da sequência modelo é incorporado. Em algumas modalidades, o modelo inclui sequências de repetição invertida terminal (ITR) de flanqueamento.
[00124] Em algumas modalidades, o modelo pode compreender um primeiro braço de homologia e um segundo braço de homologia (tam- bém chamado de primeira e segunda sequência de nucleotídeos) que são complementares às sequências localizadas a montante e a jusan- te do local de clivagem, respectivamente. Onde um modelo contém dois braços de homologia, cada braço pode ter o mesmo comprimento ou comprimentos diferentes, e a sequência entre os braços de homo- logia pode ser substancialmente semelhante ou idêntica à sequência alvo entre os braços de homologia ou pode ser totalmente não relacio- nada. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade ou porcentagem de identidade entre a primeira sequência de nucleotídeos no modelo e a sequência a montante do sítio de clivagem e entre a segunda sequência de nucleotídeos no modelo e a sequência a jusan- te do sítio de clivagem, pode permitir recombinação homóloga, como, Por exemplo, recombinação homóloga de alta fidelidade, entre o mo- delo e a molécula de ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade pode ser de cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99%, ou 100%. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade pode ser de cer- ca de 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade pode ser de pelo menos 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade pode ser 100%. Em algumas modalidades, a percentagem de identidade pode ser de cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a identidade percentual pode ser de cerca de 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a percentagem de identidade pode ser de pelo menos 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a percentagem de identidade pode ser 100%.
[00125] Em algumas modalidades, a sequência modelo pode cor- responder, compreender ou consistir em uma sequência endógena de uma célula alvo. Pode também ou alternativamente corresponder, compreender ou consistir em uma sequência exógena de uma célula alvo. Como usado neste documento, o termo "sequência endógena" refere-se a uma sequência que é nativa da célula. O termo "sequência exógena" refere-se a uma sequência que não é nativa de uma célula, ou uma sequência cuja localização nativa no genoma da célula está em um local diferente. Em algumas modalidades, a sequência endó- gena pode ser uma sequência genômica da célula. Em algumas moda- lidades, a sequência endógena pode ser uma sequência cromossômi- ca ou extracromossômica. Em algumas modalidades, a sequência en- dógena pode ser uma sequência plasmídica da célula. Em algumas modalidades, a sequência modelo pode ser substancialmente idêntica a uma porção da sequência endógena em uma célula no local ou pró- ximo ao sítio de clivagem, mas compreende pelo menos uma alteração de nucleotídeo. Em algumas modalidades, a edição da molécula de ácido nucleico alvo clivada com o modelo pode resultar em uma muta- ção compreendendo uma inserção, deleção ou substituição de um ou mais nucleotídeos da molécula de ácido nucleico alvo. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar em uma ou mais alterações de aminoácidos em uma proteína expressa a partir de um gene compre- endendo a sequência alvo. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar em uma ou mais alterações nucleotídicas em um RNA expres- so a partir do gene alvo. Em algumas modalidades, a mutação pode alterar o nível de expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar em aumento ou diminuição da expressão do gene alvo. Em algumas modalidades, a mutação pode resultar em Kknock-down do gene. Em algumas modalidades, a mutação pode re- sultar em nocaute genético. Em algumas modalidades, a mutação po- de resultar na função do gene restaurado. Em algumas modalidades, a edição da molécula de ácido nucleico alvo clivada com o modelo pode resultar em uma alteração em uma sequência de éxons, uma sequên- cia de íntrons, uma sequência reguladora, uma sequência de controle transcricional, uma sequência de controle de tradução, um sítio de splicing ou uma sequência não codificante da molécula de ácido nu- cleico alvo, como o DNA.
[00126] Em outras modalidades, a sequência modelo pode compre- ender uma sequência exógena. Em algumas modalidades, a sequên- cia exógena pode compreender uma sequência de codificação de pro- teína ou RNA operacionalmente ligada a uma sequência promotora exógena, de modo que, após a integração da sequência exógena na molécula de ácido nucleico alvo, a célula é capaz de expressar a pro- teína ou RNA codificado por a sequência integrada. Em outras modali- dades, após a integração da sequência exógena na molécula de ácido nucleico alvo, a expressão da sequência integrada pode ser regulada por uma sequência promotora endógena. Em algumas modalidades, a sequência exógena pode fornecer uma sequência de cDNA que codifi- ca uma proteína ou uma porção da proteína. Em ainda outras modali- dades, a sequência exógena pode compreender ou consistir em uma sequência de éxon, uma sequência de íntron, uma sequência regula- dora, uma sequência de controle transcricional, uma sequência de controle de tradução, um sítio de splicing ou uma sequência não codi- ficante. Em algumas modalidades, a integração da sequência exógena pode resultar na função do gene restaurado. Em algumas modalida- des, a integração da sequência exógena pode resultar em um knock-in genético. Em algumas modalidades, a integração da sequência exó- gena pode resultar em um nocaute genético.
[00127] O modelo pode ter qualquer comprimento adequado. Em algumas modalidades, o modelo pode compreender 10, 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 500, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 5500, 6000, ou mais nucleotídeos de comprimento. O mo- delo pode ser um ácido nucleico de fita simples. O modelo pode ser ácido nucleico de fita dupla ou parcialmente dupla. Em certas modali- dades, o modelo de fita única tem 20, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175 ou 200 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, o modelo pode compreender uma sequência de nucleotídeos que é complementar a uma porção da molécula de ácido nucleico alvo com- preendendo a sequência alvo (isto é, um "braço de homologia"). Em algumas modalidades, o modelo pode compreender um braço de ho- mologia que é complementar à sequência localizada a montante ou a jusante do sítio de clivagem na molécula de ácido nucleico alvo.
[00128] Em algumas modalidades, o modelo contém ssDNA ou dsDNA contendo sequências flanqueantes de repetição invertida- terminal (ITR). Em algumas modalidades, o modelo é fornecido como um vetor, plasmídeo, minicírculo, nanocírculo ou produto de PCR. Purificação de Ácidos Nucleicos
[00129] Em algumas modalidades, o ácido nucleico é purificado. Em algumas modalidades, o ácido nucleico é purificado usando um método de precipitação (Por exemplo, precipitação com LiCI, precipita- ção com álcool ou um método equivalente, Por exemplo, como des- crito neste documento). Em algumas modalidades, o ácido nucleico é purificado usando um método baseado em cromatografia, como um método baseado em HPLC ou um método equivalente (Por exemplo, como descrito neste documento). Em algumas modalidades, o nuclei- co é purificado usando um método de precipitação (Por exemplo, pre-
cipitação com LiCI) e um método baseado em HPLC. Sequências alvo
[00130] Em algumas modalidades, um sistema CRISPR/Cas da presente invenção pode ser direcionado e clivar uma sequência alvo em uma molécula de ácido nucleico alvo. Por exemplo, a sequência alvo pode ser reconhecida e clivada pela nuclease Cas. Em certas modalidades, uma sequência alvo para uma nuclease Cas está locali- zada perto da sequência de PAM cognato da nuclease. Em algumas modalidades, uma nuclease Cas de Classe 2 pode ser direcionada por um gRNA para uma sequência alvo de uma molécula de ácido nuclei- co alvo, em que o gRNA hibrida com e a proteína Cas de Classe 2 cli- va a sequência alvo. Em algumas modalidades, o RNA guia hibrida com uma nuclease Cas de Classe 2 e cliva a sequência alvo adjacente ou compreendendo seu PAM cognato. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode ser complementar à sequência de direcionamen- to do RNA guia. Em algumas modalidades, o grau de complementari- dade entre uma sequência alvo de um RNA guia e a porção da se- quência alvo correspondente que hibrida com o RNA guia pode ser de cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a percentagem de identidade entre uma sequência alvo de um RNA guia e a porção da sequência alvo correspondente que hibrida com o RNA guia pode ser de cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% ou 100%. Em algumas modalidades, a região de homologia do alvo é adjacente a uma sequência PAM cognata. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode compreender uma se- quência 100% complementar à sequência de direcionamento do RNA guia. Em outras modalidades, a sequência alvo pode compreender pe- lo menos uma incompatibilidade, deleção ou inserção, em comparação com a sequência de direcionamento do RNA guia.
[00131] O comprimento da sequência alvo pode depender do sis- tema de nuclease utilizado. Por exemplo, a sequência de direciona- mento de um RNA guia para um sistema CRISPR/Cas pode compre- ender 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais de 50 nucleotídeos de comprimento e a sequência alvo é um comprimento corresponden- te, opcionalmente adjacente a uma sequência PAM. Em algumas mo- dalidades, a sequência alvo pode compreender 15-24 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode com- preender 17-21 nucleotídeos de comprimento. Em algumas modalida- des, a sequência alvo pode compreender 20 nucleotídeos de compri- mento. Quando são utilizadas nickases, a sequência alvo pode com- preender um par de sequências alvo reconhecidas por um par de nickases que clivam as cadeias opostas da molécula de DNA. Em al- gumas modalidades, a sequência alvo pode compreender um par de sequências alvo reconhecidas por um par de nickases que clivam as mesmas cadeias da molécula de DNA. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode compreender uma parte das sequências alvo re- conhecidas por uma ou mais nucleases Cas.
[00132] A molécula de ácido nucleico alvo pode ser qualquer molé- cula de DNA ou RNA que seja endógena ou exógena a uma célula. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico alvo pode ser um DNA epissomal, um plasmídeo, um DNA genômico, genoma viral, DNA mitocondrial ou DNA cromossômico de uma célula ou na célula. Em algumas modalidades, a sequência alvo da molécula de ácido nu- cleico alvo pode ser uma sequência genômica de uma célula ou de uma célula, incluindo uma célula humana.
[00133] Em outras modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência viral. Em outras modalidades, a sequência alvo pode ser uma sequência de patógenos. Em ainda outras modalidades, a se-
quência alvo pode ser uma sequência sintetizada. Em outras modali- dades, a sequência alvo pode ser uma sequência cromossômica. Em certas modalidades, a sequência alvo pode compreender uma junção de translocação, Por exemplo, uma translocação associada a um cân- cer. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode estar em um cromossomo eucariótico, como um cromossomo humano. Em certas modalidades, a sequência alvo é uma sequência específica do fígado, na medida em que é expressa nas células do fígado.
[00134] Em algumas modalidades, a sequência alvo pode estar lo- calizada em uma sequência de codificação de um gene, uma sequên- cia de íntron de um gene, uma sequência reguladora, uma sequência de controle transcricional de um gene, uma sequência de controle de tradução de um gene, um sítio de splicing ou uma sequência não codi- ficante entre genes. Em algumas modalidades, o gene pode ser um gene codificador de proteína. Em outras modalidades, o gene pode ser um gene de RNA não codificante. Em algumas modalidades, a se- quência alvo pode compreender todo ou uma porção de um gene as- sociado à doença. Em algumas modalidades, a sequência alvo pode estar localizada em um sítio funcional não gênico no genoma, por exemplo, um sítio que controla aspectos da organização da cromatina, como um sítio de estrutura em andaime ou região de controle de locus.
[00135] Em modalidades que envolvem uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, a sequência alvo pode ser adjacente a um motivo adjacente do protospacer ("PAM"). Em algumas modalida- des, o PAM pode ser adjacente a ou dentro de 1, 2, 3 ou 4 nucleotí- deos da extremidade 3' da sequência alvo. O comprimento e a se- quência do PAM podem depender da proteína Cas usada. Por exem- plo, o PAM pode ser selecionado a partir de um consenso ou uma se- quência PAM específica para uma proteína Cas9 ou ortólogo Cas9 es- pecífico, incluindo aqueles divulgados na Figura 1 de Ran et al., Natu-
re, 520: 186-191 (2015) e Figura S5 da Zetsche 2015, cuja descrição relevante de cada uma delas é incorporada por referência neste do- cumento. Em algumas modalidades, o PAM pode ter 2, 3, 4, 5,6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento. As sequências de PAM exem- plificativas não limitativas incluem NGG, NGGNG, NG, NAAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA, TTN e NNNNGATT (em que N é definido como qualquer nucleotídeo e W é definido como A ou T). Em algumas modalidades, a sequência de PAM pode ser NGG. Em algumas modalidades, a sequência de PAM pode ser NGGNG. Em algumas modalidades, a sequência de PAM pode ser TTN. Em algu- mas modalidades, a sequência de PAM pode ser NNAAAAW. Formulação Lipídica
[00136] São divulgadas neste documento várias modalidades de formulações de LNP para agentes biologicamente ativos, como RNAs, incluindo cargas CRISPR/Cas. Tais formulações de LNP incluem um "lipídio de amina" ou "lipídio biodegradável", opcionalmente junto com um ou mais lipídios auxiliares, lipídios neutros e lipídios dissimulados, como lipídios com PEG. Por "nanopartícula lipídica" entende-se uma partícula que compreende uma pluralidade de (isto é, mais de uma) moléculas lipídicas fisicamente associadas entre si por forças intermo- leculares. Lipídios com amina
[00137] Em algumas modalidades, composições de LNP para a en- trega de agentes biologicamente ativos compreendem um "lipídio de amina", que é definido como lipídio A ou seus equivalentes, incluindo análogos de acetal do Lipídio A.
[00138] Em algumas modalidades, o lipídio de amina é o lipídio A, que é (9Z, 122Z)-3-((4,4-bis(octilóxi)butanoil)óxi)-2-((((3-(dietilamino) propóxi)carbonil)óxi)metil)propil octadeca-9,12-dienoato, também cha- mado de 3-((4,4-bis(octilóxi)butanoil)óxi)-2- ((((3-(dietilamino)propóxi)
carbonil)óxi)metil)propil (9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato. O lipídio A pode ser descrito como: o ANA Fon A, o o SOSEAO Ao N MEIO :
[00139] O |lipídioA pode ser sintetizado de acordo com o documen- to WO2015/095340 (Por exemplo, pp. 84-86). Em certas modalidades, o lipídio de amina é equivalente ao lipídio A.
[00140] Em certas modalidades, um lipídio de amina é um análogo do lipídio A. Em certas modalidades, um análogo de Lipídio A é um análogo de acetal do Lipídio A. Em determinadas composições de LNP, o análogo de acetal é um análogo de acetal C4-C12. Em algu- mas modalidades, o análogo de acetal é um análogo de acetal C5- C12. Em modalidades adicionais, o análogo de acetal é um análogo de acetal C5-C10. Em outras modalidades, o análogo de acetal é escolhi- do dentre um análogo de acetal de C4, C5, C6, C7, C9, C10, Cl1h e C12.
[00141] Os lipídios com amina e outros "lipídios biodegradáveis" adequados para uso nos LNP's descritos neste documento são biode- gradáveis in vivo. Os lipídios com aminas têm baixa toxicidade (Por exemplo, são tolerados nos modelos animais sem efeito adverso em quantidades maiores ou iguais a 10 mg/kg). Em certas modalidades, os LNPs que compreendem um lipídio de amina incluem aqueles em que pelo menos 75% do lipídio de amina é removido do plasma dentro de 8, 10, 12, 24 ou 48 horas ou 3, 4, 5, 6, 7 ou 10 dias. Em certas mo- dalidades, os LNPs que compreendem um lipídio de amina incluem aqueles em que pelo menos 50% do mRNA ou do gRNA são elimina- dos do plasma dentro de 8, 10, 12, 24 ou 48 horas ou 3, 4, 5, 6,7, ou dias. Em certas modalidades, os LNPs compreendendo um lipídio de amina incluem aqueles em que pelo menos 50% do LNP é elimina- do do plasma dentro de 8, 10, 12, 24 ou 48 horas ou 3, 4, 5, 6,7 ou 10 dias, por exemplo, medindo um lipídio (por exemplo, um lipídio de amina), RNA (por exemplo, mRNA) ou outro componente. Em certas modalidades, o componente lipídio encapsulado em lipídio versus lipí- dio livre, RNA ou ácido nucleico do LNP é medido.
[00142] Os lipídios biodegradáveis incluem, por exemplo, os lipídios biodegradáveis dos documentos WO/2017/173054, WO2015/095340 e WO2014/136086.
[00143] A depuração lipídica pode ser medida como descrito na lite- ratura. Veja Maier, M.A,, et al. Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles for Systemic Delivery of RNAi Thera- peutics. Mol. Ther. 2013, 21(8), 1570-78 ("Maier"). Por exemplo, em Maier, os sistemas LNP-siRNA contendo siRNA direcionado às lucife- rases foram administradas aos camundongos machos C57BI/6 de seis a oito semanas de idade a 0,3 mg/kg por injeção intravenosa em bolus via veia da tail lateral. Amostras de sangue, fígado e baço foram cole- tadas em 0,083, 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 e 168 horas após a do- se. Os camundongos foram perfundidos com solução salina antes da coleta de tecido e as amostras de sangue foram processadas para ob- ter plasma. Todas as amostras foram processadas e analisadas por LC-MS. Além disso, Maier descreve um procedimento para avaliar a toxicidade após a administração de formulações de LNP-siRNA. Por exemplo, um siRNA direcionado à luciferase foi administrado em O, 1, 3, 5 e 10 mg/kg (5 animais/grupo) via injeção intravenosa em bolus intravenosa a um volume de dose de 5 mL/kg em ratos Sprague- Dawley machos. Após 24 horas, cerca de 1 mL de sangue foi obtido da veia jugular de animais conscientes e o soro foi isolado. 72 horas após a dose, todos os animais foram sacrificados para necropsia. Fo-
ram realizadas avaliações de sinais clínicos, peso corporal, química sérica, pesos de órgãos e histopatologia. Embora Maier descreva mé- todos para avaliar formulações de siRNA-LNP, esses métodos podem ser aplicados para avaliar a depuração, farmacocinética e toxicidade da administração de composições de LNP da presente invenção.
[00144] Os lipídios podem levar a um aumento da taxa de depura- ção. Em algumas modalidades, a taxa de depuração é uma taxa de depuração lipídica, por exemplo, a taxa na qual um lipídio é eliminado do sangue, soro ou plasma. Em algumas modalidades, a taxa de de- puração é uma taxa de depuração de RNA, por exemplo, a taxa na qual um mRNA ou um gRNA é eliminado do sangue, soro ou plasma. Em algumas modalidades, a taxa de depuração é a taxa na qual o LNP é eliminado do sangue, soro ou plasma. Em algumas modalida- des, a taxa de depuração é a taxa na qual o LNP é eliminado de um tecido, como tecido do fígado ou tecido do baço. Em certas modalida- des, uma alta taxa de depuração leva a um perfil de segurança sem efeitos adversos substanciais. Os lipídios com amina e lipídios biode- gradáveis podem reduzir o acúmulo de LNP na circulação e nos teci- dos. Em algumas modalidades, uma redução no acúmulo de LNP na circulação e nos tecidos leva a um perfil de segurança sem efeitos ad- versos substanciais.
[00145] Os lipídios podem ser ionizáveis, dependendo do pH do meio em que estão. Por exemplo, em um meio levemente ácido, o lipí- dio, tal como os lipídios com amina podem ser protonados e, assim, carregar uma carga positiva. Por outro lado, em um meio ligeiramente básico, como, por exemplo, sangue, onde o pH é de aproximadamente 7,35, o lipídio, tal como um lipídio de amina pode não ser protonado e, portanto, não tem carga.
[00146] A capacidade de um lipídio suportar uma carga está relaci- onada ao seu pKa intrínseco. Em algumas modalidades, os lipídios com amina da presente invenção podem cada um, independentemen- te, ter um pKa na faixa de cerca de 5,1 a cerca de 7,4. Em algumas modalidades, os lipídios biodisponíveis da presente invenção podem cada um, independentemente, ter um pKa na faixa de cerca de 5,1 a cerca de 7,4. Por exemplo, os lipídios com amina da presente inven- ção podem cada um, independentemente, ter um pKa na faixa de cer- ca de 5,8 a cerca de 6,5. Os lípidos com um pKa variando entre cerca de 5,1 e cerca de 7,4 são eficazes para a entrega de carga in vivo, por exemplo, para o fígado. Além disso, verificou-se que lipídios com um pKa variando entre cerca de 5,3 e cerca de 6,4 são eficazes para entrega in vivo, por exemplo, para tumores. Ver, Por exemplo, WO2014/136086. Lipídios adicionais
[00147] "Lipídios neutros" adequados para uso em uma composição lipídica da descrição incluem, por exemplo, uma variedade de lipídios neutros, não carregados ou zwitteriônicos. Exemplos de fosfolipídios neutros adequados para uso na presente invenção incluem, mas não estão limitados a, 5-heptadecilbenzeno-1,3-diol (resorcinol), dipalmitoil- fosfatidilcolina (DPPC), distearoilfosfatidilcolina (DSPC), fosfocolina (DOPC), dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC), fosfatidilcolina (PLPC), 1,2- distearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DAPC), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilcolina do ovo (EPC), dilauriliifosfatidilcolina (DLPC), dimiristoil- fosfatidilcolina (DMPC), 1-miristoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (MPPC), 1- palmitoil-2-miristoilfosfatidilcolina (PMPC), 1-palmitoil-2-estearoilfosfati- dilcolina (PSPC), 1,2-diarachidoyl-sn-glicero-3-fosfocolina (DBPC), 1- estearoil-2-palmitoilfosfatidilcolina (SPPC), 1,2-dieicosenoil-sn-glicero- 3-fosfocololina (DEPC), palmitoiloloilfosfatidilcolina (POPC), lisofosfati- dilcolina, dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE), dilinoleoilfosfatidilcolina distearoilfosfatidiletanolamina (DSPE), dimiristoilfosfatidiletanolamina (DMPE), dipalmitoil fosfatidiletanolamina (DPPE), palmitoiloleoil fosfa- tidiletanolamina (POPE), lisofosfatidiletanilamina e combinações des-
tes. Numa modalidade, o fosfolipídio neutro pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em distearoilfosfatidilcolina (DSPC) e di- miristoil fosfatidil etanolamina (DMPE). Noutra modalidade, o fosfolipí- dio neutro pode ser distearoilfosfatidilcolina (DSPC).
[00148] Os "lipídios auxiliares" incluem esteroides, esteróis e alquil resorcinóis. Os lipídios auxiliares adequados para uso na presente in- venção incluem, mas não estão limitados ao colesterol, 5-heptade- cilresorcinol e hemisuccinato de colesterol. Numa modalidade, o lipídio auxiliar pode ser colesterol. Numa modalidade, o lipídio auxiliar pode ser hemissuccinato de colesterol.
[00149] "Lipídios furtivos" são lipídios dissimulados que alteram o tempo em que as nanopartículas podem existir in vivo (Por exemplo, no sangue). Os lipídios furtivos podem auxiliar no processo de formu- lação, por exemplo, reduzindo a agregação de partículas e controlando o tamanho das partículas. Os lipídios furtivos utilizados neste docu- mento podem modular as propriedades farmacocinéticas dos LNP. Os lipídios furtivos adequados para uso em uma composição lipídica da descrição incluem, mas não estão limitados aos lipídios furtivos com um grupo principal hidrofílico ligado a uma fração lipídica. Lípidos furti- vos adequados para uso em uma composição lipídica da presente in- venção e informações sobre a bioquímica de tais lipídios podem ser encontrados em Romberg et al., Pharmaceutical Research, vol. 25, Nº 1, 2008, pág. 55-71 e Hoekstra et a/., Biochimica et Biophysica Acta 1660 (2004) 41-52. Lipídios com PEG adequados adicionais são divul- gados, Por exemplo, no documento WO 2006/007712.
[00150] Em uma modalidade, o grupo principal hidrofílico de lipídio furtivo compreende uma fração de polímero selecionada a partir de polímeros baseados em PEG. Os lipídios furtivos podem compreender uma fração lipídica. Em algumas modalidades, o lipídio furtivo é um lipídio com PEG.
[00151] Em uma modalidade, um lipídio furtivo compreende uma fração de polímero selecionada a partir de polímeros baseados em PEG (às vezes chamado de poli(óxido de etileno)), poli(oxazolina), po- liéálcool vinílico), poli(glicero!), poli(N-vinilpirrolidona), poliaminoácidos e poli[N-(2-hidroxipropil)metacrilamida].
[00152] Em uma modalidade, o lipídio com PEG compreende uma fração de polímero à base de PEG (às vezes referido como poli(óxido de etileno)).
[00153] O lipídiocom PEG compreende ainda uma fração lipídica. Em algumas modalidades, a fração lipídica pode ser derivada de dia- cilglicerol ou diacilglicamida, incluindo aqueles que compreendem um grupo dialquilglicerol ou dialquilglicamida com comprimento de cadeia alquil independentemente compreendendo de cerca de C4 a cerca de C40 átomos de carbono saturados ou insaturados, em que a cadeia pode compreender um ou mais átomos de carbono funcionais grupos como, por exemplo, uma amida ou éster. Em algumas modalidades, o comprimento da cadeia alquil compreende cerca de C10 a C20. O grupo dialquilglicerol ou dialquilglicamida pode ainda compreender um ou mais grupos alquil substituídos. Os comprimentos da cadeia podem ser simétricos ou assimétricos.
[00154] Salvo indicação em contrário, o termo "PEG", conforme usado neste documento, significa qualquer polietileno glicol ou outro polímero de éter polialqguileno. Numa modalidade, PEG é um polímero linear ou ramificado opcionalmente substituído de etileno glicol ou óxi- do de etileno. Numa modalidade, o PEG não é substituído. Em uma modalidade, o PEG é substituído, Por exemplo, por um ou mais grupos alquil, alcóxi, acil, hidróxi ou arila. Em uma modalidade, o termo inclui copolímeros de PEG, como PEG-poliuretano ou PEG-polipropileno (ver, Por exemplo, J. Milton Harris, Química de poli(etileno glicol): apli- cações biotecnológicas e biomédicas (1992)); em outra modalidade, o termo não inclui copolímeros de PEG. Em uma modalidade, o PEG tem um peso molecular de cerca de 130 a cerca de 50.000, em uma sub-modalidade, cerca de 150 a cerca de 30.000, em uma sub- modalidade, cerca de 150 a cerca de 20.000, em uma sub-modalidade de cerca de 150 a cerca de 15.000, em uma sub-modalidade, cerca de 150 a cerca de 10.000, em uma sub-modalidade, cerca de 150 a cerca de 6.000, em uma sub-modalidade, cerca de 150 a cerca de 5.000, em uma sub-modalidade, cerca de 150 a cerca de 4.000, em uma sub- modalidade, cerca de 150 a cerca de 3.000, em uma sub-modalidade, cerca de 300 a cerca de 3.000, em uma sub-modalidade, cerca de
1.000 a cerca de 3.000 e em uma sub-modalidade, cerca de 1.500 a cerca de 2.500.
[00155] Em certas modalidades, o PEG (Por exemplo, conjugado a uma porção lipídica ou lipídica, como um lipídio furtivo), é um "PEG- 2K", também denominado "PEG 2000", que tem um peso molecular médio de cerca de 2.000 daltons. O PEG-2K é representado neste do- cumento pela seguinte fórmula (l), em que n é 45, significando que o grau médio de polimerização do número compreende cerca de 45 su-
TA mA modalidades, n pode variar de cerca de 35 a cerca de 55. Em algumas modalidades, n pode variar de cerca de 40 a cerca de 50. Em algumas modalidades, n pode variar de cerca de 42 a cerca de 48. Em algumas modalidades, n pode ser 45. Em algumas modalidades, R pode ser selecionado dentre H, alquil substituído e alquil não substituído. Em algumas modalidades, R pode ser alquil não substituído. Em algumas modalidades, R pode ser metila.
[00156] Em qualquer uma das modalidades descritas neste docu- mento, o lipídio com PEG pode ser selecionado a partir de PEG- dilauroilglicerol, PEG-dimiristoilglicerol (PEG-DMG) (ft de catálogo GM- 020 da NOF, Tóquio, Japão), dipalmitoilglicerol PEG, distearoilglicerol PEG (PEG-DSPE) (tt de catálogo DSPE-020CN, NOF, Tóquio, Japão), PEG-dilaurilglicamida, PEG-dimiristilglicamida, PEG-dipalmitoilglica- mida e PEG-distearoiliglicamida, PEG-colesterol (1-[8'-(Colest-5-en - 3[beta]-óxi)carboxamido-3"',6'-dioxaoctanil|carbamoil-[lômega]-metil-poli (etileno glicol), DMB PEG (3,4-ditetradecoxilbenzil- [ômega]-metil- poli(etileno glicol)éter), 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N- [metóxi (polietileno glicol)-2000] (PEG2k-DMG) (cat. HX880150P de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EUA), 1,2-distearoil-sn-gli- cero-3-fosfoetanolamina-N-[metóxi (polietileno glicol)-2000] (PEG2k- DSPE) (cat. %880120C de Avanti Polar Lipids, Alabaster, Alabama, EUA), 1,2-distearoil-sn-glicerol, metoxipolietilenoglico! (PEG2Kk-DSG; GS-020, NOF Tóquio, Japão), poli(etileno glicol)-2000-dimetacrilato (PEG2k-DMA) e 1,2-disteariloxipropil-3-amina-N-[metóxi (polietileno glico1)-2000] (PEG2K-DSA). Numa modalidade, o lipídio com PEG po- de ser PEG2k-DMG. Em algumas modalidades, o lipídio do PEG pode ser PEG2Kk-DSG. Numa modalidade, o lipídio com PEG pode ser PEG2K-DSPE. Numa modalidade, o lipídio com PEG pode ser PEG2k- DMA. Numa modalidade, o lipídio com PEG pode ser PEG2k-DMA. Em uma modalidade, o lipídio com PEG pode ser o composto S027, divulgado no documento WOZ2016/010840 (parágrafos [00240] a
[00244]). Numa modalidade, o lipídio com PEG pode ser PEG2k-DSA. Numa modalidade, o lipídio com PEG pode ser PEG2k-C11. Em algu- mas modalidades, o lipídio com PEG pode ser PEG2k-C14. Em algu- mas modalidades, o lipídio com PEG pode ser PEG2k-C16. Em algu- mas modalidades, o lipídio com PEG pode ser PEG2k-C18.
Formulações de LNP
[00157] O LNP pode conter (i) um lipído biodegradável, (ii) um lipí- dio neutro opcional, (iii) um lipídio auxiliar e (iv) um lipídio furtivo, tal como um lipidio com PEG. O LNP pode conter um lipídio biodegradá- vel e um ou mais lipídios neutros, lipídios auxiliares e lipídios dissimu- lados, como lipídios com PEG.
[00158] O LNP pode conter (i) um lipídio de amina para encapsula- mento e escape endossômico, (ii) um lipídio neutro para estabilização, (iii) um lipídio auxiliar, também para estabilização e (iv) um lipídio furti- vo, como um lipídio com PEG. O LNP pode conter um lipídio de amina e um ou mais lipídios neutros, lipídios auxiliares, também para estabili- zação, e lipídios dissimulados, como lipídios com PEG.
[00159] Em algumas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um componente de RNA que inclui um ou mais de um agente de ligação a DNA guiado a RNA, um mRNA da nuclease Cas, um mRNA da nuclease Cas de Classe 2, um mRNA de Cas9 e um gRNA. Em algumas modalidades, uma composição de LNP pode in- cluir uma nuclease Cas de Classe 2 e um gRNA como componente de RNA. Em certas modalidades, uma composição de LNP pode compre- ender o componente de RNA, um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio furtivo. Em certas composições de LNP, O lipídio auxiliar é o colesterol. Noutras composições, o lipídio neutro é DSPC. Em modalidades adicionais, o lipídio furtivo é PEG2k-DMG ou PEG2Kk-C11. Em certas modalidades, a composição de LNP compre- ende lipídio A ou um equivalente de lipídio A; um lipídio auxiliar; um lipídio neutro; um lipídio furtivo; e um RNA guia. Em certas composi- ções, o lipídio de amina é o lipídio A. Em certas composições, o lipídio de amina é o lipídio A ou um análogo de acetal deste; o lipídio auxiliar é o colesterol; o lipídio neutro é DSPC; e o lipídio furtivo é o PEG2k- DMG.
[00160] Em certas modalidades, as composições lipídicas são des- critas de acordo com as respectivas razões molares dos lipídios com- ponentes na formulação. Modalidades da presente invenção fornecem composições lipídicas descritas de acordo com as respectivas propor- ções molares dos lipídios componentes na formulação. Numa modali- dade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 30% molar a cerca de 60% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 40% molar a cerca de 60% molar. Numa modali- dade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 45% molar a cerca de 60% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 50% molar a cerca de 60% molar. Numa modali- dade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 55% molar a cerca de 60% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 50% molar a cerca de 55% molar. Numa modali- dade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 50% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio de amina pode ser de cerca de 55% molar. Em algumas modalidades, a% molar do lipídio de amina do lote de LNP será de + 30%, + 25%, + 20%, + 15%, + 10%, + 5% ou + 2,5% da% molar alvo. Em algumas modalidades, a% molar do lipídio de amina do lote de LNP será de + 4% molar, + 3% molar, + 2% molar, + 1,5% molar, + 1% molar, + 0,5% molar, ou + 0,25% molar da% alvo molar. Todos os números% molares são dados como uma fração do componente lipídico das composições de LNP. Em certas modalida- des, a variabilidade entre lotes de LNP da% molar do lipídio de amina será menor que 15%, menor que 10% ou menor que 5%.
[00161] Numa modalidade, a % molar do lipídio neutro pode ser de cerca de 5% molar a cerca de 15% molar. Numa modalidade, a% mo- lar do lipídio neutro pode ser de cerca de 7% molar a cerca de 12% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio natural pode ser de cer- ca de 9% molar. Em algumas modalidades, a% molar do lipídio neutro do lote de LNP será de + 30%, + 25%, + 20%, + 15%, + 10%, + 5% ou + 2,5% da% molar do alvo lipídico neutro. Em certas modalidades, a variabilidade entre lotes de LNP será menor que 15%, menor que 10% ou menor que 5%.
[00162] Numa modalidade, a% molar do lipídio auxiliar pode ser de cerca de 20% molar a cerca de 60% molar. Numa modalidade, a% mo- lar do lipídio auxiliar pode ser de cerca de 25% molar a cerca de 55% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio auxiliar pode ser de cer- ca de 25% molar a cerca de 50% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio auxiliar pode ser de cerca de 25% molar a cerca de 40% mo- lar. Numa modalidade, a% molar do lipídio auxiliar pode ser de cerca de 30% molar a cerca de 50% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio auxiliar pode ser de cerca de 30% molar a cerca de 40% molar. Em uma modalidade, a% molar do lipídio auxiliar é ajustada com base nas concentrações de lipídio de amina, lipídio neutro e lipídio com PEG para levar o componente lipídico a 100% molar. Em algumas modalidades, a% auxiliar em mol do lote de LNP será de + 30%, + 25%, + 20%, + 15%, + 10%, + 5% ou + 2,5% da% molar alvo. Em cer- tas modalidades, a variabilidade entre lotes de LNP será menor que 15%, menor que 10% ou menor que 5%.
[00163] “Numa modalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 1% molar a cerca de 10% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 2% molar a cerca de 10% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 2% molar a cerca de 8% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 2% molar a cerca de 4% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 2,5% molar a cerca de 4% molar. Numa modalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 3% molar. Numa mo- dalidade, a% molar do lipídio com PEG pode ser de cerca de 2,5%
7TT7II87 molar. Em algumas modalidades, a% molar do lipídio com PEG do lote de LNP será de + 30%, + 25%, + 20%, + 15%, + 10%, + 5% ou + 2,5% da% molar do alvo lipídico PEG. Em certas modalidades, a variabilida- de entre lotes de LNP será menor que 15%, menor que 10% ou menor que 5%.
[00164] Em certas modalidades, a carga inclui um mRNA que codi- fica um agente de ligação a DNA guiado por RNA (por exemplo, uma nuclease Cas, uma nuclease Cas ou Cas9 de Classe 2) e um gRNA ou um ácido nucleico que codifica um gRNA ou uma combinação de mMRNA e gRNA. Numa modalidade, uma composição de LNP pode compreender um lipídio A ou seus equivalentes. Em alguns aspectos, oO lipídio de amina é o lipídio A. Em alguns aspectos, o lipídio de amina é um equivalente do lipídio A, por exemplo, um análogo do lipídio A. Em certos aspectos, o lipídio de amina é um análogo acetal do lipídio A. Em várias modalidades, uma composição de LNP compreende um lipídio de amina, um lipídio neutro, um lipídio auxiliar e um lipídio com PEG. Em certas modalidades, o lipídio auxiliar é o colesterol. Em cer- tas modalidades, o lipídio neutro é DSPC. Em modalidades específi- cas, o lipídio com PEG é PEG2Kk-DMG. Em algumas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um lipídio A, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em algumas modali- dades, uma composição de LNP compreende um lipídio de amina, DSPC, colesterol e um lipídio com PEG. Em algumas modalidades, a composição de LNP compreende um lipídio com PEG compreendendo DMG. Em certas modalidades, o lipídio de amina é selecionado a partir do lipídio A e um equivalente do lipídio A, incluindo um análogo de acetal do lipídio A. Em modalidades adicionais, uma composição de LNP compreende lipídio A, colesterol, DSPC e PEG2k-DMG.
[00165] “Modalidades da presente invenção também fornecem com- posições lipídicas descritas de acordo com a razão molar entre os gru-
pos amina com carga positiva do lipídio de amina (N) e os grupos fos- fato com carga negativa (P) do ácido nucleico a ser encapsulado. Isso pode ser matematicamente representado pela equação N/P. Em algu- mas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um componente lipídico que compreende um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio auxiliar; e um componente de ácido nucleico, em que a razão N/P é de cerca de 3 a 10. Em algumas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um compo- nente lipídico que compreende um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio auxiliar; e um componente de RNA, em que a razão N/P é de cerca de 3 a 10. Numa modalidade, a razão N/P pode ser de cerca de 5 a 7. Numa modalidade, a razão N/P pode ser de cerca de 4,5 a 8. Numa modalidade, a razão N/P pode ser de cerca de 6. Numa modalidade, a razão N/P pode ser 6 + 1. Numa modalida- de, a razão N/P pode ser de cerca de 6 + 0,5. Em algumas modalida- des, a razão N/P será de + 30%, + 25%, + 20%, + 15%, + 10%, + 5% ou + 2,5% da razão N/P alvo. Em certas modalidades, a variabilidade entre lotes de LNP será menor que 15%, menor que 10% ou menor que 5%.
[00166] Em algumas modalidades, o componente de RNA pode compreender um mRNA, como um mMRNA que codifica uma nuclease Cas. Numa modalidade, o componente de RNA pode compreender um MRNA de Cas9. Em algumas composições compreendendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas, o LNP compreende ainda um ácido nucleico de gRNA, como um gRNA. Em algumas modalidades, o com- ponente de RNA compreende um mRNA da nuclease Cas e um gRNA. Em algumas modalidades, o componente de RNA compreende um MRNA de nuclease Cas de Classe 2 e um gRNA.
[00167] Em certas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um mRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, uma lipina com amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em certas composições de LNP compreendendo um mRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, o lipídio auxiliar é o colesterol. Noutras composições compreendendo um mRNA que codifica uma nuclease Cas tal como uma nuclease Cas de Classe 2, o lipídio neutro é DSPC. Em modalidades adicionais compreendendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, o lipídio com PEG é PEG2Kk-DMG ou PEG2k-C11. Em composições específicas que compreendem um mRNA que codifica uma nuclease Cas, como uma nuclease Cas de Classe 2, o lipídio de amina é selecionado a partir do lipídio A e seus equivalentes, como um análogo de acetal do lipídio A.
[00168] Em algumas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um gRNA. Em certas modalidades, uma composição de LNP pode compreender um lipídio de amina, um gRNA, um lipídio au- xiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em certas composições de LNP compreendendo um gRNA, o lipídio auxiliar é o colesterol. Em algumas composições compreendendo um gRNA, o lipídio neutro é DSPC. Em modalidades adicionais compreendendo um gRNA, o lipí- dio com PEG é PEG2Kk-DMG ou PEG2Kk-C11. Em certas modalidades, o lipídio de amina é selecionado a partir do lipídio A e seus equivalen- tes, como um análogo de acetal do lipídio A.
[00169] Numa modalidade, uma composição de LNP pode compre- ender um sgaRNA. Numa modalidade, uma composição de LNP pode compreender um sgRNA de Cas9. Numa modalidade, uma composi- ção de LNP pode compreender um sgRNA de Cpf1. Em algumas composições compreendendo um sgRNA, o LNP inclui um lipídio de amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em certas composições compreendendo um sgRNA, o lipídio auxiliar é o colesterol. Noutras composições compreendendo um sgRNA, o lipídio neutro é DSPC. Em modalidades adicionais compreendendo um sgR- NA, o lipídio com PEG é PEG2k-DMG ou PEG2K-C11. Em certas mo- dalidades, o lipídio de amina é selecionado a partir do lipídio A e seus equivalentes, como um análogo de acetal do lipídio A.
[00170] Em certas modalidades, uma composição de LNP compre- ende um mRNA que codifica uma nuclease Cas e um gRNA, que pode ser um sgaRNA. Em uma modalidade, uma composição de LNP pode compreender um lipídio de amina, um mRNA que codifica uma nu- clease Cas, um gRNA, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG. Em certas composições compreendendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas e um gRNA, o lipídio auxiliar é o colesterol. Em algumas composições compreendendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas e um gRNA, o lipídio neutro é DSPC. Em modali- dades adicionais compreendendo um mRNA que codifica uma nu- clease Cas e um gRNA, o lipídio com PEG é PEG2k-DMG ou PEG2k- C11. Em certas modalidades, o lipídio de amina é selecionado a partir do lipídio A e seus equivalentes, como um análogo de acetal do lipídio A.
[00171] Em certas modalidades, as composições de LNP incluem um mRNA de nuclease Cas, como um mRNA Cas de Classe 2 e pelo menos um gRNA. Em certas modalidades, a composição de LNP inclui uma relação de gRNA para mRNA de nuclease Cas, como mMRNA de nuclease Cas de Classe 2 de cerca de 25:1 a cerca de 1:25. Em certas modalidades, a formulação de LNP inclui uma relação de gRNA para mMRNA de nuclease Cas, como mMRNA de nuclease de Cas de Classe 2 de cerca de 10:1 a cerca de 1:10. Em certas modalidades, a formula- ção de LNP inclui uma relação de gRNA para mRNA de nuclease Cas, como o mMRNA de nuclease Cas de Classe 2 de cerca de 8:1 a cerca de 1:8. Conforme medido neste documento, as relações são em peso. Em algumas modalidades, a formulação de LNP inclui uma relação de gRNA para mRNA de nuclease Cas, como MRNA de Cas de Classe 2 de cerca de 5:1 a cerca de 1:5. Em algumas modalidades, o intervalo de relações é de cerca de 3:1 a 1:3, cerca de 2:1 a 1:2, cerca de 5:1 a 1:2, cerca de 5:1 a 1:1, cerca de 3:1 a 1:2, cerca de 3:1 a 1:1, cerca de 3:1, cerca de 2:1 a 1:1. Em algumas modalidades, a relação de gRNA para mRNA é de cerca de 3:1 ou cerca de 2:1 Em algumas modalida- des, a relação de gRNA para mRNA de nuclease Cas, como a nu- clease Cas de Classe 2 é de cerca de 1:1. A relação pode ser de 25:1, 10:1, 5:1, 3:1, 1:1, 1:3, 1:5, 1:10 ou 1:25.
[00172] As composições de LNP divulgadas neste documento po- dem incluir um ácido nucleico modelo. O ácido nucleico modelo pode ser co-formulado com um mRNA que codifica uma nuclease Cas, tal como um mMRNA de nuclease Cas de Classe 2. Em algumas modali- dades, o ácido nucleico modelo pode ser co-formulado com um RNA guia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modelo pode ser co- formulado com um mRNA que codifica uma nuclease Cas e um RNA guia. Em algumas modalidades, o ácido nucleico modelo pode ser formulado separadamente de um mRNA que codifica uma nuclease Cas ou um RNA guia. O ácido nucleico modelo pode ser entregue com ou separadamente das composições de LNP. Em algumas modalida- des, o ácido nucleico modelo pode ser de fita simples ou dupla, de- pendendo do mecanismo de reparo desejado. O modelo pode ter regi- ões de homologia para o DNA alvo ou para sequências adjacentes ao DNA alvo.
[00173] Em algumas modalidades, os LNPs são formados mistu- rando uma solução aquosa de RNA com uma solução lipídica à base de solvente orgânico, por exemplo, 100% de etanol. Soluções ou sol- ventes adequados incluem ou podem conter: água, PBS, tampão Tris, NaCl, tampão citrato, etanol, clorofórmio, éter dietílico, ciclo-hexano, tetra-hidrofurano, metanol, isopropanol. Um tampão farmaceuticamen-
te aceitável, por exemplo, para administração in vivo de LNPs, pode ser usado.
Em certas modalidades, um tampão é usado para manter o pH da composição compreendendo LNPs em pH 6,5 ou acima.
Em certas modalidades, um tampão é usado para manter o pH da compo- sição compreendendo LNPs em pH 7,0 ou acima.
Em certas modali- dades, a composição tem um pH variando de cerca de 7,2 a cerca de 7,7. Em modalidades adicionais, a composição tem um pH variando de cerca de 7,3 a cerca de 7,7 ou variando de cerca de 7,4 a cerca de 7,6. Em outras modalidades, a composição tem um pH de cerca de 7,2, 7,3, 74, 7,5, 7,6 ou 7,7. O pH de uma composição pode ser medi- do com uma sonda de micro pH.
Em certas modalidades, um criopro- tetor é incluído na composição.
Exemplos não limitativos de crioprote- tores incluem sacarose, trealose, glicerol, DMSO e etileno glicol.
Com- posições exemplares podem incluir até 10% de crioprotetor, como, por exemplo, sacarose.
Em certas modalidades, a composição de LNP pode incluir cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% de crioprotetor.
Em certas modalidades, a composição de LNP pode incluir cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10% de sacarose.
Em algumas modalidades, a composição de LNP pode incluir um tampão.
Em algumas modalida- des, o tampão pode compreender um tampão fosfato (PBS), um tam- pão Tris, um tampão citrato e suas misturas.
Em certas modalidades exemplares, o tampão compreende NaCl.
Em certas modalidades, o NaCl é omitido.
Quantidades exemplares de NaCl podem variar de cerca de 20 mM a cerca de 45 mM.
Quantidades exemplares de NaCl podem variar de cerca de 40 mM a cerca de 50 MM.
Em algumas mo- dalidades, a quantidade de NaCl é de cerca de 45 mM.
Em algumas modalidades, o tampão é um tampão Tris.
Quantidades exemplares de Tris podem variar de cerca de 20 mM a cerca de 60 mM.
Quantidades exemplares de Tris podem variar de cerca de 40 mM a cerca de 60 MM.
Em algumas modalidades, a quantidade de Tris é de cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, o tampão compreende NaCl e Tris. Certas modalidades exemplares das composições de LNP contêm sa- carose a 5% e 45 mM de NaCl em tampão Tris. Em outras modalida- des exemplares, as composições contêm sacarose em uma quantida- de de cerca de 5% pí/v, cerca de 45 mM de NaCl e cerca de 50 mM de Tris a pH 7,5. As quantidades de sal, tampão e crioprotetor podem va- riar de tal modo que a osmolalidade da formulação geral seja mantida. Por exemplo, a osmolalidade final pode ser mantida em menos de 450 mOsm/L. Em outras modalidades, a osmolalidade está entre 350 e 250 mOsm/L. Certas modalidades têm uma osmolalidade final de 300 +/- mOsm/L.
[00174] Em algumas modalidades, mistura microfluídica, mistura T ou mistura cruzada é usada. Em certos aspectos, as taxas de fluxo, tamanho da junção, geometria da junção, formato da junção, diâmetro do tubo, soluções e/ou concentrações de RNA e lipídios podem variar. As composições de LNPs ou LNP podem ser concentradas ou purifi- cadas, Por exemplo, através da diálise, filtração de fluxo tangencial ou cromatografia. Os LNPs podem ser armazenados como uma suspen- são, uma emulsão ou um pó liofilizado, por exemplo. Em algumas mo- dalidades, uma composição de LNP é armazenada a 2-8ºC, em certos aspectos, as composições de LNP são armazenadas à temperatura ambiente. Em modalidades adicionais, uma composição de LNP é ar- mazenada congelada, por exemplo, a -20ºC ou -80ºC. Em outras mo- dalidades, uma composição de LNP é armazenada a uma temperatura variando de cerca de 0ºC a cerca de -80ºC. As composições de LNP congeladas podem ser descongeladas antes do uso, por exemplo no gelo a 4ºC à temperatura ambiente ou a 25ºC. As composições de LNP congeladas podem ser mantidas a várias temperaturas, por exemplo no gelo a 4ºC à temperatura ambiente a 25ºC ou a 37ºC.
Métodos de manipulação de células-tronco, por exemplo, HSPCs; Células-tronco manipuladas, por exemplo, HSPCs
[00175] As composições de LNP divulgadas neste documento po- dem ser usadas em métodos para manipulação de células-tronco, por exemplo, HSPCs, por exemplo, pela edição de genes do sistema CRISPR/Cas in vitro. Em algumas modalidades, a população de célu- las geneticamente manipuladas é uma população de células CD34+. Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir uma população de células HSPC ou CD34+ geneticamente manipuladasin vitro, o método compreendendo (a) pré-incubação de um fator sérico com uma composição de LNP para a entrega de um mMRNA da nu- clease Cas e um gRNA; (b) entrando em contato com a população de células HSPC ou CD34+ com a composição pré-incubada de LNP in vitro; e (c) cultivando a população de células HSPC ou CD34+ in vitro, produzindo assim um HSPC geneticamente manipulado. Em algumas modalidades, os métodos envolvem o contato de uma célula HSPC ou CD34+ com uma composição de LNP descrita neste documento de acordo com os métodos de entrega descritos nesta descrição.
[00176] Em algumas modalidades, as células-tronco manipuladas, por exemplo, HSPCs, são fornecidas, por exemplo, uma população de HSPC ou HSPC manipulada. Tais células manipuladas são produzidas de acordo com os métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, o HSPC manipulado reside dentro de um tecido ou ór- gão, por exemplo, medula óssea, sangue ou outro tecido dentro de um sujeito, por exemplo, após o transplante de um HSPC manipulado.
[00177] Em alguns dos métodos e células descritos neste documen- to, uma célula compreende uma modificação, por exemplo, uma inser- ção ou deleção("indel") ou substituição de nucleotídeos em uma se- quência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma inserção de 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais nucleotídeos em uma sequên-
cia alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma inserção de 1 ou 2 nucleotídeos em uma sequência alvo. Em outras modalidades, a modificação compreende uma deleção de 1,2,3,4,5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 ou mais nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma dele- ção de 1 ou 2 nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas mo- dalidades, a modificação compreende um indel que resulta em uma mutação de deslocamento de frameshift em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma substituição de 1,2,3,4,5,6,7,8, 9,10, 15, 20 ou 25 ou mais nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma substituição de 1 ou 2 nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende um ou mais de uma inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos resultantes da in- corporação de um ácido nucleico padrão, por exemplo, qualquer um dos ácidos nucleicos padrão descritos neste documento.
[00178] Em algumas modalidades, é fornecida uma população de células compreendendo células manipuladas, por exemplo, uma popu- lação de células compreendendo células manipuladas de acordo com os métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, a população compreende células manipuladas cultivadas in vitro. Em algumas modalidades, a população reside dentro de um tecido ou ór- gão, por exemplo, um fígado dentro de um sujeito. Em algumas moda- lidades, pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo me- nos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pe- lo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% ou mais das células da população é manipulada. Em certas mo- dalidades, um método divulgado neste documento resulta em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pe- lo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de efici- ência de edição (ou "percentagem de edição"), definida pela detecção de indels. Em outras modalidades, um método divulgado neste docu- mento resulta em pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 15%, pelo menos 20%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo me- nos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% ou pelo menos 95% de eficiência na modificação do DNA, definida pela detecção de uma mudança na sequência, seja por inserção, deleção, substituição ou de outra forma. Em certas modalidades, um método neste documento divulgado resulta em um nível de eficiência de edi- ção ou um nível de eficiência de modificação de DNA entre cerca de 5% a cerca de 100%, cerca de 10% a cerca de 50%, cerca de 20 a cerca de 100%, cerca de 20 a cerca de 80%, cerca de 40 a cerca de 100% ou cerca de 40 a cerca de 80% em uma população de células.
[00179] Em alguns dos métodos e células descritos neste documen- to, as células dentro da população compreendem uma modificação, por exemplo, um indel ou substituição em uma sequência alvo. Em al- gumas modalidades, a modificação compreende uma inserção de 1,2, 3, 4 ou 5 ou mais nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma inserção de 1 ou 2 nu- cleotídeos em uma sequência alvo. Em outras modalidades, a modifi- cação compreende uma deleção de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 ou mais nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas mo- dalidades, a modificação compreende uma deleção de 1 ou 2 nucleo-
tídeos em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modifica- ção resulta em uma mutação de deslocamento de frameshift em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende um indel que resulta em uma mutação de deslocamento de frameshift em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo me- nos 99% ou mais das células manipuladas na população compreen- dem uma mutação de deslocamento de frameshift. Em algumas moda- lidades, a modificação compreende uma substituição de 1, 2,3,4,5,6, 7, 8, 9, 10, 15, 20 ou 25 ou mais nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma substitui- ção de 1 ou 2 nucleotídeos em uma sequência alvo. Em algumas mo- dalidades, a modificação compreende um ou mais de uma inserção, deleção ou substituição de nucleotídeos resultantes da incorporação de um ácido nucleico padrão, por exemplo, qualquer um dos ácidos nucleicos padrão descritos neste documento.
Métodos de edição de genes
[00180] Os métodos divulgados neste documento podem ser utili- zados para edição de genes em uma célula-tronco, uma população de HSPC ou HSPC in vitro. Em uma modalidade, uma ou mais composi- ções de LNP descritas neste documento podem ser administradas a uma célula-tronco, uma HSPC ou uma população de HSPC. Em uma modalidade, uma ou mais composições de LNP descritas neste docu- mento podem entrar em contato com uma célula-tronco, um HSPC e HSC ou um HPC. Em uma modalidade, uma célula geneticamente modificada pode ser produzida entrando em contato com uma célula com uma composição de LNP de acordo com os métodos descritos neste documento. Em alguns métodos de edição de genes, a popula-
ção de HSPC ou HSPC é mantida em cultura. Em alguns métodos de edição de genes, a população de HSPC ou HSPC é transplantada pa- ra um paciente. Em algumas modalidades, o HSPC geneticamente manipulado reside dentro de um tecido ou órgão, por exemplo, medula óssea, sangue ou outro tecido dentro de um paciente, por exemplo, após o transplante de um HSPC manipulado.
[00181] Em algumas modalidades, o método compreende uma po- pulação de células-tronco, uma HSPC ou HSPC autóloga em relação a um paciente a ser administrado à célula. Em algumas modalidades, o método compreende uma população de HSPC ou HSPC que é alogê- nica com relação a um paciente para ser administrada a referida célu- la.
[00182] Em várias modalidades, os métodos descritos neste docu- mento atingem a edição do gene CRISPR-Cas na população de célu- las-tronco, HSPC ou HSPC. Em algumas modalidades, os métodos compreendem ainda detectar a edição de genes na população de HSPC ou HSPC. Em algumas modalidades, a edição de genes é me- dida como percentagem de edição. Em algumas modalidades, as edi- ções dos genes são medidas como percentagem de modificação do DNA. Os métodos podem atingir pelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de edição. Os métodos podem alcançar pelo menos 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% de modificação do DNA.
[00183] Em uma modalidade, uma composição de LNP compreen- dendo um mMRNA que codifica uma nuclease Cas de Classe 2 e um gRNA pode ser administrado a uma célula-tronco, uma HSPC ou uma população de HSPC. Em modalidades adicionais, um ácido nucleico modelo também é introduzido na célula. Em certos casos, uma com- posição de LNP compreendendo uma nuclease Cas de Classe 2 e um SgRNA pode ser administrada a uma célula.
[00184] Numa modalidade, as composições de LNP podem ser usadas para editar um gene em uma célula-tronco, uma população de HSPC ou HSPC, resultando em um nocaute genético. Em uma moda- lidade, as composições de LNP podem ser usadas para editar um ge- ne em uma população de HSPC ou HSPC resultando em knockdown de genes, por exemplo, na população de células. O khnockdown ou no- caute pode ser detectado medindo os níveis de proteína alvo. O Kknockdown ou nocaute pode ser detectado através da detecção do DNA alvo. Em outra modalidade, as composições de LNP podem ser usadas para editar um gene em uma população de HSPC ou HSPC, resultando em uma correção de gene. Em uma modalidade adicional, as composições de LNP podem ser usadas para editar uma célula que resulta na inserção de genes.
[00185] As composições de LNP podem ser administradas como uma formulação em associação com um ou mais excipientes farma- ceuticamente aceitáveis. O termo "excipiente" inclui qualquer ingredi- ente que não seja (m) o (s) composto (s) da descrição, o (s) outro (s) componente (s) lipídico (s) e o agente biologicamente ativo. Um exci- piente pode conferir uma característica funcional (Por exemplo, contro- le da taxa de liberação do medicamento) e/ou uma característica não funcional (Por exemplo, auxiliar de processamento ou diluente) às for- mulações. A escolha do excipiente dependerá, em grande medida, de fatores como o modo particular de administração, o efeito do excipien- te na célula-tronco ou na cultura de HSPC, e na solubilidade e estabili- dade, e na natureza da forma de dosagem.
[00186] Nos casos em que a formulação é aquosa, excipientes co- mo açúcares (incluindo, entre outros, glicose, manitol, sorbitol, etc.) sais, carboidratos e agentes tamponantes (de preferência a um pH de 3 a 9), mas, para alguns pedidos, eles podem ser formulados de ma- neira mais adequada com uma solução não aquosa estéril ou como uma forma seca para ser usada em conjunto com um veículo adequa-
do, como água estéril, livre de pirogênio (WFI).
[00187] Embora a invenção seja descrita em conjunto com as mo- dalidades ilustradas, é entendido que não se destina a limitar a inven- ção às modalidades. Pelo contrário, a invenção pretende abranger to- das as alternativas, modificações e equivalentes, incluindo equivalen- tes de características específicas, que podem ser incluídas na inven- ção, conforme definido pelas reivindicações anexas.
[00188] Tanto a descrição geral acima como a descrição detalhada, bem como os exemplos a seguir, são exemplificativos e explicativos, e não são restritivos aos ensinamentos. Os títulos das seções usados neste documento são para fins organizacionais apenas e não devem ser interpretados como limitando o assunto desejado de qualquer mo- do. No caso de qualquer literatura incorporada por referência contradi- zer qualquer termo definido nesta especificação, esta especificação controla. Todos os intervalos fornecidos no pedido abrangem os pon- tos de extremidade, salvo indicação em contrário.
[00189] Deve-se notar que, conforme usado neste pedido, a forma singular "um", "uma" e "o/a" incluem referências plurais, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Assim, por exemplo, a refe- rência a "uma composição" inclui uma pluralidade de composições e a referência a "uma célula" inclui uma pluralidade de células e similares. O uso de "ou" é inclusivo e significa "e/ou", salvo indicação em contrá- rio.
[00190] Os intervalos numéricos incluem os números que definem o intervalo. Os valores medidos e mensuráveis são entendidos como aproximados, levando em consideração dígitos significativos e o erro associado à medição. O termo "cerca" ou "aproximadamente" significa um erro aceitável para um valor particular determinado por aquele ver- sado na técnica, o que depende em parte da forma como o valor é medido ou determinado. O uso de um modificador como "cerca de"
antes de um intervalo ou antes de uma lista de valores que modifica cada ponto final do intervalo ou cada valor na lista. Por exemplo, "cer- ca de 50-55" abrange "cerca de 50 a cerca de 55". Além disso, o uso de "compreendem", "compreende", "compreendendo", "contém", "con- tendo", "contêm", "incluem", "inclui", "incluindo" não são limitantes.
[00191] A menos que especificamente indicado na especificação acima, modalidades na especificação que recitam "compreendendo" vários componentes também são contemplados como "consistindo em" ou "consistindo essencialmente em" os componentes recitados; moda- lidades na especificação que recitam "consistindo em" vários compo- nentes também são contemplados como "compreendendo" ou "consis- tindo essencialmente em" os componentes recitados; modalidades na especificação que recitam "cerca de" vários componentes também são contemplados como "nos" componentes recitados; e modalidades na especificação que recitam "consistindo essencialmente em" vários componentes também são contemplados como "consistindo em" ou "compreendendo" os componentes recitados (essa intercambiabilidade não se aplica ao uso desses termos nas reivindicações).
EXEMPLOS Exemplo 1 - Métodos Cultura Celular
[00192] As células da medula óssea CD34+ humanas criopreserva- das foram obtidas de AllCells (cat. ABMO17F) ou StemCell Technolo- gies (cat. Nº 70008). Após descongelar e lavar duas vezes em 20 ml de StemSpan SFEM (tecnologias de células-tronco, cat. Nº 09650), as células foram cultivadas por 48 horas em StemSpan SFEM (StemCell Technologies, cat. Nº 09650) contendo trombopoietina (TPO, 50ng/ml, StemCell Technologies, Nº de cat. 02922), ligando FIt3 humano (FIt3l, 50ng/ml, StemCell Technologies, Nº de cat. 78137,2), interleucina-6 humana (1I-6, 50ng/mL, StemCell Technologies, Mº de cat. 78148,2),
fator de células-tronco humanas (SCF, 50ng/ml, tecnologias StemCell, código Nº 78155,2) e StemRegenin-1 (SR1, 0,75uM), bem como Peni- cilina/Estreptomicina (P/S, 100U/ml de penicilina e Estreptomicina 100ug/ml, Life Technologies, Nº de cat. 15140122).
Formulação de nanopartículas lipídicas ("LNP")
[00193] Os LNPs foram formulados dissolvendo componentes de nanopartículas lipídicas em etanol 100% com as seguintes razões mo- lares: 45% molar (12,7 mM) de lipídio de amina (Por exemplo, lipídio A); Lipídio auxiliar 44% molar (12,4 mM) (Por exemplo, colesterol); 9% em mol (2,53 mM) de lipídio neutro (Por exemplo, DSPC); e 2% molar (.563 mM) de lipídio com PEG (Por exemplo, PEG2k-DMG ou PEG2k- C11), exceto conforme especificado abaixo. A razão N/P (mol de ami- na lipídica para mol de RNA) foi de 4,5. Os números de identificação para formulações de LNP são os seguintes: LNP522, LNP525 (mMRNA GFP) e LNP670, LNP926 (guia único B2M, mRNA Cas9) e LNP899 (guia único AAVS1, mRNA Cas9). As cargas de RNA foram dissolvi- das em tampão acetato 50 mM, pH 4,5 ou citrato de sódio 25 mM, NaCl 100 mM, pH 5,0, resultando em uma concentração de carga de RNA de aproximadamente 0,45 mg/mL.
[00194] Os LNPs foram formados por mistura microfluídica das so- luções de lipídios e RNA usando um instrumento de bancada Precision Nanosystems NanoAssembIrTM, de acordo com o protocolo do fabri- cante. Uma razão de 2:1 de solvente aquoso para orgânico foi mantida durante a mistura usando taxas de fluxo diferenciais. Após mistura, os LNP's foram coletados e diluídos em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4 (PBS) ou 50 mM tris, pH 7,5 (Tris) (aproximadamente 1: 1) para reduzir o teor de etanol antes do processamento posterior. À troca final de tampão foi concluída por diálise em PBS ou Tris (exces- so de 100 vezes o volume da amostra), durante a noite a 4ºC sob agi- tação suave usando um cassete de diálise Slide-a-Lyzer"M G2 10 kDa
(ThermoFisher Scientific). As formulações processadas com Tris foram diluídas 1:1 em tris 100 mM, solução salina 90 mM, sacarose a 5% (p/v), pH 7,5 (2x TSS). Alternativamente, os LNPs foram coletados após a mistura, diluídos em água, mantidos em temperatura ambiente por 1 hora e diluídos uma segunda vez 1:1 com água. A troca final de tampão no TSS foi concluída com as colunas de dessalinização PD-10 (GE). Se necessário, as formulações por qualquer método de proces- samento foram concentradas por centrifugação com filtros centrífugos Amicon 100 kDa (Millipore). A mistura resultante foi então filtrada usando um filtro estéril de 0,2 um. O filtrado resultante foi armazenado a 2-8ºC se o tampão final fosse PBS ou -80ºC se o tampão final fosse TSS.
Transcrição in vitro ("IVT") de mMRNA da Nuclease e RNA de quia único (SsgRNA)
[00195] O mRNA de Cas9 tampado e poliadenilado foi gerado por transcrição in vitro usando um modelo de DNA de plasmídeo lineariza- do e polimerase de RNA T7. O DNA do plasmídeo contendo um pro- motor T7 e uma região poli(A/T) de 100 resíduos foi linearizado por incubação a 37ºC por 2 horas com Xbal com as seguintes condições: plasmídeo de 200 ng/ul, 2 U/ul de Xbal (NEB), e 1x tampão de rea- ção. O Xbal foi inativado por aquecimento da reação a 65ºC por 20 min. O plasmídeo linearizado foi purificado a partir de sais de enzima e tampão usando uma coluna de sílica maxi spin (Epoch Life Sciences) e analisado por gel de agarose para confirmar a linearização. A reação de IVT para gerar MRNA modificado por Cas9 foi incubada a 37ºC por 4 horas nas seguintes condições: 50 ng/uL de plasmídeo linearizado; 2 MM cada de GTP, ATP, CTP e Ni-metil pseudo-UTP (Trilink)) ARCA MM (Trilink); 5 U/uL de RNA polimerase T7 (NEB); 1 U/uL de inibi- dor da RNase murina (NEB); 0,004 U/uL de E. coli pirofosfatase inor- gânica (NEB); e 1x tampão de reação. Após as 4 horas de incubação,
TURBO DNase (ThermoFisher) foi adicionada a uma concentração final de 0,01 U/uL e a reação foi incubada por mais 30 minutos para remover o molde de DNA. O mRNA de Cas9 foi purificado usando um método de precipitação de LiCI.
[00196] Paratodos os métodos, a concentração do transcrito foi de- terminada medindo a absorvância da luz a 260 nm (Nanodrop), e o transcrito foi analisado por eletroforese capilar pela Bioanlayzer (Agi- lent). Os SgRNAs foram sintetizados quimicamente. Transfecção por LNP de células CD34+ da medula óssea humana
[00197] LNPs contendo mMRNA de GFP ou mRNA de Cas9 e guia único direcionado a beta2-microgobulina (B2M) foram adicionados em várias concentrações variando de 50,0ng a 800,0ng a 30.000 células CD34+ humanas da medula óssea em um volume total de 100,0ul. À sequência do sgRNA, que tem como alvo a sequência alvo GGCCACGGAGCGAGACATCT B2M (SEQ ID NO: 75), é a seguinte: mMG*MG*mMC*CACGGAGCGAGACAUCUGUUUUAGAmMGMCMmMUmMAm GMAMAMAMUMAmMGMCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCA MAMCMUMUMGEMAMAMAMAMAmMGMUMGMGMCMAMCMCMGMA MGMUMCMGMGMUMEMCMU*MU*mMU*mU (SEQ ID NO:76). Nesta sequência de ácido nucleico, A, U, G e C denotam adenina, uracil, citosina e guanina, respectivamente; m" indica nucleotídeos 2'-O-metil; e "*" indica ligações fosforotioato.
[00198] Para estudos séricos específicos de espécie (estudos Triple S), os LNPs foram incubados em soro a 6,0% de M. musculus (Biore- clamationIVT, cat. Nº. MSESRM, lote nº MSE245821), M. fascicularis (BioreclamationIVT, cat. Nº CYNSRM, lote nº CYN197451) e H. sapi- ens (Sigma, agrupado, H4522-20ml, lote nº SLBR7629V; Bioreclama- tionIVT, cat. nº HMSRM, lote nº BRH1278638; BioreclamationIVT, cat. nº HMSRM, lote nº BRH1227947) a 37ºC por 5 minutos antes da transfecção celular. A apolipoproteíina E3 recombinante humana
(ApoE3, R&D Systems, cat. Nº 4144-AE) foi usada em uma variedade de concentrações (01.ug/ml, 1,0ug/ml, 10,0ug/ml e 50,0ug/ml) no tam- pão nas mesmas condições de incubação descritas acima. Leitura por Citometria de Fluxo de Células da Medula Óssea Hu- manas Transfectadas com LNP CD34+
[00199] As células foram coletadas para coloração de anticorpos 24 horas após a transfecção com LNP-GFP ou 5 dias após a transfecção com LNP-B2M. Após lavagem das células no meio de amostra (PBS + 2% de FBS + 2mM EDTA), as células foram bloqueadas com Human TruStain FcX (Biolegend, cat. Nº 422302) à temperatura ambiente (TA) por 5 min.
[00200] Foram marcadas células com os seguintes anticorpos e marcadores, como mostrado na Tabela 2. Tabela 2. Anticorpos e marcadores. Número de corante PE-cianina)
[00201] As células foram corridas em um Beckman Coulter Cyto- flexS e analisadas usando o pacote de software FlowdJo.
[00202] A sobrevivência celular foi avaliada com coloração com 7- AAD. Normalização para células vivas com base na intercalação de 7- AAD em regiões de DNA ricas em GC e subsequente detecção em ensaios de citometria de fluxo. A sobrevivência celular foi calculada usando a seguinte fórmula: [(Amostra 1 número de eventos da céluia/ AMOStra | número de eventos do grânulo)* Amos-
tra número total de grânulos adicionados]/Médiaf[(Controle número de de eventos da célu- 1a/ Controle 1 número do de eventos do grânulo)* Controle Número total de grânulos adiciona- dos], [(Controle2nuúmero de eventos da céluia/ CONntrole Inúmero de eventos de grânu- los)* Controle 2 numero total de grânulos adicionados], . . ., ControlN)
[00203] Nesta fórmula, "amostra" é definida como qualquer popula- ção de HSPCs CD34+ humanos que, durante o curso do experimento, receberam tratamento com LNPs, mRNA, gRNA ou qualquer combina- ção dos primeiros e "controle" definidos em qualquer população de HSPCs CD34+ humanos que, durante o curso do experimento, não receberam nenhum tratamento com LNPs, mRNA, gRNA ou qualquer combinação dos primeiros. Sequenciamento de próxima geração ("NGS") e análise para efici- ência de clivagem!
[00204] Para determinar quantitativamente a eficiência da edição no local alvo no genoma, o sequenciamento profundo foi utilizado para identificar a presença de inserções e deleções introduzidas pela edi- ção de genes.
[00205] As células foram coletadas no dia 5 após a transfecção e o DNA extraído usando o PureLink Genomic DNA Mini Kit (ThermoFis- her Scientific, cat. No. K182002). Iniciadores para locus alvo B2M con- tendo as sequências adaptadoras lllumina P5 e P7 foram utilizados para amplificar o sítio genômico de interesse em uma reação de PCR padrão.
[00206] Os iniciadores de PCR foram projetados em torno do sítio alvo B2M e a área genômica de interesse foi amplificada. As amostras foram submetidas para a preparação da amostra (Kit de Reagente Ilumina MiSegq v2, 300 ciclos, nº de cat. 15033624) e o sequenciamen- to realizado em um instrumento Illumina MiSeg. A frequência de edi- ção no locus de interesse foi analisada usando um duto sob medida. Em resumo, PCR adicional foi realizado de acordo com os protocolos do fabricante (Ilumina) para adicionar a química necessária para o se- quenciamento. Os amplicons foram sequenciados em um instrumento Illumina MiSeg. As leituras foram alinhadas ao genoma de referência humano (Por exemplo, hg38) após a eliminação daqueles com baixos Índices de qualidade. Os arquivos resultantes que contêm as leituras foram mapeados para o genoma de referência (arquivos BAM), onde foram selecionadas leituras que se sobrepunham à região de interesse alvo e o número de leituras de tipo selvagem versus o número de leitu- ras que contêm uma inserção, substituição ou deleção foi calculado.
[00207] A percentagem de edição (Por exemplo, "eficiência de edi- ção" ou "percentagem de edição") é fornecida como o número total de leituras de sequência com inserções ou deleções sobre o número total de leituras de sequência, incluindo o tipo selvagem. Análise de Formulação
[00208] As formulações de LNP são analisadas quanto ao tamanho médio de partícula, polidispersidade(pdi), conteúdo total de RNA e efi- ciência de encapsulação do RNA. O tamanho médio das partículas e a polidispersidade são medidos por espalhamento dinâmico de luz (DLS) usando um instrumento Malvern Zetasizer DLS. As amostras de LNP são diluídas 30X em PBS antes de serem medidas por DLS. O diâme- tro médio Z, que é uma medida baseada na intensidade do tamanho médio das partículas, foi relatado juntamente com o número de diâme- tro médio e pdi.
[00209] Um ensaio baseado em fluorescência (RibogreenO, Ther- morFisher Scientific) é usado para determinar a concentração total de RNA e o RNA livre. A eficiência da encapsulação é calculada como (RNA total - RNA livre)/RNA total. As amostras de LNP são diluídas adequadamente com 1x tampão TE contendo 0,2% de Triton-X 100 para determinar o RNA total ou 1x tampão TE para determinar o RNA livre. As curvas padrão são preparadas utilizando a solução de RNA inicial usada para fazer as formulações e diluídas em 1x tampão TE +/- 0,2% de Triton-X 100.O corante RiboGreenO diluído (100X em 1xXTE tampão, de acordo com as instruções do fabricante) é então adiciona- do a cada um dos padrões e amostras e deixado incubar por 10 minu- tos à temperatura ambiente, na ausência de luz. Um leitor de micro- placas SpectraMax M5 (Molecular Devices) é usado para ler as amos- tras com excitação, corte automático e comprimentos de onda de emissão definidos para 488 nm, 515 nm e 525 nm, respectivamente. O RNA total e o RNA livre são determinados a partir das curvas padrão apropriadas. A eficiência da encapsulação é calculada como (RNA to- tal - RNA livre/RNA total. O mesmo procedimento pode ser usado pa- ra determinar a eficiência de encapsulamento de um componente de carga baseado em DNA. Para o DNA de fita simples, pode-se usar o Oligreen Dye e, para o DNA de fita dupla, o Picogreen Dye. Exemplo 2 - Entrega de GFP às células da medula óssea CD34+
[00210] Os LNPs foram formulados conforme descrito no Exemplo 1 com mRNA de GFP em um tampão final de PBS e adicionados a
30.000 células humanas da medula óssea CD34+ em um volume total de 100,0ul, fornecendo O, 50,0ng, 100,0ng e 200,0ng de mMRNA de GFP em várias reações. Antes da administração às células, os LNPs foram pré-incubados com soro a 6% (v/v) de M. musculus (Bioreclama- tionIVT, cat. Nº. MSESRM, lote nº MSE245821) a 37ºC por 5 minutos. As células foram cultivadas como descrito no Exemplo 1.
[00211] As células GFP+ foram quantificadas 24 horas após a adi- ção de LNP às células CD34+ humanas por citometria de fluxo. A po- pulação de células GFP+ foi determinada no canal FITC (excitação máxima 490, emissão máxima 525, linha laser 488) em relação a um controle GFP- (denominado "controle" na Fig. 1). A percentagem de células GFP+ em todas as células vivas da medula óssea CD34+ hu- mana 24 horas após a entrega do MRNA de GFP mediada por LNP é mostrada na Fig. 1. As composições de LNP são as seguintes, Fig. 1 (A): 45% de lipídio A, 44% de colesterol, 9% de DSPC, 2% de PEG; Fig. 1 (B): 45% de lipídio A, 45% de colesterol, 9% de DSPC, 1% de PEG. Tamanho da amostra biológica n=3.
[00212] As composições de LNP demonstram a entrega dependen- te da dose de mMRNA para células da medula óssea CD34+ in vitro. Exemplo 3 - A pré-incubação de LNP's facilita a entrega
[00213] Os testes demonstram que os LNPs requerem incubação com 6% de soro de camundongo (v/v) antes da transfecção, a fim de fornecer eficientemente mRNA de GFP para células da medula óssea CD34* humanas. As células foram cultivadas e transfectadas com composições de LNP, como descrito no Exemplo 2, com as seguintes modificações:
[00214] AFig.2A mostra a percentagem de células GFP* em todas as células vivas de amostras de medula óssea CD34* humanas com aplicação de LNP no dia O imediatamente após o descongelamento de um frasco de células criopreservadas. LNPs com mRNA de 50,0 ng, 100,0 ng ou 200,0 ng de GFP foram adicionados às células com e sem incubação sérica antes da transfecção.
[00215] AFig.2B mostra a percentagem de células GFP* em todas as células vivas de amostras de medula óssea CD34* humanas com aplicação de LNP no dia 2 após o descongelamento de um frasco de células criopreservadas. LNPs com 50,0 ng, 100,0 ng ou 200,0 ng de mMRNA de GFP foram adicionados às células com e sem incubação sérica antes da transfecção. Tamanho da amostra biológica n=3. Exemplo 4 - Entrega de RNAs Cas9 e Guia via LNPs; Edição de genes em células CD34+ da medula óssea
[00216] Os LNPs foram formulados como descrito no Exemplo 1 com sgRNA (G529) e mRNA de Cas9 como descrito no Exemplo 1 e com uma razão de peso de 1: 1 em um tampão final de TSS. A com-
posição de LNP era 45% de lipídio A, 44% de colesterol, 9% de DSPC, 2% de PEG com uma razão N/P de 4,5.
[00217] Usando os métodos de entrega de LNP para transfectar células CD34* da medula óssea humana, um RNAm de Cas9 e saRNA de B2M foram entregues eficientemente às células usando pré- incubação com percentagens crescentes (v/v) de soro de M. musculus ou M. fascicularis. Os complexos Cas9-sgRNA ativos são entregues por LNP's pré-incubados com vários soros.
[00218] A Fig. 3A mostra a análise FACS de células transfectadas, mostrando a percentagem de células negativas B2M após a aplicação de LNPs (a 400,0 ng de MRNA de Cas9 e sgRNA (1: 1 em peso)) in- cubados com soro de camundongo ("Camundongo-S") em 6%, 30% e 60% (v/v) ou soro de primata não humano ("Cyno-S") a 6%, 30% e 60% (v/v). Os LNPs sem pré-incubação sérica ("somente LNP") e as células sem tratamento ("Ctrl") servem não mostram uma distribuição eficiente (medindo a queda da expressão de B2M). A pré-incubação com soro de camundongo ou primata facilita a eliminação eficiente da expressão de B2M nas células da medula óssea CD34*.
[00219] AFig.3B mostra a frequência de edição no nível genômico conforme determinado por NGS para células da medula óssea CD34* humanas transfectadas com LNPs (a 400,0 ng de mRNA de Cas9 e SgRNA (1:1 em peso)) incubadas com soro de camundongo a 6%, 30% e 60% (v/v) ou soro de primata não humano a 6%, 30% e 60% (v/v). Como na Fig. 3 (A), a aplicação de LNP sem pré-incubação séri- ca e as células sem tratamento não apresentam distribuição eficiente (medindo a% de edição). Inserções ("lhn", cinza claro) e deleções ("Del", preto) são representadas graficamente no eixo Y, mostrando mais de 60%, mais de 70%, mais de 80% e mais de 90% de edição eficiência nas células CD34*. As amostras "apenas LNP" e "Cntrl" não exibem níveis detectáveis de indels no locus B2M. Tamanho da amos-
tra biológica n=3. Exemplo 5 - Pré-incubação com fator sérico isolado ApoE3
[00220] Para investigar se a etapa de pré-incubação sérica pode ser substituída por proteína recombinante, os LNPs, como descrito no Exemplo 4, entregando Cas9 e o saRNA B2M foram pré-incubados com Apolipoproteína E3 recombinante humana (ApoE3), soro de ca- mundongo ou não humano soro de primata durante a etapa de incuba- ção do LNP antes da transfecção celular.
[00221] Na Fig. 4A, as percentagens de células B2M negativas após a aplicação de LNPs (a 400 ng de mMRNA de Cas9 e saRNA (1: 1)) incubadas com soro de camundongo ("camundongo-S") a 6% (v/v), soro de primata não humano ("cyno-S") a 6% (v/v) ou ApoE3 a 0,1 ug/ml, 1,0 ug/ml, 10,0 ug/ml e 50,0 ug/ml. As células CD34* da medula óssea humana sem tratamento servem como controle negativo ("Ctrl"). ApoE3 mostra um aumento dependente da dose na entrega para as células CD34+, e pode ser usado na etapa de pré-incubação.
[00222] Da mesma forma, a edição de genes mostra uma resposta dependente da dose ao ApoE3. A Fig. 4B mostra a percentagem de edição do alvo B2M conforme determinado por NGS para células da medula óssea CD34* humanas transfectadas com 400,0 ng de LNPs incubadas com soro de camundongo a 6% (v/v), soro de primata não humano a 6% (v/v) ou ApoE3 a 0,1 ug/ml, 1,0 ug/ml, 10,0 ug/ml e 50,0 ug/ml. As células da medula óssea CD34* humanas sem tratamento servem como controle negativo, que não exibe níveis detectáveis de indels no locus B2M. Tamanho da amostra biológica n=3. Exemplo 6 - Pré-incubação com fatores séricos
[00223] Esta experiência testou a pré-incubação de LNP com uma variedade de apolipoproteínas diferentes, mostrando a captação in vi- tro de LNP com isoformas de ApoE, medidas como nível de knock- down de B2M e frequência de edição em uma população de HSPC.
Antes da transfecção, os LNPs (ID LNP926) foram incubados a 37C por 5 minutos com soro de M. fascicularis a 6% (v/v) ou as seguintes apolipoproteínas em várias concentrações: ApoA-l humana recombi- nante (Millipore Sigma, cat %8 SRP4693), ApoB do plasma humano (Mil- lipore Sigma, cattt A5353), ApoC-l do plasma humano (Millipore Sig- ma, cat A7785), ApoE2 recombinante humano (Millipore Sigma, cat SRP4760), ApoE3 recombinante humano (Millipore Sigma, catft SRP4696), ApoE4 recombinante humano (Millipore Sigma, catft A3S234). Os LNPs foram adicionados às células humanas da medula óssea CD34+ a uma concentração de 200ng de carga total de RNA (razão 1:1 p/p de MRNA de Cas9 e guia único). A expressão de B2M no nível da proteína foi determinada por citometria de fluxo, utilizando os mesmos anticorpos descritos acima no dia 5 após a transfecção. À análise dos dados foi realizada utilizando o pacote de software FlowJo. Os dados representam uma amostra biológica (N=1), média +/- DP de duplicatas técnicas.
[00224] A Fig. 5 mostra o kKnockdown de B2M em uma população de HSPCs CD34+ após a transfecção de LNPs pré-incubados com ApoE2, ApoE3 e ApoE4. Nenhum tratamento, nenhuma pré-incubação e pré-incubação com ApoA-l, ApoB e ApoC-l não resultaram em knockdown de B2M. Nesta experiência, a pré-incubação de LNP com ApoE2 mostrou menos knockdown de B2M em comparação com as outras duas isoformas de ApoE. Exemplo 7 - Curso de tempo da exposição ao LNP
[00225] Esta experiência testou a duração da exposição ao LNP quanto ao seu impacto na viabilidade e nas taxas de edição. O LNP899, entregando mRNA de Cas9 e G562 direcionado ao AAVS1, foi pré-incubado a 37C por cerca de 5 minutos com soro de primata não humano a 6% (v/v). Os LNPs foram adicionados às células huma- nas da medula óssea CD34+ a uma concentração de 300ng de carga total de RNA (razão 1:1 p/p de mRNA de Cas9 e guia único). Às 2 ho- ras, 6 horas ou 24 horas após a transfecção, as células foram centrifu- gadas e ressuspensas em meio fresco sem LNP. A viabilidade celular foi avaliada em 3 e 8 dias usando as Contas de Contagem Absoluta CountBright'“Y (Invitrogen, Cat. C36950) medido em um citômetro de fluxo CytoFLEXS (Beckman Coulter). A edição foi medida por NGS como descrito no Exemplo 1. A Tabela 3 e a Fig. 68B mostram a fre- quência de edição 8 dias após a transdução. A Tabela 3 e a Fig. GA mostram a viabilidade celular aos 3 dias e 8 dias após a transdução. Tabela 3 - Viabilidade e edição em diferentes exposições ao LNP ao LNP (células/ml) SD 3d (células/ml) SD 8d Indel | SD uu Negativo E E RA 5 EE e mes ee ea]
BREVE DESCRIÇÃO DAS SEQUÊNCIAS DIVULGADAS | SEQ ID NO | peserigão o | 1 Sequência de codificação do DNA de Cas9 usando o análo- go da timidina dos códons mínimos de uridina listados na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada 2 Sequência de codificação de DNA de Cas9 usando códons É femomesioaneetnamatrtes 3 Sequência de aminoácidos de Cas9 com um sinal de locali- À fsoneer on anos Tania ciamas ORF de mRNA de Cas9 usando códons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada 5 ORF de mRNA de Cas9 usando códons com expressão ge- ralmente alta em seres humanos, com códons de iniciação e de parada
[SFRTIORO Deserto 2
Sequência de codificação de mMRNA de Cas9 usando códons de uridina mínimos, conforme listado na Tabela 1 (sem có- dons de iniciação ou de parada; adequado para inclusão na sequência de codificação de proteínas de fusão)
14 ORF de mRNA de Cas9 que codifica SEQ ID NO: 13 usando códons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada
Sequência de codificação de Cas9 codificando a SEQ ID NO: 13 usando códons de uridina mínimos, conforme listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de parada; adequado para inclusão na sequência de codificação de proteínas de fusão)
17 ORF de mRNA de Cas9 nickase que codifica SEQ ID NO: 16 usando códons mínimos de uridina, conforme listado na Ta- bela 1, com códons de iniciação e de parada
18 Sequência de codificação de Cas9 nickase codificando a SEQ ID NO: 16 usando códons de uridina mínimos, confor- me listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de para- da; adequado para inclusão na sequência de codificação de proteínas de fusão)
ORF de mRNA de dCas9 que codifica SEQ ID NO: 13 usan- do códons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada
21 Sequência de codificação de dCas9 codificando a SEQ ID NO: 13 usando códons de uridina mínimos, conforme listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de parada; ade- quado para inclusão na sequência de codificação de proteí- nas de fusão)
[SERIO RO Desta 22 Sequência de aminoácidos de Cas9 com dois sinais de loca- 23 ORF de mRNA de Cas9 que codifica SEQ ID NO: 13 usando códons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada 24 Sequência de codificação de Cas9 codificando a SEQ ID NO: 13 usando códons de uridina mínimos, conforme listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de parada; adequado para inclusão na sequência de codificação de proteínas de fusão) Sequência de aminoácidos de Cas9 nickase com dois sinais O feels nte mica cima 26 ORF de mRNA de Cas9 nickase que codifica SEQ ID NO: 16 usando códons mínimos de uridina, conforme listado na Ta- bela 1, com códons de iniciação e de parada 27 Sequência de codificação de Cas9 nickase codificando a SEQ ID NO: 16 usando códons de uridina mínimos, confor- me listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de para- da; adequado para inclusão na sequência de codificação de proteínas de fusão) 28 Sequência de aminoácidos de dCas9 com dois sinais de lo- o ittonecrme matt 29 ORF de mRNA de dCas9 que codifica SEQ ID NO: 13 usan- do códons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada
Sequência de codificação de dCas9 codificando a SEQ ID NO: 13 usando códons de uridina mínimos, conforme listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de parada; ade- quado para inclusão na sequência de codificação de proteí- nas de fusão)
[FR TRE 2 " ; * 40 Mus musculus hemoglobina alfa, cadeia adulta 1 (Hba-a1),
A 42 RNA guia único G282 direcionado ao gene TTR de camun- oo aro OO SS SS SO 43 Transcrição Cas9 com 5' UTR de HSD, ORF correspondente O assanio name tacar suma s Transcrição Cas9 com 5' UTR de HSD, ORF correspondente O santo saia ataarasumens 47 Transcrição Cas9 com 5' UTR de HSD, ORF correspondente O asammo saum 48 Transcrição Cas9 compreendendo Cas9 ORF usando có- | Transcrição Cas9 compreendendo a sequência Kozak com Cas9 ORF usando códons com expressão geralmente alta em seres humanos 50 ORF Cas9 com junções de emenda removidas; 12,75% de 51 Transcrição Cas9 com 5' UTR de HSD, ORF correspondente O santo saem ataaesmeas 52 ORF Cas9 com códons mínimos de uridina frequentemente O lessons nme em gua 1760 e amei
[ssatoNo Desista — 53 Transcrição Cas9 com 5' UTR de HSD, ORF correspondente 54 ORF Cas9 com códons mínimos de uridina raramente usa- O faser nmeeenasa erscaccometcno 55 Transcrição Cas9 com 5' UTR de HSD, ORF correspondente 64 RNA guia único G209 direcionado ao gene TTR de camun- oo ao SS SS S Som 65 ORF que codifica Neisseria meningitidis Cas9 usando có- dons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1, com códons de iniciação e de parada ORF que codifica Neisseria meningitidis Cas9 usando có- dons mínimos de uridina, conforme listado na Tabela 1 (sem códons de iniciação ou de parada; adequado para inclusão na sequência de codificação das proteínas de fusão) 67 Transcrição compreendendo SEQ ID NO: 65 (codificando | [E [Estar ar daN rama ESS [E [Ae Tn SRT oe TIRA E — 70 RNA guia único G502 direcionando o gene TTR do macaco 71 RNA guia único G509 direcionando o gene TTR do macaco o apenas COS" SOTO
[00226] Vejaa Tabela de Sequências abaixo para as próprias se- quências. As sequências de transcrição geralmente incluem GGG co- mo os três primeiros nucleotídeos para uso com ARCA ou AGG como os três primeiros nucleotídeos para uso com CleanCap'Y. Por conse- guinte, os três primeiros nucleotídeos podem ser modificados para uso com outras abordagens de capeamento, como a enzima de captação de Vaccinia. Promotores e sequências poli-A não estão incluídas nas sequências de transcrição. Um promotor como um promotor T7 (SEQ ID NO: 31) e uma sequência poli-A como SEQ ID NO: 63 podem ser anexados às sequências de transcrição divulgadas nas extremidades 5' e 3', respectivamente. A maioria das sequências de nucleotídeos é fornecida como DNA, mas pode ser facilmente convertida em RNA al- terando Ts para Us. Tabela de Sequência
[00227] A tabela de sequência a seguir fornece uma lista de se- quências divulgadas neste documento. Entende-se que se uma se- quência de DNA (compreendendo Ts) for referenciada em relação a um RNA, Ts deverá ser substituído por Nós (que pode ser modificado ou não modificado dependendo do contexto) e vice-versa.
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Claims (99)

REIVINDICAÇÕES
1. Método de administração de um MRNA a uma célula- tronco hematopoiética e/ou célula progenitora (HSPC) ou a uma popu- lação de HSPC, caracterizado pelo fato de que compreende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mRNA, um lipídio com amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG; b. colocar a HSPC ou população de HSPC em contato com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a HSPC ou a população de HSPC in vitro; administrando, desse modo, o MRNA à HSPC ou à popula- ção de HSPC.
2. Método de administração de um mRNA a uma HSPC, ca- racterizado pelo fato de que compreende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mRNA e um lipídio com amina; b. colocar a célula em contato com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a HSPC in vitro; administrando, desse modo, o MRNA à HSPC.
3. Método de administração de um mMRNA a uma célula- tronco ou a uma população de células-tronco, caracterizado pelo fato de que compreende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mRNA; b. colocar a população de células-tronco em contato com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a população de células-tronco in vitro; administrando, desse modo, o mMRNA à população de célu- las-tronco.
4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o MRNA codifica uma nuclease Cas.
5. Método de introdução de um mRNA da nuclease Cas e um gRNA em uma HSPC, caracterizado pelo fato de que compreende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mRNA da nuclease Cas, um gRNA, um lipídio com amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG; b. colocar a HSPC em contato com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a HSPC; introduzindo, desse modo, o mMRNA da nuclease Cas e o gRNA na HSPC.
6. Método de produção de uma HSPC geneticamente ma- nipulada in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo um mMRNA da nuclease Cas, um gRNA, um lipídio com amina, um lipídio auxiliar, um lipídio neutro e um lipídio com PEG; b. colocar a HSPC em contato com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a HSPC in vitro; produzindo, desse modo, uma HSPC geneticamente mani- pulada.
7. Método de introdução de um mRNA da nuclease Cas e um gRNA em uma célula-tronco, caracterizado pelo fato de que com- preende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo o mMRNA da nuclease Cas, gRNA e um lipídio com amina; b. colocar a célula-tronco em contato com a composição de
LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a célula-tronco; introduzindo, desse modo, o mMRNA da nuclease Cas e o gRNA na célula-tronco.
8. Método de produção de uma célula-tronco geneticamen- te manipulada, como uma HSPC in vitro, caracterizado pelo fato de que compreende: a. pré-incubar um fator sérico com uma composição de LNP compreendendo um mRNA da nuclease Cas, gRNA e um lipídio bio- degradável; b. colocar a célula em contato com a composição de LNP pré-incubada in vitro; e c. cultivar a célula in vitro; produzindo, desse modo, uma célula-tronco geneticamente modificada, como uma HSPC.
9. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a composição de LNP compreende ainda um gRNA.
10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 4 a 9, caracterizado pelo fato de que a nuclease Cas é uma nu- clease Cas de Classe 2.
11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que a nuclease Cas de Classe 2 é uma nuclease Cas9.
12. Método, de acordo com a reivindicação 11, caracteri- zado pelo fato de que a nuclease Cas9 é uma Cas9 de S. pyogenes.
13. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado pelo fato de que a nuclease Cas de Classe 2 é uma nuclease Cpf1.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 13, caracterizado pelo fato de que o gRNA é um RNA guia duplo (dgRNA).
15. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 13, caracterizado pelo fato de que o gRNA é um RNA guia único (SsgRNA).
16. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa de lavagem após a etapa de contato.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de contato dura entre cerca de 1 minuto e cerca de 72 horas.
18. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de contato dura entre cerca de 1 minuto e cerca de 24 horas.
19. Método, de acordo com a reivindicação 17 ou 18, ca- racterizado pelo fato de que a etapa de contato dura entre cerca de 2 horas e cerca de 24 horas.
20. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 19, caracterizado pelo fato de que a etapa de contato dura entre cerca de 4 horas e cerca de 12 horas.
21. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 17 a 20, caracterizado pelo fato de que a etapa de contato dura de cerca entre 6 horas e cerca de 12 horas.
22. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a sobrevida de cé- lulas pós-transfecção é de pelo menos 60%.
23. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que a sobrevida de células pós-transfecção é de pe- lo menos 70%.
24. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que a sobrevida de células pós-transfecção é de pe-
lo menos 80%.
25. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que a sobrevida de células pós-transfecção é de pe- lo menos 90%.
26. Método, de acordo com a reivindicação 22, caracteri- zado pelo fato de que a sobrevida de células pós-transfecção é de pe- lo menos 95%.
27. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a pré-incubação do fator sérico e da composição de LNP por cerca de segundos ou durante a noite.
28. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que compreende a pré-incubação por cerca de 1 mi- nuto a 1 hora.
29. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que compreende a pré-incubação por cerca de 1-30 minutos.
30. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que compreende a pré-incubação por cerca de 1-10 minutos.
31. Método, de acordo com a reivindicação 27, caracteri- zado pelo fato de que compreende a pré-incubação por cerca de 5 mi- nutos.
32. Método, de acordo com a reivindicação 27 ou 31, ca- racterizado pelo fato de que compreende a pré-incubação por 5 minu- tos + 2 minutos.
33. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a pré-incubação ocorre a cerca de 4 “ºC.
34. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a pré-incubação ocorre a cerca de 25 ºC.
35. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a pré-incubação ocorre a cerca de 37 ºC.
36. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de pré- incubação compreende um tampão.
37. Método, de acordo com a reivindicação 36, caracteri- zado pelo fato de que o tampão compreende ou consiste em um meio de cultura de HSPC.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição de LNP é pré-incubada com soro.
39. Método, de acordo com a reivindicação 38, caracteri- zado pelo fato de que o soro é soro de mamífero, camundongo, prima- ta ou humano.
40. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 37, caracterizado pelo fato de que a composição de LNP é pré-incubada com um fator sérico isolado.
41. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteri- zado pelo fato de que o fator sérico é uma ApoE.
42. Método, de acordo com a reivindicação 40, caracteri- zado pelo fato de que o fator sérico é escolhido dentre ApoE2, ApoE3 e ApoE4.
43. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 40 a 42, caracterizado pelo fato de que a ApoE é uma proteína humana recombinante.
44. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultura compreende a expansão da célula-tronco, HSPC ou população de HSPC em um tampão de cultura de HSPC.
45. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a troca do meio de cultura entre as etapas de contato e cultura.
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a etapa de cultura compreende um expansor de células-tronco.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 2,4 a 6 ou 8 a 46, caracterizado pelo fato de que a HSPC é uma célula-tronco hematopoiética (HSC).
48. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco, a HSPC ou a população de HSPC é uma célula ou amostra humana.
49. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 48, caracterizado pelo fato de que o MRNA e o ácido nuclei- co de RNA guia são formulados em uma única composição de LNP.
50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 48, caracterizado pelo fato de que o MRNA e o gRNA são coencapsulados na composição de LNP.
51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 48, caracterizado pelo fato de que o MRNA e o gRNA são encapsulados separadamente nas LNPs.
52. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 48, caracterizado pelo fato de que o MRNA é formulado em uma primeira composição de LNP e o ácido nucleico de RNA guia é formulado em uma segunda composição de LNP.R
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado pelo fato de que a primeira e a segunda composições de LNP são administradas simultaneamente.
54. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracteri- zado pelo fato de que a primeira e a segunda composições de LNP são administradas sequencialmente.R
55. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 52 a 54, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda composições de LNP são combinadas antes da etapa de pré- incubação.
56. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 52 a 54, caracterizado pelo fato de que a primeira e a segunda composições de LNP são pré-incubadas separadamente.
57. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a introdução de um ácido nucleico modelo na célula.
58. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a composição de LNP compreende: um componente de RNA e um componente lipídico, em que o componente lipídico compreende um lipídio com amina, um lipídio neutro, um lipídio auxiliar e um lipídio do tipo stealth; e em que a razão N/P é cerca de 1-10.
59. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteri- zado pelo fato de que o componente lipídico compreende o Lipídio À ou seu análogo de acetal.
60. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteri- zado pelo fato de que o componente lipídico compreende: cerca de 40-60% em mol de lipídio com amina;R cerca de 5-15% em mol de lipídio neutro; e cerca de 1,5-10% em mol de lipídio com PEG, em que o restante do componente lipídico é lipídio auxiliar, e em que a razão N/P da composição de LNP é cerca de 3-
10.
61. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteri- zado pelo fato de que o componente lipídico compreende: cerca de 50-60% em mol de lipídio com amina;R cerca de 8-10% em mol de lipídio neutro; e cerca de 2,5-4% em mol de lipídio com PEG, em que o restante do componente lipídico é lipídio auxiliar, e em que a razão N/P da composição de LNP é cerca de 3-8.
62. Método, de acordo com a reivindicação 56, caracteri- zado pelo fato de que o componente lipídico compreende: cerca de 50-60% em mol de lipídio com amina;R cerca de 5-15% em mol de DSPC; e cerca de 2,5-4% em mol de lipídio com PEG, em que o restante do componente lipídico é colesterol e em que a razão N/P da composição de LNP é cerca de 3-8.
63. Método, de acordo com a reivindicação 58, caracteri- zado pelo fato de que o componente lipídico compreende: 48-53% em mol de Lipídio A;R cerca de 8-10% em mol de DSPC; e 1,5-10% em mol de lipídio com PEG, em que o restante do componente lipídico é colesterol e em que a razão N/P da composição de LNP é de 3-8 +0,2.
64. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o RNA é um RNA modificado.
65. Método, de acordo com a reivindicação 64, caracteri- zado pelo fato de que o RNA modificado é um mRNA modificado.
66. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que o RNA compreende um quadro de leitura aberto que codifica um agente de ligação ao DNA guiado por RNA, em que o quadro de leitura aberto tem um teor de uridina que varia de seu teor mínimo de uridina a 150% do teor de uri- dina mínimo.
67. Composição, como definida em qualquer uma das rei- vindicações precedentes, caracterizada pelo fato de que o RNA com- preende um quadro de leitura aberto que codifica um agente de liga- ção ao DNA guiado por RNA, em que o quadro de leitura aberto tem um teor de dinucleotídeo de uridina que varia de seu teor de dinucleo- tídeo de uridina mínimo a 150% do teor de dinucleotídeo de uridina mínimo.
68. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que o RNA compre- ende uma sequência com pelo menos 90% de identidade com qual- quer uma das SEQ ID NO: 1, 4, 10, 14, 15, 17, 18, 20, 21, 23, 24, 26, 27, 29, 30, 50, 52, 54, 65 ou 66, em que o MRNA compreende um quadro de leitura aberto que codifica um agente de ligação ao DNA guiado por RNA.
69. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 5 a 68, caracterizado pelo fato de que o gRNA é um gRNA mo- dificado.
70. Método, de acordo com a reivindicação 69, caracteri- zado pelo fato de que o gRNA compreende uma modificação escolhi- da dentre um nucleotídeo modificado por 2'-O-metila (2-O-Me), uma ligação fosforotioato (PS) entre nucleotídeos; e um nucleotídeo modifi- cado por 2'-fluoro (2'-F).
71. Método, de acordo com a reivindicação 69 ou 70, ca- racterizado pelo fato de que o gRNA compreende uma modificação em um ou mais dos cinco primeiros nucleotídeos na extremidade 5".
72. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica-
ções 69 a 71, caracterizado pelo fato de que o gRNA compreende uma modificação em um ou mais dos cinco últimos nucleotídeos na extremidade 3.
73. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 69 a 72, caracterizado pelo fato de que o gRNA compreende ligações PS entre os quatro primeiros nucleotídeos.
74. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 69 a 73, caracterizado pelo fato de que o gRNA compreende ligações PS entre os quatro últimos nucleotídeos.
75. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 69 a 74, caracterizado pelo fato de que compreende ainda nu- cleotídeos modificados por 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5.
76. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 69 a 75, caracterizado pelo fato de que compreende ainda nu- cleotídeos modificados por 2'-O-Me nos três últimos nucleotídeos na extremidade 3.
77. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 2,4 a 6 ou 8 a 76, caracterizado pelo fato de que a HSPC ou a população de HSPC é CD34+.
78. Método, de acordo com as reivindicações 1 a 2,4 a 6 ou 8 a 77, caracterizado pelo fato de que a HSPC ou a população de HSPC é CD34+CD90+.
79. Célula-tronco ou população de células-tronco manipula- da, caracterizada pelo fato de que é produzida pelo método como de- finido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
80. HSPC ou população de HSPC manipulada, caracteri- zada pelo fato de que é produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.
81. HSPC ou população de HSPC, de acordo com a reivin-
dicação 78, caracterizada pelo fato de que a HSPC manipulada reside dentro de um tecido ou órgão, por exemplo, medula óssea, sangue ou outro tecido dentro de um paciente, por exemplo, após transplante de uma HSPC manipulada.
82. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco, a HSPC ou a população de HSPC é autóloga em relação a um paciente ao qual será administrada a célula.
83. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco, a HSPC ou a população de HSPC é alogênica em relação a um paciente ao qual será administrada a referida célula.
84. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a realização da edição de genes por CRISPR-Cas na célula-tronco, na HSPC ou na população de HSPC.
85. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a detecção da edição de genes na célula-tronco, na HSPC ou na po- pulação de HSPC.
86. Método, de acordo com a reivindicação 84 ou 85, ca- racterizado pelo fato de que a edição de genes é medida como por- centagem de edição ou porcentagem de modificação do DNA.
87. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de edição é de pelo menos 40%.
88. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de edição é de pelo menos 60%.
89. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de edição é de pelo menos 70%.
90. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri-
zado pelo fato de que a porcentagem de edição é de pelo menos 80%.
91. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de edição é de pelo menos 90%.
92. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de edição é de pelo menos 95%.
93. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de modificação do DNA é de pe- lo menos 40%.
94. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de modificação do DNA é de pe- lo menos 60%.
95. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de modificação do DNA é de pe- lo menos 70%.
96. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de modificação do DNA é de pe- lo menos 80%.
97. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de modificação do DNA é de pe- lo menos 90%.
98. Método, de acordo com a reivindicação 86, caracteri- zado pelo fato de que a porcentagem de modificação do DNA é de pe- lo menos 95%.
99. Método, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado pelo fato de que a célula-tronco, a HSPC ou a população de HSPC é de uma amostra de medula óssea.
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