TW202028460A - 用於乳酸脫氫酶(ldha)基因編輯之組合物及方法 - Google Patents

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Abstract

本發明提供用於在LDHA 基因內進行編輯，例如引入雙鏈斷裂之組合物及方法。提供用於治療患有高草酸鹽尿症之個體之組合物及方法。

Description

用於乳酸脫氫酶(LDHA)基因編輯之組合物及方法
在患有高草酸鹽尿症之個體中，通常作為廢棄物由腎排出於尿中之草酸鹽有所升高。存在若干類型之高草酸鹽尿症，包含原發性高草酸鹽尿症、草酸鹽沈積症、腸高草酸鹽尿症及與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症。過量草酸鹽可與鈣組合以在腎及其他器官中形成草酸鈣。草酸鈣沈積物可導致廣泛沈積草酸鈣(腎鈣質沉著症)或形成腎結石及膀胱結石(尿路結石症)且引起腎損害。高草酸鹽尿症中之常見腎併發症包含血尿(血尿症)、泌尿道感染、腎損害及晚期腎病(ESRD)。隨時間變化，高草酸鹽尿症患者之腎可能開始衰竭，且血液中之草酸鹽含量可能有所升高。全身組織中之草酸鹽沈積(例如全身性草酸鹽沈積症)可因高草酸鹽血液含量而發生且可至少在骨、心臟、皮膚及眼睛中引起併發症。腎衰竭可發生於任一年齡(包含兒童)，尤其發生於患有高草酸鹽尿症之個體中。腎透析或腎/肝雙重器官移植係僅有之治療選擇。
原發性高草酸鹽尿症(PH)係影響自嬰兒至老人之所有年齡個體之罕見遺傳病症。PH包含三個亞型，該等亞型涉及改變三種不同蛋白質之表現之遺傳缺陷。PH1涉及丙胺酸-乙醛酸胺基轉移酶或AGT/AGT1。PH2涉及乙醛酸/羥基丙酮酸還原酶或GR/HPR，且PH3涉及4-羥基-2-側氧基戊二酸醛縮酶或HOGA。在PH1中，突變發現於由AGXT基因編碼之酶丙胺酸乙醛酸胺基轉移酶(AGT或AGT1)中。通常，AGT在肝過氧化物酶體中將乙醛酸鹽轉化成甘胺酸。在PH1患者中，突變AGT不能分解乙醛酸鹽，且乙醛酸鹽及其代謝物草酸鹽之含量有所增加。人類不能氧化草酸鹽，且PH1個體中之高草酸鹽含量會引起高草酸鹽尿症。
為測定個體是否患有高草酸鹽尿症，可收集24-小時尿且量測草酸鹽、羥基乙酸鹽及其他有機酸之含量。可實施遺傳測試或肝生檢以用於確定性診斷高草酸鹽尿症之遺傳形式。例如參見Cochat P等人(2012) Nephrol Dial Transplant 5:1729-36。在正常健康個體中，24-小時尿草酸鹽及羥基乙酸鹽含量小於45 mg/天，但在高草酸鹽尿症患者中，尿草酸鹽含量通常大於100 mg/天。例如參見Cochat P. (2013). N Engl J Med 369:649-658。
正常個體中之血漿羥基乙酸鹽含量通常為4-8微莫耳濃度，但在高草酸鹽尿症患者中，羥基乙酸鹽含量可具有較寬範圍且在2/3之高草酸鹽尿症個體中有所升高。例如參見Marangella等人(1992) J. Urol. 148:986-989。儘管大部分患有遺傳形式之高草酸鹽尿症之患者當前係經由遺傳測試來診斷，但24-小時尿測試係用於追蹤高草酸鹽尿症個體之治療反應之主要方法(同上)。
乳酸脫氫酶(LDH)係發現於幾乎每一細胞中之酶，其調控乳酸鹽及丙酮酸鹽之穩態以及乙醛酸鹽及草酸鹽之代謝。LDH包括形成四聚體之4個多肽。已鑑別出5種LDH同工酶，其區別在於其亞單元組成及組織分佈。兩種最常見形式之LDH係由LDHA 基因編碼之肌肉(M)形式及由LDHB 基因編碼之心臟(H)形式。在肝細胞之過氧化物酶體中，LDH係負責將乙醛酸鹽轉化成草酸鹽之關鍵酶，草酸鹽然後分泌至血漿中並由腎排泄。Lai等人(2018) Mol Ther. 26(8):1983-1995。
草酸鹽產生之增加導致草酸鈣晶體沈澱於腎中且引起腎病。隨著高草酸鹽尿症之進展，草酸鹽沈積於所有組織中。具有遺傳性乳酸脫氫酶M亞單元缺陷之個體不顯示肝功能損傷或肝特異性表型，從而表明抑制或減弱肝乳酸脫氫酶(LDH) (所提出負責將乙醛酸鹽轉化成草酸鹽之關鍵酶)之表現量可防止草酸鹽累積於高草酸鹽尿症個體中且並無由乳酸脫氫酶M亞單元損失所致之不良效應。此假設已測試於經遺傳改造之鼠類高草酸鹽尿症模型及使用乙二醇(EG)以化學方式誘導高草酸鹽尿症之鼠類模型中。參見Kanno, T等人(1988) Clin. Chim. Acta 173, 89-98；Takahashi, Y等人(1995) Intern. Med. 34, 326-329；及Tsujino, S等人(1994) Ann. Neurol. 36, 661-665。
因LDH係草酸鹽產生之最終步驟中之關鍵，故使用經由與N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)殘基偶聯來指向肝細胞之LDHA siRNA來調介小鼠高草酸鹽尿症模型中之LDHA 沉默。參見Lai等人(2018) Mol Ther. 26(8):1983-1995。使用此LDHA siRNA治療小鼠可減少肝LDH並有效還原草酸鹽且防止草酸鈣晶體沈積於經遺傳改造之小鼠高草酸鹽尿症模型及以化學方式誘導之高草酸鹽尿症小鼠模型中(同上)。小鼠中之抑制肝LDH並不引起循環肝酶急性升高、乳酸酸中度或勞力性肌病變。
藉由抑制LDHA來治療高草酸鹽尿症患者之觀點進一步由非人類靈長類動物及人類化嵌合小鼠(其中肝包括高達80%之人類肝細胞)之LDHA siRNA治療來證實(同上)。
因此，提供下列實施例。在一些實施例中，本發明提供使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)之組合物及方法，該系統可實質上減小或敲除LDHA 基因表現，由此實質上減小或消除LDH產生，由此減少尿草酸鹽且增加血清羥基乙酸鹽。經由改變LDHA 基因來實質上減小或消除LDH產生可用於長期或永久性治療高草酸鹽尿症。
提供下列實施例。 實施例01     一種誘導LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)或單鏈斷裂(SSB)之方法，其包括向細胞遞送一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。 實施例02     一種減小LDHA 基因表現之方法，其包括向細胞遞送一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。 實施例03     一種治療或預防高草酸鹽尿症之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸，由此治療或預防高草酸鹽尿症。 實施例04     一種治療或預防由高草酸鹽尿症引起之晚期腎病(ESRD)之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸，由此治療或預防由高草酸鹽尿症引起之(ESRD)。 實施例05     一種治療或預防草酸鈣產生及沈積、原發性高草酸鹽尿症(包含PH1、PH2及PH3)、草酸鹽沈積症、血尿症、腸高草酸鹽尿症、與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症中之任一者及延遲或改善腎或肝移植需要之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸，由此治療或預防草酸鈣產生及沈積、原發性高草酸鹽尿症、草酸鹽沈積症、血尿症中之任一者及延遲或改善腎或肝移植需要。 實施例06     一種增加血清羥基乙酸鹽濃度之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸，由此增加血清羥基乙酸鹽濃度。 實施例07     一種減少個體之尿中之草酸鹽之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸，由此減少個體之尿中之草酸鹽。 實施例08     如前述實施例中任一項之方法，其中投與RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。 實施例09     一種組合物，其包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。 實施例10     一種組合物，其包括含有以下之短單嚮導RNA (短-sgRNA)： a. 嚮導序列，其包括： i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致；或 iv.    SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者；或 v. SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及 b.     包括髮夾區之sgRNA之保守部分，其中該髮夾區至少缺失5至10個核苷酸且視情況其中該短-sgRNA包括5’端修飾及3’端修飾中之一或多者。 實施例11     如實施例10之組合物，其包括SEQ ID NO: 202之序列。 實施例12     如實施例10或11之組合物，其包括5’端修飾。 實施例13     如實施例10至12中任一項之組合物，其中該短-sgRNA包括3’端修飾。 實施例14     如實施例10至13中任一項之組合物，其中該短-sgRNA包括5’端修飾及3’端修飾。 實施例15     如實施例10至14中任一項之組合物，其中該短-sgRNA包括3’尾部。 實施例16     如實施例15之組合物，其中該3’尾部包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。 實施例17     如實施例15之組合物，其中該3’尾部包括約1至2、1至3、1至4、1至5、1至7、1至10、至少1至2、至少1至3、至少1至4、至少1至5、至少1至7或至少1至10個核苷酸。 實施例18     如實施例10至17中任一項之組合物，其中該短-sgRNA不包括3’尾部。 實施例19     如實施例10至18中任一項之組合物，其包括該髮夾區中之修飾。 實施例20     如實施例10至19中任一項之組合物，其包括3’端修飾及該髮夾區中之修飾。 實施例21     如實施例10至20中任一項之組合物，其包括3’端修飾、該髮夾區中之修飾及5’端修飾。 實施例22     如實施例10至21中任一項之組合物，其包括5’端修飾及該髮夾區中之修飾。 實施例23     如實施例10至22中任一項之組合物，其中該髮夾區至少缺失5個連續核苷酸。 實施例24     如實施例10至23中任一項之組合物，其中該至少5至10個缺失的核苷酸： a. 位於髮夾1內； b.     位於髮夾1內且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； c. 位於髮夾1內且包含緊接髮夾1之3’的兩個核苷酸； d.     包含髮夾1之至少一部分； e. 位於髮夾2內； f. 包含髮夾2之至少一部分； g.     位於髮夾1及髮夾2內； h.     包含髮夾1之至少一部分且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； i. 包含髮夾2之至少一部分且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； j. 包含髮夾1之至少一部分，包含髮夾1與髮夾2之間之「N」且包含髮夾2之至少一部分； k.     位於髮夾1或髮夾2內，視情況包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； l. 係連續的； m.    係連續的且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； n.     係連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分； o.     係連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾1與髮夾2之間之「N」； p.     係連續的且跨越髮夾1之至少一部分及緊接髮夾1之3’之兩個核苷酸； q.     由5至10個核苷酸組成； r. 由6至10個核苷酸組成； s. 由5至10個連續核苷酸組成； t. 由6至10個連續核苷酸組成；或 u.     由SEQ ID NO: 400之核苷酸54至58組成。 實施例25     如實施例10至24中任一項之組合物，其包括含有連接區之sgRNA之保守部分，其中該連接區至少缺失一個核苷酸。 實施例26     如實施例25之組合物，其中該連接區中缺失之該等核苷酸包括以下中之任一者或多者： a. 該連接區中之至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸； b.     該連接區中之至少或確切地1至2個核苷酸、1至3個核苷酸、1至4個核苷酸、1至5個核苷酸、1至6個核苷酸、1至10個核苷酸或1至15個核苷酸；及 c. 該連接區中之每一核苷酸。 實施例27     一種組合物，其包括含有以下之經修飾單嚮導RNA (sgRNA)： a. 嚮導序列，其包括： i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致；或 iv.    SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者；或 v. SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者；或 vi.    SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者；或 vii.   SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者；且進一步包括 b.     一或多個選自以下之修飾： 1.     位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾； 2.     位於一或多個保守區YA位點處之YA修飾； 3.     位於一或多個嚮導區YA位點處及一或多個保守區YA位點處之YA修飾； 4.     i)位於兩個或更多個嚮導區YA位點處之YA修飾； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 5.     i)位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該嚮導區YA位點位於5’末端之5’端之核苷酸8處或其後； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及視情況； iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 6.     i)位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該嚮導區YA位點位於該嚮導區之3’末端核苷酸之13個核苷酸內； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 7.     i) 5’端修飾及3’端修飾； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 8.     i)位於嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該嚮導區YA位點之該修飾包括位於該嚮導區YA位點之5’處之至少一個核苷酸所不包括之修飾； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 9.     i)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 ii)位於保守區YA位點1及8處之YA修飾；或 10.   i)位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該YA位點位於5’末端之核苷酸8處或其後； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於H1-1及H2-1中之一或多者處之修飾；或 11.    i)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾； ii)位於保守區YA位點1、5、6、7、8及9中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於H1-1及H2-1中之一或多者處之修飾；或 12.   i)位於一或多個位於5’末端之核苷酸6處或其後之核苷酸處之修飾，例如YA修飾； ii)位於一或多個嚮導序列YA位點處之YA修飾； iii)位於B3、B4及B5中之一或多者處之修飾，其中B6不包括2’-OMe修飾或包括除2’-OMe外之修飾； iv)位於LS10處之修飾，其中LS10包括除2’-氟外之修飾；及/或 v)位於N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10或N11處之修飾；且 其中下列中之至少一者係真實的： i. 位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾； ii.     位於一或多個保守區YA位點處之YA修飾； iii.    位於一或多個嚮導區YA位點處及一或多個保守區YA位點處之YA修飾； iv.    5’末端之5’端之核苷酸8至11、13、14、17或18中之至少一者不包括2’-氟修飾； v. 5’末端之5’端之核苷酸6至10中之至少一者不包括硫代磷酸酯鍵聯； vi.    B2、B3、B4或B5中之至少一者不包括2’-OMe修飾； vii.   LS1、LS8或LS10中之至少一者不包括2’-OMe修飾； viii.  N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10、N11、N16或N17中之至少一者不包括2’-OMe修飾； ix.    H1-1包括修飾； x. H2-1包括修飾；或 xi.    H1-2、H1-3、H1-4、H1-5、H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H2-1、H2-2、H2-3、H2-4、H2-5、H2-6、H2-7、H2-8、H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14或H2-15中之至少一者不包括硫代磷酸酯鍵聯。 實施例28     如實施例27之組合物，其包括SEQ ID NO: 450。 實施例29     如實施例9至28中任一項之組合物，其用於誘導細胞或個體中之LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)或單鏈斷裂(SSB)。 實施例30     如實施例9至28中任一項之組合物，其用於減小細胞或個體中之LDHA 基因表現。 實施例31     如實施例9至28中任一項之組合物，其用於治療或預防個體之高草酸鹽尿症。 實施例32     如實施例9至28中任一項之組合物，其用於增加個體中之血清及/或血漿羥基乙酸鹽濃度。 實施例33     如實施例9至28中任一項之組合物，其用於減小個體中之尿草酸鹽濃度。 實施例34     如實施例9至28中任一項之組合物，其用於治療或預防草酸鹽產生、器官中草酸鈣沈積、原發性高草酸鹽尿症、草酸鹽沈積症(包含全身性草酸鹽沈積症)、血尿症、晚期腎病(ESRD)及/或延遲或改善腎或肝移植需要。 實施例35     如實施例1至8中任一項之方法，其進一步包括： a. 誘導細胞或個體中之LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)； b.     減小細胞或個體中之LDHA 基因表現； c. 治療或預防個體之高草酸鹽尿症； d.     治療或預防個體之原發性高草酸鹽尿症； e. 治療或預防個體之PH1、PH2及/或PH3； f. 治療或預防個體之腸高草酸鹽尿症； g.     治療或預防個體之與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症； h.     增加個體中之血清及/或血漿羥基乙酸鹽濃度； i. 減小個體中之尿草酸鹽濃度； j. 減小草酸鹽產生； k.     減小器官中之草酸鈣沈積； l. 減少高草酸鹽尿症； m.    治療或預防草酸鹽沈積症(包含全身性草酸鹽沈積症)； n.     治療或預防血尿症； o.     預防晚期腎病(ESRD)；及/或 p.     延遲或改善腎或肝移植需要。 實施例36     如實施例1至8或29至35中任一項所用之方法或組合物，其中該組合物增加了血清及/或血漿羥基乙酸鹽含量。 實施例37     如實施例1至8或29至35中任一項所用之方法或組合物，其中該組合物引起該LDHA 基因之編輯。 實施例38     如實施例37所用之方法或組合物，其中該編輯計算為經編輯群體之百分比(編輯百分比)。 實施例39     如實施例38所用之方法或組合物，其中該編輯百分比介於該群體之30%與99%之間。 實施例40     如實施例38所用之方法或組合物，其中該編輯百分比介於該群體之30%與35%、35%與40%、40%與45%、45%與50%、50%與55%、55%與60%、60%與65%、65%與70%、70%與75%、75%與80%、80%與85%、85%與90%、90%與95%或95%與99%之間。 實施例41     如實施例1至8或29至35中任一項所用之方法或組合物，其中該組合物減小了尿草酸鹽濃度。 實施例42     如實施例41所用之方法或組合物，其中減少尿草酸鹽可降低腎結石及/或腎、肝、膀胱、心臟、皮膚或眼睛中之草酸鈣沈積。 實施例43     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列係選自 a. SEQ ID NO:1-84及100-192； b.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80； c. SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48； d.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184；及 e. SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123。 實施例44     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該組合物包括含有以下之sgRNA： a. SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者；或 b.     SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中之任一者；或 c. 選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80之嚮導序列；或 d.     選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48之嚮導序列； e. 選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184之嚮導序列；及 f. 選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123之嚮導序列。 實施例45     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該靶序列位於人類LDHA 基因之外顯子1至8中之任一者中。 實施例46     如實施例45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子1或2中。 實施例47     如實施例45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子3中。 實施例48     如實施例45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子4中。 實施例49     如實施例45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子5或6中。 實施例50     如實施例45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子7或8中。 實施例51     如實施例1至50中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列與LDHA 之正鏈中之靶序列互補。 實施例52     如實施例1至50中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列與LDHA 之負鏈中之靶序列互補。 實施例53     如實施例1至50中任一項之方法或組合物，其中第一嚮導序列與該LDHA 基因之正鏈中之第一靶序列互補，且其中該組合物進一步包括與該LDHA 基因之負鏈中之第二靶序列互補之第二嚮導序列。 實施例54     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括選自SEQ ID NO 1-84及100-192中之任一者之嚮導序列且進一步包括SEQ ID NO: 200之核苷酸序列，其中SEQ ID NO: 200之核苷酸接在該嚮導序列之3’端之後。 實施例55     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括選自SEQ ID NO 1-84及100-192中之任一者之嚮導序列且進一步包括SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203或SEQ ID NO: 400-450中之任一者之核苷酸序列，其中SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202或SEQ ID NO: 203之核苷酸接在該嚮導序列之3’端之後。 實施例56     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係單嚮導(sgRNA)。 實施例57     如實施例56之方法或組合物，其中該sgRNA包括含有SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者之嚮導序列。 實施例58     如實施例56之方法或組合物，其中該sgRNA包括SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者或其經修飾形式，視情況其中該等經修飾形式包括SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081。 實施例59     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中根據SEQ ID NO: 300之模式來修飾該嚮導RNA，其中N共同地係表1中之任一嚮導序列(SEQ ID NO 1-84及100-192)。 實施例60     如實施例59之方法或組合物，其中SEQ ID NO: 300中之每一N係任一天然或非天然核苷酸，其中該等N形成嚮導序列，且該嚮導序列使Cas9靶向該LDHA 基因。 實施例61     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包括SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列及SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202或SEQ ID NO: 203之核苷酸中之任一者。 實施例62     如實施例56至61中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包括與選自SEQ ID NO: 1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列。 實施例63     如實施例62之方法或組合物，其中該sgRNA包括選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079、1081、2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081之序列。 實施例64     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括至少一種修飾。 實施例65     如實施例64之方法或組合物，其中該至少一種修飾包含經2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。 實施例66     如實施例64或65之方法或組合物，其包括核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵。 實施例67     如實施例64至66中任一項之方法或組合物，其包括經2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸。 實施例68     如實施例64至67中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之5’端處之前5個核苷酸中之一或多者處之修飾。 實施例69     如實施例64至68中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之3’端處之後5個核苷酸中之一或多者處之修飾。 實施例70     如實施例64至69中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之前4個核苷酸之間之PS鍵。 實施例71     如實施例64至70中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之後4個核苷酸之間之PS鍵。 實施例72     如實施例64至71中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之5’端之前三個核苷酸處之經2’-O-Me修飾之核苷酸。 實施例73     如實施例64至72中任一項之方法或組合物，其在該嚮導RNA之3’端之後三個核苷酸處包括經2’-O-Me修飾之核苷酸。 實施例74     如實施例64至73中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括SEQ ID NO: 300之經修飾核苷酸。 實施例75     如實施例1至74中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包括醫藥上可接受之賦形劑。 實施例76     如實施例1至75中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。 實施例77     如實施例76之方法或組合物，其中該LNP包括陽離子脂質。 實施例78     如實施例77之方法或組合物，其中該陽離子脂質係(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate，亦稱為3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)。 實施例79     如實施例76至78中任一項之方法或組合物，其中該LNP包括中性脂質。 實施例80     如實施例79之方法或組合物，其中該中性脂質係DSPC。 實施例81     如實施例76至80中任一項之方法或組合物，其中該LNP包括輔助脂質。 實施例82     如實施例81之方法或組合物，其中該輔助脂質係膽固醇。 實施例83     如實施例76至82中任一項之方法或組合物，其中該LNP包括隱形脂質。 實施例84     如實施例83之方法或組合物，其中該隱形脂質係PEG2k-DMG。 實施例85     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包括RNA引導之DNA結合劑。 實施例86     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包括編碼RNA引導之DNA結合劑之mRNA。 實施例87     如實施例85或86之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係Cas9。 實施例88     如前述實施例中任一項之方法或組合物，其中該組合物係醫藥調配物且進一步包括醫藥上可接受之載劑。 實施例89     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 1。 實施例90     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 2。 實施例91     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 3。 實施例92     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 4。 實施例93     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 5。 實施例94     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 6。 實施例95     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 7。 實施例96     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 8。 實施例97     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 9。 實施例98     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 10。 實施例99     如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 11。 實施例100   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 12。 實施例101   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 13。 實施例102   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 14。 實施例103   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 15。 實施例104   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 16。 實施例105   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 17。 實施例106   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 18。 實施例107   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 19。 實施例108   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 20。 實施例109   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 21。 實施例110   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 22。 實施例111    如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 23。 實施例112   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 24。 實施例113   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 25。 實施例114   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 26。 實施例115   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 27。 實施例116   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 28。 實施例117   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 29。 實施例118   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 30。 實施例119   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 31。 實施例120   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 32。 實施例121   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 33。 實施例122   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 34。 實施例123   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 35。 實施例124   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 36。 實施例125   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 37。 實施例126   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 38。 實施例127   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 39。 實施例128   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 40。 實施例129   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 41。 實施例130   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 42。 實施例131   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 43。 實施例132   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 44。 實施例133   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 45。 實施例134   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 46。 實施例135   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 47。 實施例136   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 48。 實施例137   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 49。 實施例138   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 50。 實施例139   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 51。 實施例140   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 52。 實施例141   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 53。 實施例142   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 54。 實施例143   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 55。 實施例144   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 56。 實施例145   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 57。 實施例146   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 58。 實施例147   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 59。 實施例148   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 60。 實施例149   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 61。 實施例150   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 62。 實施例151   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 63。 實施例152   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 64。 實施例153   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 65。 實施例154   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 66。 實施例155   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 67。 實施例156   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 68。 實施例157   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 69。 實施例158   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 70。 實施例159   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 71。 實施例160   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 72。 實施例161   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 73。 實施例162   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 74。 實施例163   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 75。 實施例164   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 76。 實施例165   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 77。 實施例166   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 78。 實施例167   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 79。 實施例168   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 80。 實施例169   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 81。 實施例170   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 82。 實施例171   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 83。 實施例172   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 84。 實施例173   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 103。 實施例174   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 109。 實施例175   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 123。 實施例176   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 133。 實施例177   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 149。 實施例178   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 156。 實施例179   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 166。 實施例180   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 2、9、13、16、22、24、25、27、30、31、32、33、35、36、40、44、45、53、55、57、60、61-63、65、67、69、70、71、73、76、78、79、80、82-84、103、109、123、133、149、156及166中之任一者。 實施例181   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 100-102、104-108、110-122、124-132、134-148、150-155、157-165及167-192中之任一者。 實施例182   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者。 實施例183   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者。 實施例184   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 86-90中之任一者之sgRNA。 實施例185   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 89之sgRNA。 實施例186   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1001或2001之sgRNA。 實施例187   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1005或2005之sgRNA。 實施例188   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1007或2007之sgRNA。 實施例189   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1008或2008之sgRNA。 實施例190   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1014或2014之sgRNA。 實施例191   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1023或2023之sgRNA。 實施例192   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1027或2027之sgRNA。 實施例193   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1032或2032之sgRNA。 實施例194   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1045或2045之sgRNA。 實施例195   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1048或2048之sgRNA。 實施例196   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1063或2063之sgRNA。 實施例197   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1067或2067之sgRNA。 實施例198   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1069或2069之sgRNA。 實施例199   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1071或2071之sgRNA。 實施例200   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1074或2074之sgRNA。 實施例201   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1076或2076之sgRNA。 實施例202   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1077或2077之sgRNA。 實施例203   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1078或2078之sgRNA。 實施例204   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1079或2079之sgRNA。 實施例205   如實施例1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1081或2081之sgRNA。 實施例206   如實施例1至205中任一項之方法或組合物，其中該組合物係以單一劑量形式來投與。 實施例207   如實施例1至206中任一項之方法或組合物，其中一次性投與該組合物。 實施例208   如實施例206或207中任一項之方法或組合物，其中該單一劑量或一次性投與： a. 誘導DSB；及/或 b.     減小LDHA 基因表現；及/或 c. 治療或預防高草酸鹽尿症；及/或 d.     治療或預防由高草酸鹽尿症引起之ESRD；及/或 e. 治療或預防草酸鈣產生及沈積；及/或 f. 治療或預防原發性高草酸鹽尿症(包含PH1、PH2及PH3)；及/或 g.     治療或預防草酸鹽沈積症；及/或 h.     治療及預防血尿症；及/或 i. 治療或預防腸高草酸鹽尿症；及/或 j. 治療或預防與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症；及/或 k.     延遲或改善腎或肝移植需要；及/或 l. 增加血清羥基乙酸鹽濃度；及/或 m.    減少尿中之草酸鹽。 實施例209   如實施例208之方法或組合物，其中該單一劑量或一次性投與達成a)至m)中之任一者或多者3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週。 實施例210   如實施例208之方法或組合物，其中該單一劑量或一次性投與達成持久效應。 實施例211   如實施例1至208中任一項之方法或組合物，其進一步包括達成持久效應。 實施例212   如實施例210或211之方法或組合物，其中該持久效應持續至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少一年或至少5年。 實施例213   如實施例1至212中任一項之方法或組合物，其中投與該組合物使得尿中之草酸鹽治療相關性地減少。 實施例214   如實施例1至213中任一項之方法或組合物，其中投與該組合物使得尿草酸鹽含量在治療範圍內。 實施例215   如實施例1至214中任一項之方法或組合物，其中投與該組合物使得草酸鹽含量在正常範圍之100%、120%或150%內。 實施例216   一種如實施例9至215中任一項之組合物或調配物之用途，其用以製備用於治療患有高草酸鹽尿症之人類個體之藥劑。
亦揭示如前述實施例中任一項之組合物或調配物之用途，其用以製備用於治療患有高草酸鹽尿症之人類個體之藥劑。亦揭示前述組合物或調配物中之任一者，其用於治療高草酸鹽尿症或用於修飾(例如形成插入缺失或形成框移或無義突變)LDHA 基因。
本申請案主張下列申請案之優先權權益：2018年9月28日提出申請之美國臨時專利申請案第62/738,956號、2019年4月15日提出申請之美國臨時專利申請案第62/834,334號及2019年5月1日提出申請之美國臨時專利申請案第62/841,740號，其中之每一者之全部內容之內容出於所有目的以引用方式併入本文中。
現在將詳細參考本發明之某些實施例，在附圖中圖解說明該等實施例之實例。儘管將結合所闡釋實施例來闡述本發明，但應理解，該等實施例並不意欲將本發明限於彼等實施例。與之相反，本發明意欲涵蓋如由隨附申請專利範圍及所包含實施例所界定之本發明內可包含之所有替代、修改及等效形式。
在詳細闡述本發明教示內容之前，應理解，本發明並不限於特定組合物或製程步驟，此乃因該等要素可有所變化。應注意，除非上下文另外明確指示，否則本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一(a、an)」及「該(the)」包含複數個指示物。因此，舉例而言，所提及「偶聯物」包含複數個偶聯物且所提及「細胞」包含複數個細胞，及諸如此類。
數字範圍包含界定該範圍之數字。所量測及可量測值應理解為係近似值，且考慮有效數字及與量測有關之誤差。同樣，「包括(comprise、comprises、comprising)」、「含有(contain、contains、containing)」、「包含(include、includes及including)」在使用時並不意欲加以限制。應理解，前述一般說明及詳細說明二者僅為實例性及解釋性且並不限制教示內容。
除非在說明書中明確說明，否則說明書中敘述「包括」各種組分之實施例亦涵蓋「由所敘述組分組成」或「基本上由所敘述組分組成」；說明書中敘述「由各種組分組成」之實施例亦涵蓋「包括所敘述組分」或「基本上由所敘述組分組成」；且說明書中敘述「基本上由各種組分組成」之實施例亦涵蓋「由所敘述組分組成」或「包括所敘述組分」(此可互換性並不適用於該等術語在申請專利範圍中之使用)。除非上下文另外明確指示，否則術語「或」係以包含性意義使用，亦即等效於「及/或」。
本文所用之部分標題僅出於組織目的，而不能解釋為以任一方式限制期望標的物。在以引用方式納入之任一材料與本說明書中所定義之任一術語或本說明書之任一其他表達內容矛盾，則以本說明書為準。儘管連同各個實施例一起闡述了本發明教示內容，但並不意欲將本發明教示內容限於該等實施例。與之相反，本發明教示內容涵蓋各種替代方案、修改及等效形式，如熟習此項技術者將瞭解。 I. 定義
除非另外陳述，否則本文所用之下列術語及片語意欲具有下列含義：
「多核苷酸」及「核酸」在本文中用於係指包括具有沿主鏈連接至一起之含氮雜環鹼基或鹼基類似物之核苷或核苷類似物之多聚體化合物，包含習用RNA、DNA混合RNA-DNA及其類似聚合物。核酸「主鏈」可由多個鍵聯構成，包含糖-磷酸二酯鍵聯、肽-核酸鍵(「肽核酸」或PNA；PCT第WO 95/32305號)、硫代磷酸酯鍵聯、甲基膦酸酯鍵聯或其組合中之一或多者。核酸之糖部分可為核糖、去氧核糖或具有取代(例如2’甲氧基或2’鹵化物取代)之類似化合物。含氮鹼基可為習用鹼基(A、G、C、T、U)、其類似物(例如經修飾尿苷，例如5-甲氧基尿苷、假尿苷或N1-甲基假尿苷，或其他)；肌苷；嘌呤或嘧啶衍生物(例如N4 -甲基去氧鳥苷、去氮雜-或氮雜-嘌呤、去氮雜-或氮雜-嘧啶、在5或6位具有取代基之嘧啶鹼基(例如5-甲基胞嘧啶)、在2、6或8位具有取代基之嘌呤鹼基、2-胺基-6-甲基胺基嘌呤、O6 -甲基鳥嘌呤、4-硫基-嘧啶、4-胺基-嘧啶、4-二甲基肼-嘧啶及O4 -烷基-嘧啶；美國專利第5,378,825號及PCT第WO 93/13121號)。關於一般論述，可參見The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams等人編輯，第11版，1992)。核酸可包含一或多個「無鹼基」殘基，其中主鏈在聚合物之一或多個位置不包含含氮鹼基(美國專利第5,585,481號)。核酸可僅包括習用RNA或DNA糖、鹼基及鍵聯，或可包含習用組分及取代二者(例如具有2’甲氧基鍵聯之習用鹼基或含有習用鹼基及一或多種鹼基類似物二者之聚合物)。核酸包含「鎖核酸」 (LNA)，一種含有一或多個LNA核苷酸單體以及鎖定為模擬RNA之糖構形之雙環呋喃糖單元的類似物，該等增強了對互補RNA及DNA序列之雜交親和性(Vester及Wengel, 2004,Biochemistry 43(42):13233-41)。RNA及DNA具有不同糖部分且其區別可在於，在RNA中存在尿嘧啶或其類似物，而在DNA中存在胸腺嘧啶或其類似物。
「嚮導RNA」、「gRNA」及「嚮導」在本文中可互換使用且係指crRNA (亦稱為CRISPR RNA)或crRNA及trRNA之組合(亦稱為tracrRNA)。crRNA及trRNA可締合為單一RNA分子(單嚮導RNA，sgRNA)或為兩個單獨RNA分子(雙嚮導RNA，dgRNA)。「嚮導RNA」或「gRNA」係指每一類型。trRNA可為天然序列或與天然序列相比具有修飾或變化之trRNA序列。
如本文中所使用，「嚮導序列」係指嚮導RNA內與靶序列互補之序列，其用於將嚮導RNA引導至靶序列以用於藉由RNA引導之DNA結合劑進行結合或修飾(例如裂解)。「嚮導序列」亦可稱為「靶向序列」或「間隔體序列」。嚮導序列之長度可為20個鹼基對，例如在釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene) (亦即Spy Cas9)及相關Cas9同系物/直向同源物之情形下。亦可使用較短或較長序列作為嚮導，例如長度為15-、16-、17-、18-、19-、21-、22-、23-、24-或25個核苷酸。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包括選自SEQ ID NO:1-84之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸。在一些實施例中，舉例而言，靶序列位於基因中或染色體上，且與嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導序列與其相應靶序列之間之互補性或一致性程度可為約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。舉例而言，在一些實施例中，嚮導序列包括與選自SEQ ID NO:1-84之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列。在一些實施例中，嚮導序列及靶區域可100%互補或一致。在其他實施例中，嚮導序列及靶區域可含有至少一個失配。舉例而言，嚮導序列及靶序列可含有1、2、3或4個失配，其中靶序列之總長度為至少17、18、19、20或更多個鹼基對。在一些實施例中，嚮導序列及靶區域可含有1-4個失配，其中嚮導序列包括至少17、18、19、20或更多個核苷酸。在一些實施例中，嚮導序列及靶區域可含有1、2、3或4個失配，其中嚮導序列包括20個核苷酸。
RNA引導之DNA結合劑之靶序列包含基因體之DNA正鏈及負鏈二者(亦即既定序列及該序列之反向補體)，此乃因RNA引導之DNA結合劑之核酸受質係雙鏈核酸。因此，在嚮導序列視為「與靶序列互補」之情形下，應理解，嚮導序列可引導嚮導RNA結合至靶序列之反向補體。因此，在一些實施例中，在嚮導序列結合靶序列之反向補體之情形下，嚮導序列與靶序列(例如不包含PAM之靶序列)之某些核苷酸一致，只是在嚮導序列中使用U取代T。
如本文中所使用，「YA位點」係指5’-嘧啶-腺嘌呤-3’二核苷酸。「保守區YA位點」存在於sgRNA之保守區中。「嚮導區YA位點」存在於sgRNA之嚮導區中。sgRNA中之未修飾YA位點可易於由RNase-A樣內核酸酶(例如RNase A)裂解。在一些實施例中，sgRNA在其保守區中包括約個10 YA位點。在一些實施例中，sgRNA在其保守區中包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點。實例性保守區YA位點指示於圖10中。實例性嚮導區YA位點未展示於圖10中，此乃因嚮導區可為包含任一數量之YA位點之任一序列。在一些實施例中，sgRNA包括圖10中所指示之1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點。在一些實施例中，sgRNA在下列位置或其子組處包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個YA位點：LS5-LS6；US3-US4；US9-US10；US12-B3；LS7-LS8；LS12-N1；N6-N7；N14-N15；N17-N18；及H2-2至H2-3。在一些實施例中，YA位點包括修飾，此意指YA位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶(亦稱為嘧啶位置)包括修飾(其包含改變緊接嘧啶之糖之3’之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤(亦稱為腺嘌呤位置)包括修飾(其包含改變緊接腺嘌呤之糖之3’之核苷間鍵聯的修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶位置及腺嘌呤位置包括修飾。
如本文中所使用，「RNA引導之DNA結合劑」意指具有RNA及DNA結合活性之多肽或多肽複合物或此一複合物之DNA結合亞單元，其中DNA結合活性係序列特異性且取決於RNA序列。實例性RNA引導之DNA結合劑包含Cas裂解酶/切割酶及其不活化形式(「dCas DNA結合劑」)。本文所用之「Cas核酸酶」 (亦稱為「Cas蛋白」)涵蓋Cas裂解酶、Cas切割酶及dCas DNA結合劑。Cas裂解酶/切割酶及dCas DNA結合劑包含III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物、其Cas10、Csm1或Cmr2亞單元、I型CRISPR系統之級聯複合物、其Cas3亞單元及種類2 Cas核酸酶。如本文中所使用，「種類2 Cas核酸酶」係具有RNA引導之DNA結合活性之單鏈多肽，例如Cas9核酸酶或Cpf1核酸酶。種類2 Cas核酸酶包含種類2 Cas裂解酶及種類2 Cas切割酶(例如H840A、D10A或N863A變體，其進一步具有RNA引導之DNA裂解酶或切割酶活性)以及種類2 dCas DNA結合劑(其中裂解酶/切割酶活性不活化)。種類2 Cas核酸酶包含(例如) Cas9、Cpf1、C2c1、C2c2、C2c3、HF Cas9 (例如N497A、R661A、Q695A、Q926A變體)、HypaCas9 (例如N692A、M694A、Q695A、H698A變體)、eSPCas9(1.0) (例如K810A、K1003A、R1060A變體)及eSPCas9(1.1) (例如K848A、K1003A、R1060A變體)蛋白及其修飾。Cpf1蛋白(Zetsche等人，Cell , 163: 1-13 (2015))與Cas9同源，且含有RuvC樣核酸酶結構域。Zetsche之Cpf1序列之全部內容以引用方式併入本文中。例如參見 Zetsche之表S1及S3。「Cas9」涵蓋Spy Cas9 (本文所列示Cas9之變體中)及其等效形式。例如參見Makarova等人，Nat Rev Microbiol , 13(11): 722-36 (2015)；Shmakov等人，Molecular Cell, 60:385-397 (2015)。
如本文中所使用，「核糖核蛋白」 (RNP)或「RNP複合物」係指嚮導RNA以及RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶，例如Cas裂解酶、Cas切割酶或dCas DNA結合劑(例如Cas9))。在一些實施例中，嚮導RNA將RNA引導之DNA結合劑(例如Cas9)引導至靶序列，且嚮導RNA與靶序列雜交且該藥劑結合至靶序列；在藥劑係裂解酶或切割酶之情形下，在結合後可發生裂解或切割。
如本文中所使用，若第一序列與第二序列之比對展示整個第二序列中X%或更多之位置與第一序列匹配，則第一序列可視為「包括與第二序列具有至少X%一致性之序列」。舉例而言，序列AAGA包括與序列AAG具有100%一致性之序列，此乃因比對將得到100%一致性，其中與第二序列之所有三個位置皆匹配。RNA與DNA之間之差異(通常將尿苷交換為胸苷或反之亦然)及存在核苷類似物(例如經修飾尿苷)並不在多核苷酸中造成一致性或互補性差異，只要相關核苷酸(例如胸苷、尿苷或經修飾尿苷)具有相同補體即可(例如用於所有胸苷、尿苷或經修飾尿苷之腺苷；另一實例係胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶，二者皆使用鳥苷或經修飾鳥苷作為補體)。因此，舉例而言，序列5’-AXG (X係任一經修飾尿苷，例如假尿苷、N1-甲基假尿苷或5-甲氧基尿苷)可視為與AUG 100%一致，其中二者與同一序列(5’-CAU)完全互補。實例性比對算法係業內熟知之Smith-Waterman及Needleman-Wunsch算法。熟習此項技術者應理解，所選算法及參數設置應適用於擬比對之既定序列；對於通常具有類似長度及預期一致性(對於胺基酸而言＞50%或對於核苷酸而言＞75%)之序列而言，由EBI提供於www.ebi.ac.uk網路伺服器處之具有Needleman-Wunsch算法介面之預設設置之Needleman-Wunsch算法通常係適當的。
「mRNA」在本文中用於係指係RNA或經修飾RNA且包括可轉譯成多肽(亦即可用作核糖體及胺基-醯基化tRNA之轉譯受質)之開放閱讀框之多核苷酸。mRNA可包括含有核糖殘基或其類似物(例如2’-甲氧基核糖殘基)之磷酸酯-糖主鏈。在一些實施例中，mRNA磷酸酯-糖主鏈之糖基本上由核糖殘基、2’-甲氧基核糖殘基或其組合組成。
可用於本文所闡述之嚮導RNA組合物及方法中之嚮導序列展示於表1及整個申請案中。
如本文中所使用，「插入缺失」係指由諸多插入或缺失於靶核酸中之雙鏈斷裂(DSB)之位點處之核苷酸組成之插入/缺失突變。
如本文中所使用，「敲低」係指降低特定基因產物(例如蛋白質、mRNA或二者)之表現。可藉由檢測來自所關注組織或細胞群體之蛋白質之總細胞量來量測蛋白質敲低。已知量測mRNA敲低之方法且包含對自所關注組織或細胞群體分離之mRNA進行測序。在一些實施例中，「敲低」可係指特定基因產物之表現之一定損失，例如所轉錄mRNA之量有所降低或由細胞群體(包含活體內群體，例如發現於組織中者)表現之蛋白質之量有所降低。
如本文中所使用，「敲除」係指特定蛋白質在細胞中之表現之損失。可藉由檢測蛋白質在細胞、組織或細胞群體中之總細胞量來量測敲除。在一些實施例中，本發明方法「敲除」一或多種細胞(例如細胞群體，包含活體內群體，例如發現於組織中者)中之LDHA 。在一些實施例中，敲除並非形成突變LDHA蛋白(例如藉由插入缺失產生)，而是完全損失細胞中之表LDH蛋白現。如本文中所使用，「LDH」係指乳酸脫氫酶，其係LDHA 基因之基因產物。人類野生型LDHA 序列可獲得於NCBI基因編號：3939；Ensembl ENSG00000134333處。
「高草酸鹽尿症」係特徵在於在尿中具有過量草酸鹽之病狀。高草酸鹽尿症之實例性類型包含原發性高草酸鹽尿症(包含1型(PH1)、2型(PH2)及3型(PH3))、草酸鹽沈積症、腸高草酸鹽尿症及與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症。高草酸鹽尿症可為特發性。高草酸鹽含量引起草酸鈣結石形成及腎實質損害，此使得腎功能發生進展性退化且最終產生晚期腎病。因此，高草酸鹽尿症可產生過量草酸鹽且使草酸鈣晶體沈積於腎及泌尿道中。來自草酸鹽之腎損害係由腎小管毒性、腎中之草酸鈣沈積及藉由草酸鈣結石之尿路阻塞之組合引起。腎功能受損會加劇疾病，此乃因過量草酸鹽可能不再有效排泄，從而隨後草酸鹽累積且結晶於骨、眼睛、皮膚及心臟以及其他器官中以引起嚴重病況及死亡。可發生腎衰竭及晚期腎病。尚未批準用於高草酸鹽尿症之醫藥療法。
「1型原發性高草酸鹽尿症(PH1)」係由AGXT基因突變所致之常染色體隱性病症，該AGXT基因編碼肝過氧化物酶體丙胺酸-乙醛酸胺基轉移酶(AGT)。 AGT將乙醛酸鹽代謝成甘胺酸。缺乏AGT活性或其錯靶向線粒體使得乙醛酸鹽氧化成草酸鹽，草酸鹽僅可排泄於尿中。
破壞乳酸脫氫酶(LDH) (在將乙醛酸鹽轉化成隨後由腎排泄之草酸鹽之肝過氧化物酶體酶)係一種阻斷患病肝中之草酸鹽合成以潛在地預防出現於高草酸鹽尿症中之病況之可能機制。由乳酸脫氫酶(LDHA )基因編碼之LDH催化乙醛酸鹽至草酸鹽之轉化。阻抑LDH活性應可抑制草酸鹽產生，從而降低尿草酸鹽含量且同時累積乙醛酸鹽，乙醛酸鹽可由乙醛酸還原酶/羥基丙酮酸還原酶(GRHPR)轉化成羥基乙酸鹽。與草酸鹽不同，羥基乙酸鹽可溶於尿中且易於排泄於其中。當前，升高羥基乙酸鹽含量並無已知不利副效應。因此，在一些實施例中，提供抑制LDH活性之方法，其中在抑制後，草酸鹽產生得以抑制且羥基乙酸鹽產生有所增加。
草酸鹽(乙醛酸鹽之氧化產物)僅可排泄於尿中。在尿中具有高含量草酸鹽(「高草酸鹽尿症」)係高草酸鹽尿症之症狀。因此，尿中之草酸鹽增加係高草酸鹽尿症之症狀。草酸鹽可與鈣組合以形成草酸鈣，草酸鈣係腎結石及膀胱結石之主要組分。腎及其他組織中之草酸鈣沈積物可引起血尿(血尿症)、泌尿道感染、腎損害、晚期腎病及其他疾病。隨時間變化，血液中之草酸鹽含量可有所升高且草酸鈣可沈積於全身之其他器官中(草酸鹽沈積症或全身性草酸鹽沈積症)。
如本文中所使用，「靶序列」係指靶基因中與gRNA之嚮導序列具有互補性之核酸序列。靶序列與嚮導序列之相互作用會引導RNA引導之DNA結合劑結合且潛在地切割或裂解(取決於藥劑活性)靶序列。
如本文中所使用，「治療」係指用於個體之疾病或病症之任一治療劑投與或施加，且包含抑制疾病，阻止其發展，減輕一或多種疾病症狀，治癒疾病，或預防一或多種疾病症狀之復發。舉例而言，治療高草酸鹽尿症可包括緩解高草酸鹽尿症之症狀。
本文所用之術語「草酸鹽之治療相關性減少」或「治療範圍內之草酸鹽含量」意指，與基線相比尿草酸鹽排泄之減小大於30%。參見Leumann及Hoppe (1999) Nephrol Dial Transplant 14:2556-2558，2557頁，第二行。舉例而言，達成治療範圍內之草酸鹽含量意指將尿草酸鹽自基線減少30%以上。在一些實施例中，「正常草酸鹽含量」或「正常草酸鹽範圍」介於約80 µg草酸鹽/mg肌酸酐至約122 µg草酸鹽/mg肌酸酐之間。參見Li等人(2016) Biochim Biophys Acta 1862(2):233-239。在一些實施例中，草酸鹽之治療相關性減少達成小於200%、150%、125%、120%、115%、110%、105%或100%之正常值或在其內之含量。
術語「約」或「大約」意指如由熟習此項技術者所測定之特定值的可接受誤差，其部分地取決於該值之量測或測定方式。 II.    組成物  A.     包括嚮導RNA (gRNA)之組合物
本文提供可用於(例如)使用嚮導RNA與RNA引導之DNA結合劑(例如CRISPR/Cas系統)來誘導LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)之組合物。可將該等組合物投與患有或懷疑患有高草酸鹽尿症之個體。可將該等組合物投與具有增加之尿草酸鹽輸出或降低之血清羥基乙酸鹽輸出之個體。靶向LDHA 基因之嚮導序列展示於表1中之SEQ ID NO:1-84處。
表1中在SEQ ID NO:1-84及100-192處所展示之每一嚮導序列可進一步包括其他核苷酸以形成crRNA，舉例而言，在嚮導序列之3’端後面具有下列實例性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (SEQ ID NO: 200)，沿5’至3’方向。在sgRNA之情形下，上述嚮導序列可進一步包括其他核苷酸以形成sgRNA，舉例而言，在嚮導序列之3’端後面具有下列實例性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (SEQ ID NO: 201)或GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 203，其係不含4個末端U之SEQ ID NO: 201)，沿5’至3’方向。在一些實施例中，SEQ ID NO: 201之4個末端U並不存在。在一些實施例中，僅存在SEQ ID NO: 201之4個末端U中之1、2或3者。
在一些實施例中，提供LDHA 短單嚮導RNA (LDHA 短-sgRNA)，其包括如本文所闡述之嚮導序列及包括髮夾區之「sgRNA保守部分」，其中髮夾區至少缺失5-10個核苷酸或6-10個核苷酸。在某些實施例中，參照sgRNA之保守部分(例如表2B中之核苷酸H1-1至H2-15)，LDHA 短單嚮導RNA之髮夾區缺乏5-10個核苷酸。在某些實施例中，參照sgRNA之保守部分(例如表2B中之核苷酸H1-1至H2-12)，LDHA 短單嚮導RNA之髮夾區1缺乏5-10個核苷酸。
實例性「sgRNA保守部分」展示於表2A中，該表格展示釀膿鏈球菌Cas9 (「spyCas9」 (亦稱為「spCas9」)) sgRNA之「保守區」。第一列展示核苷酸之編號，第二列展示序列(SEQ ID NO: 700)；且第三列展示「結構域」。Briner AE 等人， Molecular Cell 56:333-339 (2014)闡述sgRNA之功能結構域(在本文中稱為「結構域」)，該等結構域包含負責靶向之「間隔體」結構域、「下莖」、「突起」、「上莖」 (其可包含四環)、「連接」及「髮夾1」及「髮夾2」結構域。參見Briner等人，第334頁，圖1A。
表2B提供本文所用之sgRNA之結構域之示意圖。在表2B中，區域之間之「n」代表核苷酸之可變數量，例如0至1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大。在一些實施例中，n等於0。在一些實施例中，n等於1。
在一些實施例中，LDHA sgRNA係來自釀膿鏈球菌Cas9 (「spyCas9」)或spyCas9等效物。在一些實施例中，sgRNA並非來自釀膿鏈球菌(「非spyCas9」)。在一些實施例中，5-10個核苷酸或6-10個核苷酸係連續的。
在一些實施例中，LDHA 短-sgRNA至少缺乏釀膿鏈球菌Cas9 (「spyCas9」) sgRNA之保守部分之核苷酸54-58 (AAAAA)，如表2A中所展示。在一些實施例中，LDHA 短-sgRNA係非spyCas9 sgRNA，其至少缺乏對應於spyCas9之保守部分之核苷酸54-58 (AAAAA)之核苷酸，如(例如)藉由成對或結構比對所測定。在一些實施例中，非spyCas9 sgRNA係金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) Cas9 (「saCas9」) sgRNA。
在一些實施例中，LDHA 短-sgRNA至少缺乏spyCas9 sgRNA之保守部分之核苷酸54-61 (AAAAAGUG)。在一些實施例中，LDHA 短-sgRNA至少缺乏spyCas9 sgRNA之保守部分之核苷酸53-60 (GAAAAAGU)。在一些實施例中，LDHA 短-sgRNA缺乏spyCas9 sgRNA之保守部分之核苷酸53-60 (GAAAAAGU)或核苷酸54-61 (AAAAAGUG)中之4、5、6、7或8個核苷酸，或缺乏非spyCas9 sgRNA之保守部分之相應核苷酸，如(例如)藉由成對或結構比對所測定。
在一些實施例中，sgRNA包括SEQ ID NO: 1-146之嚮導序列中之任一者及其他核苷酸以形成crRNA，舉例而言，在嚮導序列之3’端後面具有下列實例性核苷酸序列：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO: 202)，沿5’至3’方向。參照野生型嚮導RNA保守序列：GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (SEQ ID NO:203)，SEQ ID NO: 202缺乏8個核苷酸。
表1：用於人類及食蟹猴之靶向LDHA 之嚮導序列及染色體坐標
嚮導編號 嚮導序列 實例性基因體坐標 ( 「 Hs 」 指示人類 ；「 Cyno 」 指示食蟹猴 ； 未指定者係人類 ) SEQ ID NO:
G012089 ACAUAGACCUACCUUAAUCA chr11:18405564-18405584 1
G012090 AAAUAACUUAUGCUUACCAC Hs: chr11:18403010-18403030 Cyno: chr14:49278339-49278359 2
G012091 AUGCAGUCAAAAGCCUCACC chr11:18401009-18401029 3
G012092 UCAGGGUCUUUACGGAAUAA chr11:18407112-18407132 4
G012093 CCUAUCAUACAGUGCUUAUG chr11:18405436-18405456 5
G012094 CCGAUUCCGUUACCUAAUGG chr11:18402924-18402944 6
G012095 UAGACCUACCUUAAUCAUGG chr11:18405561-18405581 7
G012096 UACAGAGAGUCCAAUAGCCC chr11:18405486-18405506 8
G012097 CUUUUAGUGCCUGUAUGGAG Hs: chr11:18403686-18403706 Cyno: chr14:49277655- 49277675 9
G012098 CCCGAUUCCGUUACCUAAUG chr11:18402923-18402943 10
G012099 GGCUGGGGCACGUCAGCAAG chr11:18400876-18400896 11
G012100 CCCCAUUAGGUAACGGAAUC chr11:18402926-18402946 12
G012101 AAGCUGGUCAUUAUCACGGC Hs: chr11:18400859-18400879 Cyno: chr14:49280125-49280145 13
G012103 UACACUUUGGGGGAUCCAAA chr11:18407244-18407264 14
G012104 AUUUGAUGUCUUUUAGGACU chr11:18399414-18399434 15
G012105 CUCCAAGCUGGUCAUUAUCA Hs: chr11:18400855-18400875 Cyno: chr14:49280129-49280149 16
G012106 GUCCAAUAUGGCAACUCUAA chr11:18396835-18396855 17
G012107 GGCUACACAUCCUGGGCUAU chr11:18405473-18405493 18
G009440 UACCUUCAUUAAGAUACUGA chr11:18396951-18396971 19
G012108 AGCCCGAUUCCGUUACCUAA chr11:18402921-18402941 20
G012109 GCCUUUCCCCCAUUAGGUAA chr11:18402933-18402953 21
G012110 UACGCUGGACCAAAUUAAGA Hs: chr11:18400909-18400929 Cyno: chr14:49280075-49280095 22
G012111 UAUUUCUUUUAGUGCCUGUA chr11:18403681-18403701 23
G012112 AGCUGGUCAUUAUCACGGCU Hs: chr11:18400860-18400880 Cyno: chr14:49280124-49280144 24
G012113 GCUGGUCAUUAUCACGGCUG Hs: chr11:18400861-18400881 Cyno: chr14:49280123-49280143 25
G012114 GCUGGGGCACGUCAGCAAGA chr11:18400877-18400897 26
G012115 CUUUAUCAGUCCCUAAAUCU Hs: chr11:18403748-18403768 Cyno: chr14:49277593-49277613 27
G012116 GCCCGAUUCCGUUACCUAAU chr11:18402922-18402942 28
G012117 UUUCAUCUUCAGGGUCUUUA chr11:18407104-18407124 29
G012118 ACAACUGUAAUCUUAUUCUG Hs: chr11:18396899-18396919 Cyno: chr14:49282661-49282681 30
G012119 CAUUAAGAUACUGAUGGCAC Hs: chr11:18396945-18396965 Cyno: chr17:59812521-59812541 31
G012120 UUUAGGGACUGAUAAAGAUA Hs: chr11:18403751-18403771 Cyno: chr14:49277590-49277610 32
G012121 CUGAUAAAGAUAAGGAACAG Hs: chr11:18403759-18403779 Cyno: chr14:49277582-49277602 33
G012122 UUACCUAAUGGGGGAAAGGC chr11:18402933-18402953 34
G012123 UGGAGUGGAAUGAAUGUUGC Hs: chr11:18403701-18403721 Cyno: chr14:49277640-49277660 35
G012124 UCUUUAUCAGUCCCUAAAUC Hs: chr11:18403749-18403769 Cyno: chr14:49277592-49277612 36
G012125 UCCGUUACCUAAUGGGGGAA chr11:18402929-18402949 37
G012126 UAUCUGCACUCUUCUUCAAA chr11:18407226-18407246 38
G012127 UACCUAAUGGGGGAAAGGCU chr11:18402934-18402954 39
G012128 AGCCGUGAUAAUGACCAGCU Hs: chr11:18400860-18400880 Cyno: chr14:49280124-49280144 40
G012129 CCCCCAUUAGGUAACGGAAU chr11:18402927-18402947 41
G012130 UUUAAAAUUGCAGCUCCUUU chr11:18407262-18407282 42
G012131 GCUGAUUUAUAAUCUUCUAA chr11:18396862-18396882 43
G012132 ACAUUCAUUCCACUCCAUAC Hs: chr11:18403698-18403718 Cyno: chr14:49277643-49277663 44
G012133 CCUUAAUCAUGGUGGAAACU Hs: chr11:18405553-18405573 Cyno: chr12:38488548-38488568 45
G012134 ACCUUAAUCAUGGUGGAAAC chr11:18405554-18405574 46
G012135 CCUUUGCCAGAGACAAUCUU chr11:18399529-18399549 47
G012136 GAAGGUGACUCUGACUUCUG chr11:18407193-18407213 48
G012137 UAUUGGAAGCGGUUGCAAUC chr11:18402894-18402914 49
G012138 AAGUCAGAGUCACCUUCACA chr11:18407190-18407210 50
G012139 GACUCUGACUUCUGAGGAAG chr11:18407199-18407219 51
G012140 UGCAACCGCUUCCAAUAACA chr11:18402891-18402911 52
G012141 UAUUUUCUCCUUUUUCAUAG Hs: chr11:18402819-18402839 Cyno: chr14:49278530-49278550 53
G012142 UUUUUUUCAUUUCAUCUUCA chr11:18407095-18407115 54
G012143 ACCAAAGUAGUCACUGUUCA Cyno: chr14:49274629-49274649 55
G012145 ACGCAGUUAAAAGGCUCACC chr14:49279975-49279995 56
G012146 UUGCUUAUUGUUUCAAAUCC Cyno: chr14:49279996-49280016 Hs: chr11:18400988-18401008 57
G012147 UUCCCCCUAUAGAUUCCUUC chr14:49282754-49282774 58
G012148 UCGAGCUUUGUGGCAGUUAG chr14:49283162-49283182 59
G012149 UUGGGGUUAAUAAACCGCGA Cyno:  chr14:49283034-49283054 Hs: chr11:18396528-18396548 60
G012150 UGAAGGCCCAUACCUUAGCG Cyno: chr14:49282959-49282979 Hs: chr11:18396603-18396623 61
G012151 CGGUUUAUUAACCCCAAGUG Cyno: chr14:49283037-49283057 Hs: chr11:18396525-18396545 62
G012152 CCCAUACCUUAGCGUGGAAA Cyno: chr14:49282965-49282985 Hs: chr11:18396597-18396617 63
G012153 GGCUUUUCUGCACGUACCUC chr14:49283141-49283161 64
G012154 GAAAAGGAAUAUCGACGUUU Cyno: chr14:49282981-49283001 Hs: chr11:18396581-18396601 65
G012155 ACCGCGAUGGGUGAGCCCUC chr14:49283021-49283041 66
G012156 GCGGUUUAUUAACCCCAAGU Cyno: chr14:49283036-49283056 Hs: chr11:18396526-18396546 67
G012157 ACCGCACGCUUCAGUGCCUU chr14:49283186-49283206 68
G012158 GGAAAAGGAAUAUCGACGUU Cyno: chr14:49282980-49283000 Hs: chr11:18396582-18396602 69
G012159 GUGUAAGUAUAGCCUCCUGA Cyno: chr14:49283003-49283023 Hs: chr11:18396559-18396579 70
G012160 GAUAUUCCUUUUCCACGCUA Cyno: chr14:49282974-49282994 Hs: chr11:18396588-18396608 71
G012161 GCGAUGGGUGAGCCCUCAGG chr14:49283018-49283038 72
G012162 GGAAAGGCCAGCCCCACUUG Cyno: chr14:49283051-49283071 Hs: chr11:18396511-18396531 73
G012163 CACCGCACGCUUCAGUGCCU chr14:49283187-49283207 74
G012164 UGCCACAAAGCUCGAGCCCA chr14:49283167-49283187 75
G012165 GGUGUAAGUAUAGCCUCCUG Cyno: chr14:49283002-49283022 Hs: chr11:18396560-18396580 76
G012166 UCCUGAGGGCUCACCCAUCG chr14:49283017-49283037 77
G012167 AGGAAAGGCCAGCCCCACUU Cyno: chr14:49283052-49283072 Hs: chr11:18396510-18396530 78
G012168 UUAUUAACCCCAAGUGGGGC Cyno: chr14:49283041-49283061 Hs: chr11:18396521-18396541 79
G012169 GAGGAAAGGCCAGCCCCACU Cyno: chr14:49283053-49283073 Hs: chr11:18396509-18396529 80
G012170 GCUCAAAGUGAUCUUGUCUG chr14:49283072-49283092 81
G012171 CCUGGCUGUGUCCUUGCUGU Cyno: chr14:49283105-49283125 Hs: chr11:18396457-18396477 82
G012172 CGCGGUUUAUUAACCCCAAG Cyno: chr14:49283035-49283055 Hs: chr11:18396527-18396547 83
G012173 UGGGGUUAAUAAACCGCGAU Cyno: chr14:49283033-49283053 Hs: chr11:18396529-18396549 84
G015538 UUUCCCAAAAACCGUGUUAU Cyno: chr14:49278472-49278492 100
G015539 GAAAGAGGUUCACAAGCAGG Cyno: chr14:49277560-49277580 101
G015540 GUGGAAAGAGGUUCACAAGC Cyno: chr14:49277563-49277583 102
G015541 GAGAUGAUGGAUCUCCAACA Cyno: chr12:38487918-38487938 Hs: chr11:18399484-18399504 103
G015542 UAAGGAAAAGGCUGCCAUGU Cyno: chr17:59812615-59812635 104
G015543 UGUAACUGCAAACUCCAAGC Cyno: chr14:49280141-49280161 105
G015544 CUUCCAAUAACACGGUUUUU Cyno: chr14:49278466-49278486 106
G015545 AAAAACCGUGUUAUUGGAAG Cyno: chr14:49278466-49278486 107
G015546 GUUCACCCAUUAAGCUGUCA Cyno: chr14:49278391-49278411 108
G015547 UUCACCCAUUAAGCUGUCAU Cyno: chr14:49278390-49278410 Hs: chr11:18402959-18402979 109
G015548 ACCCAUUAAGCUGUCAUGGG Cyno: chr14:49278387-49278407 110
G015549 UGGAAUCUCCAUGUUCCCCA Cyno: chr14:49278359-49278379 111
G015550 AGAGUAUAAUGAAGAAUCUU Cyno: chr12:38488514-38488534 112
G015551 GCUGAUUCAUAAUCUUCUAA Cyno: chr14:49282698-49282718 113
G015552 CAAAUUGAAGGGAGAGAUGA Cyno: chr12:38487905-38487925 114
G015553 UCUUUGGUGUUCUAAGGAAA Cyno: chr12:38487947-38487967 115
G015554 CAAUAAGCAACUUGCAGUUC Cyno: chr14:49280006-49280026 116
G015555 ACAAUAAGCAACUUGCAGUU Cyno: chr14:49280005-49280025 117
G015556 GCUUAUUGUUUCAAAUCCAG Cyno: chr12:38488136-38488156 118
G015557 ACUUCCAAUAACACGGUUUU Cyno: chr14:49278465-49278485 119
G015558 CCCAUUAAGCUGUCAUGGGU Cyno: chr14:49278386-49278406 120
G015559 UCCACUCCAUACAGGCACAC Cyno: chr12:38488327-38488347 121
G015560 AAGACUCUGCACCCAGAUUU Cyno: chr14:49277607-49277627 122
G015561 AGACUCUGCACCCAGAUUUA Cyno: chr14:49277606-49277626 Hs: chr11:18403735-18403755 123
G015562 CCAGUUUCCACCAUGAUUAA Cyno: chr12:38488546-38488566 124
G015563 ACCAUGAUUAAGGGUCUCUA Cyno: chr12:38488555-38488575 125
G015564 AUAGAGACCCUUAAUCAUGG Cyno: chr12:38488556-38488576 126
G015565 UCCAUAGAGACCCUUAAUCA Cyno: chr12:38488559-38488579 127
G015566 UAAGGGUCUCUAUGGAAUAA Cyno: chr12:38488563-38488583 128
G015567 AGAUAAGGAACAGUGGAAAG Cyno: chr14:49277575-49277595 129
G015568 CAGAAUAAGAUUACAGUUGU Cyno: chr14:49282661-49282681 130
G015569 AGAAUAAGAUUACAGUUGUU Cyno: chr14:49282660-49282680 131
G015570 AACAACUGUAAUCUUAUUCU Cyno: chr14:49282660-49282680 132
G015571 GAAUAAGAUUACAGUUGUUG Cyno: chr14:49282659-49282679 Hs: chr11:18396901-18396921 133
G015572 CAACAACUGUAAUCUUAUUC Cyno: chr14:49282659-49282679 134
G015573 AAGAUUACAGUUGUUGGGGU Cyno: chr14:49282655-49282675 135
G015574 GUUGUUGGGGUUGGUGCUGU Cyno: chr14:49282646-49282666 136
G015575 UGCCAUCAGUAUCUUAAUGA Cyno: chr17:59812522-59812542 137
G015576 GUCCUUCAUUAAGAUACUGA Cyno: chr17:59812527-59812547 138
G015577 CAGUAUCUUAAUGAAGGACU Cyno: chr17:59812528-59812548 139
G015578 UGUCAUCGAAGACAAAUUGA Cyno: chr12:38487893-38487913 140
G015579 GUCAUCGAAGACAAAUUGAA Cyno: chr12:38487894-38487914 141
G015580 AGACAAUCUUUGGUGUUCUA Cyno: chr12:38487953-38487973 142
G015581 AGAACACCAAAGAUUGUCUC Cyno: chr12:38487954-38487974 143
G015582 GGCUGGGGCACGUCAACAAG Cyno: chr14:49280108-49280128 144
G015583 GCUGGGGCACGUCAACAAGA Cyno: chr14:49280107-49280127 145
G015584 GGGAGAAAGCCGUCUUAAUU Cyno: chr14:49280087-49280107 146
G015585 UAAAGAUGUUCACGUUACGC Cyno: chr14:49280060-49280080 147
G015586 GGGCUGUAUUUUACAACAUU Cyno: chr14:49280026-49280046 148
G015587 UACGUGGCUUGGAAGAUAAG Cyno: chr14:49278496-49278516 Hs: chr11:18402853-18402873 149
G015588 ACUUAUCUUCCAAGCCACGU Cyno: chr14:49278495-49278515 150
G015589 UGCAACCACUUCCAAUAACA Cyno: chr14:49278458-49278478 151
G015590 AGCCAGAUUCCGUUACCUGA Cyno: chr14:49278428-49278448 152
G015591 GCCAGAUUCCGUUACCUGAU Cyno: chr14:49278427-49278447 153
G015592 CCAGAUUCCGUUACCUGAUG Cyno: chr14:49278426-49278446 154
G015593 CCCCAUCAGGUAACGGAAUC Cyno: chr14:49278423-49278443 155
G015594 CCCACCCAUGACAGCUUAAU Cyno: chr14:49278383-49278403 Hs: chr11:18402966-18402986 156
G015595 ACCCACCCAUGACAGCUUAA Cyno: chr14:49278382-49278402 157
G015596 AGCUGUCAUGGGUGGGUCCU Cyno: chr14:49278379-49278399 158
G015597 GCUGUCAUGGGUGGGUCCUU Cyno: chr14:49278378-49278398 159
G015598 CUGUCAUGGGUGGGUCCUUG Cyno: chr14:49278377-49278397 160
G015599 GGGUGGGUCCUUGGGGAACA Cyno: chr14:49278370-49278390 161
G015600 GAGAUUCCAGUGUGCCUGUA Cyno: chr12:38488318-38488338 162
G015601 UCCAGUGUGCCUGUAUGGAG Cyno: chr12:38488323-38488343 163
G015602 AUCUGGGUGCAGAGUCUUCA Cyno: chr14:49277609-49277629 164
G015603 AAUCUGGGUGCAGAGUCUUC Cyno: chr14:49277608-49277628 165
G015604 UAUGAGGUGAUCAAACUCAA Cyno: chr12:38488447-38488467 Hs: chr11:18405452-18405472 166
G015605 UGGACUCUCUGUAGCAGAUU Cyno: chr12:38488488-38488508 167
G015606 CCCAGUUUCCACCAUGAUUA Cyno: chr12:38488545-38488565 168
G015607 UGGGGUUGGUGCUGUUGGCA Cyno: chr12:38487815-38487835 169
G015608 GAACACCAAAGAUUGUCUCU Cyno: chr17:59812635-59812655 170
G015609 CAGAUUCCGUUACCUGAUGG Cyno: chr14:49278425-49278445 171
G015610 UUACCUGAUGGGGGAAAGAC Cyno: chr14:49278416-49278436 172
G015611 GUCUUUCCCCCAUCAGGUAA Cyno: chr14:49278416-49278436 173
G015612 UACCUGAUGGGGGAAAGACU Cyno: chr14:49278415-49278435 174
G015613 CUCCCAGUCUUUCCCCCAUC Cyno: chr14:49278410-49278430 175
G015614 AACUCAAAGGCUACACAUCC Cyno: chr17:59813145-59813165 176
G015615 ACUCAAAGGCUACACAUCCU Cyno: chr17:59813146-59813166 177
G015616 GGCUACACAUCCUGGGCCAU Cyno: chr17:59813153-59813173 178
G015617 UACAGAGAGUCCAAUGGCCC Cyno: chr17:59813166-59813186 179
G015618 AUCUGCUACAGAGAGUCCAA Cyno: chr17:59813172-59813192 180
G015619 CCCUUAAUCAUGGUGGAAAC Cyno: chr12:38488549-38488569 181
G015620 CCUUGCAUUUUGGGACAGAA Cyno: chr17:59813291-59813311 182
G015621 CCAUUCUGUCCCAAAAUGCA Cyno: chr17:59813294-59813314 183
G015622 AGUGGAUAUCUUGACCUACG Cyno: chr14:49278512-49278532 184
G015623 AUAUCUUGACCUACGUGGCU Cyno: chr14:49278507-49278527 185
G015624 UAUUGGAAGUGGUUGCAAUC Cyno: chr14:49278455-49278475 186
G015625 UCUUUCCCAGAGACAAUCUU Cyno: chr17:59812643-59812663 187
G015626 GGUGGUUGAGAGUGCUUAUG Cyno: chr17:59813116-59813136 188
G015627 CCUCAGUGUUCCUUGCAUUU Cyno: chr17:59813281-59813301 189
G015628 CUCAGUGUUCCUUGCAUUUU Cyno: chr17:59813282-59813302 190
G015629 CCAAAAUGCAAGGAACACUG Cyno: chr17:59813284-59813304 191
G015630 ACGUAGGUCAAGAUAUCCAC Cyno: chr12:38488155-38488175 192
表2：靶向LDHA 之gRNA及sgRNA之命名與序列
嚮導 編號 (sgRNA) 嚮導 編號 (crRNA) sgRNA 序列 - 未修飾 SEQ ID NO sgRNA 序列 - 經修飾 SEQ ID NO
G012089 CR0011780 ACAUAGACCUACCUUAAUCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1001 mA*mC*mA*UAGACCUACCUUAAUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2001
G012093 CR0011784 CCUAUCAUACAGUGCUUAUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1005 mC*mC*mU*AUCAUACAGUGCUUAUGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2005
G012095 CR0011786 UAGACCUACCUUAAUCAUGGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1007 mU*mA*mG*ACCUACCUUAAUCAUGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2007
G012096 CR0011787 UACAGAGAGUCCAAUAGCCCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1008 mU*mA*mC*AGAGAGUCCAAUAGCCCGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2008
G012103 CR0011793 UACACUUUGGGGGAUCCAAAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1014 mU*mA*mC*ACUUUGGGGGAUCCAAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2014
G012111 CR0011801 UAUUUCUUUUAGUGCCUGUAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1023 mU*mA*mU*UUCUUUUAGUGCCUGUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2023
G012115 CR0011805 CUUUAUCAGUCCCUAAAUCUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1027 mC*mU*mU*UUUAUCAGUCCCUAAAUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2027
G012120 CR0011810 UUUAGGGACUGAUAAAGAUAUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1032 mU*mU*mU*AGGGACUGAUAAAGAUAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2032
G012133 CR0011823 CCUUAAUCAUGGUGGAAACUUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1045 mC*mC*mU*UAAUCAUGGUGGAAACUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2045
G012136 CR0011826 GAAGGUGACUCUGACUUCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1048 mG*mA*mA*GGUGACUCUGACUUCUGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2048
G012151 CR0011840 CGGUUUAUUAACCCCAAGUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1063 mC*mG*mG*UUUAUUAACCCCAAGUG GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2063
G012155 CR0011844 ACCGCGAUGGGUGAGCCCUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1067 mA*mC*mC*GCGAUGGGUGAGCCCUC GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2067
G012157 CR0011846 ACCGCACGCUUCAGUGCCUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1069 mA*mC*mC*GCACGCUUCAGUGCCUU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2069
G012159 CR0011848 GUGUAAGUAUAGCCUCCUGAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1071 mG*mU*mG*UAAGUAUAGCCUCCUGA GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2071
G012162 CR0011851 GGAAAGGCCAGCCCCACUUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1074 mG*mG*mA*AAGGCCAGCCCCACUUG GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2074
G012164 CR0011853 UGCCACAAAGCUCGAGCCCAGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1076 mU*mG*mC*CACAAAGCUCGAGCCCA GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2076
G012165 CR0011854 GGUGUAAGUAUAGCCUCCUGGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1077 mG*mG*mU*GUAAGUAUAGCCUCCUG GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2077
G012166 CR0011855 UCCUGAGGGCUCACCCAUCGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1078 mU*mC*mC*UGAGGGCUCACCCAUCG GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2078
G012167 CR0011856 AGGAAAGGCCAGCCCCACUUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1079 mA*mG*mG*AAAGGCCAGCCCCACUU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2079
G012169 CR0011858 GAGGAAAGGCCAGCCCCACUGUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU 1081 mG*mA*mG*GAAAGGCCAGCCCCACU GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU 2081
表 2A (spyCas9 sgRNA 之保守部分 ； SEQ ID NO:400)
Figure 02_image001
續
Figure 02_image003
表2B
Figure 02_image005
續
Figure 02_image007
在一些實施例中，本發明提供包括一或多個包括嚮導序列之嚮導RNA (gRNA)之組合物，該等嚮導序列將RNA引導之DNA結合劑(其可為核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9))引導至LDHA 中之靶DNA序列。gRNA可包括含有表1中所展示之嚮導序列之crRNA。gRNA可包括含有表1中所展示之嚮導序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸之crRNA。在一些實施例中，gRNA包括含有與表1中所展示嚮導序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列之crRNA。在一些實施例中，gRNA包括含有與表1中所展示之嚮導序列具有約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性之序列之crRNA。gRNA可進一步包括trRNA。在本文所闡述之每一組合物及方法實施例中，crRNA及trRNA可締合為單一RNA (sgRNA)或可為單獨RNA (dgRNA)。在sgRNA之背景中，crRNA及trRNA組分可(例如)經由磷酸二酯鍵或其他共價鍵共價連接。
在本文所闡述之組合物、用途及方法實施例中之每一者中，嚮導RNA可包括兩個RNA分子且呈「雙嚮導RNA」或「dgRNA」形式。dgRNA包括含有crRNA (包括(例如)表1中所展示之嚮導序列)之第一RNA分子及含有trRNA之第二RNA分子。第一及第二RNA分子可能並不共價連接，但可經由crRNA部分與trRNA部分之間之鹼基配對形成RNA雙鏈體。
在本文所闡述之組合物、用途及方法實施例中之每一者中，嚮導RNA可包括單一RNA分子且呈「單嚮導RNA」或「sgRNA」形式。sgRNA可包括含有共價連接至trRNA之表1中所展示嚮導序列之crRNA (或其部分)。sgRNA可包括表1中所展示之嚮導序列之17、18、19或20個鄰接核苷酸。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由連接體共價連接。在一些實施例中，sgRNA經由crRNA部分與trRNA部分之間之鹼基配對形成莖-環結構。在一些實施例中，crRNA及trRNA經由一或多個並非磷酸二酯鍵之鍵共價連接。
在一些實施例中，trRNA可包括衍生自天然CRISPR/Cas系統之trRNA序列之全部或一部分。在一些實施例中，trRNA包括截短或經修飾野生型trRNA。trRNA之長度取決於所用CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，trRNA包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100個或大於100個核苷酸或由其組成。在一些實施例中，trRNA可包括某些二級結構，例如一或多個髮夾或莖-環結構或一或多個突起結構。
在一些實施例中，本發明提供包括一或多個包括SEQ ID NO:1-84中之任一者之嚮導序列之嚮導RNA的組合物。
在一些實施例中，本發明提供包括一或多個sgRNA之組合物，該等sgRNA包括SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)。
在一態樣中，本發明提供包括gRNA之組合物，該gRNA包括與SEQ ID NO:1-84中之任一核酸至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列。
在其他實施例中，該組合物包括至少一種(例如至少兩種)包括選自SEQ ID NO:1-84之嚮導序列中之任兩者或更多者之嚮導序列的gRNA。在一些實施例中，該組合物包括至少兩種gRNA，每一gRNA包括與SEQ ID NO:1-84中之任一核酸至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列。
本發明之嚮導RNA組合物經設計以識別(例如雜交至)LDHA 基因中之靶序列。舉例而言，LDHA 靶序列可由所提供包括嚮導RNA之Cas裂解酶識別且裂解。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)可由嚮導RNA引導至LDHA 基因之靶序列，其中嚮導RNA之嚮導序列與靶序列雜交且RNA引導之DNA結合劑(例如Cas裂解酶)裂解靶序列。
在一些實施例中，一或多個嚮導RNA之選擇取決於LDHA 基因內之靶序列。
不受限於任一特定理論，某些基因區域中之突變(例如源自插入缺失之框移突變，該等插入缺失係因核酸酶調介之DSB而發生)之耐受性可小於其他基因區域中之突變，因此DSB位置係可產生之蛋白質敲低之量或類型之重要因素。在一些實施例中，使用與LDHA 內之靶序列互補或具有互補性之gRNA將RNA引導之DNA結合劑引導至LDHA 基因中之特定位置。在一些實施例中，gRNA經設計以具有與LDHA 之外顯子1、外顯子2、外顯子3、外顯子4、外顯子5、外顯子6、外顯子7或外顯子8中之靶序列互補或具有互補性之嚮導序列。
在一些實施例中，嚮導序列與存在於人類LDHA 基因中之靶序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致。在一些實施例中，靶序列可與嚮導RNA之嚮導序列互補。在一些實施例中，嚮導RNA之嚮導序列及其相應靶序列之間之互補性或一致性程度可為至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%。在一些實施例中，靶序列及gRNA之嚮導序列可為100%互補或一致。在其他實施例中，靶序列及gRNA之嚮導序列可含有至少一個失配。舉例而言，靶序列及gRNA之嚮導序列可含有1、2、3或4個失配，其中嚮導序列之總長度為20。在一些實施例中，靶序列及gRNA之嚮導序列可含有1-4個失配，其中嚮導序列具有20個核苷酸。
在一些實施例中，本文所揭示之組合物或調配物包括含有開放閱讀框(ORF)之mRNA，該開放閱讀框編碼RNA引導之DNA結合劑(例如如本文所闡述之Cas核酸酶)。在一些實施例中，提供、使用或投與包括編碼RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)之ORF之mRNA。 B.     經修飾gRNA及mRNA
在一些實施例中，以化學方式修飾gRNA。包括一或多個經修飾核苷或核苷酸之gRNA稱為「經修飾」 gRNA或「經化學修飾之」 gRNA，其闡述存在一或多種用於代替標準A、G、C及U殘基或標準A、G、C及U殘基以外之非天然及/或天然組分或構形。在一些實施例中，使用非標準核苷或核苷酸來合成經修飾gRNA，在本文中稱為「修飾」。經修飾核苷及核苷酸可包含以下中之一或多者：(i)改變(例如代替)磷酸二酯主鏈鍵聯中之一或兩個非連接性磷酸酯氧及/或一或多個連接性磷酸酯氧(實例性主鏈修飾)；(ii)改變(例如代替)核糖之組分(例如核糖上之2'羥基) (實例性糖修飾)；(iii)使用「去磷酸」連接體大規模代替磷酸酯部分(實例性主鏈修飾)；(iv)修飾或代替天然核鹼基，包含使用非標準核鹼基(實例性鹼基修飾)；(v)代替或修飾核糖-磷酸酯主鏈(實例性主鏈修飾)；(vi)修飾寡核苷酸之3'端或5'端，例如去除、修飾或代替末端磷酸酯基團或偶聯某一部分、帽或連接體(該等3'或5'帽修飾可包括糖及/或主鏈修飾)；及(vii)修飾或代替糖(實例性糖修飾)。
可組合化學修飾(例如上文所列示者)以提供包括可具有兩個、三個、四個或更多個修飾之核苷及核苷酸(統稱為「殘基」)之經修飾gRNA及/或mRNA。舉例而言，經修飾殘基可具有經修飾糖及經修飾核鹼基。在一些實施例中，gRNA之每一鹼基經修飾，舉例而言，所有鹼基皆具有經修飾磷酸酯基團(例如硫代磷酸酯基團)。在某些實施例中，gRNA分子之所有或實質上所有磷酸酯基團經硫代磷酸酯基團代替。在一些實施例中，經修飾gRNA在RNA之5'端處或附近包括至少一個經修飾殘基。在一些實施例中，經修飾gRNA在RNA之3'端處或附近包括至少一個經修飾殘基。
在一些實施例中，gRNA包括一個、兩個、三個或更多個經修飾殘基。在一些實施例中，經修飾gRNA中之至少5% (例如至少5%、至少10%、至少15%、至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%或100%)之位置係經修飾核苷或核苷酸。
未修飾核酸可易於由(例如)細胞內核酸酶或發現於血清中者降解。舉例而言，核酸酶可水解核酸磷酸二酯鍵。因此，在一態樣中，本文所闡述之gRNA可含有一或多個經修飾核苷或核苷酸以(例如)引入針對細胞內或基於血清之核酸酶之穩定性。在一些實施例中，本文所闡述之經修飾gRNA分子在引入活體內及離體細胞群體中時可展現減小之先天性免疫反應。術語「先天性免疫反應」包含對外源性核酸(包含單鏈核酸)之細胞反應，該細胞反應涉及誘導細胞介素(尤其干擾素)表現及釋放以及細胞死亡。
在主鏈修飾之一些實施例中，可藉由使用不同取代基代替一或多個氧來修飾經修飾殘基之磷酸酯基團。另外，經修飾殘基(例如存在於經修飾核酸中之經修飾殘基)可包含使用如本文所闡述之經修飾磷酸酯基團大規模代替未修飾磷酸酯部分。在一些實施例中，磷酸酯主鏈之主鏈修飾可包含產生具有不對稱電荷分佈之不帶電連接體或帶電連接體之改變。
經修飾磷酸酯基團之實例包含硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(borano phosphate、borano phosphate ester)、膦酸氫酯、磷醯胺酯、膦酸烷基酯或膦酸芳基酯及磷酸三酯。未修飾磷酸酯基團中之磷原子係非對掌性。然而，使用上述原子或原子基團中之一者代替一個非橋接氧可使得磷原子具有對掌性。立體磷原子可擁有「R」構形(本文之Rp)或「S」構形(本文之Sp)。亦可藉由使用氮(橋接磷醯胺酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基膦酸酯)代替橋接氧(亦即連接磷酸酯與核苷之氧)來修飾主鏈。代替可發生於任一連接性氧處或兩個連接性氧處。
在某些主鏈修飾中，磷酸酯基團可由非含磷連結體代替。在一些實施例中，帶電磷酸酯基團可由中性部分代替。可代替磷酸酯基團之部分之實例可包含(例如但不限於)甲基膦酸酯、羥基胺基、矽氧烷、碳酸酯、羧甲基、胺基甲酸酯、醯胺、硫醚、環氧乙烷連接體、磺酸酯、磺醯胺、硫基甲縮醛、甲縮醛、肟、亞甲基亞胺基、亞甲基甲基亞胺基、亞甲基伸肼基、亞甲基二甲基伸肼基及亞甲基氧基甲基亞胺基。
亦可構築可模擬核酸之架構，其中磷酸酯連接體及核糖由核酸酶抗性核苷或核苷酸代用品代替。該等修飾可包括主鏈及糖修飾。在一些實施例中，核鹼基可由代用主鏈結合。實例可包含(但不限於)嗎啉基、環丁基、吡咯啶及肽核酸(PNA)核苷代用品。
經修飾核苷及經修飾核苷酸可包含一或多個針對糖基團之修飾(亦即糖修飾)。舉例而言，2'羥基(OH)可經修飾，例如使用諸多不同「氧基」或「去氧」取代基代替。在一些實施例中，2'羥基修飾可增強核酸穩定性，此乃因羥基可不再發生去質子化以形成2'-烷氧化物離子。
2'羥基修飾之實例可包含烷氧基或芳基氧基(OR，其中「R」可為(例如)烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)；聚乙二醇(PEG)，亦即O(CH2 CH2 O)n CH2 CH2 OR，其中R可為(例如) H或視情況經取代之烷基，且n可為0至20之整數(例如0至4、0至8、0至10、0至16、1至4、1至8、1至10、1至16、1至20、2至4、2至8、2至10、2至16、2至20、4至8、4至10、4至16及4至20)。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-O-Me。在一些實施例中，2'羥基修飾可為2'-氟修飾，其使用氟化物代替2'羥基。在一些實施例中，2'羥基修飾可包含「鎖」核酸(LNA)，其中2'羥基可(例如)藉由C1-6 伸烷基或C1-6 伸雜烷基橋連結至相同核糖之4'碳，其中實例性橋可包含亞甲基、伸丙基、醚或胺基橋；O-胺基(其中胺基可為(例如) NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)及胺基烷氧基、O(CH2 )n -胺基(其中胺基可為(例如) NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基或二雜芳基胺基、乙二胺或聚胺基)。在一些實施例中，2'羥基修飾可包含「解鎖」核酸(UNA)，其中核糖環缺乏C2'-C3'鍵。在一些實施例中，2'羥基修飾可包含甲氧基乙基(MOE)、(OCH2 CH2 OCH3 ，例如PEG衍生物)。
「去氧」 2'修飾可包含氫(亦即去氧核糖，例如位於部分地dsRNA之懸突部分處)；鹵基(例如溴、氯、氟或碘)；胺基(其中胺基可為(例如) NH2 ；烷基胺基、二烷基胺基、雜環基、芳基胺基、二芳基胺基、雜芳基胺基、二雜芳基胺基或胺基酸)；NH(CH2 CH2 NH)n CH2 CH2 -胺基(其中胺基可(例如)如本文所闡述)、-NHC(O)R (其中R可為(例如)烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜芳基或糖)、氰基；巰基；烷基-硫基-烷基；硫基烷氧基；及烷基、環烷基、芳基、烯基及炔基，其可視情況經(例如)如本文所闡述之胺基取代。
糖修飾可包括亦可含有一或多個與核糖中之相應碳擁有相反立體化學構形之碳之糖基團。因此，經修飾核酸可包含含有(例如)阿拉伯糖作為糖之核苷酸。經修飾核酸亦可包含無鹼基糖。亦可進一步在一或多個組分糖原子處修飾該等無鹼基糖。經修飾核酸亦可包含一或多種呈L形式之糖(例如L-核苷)。
本文所闡述可納入經修飾核酸中之經修飾核苷及經修飾核苷酸可包含經修飾鹼基(亦稱為核鹼基)。核鹼基之實例包含(但不限於)腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C)及尿嘧啶(U)。該等核鹼基可經修飾或完全代替以提供可納入經修飾核酸中之經修飾殘基。核苷酸之核鹼基可獨立地選自嘌呤、嘧啶、嘌呤類似物或嘧啶類似物。在一些實施例中，核鹼基可包含(例如)鹼基之天然及合成衍生物。
在採用雙嚮導RNA之實施例中，crRNA及tracr RNA中之每一者可含有修飾。該等修飾可位於crRNA及/或tracr RNA之一端或兩端處。在包括sgRNA之實施例中，可以化學方式修飾sgRNA之一端或兩端處之一或多個殘基，及/或可修飾內部核苷，及/或可以化學方式修飾整個sgRNA。某些實施例包括5'端修飾。某些實施例包括3'端修飾。
在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包括2017年12月8日提出申請且標題為「Chemically Modified Guide RNAs」之WO2018/107028 A1中所揭示之一種修飾模式，該案件之全部內容之內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包括US20170114334中所揭示之一種結構/修飾模式，該案件之全部內容之內容以引用方式併入本文中。在一些實施例中，本文所揭示之嚮導RNA包括WO2017/136794中所揭示之一種結構/修飾模式，該案件之全部內容之內容以引用方式併入本文中。 C.     YA修飾
YA位點處之修飾(亦在本文中稱為「YA修飾」)可為核苷間鍵聯修飾、鹼基(嘧啶或腺嘌呤)修飾(例如藉由化學修飾、取代或以其他方式)及/或糖修飾(例如在2’位，例如2’-O-烷基、2’-F、2’-moe、2’-F阿拉伯糖、2’-H (去氧核糖)及諸如此類)。在一些實施例中，「YA修飾」係(例如)藉由以下方式改變二核苷酸基序之結構以減小RNA內核酸酶活性之任一修飾：藉由RNase干擾YA位點之識別或裂解及/或穩定降低裂解位點對RNase之可及性之RNA結構(例如二級結構)。參見 Peacock等人，J Org Chem . 76: 7295-7300 (2011)；Behlke,Oligonucleotides 18:305-320 (2008)；Ku等人，Adv. Drug Delivery Reviews 104: 16-28 (2016)；Ghidini等人，Chem. Commun., 2013, 49, 9036。Peacock等人、Belhke、Ku及Ghidini提供適於作為YA修飾之實例性修飾。涵蓋熟習此項技術者已知之用以減小核酸內切溶解降解之修飾。影響涉及RNase裂解之2’羥基之實例性2’核糖修飾係2’-H及2’-O-烷基(包含2’-O-Me)。YA位點處之殘基之修飾(例如雙環核糖類似物、UNA及經修飾核苷間鍵聯)可為YA修飾。可穩定RNA結構之實例性鹼基修飾係假尿苷及5-甲基胞嘧啶。在一些實施例中，YA位點之至少一個核苷酸經修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶(亦稱為「嘧啶位置」)包括修飾(其包含改變緊接嘧啶糖之3’之核苷間鍵聯之修飾、嘧啶鹼基修飾及核糖修飾(例如在其2’位))。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤(亦稱為「腺嘌呤位置」)包括修飾(其包含改變緊接嘧啶糖之3’之核苷間鍵聯之修飾、嘧啶鹼基修飾及核糖修飾(例如在其2’位))。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包括修飾。在一些實施例中，YA修飾減小了RNA內核酸酶活性。
在一些實施例中，sgRNA在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或更多個YA位點處包括修飾。在一些實施例中，YA位點之嘧啶包括修飾(其包含改變緊接嘧啶糖之3’之核苷間鍵聯之修飾)。在一些實施例中，YA位點之腺嘌呤包括修飾(其包含改變緊接腺嘌呤糖之3’之核苷間鍵聯之修飾)。在一些實施例中，YA位點之嘧啶及腺嘌呤包括修飾，例如糖、鹼或核苷間鍵聯修飾。YA修飾可為本文所陳述之任一類修飾。在一些實施例中，YA修飾包括硫代磷酸酯、2’-OMe或2’-氟中之一或多者。在一些實施例中，YA修飾包括含有硫代磷酸酯、2’-OMe或2’-氟中之一或多者之嘧啶修飾。在一些實施例中，YA修飾包括含有一或多個YA位點之RNA雙鏈體區域內之雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)。在一些實施例中，YA修飾包括含有YA位點之RNA雙鏈體區域內之雙環核糖類似物(例如LNA、BNA或ENA)，其中YA修飾位於YA位點遠端。
在一些實施例中，sgRNA包括嚮導區YA位點修飾。在一些實施例中，嚮導區包括1、2、3、4、5個或更多個可包括YA修飾之YA位點(「嚮導區YA位點」)。在一些實施例中，一或多個位於5’末端之5’端之5-端、6-端、7-端、8-端、9-端或10-端(其中「5-端」等係指嚮導區之3’端之位置5，亦即嚮導區中之最3’核苷酸)處之YA位點包括YA修飾。在一些實施例中，兩個或更多個位於5’末端之5’端之5-端、6-端、7-端、8-端、9-端或10-端處之YA位點包括YA修飾。在一些實施例中，三個或更多個位於5’末端之5’端之5-端、6-端、7-端、8-端、9-端或10-端處之YA位點包括YA修飾。在一些實施例中，四個或更多個位於5’末端之5’端之5-端、6-端、7-端、8-端、9-端或10-端處之YA位點包括YA修飾。在一些實施例中，五個或更多個位於5’末端之5’端之5-端、6-端、7-端、8-端、9-端或10-端處之YA位點包括YA修飾。修飾嚮導區YA位點包括YA修飾。
在一些實施例中，經修飾嚮導區YA位點位於嚮導區之3’末端核苷酸之17、16、15、14、13、12、11、10或9個核苷酸內。舉例而言，若經修飾嚮導區YA位點位於嚮導區之3’末端核苷酸之10個核苷酸內且嚮導區長20個核苷酸，則經修飾嚮導區YA位點之經修飾核苷酸位於位置11-20中之任一者。在一些實施例中，YA修飾位於嚮導區之3’末端核苷酸之20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸之YA位點內。在一些實施例中，YA修飾位於嚮導區之3’末端核苷酸之20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個核苷酸內。
在一些實施例中，經修飾嚮導區YA位點位於5’末端之5’端之核苷酸4、5、6、7、8、9、10或11或其後。
在一些實施例中，經修飾嚮導區YA位點並無5’端修飾。舉例而言，sgRNA可包括如本文所闡述之5’端修飾且進一步包括經修飾嚮導區YA位點。或者，sgRNA可包括未修飾5’端及經修飾嚮導區YA位點。或者，sgRNA可包括經修飾5’端及未修飾嚮導區YA位點。
在一些實施例中，經修飾嚮導區YA位點包括不包括位於嚮導區YA位點之5’處之至少一個核苷酸之修飾。舉例而言，若核苷酸1-3包括硫代磷酸酯，核苷酸4僅包括2’-OMe修飾，且核苷酸5係YA位點之嘧啶并包括硫代磷酸酯，則經修飾嚮導區YA位點包括不包括位於嚮導區YA位點(核苷酸4)之5’處之至少一個核苷酸之修飾(硫代磷酸酯)。在另一實例中，若核苷酸1-3包括硫代磷酸酯，且核苷酸4係YA位點之嘧啶并包括2’-OMe，則經修飾嚮導區YA位點包括不包括位於嚮導區YA位點(核苷酸1-3中之任一者)之5’處之至少一個核苷酸之修飾(2’-OMe)。若未修飾核苷酸位於經修飾嚮導區YA位點之5’處，則此條件亦總是滿足。
在一些實施例中，經修飾嚮導區YA位點包括如上文針對YA位點所闡述之修飾。
嚮導區YA位點修飾之其他實施例陳述於上文之發明內容中。本發明其他處所陳述之任何實施例可與前述實施例中之任一者以可行程度進行組合。
在一些實施例中，sgRNA包括保守區YA位點修飾。保守區YA位點1-10圖解說明於圖10中。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個保守區YA位點包括修飾。
在一些實施例中，保守區YA位點1、8或1及8包括YA修飾。在一些實施例中，保守區YA位點1、2、3、4及10包括YA修飾。在一些實施例中，YA位點2、3、4、8及10包括YA修飾。在一些實施例中，保守區YA位點1、2、3及10包括YA修飾。在一些實施例中，YA位點2、3、8及10包括YA修飾。在一些實施例中，YA位點1、2、3、4、8及10包括YA修飾。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7或8個其他保守區YA位點包括YA修飾。
在一些實施例中，保守區YA位點2、3、4及10中之1、2、3或4者包括YA修飾。在一些實施例中，1、2、3、4、5、6、7或8個其他保守區YA位點包括YA修飾。
在一些實施例中，經修飾保守區YA位點包括如上文針對YA位點所闡述之修飾。
保守區YA位點修飾之其他實施例陳述於上文之發明內容中。本發明其他處所陳述之任何實施例可與前述實施例中之任一者以可行程度進行組合。
在一些實施例中，sgRNA包括上文表2或下文表3中所展示之任一修飾模式，其中N在存在時係任一天然或非天然核苷酸，且其中全部N構成如本文表1中所闡述之LDHA嚮導序列。表3並不繪示sgRNA之嚮導序列部分。修飾仍如表3中所展示，儘管使用嚮導核苷酸取代N。亦即，儘管嚮導核苷酸代替「N」，但核苷酸如表3中所展示經修飾。在嚮導序列附加至5’端時，嚮導序列之5’端(或5’末端)可經修飾。在一些實施例中，修飾包括2'-O-Me及/或PS-鍵。在一些實施例中，2'-O-Me及/或PS-鍵位於嚮導序列5’端處之前1至7、1至6、1至5、1至4或1至3個核苷酸處。
表3：LDHA sgRNA修飾模式。未展示嚮導序列且在其5’端附加所展示序列。
SEQ ID NO 名稱 序列
400 G000262-僅修飾 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
401 G000263-僅修飾 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
402 G000264-僅修飾 GUUUUAGAGCUAmGmAmAmAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U
403 G000265-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAGAAAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U
404 G000266-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U
405 G000267-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
406 G000331-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
407 G000332-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
408 G000333-僅修飾 mGfUfUfUfUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
409 G000334-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
410 G000335-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
411 G000336-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
412 G000337-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
413 G000338-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
414 G000339-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
415 G000340-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
416 G000341-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
417 G000342-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
418 G000343-僅修飾 GUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
419 G000344-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
420 G000345-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUfAfUfCfAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
421 G000346-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
422 G000347-僅修飾 fGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
423 G000348-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU
424 G000349-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmU*mU*mU
425 G000350-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGfUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU
426 G000351-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGmAfAmAfAmAfGmUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGmUfGmCfU*mU*fU*mU
427 G000352-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
428 G000353-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
429 G000354-僅修飾 mGfUfUfUfUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
430 G000355-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
431 G000356-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
432 G000357-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
433 G000358-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
434 G000359-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
435 G000360-僅修飾 mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
436 G000361-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
437 G000362-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
438 G000363-僅修飾 fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
439 G000364-僅修飾 GUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
440 G000365-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
441 G000366-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUfAfUfCfAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
442 G000367-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
443 G000368-僅修飾 fGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU
444 G000369-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU
445 G000370-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmUmU*mU*mU
446 G000371-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGfUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU
447 G000372-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGmAfAmAfAmAfGmUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGmUfGmCfU*mU*fU*mU
448 實例性-僅嚮導區修飾 mN*mN*mN*mNNN*N*fN*fN*fN*fNNfNfNNNfNfNNN
449 實例性-僅嚮導區修飾 mN*mN*mN*mNNN*N*fN*fN*fN*fNNfNfNNN*fNfNNN
450 實例性-僅修飾 GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGG*mU*mG*mC
在一些實施例中，經修飾sgRNA包括下列序列：mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO: 300)，其中「N」可為任一天然或非天然核苷酸，且其中全部N構成如表1中所闡述之LDHA嚮導序列。舉例而言，本文涵蓋SEQ ID NO: 300，其中N經本文在表1中所揭示之任一嚮導序列(SEQ ID NO: 1-84)代替。
下述任一修飾可存在於本文所闡述之gRNA及mRNA中。
術語「mA」、「mC」、「mU」或「mG」可用於表示已經2’-O-Me修飾之核苷酸。
2’-O -甲基修飾可繪示如下：
Figure 02_image009
已展示影響核苷酸糖環之另一化學修飾係鹵素取代。舉例而言，核苷酸糖環上之2’-氟(2’-F)取代可增加寡核苷酸結合親和性及核酸酶穩定性。
在本申請案中，術語「fA」、「fC」、「fU」或「fG」可用於表示已經2’-F取代之核苷酸。
2’-F取代可繪示如下：
Figure 02_image011
硫代磷酸酯(PS)鍵聯或鍵係指使用硫代替磷酸二酯鍵聯(例如核苷酸鹼基之間之鍵)中之一個非橋接性磷酸酯氧之鍵。在使用硫代磷酸酯來生成寡核苷酸時，經修飾寡核苷酸亦可稱為S-寡聚物。
可使用「*」來繪示PS修飾。在本申請案中，可使用術語A*、C*、U*或G*來表示使用PS鍵連接至下一(例如3’)核苷酸之核苷酸。
在本申請案中，可使用術語「mA*」、「mC*」、「mU*」或「mG*」來表示已經2’-O-Me取代且使用PS鍵連接至下一 (例如3’)核苷酸之核苷酸。
下圖展示使用S-代替非橋接性磷酸酯氧，從而生成PS鍵以代替磷酸二酯鍵：
Figure 02_image013
無鹼基核苷酸係指缺乏含氮鹼基者。下圖繪示具有缺乏鹼基之無鹼基(亦稱為無嘌呤)位點之寡核苷酸：
Figure 02_image015
反向鹼基係指具有與正常5’至3’鍵聯相反之鍵聯(亦即5’至5’鍵聯或3’至3’鍵聯)者。例如：
Figure 02_image017
無鹼基核苷酸可經反向鍵聯附接。舉例而言，無鹼基核苷酸可經由5’至5’鍵聯附接至末端5’核苷酸，或無鹼基核苷酸可經由3’至3’鍵聯附接至末端3’核苷酸。位於任一末端5’或3’核苷酸處之反向無鹼基核苷酸亦可稱為反向無鹼基端帽。
在一些實施例中，5'末端處之前三個、四個或五個核苷酸中之一或多者及3'末端處之後三個、四個或五個核苷酸中之一或多者經修飾。在一些實施例中，修飾係2’-O-Me、2’-F、反向無鹼基核苷酸、PS鍵或業內所熟知可增加穩定性及/或性能之其他核苷酸修飾。
在一些實施例中，5'末端處之前四個核苷酸及3'末端處之後四個核苷酸經硫代磷酸酯(PS)鍵連接。
在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之後三個核苷酸包括經2'-O-甲基(2'-O-Me)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之後三個核苷酸包括經2'-氟(2'-F)修飾之核苷酸。在一些實施例中，5'末端處之前三個核苷酸及3'末端處之後三個核苷酸包括反向無鹼基核苷酸。
在一些實施例中，嚮導RNA包括經修飾sgRNA。在一些實施例中，sgRNA包括SEQ ID No: 201、202或203中所展示之修飾模式，其中N係任一天然或非天然核苷酸，且其中全部N構成將核酸酶引導至LDHA 中之靶序列之嚮導序列(例如如表1中所展示)。
在一些實施例中，嚮導RNA包括SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中所展示之sgRNA。在一些實施例中，嚮導RNA包括含有SEQ ID No: 1-84及100-192中之任一嚮導序列及SEQ ID No: 201、202或203之核苷酸之sgRNA，其中SEQ ID No: 201、202或203之核苷酸位於嚮導序列之3’端上，且其中sgRNA可如表3或SEQ ID NO: 300中所展示進行修飾。
如上所述，在一些實施例中，本文所揭示之組合物或調配物包括含有開放閱讀框(ORF)之mRNA，該開放閱讀框編碼RNA引導之DNA結合劑(例如如本文所闡述之Cas核酸酶)。在一些實施例中，提供、使用或投與包括編碼RNA引導之DNA結合劑(例如Cas核酸酶)之ORF之mRNA。在一些實施例中，編碼RNA引導之DNA核酸酶之ORF係「經修飾之RNA引導之DNA結合劑ORF」或簡稱為「經修飾ORF」，其用於指示ORF經修飾之簡寫。
在一些實施例中，經修飾ORF可至少在一個、複數個或所有尿苷位置包括經修飾尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係在5位(例如)經鹵素、甲基或乙基修飾之尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係在1位(例如)經鹵素、甲基或乙基修飾之假尿苷。經修飾尿苷可為(例如)假尿苷、N1-甲基-假尿苷、5-甲氧基尿苷、5-碘尿苷或其組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-甲氧基尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-碘尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係N1-甲基-假尿苷。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷及N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷及5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係N1-甲基假尿苷及5-甲氧基尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-碘尿苷及N1-甲基-假尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係假尿苷及5-碘尿苷之組合。在一些實施例中，經修飾尿苷係5-碘尿苷及5-甲氧基尿苷之組合。
在一些實施例中，本文所揭示之mRNA包括5’帽，例如帽0、帽1或帽2。5’帽通常係經由5’-三磷酸酯連接至mRNA中5’至3’鏈之第一核苷酸(亦即第一帽-近端核苷酸)之5’位之7-甲基鳥嘌呤核糖核苷酸(其可進一步經修飾，如下文例如針對ARCA所論述)。在帽0中，mRNA之第一及第二帽-近端核苷酸之核糖皆包括2’-羥基。在帽1中，mRNA之第一及第二轉錄核苷酸之核糖分別包括2’-甲氧基及2’-羥基。在帽2中，mRNA之第一及第二帽-近端核苷酸之核糖皆包括2’-甲氧基。例如參見Katibah等人(2014)Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30；Abbas等人(2017)Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115。大部分內源性高級真核mRNA (包含哺乳動物mRNA，例如人類mRNA)包括帽1或帽2。帽0及其他不同於帽1及帽2之帽結構可在哺乳動物(例如人類)中具有免疫原性，此乃因其由先天性免疫系統之組分(例如IFIT-1及IFIT-5)識別為「非自身」，此可升高細胞介素(包含I型干擾素)之含量。先天性免疫系統之組分(例如IFIT-1及IFIT-5)亦可與eIF4E競爭結合具有除帽1或帽2外之帽之mRNA，從而潛在地抑制mRNA轉譯。
可共轉錄性地包含帽。舉例而言，ARCA (抗-反向帽類似物；Thermo Fisher Scientific目錄編號：AM8045)係包括連接至鳥嘌呤核糖核苷酸之5’位之7-甲基鳥嘌呤3’-甲氧基-5’-三磷酸酯之帽類似物，其可在開始時活體外納入轉錄物中。ARCA產生帽0，其中第一帽-近端核苷酸之2’位係羥基。例如參見Stepinski等人(2001) 「Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 「anti-reverse」 cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG,」RNA 7: 1486-1495。ARCA結構展示於下文中。
Figure 02_image019
可使用CleanCapTM AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG；TriLink Biotechnologies目錄編號：N-7113)或CleanCapTM GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG；TriLink Biotechnologies目錄編號：N-7133)來共轉錄性地提供帽1結構。亦可自TriLink Biotechnologies分別以目錄編號：N-7413及N-7433獲得CleanCapTM AG及CleanCapTM GG之3’-O-甲基化形式。CleanCapTM AG結構展示於下文中。
Figure 02_image021
或者，可在轉錄後將帽添加至RNA中。舉例而言，牛痘封端酶市面有售(New England Biolabs目錄編號：M2080S)且具有RNA三磷酸酯及鳥苷醯基轉移酶活性(由其D1亞單元提供)及鳥嘌呤甲基轉移酶(由其D12亞單元提供)。因此，可在S-腺苷甲硫胺酸及GTP存在下將7-甲基鳥嘌呤添加至RNA中以得到帽0。例如參見Guo, P.及Moss, B. (1990)Proc. Natl. Acad. Sci .USA 87, 4023-4027；Mao, X.及Shuman, S. (1994)J. Biol. Chem . 269, 24472-24479。
在一些實施例中，mRNA進一步包括聚腺苷酸化(聚A)尾部。在一些實施例中，聚A尾部包括至少20、30、40、50、60、70、80、90或100個腺嘌呤、視情況最多300個腺嘌呤。在一些實施例中，聚A尾部包括95、96、97、98、99或100個腺嘌呤核苷酸。 D.     核糖核蛋白複合物
在一些實施例中，涵蓋一種組合物，其包括一或多個包括表1之一或多個嚮導序列之gRNA或表2之一或多個sgRNA及RNA引導之DNA結合劑(例如核酸酶，例如Cas核酸酶，例如Cas9)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有裂解酶活性，其亦可稱為雙鏈內核酸酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包括Cas核酸酶。Cas9核酸酶之實例包含釀膿鏈球菌、 金黃色葡萄球菌(S. aureus )及其他原核生物(例如參見下一段落中之清單)之II型CRISPR系統及其經修飾(例如改造或突變)形式。例如參見US2016/0312198 A1；US 2016/0312199 A1。Cas核酸酶之其他實例包含III型CRISPR系統之Csm或Cmr複合物或其Cas10、Csm1或Cmr2亞單元；及I型CRISPR系統之級聯複合物或其Cas3亞單元。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自IIA型、IIB型或IIC型系統。關於各種CRISPR系統及Cas核酸酶之論述，參見(例如) Makarova等人，NAT. REV. MICROBIOL. 9:467-477 (2011)；Makarova等人，NAT. REV. MICROBIOL, 13: 722-36 (2015)；Shmakov等人，MOLECULAR CELL, 60:385-397 (2015)。
可衍生Cas核酸酶之非限制性實例性物種包含釀膿鏈球菌、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)、金黃色葡萄球菌、英諾克李斯特氏菌(Listeria innocua)、加氏乳桿菌(Lactobacillus gasseri)、新兇手弗朗西絲菌(Francisella novicida)、產琥珀酸沃林氏菌(Wolinella succinogene)、華德薩特菌(Sutterella wadsworthensis)、γ-變形菌(Gammaproteobacterium)、腦膜炎雙球菌(Neisseria meningitidis)、空腸曲桿菌(Campylobacter jejuni)、多殺巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、產琥珀酸絲狀桿菌(Fibrobacter succinogene)、深紅紅螺菌(Rhodospirillum rubrum)、達松維爾擬諾卡氏菌(Nocardiopsis dassonvillei)、始旋鏈黴菌(Streptomyces pristinaespiralis)、綠色產色鏈黴菌(Streptomyces viridochromogene)、綠色產色鏈黴菌、玫瑰鏈孢囊菌(Streptosporangium roseum)、玫瑰鏈孢囊菌、酸熱脂環酸芽胞桿菌(Alicyclobacillus acidocaldarius)、假真菌樣芽孢桿菌(Bacillus pseudomycoides)、還原硒酸鹽芽孢桿菌(Bacillus selenitireducens)、西伯利亞微小桿菌(Exiguobacterium sibiricum)、戴白氏乳桿菌(Lactobacillus delbrueckii)、唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)、布氏乳桿菌(Lactobacillus buchneri)、齒垢密螺旋體(Treponema denticola)、海洋微顫菌(Microscilla marina)、伯克霍爾德氏菌(Burkholderiales bacterium)、食萘極單胞菌(Polaromonas naphthalenivorans)、極胞菌屬(Polaromonas sp.)、海洋固氮藍藻(Crocosphaera watsonii)、藍桿藻屬(Cyanothece sp.)、銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、聚球藻屬(Synechococcus sp.)、阿拉伯糖醋鹽桿菌(Acetohalobium arabaticum)、丹氏製胺菌(Ammonifex degensii)、熱角軍纖維素菌(Caldicelulosiruptor becscii)、礦菌(Candidatus desulforudis)、肉毒梭狀芽孢桿菌(Clostridium botulinum)、難養芽胞梭菌(Clostridium difficile)、大芬戈爾德菌(Finegoldia magna)、嗜熱鹽鹼厭氧菌(Natranaerobius thermophilus)、嗜熱丙酸降解發酵菌(Pelotomaculum thermopropionicum)、嗜酸性喜溫硫桿菌(Acidithiobacillus caldus)、嗜酸性氧化亞鐵硫桿菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、酒色別樣著色菌(Allochromatium vinosum)、海桿菌屬(Marinobacter sp.)、嗜鹽亞消化球菌(Nitrosococcus halophilus)、亞硝化球菌(Nitrosococcus watsoni)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonas haloplanktis)、消旋纖線桿菌(Ktedonobacter racemifer)、甲烷鹽菌(Methanohalobium evestigatum)、魚腥藻(Anabaena variabilis)、泡沫節球藻(Nodularia spumigena)、念珠藻屬(Nostoc sp.)、極大螺旋藻(Arthrospira maxima)、鈍頂螺旋藻(Arthrospira platensis)、螺旋藻屬(Arthrospira sp.)、林氏藻屬(Lyngbya sp.)、原型微鞘藻(Microcoleus chthonoplastes)、顫藻屬(Oscillatoria sp.)、石袍藻(Petrotoga mobilis)、非洲棲熱腔菌(Thermosipho africanus)、巴氏鏈球菌(Streptococcus pasteurianus)、灰色奈瑟球菌(Neisseria cinerea)、紅嘴鷗彎曲桿菌(Campylobacter lari)、食清潔劑細小棒菌(Parvibaculum lavamentivorans)、白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)、胺基酸球菌屬(Acidaminococcus sp.)、毛螺科菌(Lachnospiraceae bacterium) ND2006及藻青菌(Acaryochloris marina)。
在一些實施例中，Cas核酸酶係來自釀膿鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自嗜熱鏈球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自腦膜炎雙球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自金黃色葡萄球菌之Cas9核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自新兇手弗朗西絲菌之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌屬之Cpf1核酸酶。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自毛螺科菌ND2006之Cpf1核酸酶。 在其他實施例中，Cas核酸酶係來自以下物種之Cpf1核酸酶：土倫病弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis )、毛螺科菌、解蛋白丁酸弧菌(Butyrivibrio proteoclasticus )、佩萊格裡尼菌科細菌(Peregrinibacteria bacterium )、帕庫菌科細菌(Parcubacteria bacterium )、史密斯氏菌(Smithella )、胺基酸球菌、候選白蟻甲烷枝原體(Candidatus Methanoplasma termitum )、挑剔真桿菌(Eubacterium eligens )、牛眼莫拉氏菌(Moraxella bovoculi )、稻田鉤端螺旋體(Leptospira inadai )、狗口腔卟啉單胞菌(Porphyromonas crevioricanis )、解糖腖普雷沃菌(Prevotella disiens )或獼猴卟啉單胞菌(Porphyromonas macacae )。在某些實施例中，Cas核酸酶係來自胺基酸球菌或毛螺菌科(Lachnospiraceae )之Cpf1核酸酶。
在一些實施例中，gRNA以及RNA引導之DNA結合劑稱為核糖核蛋白複合物(RNP)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑係Cas核酸酶。在一些實施例中，gRNA以及Cas核酸酶稱為Cas RNP。在一些實施例中，RNP包括I型、II型或III型組分。在一些實施例中，Cas核酸酶係來自II型CRISPR/Cas系統之Cas9蛋白。在一些實施例中，gRNA以及Cas9稱為Cas9 RNP。
野生型Cas9具有兩個核酸酶結構域：RuvC及HNH。RuvC結構域裂解非靶DNA鏈，且HNH結構域裂解DNA之靶鏈。在一些實施例中，Cas9蛋白包括一個以上RuvC結構域及/或一個以上HNH結構域。在一些實施例中，Cas9蛋白係野生型Cas9。在組合物、用途及方法實施例中之每一者中，Cas誘導靶DNA中之雙鏈斷裂。
在一些實施例中，使用嵌合Cas核酸酶，其中蛋白質之一個結構域或區域由不同蛋白質之一部分代替。在一些實施例中，Cas核酸酶結構域可經來自不同核酸酶(例如Fok1)之結構域代替。在一些實施例中，Cas核酸酶可為經修飾核酸酶。
在其他實施例中，Cas核酸酶可來自I型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可為I型 CRISPR/Cas系統之級聯複合物之組分。在一些實施例中，Cas核酸酶可為Cas3蛋白。在一些實施例中，Cas核酸酶可來自III型CRISPR/Cas系統。在一些實施例中，Cas核酸酶可具有RNA裂解活性。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑具有單鏈切割酶活性，亦即可切割一條DNA鏈以產生單鏈斷裂，亦稱為「切割」。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包括Cas切割酶。切割酶係在dsDNA中產生切割(亦即切割一條鏈，但並不切割DNA雙螺旋之另一條鏈)之酶。在一些實施例中，Cas切割酶係Cas核酸酶(例如上述Cas核酸酶)之一種形式，其中核酸內切溶解活性位點(例如)由催化結構域中之一或多個改變(例如點突變)不活化。例如參見美國專利第8,889,356號，其論述Cas切割酶及實例性催化結構域改變。在一些實施例中，Cas切割酶(例如Cas9切割酶)具有不活化RuvC或HNH結構域。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑經修飾以僅含有一個功能核酸酶結構域。舉例而言，可修飾藥劑蛋白，從而一個核酸酶結構域發生突變或完全或部分地缺失以減小其核酸裂解活性。在一些實施例中，使用具有較小活性RuvC結構域之切割酶。在一些實施例中，使用具有惰性RuvC結構域之切割酶。在一些實施例中，使用具有較小活性HNH結構域之切割酶。在一些實施例中，使用具有惰性HNH結構域之切割酶。
在一些實施例中，取代Cas蛋白核酸酶結構域內之保守胺基酸以減小或改變核酸酶活性。在一些實施例中，Cas核酸酶可在RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中包括胺基酸取代。RuvC或RuvC樣核酸酶結構域中之實例性胺基酸取代包含D10A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如參見Zetsche等人(2015)Cell Oct 22:163(3): 759-771。在一些實施例中，Cas核酸酶可在HNH或HNH樣核酸酶結構域中包括胺基酸取代。HNH或HNH樣核酸酶結構域中之實例性胺基酸取代包含E762A、H840A、N863A、H983A及D986A (基於釀膿鏈球菌Cas9蛋白)。例如參見Zetsche等人(2015)。其他實例性胺基酸取代包含D917A、E1006A及D1255A (基於新兇手弗朗西絲菌U112 Cpf1 (FnCpf1)序列 (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN))。
在一些實施例中，提供與一對嚮導RNA組合之編碼切割酶之mRNA，該等嚮導RNA分別與靶序列之有義鏈及反義鏈互補。在此實施例中，嚮導RNA將切割酶引導至靶序列且藉由在靶序列之相反鏈上生成切割(亦即雙重切割)來引入DSB。在一些實施例中，使用雙重切割可改良特異性且減小脫靶效應。在一些實施例中，使用切割酶以及兩個靶向DNA之相反鏈之單獨嚮導RNA來在靶DNA中產生雙重切割。在一些實施例中，使用切割酶以及兩個經選擇以緊鄰之單獨嚮導RNA來在靶DNA中產生雙重切割。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑缺乏裂解酶及切割酶活性。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包括dCas DNA結合性多肽。dCas多肽具有DNA結合活性，而基本上缺乏催化(裂解酶/切割酶)活性。在一些實施例中，dCas多肽係dCas9多肽。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑缺乏裂解酶及切割酶活性或dCas DNA結合性多肽係Cas核酸酶(例如上述Cas核酸酶)之一種形式，其中其核酸內切溶解活性位點(例如)由其催化結構域中之一或多個改變(例如點突變)不活化。例如參見US 2014/0186958 A1；US 2015/0166980 A1。
在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑包括一或多個異源性功能結構域(例如係或包括融合多肽)。
在一些實施例中，異源性功能結構域可促進RNA引導之DNA結合劑向細胞核之傳輸。舉例而言，異源性功能結構域可為核定位信號(NLS)。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-10個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與1-5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個NLS融合。在使用一個NLS之情形下，NLS可連接於RNA引導之DNA結合劑序列之N-末端或C-末端處。其亦可插入RNA引導之DNA結合劑序列內。在其他實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與一個以上NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與2、3、4或5個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合。在某些情況下，兩個NLS可相同(例如兩個SV40 NLS)或不同。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑融合至兩個連接於羧基末端處之SV40 NLS序列。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與兩個NLS融合，一個連接於N-末端處且一個連接於C-末端處。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可與3個NLS融合。在一些實施例中，RNA引導之DNA結合劑可不與NLS融合。在一些實施例中，NLS可為單組分序列，例如SV40 NLS、PKKKRKV (SEQ ID NO: 600)或PKKKRRV (SEQ ID NO: 601)。在一些實施例中，NLS可為二組分序列，例如核質蛋白、KRPAATKKAGQAKKKK (SEQ ID NO: 602)之NLS。在一具體實施例中，單一PKKKRKV (SEQ ID NO: 600) NLS可連接於RNA引導之DNA結合劑之C-末端處。一或多個連接體視情況包含於融合位點處。
在一些實施例中，異源性功能結構域可能能夠改良RNA引導之DNA結合劑之細胞內半衰期。在一些實施例中，可增加RNA引導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，可減小RNA引導之DNA結合劑之半衰期。在一些實施例中，異源性功能結構域可能能夠增加RNA引導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源性功能結構域可能能夠減小RNA引導之DNA結合劑之穩定性。在一些實施例中，異源性功能結構域可用作蛋白質降解之信號肽。在一些實施例中，蛋白質降解可由蛋白水解酶(例如蛋白酶體、溶酶體蛋白酶或鈣蛋白酶蛋白酶)調介。在一些實施例中，異源性功能結構域可包括PEST序列。在一些實施例中，可藉由添加泛素或聚泛素鏈來修飾RNA引導之DNA結合劑。在一些實施例中，泛素可為泛素樣蛋白(UBL)。泛素樣蛋白之非限制性實例包含小泛素樣修飾因子(SUMO)、泛素交叉反應性蛋白(UCRP，亦稱為干擾素刺激基因-15 (ISG15))、泛素相關修飾因子-1 (URM1)、神經元前體細胞表現之發育下調蛋白-8 (NEDD8，亦稱為釀酒酵母(S. cerevisiae )中之Rub1)、人類白血球抗原F相關因子(FAT10)、自體吞噬-8 (ATG8)及-12 (ATG12)、Fau泛素樣蛋白(FUB1)、膜錨定UBL (MUB)、泛素摺疊修飾因子-1 (UFM1)及泛素樣蛋白-5 (UBL5)。
在一些實施例中，異源性功能結構域可為標記物結構域。標記物結構域之非限制性實例包含螢光蛋白、純化標籤、表位標籤及報告基因序列。在一些實施例中，標記物結構域可為螢光蛋白。適宜螢光蛋白之非限制性實例包含綠色螢光蛋白(例如GFP、GFP-2、tagGFP、turboGFP、sfGFP、EGFP、Emerald、Azami Green、Monomeric Azami Green、CopGFP、AceGFP、ZsGreen1)、黃色螢光蛋白(例如YFP、EYFP、Citrine、Venus、YPet、PhiYFP、ZsYellow1)、藍色螢光蛋白(例如EBFP、EBFP2、Azurite、mKalamal、GFPuv、Sapphire、T-sapphire)、青色螢光蛋白(例如ECFP、Cerulean、CyPet、AmCyan1、Midoriishi-Cyan)、紅色螢光蛋白(例如mKate、mKate2、mPlum、DsRed-Monomer、mCherry、mRFP1、DsRed-Express、DsRed2、DsRed-Monomer、HcRed-Tandem、HcRed1、AsRed2、eqFP611、mRasberry、mStrawberry、Jred)及橙色螢光蛋白(mOrange、mKO、Kusabira-Orange、Monomeric Kusabira-Orange、mTangerine、tdTomato)或任一其他適宜螢光蛋白。在其他實施例中，標記物結構域可為純化標籤及/或表位標籤。非限制性實例性標籤包含麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、殼多糖結合蛋白(CBP)、麥芽糖結合蛋白(MBP)、硫氧還蛋白(TRX)、聚(NANP)、串聯親和純化(TAP)標籤、myc、AcV5、AU1、AU5、E、ECS、E2、FLAG、HA、nus、Softag 1、Softag 3、Strep、SBP、Glu-Glu、HSV、KT3、S、S1、T7、V5、VSV-G、6xHis、8xHis、生物素羧基載體蛋白(BCCP)、聚His及鈣調蛋白。非限制性實例性報告基因包含麩胱甘肽-S-轉移酶(GST)、辣根過氧化物酶(HRP)、氯黴素(chloramphenicol)乙醯基轉移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、螢光素酶或螢光蛋白。
在其他實施例中，異源性功能結構域可使RNA引導之DNA結合劑靶向特定細胞器、細胞類型、組織或器官。在一些實施例中，異源性功能結構域可使RNA引導之DNA結合劑靶向線粒體。
在其他實施例中，異源性功能結構域可為效應結構域。在將RNA引導之DNA結合劑引導至其靶序列時(例如在藉由gRNA將Cas核酸酶引導至靶序列時)，效應結構域可修飾或影響靶序列。在一些實施例中，效應結構域可選自核酸結合結構域、核酸酶結構域(例如非Cas核酸酶結構域)、表觀遺傳修飾結構域、轉錄活化結構域或轉錄阻抑結構域。在一些實施例中，異源性功能結構域係核酸酶(例如FokI核酸酶)。例如參見美國專利第9,023,649號。在一些實施例中，異源性功能結構域係轉錄活化因子或阻抑因子。例如參見Qi等人，「Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression,」Cell 152:1173-83 (2013)；Perez-Pinera等人，「RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors,」Nat. Methods 10:973-6 (2013)；Mali等人，「CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering,」Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013)；Gilbert等人，「CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes,」Cell 154:442-51 (2013)。因此，RNA引導之DNA結合劑基本上變為可使用嚮導RNA引導結合期望靶序列之轉錄因子。 E.     gRNA效能之測定
在一些實施例中，在與形成RNP之其他組分一起遞送或表現時，測定gRNA效能。在一些實施例中，表現gRNA以及RNA引導之DNA結合劑(例如Cas蛋白，例如Cas9)。在一些實施例中，將gRNA遞送至或表現於已穩定表現RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶或切割酶，例如Cas9核酸酶或切割酶)之細胞系中。在一些實施例中，將gRNA作為RNP之一部分遞送至細胞中。在一些實施例中，將gRNA以及編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶或切割酶，例如Cas9核酸酶或切割酶)之mRNA遞送至細胞中。
如本文所闡述，使用本文所揭示之RNA引導之DNA核酸酶及嚮導RNA可在DNA中產生雙鏈斷裂，該等雙鏈斷裂可在藉由細胞機構修復時產生呈插入/缺失(插入缺失)突變形式之錯誤。許多由插入缺失所致之突變改變了讀取框或引入過早終止密碼子且由此產生非功能蛋白。
在一些實施例中，基於活體外模型來測定特定gRNA之效能。在一些實施例中，活體外模型係穩定表現Cas9之HEK293細胞(HEK293_Cas9)。在一些實施例中，活體外模型係HUH7人類肝癌細胞。在一些實施例中，活體外模型係HepG2細胞。在一些實施例中，活體外模型係原代人類肝細胞。在一些實施例中，活體外模型係原代食蟹猴肝細胞。就使用原代人類肝細胞而言，可使用市售原代人類肝細胞以在實驗之間提供較大一致性。在一些實施例中，藉由(例如)分析在活體外使用Cas9 mRNA及嚮導RNA轉染之原代人類肝細胞之基因體DNA來測定活體外模型(例如原代人類肝細胞)中發生缺失或插入之脫靶位點的數量。在一些實施例中，此一測定包括分析在活體外使用Cas9 mRNA、嚮導RNA及供體寡核苷酸轉染之原代人類肝細胞之基因體DNA。用於該等測定之實例性程序提供於下文之工作實例中。
在一些實施例中，在gRNA選擇製程之多個活體外細胞模型中測定特定gRNA之效能。在一些實施例中，使用所選gRNA實施細胞係數據對比。在一些實施例中，在多個細胞模型中實施交叉篩選。
在一些實施例中，基於活體內模型來測定特定gRNA之效能。在一些實施例中，活體內模型係齧齒類動物模型。在一些實施例中，齧齒類動物模型係表現LDHA 基因之小鼠。在一些實施例中，齧齒類動物模型係表現人類LDHA 基因之小鼠。在一些實施例中，活體內模型係非人類靈長類動物(例如食蟹猴)。
在一些實施例中，藉由LDHA 之編輯百分比來量測嚮導RNA之效能。在一些實施例中，將LDHA 之編輯百分比與達成(例如)來自全細胞溶解物(在活體外模型之情形下)或組織(在活體內模型之情形下)之LDHA蛋白之敲低的所需編輯百分比進行比較。
在一些實施例中，藉由靶細胞類型之基因體內脫靶序列處之插入缺失之數量及/或頻率來量測嚮導RNA的效能。在一些實施例中，提供有效嚮導RNA，其在細胞群體中於脫靶位點處及/或相對於靶位點處之插入缺失產生頻率以極低頻率(例如＜5%)產生插入缺失。因此，本發明提供如下嚮導RNA：其在靶細胞類型(例如肝細胞)中不展現脫靶插入缺失形成，或其在細胞群體中及/或相對於靶位點處之插入缺失產生頻率產生＜5%之脫靶插入缺失形成頻率。在一些實施例中，本發明提供在靶細胞類型(例如肝細胞)中不展現任何脫靶插入缺失形成之嚮導RNA。在一些實施例中，提供在小於5個脫靶位點處產生插入缺失之嚮導RNA，例如如藉由本文所闡述之一或多種方法所評估。在一些實施例中，提供在小於或等於4、3、2或1個脫靶位點處產生插入缺失之嚮導RNA，例如如藉由本文所闡述之一或多種方法所評估。在一些實施例中，脫靶位點不出現於靶細胞(例如肝細胞)基因體中之蛋白質編碼區中。
在一些實施例中，檢測靶DNA中之基因編輯事件(例如形成插入/缺失(「插入缺失」)突變及同源定向修復(HDR)事件)利用使用加標籤引子之線性擴增且分離加標籤擴增產物(在下文中稱為「LAM-PCR」或「線性擴增(LA)」方法)。
在一些實施例中，藉由量測試樣(例如體液，例如血清、血漿、血液或尿)中之羥基乙酸鹽含量及/或草酸鹽含量來量測嚮導RNA之效能。在一些實施例中，藉由量測血清或血漿中之羥基乙酸鹽含量及/或尿中之草酸鹽含量來量測嚮導RNA之效能。血清或血漿中之羥基乙酸鹽含量增加及/或尿中之草酸鹽含量降低指示有效嚮導RNA。在一些實施例中，尿草酸鹽降至低於0.7 mmol/24 hr/1.73m2 。在一些實施例中，使用酶聯免疫吸附分析(ELISA)分析利用細胞培養基或血清或血漿來量測羥基乙酸鹽及草酸鹽之含量。在一些實施例中，在用於量測編輯之相同活體外或活體內系統或模型中量測羥基乙酸鹽及草酸鹽之含量。在一些實施例中，在細胞(例如原代人類肝細胞)中量測羥基乙酸鹽及草酸鹽之含量。在一些實施例中，在HUH7細胞中量測羥基乙酸鹽及草酸鹽之含量。在一些實施例中，在HepG2細胞中量測羥基乙酸鹽及草酸鹽之含量。 III.   治療方法
本文所揭示之gRNA以及相關方法及組合物可用於誘導LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)且減小LDHA 基因表現。本文所揭示之gRNA以及相關方法及組合物可用於治療及預防高草酸鹽尿症且預防高草酸鹽尿症症狀。在一些實施例中，本文所揭示之gRNA可用於治療及預防草酸鈣產生、器官中之草酸鈣沈積、原發性高草酸鹽尿症(包含PH1、PH2及PH3)、草酸鹽沈積症(包含全身性草酸鹽沈積症)及血尿症。在一些實施例中，本文所揭示之gRNA可用於延遲或改善腎或肝移植需要。在一些實施例中，本文所揭示之gRNA可用於預防晚期腎病(ESRD)。投與本文所揭示之gRNA將增加血清或血漿羥基乙酸鹽且降低草酸鹽產生或累積，從而在尿中排泄較少草酸鹽。因此，在一態樣中，可藉由量測血清或血漿羥基乙酸鹽來評價治療/預防之有效性，其中羥基乙酸鹽含量增加指示有效性。在一些實施例中，可藉由量測試樣中之草酸鹽(例如尿草酸鹽)來評價治療/預防之有效性，其中尿草酸鹽降低指示有效性。
健康個體之尿中之正常日草酸鹽排泄小於約45 mg，而超過約45 mg/24小時之濃度可視為臨床高草酸鹽尿症(例如參見Bhasin等人，World J Nephrol，2015年5月6日；4(2): 235-244；及Cochat P., Rumsby G. (2013). N Engl J Med 369:649-658)。因此，在一些實施例中，投與本文所揭示之gRNA及組合物可用於減小草酸鹽含量，從而個體不再展現與臨床高草酸鹽尿症有關之尿草酸鹽含量。在一些實施例中，投與本文所揭示之gRNA及組合物將個體在24-小時時段內之尿草酸鹽減少至小於約45 mg或40 mg。在一些實施例中，投與本文所揭示之gRNA及組合物可將個體在24-小時時段內之尿草酸鹽減少至小於約35 mg、小於約30 mg、小於約25 mg、小於約20 mg、小於約15 mg或小於約10 mg。
在一些實施例中，本文所闡述之gRNA、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者係用以製備用於治療或預防個體之疾病或病症之藥劑。在一些實施例中，使用單一劑量(例如一次性治療)之藥劑/組合物來達成治療及/或預防。在一些實施例中，疾病或病症係高草酸鹽尿症。
在一些實施例中，本發明包括治療或預防個體之疾病或病症之方法，其包括投與本文所闡述之gRNA、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。在一些實施例中，疾病或病症係高草酸鹽尿症。在一些實施例中，以單一劑量形式(例如一次性)投與本文所闡述之gRNA、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，單一劑量達成持久治療及/或預防。在一些實施例中，該方法達成持久治療及/或預防。本文所用之持久治療及/或預防包含至少延長以下時間之治療及/或預防：i) 3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週；ii) 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18、24、30或36個月；或iii) 1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年。在一些實施例中，單一劑量之本文所闡述之gRNA、組合物或醫藥調配物足以治療及/或預防本文所闡述之任一適應症且在個體中持續一生。
在一些實施例中，本發明包括用於修飾(例如產生雙鏈斷裂)靶DNA之方法或用途，其包括投與或遞送本文所闡述之gRNA、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。在一些實施例中，靶DNA係LDHA 基因。在一些實施例中，靶DNA位於LDHA 基因之外顯子中。在一些實施例中，靶DNA位於LDHA 基因之外顯子1、2、3、4、5、6、7或8中。
在一些實施例中，本發明包括用於調節靶基因之方法或用途，其包括投與或遞送本文所闡述之gRNA、組合物或醫藥調配物中之任一者或多者。在一些實施例中，調節係編輯LDHA 靶基因。在一些實施例中，調節係改編由LDHA 靶基因編碼之蛋白質之表現。
在一些實施例中，該方法或用途產生基因編輯。在一些實施例中，該方法或用途在靶LDHA 基因內產生雙鏈斷裂。在一些實施例中，該方法或用途使得在DSB之非同源端接合期間形成插入缺失突變。在一些實施例中，該方法或用途所得在靶LDHA 基因中插入或缺失核苷酸。在一些實施例中，在靶LDHA 基因中插入或缺失核苷酸可產生框移突變或過早終止密碼子，從而得到非功能蛋白。在一些實施例中，在靶LDHA 基因中插入或缺失核苷酸可敲低或消除靶基因表現。在一些實施例中，該方法或用途包括DSB之同源性引導修復。
在一些實施例中，該方法或用途產生LDHA 基因調節。在一些實施例中，LDHA 基因調節係降低基因表現。在一些實施例中，該方法或用途可降低由靶基因編碼之蛋白質之表現。
在一些實施例中，提供誘導LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)之方法，其包括投與包括以下各項之組合物：包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA；或以下SEQ ID NO中之任一或多個sgRNA：1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)。在一些實施例中，投與包括SEQ ID NO:1-84及100-192中之任一或多個嚮導序列之gRNA以誘導LDHA 基因中之DSB。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，提供修飾LDHA 基因之方法，其包括投與包括以下之組合物：包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA；或以下SEQ ID NO中之任一或多個sgRNA：1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)。在一些實施例中，投與包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之gRNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081所展示)中之任一或多個sgRNA以修飾LDHA 基因。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，提供治療或預防高草酸鹽尿症之方法，其包括投與包括以下之組合物：包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA；或以下SEQ ID NO中之任一或多個sgRNA：1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)。在一些實施例中，投與包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之gRNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA以治療或預防高草酸鹽尿症。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。在一些實施例中，高草酸鹽尿症係原發性高草酸鹽尿症。在一些實施例中，原發性高草酸鹽尿症係1型(PH1)、2型(PH2)或3型(PH3)。在一些實施例中，高草酸鹽尿症係特發性的。
在一些實施例中，提供降低或消除草酸鈣產生及/或沈積之方法，其包括投與包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，提供治療或預防原發性高草酸鹽尿症(包含PH1、PH2或PH3)之方法，其包括投與包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，提供治療或預防草酸鹽沈積症(包含全身性草酸鹽沈積症)之方法，其包括投與包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，提供治療或預防血尿症之方法，其包括投與包括SEQ ID NO:1-84中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA。可投與嚮導RNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，投與包括SEQ ID NO:1-84及100-192中之任一或多個嚮導序列之gRNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA以減小尿中之草酸鹽含量。可投與gRNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，投與包括SEQ ID NO:1-84及100-192中之任一或多個嚮導序列之gRNA或SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081或其經修飾形式(如、例如在SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中所展示)中之任一或多個sgRNA以增加血清或血漿中之血清羥基乙酸鹽。可投與gRNA以及RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)或編碼RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶，例如Cas9)之mRNA或載體。
在一些實施例中，包括表1之嚮導序列之gRNA與RNA引導之DNA核酸酶(例如Cas核酸酶)一起可誘導DSB，且修復期間之非同源端接合(NHEJ)會在LDHA 基因中產生突變。在一些實施例中，NHEJ使得缺失或插入核苷酸，此會誘導LDHA 基因中之框移或無義突變。
在一些實施例中，投與本發明之嚮導RNA (例如於本文所提供之組合物中)可增加個體中之羥基乙酸鹽含量(例如血清或血漿含量)，且由此預防草酸鹽累積。
在一些實施例中，增加血清羥基乙酸鹽可降低尿草酸鹽。在一些實施例中，減少尿草酸鹽可減小或消除器官中之草酸鈣形成及沈積。
在一些實施例中，個體係哺乳動物。在一些實施例中，個體係人類。在一些實施例中，個體係牛、豬、猴、綿羊、狗、貓、魚或家禽。
在一些實施例中，提供包括表1中之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA或表2之一或多個sgRNA (例如於本文所提供之組合物中)之用途，其用以製備用於治療患有高草酸鹽尿症之人類個體之藥劑。
在一些實施例中，經靜脈內投與嚮導RNA、組合物及調配物。在一些實施例中，將嚮導RNA、組合物及調配物投與肝循環中。
在一些實施例中，單一投與包括本文所提供之嚮導RNA之組合物足以敲低突變蛋白之表現。在其他實施例中，投與包括本文所提供之嚮導RNA之組合物一次以上可有益於最大化治療效應。
在一些實施例中，治療可減緩或終止高草酸鹽尿症疾病進展。
在一些實施例中，治療可減緩或終止晚期腎病(ESRD)之進展。在一些實施例中，治療可減緩或終止腎及/或肝移植需要。在一些實施例中，治療可改良、穩定高草酸鹽尿症症狀或減緩其變化。 A.     組合療法
在一些實施例中，本發明包括組合療法，該等組合療法包括任一包括表1中所揭示之任一或多個嚮導序列之gRNA (例如於本文所提供之組合物中)以及適於緩解高草酸鹽尿症及其症狀(如上文所闡述)之其他療法。
在一些實施例中，用於高草酸鹽尿症之其他療法係維他命B6、水化、腎透析或肝或腎移植。在一些實施例中，其他療法係另一破壞LDHA 基因之藥劑，例如引導至LDHA 基因之siRNA。在一些實施例中，引導至LDHA 基因之siRNA係DCR-PHXC。在一些實施例中，例如在高草酸鹽尿症係由PH1引起時，其他療法係破壞HAO1 基因之藥劑(例如引導至HAO1 基因之siRNA)。在一些實施例中，HAO1 siRNA係盧馬西蘭(lumasiran) (ALN-GO1；Alnylam)。
在一些實施例中，組合療法包括任一包括表1中所揭示之任一或多個嚮導序列之gRNA以及靶向HAO1 或LDHA 之siRNA。在一些實施例中，siRNA係任一能夠進一步減小或消除LDHA 表現之siRNA。在一些實施例中，在任一包括表1中所揭示之任一或多個嚮導序列之gRNA (例如於本文所提供之組合物中)之後投與siRNA。在一些實施例中，在使用本文所提供之任一gRNA組合物治療後定期投與siRNA。
在一些實施例中，組合療法包括任一包括表1中所揭示之任一或多個嚮導序列之gRNA (例如於本文所提供之組合物中)以及靶向LDHA之反義核苷酸。在一些實施例中，反義核苷酸係任一能夠進一步減小或消除LDHA表現之反義核苷酸。在一些實施例中，在任一包括表1中所揭示之任一或多個嚮導序列之gRNA (例如於本文所提供之組合物中)之後投與反義寡核苷酸。在一些實施例中，在使用本文所提供之任一gRNA組合物治療後定期投與反義寡核苷酸。 B.     gRNA組合物之遞送
脂質奈米顆粒(LNP)係用於遞送核苷酸及蛋白質負荷之熟知方式，且可用於遞送本文所揭示之嚮導RNA、組合物或醫藥調配物。在一些實施例中，LNP遞送核酸、蛋白質或核酸以及蛋白質。
在一些實施例中，本發明包括將本文所揭示之任一gRNA遞送至個體之方法，其中gRNA與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA締合。
在一些實施例中，本發明包括包含所揭示任一gRNA及LNP之組合物。在一些實施例中，該組合物進一步包括Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，LNP包括陽離子脂質。在一些實施例中，LNP包括(9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate，亦稱為3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)或另一可離子化脂質。例如參見WO/2017/173054之脂質及其中所闡述之參考內容。在一些實施例中，LNP所包括之陽離子脂質胺對RNA磷酸酯之莫耳比率(N:P)為約4.5、5.0、5.5、6.0或6.5。在一些實施例中，LNP脂質背景中之術語陽離子及可離子化可互換使用，舉例而言，其中可離子化脂質端視pH係陽離子。
在一些實施例中，與本文所揭示gRNA締合之LNP係用以製備用於治療疾病或病症之藥劑。
電穿孔係用於遞送負荷之熟知方式，且可使用任一電穿孔方法來遞送本文所揭示之任一gRNA。在一些實施例中，可使用電穿孔來遞送本文所揭示之任一gRNA及Cas9或編碼Cas9之mRNA。
在一些實施例中，本發明包括將本文所揭示之任一gRNA遞送至離體細胞之方法，其中gRNA與LNP締合或不與LNP締合。在一些實施例中，gRNA/LNP或gRNA亦與Cas9或編碼Cas9之mRNA締合。
在一些實施例中，將本文所闡述之嚮導RNA組合物(單獨或編碼於一或多種載體上)調配於脂質奈米顆粒中或經由脂質奈米顆粒來投與；例如參見2017年3月30日提出申請且2017年5月10日公開之標題為「LIPID NANOPARTICLE FORMULATIONS FOR CRISPR/CAS COMPONENTS」之WO/2017/173054，其全部內容之內容以引用方式併入本文中。
在某些實施例中，本發明包括編碼任一包括本文所闡述之任一或多個嚮導序列之嚮導RNA之DNA或RNA載體。在一些實施例中，除嚮導RNA序列外，載體亦進一步包括不編碼嚮導RNA之核酸。不編碼嚮導RNA之核酸包含(但不限於)啟動子、增強子、調控序列及編碼RNA引導之DNA核酸酶(其可為諸如Cas9等核酸酶)之核酸。在一些實施例中，載體包括一或多個編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包括一或多個編碼sgRNA及編碼RNA引導之DNA核酸酶(其可為Cas核酸酶，例如Cas9或Cpf1)之mRNA之核苷酸序列。在一些實施例中，載體包括一或多個編碼crRNA、trRNA及編碼RNA引導之DNA核酸酶(其可為Cas蛋白，例如Cas9)之mRNA之核苷酸序列。在一實施例中，Cas9係來自釀膿鏈球菌(亦即Spy Cas9)。在一些實施例中，編碼crRNA、trRNA或crRNA及trRNA (其可為sgRNA)之核苷酸序列包括側接有來自天然CRISPR/Cas系統之所有或一部分重複序列之嚮導序列或由其組成。包括crRNA、trRNA或crRNA及trRNA或由其組成之核酸可進一步包括載體序列，其中該載體序列包括並非與crRNA、trRNA或crRNA及trRNA一起天然發現之核酸或由其組成。
此闡述及實例性實施例不應視為限制性。出於本說明書及隨附申請專利範圍之目的，除非另外指示，否則說明書及申請專利範圍中所使用所有表達量、百分比或比例之數字及其他數值應理解為在所有情況下皆由術語「約」修飾，只要其尚未如此修飾。因此，除非指示相反情況，否則下列說明書及隨附申請專利範圍中所陳述之數值參數皆為可視尋求獲得之期望性質而變化的近似值。最低限度地且並非試圖限制申請專利範圍範疇之等效項之準則之應用，每一數值參數應至少根據所報告有效數字之數值且透過應用普通捨入技術來解釋。
應注意，如本說明書及隨附申請專利範圍中所使用，除非明確且無疑地限於一種指示物，否則單數形式「一(a、an)」及「該(the)」及任一以單數使用之任一詞語包含複數個指示物。如本文中所使用，術語「包含」及其語法變化形式意欲係非限制性，從而清單中之所列舉項目並不排除其他可代替或增加至所列示項目之類似項目。 實例
提供下列實例以闡釋某些所揭示實施例且不應解釋為以任一方式限制本發明範圍。
實例1 -材料及方法
核酸酶mRNA之活體外轉錄(「IVT」)
藉由活體外轉錄使用線性化質體DNA模板及T7 RNA聚合酶來生成含有N1-甲基假-U之封端及聚腺苷酸化釀膿鏈球菌(「Spy」) Cas9 mRNA。藉由以下方式來線性化用於產生包括本文所闡述mRNA (實例性ORF可參見下文表24中之SEQ ID NO: 501-515)之mRNA之含有T7啟動子及轉錄序列之質體DNA：在37℃下使用XbaI利用下列條件培育至完全消解：200 ng/µL質體、2 U/µL XbaI (NEB)及1×反應緩衝液。藉由將反應液在65℃下加熱20 min來不活化XbaI。使用二氧化矽maxi旋轉管柱(Epoch Life Sciences)自酶及緩衝液鹽純化線性化質體且藉由瓊脂糖凝膠分析以證實線性化。將用以生成經Cas9修飾之mRNA之IVT反應液在37℃下於下列條件中培育4小時：50 ng/µL線性化質體；2 mM GTP、ATP、CTP及N1-甲基假-UTP (Trilink)中之每一者；10 mM ARCA (Trilink)；5 U/µL T7 RNA聚合酶(NEB)；1 U/µL鼠類RNase抑制劑(NEB)；0.004 U/µL無機大腸桿菌(E. coli )焦磷酸酶(NEB)；及1×反應緩衝液。在4-小時培育之後，添加TURBO DNase (ThermoFisher)直至最終濃度為0.01 U/µL，且將反應液再培育30分鐘以去除DNA模板。使用MegaClear Transcription Clean-up套組根據製造商方案(ThermoFisher)自酶及核苷酸純化Cas9 mRNA。或者，使用LiCl沈澱方法純化Cas9 mRNA，在一些情形下隨後藉由切向流過濾進一步純化。藉由量測260 nm下之吸光度(Nanodrop)來測定轉錄物濃度，且藉由毛細管電泳使用生物分析儀(Agilent)來分析轉錄物。
實例中所使用之Cas9 mRNA轉錄序列包括選自SEQ ID NO: 501-515之序列，如表24中所展示。
表24 ：實例性Cas9 mRNA序列
SEQ ID NO 序列
501 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCGCCACCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
502 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACUAG
503 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGAC
504 AUGGACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGAUAG
505 GACAAGAAGUACAGCAUCGGACUGGACAUCGGAACAAACAGCGUCGGAUGGGCAGUCAUCACAGACGAAUACAAGGUCCCGAGCAAGAAGUUCAAGGUCCUGGGAAACACAGACAGACACAGCAUCAAGAAGAACCUGAUCGGAGCACUGCUGUUCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACUGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGAUACACAAGAAGAAAGAACAGAAUCUGCUACCUGCAGGAAAUCUUCAGCAACGAAAUGGCAAAGGUCGACGACAGCUUCUUCCACAGACUGGAAGAAAGCUUCCUGGUCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGAUCUUCGGAAACAUCGUCGACGAAGUCGCAUACCACGAAAAGUACCCGACAAUCUACCACCUGAGAAAGAAGCUGGUCGACAGCACAGACAAGGCAGACCUGAGACUGAUCUACCUGGCACUGGCACACAUGAUCAAGUUCAGAGGACACUUCCUGAUCGAAGGAGACCUGAACCCGGACAACAGCGACGUCGACAAGCUGUUCAUCCAGCUGGUCCAGACAUACAACCAGCUGUUCGAAGAAAACCCGAUCAACGCAAGCGGAGUCGACGCAAAGGCAAUCCUGAGCGCAAGACUGAGCAAGAGCAGAAGACUGGAAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACUGUUCGGAAACCUGAUCGCACUGAGCCUGGGACUGACACCGAACUUCAAGAGCAACUUCGACCUGGCAGAAGACGCAAAGCUGCAGCUGAGCAAGGACACAUACGACGACGACCUGGACAACCUGCUGGCACAGAUCGGAGACCAGUACGCAGACCUGUUCCUGGCAGCAAAGAACCUGAGCGACGCAAUCCUGCUGAGCGACAUCCUGAGAGUCAACACAGAAAUCACAAAGGCACCGCUGAGCGCAAGCAUGAUCAAGAGAUACGACGAACACCACCAGGACCUGACACUGCUGAAGGCACUGGUCAGACAGCAGCUGCCGGAAAAGUACAAGGAAAUCUUCUUCGACCAGAGCAAGAACGGAUACGCAGGAUACAUCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAAUUCUACAAGUUCAUCAAGCCGAUCCUGGAAAAGAUGGACGGAACAGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGAGAAGACCUGCUGAGAAAGCAGAGAACAUUCGACAACGGAAGCAUCCCGCACCAGAUCCACCUGGGAGAACUGCACGCAAUCCUGAGAAGACAGGAAGACUUCUACCCGUUCCUGAAGGACAACAGAGAAAAGAUCGAAAAGAUCCUGACAUUCAGAAUCCCGUACUACGUCGGACCGCUGGCAAGAGGAAACAGCAGAUUCGCAUGGAUGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAAUCACACCGUGGAACUUCGAAGAAGUCGUCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCUUCAUCGAAAGAAUGACAAACUUCGACAAGAACCUGCCGAACGAAAAGGUCCUGCCGAAGCACAGCCUGCUGUACGAAUACUUCACAGUCUACAACGAACUGACAAAGGUCAAGUACGUCACAGAAGGAAUGAGAAAGCCGGCAUUCCUGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAAUCGUCGACCUGCUGUUCAAGACAAACAGAAAGGUCACAGUCAAGCAGCUGAAGGAAGACUACUUCAAGAAGAUCGAAUGCUUCGACAGCGUCGAAAUCAGCGGAGUCGAAGACAGAUUCAACGCAAGCCUGGGAACAUACCACGACCUGCUGAAGAUCAUCAAGGACAAGGACUUCCUGGACAACGAAGAAAACGAAGACAUCCUGGAAGACAUCGUCCUGACACUGACACUGUUCGAAGACAGAGAAAUGAUCGAAGAAAGACUGAAGACAUACGCACACCUGUUCGACGACAAGGUCAUGAAGCAGCUGAAGAGAAGAAGAUACACAGGAUGGGGAAGACUGAGCAGAAAGCUGAUCAACGGAAUCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAAUCCUGGACUUCCUGAAGAGCGACGGAUUCGCAAACAGAAACUUCAUGCAGCUGAUCCACGACGACAGCCUGACAUUCAAGGAAGACAUCCAGAAGGCACAGGUCAGCGGACAGGGAGACAGCCUGCACGAACACAUCGCAAACCUGGCAGGAAGCCCGGCAAUCAAGAAGGGAAUCCUGCAGACAGUCAAGGUCGUCGACGAACUGGUCAAGGUCAUGGGAAGACACAAGCCGGAAAACAUCGUCAUCGAAAUGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAAUGAAGAGAAUCGAAGAAGGAAUCAAGGAACUGGGAAGCCAGAUCCUGAAGGAACACCCGGUCGAAAACACACAGCUGCAGAACGAAAAGCUGUACCUGUACUACCUGCAGAACGGAAGAGACAUGUACGUCGACCAGGAACUGGACAUCAACAGACUGAGCGACUACGACGUCGACCACAUCGUCCCGCAGAGCUUCCUGAAGGACGACAGCAUCGACAACAAGGUCCUGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGUCCCGAGCGAAGAAGUCGUCAAGAAGAUGAAGAACUACUGGAGACAGCUGCUGAACGCAAAGCUGAUCACACAGAGAAAGUUCGACAACCUGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACUGAGCGAACUGGACAAGGCAGGAUUCAUCAAGAGACAGCUGGUCGAAACAAGACAGAUCACAAAGCACGUCGCACAGAUCCUGGACAGCAGAAUGAACACAAAGUACGACGAAAACGACAAGCUGAUCAGAGAAGUCAAGGUCAUCACACUGAAGAGCAAGCUGGUCAGCGACUUCAGAAAGGACUUCCAGUUCUACAAGGUCAGAGAAAUCAACAACUACCACCACGCACACGACGCAUACCUGAACGCAGUCGUCGGAACAGCACUGAUCAAGAAGUACCCGAAGCUGGAAAGCGAAUUCGUCUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUCAGAAAGAUGAUCGCAAAGAGCGAACAGGAAAUCGGAAAGGCAACAGCAAAGUACUUCUUCUACAGCAACAUCAUGAACUUCUUCAAGACAGAAAUCACACUGGCAAACGGAGAAAUCAGAAAGAGACCGCUGAUCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAAUCGUCUGGGACAAGGGAAGAGACUUCGCAACAGUCAGAAAGGUCCUGAGCAUGCCGCAGGUCAACAUCGUCAAGAAGACAGAAGUCCAGACAGGAGGAUUCAGCAAGGAAAGCAUCCUGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCUGAUCGCAAGAAAGAAGGACUGGGACCCGAAGAAGUACGGAGGAUUCGACAGCCCGACAGUCGCAUACAGCGUCCUGGUCGUCGCAAAGGUCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCUGAAGAGCGUCAAGGAACUGCUGGGAAUCACAAUCAUGGAAAGAAGCAGCUUCGAAAAGAACCCGAUCGACUUCCUGGAAGCAAAGGGAUACAAGGAAGUCAAGAAGGACCUGAUCAUCAAGCUGCCGAAGUACAGCCUGUUCGAACUGGAAAACGGAAGAAAGAGAAUGCUGGCAAGCGCAGGAGAACUGCAGAAGGGAAACGAACUGGCACUGCCGAGCAAGUACGUCAACUUCCUGUACCUGGCAAGCCACUACGAAAAGCUGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCUGUUCGUCGAACAGCACAAGCACUACCUGGACGAAAUCAUCGAACAGAUCAGCGAAUUCAGCAAGAGAGUCAUCCUGGCAGACGCAAACCUGGACAAGGUCCUGAGCGCAUACAACAAGCACAGAGACAAGCCGAUCAGAGAACAGGCAGAAAACAUCAUCCACCUGUUCACACUGACAAACCUGGGAGCACCGGCAGCAUUCAAGUACUUCGACACAACAAUCGACAGAAAGAGAUACACAAGCACAAAGGAAGUCCUGGACGCAACACUGAUCCACCAGAGCAUCACAGGACUGUACGAAACAAGAAUCGACCUGAGCCAGCUGGGAGGAGACGGAAGCGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGUCGACAGCGGA
506 GGGTCCCGCAGTCGGCGTCCAGCGGCTCTGCTTGTTCGTGTGTGTGTCGTTGCAGGCCTTATTCGGATCCATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAGCTAGCCATCACATTTAAAAGCATCTCAGCCTACCATGAGAATAAGAGAAAGAAAATGAAGATCAATAGCTTATTCATCTCTTTTTCTTTTTCGTTGGTGTAAAGCCAACACCCTGTCTAAAAAACATAAATTTCTTTAATCATTTTGCCTCTTTTCTCTGTGCTTCAATTAATAAAAAATGGAAAGAACCTCGAG
507 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGACTGGACATCGGAACAAACAGCGTCGGATGGGCAGTCATCACAGACGAATACAAGGTCCCGAGCAAGAAGTTCAAGGTCCTGGGAAACACAGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCACTGCTGTTCGACAGCGGAGAAACAGCAGAAGCAACAAGACTGAAGAGAACAGCAAGAAGAAGATACACAAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAAATCTTCAGCAACGAAATGGCAAAGGTCGACGACAGCTTCTTCCACcggCTGGAAGAAAGCTTCCTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCGATCTTCGGAAACATCGTCGACGAAGTCGCATACCACGAAAAGTACCCGACAATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTCGACAGCACAGACAAGGCAGACCTGAGACTGATCTACCTGGCACTGGCACACATGATCAAGTTCAGAGGACACTTCCTGATCGAAGGAGACCTGAACCCGGACAACAGCGACGTCGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTCCAGACATACAACCAGCTGTTCGAAGAAAACCCGATCAACGCAAGCGGAGTCGACGCAAAGGCAATCCTGAGCGCAAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAAAACCTGATCGCACAGCTGCCGGGAGAAAAGAAGAACGGACTGTTCGGAAACCTGATCGCACTGAGCCTGGGACTGACACCGAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCAGAAGACGCAAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACATACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCACAGATCGGAGACCAGTACGCAGACCTGTTCCTGGCAGCAAAGAACCTGAGCGACGCAATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTCAACACAGAAATCACAAAGGCACCGCTGAGCGCAAGCATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAGGACCTGACACTGCTGAAGGCACTGGTCAGACAGCAGCTGCCGGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGATACGCAGGATACATCGACGGAGGAGCAAGCCAGGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCGATCCTGGAAAAGATGGACGGAACAGAAGAACTGCTGGTCAAGCTGAACAGAGAAGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACATTCGACAACGGAAGCATCCCGCACCAGATCCACCTGGGAGAACTGCACGCAATCCTGAGAAGACAGGAAGACTTCTACCCGTTCCTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCCTGACATTCAGAATCCCGTACTACGTCGGACCGCTGGCAAGAGGAAACAGCAGATTCGCATGGATGACAAGAAAGAGCGAAGAAACAATCACACCGTGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGAGCAAGCGCACAGAGCTTCATCGAAAGAATGACAAACTTCGACAAGAACCTGCCGAACGAAAAGGTCCTGCCGAAGCACAGCCTGCTGTACGAATACTTCACAGTCTACAACGAACTGACAAAGGTCAAGTACGTCACAGAAGGAATGAGAAAGCCGGCATTCCTGAGCGGAGAACAGAAGAAGGCAATCGTCGACCTGCTGTTCAAGACAAACAGAAAGGTCACAGTCAAGCAGCTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACAGCGTCGAAATCAGCGGAGTCGAAGACAGATTCAACGCAAGCCTGGGAACATACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCCTGGAAGACATCGTCCTGACACTGACACTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGACTGAAGACATACGCACACCTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACAGGATGGGGAAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGAATCAGAGACAAGCAGAGCGGAAAGACAATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGATTCGCAAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACATTCAAGGAAGACATCCAGAAGGCACAGGTCAGCGGACAGGGAGACAGCCTGCACGAACACATCGCAAACCTGGCAGGAAGCCCGGCAATCAAGAAGGGAATCCTGCAGACAGTCAAGGTCGTCGACGAACTGGTCAAGGTCATGGGAAGACACAAGCCGGAAAACATCGTCATCGAAATGGCAAGAGAAAACCAGACAACACAGAAGGGACAGAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGAATCAAGGAACTGGGAAGCCAGATCCTGAAGGAACACCCGGTCGAAAACACACAGCTGCAGAACGAAAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAaAACGGAAGAGACATGTACGTCGACCAGGAACTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCGCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTCCTGACAAGAAGCGACAAGAACAGAGGAAAGAGCGACAACGTCCCGAGCGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCAAAGCTGATCACACAGAGAAAGTTCGACAACCTGACAAAGGCAGAGAGAGGAGGACTGAGCGAACTGGACAAGGCAGGATTCATCAAGAGACAGCTGGTCGAAACAAGACAGATCACAAAGCACGTCGCACAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACAAAGTACGACGAAAACGACAAGCTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACACTGAAGAGCAAGCTGGTCAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCACACGACGCATACCTGAACGCAGTCGTCGGAACAGCACTGATCAAGAAGTACCCGAAGCTGGAAAGCGAATTCGTCTACGGAGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCAAAGAGCGAACAGGAAATCGGAAAGGCAACAGCAAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACAGAAATCACACTGGCAAACGGAGAAATCAGAAAGAGACCGCTGATCGAAACAAACGGAGAAACAGGAGAAATCGTCTGGGACAAGGGAAGAGACTTCGCAACAGTCAGAAAGGTCCTGAGCATGCCGCAGGTCAACATCGTCAAGAAGACAGAAGTCCAGACAGGAGGATTCAGCAAGGAAAGCATCCTGCCGAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCAAGAAAGAAGGACTGGGACCCGAAGAAGTACGGAGGATTCGACAGCCCGACAGTCGCATACAGCGTCCTGGTCGTCGCAAAGGTCGAAAAGGGAAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTCAAGGAACTGCTGGGAATCACAATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAAAAGAACCCGATCGACTTCCTGGAAGCAAAGGGATACAAGGAAGTCAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCGAAGTACAGCCTGTTCGAACTGGAAAACGGAAGAAAGAGAATGCTGGCAAGCGCAGGAGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCACTGCCGAGCAAGTACGTCAACTTCCTGTACCTGGCAAGCCACTACGAAAAGCTGAAGGGAAGCCCGGAAGACAACGAACAGAAGCAGCTGTTCGTCGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAAATCATCGAACAGATCAGCGAATTCAGCAAGAGAGTCATCCTGGCAGACGCAAACCTGGACAAGGTCCTGAGCGCATACAACAAGCACAGAGACAAGCCGATCAGAGAACAGGCAGAAAACATCATCCACCTGTTCACACTGACAAACCTGGGAGCACCGGCAGCATTCAAGTACTTCGACACAACAATCGACAGAAAGAGATACACAAGCACAAAGGAAGTCCTGGACGCAACACTGATCCACCAGAGCATCACAGGACTGTACGAAACAAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGAGGAGACGGAGGAGGAAGCCCGAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAG
508 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACAGACACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCAGACTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGAGACACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGAGACTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCAGACTGAGCAAGAGCAGAAGACTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGAGACAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGAGAAAGCAGAGAACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGAGAAGACAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACAGAGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCAGAATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCAGAGGCAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGAGAATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACAGATTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAGAGACTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGAGAAGAAGATACACCGGCTGGGGCAGACTGAGCAGAAAGCTGATCAACGGCATCAGAGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCAGACACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCAGAGAGAGAATGAAGAGAATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCAGAGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACAGACTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACAGAGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGAGAAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAGACCAGACAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCAGAGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCAGAAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGAGAGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGAGAAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCAGAAAGAGACCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCAGAGACTTCGCCACCGTGAGAAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGAGAAACAGCGACAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGAGAAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCAGAAAGAGAATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCAGAATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCGGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGTGA
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510 ATGGACAAGAAGTACTCTATCGGTTTGGACATCGGTACCAACTCTGTCGGTTGGGCCGTCATCACCGACGAATACAAGGTCCCATCTAAGAAGTTCAAGGTCTTGGGTAACACCGACAGACACTCTATCAAGAAGAACTTGATCGGTGCCTTGTTGTTCGACTCTGGTGAAACCGCCGAAGCCACCAGATTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGAAGAAAGAACAGAATCTGCTACTTGCAAGAAATCTTCTCTAACGAAATGGCCAAGGTCGACGACTCTTTCTTCCACAGATTGGAAGAATCTTTCTTGGTCGAAGAAGACAAGAAGCACGAAAGACACCCAATCTTCGGTAACATCGTCGACGAAGTCGCCTACCACGAAAAGTACCCAACCATCTACCACTTGAGAAAGAAGTTGGTCGACTCTACCGACAAGGCCGACTTGAGATTGATCTACTTGGCCTTGGCCCACATGATCAAGTTCAGAGGTCACTTCTTGATCGAAGGTGACTTGAACCCAGACAACTCTGACGTCGACAAGTTGTTCATCCAATTGGTCCAAACCTACAACCAATTGTTCGAAGAAAACCCAATCAACGCCTCTGGTGTCGACGCCAAGGCCATCTTGTCTGCCAGATTGTCTAAGAGCAGAAGATTGGAAAACTTGATCGCCCAATTGCCAGGTGAAAAGAAGAACGGTTTGTTCGGTAACTTGATCGCCTTGTCTTTGGGTTTGACCCCAAACTTCAAGTCTAACTTCGACTTGGCCGAAGACGCCAAGTTGCAATTGTCTAAGGACACCTACGACGACGACTTGGACAACTTGTTGGCCCAAATCGGTGACCAATACGCCGACTTGTTCTTGGCCGCCAAGAACTTGTCTGACGCCATCTTGTTGTCTGACATCTTGAGAGTCAACACCGAAATCACCAAGGCCCCATTGTCTGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAACACCACCAAGACTTGACCTTGTTGAAGGCCTTGGTCAGACAACAATTGCCAGAAAAGTACAAGGAAATCTTCTTCGACCAATCTAAGAACGGTTACGCCGGTTACATCGACGGTGGTGCCTCTCAAGAAGAATTCTACAAGTTCATCAAGCCAATCTTGGAAAAGATGGACGGTACCGAAGAATTGTTGGTCAAGTTGAACAGAGAAGACTTGTTGAGAAAGCAAAGAACCTTCGACAACGGTTCTATCCCACACCAAATCCACTTGGGTGAATTGCACGCCATCTTGAGAAGACAAGAAGACTTCTACCCATTCTTGAAGGACAACAGAGAAAAGATCGAAAAGATCTTGACCTTCAGAATCCCATACTACGTCGGTCCATTGGCCAGAGGTAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGTCTGAAGAAACCATCACCCCATGGAACTTCGAAGAAGTCGTCGACAAGGGTGCCTCTGCCCAATCTTTCATCGAAAGAATGACCAACTTCGACAAGAACTTGCCAAACGAAAAGGTCTTGCCAAAGCACTCTTTGTTGTACGAATACTTCACCGTCTACAACGAATTGACCAAGGTCAAGTACGTCACCGAAGGTATGAGAAAGCCAGCCTTCTTGTCTGGTGAACAAAAGAAGGCCATCGTCGACTTGTTGTTCAAGACCAACAGAAAGGTCACCGTCAAGCAATTGAAGGAAGACTACTTCAAGAAGATCGAATGCTTCGACTCTGTCGAAATCTCTGGTGTCGAAGACAGATTCAACGCCTCTTTGGGTACCTACCACGACTTGTTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCTTGGACAACGAAGAAAACGAAGACATCTTGGAAGACATCGTCTTGACCTTGACCTTGTTCGAAGACAGAGAAATGATCGAAGAAAGATTGAAGACCTACGCCCACTTGTTCGACGACAAGGTCATGAAGCAATTGAAGAGAAGAAGATACACCGGTTGGGGTAGATTGAGCAGAAAGTTGATCAACGGTATCAGAGACAAGCAATCTGGTAAGACCATCTTGGACTTCTTGAAGTCTGACGGTTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAATTGATCCACGACGACTCTTTGACCTTCAAGGAAGACATCCAAAAGGCCCAAGTCTCTGGTCAAGGTGACTCTTTGCACGAACACATCGCCAACTTGGCCGGTTCTCCAGCCATCAAGAAGGGTATCTTGCAAACCGTCAAGGTCGTCGACGAATTGGTCAAGGTCATGGGTAGACACAAGCCAGAAAACATCGTCATCGAAATGGCCAGAGAAAACCAAACCACCCAAAAGGGTCAAAAGAACAGCAGAGAAAGAATGAAGAGAATCGAAGAAGGTATCAAGGAATTGGGTTCTCAAATCTTGAAGGAACACCCAGTCGAAAACACCCAATTGCAAAACGAAAAGTTGTACTTGTACTACTTGCAAAACGGTAGAGACATGTACGTCGACCAAGAATTGGACATCAACAGATTGTCTGACTACGACGTCGACCACATCGTCCCACAATCTTTCTTGAAGGACGACTCTATCGACAACAAGGTCTTGACCAGATCTGACAAGAACAGAGGTAAGTCTGACAACGTCCCATCTGAAGAAGTCGTCAAGAAGATGAAGAACTACTGGAGACAATTGTTGAACGCCAAGTTGATCACCCAAAGAAAGTTCGACAACTTGACCAAGGCCGAAAGAGGTGGTTTGTCTGAATTGGACAAGGCCGGTTTCATCAAGAGACAATTGGTCGAAACCAGACAAATCACCAAGCACGTCGCCCAAATCTTGGACAGCAGAATGAACACCAAGTACGACGAAAACGACAAGTTGATCAGAGAAGTCAAGGTCATCACCTTGAAGTCTAAGTTGGTCTCTGACTTCAGAAAGGACTTCCAATTCTACAAGGTCAGAGAAATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACTTGAACGCCGTCGTCGGTACCGCCTTGATCAAGAAGTACCCAAAGTTGGAATCTGAATTCGTCTACGGTGACTACAAGGTCTACGACGTCAGAAAGATGATCGCCAAGTCTGAACAAGAAATCGGTAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCTAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAAATCACCTTGGCCAACGGTGAAATCAGAAAGAGACCATTGATCGAAACCAACGGTGAAACCGGTGAAATCGTCTGGGACAAGGGTAGAGACTTCGCCACCGTCAGAAAGGTCTTGTCTATGCCACAAGTCAACATCGTCAAGAAGACCGAAGTCCAAACCGGTGGTTTCTCTAAGGAATCTATCTTGCCAAAGAGAAACTCTGACAAGTTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCAAAGAAGTACGGTGGTTTCGACTCTCCAACCGTCGCCTACTCTGTCTTGGTCGTCGCCAAGGTCGAAAAGGGTAAGTCTAAGAAGTTGAAGTCTGTCAAGGAATTGTTGGGTATCACCATCATGGAAAGATCTTCTTTCGAAAAGAACCCAATCGACTTCTTGGAAGCCAAGGGTTACAAGGAAGTCAAGAAGGACTTGATCATCAAGTTGCCAAAGTACTCTTTGTTCGAATTGGAAAACGGTAGAAAGAGAATGTTGGCCTCTGCCGGTGAATTGCAAAAGGGTAACGAATTGGCCTTGCCATCTAAGTACGTCAACTTCTTGTACTTGGCCTCTCACTACGAAAAGTTGAAGGGTTCTCCAGAAGACAACGAACAAAAGCAATTGTTCGTCGAACAACACAAGCACTACTTGGACGAAATCATCGAACAAATCTCTGAATTCTCTAAGAGAGTCATCTTGGCCGACGCCAACTTGGACAAGGTCTTGTCTGCCTACAACAAGCACAGAGACAAGCCAATCAGAGAACAAGCCGAAAACATCATCCACTTGTTCACCTTGACCAACTTGGGTGCCCCAGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACAGAAAGAGATACACCTCTACCAAGGAAGTCTTGGACGCCACCTTGATCCACCAATCTATCACCGGTTTGTACGAAACCAGAATCGACTTGTCTCAATTGGGTGGTGACGGTGGTGGTTCTCCAAAGAAGAAGAGAAAGGTCTAA
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513 ATGGACAAGAAGTACTCCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACTCCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCTCCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACTCCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACTCCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCTCCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACTCCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGTCCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACTCCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACTCCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCTCCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCCGCCCGGCTGTCCAAGTCCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGTCCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGTCCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGTCCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGTCCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGTCCGCCTCCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGTCCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCTCCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCTCCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACTCCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGTCCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCTCCGCCCAGTCCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACTCCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGTCCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAGATCTCCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGTCCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACTCCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGACTCCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCTCCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACTCCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCTCCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGTCCTTCCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGTCCGACAAGAACCGGGGCAAGTCCGACAACGTGCCCTCCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGTCCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGTCCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGTCCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACTCCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGTCCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCTCCAAGGAGTCCATCCTGCCCAAGCGGAACTCCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACTCCCCCACCGTGGCCTACTCCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGTCCAAGAAGCTGAAGTCCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGTCCTCCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCTCCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCTCCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCTCCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCTCCGAGTTCTCCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCTCCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGTCCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGTCCCAGCTGGGCGGCGACGGCTCCGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCTCCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACTCCGGCTGA
514 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACGGCAGCGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACGGCAGCCCCAAGAAGAAGCGGAAGGTGGACAGCGGCTGA
515 ATGGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGACATCGGCACCAACAGCGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAGTTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGCGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAGACCGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGCGGACCGCCCGGCGGCGGTACACCCGGCGGAAGAACCGGATCTGCTACCTGCAGGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACCGGCTGGAGGAGAGCTTCCTGGTGGAGGAGGACAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGCGGAAGAAGCTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTACCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAGAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGAGCGCCCGGCTGAGCAAGAGCCGGCGGCTGGAGAACCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAACGGCCTGTTCGGCAACCTGATCGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGACGCCAAGCTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTCCTGGCCGCCAAGAACCTGAGCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGCGGGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCAGCATGATCAAGCGGTACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAGGCCCTGGTGCGGCAGCAGCTGCCCGAGAAGTACAAGGAGATCTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATCGACGGCGGCGCCAGCCAGGAGGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAGAAGATGGACGGCACCGAGGAGCTGCTGGTGAAGCTGAACCGGGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGCGAGCTGCACGCCATCCTGCGGCGGCAGGAGGACTTCTACCCCTTCCTGAAGGACAACCGGGAGAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGGATCCCCTACTACGTGGGCCCCCTGGCCCGGGGCAACAGCCGGTTCGCCTGGATGACCCGGAAGAGCGAGGAGACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAGGTGGTGGACAAGGGCGCCAGCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGACAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTACAACGAGCTGACCAAGGTGAAGTACGTGACCGAGGGCATGCGGAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAGAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAGGTGACCGTGAAGCAGCTGAAGGAGGACTACTTCAAGAAGATCGAGTGCTTCGACAGCGTGGAGATCAGCGGCGTGGAGGACCGGTTCAACGCCAGCCTGGGCACCTACCACGACCTGCTGAAGATCATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAACGAGGAGAACGAGGACATCCTGGAGGACATCGTGCTGACCCTGACCCTGTTCGAGGACCGGGAGATGATCGAGGAGCGGCTGAAGACCTACGCCCACCTGTTCGACGACAAGGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGCGGTACACCGGCTGGGGCCGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGAGCGGCAAGACCATCCTGGACTTCCTGAAGAGCGACGGCTTCGCCAACCGGAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTCAAGGAGGACATCCAGAAGGCCCAGGTGAGCGGCCAGGGCGACAGCCTGCACGAGCACATCGCCAACCTGGCCGGCAGCCCCGCCATCAAGAAGGGCATCCTGCAGACCGTGAAGGTGGTGGACGAGCTGGTGAAGGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAGATGGCCCGGGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGCCAGAAGAACAGCCGGGAGCGGATGAAGCGGATCGAGGAGGGCATCAAGGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAGGAGCACCCCGTGGAGAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAACGGCCGGGACATGTACGTGGACCAGGAGCTGGACATCAACCGGCTGAGCGACTACGACGTGGACCACATCGTGCCCCAGAGCTTCCTGAAGGACGACAGCATCGACAACAAGGTGCTGACCCGGAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCAGCGAGGAGGTGGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATCACCCAGCGGAAGTTCGACAACCTGACCAAGGCCGAGCGGGGCGGCCTGAGCGAGCTGGACAAGGCCGGCTTCATCAAGCGGCAGCTGGTGGAGACCCGGCAGATCACCAAGCACGTGGCCCAGATCCTGGACAGCCGGATGAACACCAAGTACGACGAGAACGACAAGCTGATCCGGGAGGTGAAGGTGATCACCCTGAAGAGCAAGCTGGTGAGCGACTTCCGGAAGGACTTCCAGTTCTACAAGGTGCGGGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTGGTGGGCACCGCCCTGATCAAGAAGTACCCCAAGCTGGAGAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAGATCGGCAAGGCCACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTCTTCAAGACCGAGATCACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCCCTGATCGAGACCAACGGCGAGACCGGCGAGATCGTGTGGGACAAGGGCCGGGACTTCGCCACCGTGCGGAAGGTGCTGAGCATGCCCCAGGTGAACATCGTGAAGAAGACCGAGGTGCAGACCGGCGGCTTCAGCAAGGAGAGCATCCTGCCCAAGCGGAACAGCGACAAGCTGATCGCCCGGAAGAAGGACTGGGACCCCAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTACAGCGTGCTGGTGGTGGCCAAGGTGGAGAAGGGCAAGAGCAAGAAGCTGAAGAGCGTGAAGGAGCTGCTGGGCATCACCATCATGGAGCGGAGCAGCTTCGAGAAGAACCCCATCGACTTCCTGGAGGCCAAGGGCTACAAGGAGGTGAAGAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCCAAGTACAGCCTGTTCGAGCTGGAGAACGGCCGGAAGCGGATGCTGGCCAGCGCCGGCGAGCTGCAGAAGGGCAACGAGCTGGCCCTGCCCAGCAAGTACGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTACGAGAAGCTGAAGGGCAGCCCCGAGGACAACGAGCAGAAGCAGCTGTTCGTGGAGCAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCAGCAAGCGGGTGATCCTGGCCGACGCCAACCTGGACAAGGTGCTGAGCGCCTACAACAAGCACCGGGACAAGCCCATCCGGGAGCAGGCCGAGAACATCATCCACCTGTTCACCCTGACCAACCTGGGCGCCCCCGCCGCCTTCAAGTACTTCGACACCACCATCGACCGGAAGCGGTACACCAGCACCAAGGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACCCGGATCGACCTGAGCCAGCTGGGCGGCGACTGA
脂質奈米顆粒(LNP)調配物
一般而言，將脂質奈米顆粒組分以不同莫耳比率溶於100%乙醇中。將RNA負荷(例如Cas9 mRNA及sgRNA)溶於25 mM檸檬酸鹽/100 mM NaCl (pH 5.0)中，從而得到大約0.45 mg/mL之RNA負荷濃度。實例2-4中所使用之LNP以50:38:9:3莫耳比率分別含有可離子化脂質((9Z,12Z)-3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八-9,12-二烯酸酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate，亦稱為3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate))、膽固醇、DSPC及PEG2k-DMG。使用約6之脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)莫耳比率及1:1之gRNA對mRNA重量比率來調配LNP。
使用交叉流技術藉由撞擊射流混合於乙醇中之脂質與兩體積RNA溶液及一體積水來製備LNP。經由混合十字架來混合於乙醇中之脂質與兩體積RNA溶液。經由直插式三通混合第四水流與十字架出口流(參見 WO2016010840圖2)。將LNP在室溫下保持1小時，並使用水(大約1:1 v/v)進一步稀釋。使用切向流過濾在平板柱(Sartorius, 100kD MWCO)上濃縮經稀釋LNP且然後使用PD-10去鹽管柱(GE)緩衝液交換至50 mM Tris、45 mM NaCl、5% (w/v)蔗糖(pH 7.5) (TSS)。然後使用0.2 μm無菌過濾器過濾所得混合物。將最終LNP儲存於4℃或-80℃下直至進一步使用。
人類LDHA嚮導設計及具有食蟹猴同源性嚮導設計之人類LDHA
在電腦中使用人類參考基因體(例如hg38)及使用者定義之所關注基因體區域(例如編碼LDHA 蛋白之外顯子)來實施初始嚮導選擇以鑑別所關注區域中之PAM。對於每一所鑑別PAM而言，實施分析且報告統計學。進一步選擇gRNA分子且基於業內已知之諸多準則(例如GC含量、預測在靶活性及潛在脫靶活性)進行排序。
針對人類LDHA (ENSG00000134333)設計總共84個靶向蛋白質外顯子編碼區之嚮導RNA。嚮導及相應基因體坐標提供於上文中(表1)。40個嚮導RNA與食蟹猴LDHA 具有100%同源性。
針對新食蟹猴LDHA轉錄物設計其他嚮導。自來自雌性毛裡求斯源食蟹猴(NCBI SRA ID: SRR1758956；Peng等人(2015), Nucleic Acids Research，第43卷，第D1期，第D737-D742頁)之肝試樣之公開轉錄組測序獲得原始數據。使用Trinity (v2.8.4；Grabherr等人(2011), Nature Biotechnology, 29: 644-652)及SPAdes (v3.13.0；Bankevich等人(2012), Journal of Computational Biology, 19:5)實施重新轉錄組組裝。兩種方法皆能夠組裝LDHA 轉錄物，該等轉錄物係藉由使用BLAST比較其序列與LDHA蛋白(UniProt ID: Q9BE24)來進行鑑別(Altschul等人(1990), Journal of Molecular Biology, 215:3, 403-410)。Cas9 (mRNA/蛋白質)及嚮導RNA之活體外遞送
將原代人類肝肝細胞(PHH) (Gibco，批號：Hu8298或Hu8296)及原代食蟹猴肝肝細胞(PCH) (Gibco，批號：Cy367；或In Vitro ADMET Laboratories, Inc.，批號：10281011)解凍並再懸浮於含有補充物之肝細胞解凍培養基(Gibco，目錄號：CM7500)中，隨後離心。棄除上清液並將粒化細胞再懸浮於肝細胞平鋪培養基加上補充包(Invitrogen，目錄號：A1217601及CM3000)中。對細胞進行計數並以33,000個細胞/孔(對於PHH)及50,000個細胞/孔(對於PCH)之密度平鋪於經Bio-coat膠原I塗覆之96孔板(ThermoFisher，目錄號：877272)上。使經平鋪細胞在37℃及5% CO2 氣氛下於組織培養培育器中沉降並黏附5小時。在培育之後，檢查細胞中之單層形成且使用肝細胞培養基(Takara，目錄號：Y20020；及/或Invitrogen，目錄號：A1217601及CM4000)洗滌一次。
對於利用dgRNA之研究而言，藉由以下方式來預退火個別crRNA及trRNA：混合等量試劑並在95℃下培育 2 min，且冷卻至室溫。將由預退火crRNA及trRNA組成之雙嚮導(dgRNA)與Spy Cas9蛋白一起培育以形成核糖核蛋白(RNP)複合物。使用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher，目錄號：13778150)根據製造商方案來轉染細胞。使用含有Spy Cas9 (10nM)、個別嚮導(10 nM)、示蹤RNA (10 nM)、Lipofectamine RNAiMAX (1.0 µL/孔)及OptiMem之RNP轉染細胞。
對於利用sgRNA之研究而言，將嚮導與Spy Cas9蛋白一起培育以形成核糖核蛋白(RNP)複合物。在利用RNP轉染之研究中，使用Lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher，目錄號：13778150)根據製造商方案來轉染細胞。使用含有Spy Cas9 (10nM)、sgRNA (10 nM)、Lipofectamine RNAiMAX (1.0 µL/孔)及OptiMem之RNP轉染細胞。在利用電穿孔之研究中，使用含有Spy Cas9 (2uM)及sgRNA (4uM)之RNP利用Lonza 4D-Nucleofector核心單元(目錄號：AAF-1002X)、96孔穿梭裝置(目錄號：AAM 10015)及P3原代細胞套組(目錄號：V4XP-3960)來電穿孔細胞。
亦使用LNP來處理原代人類及食蟹猴肝細胞，如下文進一步所闡述。在使用LNP處理之前，將細胞在37℃、5% CO2 下培育48小時。將LNP在37℃下於含有3%食蟹猴血清之培養基中培育10分鐘並以如本文進一步所提供之量投與細胞中。
Cas9 mRNA及gRNA之脂質轉染使用預混合脂質調配物，其中將脂質組分以50%脂質A、9% DSPC、38%膽固醇及3% PEG2k-DMG之莫耳比率重構於100%乙醇中。然後以約6.0之脂質胺對RNA磷酸酯(N:P)莫耳比率混合脂質混合物與RNA負荷(例如Cas9 mRNA及gRNA)。使用6%食蟹猴血清及1:1之gRNA對mRNA之重量比率來實施脂質轉染。
基因體DNA分離
在轉染後72或96小時收穫PHH及PCH轉染細胞。使用50 µL/孔BuccalAmp DNA提取溶液(Epicentre，目錄號：QE09050)根據製造商方案自96孔板之每一孔提取gDNA。對所有DNA試樣實施PCR及後續NGS分析，如本文所闡述。
二代測序(「NGS」)及在靶裂解效率分析
為定量測定基因體中之靶位置之編輯效率，利用深度測序來鑑別藉由基因編輯引入之插入及缺失之存在。將PCR引子設計於所關注基因(例如LDHA )內之靶位點附近，且擴增所關注之基因體區域。引子序列設計係該領域中之標準設計。
根據製造商方案(Illumina)實施額外PCR以添加測序用化學物質。在Illumina MiSeq儀器上對擴增子進行測序。在消除具有低品質評分者之後，將讀數與參考基因體(例如hg38)進行比對。將含有讀數之所得檔案映射至參考基因體(BAM檔案)，其中選擇與所關注靶區域重疊之讀數且計算野生型讀取數與含有插入或缺失(「插入缺失」)之讀取數。
編輯百分比(例如「編輯效率」或「編輯百分數」)定義為具有插入或缺失(「插入缺失」)之序列讀數之總數除以序列讀數(包含野生型)之總數。
藉由西方印漬實施之乳酸脫氫酶A (LDHA)蛋白分析
使用利用如實例3中進一步所闡述之來自表1之所選嚮導調配之LNP處理原發性人類肝細胞。將LNP在37℃下於含有3%食蟹猴血清之培養基(Takara，目錄號：Y20020)中培育10分鐘。在培育後，將LNP添加至人類肝細胞中。在轉染後21天，去除培養基且使用50 µL/孔RIPA緩衝液(Boston Bio Products，目錄號：BP-115)加上新添加之蛋白酶抑制劑混合物(由全蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma，目錄號：11697498001)、1 mM DTT及250 U/ml Benzonase (EMD Millipore，目錄號：71206-3)組成)裂解細胞。將細胞在冰上保持30分鐘，然後添加NaCl (1 M最終濃度)。將細胞溶解物充分混合並在冰上保留30分鐘。將全細胞提取物(「WCE」)轉移至PCR板中並離心成糰粒碎屑。使用Bradford分析 (Bio-Rad，目錄號：500-0001)來評價溶解物之蛋白質含量。根據製造商方案完成Bradford分析程序。將提取物在使用之前儲存於-20℃下。
使用利用如實例4中進一步所闡述之所選嚮導調配之LNP治療AGT缺陷型小鼠。在治療後自小鼠收穫肝且使用60 mg部分進行蛋白質提取。將試樣置於珠粒管(MP Biomedical，目錄號：6925-500)中並使用600 µL/試樣之RIPA緩衝液(Boston Bio Products，目錄號：BP-115)加上新添加之蛋白酶抑制劑混合物(由全蛋白酶抑制劑混合劑(Sigma，目錄號：116974500)組成)裂解，且在5.0 m/sec下均質化。然後將試樣在14,000 RPM及4℃下離心10 min.且將液體轉移至新管中。在14,000 RPM下實施最終離心10 min.且使用如上文所闡述之Bradford分析量化試樣。
實施西方印漬以評價LDHA蛋白含量。混合裂解物與Laemmli緩衝液並在95℃下變性10分鐘。使用NuPage系統在10% Bis-Tris凝膠(Thermo Fisher Scientific，目錄號：NP0302BOX)上根據製造商方案來運行印漬，隨後濕轉移於0.45 µm硝基纖維素膜(Bio-Rad，目錄號：1620115)上。然後，使用水充分沖洗轉移膜並使用Ponceau S溶液(Boston Bio Products，目錄號：ST-180)染色以證實完全且均勻地轉移。在室溫下於實驗室振盪器上使用5%奶粉於TBS中阻斷印漬30分鐘。使用TBST沖洗印漬物並使用兔α-LDHA多株抗體(Sigma，目錄號：SAB2108638，用於細胞溶解物；或Genetex，目錄號：GTX101416，用於小鼠肝溶解物)以1:1000在TBST中進行探測。對於使用活體外細胞溶解物之印漬而言，以1:1000於TBST中使用β-肌動蛋白作為加載對照(Novus，目錄號：NB600-501)並同時與LDHA一級抗體一起培育。對使用活體內小鼠肝提取物之印漬而言，以1:1000在TBST中使用GAPDH作為加載對照(Abcam, ab8245)並同時與LDHA一級抗體一起培育。將印漬物密封於袋中並在4℃下於實驗室振盪器上保持過夜。在培育之後，將印漬物在TBST中沖洗3次(各5分鐘)且使用小鼠及兔二級抗體(Thermo Fisher Scientific，目錄號：PI35518及PISA535571)各自以1:12,500在室溫下於TBST中探測30分鐘。在培育之後，將印漬物在TBST中沖洗3次(各5分鐘)且使用PBS沖洗2次。目測印漬物並使用Licor Odyssey系統分析。
藉由免疫組織化學染色實施之乳酸脫氫酶A (LDHA)蛋白分析
對於小鼠肝之目測LDHA蛋白分析而言，在Lecia Bond Rxm上實施標準免疫組織化學染色。對於抗原修復(HIER)而言，將載玻片在94℃下於 pH 9 EDTA基緩衝液中加熱25分鐘，隨後以1:500實施抗體培育30分鐘(Abcam目錄編號：Ab52488)。使用與HRP偶聯之二級聚合物檢測抗體結合，隨後使用二胺基聯苯胺實施顯色可視化。
小鼠肌肉及肝之LDH活性之量測
使用生物化學方法(例如Wood KD等人，Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2019 Sep 1;1865(9):2203-2209；PMC6613992)來分析乳酸脫氫酶活性。為量測乳酸脫氫酶活性，使用探針超音波處理將組織在冰冷裂解緩衝液(25mM HEPES, pH 7.3, 0.1% Triton-X-100)中均質化以得到10% wt/vol溶解物。藉由340nm下吸光度之增加及在乳酸鹽存在下NAD至NADH之還原來量測LDH活性。使用20mM乳酸鹽、100mM Tris-HCL (pH 9.0)、2mM NAD+、0.01%肝溶解物量測LDG之乳酸鹽至丙酮酸鹽活性。使用Cooomassie Plus蛋白質分析套組(Pierce, Rockford, IL) (使用牛血清白蛋白(BSA)作為標準物)來測定組織溶解物中之蛋白質濃度。
小鼠試樣之草酸鹽、肌酸酐、丙酮酸鹽及乳酸鹽之量測
對於草酸鹽測定而言，在儲存於-80℃下之前，使用HCl將尿收集部分酸化至pH介於1與2之間以防止任何可發生於冷儲存時之可能草酸鹽結晶及/或與鹼化有關之草酸生成。將剩餘未酸化尿冷凍於-80℃下以用於量測肌酸酐。經由使用10,000標稱分子量限值之Nano-sep離心過濾器(VWR International, Batavia, IL)過濾血漿製劑以去除大分子，然後實施離子層析以及質譜或ICMS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)。使用10 mM HCl洗滌離心過濾器，然後過濾試樣以去除捕集於過濾裝置中之任何污染性痕量有機酸。使用10% (wt/vol)三氯乙酸(TCA)提取肝組織以用於有機酸分析。在去除TCA後藉由以下方式藉由ICMS量測該等有機酸：使用等體積之1,1,2-三氯三氟乙烷(Freon)-三辛基胺(3:1, vol/vol；Aldrich, Milwaukee, WI)劇烈渦旋，在4℃下離心以促進相分離，且收集上部水層用於分析。在化學分析儀上量測尿肌酸酐，且藉由ICMS量測尿草酸鹽，如先前所闡述。
使用選定離子監測(SIM)在下列質/荷比及錐電壓下量化乳酸鹽(SIM 89.0, 35 V)及13C3-乳酸鹽(SIM 92.0, 35 V)。藉由IC/MS使用AS11-HC陰離子交換管柱(4 μm, 2 × 150 mm，在30℃之受控溫度下)及Dionex™ ERS™ 500陰離子電解再生性抑制劑量測丙酮酸鹽。使用0.5 mM至80 mM KOH之梯度(60 min，流速為0.38 ml/min)來分離試樣陰離子。以ESI負模式使用1.5 V針電壓、500℃源溫度來操作質譜儀(MSQ-PLUS)，且在進入MSQ之前使用0死體積混合三通以0.38 ml/min混合管柱洗脫劑與50%乙腈。使用選定離子監測(SIM)在下列質/荷比及錐電壓下測得丙酮酸鹽(SIM 87.0, 30 V)。
實例2 -篩選及嚮導量化
原代肝細胞中之LDHA嚮導之交叉篩選
將靶向人類LDHA 之嚮導及與食蟹猴LDHA 同源者轉染至原代人類(經由RNP轉染)及食蟹猴肝細胞(經由RNP電穿孔)中，如實例1中所闡述。在每一細胞類型中測定包括每一嚮導序列之sgRNA之編輯百分比。表1中之嚮導序列在兩種細胞系中之篩選數據列示於下文中(表4-5)。
表4展示一式兩份試樣中以RNP形式轉染至原代人類肝細胞中之LDHA 之編輯%、插入(Ins) %及缺失(Del) %之平均值及標準偏差。N=2。
表 4 ： 經由 RNP 轉染遞送至原代人類肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 平均編輯% 編輯%標準偏差 平均Ins % Ins %標準偏差 平均Del % Del %標準偏差
G009440 9.50 4.10 2.45 0.92 7.05 3.18
G012089 38.15 3.18 12.10 0.14 26.00 3.25
G012090 11.85 3.89 1.45 0.49 10.60 3.39
G012092 22.75 2.76 4.00 0.14 19.65 2.62
G012093 34.60 0.28 8.95 0.21 25.60 0.42
G012094 20.50 0.42 14.30 0.85 6.35 1.34
G012095 28.45 2.33 3.50 0.71 25.00 2.97
G012096 32.30 0.42 0.70 0.00 31.75 0.49
G012097 24.65 1.34 3.95 1.06 20.75 2.33
G012098 6.25 1.77 2.10 0.57 4.30 1.13
G012099 12.20 1.84 5.10 0.85 7.10 0.99
G012100 9.40 1.13 6.95 0.78 2.45 0.35
G012101 3.60 0.85 1.45 0.35 2.15 0.49
G012103 34.90 3.11 2.30 0.00 32.70 3.25
G012104 5.85 2.33 0.25 0.21 5.60 2.12
G012105 23.45 0.78 8.45 0.49 15.15 1.34
G012106 5.80 1.56 1.60 0.14 4.20 1.41
G012107 2.85 0.21 0.75 0.21 2.20 0.28
G012108 14.50 0.57 0.80 0.14 13.75 0.64
G012109 12.40 0.71 0.65 0.07 11.80 0.71
G012110 12.00 1.98 3.85 0.49 8.35 1.48
G012111 27.20 0.28 16.40 0.14 10.85 0.07
G012112 3.85 1.34 0.95 0.35 2.95 1.06
G012113 9.45 2.62 2.05 1.06 7.40 1.56
G012114 7.05 0.78 1.95 0.07 5.10 0.85
G012115 31.10 7.64 12.40 3.25 18.90 4.24
G012116 12.55 1.34 4.85 0.07 7.80 1.41
G012117 10.40 1.41 3.40 0.00 7.40 1.56
G012118 21.95 3.32 2.35 0.35 19.60 2.97
G012119 15.50 3.68 0.50 0.14 14.95 3.46
G012120 22.05 4.88 1.70 0.71 20.45 4.31
G012121 10.90 0.28 3.45 0.21 7.65 0.64
G012122 2.60 0.28 0.40 0.00 2.20 0.28
G012123 6.80 0.85 1.90 0.14 4.90 0.71
G012124 10.90 2.40 1.30 0.14 9.70 2.26
G012125 6.10 0.42 0.85 0.21 5.35 0.64
G012126 1.85 0.21 0.50 0.00 1.35 0.21
G012127 10.05 1.20 0.85 0.21 9.30 1.41
G012128 6.20 0.14 1.05 0.21 5.20 0.28
G012129 6.40 0.71 0.45 0.07 6.00 0.57
G012130 1.00 0.14 0.55 0.07 0.55 0.07
G012131 3.15 0.21 0.70 0.28 2.55 0.35
G012132 17.90 1.84 11.50 2.12 6.45 0.21
G012133 23.45 0.64 6.70 0.14 16.75 0.49
G012134 4.45 0.07 1.70 0.00 2.85 0.07
G012135 16.80 0.71 4.30 0.42 12.60 0.42
G012136 38.65 0.92 0.90 0.00 37.80 0.99
G012137 1.10 0.28 0.30 0.14 0.80 0.14
G012138 17.35 3.75 4.70 0.99 12.85 2.76
G012139 6.30 0.57 0.45 0.35 5.85 0.21
G012140 14.65 2.33 4.30 1.84 10.45 0.49
G012141 0.95 0.07 0.35 0.07 0.65 0.07
G012142 32.35 0.92 30.85 1.06 19.55 0.64
G012143 3.35 0.07 1.75 0.07 1.60 0.00
G012149 17.65 0.35 1.50 0.57 16.20 0.14
G012150 12.65 0.64 9.50 0.85 3.20 0.14
G012151 12.90 0.14 6.70 0.14 6.25 0.21
G012152 4.80 0.14 0.80 0.14 4.10 0.00
G012154 11.45 2.90 4.85 1.06 6.65 1.91
G012156 7.85 1.34 3.70 0.42 4.30 0.85
G012158 10.90 1.56 2.20 0.57 8.70 0.99
G012159 11.35 0.49 2.35 0.07 9.10 0.57
G012160 10.40 0.42 2.00 0.28 8.45 0.07
G012162 3.95 0.49 1.75 0.35 2.30 0.14
G012165 27.95 3.04 1.40 0.71 26.55 2.47
G012167 27.95 1.06 18.70 0.57 9.35 0.49
G012168 9.90 1.27 0.50 0.28 9.50 0.99
G012169 20.20 2.97 4.05 0.78 16.30 2.12
G012171 19.15 1.34 2.90 0.71 16.40 0.57
G012172 15.85 2.47 2.15 0.35 13.85 2.19
G012173 11.10 0.14 6.60 0.14 4.55 0.07
表5展示使用RNP電穿孔至原代食蟹猴肝細胞中之所測試LDHA sgRNA之編輯%、插入(Ins) %及缺失(Del) %之平均值及標準偏差。N=2。
表 5 ： 經由 RNP 電穿孔遞送至原代食蟹猴肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 平均編輯 % 編輯 % 標準偏差 平均 Ins % Ins % 標準偏差 平均 Del % Del % 標準偏差
G012090 11.40 8.34 0.20 0.14 11.30 8.20
G012143 4.75 0.92 2.25 0.07 2.60 0.85
G012145 4.10 1.70 0.15 0.07 3.95 1.63
G012146 9.60 2.69 3.50 1.70 6.20 1.13
G012147 0.20 0.00 0.00 0.00 0.15 0.07
G012148 36.30 1.70 12.80 0.28 23.90 1.56
G012149 31.00 3.82 1.30 0.00 29.65 3.75
G012150 30.35 19.16 18.60 14.00 11.95 5.16
G012151 65.05 4.45 36.60 2.26 28.50 2.12
G012152 19.50 0.14 0.55 0.21 19.05 0.21
G012153 0.90 0.42 0.05 0.07 0.85 0.35
G012154 47.50 0.99 28.60 3.68 19.00 2.55
G012155 65.55 3.32 2.25 0.21 63.65 3.18
G012156 17.60 9.05 3.05 0.92 14.55 8.27
G012157 42.80 6.36 7.70 0.28 35.10 6.65
G012158 31.95 17.47 4.35 3.04 27.70 14.57
G012159 44.70 1.41 3.60 0.28 41.10 1.13
G012160 34.70 1.70 7.55 0.78 27.20 2.40
G012161 25.75 6.58 5.75 3.18 20.20 3.39
G012162 14.50 3.82 6.55 0.35 8.10 3.54
G012163 28.30 4.53 0.40 0.00 28.00 4.53
G012164 57.85 2.33 3.65 0.35 54.20 2.69
G012165 42.75 14.07 1.30 0.14 41.45 13.93
G012166 57.55 5.30 39.70 3.11 17.90 2.12
G012167 47.95 12.94 23.50 6.65 24.70 6.08
G012168 21.80 N/A 0.10 N/A 21.80 N/A
G012169 58.25 5.73 2.50 0.57 55.85 5.30
G012170 17.55 4.60 5.40 0.42 12.15 4.17
G012171 49.25 9.83 6.75 3.04 42.55 6.86
G012172 19.10 3.68 1.45 0.35 17.65 3.32
G012173 21.35 8.27 7.75 3.18 13.65 5.16
表6展示使用脂轉染在30nM sgRNA濃度下所測試LDHA sgRNA在原代食蟹猴肝細胞中之多個染色體位置之編輯%之平均值及標準偏差。N=2。
表 6 ： 遞送至原代食蟹猴肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 Chr12 平均編輯 % Chr12 編輯 % 標準偏差 Chr14 平均編輯 % Chr14 編輯 % 標準偏差 Chr17 平均編輯 % Chr17 編輯 % 標準偏差
G015538 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015539 0.0 0.0 19.4 3.5 0.0 0.0
G015540 0.0 0.0 34.6 0.5 0.0 0.0
G015541 59.3 6.7 0.0 0.0 59.3 5.4
G015542 0.0 0.0 0.0 0.0 31.7 1.1
G015543 0.0 0.0 27.0 1.6 0.0 0.0
G015544 0.0 0.0 7.6 0.8 0.0 0.0
G015545 0.0 0.0 9.3 1.7 0.0 0.0
G015546 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015547 0.0 0.0 58.6 4.2 0.0 0.0
G015548 0.0 0.0 32.5 4.0 0.0 0.0
G015549 0.0 0.0 9.4 5.1 0.0 0.0
G015550 15.0 4.2 0.0 0.0 15.9 4.3
G015551 0.0 0.0 6.7 3.5 0.0 0.0
G015552 25.7 16.6 0.0 0.0 26.7 16.0
G015553 21.6 0.0 0.0 0.0 25.1 9.7
G015554 0.0 0.0 20.4 7.4 0.0 0.0
G015555 0.0 0.0 32.3 14.0 0.0 0.0
G015556 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015557 0.0 0.0 8.6 5.3 4.0 0.0
G015558 0.0 0.0 15.9 11.2 0.0 0.0
G015559 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015560 0.0 0.0 36.7 0.0 0.0 0.0
G015561 0.0 0.0 42.1 0.0 0.0 0.0
G015562 51.6 0.0 0.0 0.0 43.8 0.0
G015563 37.2 0.0 0.0 0.0 38.3 0.0
G015564 44.9 0.0 0.0 0.0 40.2 0.0
G015565 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015566 35.6 0.0 0.0 0.0 36.5 0.0
G015567 0.0 0.0 3.6 0.0 0.0 0.0
G015568 0.0 0.0 10.3 3.0 0.0 0.0
G015569 0.0 0.0 22.6 0.9 0.0 0.0
G015570 0.0 0.0 17.4 1.0 0.0 0.0
G015571 0.0 0.0 98.0 0.2 0.0 0.0
G015572 0.0 0.0 14.7 0.7 0.0 0.0
G015573 0.0 0.0 7.6 2.0 0.0 0.0
G015574 0.0 0.0 15.8 3.8 0.0 0.0
G015575 0.0 0.0 0.0 0.0 27.0 4.2
G015576 0.0 0.0 0.0 0.0 16.5 2.5
G015577 0.0 0.0 0.0 0.0 27.8 5.4
G015578 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015579 41.4 1.0 0.0 0.0 42.2 1.9
G015580 17.4 0.0 0.0 0.0 24.2 1.6
G015581 6.2 0.5 0.0 0.0 6.3 0.1
G015582 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015583 0.0 0.0 27.8 2.2 0.0 0.0
G015584 0.0 0.0 6.5 0.0 0.0 0.0
G015585 0.0 0.0 4.3 1.3 0.0 0.0
G015586 0.0 0.0 20.5 0.8 15.0 1.1
G015587 0.0 0.0 40.6 3.2 0.0 0.0
G015588 0.0 0.0 21.2 1.2 0.0 0.0
G015589 0.0 0.0 22.4 0.8 0.0 0.0
G015590 0.0 0.0 29.3 4.3 0.0 0.0
G015591 0.0 0.0 38.8 2.3 0.0 0.0
G015592 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015593 0.0 0.0 9.8 1.3 0.0 0.0
G015594 0.0 0.0 41.4 6.4 0.0 0.0
G015595 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015596 0.0 0.0 5.1 2.7 0.0 0.0
G015597 0.0 0.0 12.1 2.2 0.0 0.0
G015598 0.0 0.0 25.6 3.5 0.0 0.0
G015599 0.0 0.0 25.6 1.8 0.0 0.0
G015600 35.9 4.7 0.0 0.0 38.4 7.6
G015601 23.6 0.6 0.0 0.0 24.1 1.1
G015602 0.0 0.0 37.6 1.7 0.0 0.0
G015603 0.0 0.0 17.7 0.3 0.0 0.0
G015604 53.5 7.2 0.0 0.0 72.6 2.5
G015605 12.3 2.8 0.0 0.0 13.5 1.2
G015606 30.5 0.8 0.0 0.0 27.3 1.6
G015607 10.9 2.9 0.0 0.0 11.5 0.5
G015608 0.0 0.0 0.0 0.0 20.3 1.5
G015609 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0 0.0
G015610 0.0 0.0 29.5 0.3 0.0 0.0
G015611 0.0 0.0 14.8 1.0 0.0 0.0
G015612 0.00 0.00 2.00 0.00 22.90 0.00
G015613 0.00 0.00 32.90 0.85 33.90 2.55
G015614 0.00 0.00 0.00 0.00 12.25 0.64
G015615 0.00 0.00 0.00 0.00 30.05 1.91
G015616 0.00 0.00 0.00 0.00 5.25 0.21
G015617 0.00 0.00 0.00 0.00 36.15 0.64
G015618 0.00 0.00 0.00 0.00 8.75 0.92
G015619 2.45 0.35 0.00 0.00 3.85 0.49
G015620 0.00 0.00 0.00 0.00 18.25 2.90
G015621 0.00 0.00 0.00 0.00 46.70 0.71
G015622 41.60 2.83 3.05 1.06 0.00 0.00
G015623 15.60 0.42 1.15 0.35 0.00 0.00
G015624 0.00 0.00 1.70 0.57 0.00 0.00
G015625 0.00 0.00 0.00 0.00 22.50 1.70
G015626 0.00 0.00 0.00 0.00 50.45 1.48
G015627 0.00 0.00 0.00 0.00 24.60 0.85
G015628 0.00 0.00 0.00 0.00 8.70 1.27
G015629 0.00 0.00 0.00 0.00 50.55 0.07
G015630 17.10 0.28 0.00 0.00 0.00 0.00
基於原代人類及原代食蟹猴肝細胞編輯數據，進一步評估嚮導序列之子組。此子組提供於表7及8中，其中相應編輯數據係來自再現之原代肝細胞篩選。
表 7 ： 選擇用於進一步在 PHH 中分析之原代人類肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 編輯 % ( 來自上文表 4)
G012089 38.15
G012093 34.60
G012095 28.45
G012096 32.30
G012103 34.90
G012111 27.20
G012115 31.10
G012120 22.05
G012133 23.45
G012136 38.65
表 8 ： 選擇用於進一步在 PCH 中分析之原代食蟹猴肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 編輯 % ( 來自上文表 5)
G012151 65.05
G012155 65.55
G012157 42.8
G012159 44.7
G012162 14.5
G012164 57.85
G012165 42.75
G012166 57.55
G012167 47.95
G012169 58.25
LDHA嚮導之脫靶分析
使用生物化學方法(例如參見Cameron等人，Nature Methods. 6, 600-606；2017)來測定藉由靶向LDHA 之Cas9裂解之潛在脫靶基因體位點。在此實驗中，使用經分離HEK293基因體DNA篩選10個靶向人類LDHA 之經修飾sgRNA (及兩個具有已知脫靶特徵之對照嚮導)且潛在脫靶結果繪示於圖1中。該分析鑑別所測試sgRNA之潛在脫靶位點。
用於驗證潛在脫靶位點之靶向測序
在已知脫靶檢測分析(例如上文所使用之生物化學方法)中，通常有意地回收大量潛在脫靶位點，以「廣泛搜集(cast a wide net)」可在其他環境(例如所關注原代細胞)中驗證之潛在位點。舉例而言，生物化學方法通常過度代表潛在脫靶位點之數量，此乃因該分析利用不含細胞環境之經純化高分子量基因體DNA且依賴於所用Cas9 RNP之劑量。因此，藉由該等方法鑑別之潛在脫靶位點可使用所鑑別潛在脫靶位點之靶向測序來進行驗證。
在一種方式中，使用包括Cas9 mRNA及所關注sgRNA (例如具有用於評估之潛在脫靶位點之sgRNA)之LNP處理原代肝細胞。然後裂解原代肝細胞且使用側接於潛在脫靶位點之引子來生成用於NGS分析之擴增子。鑑別出某一程度之插入缺失可驗證潛在脫靶位點，而缺乏發現於潛在脫靶位點處之插入缺失可指示所利用脫靶分析中之假陽性。
含有Spy Cas9 mRNA及sgRNA之脂質奈米顆粒(LNP)調配物在原代人類及食蟹猴肝細胞中之交叉篩選
在原代人類肝細胞及原代食蟹猴肝細胞中以劑量反應分析來測試靶向人類LDHA 之經修飾sgRNA及與食蟹猴LDHA 同源者之脂質奈米顆粒(LNP)調配物。如實例1中所闡述來調配LNP。如實例1中所闡述來平鋪原代人類及食蟹猴肝細胞。在使用LNP處理之前，將兩種細胞系在37℃、5% CO2 下培育48小時。將LNP在37℃下於含有 6%食蟹猴血清之培養基中培育10分鐘。在培育後，以8點3倍劑量反應曲線自300ng Cas9 mRNA開始將LNP添加至人類或食蟹猴肝細胞中。在處理後96小時裂解細胞以用於如實例1中所闡述之NGS分析。嚮導序列在兩種細胞系中之劑量反應曲線數據展示於圖2及3中。22 nM濃度下之編輯百分比列示於下文之表9及10中。
表9展示經由LNP與Spy Cas9 一起遞送於原代人類肝細胞中之22 nM經測試LDHA sgRNA之編輯%、插入(Ins) %及缺失(Del) %之平均值及標準偏差。一式兩份生成該等試樣。
表 9 ： 經由 LNP 以 22 nM ( 關於 sgRNA 負荷之濃度 ) 遞送至原代人類肝細胞中之 sgRNA/Cas9 mRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 平均編輯% 編輯%標準偏差 平均Ins % Ins %標準偏差 平均Del % Del %標準偏差 EC50
G012089 69.10 4.95 22.65 3.04 46.50 1.98 90.93
G012093 89.30 0.99 20.75 0.64 68.65 1.48 30.85
G012095 76.75 2.19 8.70 0.14 68.20 2.40 71.83
G012096 82.00 2.55 1.90 0.42 80.10 2.12 53.27
G012103 84.30 0.00 5.65 1.20 78.75 1.20 8.73
G012111 67.80 2.83 32.95 2.62 34.90 0.14 63.84
G012115 80.05 3.46 34.65 1.91 45.55 1.48 50.98
G012120 74.15 1.91 5.20 1.27 69.00 0.71 48.93
G012133 75.25 1.20 24.55 1.20 50.75 2.33 55.54
G012136 86.50 0.71 1.45 0.07 85.10 0.85 18.54
表10展示經由LNP與Spy Cas9 一起遞送於原代食蟹猴肝細胞中之22 nM經測試LDHA sgRNA之編輯%、插入(Ins) %及缺失(Del) %之平均值及標準偏差。一式三份生成該等試樣。
表 10 ： 經由 LNP 以 22 nM ( 關於 sgRNA 負荷之濃度 ) 遞送至原代食蟹猴肝細胞中之 sgRNA/Cas9 mRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 平均編輯 % 編輯 % 標準偏差 平均 Ins % Ins % 標準偏差 平均 Del % Del % 標準偏差 EC50
G012151 94.87 0.12 78.50 1.39 16.77 1.33 0.599
G012155 96.93 0.23 7.17 0.15 90.83 0.31 0.255
G012157 77.43 3.33 31.77 1.76 46.80 2.17 1.111
G012159 87.73 1.02 20.47 3.37 67.93 3.11 0.950
G012162 95.17 0.64 28.77 0.25 67.17 0.99 0.801
G012164 78.80 0.17 10.17 0.31 69.10 0.20 0.637
G012165 83.40 2.20 14.87 0.83 69.27 2.72 0.953
G012166 97.47 0.38 82.00 2.07 16.03 2.15 0.250
G012167 96.63 0.29 70.37 0.90 27.87 1.29 0.297
G012169 95.13 1.29 19.77 2.15 75.97 1.06 0.438
使用脂轉染在原代食蟹猴肝細胞中交叉篩選Spy Cas9 mRNA及sgRNA。在原代食蟹猴肝細胞中以劑量反應分析來測試靶向LDHA 之經修飾sgRNA。如實例1中所闡述來製備脂轉染試樣。如實例1中所闡述來平鋪原代食蟹猴肝細胞。在脂轉染之前，將細胞在37℃、5% CO2 下培育48小時。將脂轉染試樣在37℃下於含有 6%食蟹猴血清之培養基中培育10分鐘。在培育後，以8點3倍劑量反應曲線自53 nM sgRNA開始將脂轉染試樣添加至食蟹猴肝細胞中(n=2)。在處理後96小時裂解細胞以用於如實例1中所闡述之NGS分析。嚮導序列之劑量反應曲線數據展示於圖12A-12C中。53 nM濃度下之編輯%列示於下文之表11中。
表 11 ： 經由脂轉染以 53 nM sgRNA 遞送至原代食蟹猴肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導 編號 Chr 12 平均編輯 % Chr 12 平均編輯 % 標準偏差 Chr 12 EC50 Chr 14 平均編輯 % 平均 Chr 14 編輯 % 標準偏差 Chr 14 EC50 Chr 17 平均編輯 % Chr 17 平均編輯 % 標準偏差 Chr 17 EC50
G012113 60.0 8.9 5.1 61.5 16.5 5.9 70.1 6.6 4.6
G015541 75.4 14.4 4.4 NA NA NA 85.4 8.7 4.0
G015547 69.8 5.7 6.8 76.0 1.1 7.5 76.2 3.5 7.6
G015561 NA NA NA 58.3 7.0 6.5 60.3 4.7 7.1
G015571 52.3 9.1 14.7 NA NA NA 68.1 6.6 10.2
G015587 70.8 8.5 9.2 78.0 9.2 9.3 80.3 8.1 8.7
G015591 74.6 1.1 8.3 72.3 2.8 8.6 77.9 1.1 6.9
G015594 51.3 3.5 6.8 67.2 6.6 6.1 70.2 5.4 6.7
G015622 66.3 6.9 4.5 4.9 0.3 5.0 NA NA NA
實例3.表型分析
細胞內乳酸脫氫酶A之西方印漬分析
將靶向人類LDHA 之經修飾sgRNA之脂質奈米顆粒(LNP)調配物投與原代人類肝細胞中以生成用於西方印漬之試樣。如實例1中所闡述來調配LNP。如實例1中所闡述來平鋪原代人類肝細胞。在使用LNP處理之前，將細胞在37℃、5% CO2 下培育48小時。將LNP在37℃下於含有 6%食蟹猴血清之培養基中培育10分鐘。在培育後，將LNP以25nM sgRNA/試樣之濃度添加至人類肝細胞中。在轉染後96小時，收集一部分細胞並處理以用於如實例1中所闡述之NGS測序。在轉染後21天收穫剩餘細胞且製備全細胞提取物(WCE)並如實例1中所闡述藉由西方印漬實施分析。
該等細胞之編輯數據提供於表12中。
表 12 ： 遞送至原代人類肝細胞中之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 PHH 中之編輯頻率
G012089 0.871
G012093 0.961
G012095 0.926
G012096 0.93
G012103 0.882
G012111 0.886
G012115 0.933
G012120 0.895
G012133 0.915
G012136 0.895
藉由西方印漬分析WCE之LDHA蛋白減少。全長LDHA蛋白具有332個胺基酸且預測分子量為36.6 kD。在對照泳道(未處理細胞)中觀察到此分子量下之帶，但在任一處理泳道(圖4)中則未觀察到。
乳酸脫氫酶A之轉錄分析
藉由脂轉染將靶向LDHA 之所選經修飾sgRNA投與原代人類及食蟹猴肝細胞中以生成用於qPCR之試樣。如實例1中所闡述來調配脂轉染試樣。如實例1中所闡述來平鋪原代肝細胞。在使用脂質包處理之前，將細胞在37℃、5% CO2 下培育48小時。將脂轉染試樣在37℃下於含有 6%食蟹猴血清之培養基中培育10分鐘。在培育後，將脂質包以多個濃度添加至肝細胞中。在脂轉染後96小時，收集細胞並如實例1中所闡述處理RNA。在15nM嚮導下原代人類及食蟹猴肝細胞中之平均LDHA轉錄物減少含於下文表13內，其中全劑量-反應數據顯示於圖13A-13B中。
表 13 ： 在 15nM sgRNA 下原代人類及食蟹猴肝細胞中之平均相對 LDHA 減少
原代人類肝細胞 原代食蟹猴肝細胞
嚮導編號 LDHA 表現之平均相對減小 LDHA 表現之平均相對減小之標準偏差 LDHA 表現之平均相對減小 LDHA 表現之平均相對減小之標準偏差
G012113 0.55 0.03 0.82 0
G012115 0.76 0.01 0.88 0.01
G012120 0.73 0 0.72 0.03
G012133 0.61 0.01 0.55 0.03
G015541 0.7 0.01 0.88 0.03
G015547 NA NA 0.79 0.02
G015561 0.56 0.01 0.85 0.01
G015622 NA NA 0.82 0.01
實例4. PH1小鼠模型中之活體內Ldha 編輯
在此研究中使用野生型及AGT缺陷型小鼠(Agxt1 -/- ) (例如缺乏肝AGXT mRNA及蛋白質之無突變小鼠)。AGT缺陷型小鼠展現高草酸鹽尿症及結晶尿且由此代表PH1之表型模型，如先前由Salido等人，Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Nov 28;103(48):18249-54所闡述。使用野生型小鼠來確定在AGT缺陷型小鼠中測試何種調配物。
在調配LNP之前，類似於實例2中針對靶向人類及食蟹猴LDHA 之gRNA所闡述，針對編輯效率來篩選包括靶向鼠類Ldha 之dgRNA之RNP。在已自dgRNA篩選鑑別出活性gRNA之情形下，合成較小組之基於該等gRNA之經修飾sgRNA以用於進一步在活體內評估。
將動物稱重且根據體重分組以用於基於組平均重量來製備投藥溶液。經由側向尾部靜脈以0.2 mL/動物之體積(大約10 mL/公斤體重)來投用含有靶向鼠類Ldha 之經修飾sgRNA (參見下文表14)之LNP。如實例1中所闡述來調配LNP。在治療後一週，對野生型小鼠實施安樂死且收集肝組織以用於提取DNA且分析鼠類Ldha 之編輯。如下文表14中所展示，在經治療小鼠中觀察到劑量依賴性編輯程度。
表 14 ： 靶向鼠類 Ldha 之 sgRNA 之 LDHA 編輯數據
嚮導編號 sgRNA 序列 (* = PS 鍵聯；「 m 」 = 2'-O-Me 核苷酸 ) 劑量 (mpk ， 總 RNA 負荷 ) 平均編輯 % 編輯 % 標準偏差 n
G009438 mG*mU*mU*CACGCGCUGAGCUGUCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:86) 0.3 19.20 7.01 5
1 59.08 9.83 5
3 74.54 0.74 5
G009439 mG*mG*mG*GGCCCGUCAGCAAGAGGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:87) 0.3 9.40 2.75 5
1 37.56 9.30 5
3 65.94 5.37 5
G009442 mG*mU*mU*GCAAUCUGGAUUCAGCGGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:88) 0.3 15.90 1.74 5
1 49.98 7.41 5
3 68.40 3.85 5
G009445 mG*mU*mC*AUGGAAGACAAACUCAAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:89) 0.3 12.40 4.60 5
1 47.62 10.11 5
3 62.10 4.06 5
G009447 mA*mC*mU*GGGCACUGACGCAGACAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:90) 0.3 9.48 4.78 5
1 40.88 11.07 5
3 66.10 4.69 5
在已確定LNP可在活體內編輯小鼠Ldha 基因之情形下，以劑量反應形式(0、0.25、0.5、1及2 mpk，關於總mRNA負荷)將含有G009439之LNP投與AGT缺陷型小鼠。將該等小鼠飼養於代謝籠中且在各個時間點收集尿以用於分析草酸鹽含量，例如如由Liebow等人，J Am Soc Nephrol. 2017 Feb;28(2):494-503所闡述。使用增加劑量之LNP展示分別可增加及降低Ldha 基因編輯及草酸鹽分泌。編輯%及所排泄ug尿草酸鹽/mg肌酸酐含於下文表15內且顯示於圖14A-14C中。
表 15 ： 在將含有 G009439 之 LNP 投與 AGT 缺陷型小鼠之後之編輯 % 及所排泄 ug 尿草酸鹽 /mg 肌酸酐。
治療 平均編輯 % 平均編輯 % 標準偏差 平均 ug 尿草酸鹽 /mg 肌酸酐 平均尿草酸鹽 /mg 肌酸酐標準偏差 n
TSS 0.0 0.0 357.3 63.4 3
0.25 mpk Ldha 28.7 10.7 287.2 45.0 3
0.5 mpk Ldha 62.5 2.0 176.4 4.9 3
1 mpk Ldha 81.6 3.8 117.3 13.4 3
2 mpk Ldha 85.5 0.2 122.2 11.5 2
在確定LNP可減小活體內草酸鹽分泌之後，以關於總mRNA負荷2 mpk之劑量將含有G009439之LNP投與AGT缺陷型小鼠(n=4)。如圖5中所展示，尿草酸鹽含量在治療後一週有所減小且此減小程度持續至投藥後至少5週，然後終止研究。在對照(注射PBS)動物(n=4)中未觀察到減小。每一治療動物中之編輯百分比報告於表16中，且治療後每週之尿草酸鹽減小%展示於表18中。
在相同研究中，亦向AGT缺陷型小鼠投用含有靶向鼠類Hao1 之sgRNA (G000723)之LNP (以2 mpk之劑量(n=4))。如亦在圖5及表17中所展示，在使用包括此gRNA之LNP治療後一週草酸鹽含量有所減小，且此減小程度持續至投藥後至少5週。
G000723: mC*mA*mC*GUGAGCCAUGCACUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (SEQ ID NO:85) * = PS鍵聯；「m」 = 2'-O-Me核苷酸
表 16 ： 以 2mpk 使用包括 LDHA 靶向 gRNA (G009439) 之 LNP 治療之 AGXT -/- 小鼠之編輯結果
小鼠編號 編輯 % 插入 % 缺失 %
1 90.8 1.1 89.7
2 86.1 1.3 84.8
3 90.5 1.1 89.4
4 90.3 1.2 89.2
表 17 ： 以 2mpk 使用包括 HAO1 靶向 gRNA (G000723) 之 LNP 治療之 AGXT -/- 小鼠之編輯結果
小鼠編號 編輯 % 插入 % 缺失 %
1 71.1 47.7 23.4
2 83.1 56 27.1
3 81.5 52.8 28.7
4 83.7 54.9 28.8
表 18 ： 以 2mpk ( 關於總 RNA 負荷 ) 使用包括 LDHA 靶向 gRNA (G009439) 之 LNP 治療之 AGXT -/- 小鼠在 5 週內之平均草酸鹽含量及自基線之減小 % 。 N=4
收集日期 平均 ug 草酸鹽 /mg 肌酸酐 平均減小 % ug 草酸鹽 /mg 肌酸酐
基線 407 0.00
第1週 272 33.18
第2週 182 55.25
第3週 168 58.59
第4週 146 64.11
第5週 142 65.11
在已證實在LNP治療之後AGT缺陷型小鼠中之尿草酸鹽減少持續最長5週之情形下，實施其他研究以追蹤尿草酸鹽至投藥後最長15週。以0.3 mpk (n=4)及1 mpk (n=4)之劑量將含有G009439之LNP投與AGT缺陷型小鼠。將該等小鼠飼養於代謝籠中且在各個時間點收集尿以用於分析草酸鹽含量，如上文所闡述。表19展示AGT缺陷型小鼠之編輯結果。在0.3 mpk劑量下達成之平均編輯%為33.42，標準偏差為11.95。在1 mpk劑量下達成之平均編輯%為75.68，標準偏差為7.35。如圖6中所展示，在治療後尿草酸鹽含量有所減小且此減小程度持續至投藥後15週，然後終止研究。圖6中所繪示之數據展示於表20中。在對照(注射PBS)動物(n=3)中未觀察到減小(數據未展示)。
如實例1中所闡述來處理來自經治療小鼠之肝試樣且運行於西方印漬分析中。使用Licor Odyssey Image Studio Ver 5.2軟體計算LDHA蛋白之減少百分比。使用GAPDH作為加載對照且使用LDHA同時探測。計算每一試樣內GAPDH之密度測定值與涵蓋LDHA帶之總區域相比之比率。在將該等比率正規化至陰性對照泳道之後測定LDHA蛋白之減少百分比。結果展示於表19中且繪示於圖7中。
經由免疫組織化學染色來進一步表徵經治療及未治療小鼠中之LDHA蛋白，如實例1中所闡述及圖8中所繪示。與對照小鼠相比，在0.3 mpk劑量小鼠及1mpk劑量小鼠中觀察到LDHA染色逐漸減少。圖9展示表19中之編輯與蛋白質含量之間之相關性，其中R2 值為0.95。
表 19. Agxt1-/- 小鼠模型編輯及蛋白質數據 ， 15 週研究
小鼠編號 mpk G009439 編輯 % 插入 % 缺失 % 剩餘 LDHA 蛋白 ( 相對於陰性對照 )
1 0.3 27.2 0.3 26.9 0.67
2 0.3 37.2 0.5 36.7 0.47
3 0.3 48.3 0.7 47.7 0.53
4 0.3 21.0 0.5 20.6 0.71
5 1 81.6 1.2 80.5 0.13
6 1 72.0 1.0 71.1 0.11
7 1 67.1 0.8 66.3 0.22
8 1 82.0 1.2 80.8 0.21
表 20. Agxt1-/- 小鼠模型平均尿草酸鹽 ( 對於每一劑量 ， n=4)
週 G009439 劑量 (mpk) 平均尿草酸鹽 (mg/g 肌酸酐 /24hr) 平均尿草酸鹽標準偏差
0 TSS 377.47 58.22
5 TSS 413.72 77.33
9 TSS 354.77 43.75
15 TSS 345.95 88.18
0 0.3 352.09 39.77
5 0.3 304.78 68.34
9 0.3 255.69 53.17
15 0.3 270.24 37.08
0 1.0 390.46 68.06
5 1.0 123.26 8.94
9 1.0 174.33 25.01
15 1.0 145.91 15.46
處理來自經治療小鼠之肝及肌肉試樣以分析LDH活性，如實例1中所闡述。在來自經1mpkLdha LNP治療之小鼠之肝試樣中觀察到LDH活性減小。經治療小鼠及對照小鼠之比活性(µmol/min/mg蛋白質)含於下文表21中且數據顯示於圖15A-15B中。
表 21 ： 肝及肌肉之比 LDH 活性
治療 平均比活性 (µmol/min/mg 蛋白質 ) - 肝 平均比活性標準偏差 (µmol/min/mg 蛋白質 ) - 肝 平均比活性 (µmol/min/mg 蛋白質 ) - 肌肉 平均比活性標準偏差 (µmol/min/mg 蛋白質 ) - 肌肉 n
TSS 0.8 0.1 1.9 0.2 3.0
陰性對照嚮導 0.8 0.1 1.8 0.2 3.0
0.3mpk Ldha嚮導 0.7 0.2 1.6 0.5 4.0
1mpk Ldha嚮導 0.2 0.1 1.8 0.1 4.0
亦分析來自經治療小鼠之肝及血漿試樣之丙酮酸鹽，如實例1中所闡述。丙酮酸鹽係藉由乳酸脫氫酶轉化成乳酸鹽之代謝物(Urbańska K等人，Int J Mol Sci. 2019 Apr 27;20(9))。已證實，來自1mpk治療小鼠之肝試樣中之丙酮酸鹽濃度有所升高，但在經治療小鼠與對照小鼠之間觀察到血漿丙酮酸鹽濃度具有較小差異。該等數據含於表22中且展示於圖16A-16B中。
表 22 ：肝及血漿之丙酮酸鹽量化
治療 平均肝丙酮酸鹽 (nmol/g 組織 ) 平均肝丙酮酸鹽標準偏差 (nmol/g 組織 ) 平均血漿丙酮酸鹽 (µM) 平均血漿丙酮酸鹽標準偏差 (µM) n
TSS 17.40 1.76 41.64 14.29 3
陰性對照嚮導 25.12 8.17 48.76 16.47 3
0.3mpk Ldha嚮導 19.11 3.58 71.64 10.20 4
1mpk Ldha嚮導 85.46 35.30 61.32 33.82 4
在已證實在LNP治療之後AGT缺陷型小鼠中之尿草酸鹽減少持續最長15週之情形下，實施其他研究以測定腎功能受損之小鼠在LDHA敲低之後清除乳酸鹽之能力。自Jackson實驗室(Bar Harbor, ME)獲得已經受5/6腎切除術或假手術之C51Bl6雄性小鼠。在手術後一週，對動物抽血以測定基線乳酸鹽含量，如實例1中所闡述。然後以2mpk (n=6)之劑量向動物投用含有G009439之LNP。在投藥後兩週，給予動物包括2g/kg溶於磷酸酯緩衝鹽水中之乳酸鈉(濃度為200mg/mL，約18mM，pH 7.4)之乳酸鹽攻擊，且經腹膜腔內遞送。在攻擊之前且然後在攻擊後15、30、60及180分鐘，自動物尾部抽血。分析血樣之乳酸鹽含量，如實例1中所闡述。與假手術及媒劑治療小鼠相比，在已接收腎切除術手術及LDHA LNP之小鼠中觀察到乳酸鹽清除並無顯著差異。下文表23詳述各動物組中之平均血漿丙酮酸鹽，如亦在圖17中所展示。
表 23 ：腎切除術研究之血漿乳酸鹽清除
   假手術 - TSS 媒劑對照 (n=5) 假手術 - 1mpk Ldha  (n=6) 5/6 腎切除術 - TSS 媒劑對照 (n=5) 5/6 腎切除術 - 1mpk Ldha  (n=5)
時間 (min) 平均血漿乳酸鹽 (mM) 平均血漿乳酸鹽標準偏差 (mM) 平均血漿乳酸鹽 (mM) 平均血漿乳酸鹽標準偏差 (mM) 平均血漿乳酸鹽 (mM) 平均血漿乳酸鹽標準偏差 (mM) 平均血漿乳酸鹽 (mM) 平均血漿乳酸鹽標準偏差 (mM)
0 7.2 2.9 5.9 2.0 9.0 2.3 6.5 2.8
15 24.5 10.3 23.3 4.6 24.2 8.1 21.7 9.1
30 20.4 8.2 17.2 3.7 18.7 4.3 18.1 7.7
60 11.7 4.9 9.4 3.1 12.2 4.5 11.1 4.7
180 6.6 2.6 6.3 2.9 8.4 2.7 5.5 2.8
圖1展示某些靶向LDHA 之sgRNA之脫靶分析。
圖2展示某些靶向LDHA 之sgRNA在PHH中之編輯%之劑量反應曲線。
圖3展示某些靶向LDHA 之sgRNA在PCH中之編輯%之劑量反應曲線。
圖4展示靶向LDHA之經修飾sgRNA (列示於表2中)在PHH中之西方印漬分析(Western Blot analysis)。
圖5展示在使用包括經修飾sgRNA之LNP治療之後AGT缺陷型小鼠中之活體內尿草酸鹽含量。
圖6展示在15-週研究中使用包括經修飾sgRNA之LNP治療之後AGT缺陷型小鼠中之活體內尿草酸鹽含量。
圖7展示在15-週研究中使用包括經修飾sgRNA之LNP治療之後AGT缺陷型小鼠中之活體內西方印漬分析。
圖8展示AGT缺陷型小鼠之肝中之LDHA蛋白之活體內免疫組織化學染色。
圖9展示表19中所繪示之編輯與蛋白質含量之間之相關性。
圖10標記實例性sgRNA序列(SEQ ID NO: 2082)中之10個保守區YA位點(1至10)。數字25、45、50、56、64、67及83指示具有嚮導區(指示為(N)x，例如其中x視情況為20)之sgRNA中之YA位點1、5、6、7、8、9及10之嘧啶位置。
圖11展示實例性sgRNA (SEQ ID NO: 401；並不展示所有修飾)之可能二級結構，該二級結構具有指定sgRNA之保守區之個別核苷酸之標記且包含下莖區、突起區、上莖區、連接區(其核苷酸可沿5’至3’方向分別稱為N1至N18)、髮夾區1及髮夾區2。髮夾1與髮夾2之間之核苷酸標記為n。嚮導區可存在於sgRNA上且在此圖中指示為「(N)x」 (位於sgRNA之保守區之前)。
圖12A-12C展示某些靶向LDHA 之sgRNA在原代食蟹猴肝細胞中之編輯百分比之劑量反應曲線。
圖13A-13B展示在包括某些sgRNA之脂轉染處理之後原代人類及食蟹猴肝細胞中之LDHA表現相對減小的劑量反應曲線。
圖14A-14C分別展示在使用包括某一sgRNA之LNP治療AGT缺陷型小鼠之後之劑量依賴性尿草酸鹽含量、編輯百分比及尿草酸鹽含量與編輯百分比之間的相關性。
圖15A-15B展示在15-週持久性研究中使用包括某一sgRNA之LNP治療AGT缺陷型小鼠之後肝及肌肉試樣中之LDHA活性，如實例4中所闡述。
圖16A-16B展示在15-週持久性研究中使用包括某一sgRNA之LNP治療AGT缺陷型小鼠之後肝及血漿試樣中之丙酮酸鹽含量，如實例4中所闡述。
圖17展示經受5/6腎切除術或假手術之小鼠在使用包括某一sgRNA之LNP治療之後之平均血漿乳酸鹽清除功能。
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Claims (216)

  1. 一種誘導LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)或單鏈斷裂(SSB)之方法，其包括向細胞遞送一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。
  2. 一種減小LDHA 基因表現之方法，其包括向細胞遞送一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。
  3. 一種治療或預防高草酸鹽尿症之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸， 由此治療或預防高草酸鹽尿症。
  4. 一種治療或預防由高草酸鹽尿症引起之晚期腎病(ESRD)之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸， 由此治療或預防由高草酸鹽尿症引起之(ESRD)。
  5. 一種治療或預防草酸鈣產生及沈積、原發性高草酸鹽尿症、草酸鹽沈積症、血尿症中之任一者及延遲或改善腎或肝移植需要之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸， 由此治療或預防草酸鈣產生及沈積、原發性高草酸鹽尿症、草酸鹽沈積症、血尿症中之任一者及延遲或改善腎或肝移植需要。
  6. 一種增加血清羥基乙酸鹽濃度之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸， 由此增加血清羥基乙酸鹽濃度。
  7. 一種減少個體之尿中之草酸鹽之方法，其包括向有需要之個體投與一種組合物，其中該組合物包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸， 由此減少個體之尿中之草酸鹽。
  8. 如前述請求項中任一項之方法，其中投與RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。
  9. 一種組合物，其包括： a. 嚮導RNA，其包括 i. 選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列；或 ii.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 iii.    與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列；或 iv.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者之嚮導序列；或 v. 包括SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者之嚮導序列；或 vi.    包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者之嚮導序列；或 vii.   包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者之嚮導序列；及視情況 b.     RNA引導之DNA結合劑或編碼RNA引導之DNA結合劑之核酸。
  10. 一種組合物，其包括含有以下之短單嚮導RNA (短-sgRNA)： i. 嚮導序列，其包括： 1.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者；或 2.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 3.     與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致；或 4.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者；或 5.     SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者；或 6.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者；或 7.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者；及 ii.     包括髮夾區之sgRNA之保守部分，其中該髮夾區缺失至少5至10個核苷酸且視情況其中該短-sgRNA包括5’端修飾及3’端修飾中之一或多者。
  11. 如請求項10之組合物，其包括SEQ ID NO: 202之序列。
  12. 如請求項10或11之組合物，其包括5’端修飾。
  13. 如請求項10至12中任一項之組合物，其中該短-sgRNA包括3’端修飾。
  14. 如請求項10至13中任一項之組合物，其中該短-sgRNA包括5’端修飾及3’端修飾。
  15. 如請求項10至14中任一項之組合物，其中該短-sgRNA包括3’尾部。
  16. 如請求項15之組合物，其中該3’尾部包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸。
  17. 如請求項15之組合物，其中該3’尾部包括約1至2、1至3、1至4、1至5、1至7、1至10、至少1至2、至少1至3、至少1至4、至少1至5、至少1至7或至少1至10個核苷酸。
  18. 如請求項10至17中任一項之組合物，其中該短-sgRNA不包括3’尾部。
  19. 如請求項10至18中任一項之組合物，其包括該髮夾區中之修飾。
  20. 如請求項10至19中任一項之組合物，其包括3’端修飾及該髮夾區中之修飾。
  21. 如請求項10至20中任一項之組合物，其包括3’端修飾、該髮夾區中之修飾及5’端修飾。
  22. 如請求項10至21中任一項之組合物，其包括5’端修飾及該髮夾區中之修飾。
  23. 如請求項10至22中任一項之組合物，其中該髮夾區缺失至少5個連續核苷酸。
  24. 如請求項10至23中任一項之組合物，其中該至少5至10個缺失的核苷酸： a. 位於髮夾1內； b.     位於髮夾1內且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； c. 位於髮夾1內且包含緊接髮夾1之3’的兩個核苷酸； d.     包含髮夾1之至少一部分； e. 位於髮夾2內； f. 包含髮夾2之至少一部分； g.     位於髮夾1及髮夾2內； h.     包含髮夾1之至少一部分且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； i. 包含髮夾2之至少一部分且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； j. 包含髮夾1之至少一部分，包含髮夾1與髮夾2之間之「N」且包含髮夾2之至少一部分； k.     位於髮夾1或髮夾2內，視情況包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； l. 係連續的； m.    係連續的且包含髮夾1與髮夾2之間之「N」； n.     係連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾2之一部分； o.     係連續的且跨越髮夾1之至少一部分及髮夾1與髮夾2之間之「N」； p.     係連續的且跨越髮夾1之至少一部分及緊接髮夾1之3’之兩個核苷酸； q.     由5至10個核苷酸組成； r. 由6至10個核苷酸組成； s. 由5至10個連續核苷酸組成； t. 由6至10個連續核苷酸組成；或 u.     由SEQ ID NO: 400之核苷酸54至58組成。
  25. 如請求項10至24中任一項之組合物，其包括含有連接區之sgRNA之保守部分，其中該連接區缺失至少一個核苷酸。
  26. 如請求項25之組合物，其中該連接區中缺失之該等核苷酸包括以下中之任一者或多者： a. 該連接區中之至少2、3、4、5、6、7、8、9或10個核苷酸； b.     該連接區中之至少或確切地1至2個核苷酸、1至3個核苷酸、1至4個核苷酸、1至5個核苷酸、1至6個核苷酸、1至10個核苷酸或1至15個核苷酸；及 c. 該連接區中之每一核苷酸。
  27. 一種組合物，其包括含有以下之經修飾單嚮導RNA (sgRNA)： a. 嚮導序列，其包括： 1.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者；或 2.     選自SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列中之任一者之至少17、18、19或20個鄰接核苷酸；或 3.     與選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致；或 4.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80中之任一者；或 5.     SEQ ID No: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48中之任一者；或 6.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者；或 7.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者；且進一步包括 b.     一或多個選自以下之修飾： 1.     位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾； 2.     位於一或多個保守區YA位點處之YA修飾； 3.     位於一或多個嚮導區YA位點處及一或多個保守區YA位點處之YA修飾； 4.     i)位於兩個或更多個嚮導區YA位點處之YA修飾； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 5.     i)位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該嚮導區YA位點位於5’末端之5’端之核苷酸8處或其後； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及視情況； iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 6.     i)位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該嚮導區YA位點位於該嚮導區之3’末端核苷酸之13個核苷酸內； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 7.     i) 5’端修飾及3’端修飾； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 8.     i)位於嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該嚮導區YA位點之該修飾包括位於該嚮導區YA位點之5’處之至少一個核苷酸所不包括之修飾； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於保守區YA位點1及8中之一或多者處之YA修飾；或 9.     i)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 ii)位於保守區YA位點1及8處之YA修飾；或 10.   i)位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾，其中該YA位點位於5’末端之核苷酸8處或其後； ii)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；及 iii)位於H1-1及H2-1中之一或多者處之修飾；或 11.    i)位於保守區YA位點2、3、4及10中之一或多者處之YA修飾；ii)位於保守區YA位點1、5、6、7、8及9中之一或多者處之YA修飾；及iii)位於H1-1及H2-1中之一或多者處之修飾；或 12.   i)位於一或多個位於5’末端之核苷酸6處或其後之核苷酸處之修飾，例如YA修飾； ii)位於一或多個嚮導序列YA位點處之YA修飾； iii)位於B3、B4及B5中之一或多者處之修飾，其中B6不包括2’-OMe修飾或包括除2’-OMe外之修飾； iv)位於LS10處之修飾，其中LS10包括除2’-氟外之修飾；及/或 v)位於N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10或N11處之修飾；且 其中下列中之至少一者係真實的： a. 位於一或多個嚮導區YA位點處之YA修飾； b.     位於一或多個保守區YA位點處之YA修飾； c. 位於一或多個嚮導區YA位點處及一或多個保守區YA位點處之YA修飾； d.     5’末端之5’端之核苷酸8至11、13、14、17或18中之至少一者不包括2’-氟修飾； e. 5’末端之5’端之核苷酸6至10中之至少一者不包括硫代磷酸酯鍵聯； f. B2、B3、B4或B5中之至少一者不包括2’-OMe修飾； g.     LS1、LS8或LS10中之至少一者不包括2’-OMe修飾； h.     N2、N3、N4、N5、N6、N7、N10、N11、N16或N17中之至少一者不包括2’-OMe修飾； i. H1-1包括修飾； j. H2-1包括修飾；或 k.     H1-2、H1-3、H1-4、H1-5、H1-6、H1-7、H1-8、H1-9、H1-10、H2-1、H2-2、H2-3、H2-4、H2-5、H2-6、H2-7、H2-8、H2-9、H2-10、H2-11、H2-12、H2-13、H2-14或H2-15中之至少一者不包括硫代磷酸酯鍵聯。
  28. 如請求項27之組合物，其包括SEQ ID NO: 450。
  29. 如請求項9至28中任一項之組合物，其用於誘導細胞或個體中之LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)或單鏈斷裂(SSB)。
  30. 如請求項9至28中任一項之組合物，其用於減小細胞或個體中之LDHA 基因表現。
  31. 如請求項9至28中任一項之組合物，其用於治療或預防個體之高草酸鹽尿症。
  32. 如請求項9至28中任一項之組合物，其用於增加個體中之血清及/或血漿羥基乙酸鹽濃度。
  33. 如請求項9至28中任一項之組合物，其用於減小個體中之尿草酸鹽濃度。
  34. 如請求項9至28中任一項之組合物，其用於治療或預防草酸鹽產生、器官中草酸鈣沈積、原發性高草酸鹽尿症、草酸鹽沈積症(包含全身性草酸鹽沈積症)、血尿症、晚期腎病(ESRD)及/或延遲或改善腎或肝移植需要。
  35. 如請求項1至8中任一項之方法，其進一步包括： a. 誘導細胞或個體中之LDHA 基因內之雙鏈斷裂(DSB)； b.     減小細胞或個體中之LDHA 基因表現； c. 治療或預防個體之高草酸鹽尿症； d.     治療或預防個體之原發性高草酸鹽尿症； e. 治療或預防個體之PH1、PH2及/或PH3； f. 治療或預防個體之腸高草酸鹽尿症； g.     治療或預防個體之與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症； h.     增加個體中之血清及/或血漿羥基乙酸鹽濃度； i. 減小個體中之尿草酸鹽濃度； j. 減小草酸鹽產生； k.     減小器官中之草酸鈣沈積； l. 減少高草酸鹽尿症； m.    治療或預防草酸鹽沈積症，包含全身性草酸鹽沈積症； n.     治療或預防血尿症； o.     預防晚期腎病(ESRD)；及/或 p.     延遲或改善腎或肝移植需要。
  36. 如請求項1至8或29至35中任一項所用之方法或組合物，其中該組合物增加血清及/或血漿羥基乙酸鹽含量。
  37. 如請求項1至8或29至35中任一項所用之方法或組合物，其中該組合物引起該LDHA 基因之編輯。
  38. 如請求項37所用之方法或組合物，其中該編輯計算為經編輯群體之百分比(編輯百分比)。
  39. 如請求項38所用之方法或組合物，其中該編輯百分比介於該群體之30%與99%之間。
  40. 如請求項38所用之方法或組合物，其中該編輯百分比介於該群體之30%與35%、35%與40%、40%與45%、45%與50%、50%與55%、55%與60%、60%與65%、65%與70%、70%與75%、75%與80%、80%與85%、85%與90%、90%與95%或95%與99%之間。
  41. 如請求項1至8或29至35中任一項所用之方法或組合物，其中該組合物減小尿草酸鹽濃度。
  42. 如請求項41所用之方法或組合物，其中減少尿草酸鹽降低腎結石及/或腎、肝、膀胱、心臟、皮膚或眼睛中之草酸鈣沈積。
  43. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列係選自 a. SEQ ID NO:1-84及100-192； b.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80； c. SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48； d.     SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184；及 e. SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123。
  44. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物包括含有以下之sgRNA： a. SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者；或 b.     SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081中之任一者；或 c. 選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78及80之嚮導序列；或 c. 選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45及48之嚮導序列； d.     選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184之嚮導序列；及 e. 選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123之嚮導序列。
  45. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中靶序列位於人類LDHA 基因之外顯子1至8中之任一者中。
  46. 如請求項45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子1或2中。
  47. 如請求項45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子3中。
  48. 如請求項45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子4中。
  49. 如請求項45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子5或6中。
  50. 如請求項45之方法或組合物，其中該靶序列位於該人類LDHA 基因之外顯子7或8中。
  51. 如請求項1至50中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列與LDHA 之正鏈中之靶序列互補。
  52. 如請求項1至50中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列與LDHA 之負鏈中之靶序列互補。
  53. 如請求項1至50中任一項之方法或組合物，其中第一嚮導序列與該LDHA 基因之正鏈中之第一靶序列互補，且其中該組合物進一步包括與該LDHA 基因之負鏈中之第二靶序列互補之第二嚮導序列。
  54. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括選自SEQ ID NO: 1-84及100-192中之任一者之嚮導序列且進一步包括SEQ ID NO: 200之核苷酸序列，其中SEQ ID NO: 200之核苷酸接在該嚮導序列之3’端之後。
  55. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括選自SEQ ID NO: 1-84及100-192中之任一者之嚮導序列且進一步包括SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202、SEQ ID NO: 203或SEQ ID NO: 400-450中之任一者之核苷酸序列，其中SEQ ID NO: 201之核苷酸接在該嚮導序列之3’端之後。
  56. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係單嚮導(sgRNA)。
  57. 如請求項56之方法或組合物，其中該sgRNA包括含有SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者之嚮導序列。
  58. 如請求項56之方法或組合物，其中該sgRNA包括SEQ ID NO: 1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079及1081中之任一者或其經修飾形式，視情況其中該等經修飾形式包括SEQ ID NO: 2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081。
  59. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中根據SEQ ID NO: 300之模式來修飾該嚮導RNA，其中N共同地係表1之嚮導序列中任一者(SEQ ID NO 1-84及100-192)。
  60. 如請求項59之方法或組合物，其中SEQ ID NO: 300中之每一N係任一天然或非天然核苷酸，其中該等N形成該嚮導序列，且該嚮導序列使Cas9靶向該LDHA 基因。
  61. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包括SEQ ID NO:1-84及100-192之嚮導序列及SEQ ID NO: 201、SEQ ID NO: 202或SEQ ID NO: 203之核苷酸中之任一者。
  62. 如請求項56至61中任一項之方法或組合物，其中該sgRNA包括與選自SEQ ID NO: 1-84及100-192之序列至少99%、98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或90%一致之嚮導序列。
  63. 如請求項62之方法或組合物，其中該sgRNA包括選自SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、1001、1005、1007、1008、1014、1023、1027、1032、1045、1048、1063、1067、1069、1071、1074、1076、1077、1078、1079、1081、2001、2005、2007、2008、2014、2023、2027、2032、2045、2048、2063、2067、2069、2071、2074、2076、2077、2078、2079及2081之序列。
  64. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括至少一種修飾。
  65. 如請求項64之方法或組合物，其中該至少一種修飾包含經2’-O-甲基(2’-O-Me)修飾之核苷酸。
  66. 如請求項64或65之方法或組合物，其包括核苷酸之間之硫代磷酸酯(PS)鍵。
  67. 如請求項64至66中任一項之方法或組合物，其包括經2’-氟(2’-F)修飾之核苷酸。
  68. 如請求項64至67中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之5’端處之前5個核苷酸中之一或多者處之修飾。
  69. 如請求項64至68中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之3’端處之後5個核苷酸中之一或多者處之修飾。
  70. 如請求項64至69中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之前4個核苷酸之間之PS鍵。
  71. 如請求項64至70中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之後4個核苷酸之間之PS鍵。
  72. 如請求項64至71中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之5’端之前三個核苷酸處之經2’-O-Me修飾之核苷酸。
  73. 如請求項64至72中任一項之方法或組合物，其包括位於該嚮導RNA之3’端之後三個核苷酸處之經2’-O-Me修飾之核苷酸。
  74. 如請求項64至73中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA包括SEQ ID NO: 300之經修飾核苷酸。
  75. 如請求項1至74中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包括醫藥上可接受之賦形劑。
  76. 如請求項1至75中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA與脂質奈米顆粒(LNP)締合。
  77. 如請求項76之方法或組合物，其中該LNP包括陽離子脂質。
  78. 如請求項77之方法或組合物，其中該陽離子脂質係(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯酸3-((4,4-雙(辛基氧基)丁醯基)氧基)-2-((((3-(二乙基胺基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯((9Z,12Z)-3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl octadeca-9,12-dienoate，亦稱為3-((4,4-bis(octyloxy)butanoyl)oxy)-2-((((3-(diethylamino)propoxy)carbonyl)oxy)methyl)propyl (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate)。
  79. 如請求項76至78中任一項之方法或組合物，其中該LNP包括中性脂質。
  80. 如請求項79之方法或組合物，其中該中性脂質係DSPC。
  81. 如請求項76至80中任一項之方法或組合物，其中該LNP包括輔助脂質。
  82. 如請求項81之方法或組合物，其中該輔助脂質係膽固醇。
  83. 如請求項76至82中任一項之方法或組合物，其中該LNP包括隱形脂質。
  84. 如請求項83之方法或組合物，其中該隱形脂質係PEG2k-DMG。
  85. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包括RNA引導之DNA結合劑。
  86. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物進一步包括編碼RNA引導之DNA結合劑之mRNA。
  87. 如請求項85或86之方法或組合物，其中該RNA引導之DNA結合劑係Cas9。
  88. 如前述請求項中任一項之方法或組合物，其中該組合物係醫藥調配物且進一步包括醫藥上可接受之載劑。
  89. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 1。
  90. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 2。
  91. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 3。
  92. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 4。
  93. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 5。
  94. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 6。
  95. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 7。
  96. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 8。
  97. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 9。
  98. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 10。
  99. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 11。
  100. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 12。
  101. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 13。
  102. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 14。
  103. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 15。
  104. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 16。
  105. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 17。
  106. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 18。
  107. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 19。
  108. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 20。
  109. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 21。
  110. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 22。
  111. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 23。
  112. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 24。
  113. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 25。
  114. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 26。
  115. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 27。
  116. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 28。
  117. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 29。
  118. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 30。
  119. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 31。
  120. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 32。
  121. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 33。
  122. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 34。
  123. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 35。
  124. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 36。
  125. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 37。
  126. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 38。
  127. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 39。
  128. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 40。
  129. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 41。
  130. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 42。
  131. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 43。
  132. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 44。
  133. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 45。
  134. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 46。
  135. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 47。
  136. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 48。
  137. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 49。
  138. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 50。
  139. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 51。
  140. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 52。
  141. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 53。
  142. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 54。
  143. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 55。
  144. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 56。
  145. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 57。
  146. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 58。
  147. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 59。
  148. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 60。
  149. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 61。
  150. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 62。
  151. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 63。
  152. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 64。
  153. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 65。
  154. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 66。
  155. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 67。
  156. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 68。
  157. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 69。
  158. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 70。
  159. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 71。
  160. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 72。
  161. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 73。
  162. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 74。
  163. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 75。
  164. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 76。
  165. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 77。
  166. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 78。
  167. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 79。
  168. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 80。
  169. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 81。
  170. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 82。
  171. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 83。
  172. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 84。
  173. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 103。
  174. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 109。
  175. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 123。
  176. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 133。
  177. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 149。
  178. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 156。
  179. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該選自SEQ ID NO:1-84及100-192之序列係SEQ ID NO: 166。
  180. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 2、9、13、16、22、24、25、27、30、31、32、33、35、36、40、44、45、53、55、57、60、61-63、65、67、69、70、71、73、76、78、79、80、82-84、103、109、123、133、149、156及166中之任一者。
  181. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 100-102、104-108、110-122、124-132、134-148、150-155、157-165及167-192中之任一者。
  182. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、62、66、68、70、73、75、76、77、78、80、103、109、123、133、149、153、156及184中之任一者。
  183. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導序列包括SEQ ID NO: 1、5、7、8、14、23、25、27、32、45、48、103及123中之任一者。
  184. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 86-90中之任一者之sgRNA。
  185. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 89之sgRNA。
  186. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1001或2001之sgRNA。
  187. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1005或2005之sgRNA。
  188. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1007或2007之sgRNA。
  189. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1008或2008之sgRNA。
  190. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1014或2014之sgRNA。
  191. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1023或2023之sgRNA。
  192. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1027或2027之sgRNA。
  193. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1032或2032之sgRNA。
  194. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1045或2045之sgRNA。
  195. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1048或2048之sgRNA。
  196. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1063或2063之sgRNA。
  197. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1067或2067之sgRNA。
  198. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1069或2069之sgRNA。
  199. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1071或2071之sgRNA。
  200. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1074或2074之sgRNA。
  201. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1076或2076之sgRNA。
  202. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1077或2077之sgRNA。
  203. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1078或2078之sgRNA。
  204. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1079或2079之sgRNA。
  205. 如請求項1至88中任一項之方法或組合物，其中該嚮導RNA係包括SEQ ID NO: 1081或2081之sgRNA。
  206. 如請求項1至205中任一項之方法或組合物，其中該組合物係以單一劑量形式來投與。
  207. 如請求項1至206中任一項之方法或組合物，其中一次性投與該組合物。
  208. 如請求項206或207中任一項之方法或組合物，其中該單一劑量或一次性投與： a. 誘導DSB；及/或 b.     減小LDHA基因表現；及/或 c. 治療或預防高草酸鹽尿症；及/或 d.     治療或預防由高草酸鹽尿症引起之ESRD；及/或 e. 治療或預防草酸鈣產生及沈積；及/或 f. 治療或預防原發性高草酸鹽尿症(包含PH1、PH2及PH3)；及/或 g.     治療或預防草酸鹽沈積症；及/或 h.     治療及預防血尿症；及/或 i. 治療或預防腸高草酸鹽尿症；及/或 j. 治療或預防與食用高草酸鹽食物相關之高草酸鹽尿症；及/或 k.     延遲或改善腎或肝移植需要；及/或 l. 增加血清羥基乙酸鹽濃度；及/或 m.    減少尿中之草酸鹽。
  209. 如請求項208之方法或組合物，其中該單一劑量或一次性投與達成a)至m)中之任一者或多者達3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15週。
  210. 如請求項208之方法或組合物，其中該單一劑量或一次性投與達成持久效應。
  211. 如請求項1至208中任一項之方法或組合物，其進一步包括達成持久效應。
  212. 如請求項210或211之方法或組合物，其中該持久效應持續至少1個月、至少3個月、至少6個月、至少一年或至少5年。
  213. 如請求項1至212中任一項之方法或組合物，其中投與該組合物使得尿中之草酸鹽治療相關地減少。
  214. 如請求項1至213中任一項之方法或組合物，其中投與該組合物使得尿草酸鹽含量在治療範圍內。
  215. 如請求項1至214中任一項之方法或組合物，其中投與該組合物使得草酸鹽含量在正常範圍之100%、120%或150%內。
  216. 一種如請求項9至215中任一項之組合物或調配物之用途，其用以製備用於治療患有高草酸鹽尿症之人類個體之藥劑。
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