KR20210086621A - 락테이트 데히드로게나제 (ldha) 유전자 편집을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
LDHA 유전자 내에 편집, 예를 들어, 이중-가닥 파괴를 도입하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 고수산뇨증을 가진 대상체를 치료하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다.
Description
본 출원은 2018년 9월 28일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/738,956호, 2019년 4월 15일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/834,334호, 및 2019년 5월 1일에 출원된 미국 가특허 출원 번호 제62/841,740호의 우선권의 이득을 주장하고, 이들 각각의 내용은 모든 목적을 위해 그 전문을 참조로 포함한다.
콩팥에 의해 노폐물로서 소변에서 일반적으로 제거되는 옥살레이트는 고수산뇨증을 가진 대상체에서 상승된다. 고-옥살레이트 식품 섭취와 관련된 원발성 고수산뇨증, 옥살산증, 장성 고수산뇨증, 및 고수산뇨증을 포함한 여러 유형의 고수산뇨증이 있다. 과도한 옥살레이트는 칼슘과 결합하여 콩팥과 다른 기관에서 옥살산칼슘을 형성할 수 있다. 옥살산칼슘의 침착은 옥살산칼슘의 광범위한 침착 (신석회화증) 또는 콩팥 및 방광 결석 형성 (요로 결석)을 생성하여 콩팥 손상을 유발할 수 있다. 고수산뇨증의 일반적인 콩팥 합병증은 소변에서의 혈액 (혈뇨), 요로 감염, 콩팥 손상, 및 말기 신장 질환 (ESRD)을 포함한다. 시간 경과에 따라, 고수산뇨증을 가진 환자의 콩팥은 기능이 저하되기 시작하고, 옥살레이트의 수준은 혈액에서 상승할 수 있다. 전신을 통한 조직에서의 옥살레이트의 침착, 예를 들어, 전신성 옥살산증은 높은 혈액 수준의 옥살레이트로 인해 발생할 수 있고 적어도 뼈, 심장, 피부 및 눈에서 합병증을 유발할 수 있다. 콩팥 부전은 어린이를 포함한 임의의 연령에서, 특히 고수산뇨증을 가진 대상체에서 발생할 수 있다. 유일한 치료 옵션으로서 신장 투석 또는 이중 콩팥/간 기관 이식.
원발성 고수산뇨증 (PH)은 유아부터 노인까지 모든 연령의 대상체에게 영향을 미치는 희귀 유전 장애이다. PH는 세 가지 별개의 단백질의 발현을 변경하는 유전적 결함을 포함하는 세 가지 하위유형을 포함한다. PH1은 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제, 또는 AGT/AGT1을 포함한다. PH2는 글리옥실레이트/하이드록시피루베이트 리덕타제, 또는 GR/HPR을 포함하고, PH3은 4-하이드록시-2-옥소글루타레이트 알돌라제, 또는 HOGA를 포함한다. PH1에서, 돌연변이는 AGXT 유전자에 의해 암호화되는 효소 알라닌 글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 (AGT 또는 AGT1)에서 발견된다. 일반적으로, AGT는 간 퍼옥시좀에서 글리옥실레이트를 글리신으로 전환시킨다. PH1을 가진 환자에서, 돌연변이 AGT는 글리옥실레이트를 분해할 수 없고, 글리옥실레이트와 이의 대사산물 옥살레이트의 수준이 증가한다. 인간은 옥살레이트를 산화시킬 수 없고, PH1을 가진 대상체에서 높은 수준의 옥살 레이트는 고수산뇨증 야기한다
대상체가 고수산뇨증을 앓고 있는지를 결정하기 위해, 24시간 소변을 수집할 수 있고, 옥살레이트, 글리콜레이트 및 기타 유기산 수준을 측정한다. 유전자 검사 또는 간 생검은 유전적 형태의 고수산뇨증의 확실한 진단을 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Cochat P et al., (2012) Nephrol Dial Transplant 5:1729-36)을 참조한다. 정상적인 건강한 대상체에서, 24시간 소변 옥살레이트 및 글리콜레이트 수준은 45 mg/일 미만이지만, 고수산뇨증 환자에서는, 100 mg/일 초과의 소변 옥살레이트 수준이 전형적이다. 예를 들어, 문헌 (Cochat P. (2013). N Engl J Med 369:649-658)을 참조한다.
정상 대상체에서 혈장 글리콜레이트 수준은 전형적으로 4 내지 8 마이크로 몰이지만, 고수산뇨증 환자에서는 글리콜레이트 수준은 광범위할 수 있고, 고수산뇨증 대상체의 2/3에서 상승한다. 예를 들어, 문헌 (Marangella, M et al. (1992) J. Urol. 148:986-989)을 참조한다. 유전적 형태의 고수산뇨증을 가진 대부분의 환자는 현재 유전자 검사를 통해 진단되지만, 24시간 소변 검사는 고수산뇨증 대상체의 치료 반응을 추적하는 데 사용되는 주요 방법이다. 위와 동일함.
락테이트 데하이드로게나제 (LDH)는 락테이트와 피루베이트의 항상성과 글리옥실레이트와 옥살레이트 대사의 항상성 둘 다를 조절하는 거의 모든 세포에서 발견되는 효소이다. LDH는 4량체를 형성하는 4개의 폴리펩타이드로 구성된다. 이들의 서브유닛 구성요소와 조직 분포가 상이한 LDH의 5개의 아이소자임이 식별되었다. LDH의 2개의 가장 일반적인 형태는 LDHA 유전자에 의해 암호화된 근육 (M) 형태와 LDHB 유전자에 의해 암호화된 심장 (H) 형태이다. 간 세포의 퍼옥시좀에서, LDH는 글리옥살레이트를 옥살레이트로 전환시키는 역할을 하는 핵심 효소로, 이어서 혈장으로 분비되어 콩팥에 의해 배설된다 (Lai et al. (2018) Mol Ther. 26(8):1983-1995)
옥살레이트 생성의 증가는 콩팥 및 신장 질환에서 옥살산칼슘 결정의 침전을 초래한다. 고수산뇨증이 진행됨에 따라, 옥살레이트는 모든 조직에서 침착된다. 유전성 락테이트 데하이드로게나제 M-서브유닛 결핍을 가진 대상체는 손상된 간 기능 또는 간-특이적 표현형을 나타내지 않고, 이는 글리옥실레이트를 옥살레이트로 전환시키는 역할을 하는 제안된 핵심 효소인 간 락테이트 데하이드로게나제 (LDH) 발현 양의 억제 또는 감소는 락테이트 데하이드로게나제 M-서브유닛의 손실로 인한 부작용 없이 고수산뇨증을 가진 대상체에서 옥살레이트의 축적을 방지할 수 있음을 시사한다. 이 가설은 고수산뇨증의 유전자 조작된 뮤린 모델과 고수산뇨증이 에틸렌 글리콜 (EG)로 화학적으로 유도된 뮤린 모델에서 시험되었다. 문헌 (Kanno, T et al. (1988) Clin. Chim. Acta 173, 89-98; Takahashi, Y et al. (1995) Intern. Med. 34, 326-329; and Tsujino, S et al. (1994) Ann. Neurol. 36, 661-665)을 참조한다.
LDH가 옥살레이트 생성의 최종 단계에서 핵심이기 때문에, N-아세틸 갈락토사민 (GalNAc) 잔기와의 접합을 통해 간세포로 유도된 LDHA siRNA를 사용하여 고수산뇨증의 마우스 모델에서 LDHA 사일런싱을 매개하였다. 문헌 (Lai et al. (2018) Mol Ther. 26(8):1983-1995)을 참조한다. 이 LDHA siRNA로 마우스를 처리하면 간 LDH의 감소와 효율적인 옥살레이트 감소가 초래되었고, 유전자 조작된 고수산뇨증 마우스 모델과 화학적으로 유도된 고수산뇨증 마우스 모델 둘 다에서 옥살산칼슘 결정 침착이 방지되었다. 위와 동일함. 마우스에서 간 LDH의 억제는 순환하는 간 효소, 락테이트 산성혈증 또는 운동성 근육병증의 급성 상승을 초래하지 않았다.
LDHA를 억제하여 고수산뇨증을 가진 환자를 치료하는 아이디어는 간이 최대 80%의 인간 간세포로 구성된 인간화된 키메라 마우스와 비인간 영장류 둘 다의 LDHA siRNA 처리에 의해 더 뒷받침된다. 위와 동일함.
따라서, 다음 구현예가 제공된다. 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 LDHA 유전자의 발현을 실질적으로 감소 또는 녹아웃시킴으로써 LDH의 생성을 실질적으로 감소 또는 제거하여, 소변 옥살레이트를 감소시키고 혈청 글리콜레이트를 증가시키기 위해 CRISPR/Cas 시스템과 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제와 함께 가이드 RNA를 사용하는 조성물 및 방법을 제공한다. LDHA 유전자의 변경을 통한 LDH 생산의 실질적인 감소 또는 제거는 고수산뇨증에 대한 장기적인 또는 영구적인 치료일 될 수 있다.
요약
하기 구현예가 제공된다.
구현예 01
조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하여, LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB) 또는 단일-가닥 파괴 (SSB)를 유도하는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 02
조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하여 LDHA 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 03
조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하여 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 04
조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 고수산뇨증으로 야기된 말기 신장 질환 (ESRD)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하여 고수산뇨증으로 야기된 (ESRD)를 치료 또는 예방하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 05
조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 옥살산칼슘 생성 및 침착, 원발성 고수산뇨증 (PH1, PH2, 및 PH3 포함), 옥살산증, 혈뇨 중 임의의 하나를 치료 또는 예방하고, 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하여 옥살산칼슘 생성 및 침착, 원발성 고수산뇨증, 옥살산증, 혈뇨 중 임의의 하나를 치료 또는 예방하고, 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 06
조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여, 혈청 글리콜레이트 농도를 증가시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하여 혈청 글리콜레이트 농도를 증가시키는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 07
조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하여 대상체의 소변에서 옥실레이트를 감소시키는 방법으로서, 여기서, 상기 조성물은 다음을 포함하여 대상체의 소변에서 옥살레이트를 감소시키는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 08
구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산이 투여되는, 방법.
구현예 09
다음을 포함하는 조성물:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 어느 한 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산.
구현예 10
다음을 포함하는 짧은-단일 가이드 RNA (짧은-sgRNA)를 포함하는 조성물:
a. 다음을 포함하는 가이드 서열:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나; 및
b. 헤어핀 영역을 포함하는 sgRNA의 보존된 부분으로서, 여기서, 상기 헤어핀 영역은 적어도 5 내지 10개의 뉴클레오티드가 결여되어 있고 임의로 상기 짧은-sgRNA는 5' 단부 변형 및 3' 단부 변형 중 하나 이상을 포함하는, 보존된 부분.
구현예 11
구현예 10에 있어서, 서열번호 202의 서열을 포함하는, 조성물.
구현예 12
구현예 10 또는 11에 있어서, 5' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 13
구현예 10 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 3' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 14
구현예 10 내지 13 중 어느 하나에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 5' 단부 변형 및 3' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 15
구현예 10 내지 14중 어느 하나에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 3' 꼬리 (tail)를 포함하는, 조성물.
구현예 16
구현예 15에 있어서, 상기 3' 꼬리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
구현예 17
구현예 15에 있어서, 상기 3' 꼬리는 약 1 내지 2개, 1 내지 3개, 1 내지 4개, 1 내지 5개, 1 내지 7개, 1 내지 10개, 적어도 1 내지 2개, 적어도 1 내지 3개, 적어도 1 내지 4개, 적어도 1 내지 5개, 적어도 1 내지 7개, 또는 적어도 1 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
구현예 18
구현예 10 내지 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 3' 꼬리를 포함하지 않는, 조성물.
구현예 19
구현예 10 내지 18 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤어핀 영역에서의 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 20
구현예 10 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 3' 단부 변형, 및 상기 헤어핀 영역에서의 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 21
구현예 10 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 3' 단부 변형, 상기 헤어핀 영역에서의 변형, 및 5' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 22
구현예 10 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 5' 단부 변형, 및 상기 헤어핀 영역에서의 변형을 포함하는, 조성물.
구현예 23
구현예 10 내지 22 중 어느 하나에 있어서, 상기 헤어핀 영역은 적어도 5개의 연속 뉴클레오티드가 결여된 것인, 조성물.
구현예 24
구현예 10 내지 23 중 어느 하나에 있어서, 적어도 5 내지 10개의 결여된 뉴클레오티드는
a. 헤어핀 1 내에 있거나;
b. 헤어핀 1 내에 있고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "N"이거나;
c. 헤어핀 1 내에 있고 헤어핀 1의 3' 바로 인접한 2개의 뉴클레오티드이거나;
d. 헤어핀 1의 적어도 일부를 포함하거나;
e. 헤어핀 2 내에 있거나;
f. 헤어핀 2의 적어도 일부를 포함하거나;
g. 헤어핀 1 및 헤어핀 2 내에 있거나;
h. 헤어핀 1의 적어도 일부를 포함하고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하거나;
i. 헤어핀 2의 적어도 일부를 포함하고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하거나;
j. 헤어핀 1의 적어도 일부를 포함하고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하고 헤어핀 2의 적어도 일부를 포함하거나;
k. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 임의로 포함하는 헤어핀 1 또는 헤어핀 2 내에 있거나;
l. 연속적이거나;
m. 연속적이고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하거나;
n. 연속적이고 헤어핀 1의 적어도 일부 및 헤어핀 2의 일부에 걸쳐 있거나;
o. 연속적이고 헤어핀 1의 적어도 일부와 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "N"에 걸쳐 있거나;
p. 연속적이고 헤어핀 1의 적어도 일부 및 헤어핀 1의 3' 바로 인접한 2개의 뉴클레오티드에 걸쳐 있거나;
q. 5 내지 10개의 뉴클레오티드로 이루어지거나;
r. 6 내지 10개의 뉴클레오티드로 이루어지거나;
s. 5 내지 10개의 연속 뉴클레오티드로 이루어지거나;
t. 6 내지 10개의 연속 뉴클레오티드로 이루어지거나;
u. 서열번호 400의 뉴클레오티드 54 내지 58로 이루어진, 조성물.
구현예 25
구현예 10 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 넥서스 영역을 포함하는 sgRNA의 보존된 부분을 포함하며, 여기서, 상기 넥서스 영역은 적어도 하나의 뉴클레오티드가 결여되어 있는, 조성물.
구현예 26
구현예 25에 있어서, 상기 넥서스 영역에 결여된 뉴클레오티드는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 조성물:
a. 상기 넥서스 영역에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드;
b. 상기 넥서스 영역에서 적어도 또는 정확히 1 내지 2개의 뉴클레오티드, 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 1 내지 4개의 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 뉴클레오티드, 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 또는 1 내지 15개의 뉴클레오티드; 및
c. 상기 넥서스 영역에서 각각의 뉴클레오티드.
구현예 27
다음을 포함하는 변형된 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 포함하는 조성물:
a. 다음을 포함하는 가이드 서열:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나; 그리고 추가로 포함하는
b. 다음으로부터 선택된 하나 이상의 변형:
1. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
2. 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
3. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위 및 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
4. i) 2개 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
5. i) 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 가이드 영역 YA 부위는 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 8에 또는 그 뒤에 있는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및 임의로;
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
6. i) 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 가이드 영역 YA 부위는 상기 가이드 영역의 3' 말단 뉴클레오티드의 13개의 뉴클레오티드 내에 있는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
7. i) 5' 단부 변형 및 3' 단부 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
8. i) 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 가이드 영역 YA 부위의 변형은 상기 가이드 영역 YA 부위의 5'에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드가 포함하지 않는 변형을 포함하는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
9. i) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
ii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8에서 YA 변형; 또는
10. i) 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 YA 부위는 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 8에 또는 그 뒤에 있는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) H1-1 및 H2-1 중 하나 이상에서의 변형; 또는
11. i) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 1, 5, 6, 7, 8, 및 9 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) H1-1 및 H2-1 중 하나 이상에서의 변형; 또는
12. i) 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 6에 또는 그 뒤에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드에서 YA 변형과 같은 변형;
ii) 하나 이상의 가이드 서열 YA 부위에서의 YA 변형;
iii) B3, B4, 및 B5 중 하나 이상에서의 변형으로서, 여기서, B6은 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나 2'-OMe 이외의 변형을 포함하는, 변형;
iv) LS10에서의 변형으로서, 여기서, LS10은 2'-플루오로 이외의 변형을 포함하는, 변형; 및/또는
v) N2, N3, N4, N5, N6, N7, N10, 또는 N11에서의 변형; 및
여기서, 다음 중 적어도 하나는 참이다:
i. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
ii. 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
iii. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위 및 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
iv. 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 8 내지 11, 13, 14, 17, 또는 18 중 적어도 하나는 2'-플루오로 변형을 포함하지 않거나;
v. 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 6 내지 10 중 적어도 하나는 포스포로티오에이트 연결을 포함하지 않거나;
vi. B2, B3, B4, 또는 B5 중 적어도 하나는 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나;
vii. LS1, LS8, 또는 LS10 중 적어도 하나는 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나;
viii. N2, N3, N4, N5, N6, N7, N10, N11, N16, 또는 N17 중 적어도 하나는 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나;
ix. H1-1은 변형을 포함하거나;
x. H2-1은 변형을 포함하거나;
xi. H1-2, H1-3, H1-4, H1-5, H1-6, H1-7, H1-8, H1-9, H1-10, H2-1, H2-2, H2-3, H2-4, H2-5, H2-6, H2-7, H2-8, H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14, 또는 H2-15 중 적어도 하나는 포스포로티오에이트 연결을 포함하지 않는다.
구현예 28
구현예 27에 있어서, 서열번호 450을 포함하는, 조성물.
구현예 29
구현예 9 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 세포 또는 대상체에서 LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB) 또는 단일-가닥 파괴 (SSB)를 유도하는데 사용하기 위한, 조성물.
구현예 30
구현예 9 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 세포 또는 대상체에서 LDHA 유전자의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한, 조성물.
구현예 31
구현예 9 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 조성물.
구현예 32
구현예 9 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 혈청 및/또는 혈장 글리콜레이트 농도를 증가시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
구현예 33
구현예 9 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 대상체에서 소변 옥살레이트 농도를 감소시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
구현예 34
구현예 9 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 옥살레이트 생성, 기관에서의 옥살산칼슘 침착, 원발성 고수산뇨증, 전신성 옥살산증을 포함한 옥살산증, 혈뇨, 말기 신장 질환 (ESRD)을 치료 또는 예방 및/또는 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는 데 사용하기 위한, 조성물.
구현예 35
구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 다음을 추가로 포함하는, 방법:
a. 세포 또는 대상체에서 상기 LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB) 유도;
b. 세포 또는 대상체에서 상기 LDHA 유전자의 발현 감소;
c. 대상체에서 고수산뇨증 치료 또는 예방;
d. 대상체에서 원발성 고수산뇨증 치료 또는 예방;
e. 대상체에서 PH1, PH2, 및/또는 PH3 치료 또는 예방;
f. 대상체에서 장성 고수산뇨증 치료 또는 예방;
g. 대상체에서 고-옥살레이트 식품 섭취와 관련된 고수산뇨증 치료 또는 예방;
h. 대상체에서 혈청 및/또는 혈장 글리콜레이트 농도 증가;
i. 대상체에서 소변 옥살레이트 농도 감소;
j. 옥살레이트 생성 감소;
k. 기관에서의 옥살산칼슘 침착 감소;
l. 고수산뇨증 감소;
m. 전신성 옥살산증을 포함한 옥살산증 치료 또는 예방;
n. 혈뇨 치료 또는 예방;
o. 말기 신장 질환 (ESRD) 예방; 및/또는
p. 콩팥 또는 간 이식의 필요성 지연 또는 개선.
구현예 36
구현예 1 내지 8 또는 29 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 혈청 및/또는 혈장 글리콜레이트 수준을 증가시키는, 방법 또는 조성물.
구현예 37
구현예 1 내지 8 또는 29 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 상기 LDHA 유전자의 편집을 초래하는, 방법 또는 조성물.
구현예 38
구현예 37에 있어서, 상기 편집이 편집된 집단의 백분율 (퍼센트 편집)로서 계산되는, 방법 또는 조성물.
구현예 39
구현예 38에 있어서, 상기 퍼센트 편집은 상기 집단의 30%와 99% 사이인, 방법 또는 조성물.
구현예 40
구현예 38에 있어서, 상기 퍼센트 편집은 상기 집단의 30%와 35% 사이, 35%와 40% 사이, 40%와 45% 사이, 45%와 50% 사이, 50%와 55% 사이, 55%와 60% 사이, 60%와 65% 사이, 65%와 70% 사이, 70%와 75% 사이, 75%와 80% 사이, 80%와 85% 사이, 85%와 90% 사이, 90%와 95% 사이, 또는 95%와 99% 사이인, 방법 또는 조성물.
구현예 41
구현예 1 내지 8 또는 29 내지 35 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 소변 옥살레이트 농도를 감소시키는, 방법 또는 조성물.
구현예 42
구현예 41에 있어서, 소변 옥살레이트의 감소는 콩팥, 간, 방광, 심장, 피부 또는 눈에서 콩팥 결석 및/또는 옥살산칼슘 침착을 감소시키는, 방법 또는 조성물.
구현예 43
구현예 1 내지 42 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 다음으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물:
a. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192;
b. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80;
c. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48;
d. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184; 및
e. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123.
구현예 44
구현예 1 내지 43 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 sgRNA를 포함하는, 방법 또는 조성물:
a. 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나; 또는
b. 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081 중 임의의 하나; 또는
c. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80으로부터 선택된 가이드 서열; 또는
d. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48로부터 선택된 가이드 서열;
e. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184로부터 선택된 가이드 서열; 및
f. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123으로부터 선택된 가이드 서열.
구현예 45
구현예 1 내지 44 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 1 내지 8 중 임의의 하나에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 46
구현예 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 1 또는 2에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 47
구현예 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 3에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 48
구현예 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 4에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 49
구현예 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 5 또는 6에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 50
구현예 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 7 또는 8에 있는, 방법 또는 조성물.
구현예 51
구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 LDHA의 양성 가닥의 표적 서열에 상보적인, 방법 또는 조성물.
구현예 52
구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 LDHA의 음성 가닥의 표적 서열에 상보적인, 방법 또는 조성물.
구현예 53
구현예 1 내지 50 중 어느 하나에 있어서, 상기 제1 가이드 서열은 상기 LDHA 유전자의 양성 가닥에서 제1 표적 서열에 상보적이고, 상기 조성물은 상기 LDHA 유전자의 음성 가닥에서 제2 표적 서열에 상보적인 제2 가이드 서열을 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 54
구현예 1 내지 53 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192 중 임의의 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고, 서열번호 200의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 서열번호 200의 뉴클레오티드는 이의 3' 단부에서 상기 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
구현예 55
구현예 1 내지 54 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192 중 임의의 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고, 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203, 또는 서열번호 400 내지 450 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203의 뉴클레오티드는 이의 3' 단부에서 상기 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
구현예 56
구현예 1 내지 55 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 가이드 (sgRNA)인, 방법 또는 조성물.
구현예 57
구현예 56에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 58
구현예 56에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나, 또는 이의 변형된 버전을 포함하고, 임의로 상기 변형된 버전은 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 59
구현예 1 내지 58 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 300의 패턴에 따라 변형되고, 상기 N은 집합적으로 표 1의 가이드 서열 (서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192) 중 임의의 하나인, 방법 또는 조성물.
구현예 60
구현예 59에 있어서, 서열번호 300에서 각각의 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 N은 가이드 서열을 형성하고, 상기 가이드 서열은 Cas9를 LDHA 유전자에 표적화하는, 방법 또는 조성물.
구현예 61
구현예 1 내지 60 중 어느 하나에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192의 가이드 서열 중 임의의 하나 및 서열번호 201, 서열번호 202, 또는 서열번호 203의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 62
구현예 56 내지 61 중 어느 하나에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 63
구현예 62에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 1081, 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 64
구현예 1 내지 63 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 65
구현예 64에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 66
구현예 64 또는 65에 있어서, 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 67
구현예 64 내지 66 중 어느 하나에 있어서, 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 68
구현예 64 내지 67 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA의 5' 단부에서 처음 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 69
구현예 64 내지 68 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA의 3' 단부에서 마지막 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 70
구현예 64 내지 69 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA의 처음 4개의 뉴클레오티드 사이에 PS 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 71
구현예 64 내지 70 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA의 마지막 4개의 뉴클레오티드 사이에 PS 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 72
구현예 64 내지 71 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA의 5' 단부에서 처음 3개의 뉴클레오티드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 73
구현예 64 내지 72 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA의 3' 단부에서 마지막 3개의 뉴클레오티드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 74
구현예 64 내지 73 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 300의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물,
구현예 75
구현예 1 내지 74 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 76
구현예 1 내지 75 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 지질 나노입자 (LNP)와 회합되는, 방법 또는 조성물.
구현예 77
구현예 76에 있어서, 상기 LNP는 양이온성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 78
구현예 77에 있어서, 상기 양이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트인, 방법 또는 조성물.
구현예 79
구현예 76 내지 78 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 중성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 80
구현예 79에 있어서, 상기 중성 지질은 DSPC인, 방법 또는 조성물.
구현예 81
구현예 76 내지 80 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 헬퍼 (helper) 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 82
구현예 81에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 방법 또는 조성물.
구현예 83
구현예 76 내지 82 중 어느 하나에 있어서, 상기 LNP는 스텔스 (stealth) 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 84
구현예 83에 있어서, 상기 스텔스 지질은 PEG2k-DMG인, 방법 또는 조성물.
구현예 85
구현예 1 내지 84 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 86
구현예 1 내지 85 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 87
구현예 85 또는 86에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9인, 방법 또는 조성물.
구현예 88
구현예 1 내지 87 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이고, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 89
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 1인, 방법 또는 조성물.
구현예 90
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 2인, 방법 또는 조성물.
구현예 91
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 3인, 방법 또는 조성물.
구현예 92
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 4인, 방법 또는 조성물.
구현예 93
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 5인, 방법 또는 조성물.
구현예 94
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 6인, 방법 또는 조성물.
구현예 95
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 7인, 방법 또는 조성물.
구현예 96
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 8인, 방법 또는 조성물.
구현예 97
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 9인, 방법 또는 조성물.
구현예 98
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 10인, 방법 또는 조성물.
구현예 99
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 11인, 방법 또는 조성물.
구현예 100
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 12인, 방법 또는 조성물.
구현예 101
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 13인, 방법 또는 조성물.
구현예 102
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 14인, 방법 또는 조성물.
구현예 103
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 15인, 방법 또는 조성물.
구현예 104
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 16인, 방법 또는 조성물.
구현예 105
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 17인, 방법 또는 조성물.
구현예 106
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 18인, 방법 또는 조성물.
구현예 107
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 19인, 방법 또는 조성물.
구현예 108
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 20인, 방법 또는 조성물.
구현예 109
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 21인, 방법 또는 조성물.
구현예 110
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 22인, 방법 또는 조성물.
구현예 111
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 23인, 방법 또는 조성물.
구현예 112
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 24인, 방법 또는 조성물.
구현예 113
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 25인, 방법 또는 조성물.
구현예 114
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 26인, 방법 또는 조성물.
구현예 115
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 27인, 방법 또는 조성물.
구현예 116
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 28인, 방법 또는 조성물.
구현예 117
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 29인, 방법 또는 조성물.
구현예 118
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 30인, 방법 또는 조성물.
구현예 119
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 31인, 방법 또는 조성물.
구현예 120
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 32인, 방법 또는 조성물.
구현예 121
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 33인, 방법 또는 조성물.
구현예 122
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 34인, 방법 또는 조성물.
구현예 123
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 35인, 방법 또는 조성물.
구현예 124
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 36인, 방법 또는 조성물.
구현예 125
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 37인, 방법 또는 조성물.
구현예 126
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 38인, 방법 또는 조성물.
구현예 127
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 39인, 방법 또는 조성물.
구현예 128
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 40인, 방법 또는 조성물.
구현예 129
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 41인, 방법 또는 조성물.
구현예 130
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 42인, 방법 또는 조성물.
구현예 131
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 43인, 방법 또는 조성물.
구현예 132
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 44인, 방법 또는 조성물.
구현예 133
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 45인, 방법 또는 조성물.
구현예 134
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 46인, 방법 또는 조성물.
구현예 135
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 47인, 방법 또는 조성물.
구현예 136
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 48인, 방법 또는 조성물.
구현예 137
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 49인, 방법 또는 조성물.
구현예 138
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 50인, 방법 또는 조성물.
구현예 139
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 51인, 방법 또는 조성물.
구현예 140
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 52인, 방법 또는 조성물.
구현예 141
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 53인, 방법 또는 조성물.
구현예 142
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 54인, 방법 또는 조성물.
구현예 143
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 55인, 방법 또는 조성물.
구현예 144
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 56인, 방법 또는 조성물.
구현예 145
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 57인, 방법 또는 조성물.
구현예 146
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 58인, 방법 또는 조성물.
구현예 147
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 59인, 방법 또는 조성물.
구현예 148
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 60인, 방법 또는 조성물.
구현예 149
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 61인, 방법 또는 조성물.
구현예 150
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 62인, 방법 또는 조성물.
구현예 151
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 63인, 방법 또는 조성물.
구현예 152
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 64인, 방법 또는 조성물.
구현예 153
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 65인, 방법 또는 조성물.
구현예 154
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 66인, 방법 또는 조성물.
구현예 155
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 67인, 방법 또는 조성물.
구현예 156
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 68인, 방법 또는 조성물.
구현예 157
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 69인, 방법 또는 조성물.
구현예 158
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 70인, 방법 또는 조성물.
구현예 159
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 71인, 방법 또는 조성물.
구현예 160
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 72인, 방법 또는 조성물.
구현예 161
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 73인, 방법 또는 조성물.
구현예 162
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 74인, 방법 또는 조성물.
구현예 163
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 75인, 방법 또는 조성물.
구현예 164
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 76인, 방법 또는 조성물.
구현예 165
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 77인, 방법 또는 조성물.
구현예 166
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 78인, 방법 또는 조성물.
구현예 167
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 79인, 방법 또는 조성물.
구현예 168
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 80인, 방법 또는 조성물.
구현예 169
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 81인, 방법 또는 조성물.
구현예 170
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 82인, 방법 또는 조성물.
구현예 171
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 83인, 방법 또는 조성물.
구현예 172
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 84인, 방법 또는 조성물.
구현예 173
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 103인, 방법 또는 조성물.
구현예 174
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 109인, 방법 또는 조성물.
구현예 175
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 123인, 방법 또는 조성물.
구현예 176
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 133인, 방법 또는 조성물.
구현예 177
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 149인, 방법 또는 조성물.
구현예 178
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 156인, 방법 또는 조성물.
구현예 179
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 166인, 방법 또는 조성물.
구현예 180
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 2, 9, 13, 16, 22, 24, 25, 27, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 40, 44, 45, 53, 55, 57, 60, 61-63, 65, 67, 69, 70, 71, 73, 76, 78, 79, 80, 82-84, 103, 109, 123, 133, 149, 156, 및 166 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 181
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 100 내지 102, 104 내지 108, 110 내지 122, 124 내지 132, 134 내지 148, 150 내지 155, 157 내지 165, 및 167 내지 192 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 182
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 183
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 184
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 86 내지 90 중 임의의 하나를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 185
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 89를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 186
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1001 또는 2001을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 187
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1005 또는 2005를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 188
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1007 또는 2007을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 189
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1008 또는 2008을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 190
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1014 또는 2014를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 191
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1023 또는 2023을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 192
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1027 또는 2027을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 193
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1032 또는 2032를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 194
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1045 또는 2045를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 195
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1048 또는 2048을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 196
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1063 또는 2063을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 197
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1067 또는 2067을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 198
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1069 또는 2069를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 199
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1071 또는 2071을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 200
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1074 또는 2074를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 201
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1076 또는 2076을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 202
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1077 또는 2077을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 203
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1078 또는 2078을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 204
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1079 또는 2079를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 205
구현예 1 내지 88 중 어느 하나에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1081 또는 2081을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
구현예 206
구현예 1 내지 205 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 단일 용량으로 투여되는, 방법 또는 조성물.
구현예 207
구현예 1 내지 206 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물은 1회 투여되는, 방법 또는 조성물.
구현예 208
구현예 206 또는 207에 있어서, 상기 단일 용량 또는 1회 투여는
a. DSB를 유도하고/하거나;
b. LDHA 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나;
c. 고수산뇨증을 치료 또는 예방하고/하거나;
d. 고수산뇨증으로 야기된 ESRD의 치료 또는 예방하고/하거나;
e. 옥살산칼슘 생성 및 침착을 치료 또는 예방하고/하거나;
f. 원발성 고수산뇨증 (PH1, PH2, 및 PH3을 포함)을 치료 또는 예방하고/하거나;
g. 옥살산증을 치료 또는 예방하고/하거나;
h. 혈뇨를 치료 및 예방하고/하거나;
i. 장성 고수산뇨증을 치료 또는 예방하고/하거나;
j. 고-옥살레이트 식품 섭취와 관련된 고수산뇨증을 치료 또는 예방하고/하거나;
k. 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하고/하거나;
l. 혈청 글리콜레이트 농도를 증가시키고/시키거나;
m. 소변에서 옥살레이트를 감소시키는, 방법 또는 조성물.
구현예 209
구현예 208에 있어서, 상기 단일 용량 또는 1회 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15주 동안 a) 내지 m) 중 임의의 하나 이상을 달성하는, 방법 또는 조성물.
구현예 210
구현예 208에 있어서, 상기 단일 용량 또는 1회 투여는 지속 효과를 달성하는, 방법 또는 조성물.
구현예 211
구현예 1 내지 208 중 어느 하나에 있어서, 지속 효과를 달성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
구현예 212
구현예 210 또는 211에 있어서, 상기 지속 효과는 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 또는 적어도 5년 지속되는, 방법 또는 조성물.
구현예 213
구현예 1 내지 212 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물의 투여는 치료적으로 관련된 소변 내 옥살레이트의 감소를 초래하는, 방법 또는 조성물.
구현예 214
구현예 1 내지 213 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물의 투여는 치료 범위 내의 소변 옥살레이트 수준을 초래하는, 방법 또는 조성물.
구현예 215
구현예 1 내지 214 중 어느 하나에 있어서, 상기 조성물의 투여는 정상 범위의 100, 120, 또는 150% 내의 옥살레이트 수준을 초래하는, 방법 또는 조성물.
구현예 216
고수산뇨증을 가진 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 구현예 9 내지 215 중 어느 하나의 조성물 또는 제형의 용도.
또한, 고수산뇨증을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 임의의 전술한 구현예의 조성물 또는 제형의 용도가 개시된다. 또한, 고수산뇨증을 치료하는데 사용하거나 LDHA 유전자를 변형하는데 (예를 들어, 인델 (indel) 형성 또는 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이 형성) 사용하기 위한 임의의 전술한 조성물 또는 제형이 개시된다.
도 1은 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 오프-표적 분석을 나타낸다.
도 2는 PHH에서 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 편집 %의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 3은 PCH에서 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 편집 %의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 4는 PHH에서 LDHA-표적화된 변형된 sgRNA (표 2에 나열됨)의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다
도 5는 AGT-결핍 마우스에서 생체내 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 소변 옥살레이트 수준을 나타낸다.
도 6은 15주 연구에서 AGT-결핍 마우스에서 생체내 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 소변 옥살레이트 수준을 나타낸다.
도 7은 15주 연구에서 AGT-결핍 마우스에서 생체내 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 8은 AGT-결핍 마우스의 간에서 생체내 LDHA 단백질의 면역조직화학적 염색을 타나내다.
도 9는 표 19에 묘사된 편집 수준과 단백질 수준 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 10은 예시적인 sgRNA 서열에서 1 내지 10 (서열번호 2082)의 10개의 보존된 영역 YA 부위를 표지한다. 숫자 25, 45, 50, 56, 64, 67, 및 83은 (N)x로서 나타낸 가이드 영역을 갖는 sgRNA에서 YA 부위 1, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 피리미딘의 위치를 나타내고, 예를 들어, 여기서 x는 임의로 20이다.
도 11은 하단 줄기 (stem), 돌출부 (bulge), 상단 줄기, 넥서스 (이의 뉴클레오티드는 각각 5'에서 3' 방향으로 N1 내지 N18로서 지칭될 수 있음), 헤어핀 1, 및 헤어핀 2 영역을 포함한 sgRNA의 보존된 영역의 개별 뉴클레오티드를 지정하는 라벨을 갖는 가능한 2차 구조의 예시적인 sgRNA (서열번호 401; 모든 변형을 나타내지 않음)를 나타낸다. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 뉴클레오티드는 n으로 표지된다. 가이드 영역은 sgRNA 상에 존재할 수 있고, 이 도면에서 sgRNA의 보존된 영역 앞에 "(N)x"로 나타낸다.
도 12a 내지 12c는 일차 사이노몰구스 간세포에서 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 퍼센트 편집의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 1차 인간 및 사이노몰구스 간세포에서 특정 sgRNA를 포함하는 리포펙션 처리 후 LDHA 발현에서 상대적 감소의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 14a 내지 14c는 AGT-결핍 마우스의 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후, 용량-의존적 소변 옥살레이트 수준, 퍼센트 편집 및 소변 옥살레이트 수준과 퍼센트 편집 사이의 상관관계를 각각 나타낸다.
도 15a 및 15b는 실시예 4에 기재된 바와 같이 15주 내구성 연구에서 AGT-결핍 마우스의 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 간 및 근육 샘플에서의 LDHA 활성을 나타낸다.
도 16a 및 16b는 실시예 4에 기재된 바와 같이 15주 지속성 연구에서 AGT-결핍 마우스의 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 간 및 혈장 샘플에서의 피루베이트 수준을 나타낸다.
도 17은 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 5/6 신장절제술 또는 샴 (sham) 수술을 받은 마우스에서 평균 혈장 락테이트 제거율을 나타낸다.
도 2는 PHH에서 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 편집 %의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 3은 PCH에서 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 편집 %의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 4는 PHH에서 LDHA-표적화된 변형된 sgRNA (표 2에 나열됨)의 웨스턴 블롯 분석을 보여준다
도 5는 AGT-결핍 마우스에서 생체내 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 소변 옥살레이트 수준을 나타낸다.
도 6은 15주 연구에서 AGT-결핍 마우스에서 생체내 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 소변 옥살레이트 수준을 나타낸다.
도 7은 15주 연구에서 AGT-결핍 마우스에서 생체내 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 8은 AGT-결핍 마우스의 간에서 생체내 LDHA 단백질의 면역조직화학적 염색을 타나내다.
도 9는 표 19에 묘사된 편집 수준과 단백질 수준 사이의 상관관계를 나타낸다.
도 10은 예시적인 sgRNA 서열에서 1 내지 10 (서열번호 2082)의 10개의 보존된 영역 YA 부위를 표지한다. 숫자 25, 45, 50, 56, 64, 67, 및 83은 (N)x로서 나타낸 가이드 영역을 갖는 sgRNA에서 YA 부위 1, 5, 6, 7, 8, 9 및 10의 피리미딘의 위치를 나타내고, 예를 들어, 여기서 x는 임의로 20이다.
도 11은 하단 줄기 (stem), 돌출부 (bulge), 상단 줄기, 넥서스 (이의 뉴클레오티드는 각각 5'에서 3' 방향으로 N1 내지 N18로서 지칭될 수 있음), 헤어핀 1, 및 헤어핀 2 영역을 포함한 sgRNA의 보존된 영역의 개별 뉴클레오티드를 지정하는 라벨을 갖는 가능한 2차 구조의 예시적인 sgRNA (서열번호 401; 모든 변형을 나타내지 않음)를 나타낸다. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 뉴클레오티드는 n으로 표지된다. 가이드 영역은 sgRNA 상에 존재할 수 있고, 이 도면에서 sgRNA의 보존된 영역 앞에 "(N)x"로 나타낸다.
도 12a 내지 12c는 일차 사이노몰구스 간세포에서 LDHA를 표적화하는 특정 sgRNA의 퍼센트 편집의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 13a 및 13b는 1차 인간 및 사이노몰구스 간세포에서 특정 sgRNA를 포함하는 리포펙션 처리 후 LDHA 발현에서 상대적 감소의 용량 반응 곡선을 나타낸다.
도 14a 내지 14c는 AGT-결핍 마우스의 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후, 용량-의존적 소변 옥살레이트 수준, 퍼센트 편집 및 소변 옥살레이트 수준과 퍼센트 편집 사이의 상관관계를 각각 나타낸다.
도 15a 및 15b는 실시예 4에 기재된 바와 같이 15주 내구성 연구에서 AGT-결핍 마우스의 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 간 및 근육 샘플에서의 LDHA 활성을 나타낸다.
도 16a 및 16b는 실시예 4에 기재된 바와 같이 15주 지속성 연구에서 AGT-결핍 마우스의 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 간 및 혈장 샘플에서의 피루베이트 수준을 나타낸다.
도 17은 특정 sgRNA를 포함하는 LNP로 처리한 후 5/6 신장절제술 또는 샴 (sham) 수술을 받은 마우스에서 평균 혈장 락테이트 제거율을 나타낸다.
이제 본 발명의 특정 구현예에 대한 참조가 상세하게 이루어질 것이고, 이의 예는 첨부된 도면에 도시되어 있다. 본 발명은 예시된 구현예와 관련하여 설명되지만, 본 발명을 이들 구현예로 제한하려는 의도가 아님을 이해할 것이다. 반대로, 본 발명은 첨부된 청구범위 및 포함된 구현예에 의해 정의된 바와 같이 본 발명 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변형, 및 등가물을 포함하도록 의도된다.
본 교시를 상세하게 설명하기 전에, 개시내용이 특정 조성물 또는 공정 단계로 제한되지 않고, 그 자체가 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이 "a", "an" "the"는 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 언급을 포함함을 주목해야 한다. 따라서, 예를 들어, "접합체"에 대한 언급은 복수의 접합체를 포함하고 "세포"에 대한 언급은 복수의 세포 등을 포함한다.
숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 측정 및 측정 가능한 값은 유효 숫자 및 측정과 관련된 오류를 고려하여 근사치로 이해된다. 또한, "포함하다 (comprise)", "포함하다 (comprises)", "포함하는 (comprising)", "함유하다 (contain)", "함유하다 (contains)", "함유하는 (containing)", "포함하다 (include)", "포함하다 (includes)" 및 "포함하는 (including)"의 사용은 제한하려는 의도가 아니다. 전술한 일반적인 설명과 상세한 설명 둘 다는 예시적이고 설명적일 뿐이며 교시를 제한하지 않음을 이해해야 한다.
명세서에서 구체적으로 언급하지 않는 한, 다양한 구성요소를 "포함하는"을 언급하는 명세서에서의 구현예는 또한, 언급된 구성요소의 "이루어진" 또는 "본질적으로 이루어진"으로 고려되고; 다양한 구성요소로 "이루어진"을 언급하는 명세서에서의 구현예는 또한, 언급된 구성요소를 "포함하는" 또는 "본질적으로 이루어진"으로 고려되고; 다양한 구성요소로 "본질적으로 이루어진"을 언급하는 명세서에서의 구현예는 또한, 언급된 구성요소를 "이루는" 또는 "포함하는"으로 고려된다 (이 상호교환성은 청구범위에서 이들 용어의 사용에 적용되지 않음). 용어 "또는"은 포괄적인 의미, 즉 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 "및/또는"과 동등한 의미로 사용된다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성 목적으로만 사용되고 어떤 방식으로든 원하는 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 참고로 포함된 임의의 자료가 본 명세서에 정의된 임의의 용어 또는 본 명세서의 임의의 다른 표현 내용과 모순되는 경우, 본 명세서가 우선한다. 본 교시가 다양한 구현예와 관련하여 설명되었지만, 본 교시가 그러한 구현예로 제한되는 것으로 의도되지 않는다. 반대로, 본 교시는 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 다양한 대안, 변형 및 등가물을 포함한다.
I. 정의
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 다음 용어 및 구는 다음 의미를 갖는 것으로 의도된다:
"폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 통상적인 RNA, DNA, 혼합 RNA-DNA 및 이들의 유사체인 중합체를 포함한 골격을 따라 함께 연결된 질소성 헤테로사이클릭 염기 또는 염기 유사체를 갖는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체를 포함하는 다량체 화합물을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 핵산 "골격"은 당-포스포디에스테르 연결, 펩타이드-핵산 결합 ("펩타이드 핵산" 또는 PNA; PCT 번호 제WO 95/32305호), 포스포로티오에이트 결합, 메틸포스포네이트 연결, 또는 이들의 조합 중 하나 이상을 포함하는 다양한 연결로 구성될 수 있다. 핵산의 당 모이어티는 리보스, 데옥시리보스 또는 치환, 예를 들어, 2' 메톡시 또는 2' 할라이드 치환을 갖는 유사한 화합물일 수 있다. 질소성 염기는 통상적인 염기 (A, G, C, T, U), 이의 유사체 (예를 들어, 변형된 우리딘, 예컨대 5-메톡시우리딘, 슈도우리딘, 또는 N1-메틸슈도우리딘, 또는 기타); 이노신; 퓨린 또는 피리미딘의 유도체 (예를 들어, N4-메틸 데옥시아노신, 데아자- 또는 아자-퓨린, 데아자- 또는 아자-피리미딘, 5 또는 6 위치에서 치환기를 갖는 피리미딘 염기 (예를 들어, 5-메틸시토신), 2, 6, 또는 8 위치에서 치환기를 갖는 퓨린 염기, 2-아미노-6-메틸아미노퓨린, O6-메틸구아닌, 4-티오-피리미딘, 4-아미노-피리미딘, 4-디메틸하이드라진-피리미딘, 및 O4-알킬-피리미딘; 미국 특허 제5,378,825호 및 PCT 번호 제WO 93/13121호)일 수 있다. 일반적인 논의는 문헌 (The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al., ed., 11th ed., 1992)을 참조한다. 핵산은 골격이 중합체의 위치(들)에 대한 질소성 염기를 포함하지 않는 하나 이상의 "비염기성" 잔기를 포함할 수 있다 (미국 특허 번호 제5,585,481호). 핵산은 통상적인 RNA 또는 DNA 당, 염기 및 연결만을 포함할 수 있거나, 통상적인 구성요소 및 치환 (예를 들어, 2' 메톡시 연결을 갖는 통상적인 염기, 또는 통상적인 염기 및 하나 이상의 염기 유사체를 둘 다 함유하는 중합체)을 둘 다 포함할 수 있다. 핵산은 상보적 RNA 및 DNA 서열에 대한 혼성화 친화성을 향상시키는 당 형태를 모방하는 RNA에 잠금된 바이사이클릭 퓨라노스 단위를 갖는 하나 이상의 LNA 뉴클레오티드 단량체를 함유하는 유사체인 "잠금된 핵산" (LNA: locked nucleic acid)을 포함한다 (Vester 및 Wengel, 2004, Biochemistry 43(42):13233-41). RNA 및 DNA는 상이한 당 모이어티를 가지고, RNA에서 우라실 또는 이의 유사체와 DNA에서 티민 또는 이의 유사체의 존재에 의해 상이할 수 있다.
"가이드 RNA", "gRNA", 및 "가이드"는 crRNA (CRISPR RNA로도 알려짐) 또는 crRNA와 trRNA의 조합 (tracrRNA로도 알려짐)을 지칭하기 위해 본원에서 상호교환적으로 사용된다. crRNA 및 trRNA는 단일 RNA 분자 (단일 가이드 RNA, sgRNA) 또는 2개의 개별 RNA 분자 (이중 가이드 RNA, dgRNA)로서 회합될 수 있다. "가이드 RNA" 또는 "gRNA"는 각 유형을 지칭한다. trRNA는 자연 발생 서열, 또는 자연 발생 서열과 비교하여 변형 또는 변이가 있는 trRNA 서열일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "가이드 서열"은 표적 서열에 상보적이고 RNA-가이드된 DNA 결합제에 의한 결합 또는 변형 (예를 들어, 절단)을 위해 가이드 RNA를 표적 서열로 지시하는 기능을 하는 가이드 RNA 내의 서열을 지칭한다. "가이드 서열"은 "표적화 서열" 또는 "스페이서 서열"로도 지칭될 수 있다. 가이드 서열은 스트렙토코커스 피로게네스 (즉, Spy Cas9) 및 관련된 Cas9 상동체/오톨로그의 경우 20개의 염기 쌍 길이일 수 있다. 더 짧거나 더 긴 서열은 또한, 예를 들어, 15-, 16-, 17-, 18-, 19-, 21-, 22-, 23-, 24-, 또는 25-뉴클레오티드 길이인 가이드로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 서열은 서열 번호 1 내지 84로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 서열은, 예를 들어, 유전자 또는 염색체에 있고 가이드 서열에 상보적이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 가이드 서열은 서열번호 1 내지 84로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드와 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 적어도 하나의 불일치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 가이드 서열 및 표적 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 포함할 수 있고, 여기서, 표적 서열의 총 길이는 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 염기 쌍이다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1 내지 4개의 불일치를 포함할 수 있고, 여기서, 가이드 서열은 적어도 17, 18, 19, 20개 이상의 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 서열 및 표적 영역은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 포함할 수 있고, 여기서, 가이드 서열은 20개의 뉴클레오티드를 포함한다.
RNA-가이드된 DNA 결합제에 대한 핵산 기질이 이중 가닥 핵산이므로, RNA-가이드된 DNA 결합제에 대한 표적 서열은 게놈 DNA의 양성 및 음성 가닥 (즉, 주어진 서열 및 서열의 역 보체)을 둘 다 포함한다. 따라서, 가이드 서열이 "표적 서열에 상보적"이라고 언급되는 경우, 가이드 서열은 가이드 RNA가 표적 서열의 역 보체에 결합하도록 지시할 수 있음을 이해해야 한다. 따라서, 일부 구현예에서, 가이드 서열이 표적 서열의 역 보체에 결합하는 경우, 가이드 서열은 가이드 서열에서 T를 U로 치환하는 것을 제외하고는 표적 서열 (예를 들어, PAM을 포함하지 않는 표적 서열)의 특정 뉴클레오티드와 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "YA 부위"는 5'-피리미딘-아데닌-3' 디뉴클레오티드를 지칭한다. "보존된 영역 YA 부위"는 sgRNA의 보존된 영역에 존재한다. "가이드 영역 YA 부위"는 sgRNA의 가이드 영역에 존재한다. sgRNA에서 비변형된 YA 부위는 RNase-A 유사 엔도뉴클레아제, 예를 들어, RNase A에 의해 절단되기 쉬울 수 있다. 일부 구현예에서, sgRNA는 이의 보존된 영역에서 약 10개의 YA 부위를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 이의 보존된 영역에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 YA 부위를 포함한다. 예시적인 보존된 영역 YA 부위는 도 10에 나타낸다. 가이드 영역은 임의의 수의 YA 부위를 포함하여 임의의 서열일 수 있으므로 예시적인 가이드 영역 YA 부위는 도 10에 나타내지 않는다. 일부 구현예에서, sgRNA는 도 10에 나타낸 YA 부위 중 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 다음 위치 또는 이의 서브세트에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 YA 부위를 포함한다: LS5-LS6; US3-US4; US9-US10; US12-B3; LS7-LS8; LS12-N1; N6-N7; N14-N15; N17-N18; 및 H2-2 내지 H2-3. 일부 구현예에서, YA 부위는 변형을 포함하고, 이는 YA 부위의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형됨을 의미한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 피리미딘 (피리미딘 위치로도 불림)은 변형 (피리미딘의 당의 3' 바로 인접한 뉴클레오시드간 연결을 변경하는 변형을 포함)을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 아데닌 (아데닌 위치로도 불림)은 변형 (아데닌의 당의 3' 바로 인접한 뉴클레오시드간 연결을 변경하는 변형을 포함)을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 피리미딘 위치 및 아데닌 위치는 변형을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "RNA-가이드된 DNA 결합제"는 RNA 및 DNA 결합 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 폴리펩티드의 복합체, 또는 그러한 복합체의 DNA-결합 서브유닛을 의미하고, 여기서, DNA 결합 활성은 서열-특이적이고 RNA의 서열에 따라 다르다. 예시적인 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 클리바세/닉카제 및 이의 불활성화된 형태 ("dCas DNA 결합제")를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Cas 단백질"로도 불리는 "Cas 뉴클레아제뉴클레아제"는 Cas 클리바세, Cas 닉카제 및 dCas DNA 결합제를 포함한다. Cas 클리바세/닉카제 및 dCas DNA 결합제는 III형 CRISPR 시스템의 Csm 또는 Cmr 복합체, Cas10, Csm1, 또는 이의 Cmr2 서브유닛, I형 CRISPR 시스템의 캐스케이드 복합체, 이의 Cas3 서브유닛, 및 부류 2 Cas 뉴클레아제를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "부류 2 Cas 뉴클레아제"는 Cas9 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합 활성을 갖는 단일-사슬 폴리펩타이드이다. 부류 2 Cas 뉴클레아제는 RNA-가이드된 DNA 클리바세 또는 닉카제 활성을 추가로 갖는 부류 2 Cas 클리바세 및 부류 2 Cas 닉카제 (예를 들어, H840A, D10A, 또는 N863A 변이체), 및 클리바세/닉카제 활성이 비활성화된 부류 2 dCas DNA 결합제를 포함한다. 부류 2 Cas 뉴클레아제는, 예를 들어, Cas9, Cpf1, C2c1, C2c2, C2c3, HF Cas9 (예를 들어, N497A, R661A, Q695A, Q926A 변이체), HypaCas9 (예를 들어, N692A, M694A, Q695A, H698A 변이체), eSPCas9(1.0) (예를 들어, K810A, K1003A, R1060A 변이체), 및 eSPCas9(1.1) (예를 들어, K848A, K1003A, R1060A 변이체) 단백질 및 이의 변형을 포함한다. Cpf1 단백질 (Zetsche et al., Cell, 163: 1-13 (2015))은 Cas9와 상동성이고, RuvC-유사 뉴클레아제 도메인을 포함한다. Zetsche의 Cpf1 서열은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 예를 들어, Zetsche의 표 S1 및 S3을 참조한다. "Cas9"는 Spy Cas9, 본원에 열거된 Cas9의 변이체 및 이의 등가물을 포함한다. 예를 들어, 문헌 (Makarova et al., Nat Rev Microbiol, 13(11): 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015))을 참조한다.
본원에 사용된 바와 같이, "리보핵단백질" (RNP) 또는 "RNP 복합체"는 Cas 뉴클레아제, 예를 들어, Cas 클리바세, Cas 닉카제, 또는 dCas DNA 결합제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제와 함께 가이드 RNA를 지칭한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 Cas9와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 표적 서열로 가이드하고, 가이드 RNA는 표적 서열과 혼성화하고 제제가 표적 서열에 결합한다; 제제가 클리바세 또는 닉카제인 경우, 결합은 절단 또는 닉킹 (nicking)이 뒤따를 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 제1 서열에 대한 제2 서열의 정렬이 제2 서열의 이의 전체 위치의 X% 이상이 제1 서열과 일치함을 나타내는 경우, 제1 서열은 제2 서열과 "적어도 X% 동일성을 갖는 서열을 포함"하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 서열 AAGA는 제2 서열의 3개 위치 모두에 대한 일치가 존재한다는 점에서 정렬이 100% 동일성을 제공하기 때문에 서열 AAG와 100% 동일성을 갖는 서열을 포함한다. RNA와 DNA 사이의 차이 (일반적으로 우리딘을 티미딘으로 또는 그 반대로 교환) 및 변형된 우리딘과 같은 뉴클레오시드 유사체의 존재는, 관련 뉴클레오티드 (예컨대 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘)가 동일한 보체 (예를 들어, 모든 티미딘, 우리딘, 또는 변형된 우리딘에 대한 아데노신; 또 다른 예는 시토신 및 5-메틸시토신이며, 둘 다 보체로서 구아노신 또는 변형된 구아노신을 갖는다)를 갖는 한, 폴리뉴클레오티드 간의 동일성 또는 상보성의 차이에 기여하지 않는다. 따라서, 예를 들어, 슈도우리딘, N1-메틸슈도우리딘, 또는 5-메톡시우리딘과 같은 X가 임의의 변형된 우리딘인 서열 5'-AXG는 둘 다가 동일한 서열 (5'-CAU)에 완벽하게 상보적이라는 점에서 AUG와 100% 동일한 것으로 간주된다. 예시적인 정렬 알고리즘은 당업계에 잘 알려진 Smith-Waterman 및 Needleman-Wunsch 알고리즘이다. 당업자는 어떤 알고리즘과 파라미터 설정의 선택이 정렬된 주어진 서열 쌍에 적절한지를 이해할 것이다; 일반적으로 유사한 길이 및 아미노산의 경우 > 50% 또는 뉴클레오티드의 경우> 75%의 예상 동일성을 갖는 서열의 경우, www.ebi.ac.uk 웹 서버에서 EBI에 의해 제공되는 Needleman-Wunsch 알고리즘 인터페이스의 디폴트 설정을 사용하는 Needleman-Wunsch 알고리즘이 일반적으로 적절하다.
"mRNA"는 RNA 또는 변형된 RNA이고 폴리펩티드로 해독될 수 있는 오픈 리딩 프레임을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다 (즉, 리보솜 및 아미노-아실화된 tRNA에 의한 해독을 위한 기질로서 작용할 수 있음). mRNA는 리보스 잔기 또는 이의 유사체, 예를 들어 2'-메톡시 리보스 잔기를 포함하는 포스페이트-당 골격을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, mRNA 포스페이트-당 골격의 당은 본질적으로 리보스 잔기, 2'-메톡시 리보스 잔기 또는 이들의 조합으로 이루어진다.
본원에 기재된 가이드 RNA 조성 및 방법에 유용한 가이드 서열은 표 1 및 출원 전반에 걸쳐 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, "인델"은 표적 핵산에서 이중-가닥 파괴 (DSB) 부위에 삽입되거나 결실된 다수의 뉴클레오티드로 이루어진 삽입/결실 돌연변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "녹다운"은 특정 유전자 산물 (예를 들어, 단백질, mRNA, 또는 둘 다)의 발현의 감소를 지칭한다. 단백질의 녹다운은 관심있는 조직 또는 세포 집단으로부터 단백질의 총 세포 양을 검출하여 측정될 수 있다. mRNA의 녹다운을 측정하는 방법은 알려져 있고, 관심있는 조직 또는 세포 집단으로부터 단리된 mRNA의 서열분석을 포함한다. 일부 구현예에서, "녹다운"은 특정 유전자 산물의 발현의 일부 손실, 예를 들어, 전사된 mRNA 양의 감소 또는 세포 집단에 의해 발현된 단백질 양의 감소를 지칭할 수 있다 (조직에서 발견되는 것들과 같은 생체내 집단을 포함함).
본원에 사용된 바와 같이, "녹아웃"은 세포에서 특정 단백질의 발현 손실을 지칭한다. 녹아웃은 세포, 조직 또는 세포 집단에서 단백질의 총 세포 양을 감지함으로써 측정될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시내용의 방법은 하나 이상의 세포에서 (예를 들어, 조직에서 발견되는 것들과 같은 생체내 집단을 포함하는 세포 집단에서) LDHA를 "녹아웃"한다. 일부 구현예에서, 녹아웃은, 예를 들어, 인델에 의해 생성된 돌연변이 LDHA 단백질의 형성이 아니라 세포에서 LDH 단백질의 완전한 발현 손실이다. 본원에 사용된 바와 같이, "LDH"는 LDHA 유전자의 유전자 산물인 락테이트 데하이드로게나제를 지칭한다. 인간 야생형 LDHA 서열은 NCBI 유전자 ID: 3939; Ensembl ENSG00000134333에서 가용하다.
"고수산뇨증"은 소변에서 과도한 옥살레이트를 특징으로 하는 병태이다. 고수산뇨증의 예시적인 유형은 원발성 고수산뇨증 (1형 (PH1), 2형 (PH2), 및 3형 (PH3) 포함), 옥살산증, 장성 고수산뇨증, 및 고-옥살레이트 식품 섭취와 관련된 고수산뇨증을 포함한다. 고수산뇨증은 특발성일 수 있다. 높은 옥살레이트 수준은 옥살산칼슘 결석 형성 및 신장 실질 손상을 유발하여 신장 기능의 점진적인 저하를 초래하고 결국 말기 신장 질환을 초래한다. 따라서, 고수산뇨증은 과도한 옥살레이트 생성과 콩팥과 요로에서의 옥살살칼슘 결정의 침착을 초래할 수 있다. 옥살레이트로부터의 신장 손상은 세뇨관 독성, 콩팥에서의 옥살산칼슘 침착, 옥살산칼슘 결석에 의한 소변 폐색의 조합에 의해 야기된다. 과도한 옥살레이트가 더 이상 효과적으로 배설될 수 없기 때문에 손상된 콩팥 기능은 질환을 악화시켜 뼈, 눈, 피부, 및 심장, 및 기타 기관에 옥살레이트의 후속적 축적 및 결정화를 초래하여 심각한 질병과 사망을 야기한다. 신부전 및 말기 신장 질환이 발생할 수 있다. 고수산뇨증에 대한 승인된 약제학적 요법은 없다.
"원발성 고수산뇨증 1형 (PH1)"은 간 퍼옥시좀 알라닌-글리옥실레이트 아미노트랜스퍼라제 (AGT) 효소를 암호화하는 AGXT 유전자의 돌연변이로 인한 상염색체 열성 장애이다. AGT는 글리옥실레이트를 글리신으로 대사한다. AGT 활성이 결여되어 있거나 미토콘드리아에 대한 잘못된 표적화는 글리옥실레이트가 옥살레이트로 산화되어 소변으로만 배설될 수 있도록 한다.
콩팥에 의해 배설되기 전에 글리옥실레이트를 옥실레이트로 전환하는 간 퍼옥시좀 효소인 락테이트 데하이드로게나제 (LDH)를 방해하는 것은 고수산뇨증에서 발생하는 병리를 잠재적으로 예방하기 위해 병든 간에서 옥살레이트 합성을 차단하는 하나의 가능한 메커니즘이다. 락테이트 데하이드로게나제 유전자 (LDHA) 유전자에 의해 암호화된 LDH는 글리옥실레이트로부터 옥살레이트로의 전환을 촉매한다. LDH 활성의 억제는 옥살레이트 생성을 억제하여 소변의 옥살레이트 수준을 감소시키면서 글리옥실레이트 리덕타제/하이드록시피루베이트 리덕타제 (GRHPR)에 의해 글리콜레이트로 전환될 수 있는 글리옥실레이트의 축적을 야기해야 한다. 옥살레이트와 달리, 글리콜레이트는 가용성이며, 소변으로 쉽게 배설된다. 현재 상승된 글리콜레이트 수준의 알려진 부작용은 없다. 따라서, 일부 구현예에서, 일단 억제되면 옥살레이트 생성이 억제되고 글리콜레이트 생성이 증가되는 LDH 활성을 억제하는 방법이 제공된다.
글리옥실레이트의 산화 생성물인 옥살레이트는 소변으로만 배설될 수 있다. 소변에서 높은 수준의 옥살레이트 ("고수산뇨증")는 고수산뇨증의 증상이다. 따라서, 소변 내 증가된 옥살레이트는 고수산뇨증의 증상이다. 옥살레이트는 칼슘과 결합하여 콩팥 및 방광 결석의 주 성분인 옥살산칼슘을 형성할 수 있다. 콩팥 및 기타 조직에 옥살산칼슘의 침착은 소변에서의 혈액 (혈뇨), 요로 감염, 신장 손상, 말기 신장 질환 등을 유발할 수 있다. 시간 경과에 따라, 혈중 옥살레이트 수준이 상승할 수 있고 옥살산칼슘이 신체 전체의 다른 기관에 침착될 수 있다 (옥살산증 또는 전신성 옥살산증).
본원에 사용된 바와 같이, "표적 서열"은 gRNA의 가이드 서열에 상보성을 갖는 표적 유전자의 핵산 서열을 지칭한다. 표적 서열과 가이드 서열의 상호작용은 RNA-가이드된 DNA 결합제가 표적 서열 내에서 결합하고 잠재적으로 닉킹 또는 절단 (작용제의 활성에 따름)하도록 지시한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료"는 대상체에서 질환 또는 장애에 대한 치료제의 임의의 투여 또는 적용을 지칭하고, 질환 억제, 이의 발병 억제, 질환의 하나 이상의 증상 완화, 질환 치료, 또는 질환의 하나 이상의 증상 재발 방지를 포함한다. 예를 들어, 고수산뇨증의 치료는 고수산뇨증의 증상 완화를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 "옥살레이트의 치료적으로 관련된 감소" 또는 "치료 범위 내의 옥살레이트 수준"이라는 용어는 기준선과 비교하여 소변 옥살레이트 배설물의 30% 초과의 감소를 의미한다. 문헌 (Leumann and Hoppe (1999) Nephrol Dial Transplant 14:2556-2558 at 2557, second column)을 참조한다. 예를 들어, 치료 범위 내에서 옥살레이트 수준을 달성한다는 것은 기준선으로부터 30% 초과로 소변 옥살레이트를 감소시킴을 의미한다. 일부 구현예에서, "정상 옥살레이트 수준" 또는 "정상 옥살레이트 범위"는 약 80 μg과 약 122 μg 사이의 옥살레이트/mg 크레아티닌이다. 문헌 (Li et al. (2016) Biochim Biophys Acta 1862(2):233-239)을 참조한다. 일부 구현예에서, 치료적으로 관련된 옥살레이트의 감소는 정상의 200%, 150%, 125%, 120%, 115%, 110%, 105%, 또는 100% 미만 또는 그 이내의 수준을 달성한다.
용어 "약" 또는 "대략"은 값이 측정 또는 결정되는 방법에 부분적으로 의존하는 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용 가능한 오류를 의미한다.
II. 조성물
A.
가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물
예를 들어, RNA-가이드된 DNA 결합제 (예를 들어, CRISPR/Cas 시스템)와 함께 가이드 RNA를 사용하여 LDHA 유전자 내에서 이중-가닥 파괴 (DSB)를 유도하는 데 유용한 조성물이 본원에서 제공된다. 조성물은 고수산뇨증을 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상체에게 투여될 수 있다. 조성물은 증가된 소변 옥살레이트 생산량 또는 감소된 혈청 글리콜레이트 생산량을 갖는 대상체에게 투여될 수 있다. LDHA 유전자를 표적화하는 가이드 서열은 표 1의 서열번호 1 내지 84에 나타낸다.
표 1의 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192에 나타낸 각각의 가이드 서열은 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함하여 예를 들어, 이의 3' 단부에서 가이드 서열 뒤에 하기 예시적인 뉴클레오티드 서열과 함께 crRNA를 형성한다: 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG (서열번호 200). sgRNA의 경우, 상기 가이드 서열은 추가 뉴클레오티드를 추가로 포함하여 예를 들어, 가이드 서열의 3' 단부 뒤에 하기 예시적인 뉴클레오티드 서열과 함께 sgRNA를 형성한다: 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU (서열번호 201) 또는 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열번호 203, 4개의 말단 U가 없는 서열번호 201). 일부 구현예에서, 서열 번호 201의 4개의 말단 U는 존재하지 않는다. 일부 구현예에서, 서열번호 201의 4개의 말단 U 중 1, 2 또는 3개만이 존재한다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 가이드 서열 및 헤어핀 영역을 포함하는 "sgRNA의 보존된 부분"을 포함하는 LDHA 짧은-단일 가이드 RNA (LDHA 짧은-sgRNA)가 제공되고, 여기서, 헤어핀 영역은 적어도 5 내지 10개의 뉴클레오티드 또는 6 내지 10개의 뉴클레오티드가 결여되어 있다. 특정 구현예에서, LDHA 짧은-단일 가이드 RNA의 헤어핀 영역은 sgRNA의 보존된 부분과 관련하여 5 내지 10개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 표 2B에서의 뉴클레오티드 H1-1 내지 H2-15가 결여되어 있다. 특정 구현예에서, LDHA 짧은-단일 가이드 RNA의 헤어핀 1 영역은 sgRNA의 보존된 부분과 관련하여 5 내지 10개의 뉴클레오티드, 예를 들어, 표 2B에서의 뉴클레오티드 H1-1 내지 H1-12가 결여되어 있다.
예시적인 "sgRNA의 보존된 부분"은 에스. 피로게네스 (S. pyogenes) Cas9 ("spyCas9" ("spCas9"로도 지칭됨)) sgRNA의 "보존된 영역"을 나타내는 표 2A에 나타낸다. 제1 행은 뉴클레오티드의 번호매김을 나타내고, 제2 행은 서열 (서열 번호 700)을 나타낸다; 제3 행은 "도메인"을 나타낸다. 문헌 (Briner AE et al., Molecular Cell 56:333-339 (2014))은 표적화를 담당하는 "스페이서" 도메인, "하단 줄기", "돌출부", "상단 줄기" (테트라루프를 포함할 수 있음), "넥서스" 및 "헤어핀 1" 및 "헤어핀 2" 도메인 포함하는, "도메인"으로 본원에서 지칭되는 sgRNA의 기능적 도메인을 설명한다. Briner 등의 334쪽, 도 1a를 참조한다.
표 2B는 본원에 사용된 sgRNA의 도메인의 개략도를 제공한다. 표 2B에서, 영역 사이의 "n"은 뉴클레오티드의 가변 수, 예를 들어, 0 내지 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 이상을 나타낸다. 일부 구현예에서, n은 0과 같다. 일부 구현예에서, n은 1과 같다.
일부 구현예에서, LDHA sgRNA는 에스. 피로겐 (S. pyogene) Cas9 ("spyCas9") 또는 spyCas9 등가물로부터 기원한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 에스. 피로겐으로부터 기원하지 않는다 ("비-spyCas9"). 일부 구현예에서, 5 내지 10개의 뉴클레오티드 또는 6 내지 10개의 뉴클레오티드는 연속적이다.
일부 구현예에서, LDHA 짧은-sgRNA는 표 2A에 나타낸 바와 같이 에스. 피로겐 Cas9 ("spyCas9") sgRNA의 보존된 부분의 적어도 뉴클레오티드 54 내지 58 (AAAAA)이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, LDHA 짧은-sgRNA는, 예를 들어, 쌍별 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 spyCas9의 보존된 부분의 뉴클레오티드 54 내지 58 (AAAAA)에 상응하는 뉴클레오티드가 적어도 결여된 비-spyCas9 sgRNA이다. 일부 구현예에서, 비-spyCas9 sgRNA는 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus) Cas9 ("saCas9") sgRNA이다.
일부 구현예에서, LDHA 짧은-sgRNA는 spyCas9 sgRNA의 보존된 부분의 적어도 뉴클레오티드 54 내지 61 (AAAAAGUG)이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, LDHA 짧은-sgRNA는 spyCas9 sgRNA의 보존된 부분의 뉴클레오티드 53 내지 60 (GAAAAAGU)이 적어도 결여되어 있다. 일부 구현예에서, LDHA 짧은-sgRNA는 spyCas9 sgRNA의 보존된 부분의 뉴클레오티드 53 내지 60 (GAAAAAGU) 또는 뉴클레오티드 54 내지 61 (AAAAAGUG)의 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 뉴클레오티드, 또는, 예를 들어, 쌍별 또는 구조적 정렬에 의해 결정된 바와 같이 비-spyCas9 sgRNA의 보존된 부분의 상응하는 뉴클레오티드가 결여되어 있다.
일부 구현예에서, sgRNA는 서열번호 1 내지 146의 가이드 서열 중 임의의 하나 및 추가 뉴클레오티드를 포함하여 예를 들어, 이의 3' 단부에서 가이드 서열 뒤에 하기 예시적인 뉴클레오티드 서열과 함께 crRNA를 형성한다: 5'에서 3' 방향으로 GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGGCACCGAGUCGGUGC (서열번호 202). 서열번호 202는 야생형 가이드 RNA 보존된 서열과 관련하여 8개의 뉴클레오티드가 결여되어 있다: GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC (서열번호 203).
[표 1] 인간 및 사이노몰구스 원숭이에 대한 LDHA 표적화된 가이드 서열 및 염색체 좌표
표 2B
일부 구현예에서, 본 발명은 뉴클레아제 (예를 들어, Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9)일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 LDHA의 표적 DNA 서열로 지시하는 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA (gRNA)를 포함하는 조성물을 제공한다. gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함하는 crRNA를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드와 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, gRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열과 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 동일성을 갖는 서열을 포함하는 crRNA를 포함한다. gRNA는 trRNA를 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 각각의 조성물 및 방법 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 단일 RNA (sgRNA)로서 회합될 수 있거나, 개별 RNA (dgRNA) 상에 있을 수 있다. sgRNA의 맥락에서, crRNA 및 trRNA 조성은, 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 또는 다른 공유 결합을 통해 공유적으로 연결될 수 있다.
본원에 기재된 각각의 조성물, 용도 및 방법 구현예에서, 가이드 RNA는 "이중 가이드 RNA" 또는 "dgRNA"로서 2개의 RNA 분자를 포함할 수 있다. dgRNA 는, 예를 들어, 표 1에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA를 포함하는 제1 RNA 분자 및 trRNA를 포함하는 제2 RNA 분자를 포함한다. 제1 및 제2 RNA 분자는 공유적으로 연결되지 않을 수 있지만 crRNA와 trRNA의 일부 사이의 염기 쌍을 통해 RNA 듀플렉스를 형성할 수 있다.
본원에 기재된 각각의 조성물, 용도 및 방법 구현예에서, 가이드 RNA는 "단일 가이드 RNA" 또는 "sgRNA"로서 단일 RNA 분자를 포함할 수 있다. sgRNA는 trRNA에 공유적으로 연결된 표 1에 나타낸 가이드 서열을 포함하는 crRNA (또는 이의 일부)를 포함할 수 있다. sgRNA는 표 1에 나타낸 가이드 서열의 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 링커를 통해 공유적으로 연결된다. 일부 구현예에서, sgRNA는 crRNA와 trRNA 일부 사이의 염기 쌍을 통해 줄기-루프 구조를 형성한다. 일부 구현예에서, crRNA 및 trRNA는 포스포디에스테르 결합이 아닌 하나 이상의 결합을 통해 공유적으로 연결된다..
일부 구현예에서, trRNA는 자연-발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래된 trRNA 서열의 전부 또는 일부를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, trRNA는 절단되거나 변형된 야생형 trRNA를 포함한다. trRNA의 길이는 사용된 CRISPR/Cas 시스템에 따라 다르다. 일부 구현예에서, trRNA는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 또는 100개 초과의 뉴클레오티드를 포함하거나 이루어진다. 일부 구현예에서, trRNA는, 예를 들어, 하나 이상의 헤어핀 또는 줄기-루프 구조, 또는 하나 이상의 돌출부 구조와 같은 특정 2차 구조를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 84 중 임의의 하나의 가이드 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나를 포함하는 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 포함하는 조성물을 제공한다.
하나의 양상에서, 본 발명은 서열 번호 1 내지 84의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는 gRNA를 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 구현예에서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 2개 이상으로부터 선택된 가이드 서열을 포함하는 적어도 하나, 예를 들어, 적어도 2개의 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 서열번호 1 내지 84의 임의의 핵산과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 각각 포함하는 적어도 2개의 gRNA를 포함한다.
본 발명의 가이드 RNA 조성물은 LDHA 유전자에서 표적 서열을 인식 (예를 들어, 하이브리드화)하도록 디자인된다. 예를 들어, LDHA 표적 서열은 절단되고 가이드 RNA를 포함하는 제공된 Cas 클리바세에 의해 절단될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제, 예컨대 Cas 클리바세는 가이드 RNA에 의해 LDHA 유전자의 표적 서열로 지시될 수 있고, 여기서, 가이드 RNA의 가이드 서열은 표적 서열과 혼성화하고 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예컨대 aCas 클리바세는 표적 서열을 절단한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 가이드 RNA의 선택은 LDHA 유전자 내의 표적 서열에 기반하여 결정된다.
임의의 특정 이론에 얽매이지 않고, 유전자의 특정 영역에서의 돌연변이 (예를 들어, 뉴클레아제-매개된 DSB의 결과로서 발생하는 인델로부터 초래되는 프레임 시프트 돌연변이)는 유전자의 다른 영역에서의 돌연변이보다 덜 관용성일 수 있으므로 DSB의 위치는 결과적으로 발생할 수 있는 단백질 녹다운의 양 또는 유형에서 중요한 요소이다. 일부 구현예에서, LDHA 내의 표적 서열에 상보적이거나 상보성을 갖는 gRNA는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 LDHA 유전자의 특정 위치로 지시하는 데 사용된다. 일부 구현예에서, gRNA는 LDHA의 엑손 1, 엑손 2, 엑손 3, 엑손 4, 엑손 5, 엑손 6, 엑손 7 또는 엑손 8에서 표적 서열에 상보적이거나 상보성을 갖는 가이드 서열을 갖도록 디자인된다.
일부 구현예에서, 가이드 서열은 인간 LDHA 유전자에 존재하는 표적 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일하다. 일부 구현예에서, 표적 서열은 가이드 RNA의 가이드 서열에 상보적일 수 있다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 가이드 서열과 이의 상응하는 표적 서열 사이의 상보성 또는 동일성의 정도는 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 100% 상보적이거나 동일할 수 있다. 다른 구현예에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 적어도 하나의 불일치를 포함할 수 있다. 예를 들어, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1, 2, 3, 또는 4개의 불일치를 포함할 수 있고, 여기서, 가이드 서열의 총 길이는 20이다. 일부 구현예에서, gRNA의 표적 서열 및 가이드 서열은 1 내지 4개의 불일치를 포함할 수 있고, 여기서, 가이드 서열은 20개의 뉴클레오티드이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 본원에 기재된 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다.
B. 변형된 gRNA 및 mRNA
일부 구현예에서, gRNA는 화학적으로 변형된다. 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함하는 gRNA는 "변형된" gRNA 또는 "화학적으로 변형된" gRNA로 불리고, 표준 (canonical) A, G, C 및 U 잔기 대신에 또는 이에 추가하여 사용되는 하나 이상의 비-천연 및/또는 자연 발생 성분 또는 배열의 존재를 설명한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 비-표준 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드로 합성되며, 본원에서는 "변형된"으로 불린다. 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 다음 중 하나 이상을 포함할 수 있다: (i) 포스포디에스테르 골격 연결에서 비-연결 포스페이트 산소 중 하나 또는 둘 다 및/또는 연결 포스페이트 산소 중 하나 이상의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 골격 변형); (ii) 리보스 당의 구성성분, 예를 들어, 리보스 당 상의 2' 하이드록실의 변경, 예를 들어, 대체 (예시적인 당 변형); (iii) "데포스포" 링커로 포스페이트 모이어티의 대규모 대체 (예시적인 골격 변형); (iv) 비-표준 핵염기를 포함하는 자연 발생 핵염기의 변형 또는 대체 (예시적인 염기 변형); (v) 리보스-포스페이트 골격의 대체 또는 변형 (예시적인 골격 변형); (vi) 올리고뉴클레오티드의 3' 단부 또는 5' 단부의 변형, 예를 들어, 말단 포스페이트 기의 제거, 변형 또는 대체, 또는 모이어티, 캡 또는 링커의 접합 (그러한 3' 또는 5' 캡 변형은 당 및/또는 골격 변형을 포함할 수 있음); 및 (vii) 당의 변형 또는 대체 (예시적인 당 변형).
상기 열거된 것과 같은 화학적 변형을 조합하여 2개, 3개, 4개 또는 그 이상의 변형을 가질 수 있는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 (집합적으로 "잔기")를 포함하는 변형된 gRNA 및/또는 mRNA를 제공할 수 있다. 예를 들어, 변형된 잔기는 변형된 당 및 변형된 핵염기를 가질 수 있다. 일부 구현예에서, gRNA의 모든 염기는 변형되는데, 예를 들어, 모든 염기는 변형된 포스페이트 기, 예컨대 포스포로티오에이트 기를 갖는다. 특정 구현예에서, gRNA 분자의 포스페이트 기의 전부 또는 실질적으로 전부는 포스포로티오에이트 기로 대체된다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 5' 단부에 또는 그 근처에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA는 RNA의 3' 단부에 또는 그 근처에 적어도 하나의 변형된 잔기를 포함한다.
일부 구현예에서, gRNA는 1, 2, 3개 이상의 변형된 잔기를 포함한다. 일부 구현예에서, 변형된 gRNA에서 위치의 적어도 5% (예를 들어, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%)는 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티이다.
비변형된 핵산, 예를 들어, 세포내 뉴클레아제 또는 혈청에서 발견되는 것들에 의해 분해되기 쉬울 수 있다. 예를 들어, 뉴클레아제는 핵산 포스포디에스테르 결합을 가수분해할 수 있다. 따라서, 하나의 양상에서, 본원에 기재된 gRNA는, 예를 들어, 세포내 또는 혈청-기반 뉴클레아제에 대한 안정성을 도입하기 위해 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 변형된 gRNA 분자는 생체내 및 생체외 둘 다에서 세포 집단에 도입될 때 감소된 선천적 면역 반응을 나타낼 수 있다. 용어 "선천적 면역 반응"은 사이토카인 발현 및 방출, 특히 인터페론 및 세포 사멸의 유도를 포함하는 단일 가닥 핵산을 포함하는 외인성 핵산에 대한 세포 반응을 포함한다.
골격 변형의 일부 구현예에서, 변형된 잔기의 포스페이트 기는 하나 이상의 산소를 상이한 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 잔기, 예를 들어, 변형된 핵산에 존재하는 변형된 잔기는 비변형된 포스페이트 모이어티를 본원에 기재된 변형된 포스페이트 기로 대량 대체함을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 포스페이트 골격의 골격 변형은 비대칭 전하 분포를 갖는 비하전된 링커 또는 하전된 링커를 초래하는 변경을 포함할 수 있다.
변형된 포스페이트 기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노 포스페이트, 보라노 포스페이트 에스테르, 수소 포스포네이트, 포스포로아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트리에스테르를 포함한다. 비변형된 포스페이트 기에서 인 원자는 아키랄이다. 그러나, 비-브릿징 (non-bridging) 산소 중 하나를 상기 원자들 또는 원자들의 기 중 하나로 대체하면 인 원자가 키랄이 되도록 할 수 있다. 입체중심 인 원자는 "R" 배열 (여기서 Rp) 또는 "S" 배열 (여기서 Sp)을 가질 수 있다. 골격은 또한 브릿징 산소 (즉, 포스페이트를 뉴클레오시드에 연결하는 산소)를, 질소 (브릿징된 포스포로아미데이트), 황 (브릿징된 포스포로티오에이트) 및 탄소 (브릿징된 메틸렌포스포네이트)로 대체하여 변형될 수 있다. 대체는 연결 산소 또는 연결 산소 둘 다에서 발생할 수 있다.
포스페이트 기는 특정 골격 변형에서 비-인 함유 커넥터로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, 하전된 포스페이트 기는 중성 모이어티로 대체될 수 있다. 포스페이트 기를 대체할 수 있는 모이어티의 예는, 제한 없이, 예를 들어, 메틸 포스페이트, 하이드록실아미노, 실록산, 카보네이트, 카복시메틸, 카바메이트, 아미드, 티오에테르, 에틸린 옥사이드 링커, 설포네이트, 설폰아미드, 티오포름아세탈, 포름아세탈, 옥심, 메틸렌이미노, 메틸렌메틸이미노, 메틸렌하이드라조, 메틸렌디메틸하이드라조 및 메틸렌옥시메틸이미노를 포함할 수 있다.
포스페이트 링커 및 리보스 당이 뉴클레아제 내성 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 대용물로 대체되는, 핵산을 모방할 수 있는 스캐폴드도 작제될 수 있다. 그러한 변형은 골격 및 당 변형을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는 대용물 골격에 의해 테더링될 수 있다. 예는, 제한 없이, 모르폴리노, 사이클로부틸, 피롤리딘 및 펩타이드 핵산 (PNA) 뉴클레오시드 대용물을 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 당 기에 대한 하나 이상의 변형, 즉 당 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 2' 하이드록실 기 (OH)는 변형될 수 있는데, 예를 들어, 다수의 상이한 "옥시" 또는 "데옥시" 치환기로 대체된다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실 기에 대한 변형은 하이드록실이 더 이상 2'-알콕시드 이온을 형성하기 위해 탈양성자화될 수 없기 때문에 핵산의 안정성을 향상시킬 수 있다.
2' 하이드록실 기 변형의 예는 알콕시 또는 아릴옥시 (또는, 여기서, "R"은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있다); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), O(CH2CH2O)nCH2CH2OR을 포함할 수 있고, 여기서, R은, 예를 들어, H 또는 임의로 치환된 알킬일 수 있고, n은 0 내지 20 (예를 들어, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실 기 변형은 2'-O-Me일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실 기 변형은 2' 하이드록실 기를 플루오라이드로 대체하는 2'-플루오로 변형일 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실 기 변형은 2' 하이드록실이, 예를 들어, C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4' 탄소에 연결될 수 있는 "잠금된" 핵산 (LNA)을 포함할 수 있고, 여기서, 예시적인 브릿지는 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 또는 아미노 브릿지; O-아미노 (여기서, 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있다) 및 아미노알콕시, O(CH2)n-아미노 (여기서, 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 또는 디헤테로아릴아미노, 에틸렌디아민, 또는 폴리아미노일 수 있다)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실 기 변형은 리보스 고리가 C2'-C3' 결합이 결여된 "비잠금된 (unlocked)" 핵산 (UNA)을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 2' 하이드록실 기 변형은 메톡시에틸 기 (MOE), (OCH2CH2OCH3, 예를 들어, PEG 유도체)를 포함할 수 있다.
"데옥시" 2' 변형은 수소 (즉, 예를 들어, 부분적으로 dsRNA의 오버행 부분에서의 데옥시리보스 당); 할로 (예를 들어, 브로모, 클로로, 플루오로, 또는 요오도); 아미노 (여기서, 아미노는, 예를 들어, NH2; 알킬아미노, 디알킬아미노, 헤테로사이클릴, 아릴아미노, 디아릴아미노, 헤테로아릴아미노, 디헤테로아릴아미노, 또는 아미노산일 수 있다); NH(CH2CH2NH)nCH2CH2- 아미노 (여기서, 아미노는, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같을 수 있다), -NHC(O)R (여기서, R은, 예를 들어, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로아릴 또는 당일 수 있다), 시아노; 머캅토; 알킬-티오-알킬; 티오알콕시; 및 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 아미노로 임의로 치환될 수 있는 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 알케닐 및 알키닐을 포함할 수 있다.
당 변형은 리보스에서 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학적 배열을 갖는 하나 이상의 탄소를 또한 포함할 수 있는 당 그룹을 포함할 수 있다. 따라서, 변형된 핵산은 당으로서, 예를 들어, 아라비노스를 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 핵산은 또한 무염기 (abasic) 당을 포함할 수 있다. 이들 무염기 당은 또한 구성성분 당 원자 중 하나 이상에서 추가로 변형될 수 있다. 변형된 핵산은 또한 L 형태, 예를 들어 L-뉴클레오시드인 하나 이상의 당을 포함할 수 있다.
변형된 핵산에 통합될 수 있는 본원에 기재된 변형된 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오티드는 핵염기로도 불리는 변형된 염기를 포함할 수 있다. 핵염기의 예는 아데닌 (A), 구아닌 (G), 시토신 (C), 및 우라실 (U)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 핵염기는 변형된 핵산에 통합될 수 있는 변형된 잔기를 제공하기 위해 변형되거나 완전히 대체될 수 있다. 뉴클레오티드의 핵염기는 퓨린, 피리미딘, 퓨린 유사체 또는 피리미딘 유사체로부터 독립적으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 핵염기는, 예를 들어, 염기의 자연-발생 및 합성 유도체를 포함할 수 있다.
이중 가이드 RNA를 사용하는 구현예에서, crRNA 및 tracr RNA 각각은 변형을 포함할 수 있다. 그러한 변형은 crRNA 및/또는 tracr RNA의 한쪽 또는 양쪽 단부에 있을 수 있다. sgRNA를 포함하는 구현예에서, sgRNA의 한쪽 또는 양쪽 단부에 있는 하나 이상의 잔기는 화학적으로 변형될 수 있고/있거나, 내부 뉴클레오시드가 변형될 수 있고/있거나, 전체 sgRNA가 화학적으로 변형될 수 있다. 특정 구현예는 5' 단부 변형을 포함한다. 특정 구현예는 3' 단부 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 "화학적으로 변형된 가이드 RNA"란 명칭으로 2017년 12월 8일에 출원된 제WO2018/107028 A1호에 개시된 변형 패턴 중 하나를 포함하고, 상기 특허의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 제US20170114334호에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함하고, 상기 특허의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 가이드 RNA는 제WO2017/136794호에 개시된 구조/변형 패턴 중 하나를 포함하고, 상기 특허의 내용은 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
C.
YA 변형
YA 부위에서 변형 (본원에서 "YA 변형"으로도 지칭됨)은 뉴클레오시드간 연결의 변형, 예를 들어, 화학적 변형, 치환, 또는 달리 및/또는 당의 변형 (예를 들어, 2'-O-알킬, 2'-F, 2'-moe, 2'-F 아라비노스, 2'-H (데옥시리보스) 등과 같은 2' 위치에서)에 의한 염기의 변형 (피리미딘 또는 아데닌)일 수 있다. 일부 구현예에서, "YA 변형"은, 예를 들어, RNase에 의한 YA 부위의 인식 또는 절단을 방해하고/하거나 RNase에 대한 절단 부위의 접근성을 감소시키는 RNA 구조 (예를 들어, 2차 구조)를 안정화함으로써 RNA 엔도뉴클레아제 활성을 감소시키기 위해 디뉴클레오티드 모티프의 구조를 변경하는 임의의 변형이다. 문헌 (Peacock et al., J Org Chem. 76: 7295-7300 (2011); Behlke, Oligonucleotides 18:305-320 (2008); Ku et al., Adv. Drug Delivery Reviews 104: 16-28 (2016); Ghidini et al., Chem. Commun., 2013, 49, 9036)을 참조한다. Peacock 등, Belhke, Ku, 및 Ghidini는 YA 변형에 적합한 예시적인 변형을 제공한다. 내핵분해 분해 (endonucleolytic degradation)를 감소시키기 위해 당업자에게 알려진 변형이 포함된다. RNase 절단에 관여하는 2' 하이드록실 기에 영향을 미치는 예시적인 2' 리보스 변형은 2'-H, 및 2'-O-Me를 포함한 2'-O-알킬이다. 변형, 예컨대 바이사이클릭 리보스 유사체, UNA, 및 YA 부위에서 잔기의 변형된 뉴클레오시드간 연결은 YA 변형일 수 있다. RNA 구조를 안정화할 수 있는 예시적인 염기 변형은 슈도우리딘 및 5-메틸시토신이다. 일부 구현예에서, YA 부위의 적어도 하나의 뉴클레오티드가 변형된다. 일부 구현예에서, YA 부위의 피리미딘 ("피리미딘 위치"로도 불림)은 변형 (예를 들어, 이의 2' 위치에서 피리미딘의 당의 3' 바로 인접한 뉴클레오시드간 연결을 변경하는 변형, 피리미딘 염기의 변형, 및 리보스의 변형을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 아데닌 ("아데닌 위치"로도 불림)은 변형 (예를 들어, 이의 2' 위치에서 피리미딘 당의 3' 바로 인접한 뉴클레오시드간 연결을 변경하는 변형, 피리미딘 염기의 변형 및 리보스의 변형을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 피리미딘 및 아데닌은 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 변형은 RNA 엔도뉴클레아제 활성을 감소시킨다.
일부 구현예에서, sgRNA는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16개 이상의 YA 부위에서 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 피리미딘은 변형 (피리미딘의 당의 3' 바로 인접한 뉴클레오시드간 연결을 변경하는 변형을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 아데닌은 변형 (피리미딘의 당의 3' 바로 인접한 뉴클레오시드간 연결을 변경하는 변형을 포함함)을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위의 피리미딘 및 아데닌은 변형, 예컨대 당, 염기, 또는 뉴클레오시드간 연결 변형을 포함한다. YA 변형은 본원에 설명된 임의의 유형의 변형일 수 있다. 일부 구현예에서, YA 변형은 포스포로티오에이트, 2'-OMe, 또는 2'-플루오로 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 변형은 포스포로티오에이트, 2'-OMe, 또는 2'-플루오로 중 하나 이상을 포함하는 피리미딘 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 변형은 하나 이상의 YA 부위를 포함하는 RNA 듀플렉스 영역 내에 바이사이클릭 리보스 유사체 (예를 들어, LNA, BNA, 또는 ENA)를 포함한다. 일부 구현예에서, YA 변형은 YA 부위를 포함하는 RNA 듀플렉스 영역 내에 바이사이클릭 리보스 유사체 (예를 들어, LNA, BNA, 또는 ENA)를 포함하며, 여기서, YA 변형은 YA 부위에 대해 원위에 있다.
일부 구현예에서, sgRNA는 가이드 영역 YA 부위 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 영역은 YA 변형을 포함할 수 있는 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 YA 부위 ("가이드 영역 YA 부위")를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단 (여기서, "5-단부" 등은 가이드 영역의 3' 단부, 즉 가이드 영역에서 최외곽 3' 뉴클레오티드에 대한 위치 5를 지칭한다)의 5' 단부로부터 5-단부, 6-단부, 7-단부, 8-단부, 9-단부, 또는 10-단부에 위치하는 하나 이상의 YA 부위는 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 5' 단부로부터 5-단부, 6-단부, 7-단부, 8-단부, 9-단부, 또는 10-단부에 위치하는 2개 이상의 YA 부위는 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 5' 단부로부터 5-단부, 6-단부, 7-단부, 8-단부, 9-단부, 또는 10-단부에 위치하는 3개 이상의 YA 부위는 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 5' 단부로부터 5-단부, 6-단부, 7-단부, 8-단부, 9-단부, 또는 10-단부에 위치하는 4개 이상의 YA 부위는 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단의 5' 단부로부터 5-단부, 6-단부, 7-단부, 8-단부, 9-단부, 또는 10-단부에 위치하는 5개 이상의 YA 부위는 YA 변형을 포함한다. 변형된 가이드 영역 YA 부위는 YA 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 가이드 영역의 3' 말단 뉴클레오티드의 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 또는 9개의 뉴클레오티드 내에 있다. 예를 들어, 변형된 가이드 영역 YA 부위가 가이드 영역의 3' 말단 뉴클레오티드의 10개의 뉴클레오티드 이내이고 가이드 영역의 길이가 20개의 뉴클레오티드인 경우, 변형된 가이드 영역 YA 부위의 변형된 뉴클레오티드는 11 내지 20 위치 중 하나에 위치한다. 일부 구현예에서, YA 변형은 가이드 영역의 3' 말단 뉴클레오티드로부터 YA 부위 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드 내에 위치한다. 일부 구현예에서, YA 변형은 가이드 영역의 3' 말단 뉴클레오티드로부터 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개의 뉴클레오티드에 위치한다.
일부 구현예에서, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 또는 11에 또는 그 뒤에 있다.
일부 구현예에서, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 5' 단부 변형이 아니다. 예를 들어, sgRNA는 본원에 기재된 5' 단부 변형을 포함할 수 있고, 변형된 가이드 영역 YA 부위를 추가로 포함한다. 대안적으로, sgRNA는 비변형된 5' 단부 및 변형된 가이드 영역 YA 부위를 포함할 수 있다. 대안적으로, sgRNA는 변형된 5' 단부 및 비변형된 가이드 영역 YA 부위를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 가이드 영역 YA 부위의 5'에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드가 포함하지 않는 변형을 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드 1 내지 3이 포스포로티오에이트를 포함하고, 뉴클레오티드 4가 2'-OMe 변형만을 포함하고, 뉴클레오티드 5가 YA 부위의 피리미딘이고 포스포로티오에이트를 포함하는 경우, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 가이드 영역 YA 부위의 5'에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 4)가 포함하지 않는 변형 (포스포로티오에이트)을 포함한다. 또 다른 예에서, 뉴클레오티드 1 내지 3이 포스포로티오에이트를 포함하고, 뉴클레오티드 4가 YA 부위의 피리미딘이고 2'-OMe를 포함하는 경우, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 가이드 영역 YA 부위의 5'에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드 1 내지 3 중 임의의 것)가 포함하지 않는 변형 (2'-OMe)을 포함한다. 이 조건은 또한 비변형된 뉴클레오티드가 변형된 가이드 영역 YA 사이트의 5'에 위치하는 경우에도 항상 충족된다.
일부 구현예에서, 변형된 가이드 영역 YA 부위는 상기 YA 부위에 대해 기재된 바와 같은 변형을 포함한다.
가이드 영역 YA 부위 변형의 추가 구현예는 상기 요약에 설명되어 있다. 본 개시내용의 다른 곳에 설명된 임의의 구현예는 전술한 구현예 중 임의의 것과 가능한 정도까지 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, sgRNA는 보존된 영역 YA 부위 변형을 포함한다. 보존된 영역 YA 부위 1 내지 10은 도 10에 도시되어 있다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10의 보존된 영역 YA 부위는 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 보존된 영역 YA 부위 1, 8, 또는 1 및 8은 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 보존된 영역 YA 부위 1, 2, 3, 4, 및 10은 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위 2, 3, 4, 8, 및 10은 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 보존된 영역 YA 부위 1, 2, 3, 및 10은 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위 2, 3, 8, 및 10은 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, YA 부위 1, 2, 3, 4, 8, 및 10은 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8의 추가 보존된 영역 YA 부위는 YA 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10의 1, 2, 3, 또는 4는 YA 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8의 추가 보존된 영역 YA 부위는 YA 변형을 포함한다.
일부 구현예에서, 변형된 보존된 영역 YA 부위는 상기 YA 부위에 대해 기재된 바와 같은 변형을 포함한다.
보존된 영역 YA 부위 변형의 추가 구현예는 상기 요약에 설명되어 있다. 본 개시내용의 다른 곳에 설명된 임의의 구현예는 전술한 구현예 중 임의의 것과 가능한 정도까지 조합될 수 있다.
일부 구현예에서, sgRNA는 표 2 위 또는 표 3 아래에 나타낸 임의의 변형 패턴을 포함하고, 여기서, N은, 존재하는 경우, 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, N의 전체는 표 1에 본원에 기재된 바와 같은 LDHA 가이드 서열을 포함한다. 표 3은 sgRNA의 가이드 서열 부분을 묘사하지 않는다. 가이드의 뉴클레오티드에 대한 N의 치환에도 불구하고 변형은 표 3에 나타낸 대로 남아 있다. 즉, 가이드의 뉴클레오티드가 "N"을 대체하더라도, 표 3에 나타낸 바와 같이 뉴클레오티드가 변형된다. 가이드 서열이 5' 단부에 추가되는 경우, 가이드 서열의 5' 단부 (또는 5' 말단)가 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me 및/또는 PS-결합을 포함한다. 일부 구현예에서, 2'-O-Me 및/또는 PS-결합은 이의 5' 단부에서 가이드 서열의 처음 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 또는 1 내지 3개의 뉴클레오티드에 있다.
[표 3] LDHA sgRNA 변형 패턴. 가이드 서열은 나타내지 않고 이의 5' 단부에 나타낸 서열을 추가할 것이다.
일부 구현예에서, 변형된 sgRNA는 하기 서열을 포함하고: mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열번호 300), 여기서, "N"은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드일 수 있고, N의 전체는 표 1에 기재된 바와 같은 LDHA 가이드 서열을 포함한다. 예를 들어, 본원에 포함되는 것은 서열번호 300이고, 여기서, N은 표 1에서 본원에 개시된 임의의 가이드 서열로 대체된다 (서열번호 1 내지 84).
아래에 기재된 임의의 변형은 본원에 기재된 gRNA 및 mRNA에 존재할 수 있다.
용어 "mA," "mC," "mU," 또는 "mG"는 2'-O-Me로 변형된 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2'-O-메틸의 변형은 다음과 같이 묘사될 수 있다:
뉴클레오티드 당 고리에 영향을 미치는 것으로 밝혀진 또 다른 화학적 변형은 할로겐 치환이다. 예를 들어, 뉴클레오티드 당 고리에서 2'-플루오로 (2'-F) 치환은 올리고뉴클레오티드 결합 친화도 및 뉴클레아제 안정성을 증가시킬 수 있다.
본 출원에서, 용어 "fA," "fC," "fU," 또는 "fG"는 2'-F로 치환된 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
2'-F의 치환은 다음과 같이 묘사될 수 있다:
포스포로티오에이트 (PS) 연결 또는 결합은 포스포디에스테르 결합, 예를 들어, 뉴클레오티드 염기 사이의 결합에서 하나의 비브릿징 포스페이트 산소 대신 황이 대체되는 결합을 지칭한다. 포스포로티오에이트가 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 사용되는 경우, 변형된 올리고뉴클레오티드는 또한 S-올리고로 지칭될 수 있다.
PS 변형을 나타내지 위해 "*"가 사용될 수 있다. 본 출원에서, 용어 A*, C*, U*, 또는 G*는 PS 결합으로 다음 (예를 들어, 3') 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
본 출원에서, 용어 "mA*," "mC*," "mU*," 또는 "mG*"는 2'-O-Me로 치환되고 PS 결합으로 다음 (예를 들어, 3') 뉴클레오티드에 연결된 뉴클레오티드를 나타내기 위해 사용될 수 있다.
아래 다이어그램은 포스포디에스테르 결합 대신에 PS 결합을 생성하는 비브릿징 포스페이트 산소로의 S-의 치환을 나타낸다.
비염기성 (abasic) 뉴클레오티드는 질소 염기가 결여된 뉴클레오티드를 지칭한다. 아래 도면은 염기가 결여된 무염기 (아퓨린으로도 알려짐) 부위를 갖는 올리고뉴클레오티드를 나타낸다:
역전된 염기 (inverted base)란 정상적인 5'로부터 3' 연결 (즉, 5'로부터 5' 연결 또는 3'로부터 3' 연결)로 반전된 연결을 가진 염기를 지칭한다. 예를 들어:
비염기성 뉴클레오티드는 역전된 연결로 부착될 수 있다. 예를 들어, 비염기성 뉴클레오티드는 5'로부터 5' 연결을 통해 말단 5' 뉴클레오티드에 부착될 수 있거나, 비염기성 뉴클레오티는 3'로부터 3' 연결을 통해 말단 3' 뉴클레오티드에 부착될 수 있다. 말단 5' 또는 3' 뉴클레오티드에서의 역전된 비염기성 뉴클레오티는 역전된 비염기성 말단 캡으로도 불릴 수 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상 및 3' 말단에서 마지막 3개, 4개 또는 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상이 변형된다. 일부 구현예에서, 변형은 2'-O-Me, 2'-F, 역전된 비염기성 뉴클레오티드, PS 결합, 또는 안정성 및/또는 성능을 증가시키기 위해 당업계에 잘 알려진 다른 뉴클레오티드 변형이다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 4개의 뉴클레오티드와 3' 말단에서 마지막 4개의 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 (PS) 결합과 연결되어 있다.
일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개의 뉴클레오티드와 3' 말단에서 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'-O-메틸 (2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개의 뉴클레오티드와 3' 말단에서 마지막 3개의 뉴클레오티드는 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 구현예에서, 5' 말단에서 처음 3개의 뉴클레오티드와 3' 말단에서 마지막 3개의 뉴클레오티드는 역전된 비염기성 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 변형된 sgRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, sgRNA는 서열번호 201, 202, 또는 203에 나타낸 변형 패턴을 포함하고, 여기서, N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, N의 전체는 뉴클레아제를, 예를 들어, 표 1에 나타낸 바와 같이 LDHA의 표적 서열로 지시하는 가이드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나로 나타낸 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192의 가이드 서열 중 임의의 하나 및 서열번호 201, 202, 또는 203의 뉴클레오티드를 포함하는 sgRNA를 포함하고, 여기서, 서열번호 201, 202, 또는 203의 뉴클레오티드는 가이드 서열의 3' 단부에 있고, sgRNA는 표 3 또는 서열번호 300에 나타낸 바와 같이 변형될 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 조성물 또는 제형은 본원에 기재된 Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 포함하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 ORF를 포함하는 mRNA가 제공, 사용 또는 투여된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 ORF는 "변형된 RNA-가이드된 DNA 결합제 ORF" 또는 단순히 "변형된 ORF"이고, 이는 ORF가 변형되었음을 나타내는 약어로서 사용된다.
일부 구현예에서, 변형된 ORF는 적어도 하나, 복수 또는 모든 우리 딘 위치에서 변형된 우리딘을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5 위치에서, 예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로 변형된 우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 1 위치에서, 예를 들어, 할로겐, 메틸, 또는 에틸로 변형된 슈도우리딘이다. 변형된 우리딘은, 예를 들어, 슈도우리딘, N1-메틸-슈도우리딘, 5-메톡시우리딘, 5-요오도우리딘, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-메톡시우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸-슈도우리딘이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 N1-메틸슈도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도우리딘과 N1-메틸-슈도우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 슈도우리딘과 5-요오도우리딘의 조합이다. 일부 구현예에서, 변형된 우리딘은 5-요오도우리딘과 5-메톡시우리딘의 조합이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 mRNA는 Cap0, Cap1, 또는 Cap2와 같은 5' 캡을 포함한다. 5' 캡은 일반적으로 5'-트리포스페이트를 통해 mRNA의 5'-내지-3' 사슬의 제1 뉴클레오티드, 즉 제1 캡-근위 뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 리보뉴클레오티드 (이는 예를 들어, ARCA와 관련하여 아래에 논의된 바와 같이 추가로 변형될 수 있음)이다. Cap0에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오티드의 리보스는 둘 다 2'-하이드록실을 포함한다. Cap1에서, mRNA의 제1 및 제2 전사된 뉴클레오티드의 리보스는 각각 2'-메톡시 및 2'-하이드록실을 포함한다. Cap2에서, mRNA의 제1 및 제2 캡-근위 뉴클레오티드의 리보스는 둘 다 2'-메톡시를 포함한다. 예를 들어, 문헌 (Katibah et al. (2014) Proc Natl Acad Sci USA 111(33):12025-30; Abbas et al. (2017) Proc Natl Acad Sci USA 114(11):E2106-E2115)을 참조한다. 인간 mRNA와 같은 포유류 mRNA를 포함한 대부분의 내인성 고등 진핵 mRNA는 Cap1 또는 Cap2를 포함한다. Cap1 및 Cap2와 상이한 Cap0 및 기타 캡 구조는 IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천적 면역계의 구성요소에 의해 "비-자기 (non-self)"로 인식되기 때문에 인간과 같은 포유동물에서 면역원성일 수 있고, 이는 I형 인터페론을 포함한 상승된 사이토카인 수준을 초래할 수 있다. IFIT-1 및 IFIT-5와 같은 선천적 면역계의 구성요소는 또한 mRNA의 Cap1 또는 Cap2 이외의 캡과의 결합에 대해 eIF4E와 경쟁하여 잠재적으로 mRNA의 해독을 억제할 수 있다.
캡은 공동-전사로 포함될 수 있다. 예를 들어, ARCA (반-역 캡 유사체; Thermo Fisher Scientific 카탈로그 번호 AM8045)는 시험관내에서 시작시 전사체로 통합될 수 있는 구아닌 리보뉴클레오티드의 5' 위치에 연결된 7-메틸구아닌 3'-메톡시-5'-트리포스페이트를 포함하는 캡 유사체이다. ARCA는 제1 캡-근위 뉴클레오티드의 2' 위치가 하이드록실인 Cap0 캡을 초래한다. 예를 들어, 문헌 (Stepinski et al., (2001) "Synthesis and properties of mRNAs containing the novel 'anti-reverse' cap analogs 7-methyl(3'-O-methyl)GpppG and 7-methyl(3'deoxy)GpppG," RNA 7: 1486-1495)을 참조한다. ARCA 구조는 아래에 나타낸다.
CleanCapTM AG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeA)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7113) 또는 CleanCapTM GG (m7G(5')ppp(5')(2'OMeG)pG; TriLink Biotechnologies 카탈로그 번호 N-7133)를 사용하여 공동-전사로 Cap1 구조를 제공할 수 있다. 3'-O-메틸화된 버전의 CleanCapTM AG 및 CleanCapTM GG는 또한 각각 카탈로그 번호 N-7413 및 N-7433으로서 TriLink Biotechnologies로부터 입수 가능하다. CleanCapTM AG 구조는 아래에 나타낸다.
대안적으로, 캡은 전사 후 RNA에 추가될 수 있다. 예를 들어, 백시니아 캡핑 효소는 상업적으로 입수 가능하고 (New England Biolabs 카탈로그 번호 M2080S), 이의 D1 서브유닛에 의해 제공되는 RNA 트리포스파타제 및 구아닐릴트랜스퍼라제 활성 및 이의 D12 서브유닛에 의해 제공되는 구아닌 메틸트랜스퍼라제를 갖는다. 이와 같이, 7-메틸구아닌을 RNA에 추가하여 S-아데노실 메티오닌 및 GTP의 존재하에 Cap0을 제공할 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Guo, P. 및 Moss, B. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4023-4027; Mao, X. 및 Shuman, S. (1994) J. Biol. Chem. 269, 24472-24479)을 참조한다.
일부 구현예에서, mRNA는 폴리-아데닐화된 (폴리-A) 꼬리를 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 적어도 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100개의 아데닌, 임의로 최대 300개의 아데닌을 포함한다. 일부 구현예에서, 폴리-A 꼬리는 95, 96, 97, 98, 99, 또는 100개의 아데닌 뉴클레오티드를 포함한다.
A. 리보핵단백질 복합체
일부 구현예에서, 표 1로부터의 하나 이상의 가이드 서열 또는 표 2로부터의 하나 이상의 sgRNA를 포함하는 하나 이상의 gRNA 및 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예를 들어, 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제, 예컨대 Cas9를 포함하는 조성물이 포함된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 클리바세 활성을 가지고, 이는 또한 이중-가닥 엔도뉴클레아제 활성으로 지칭될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 뉴클레아제를 포함한다. Cas9 뉴클레아제의 예는 에스. 피로게네스 (S. pyogenes), 에스. 아우레스 (S. aureus) 및 기타 원핵생물 (예를 들어, 다음 단락의 리스트 참조)의 II형 CRISPR 시스템, 및 이의 변형된 (예를 들어, 조작된 또는 돌연변이) 버전의 것들을 포함한다. 예를 들어, 문헌 (US2016/0312198 A1; US 2016/0312199 A1)을 참조한다. Cas 뉴클레아제의 다른 예는 III형 CRISPR 시스템 또는 이의 Cas10, Csm1, 또는 Cmr2 서브유닛의 Csm 또는 Cmr 복합체; 및 I형 CRISPR 시스템 또는 이의 Cas3 서브유닛의 캐스케이드 복합체를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 IIA형, IIB형, 또는 IIC형 시스템으로부터 유래될 수 있다. 다양한 CRISPR 시스템 및 Cas 뉴클레아제에 대한 논의의 경우, 예를 들어, 문헌 (Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 9:467-477 (2011); Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol, 13: 722-36 (2015); Shmakov et al., Molecular Cell, 60:385-397 (2015))을 참조한다.
Cas 뉴클레아제가 유래될 수 있는 비제한적인 예시적인 종은 스트렙토코커스 피로게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코커스 써모필루스 (Streptococcus thermophilus), 스트렙코커스 종 (Streptococcus sp.), 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 리스테리아 이노쿠아 (Listeria innocua), 락토바실러스 가세리 (Lactobacillus gasseri), 프란시셀라 노비시다 (Francisella novicida), 윌리넬라 숙시노게네 (Wolinella succinogenes), 수테렐라 와즈워텐시스 (Sutterella wadsworthensis), 감마프로테오박테리움 (Gammaproteobacterium), 나이세리아 메닌지티디스 (Neisseria meningitidis), 캄필로벡터 제주니 (Campylobacter jejuni), 파스튜렐라 멀토시다 (Pasteurella multocida), 피브로박터 숙시노게네 (Fibrobacter succinogene), 로도스피릴륨 루브륨 (Rhodospirillum rubrum), 노카르디옵시스 다손빌레이 (Nocardiopsis dassonvillei), 스트렙토마이세스 프리스티네스피랄리스 (Streptomyces pristinaespiralis), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스 (Streptomyces viridochromogenes), 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스, 스트렙토스포랑기움 로세움 (Streptosporangium roseum), 스트렙토스포랑기움 로세움, 알리시클로바실러스 아시도칼다리우스 (Alicyclobacillus acidocaldarius), 바실러스 슈도마이코이데스 (Bacillus pseudomycoides), 바실러스 셀레니티레두센스 (Bacillus selenitireducens), 엑시구오박테니움 시비리쿰 (Exiguobacterium sibiricum), 락토바실러스 델브루엑기 (Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 살리바리우스 (Lactobacillus salivarius), 락투바실러스 부크네리 (Lactobacillus buchneri), 트레포네마 덴티콜라 (Treponema denticola), 미크로스킬라 마리나 (Microscilla marina), 버크홀데리알레스 박테리움 (Burkholderiales bacterium), 폴라로모나스 나프탈레니보란스 (Polaromonas naphthalenivorans), 폴라로모나스 종 (Polaromonas sp.), 크로코스파에라 와트소니아 (Crocosphaera watsonii), 시아노테세 종 (Cyanothece sp.), 마이크로시스티스 애루기노사 (Microcystis aeruginosa), 시네코코커스 종 (Synechococcus sp.), 아세토할로븀 아라바티쿰 (Acetohalobium arabaticum), 암모니펙스 데겐시이 (Ammonifex degensii) 칼디셀룰로시룹터 벡시이 (Caldicelulosiruptor becscii), 칸디다투스 데술포루디스 (Candidatus Desulforudis), 클로스트리디움 보툴리눔 (Clostridium botulinum), 클로스트리디움 디피실 (Clostridium difficile), 피레골디아 마그나 (Finegoldia magna), 나트라나에로비우스 써모필러스 (Natranaerobius thermophilus), 펠로토마쿨룸 써모프로피오니쿰 (Pelotomaculum thermopropionicum), 애시디티오바실러스 칼더스 (Acidithiobacillus caldus), 애시디티오바실러스 페로악시댄스 (Acidithiobacillus ferrooxidans), 알로크로마티움 비노숨 (Allochromatium vinosum), 마리노박터 종 (Marinobacter sp.), 니트로소코커스 할로필러스 (Nitrosococcus halophilus), 니트로소코커스 와트소니 (Nitrosococcus watsoni), 슈도알테로모나스 할로플랭크티스 (Pdeudoalteromonas haloplanktis), 크테도노박터 라세미퍼 (Ktedonobacter racemifer), 메타노할로비움 에베스티가툼 (Methanohalobium evestigatum), 아나베나 바리아빌리스 (Anabaena variabilis), 노둘라리아 스푸미게나 (Nodularia spumigena), 노스톡 종 (Nostoc sp.), 아르트로스피라 막시마 (Arthrospira maxima), 아르토로스피라 플라텐시스 (Arthrospira platensis), 아르트로스피라 종 (Arthrospira sp.), 링비아 종 (Lyngbya sp.), 마이크로콜레우스 크토노플라스테스 (Microcoleus chthonoplastes), 오실라토리아 종 (Oscillatoria sp.), 페트로토가 모빌리스 (Petrotoga mobilis), 서모시포 아프리카누스 (Thermosipho africanus), 스트렙코커스 파스테우리아누스 (Streptococcus pasteurianus), 네이세리아 키네레아 (Neisseria cinerea), 캄필로박터 라리 (Campylobacter lari), 파르비바쿨룸 라바멘티보란스 (Parvibaculum lavamentivorans), 코리네박테니움 디프테리아 (Corynebacterium diphtheria), 액시드아미노코커스 종 (Acidaminococcus sp.), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium) ND2006, 및 아카리오클로리스 마리나 (Acaryochloris marina)를 포함한다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙토코커스 피로게네스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스트렙코커스 써모필루스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 나이세리아 메닌지티디스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 스타필로코커스 아우레우스로부터의 Cas9 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 노비시다로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 액시드아미노코커스 종으로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 라크노스피라세아에 박테리움 ND2006으로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 추가의 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 프란시셀라 툴라렌시스 (Francisella tularensis), 라크노스피라세아에 박테리움 (Lachnospiraceae bacterium), 부티리비브리오 프로테오클라스티쿠스 (Butyrivibrio proteoclasticus), 페레그리니박테리아 박테리움 (Peregrinibacteria bacterium), 파르쿠박테리아 박테리움 (Parcubacteria bacterium), 스미텔라 (Smithella), 액시드아미노코커스 (Acidaminococcus), 칸디다투스 메타노플라스마 터미툼 (Candidatus Methanoplasma termitum), 유박테리움 엘리겐스 (Eubacterium eligens), 모락셀라 보보쿨리 (Moraxella bovoculi), 렙토스피라 이나다이 (Leptospira inadai), 포르피로모나스 크레비오리카니스 (Porphyromonas crevioricanis), 프레보텔라 디시엔스 (Prevotella disiens), 또는 포르피로모나스 마카카에 (Porphyromonas macacae)로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다. 특정 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 애시드아미노코커스 또는 라크노스피라세아에로부터의 Cpf1 뉴클레아제이다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제와 함께 gRNA는 리보핵단백질 복합체 (RNP)로 불린다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas 뉴클레아제이다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제와 함께 gRNA는 Cas RNP로 불린다. 일부 구현예에서, RNP는 I형, II형, 또는 III형 구성요소를 포함한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 II형 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 Cas9 단백질이다. 일부 구현예에서, Cas9와 함께 gRNA는 Cas9 RNP로 불린다.
야생형 Cas9는 두 가지 뉴클레아제 도메인을 갖는다: RuvC 및 HNH. RuvC 도메인은 비-표적 DNA 가닥을 절단하고, HNH 도메인은 DNA의 표적 가닥을 절단한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 하나 초과의 RuvC 도메인 및/또는 하나 초과의 HNH 도메인을 포함한다. 일부 구현예에서, Cas9 단백질은 야생형 Cas9이다. 각각의 조성물, 용도, 및 방법 구현예에서, Cas는 표적 DNA에서 이중 가닥 절단을 유도한다.
일부 구현예에서, 키메라 Cas 뉴클레아제가 사용되고, 여기서, 단백질의 하나의 도메인 또는 영역은 상이한 단백질의 일부로 대체된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제 도메인은 Fok1과 같은 상이한 뉴클레아제로부터 도메인으로 대체될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 변형된 뉴클레아제일 수 있다.
다른 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 I형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 I형 CRISPR/Cas 시스템의 캐스케이드 복합체의 구성요소일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 Cas3 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 III형 CRISPR/Cas 시스템으로부터 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 RNA 절단 활성을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 단일-가닥 닉카제 활성을 가지고, 즉, 하나의 DNA 가닥을 절단하여 "닉"으로도 알려진 단일-가닥 절단을 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 Cas 닉카제를 포함한다. 닉카제는 dsDNA에서 닉을 생성하는 효소인데, 즉, DNA 이중 나선의 한 가닥은 절단하고 다른 가닥은 절단하지 않는다. 일부 구현예에서, Cas 닉카제는, 예를 들어, 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경 (예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 내핵분해 활성 부위가 비활성화되는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)의 버전이다. 예를 들어, Cas 닉카제 및 예시적인 촉매 도메인 변경의 논의에 대해 미국 특허 제8,889,356호를 참조한다. 일부 구현예에서, Cas9 닉카제와 같은 Cas 닉카제는 비활성화된 RuvC 또는 HNH 도메인을 갖는다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나의 기능적 뉴클레아제 도메인만을 함유하도록 변형된다. 예를 들어, 작용제 단백질은 이의 핵산 절단 활성을 감소시키기 위해 뉴클레아제 도메인 중 하나가 돌연변이되거나 완전히 또는 부분적으로 결실되도록 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 활성이 감소된 RuvC 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 RuvC 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다. 일부 구현예에서, 활성이 감소된 HNH 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다. 일부 구현예에서, 불활성 HNH 도메인을 갖는 닉카제가 사용된다.
일부 구현예에서, Cas 단백질 뉴클레아제 도메인 내의 보존된 아미노산은 뉴클레아제 활성을 감소시키거나 변경시키기 위해 치환된다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. RuvC 또는 RuvC-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 D10A (에스. 피로게네스 Cas9 단백질을 기반으로 함)을 포함한다. 예를 들어, 문헌 (Zetsche et al. (2015) Cell Oct 22:163(3): 759-771)을 참조한다. 일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제는 HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 아미노산 치환을 포함할 수 있다. HNH 또는 HNH-유사 뉴클레아제 도메인에서 예시적인 아미노산 치환은 E762A, H840A, N863A, H983A, 및 D986A (에스. 피로게네스 Cas9 단백질을 기반으로 함)를 포함한다. 예를 들어, 문헌 (Zetsche et al. (2015))을 참조한다. 또한, 예시적인 아미노산 치환은 D917A, E1006A, 및 D1255A (프란시셀라 노비시다 U112 Cpf1 (FnCpf1) 서열 (UniProtKB - A0Q7Q2 (CPF1_FRATN)에 기반함)을 포함한다.
일부 구현예에서, 닉카제를 암호화하는 mRNA는 각각 표적 서열의 센스 및 안티센스 가닥에 상보적인 가이드 RNA의 쌍과 조합하여 제공된다. 이 구현예에서, 가이드 RNA는 닉카제를 표적 서열로 지시하고 표적 서열의 반대 가닥에 닉을 생성함으로써 DSB를 도입한다 (즉, 이중 닉킹). 일부 구현예에서, 이중 닉킹의 사용은 특이성을 개선하고 오프-표적 효과를 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 닉카제는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하기 위해 DNA의 반대 가닥을 표적화하는 2개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용된다. 일부 구현예에서, 닉카제는 표적 DNA에서 이중 닉을 생성하기 위해 매우 근접하도록 선택되는 2개의 개별 가이드 RNA와 함께 사용된다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 클리바세 및 닉카제 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드를 포함한다. dCas 폴리펩타이드는 DNA-결합 활성을 갖지만 본질적으로 촉매 (클리바세/닉카제) 활성이 결여되어 있다. 일부 구현예에서, dCas 폴리펩타이드는 dCas9 폴리펩타이드이다. 일부 구현예에서, 클리바세 및 닉카제 활성이 결여된 RNA-가이드된 DNA-결합제 또는 dCas DNA-결합 폴리펩타이드는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, 상기 논의된 Cas 뉴클레아제)의 한 버전으로, 이의 내핵분해 활성 부위가, 예를 들어, 이의 촉매 도메인에서 하나 이상의 변경 (예를 들어, 점 돌연변이)에 의해 비활성화된다. 예를 들어, 문헌 (US 2014/0186958 A1; US 2015/0166980 A1)을 참조한다.
일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나 이상의 이종 기능성 도메인을 포함한다 (예를 들어, 융합 폴리펩타이드이거나 이를 포함한다).
일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 세포 핵으로의 수송을 촉진할 수 있다. 예를 들어, 이종 기능성 도메인은 핵 위치 신호 (NLS)일 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 1 내지 10개의 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 1 내지 5개의 NLS(들)와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 하나의 NLS와 융합될 수 있다. 하나의 NLS가 사용되는 경우, NLS는 RNA-가이드된 DNA-결합제 서열의 N-말단 또는 C-말단에 연결될 수 있다. 또한 RNA-가이드된 DNA 결합제 서열 내에 삽입될 수 있다. 다른 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 하나 초과의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제는 2, 3, 4 또는 5개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2개의 NLS와 융합될 수 있다. 특정 상황에서, 2개의 NLS는 동일하거나 (예를 들어, 2개의 SV40 NLS) 상이할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 카복시 말단에 연결된 2개의 SV40 NLS 서열에 융합된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 2개의 NLS와 융합될 수 있는데, 하나는 N-말단에 연결되고 하나는 C-말단에 연결된다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 3개의 NLS와 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 NLS 없이 융합될 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는, 예를 들어, SV40 NLS, PKKKRKV (서열번호 600) 또는 PKKKRRV (서열번호 601)와 같은 단일분절 (monopartite) 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, NLS는 뉴클레오플라스민의 NLS, KRPAATKKAGQAKKKK (서열번호 602)와 같은 이분절 (bipartite) 서열일 수 있다. 특정 구현예에서, 단일 PKKKRKV (서열번호 600) NLS는 RNA-가이드된 DNA-결합제의 C-말단에 연결될 수 있다. 하나 이상의 링커는 임의로 융합 부위에 포함된다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA 결합제의 세포내 반감기를 변형시킬 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA 결합제의 반감기가 증가될 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제의 반감기가 감소될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제의 안정성을 감소시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 단백질 분해를 위한 신호 펩타이드로서 작용할 수 있다. 일부 구현예에서, 단백질 분해는, 예를 들어, 프로테아좀, 리소좀 프로테아제 또는 칼파인 프로테아제와 같은 단백질분해 효소에 의해 매개될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 PEST 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, RNA-가이드된 DNA-결합제는 유비퀴틴 또는 폴리유비퀴틴 사슬의 첨가에 의해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 유비퀴틴은 유비퀴틴-유사 단백질 (UBL)일 수 있다. 유비퀴틴-유사 단백질의 비제한적인 예는 작은 유비퀴틴-유사 변형체 (SUMO), 유비퀴틴 교차반응 단백질 (UCRP, 인터페론-자극 유전자-15 (ISG15)로도 알려져 있음), 유비퀴틴-관련 변형체-1 (URM1), 뉴런-전구체-세포-발현 발달 하향조절된 단백질-8 (NEDD8, 에스. 세레비세에 (S. cerevisiae)에서 Rub1로도 불림), 인간 백혈구 항원 F-연관 (FAT10), 자가포식-8 (ATG8) 및 -12 (ATG12), Fau 유비퀴틴-유사 단백질 (FUB1), 막-고정 UBL (MUB), 유비퀴틴 폴드-변형체-1 (UFM1), 및 유비퀴틴-유사 단백질-5 (UBL5)를 포함한다.
일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 마커 도메인일 수 있다. 마커 도메인의 비제한적인 예는 형광 단백질, 정제 태그, 에피토프 태그, 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 마커 도메인은 형광 단백질일 수 있다. 적합한 형광 단백질의 비제한적인 예는 녹색 형광 단백질 (예를 들어, GFP, GFP-2, tagGFP, turboGFP, sfGFP, EGFP, Emerald, Azami Green, Monomeric Azami Green, CopGFP, AceGFP, ZsGreen1), 황색 형광 단백질 (예를 들어, YFP, EYFP, Citrine, Venus, YPet, PhiYFP, ZsYellow1), 청색 형광 단백질 (예를 들어, EBFP, EBFP2, Azurite, mKalamal, GFPuv, Sapphire, T-sapphire), 청록색 형광 단백질 (예를 들어, ECFP, Cerulean, CyPet, AmCyan1, Midoriishi-Cyan), 적색 형광 단백질 (예를 들어, mKate, mKate2, mPlum, DsRed 단량체, mCherry, mRFP1, DsRed-Express, DsRed2, DsRed-단량체, HcRed-Tandem, HcRed1, AsRed2, eqFP611, mRasberry, mStrawberry, Jred), 및 오렌지색 형광 단백질 (mOrange, mKO, Kusabira-Orange, Monomeric Kusabira-Orange, mTangerine, tdTomato) 또는 임의의 다른 적합한 형광 단백질을 포함한다. 다른 구현예에서, 마커 도메인은 정제 태그 및/또는 에피토프 태그일 수 있다. 비제한적인 예시적인 태그는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 키틴 결합 단백질 (CBP), 말토오스 결합 단백질 (MBP), 티오레독신 (TRX), 폴리(NANP), 직렬 친화성 정제 (TAP) 태그, myc, AcV5, AU1, AU5, E, ECS, E2, FLAG, HA, nus, Softag 1, Softag 3, Strep, SBP, Glu-Glu, HSV, KT3, S, S1, T7, V5, VSV-G, 6xHis, 8xHis, 비오틴 카복실 담체 단백질 (BCCP), 폴리-His, 및 칼모둘린을 포함한다. 비제한적인 예시적인 리포터 유전자는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST), 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), 베타-갈락토시다제, 베타-글루쿠로니다제, 루시퍼라제, 또는 형광 단백질을 포함한다.
추가 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 특정 세포기관, 세포 유형, 조직, 또는 기관에 표적화할 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 RNA-가이드된 DNA-결합제를 미토콘드리아에 표적화할 수 있다.
추가 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 이펙터 (effector) 도메인일 수 있다. RNA-가이드된 DNA-결합제가 표적 서열로 지시되는 경우, 예를 들어 Cas 뉴클레아제가 gRNA에 의해 표적 서열로 지시되는 경우, 이펙터 도메인은 표적 서열을 변형하거나 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 이펙터 도메인은 핵산 결합 도메인, 뉴클레아제 도메인 (예를 들어, 비-Cas 뉴클레아제 도메인), 후성적 변형 도메인, 전사 활성화 도메인, 또는 전사 억제인자 도메인으로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 FokI 뉴클레아제와 같은 뉴클레아제이다. 예를 들어, 미국 특허 제9,023,649호를 참조한다. 일부 구현예에서, 이종 기능성 도메인은 전사 활성화제 또는 억제인자이다. 예를 들어, 문헌 (Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression," Cell 152:1173-83 (2013); Perez-Pinera et al., "RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors," Nat. Methods 10:973-6 (2013); Mali et al., "CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering," Nat. Biotechnol. 31:833-8 (2013); Gilbert et al., "CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes," Cell 154:442-51 (2013))을 참조한다. 이와 같이, RNA-가이드된 DNA-결합제는 본질적으로 가이드 RNA를 사용하여 원하는 표적 서열에 결합하도록 지시될 수 있는 전사 인자가 된다.
E.
gRNA의 효능 결정
일부 구현예에서, gRNA의 효능은 RNP를 형성하는 다른 성분과 함께 전달되거나 발현될 때 결정된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 결합제, 예컨대 Cas 단백질, 예를 들어, Cas9와 함께 발현된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제 또는 닉카제, 예를 들어, Cas9 뉴클레아제 또는 닉카제를 이미 안정적으로 발현하는 세포주로 전달되거나 세포주에서 발현된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNP의 일부로서 세포에 전달된다. 일부 구현예에서, gRNA는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제, 예컨대 Cas 뉴클레아제 또는 닉카제, 예를 들어, Cas9 뉴클레아제 또는 닉카제를 암호화하는 mRNA와 함께 세포로 전달된다.
본원에 기재된 바와 같이, 본원에 개시된 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 및 가이드 RNA의 사용은 DNA에 이중-가닥 파괴를 유발하여 세포 기계에 의한 복구시 삽입/결실 (인델) 돌연변이 형태로 오류를 생성할 수 있다. 인델로 인한 많은 돌연변이는 판독 프레임을 변경하거나 조기 중지 코돈을 도입하여 비-기능적 단백질을 생성한다.
일부 구현예에서, 특정 gRNA의 효능은 시험관내 모델을 기반으로 결정된다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 Cas9 (HEK293_Cas9)를 안정적으로 발현하는 HEK293 세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 HUH7 인간 간암종 세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 HepG2 세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 1차 인간 간세포이다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델은 1차 사이노몰구스 간세포이다. 1차 인간 간세포 사용과 관련하여, 상업적으로 이용 가능한 1차 인간 간세포를 사용하여 실험 간의 일관성을 높일 수 있다. 일부 구현예에서, 시험관내 모델에서 (예를 들어, 1차 인간 간세포에서) 결실 또는 삽입이 발생하는 오프-표적 부위의 수는, 예를 들어, Cas9 mRNA 및 가이드 RNA로 시험관내에서 형질감염된 1차 인간 간세포로부터 게놈 DNA를 분석하여 결정된다. 일부 구현예에서, 그러한 결정은 Cas9 mRNA, 가이드 RNA 및 공여자 올리고뉴클레오티드로 시험관내 형질감염된 1차 인간 간세포로부터의 게놈 DNA를 분석하는 단계를 포함한다. 그러한 결정을 위한 예시적인 절차는 아래 작업 실시예에서 제공된다.
일부 구현예에서, 특정 gRNA의 효능은 gRNA 선택 과정을 위한 다수의 시험관내 세포 모델에 걸쳐 결정된다. 일부 구현예에서, 선택된 gRNA와 데이터의 세포주 비교가 수행된다. 일부 구현예에서, 다중 세포 모델에서의 교차 스크리닝이 수행된다.
일부 구현예에서, 특정 gRNA의 효능은 생체내 모델을 기반으로 결정된다. 일부 구현예에서, 생체내 모델은 설치류 모델이다. 일부 구현예에서, 설치류 모델은 LDHA 유전자를 발현하는 마우스이다. 일부 구현예에서, 설치류 모델은 인간 LDHA 유전자를 발현하는 마우스이다. 일부 구현예에서, 생체내 모델은 비-인간 영장류, 예를 들어, 사이노몰구스 원숭이이다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 LDHA의 퍼센트 편집으로 측정된다. 일부 구현예에서, LDHA의 퍼센트 편집은, 예를 들어, 시험관내 모델의 경우 전체 세포 용해물로부터, 생체내 모델의 경우 조직에서 LDHA 단백질의 녹다운을 달성하는 데 필요한 퍼센트 편집과 비교된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 표적 세포 유형의 게놈 내 오프-표적 서열에서 인델의 수 및/또는 빈도에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 세포 집단에서 매우 낮은 빈도 (예를 들어, < 5%)로 및/또는 표적 부위에서 인델 생성 빈도에 비해 오프-표적 부위에서 인델을 생성하는 효과적인 가이드 RNA가 제공된다. 따라서, 본 개시내용은 표적 세포 유형 (예를 들어, 간세포)에서 오프-표적 인델 형성을 나타내지 않거나 세포 집단에서 및/또는 표적 부위에서의 인델 생성 빈도에 비해 < 5%의 오프-표적 인델 형성 빈도를 생성하는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용은 표적 세포 유형 (예를 들어, 간세포)에서 임의의 오프 표적 인델 형성도 나타내지 않는 가이드 RNA를 제공한다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 방법에 의해 평가된 바와 같이, 5개 미만의 오프-표적 부위에서 인델을 생성하는 가이드 RNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 본원에 기재된 하나 이상의 방법에 의해 평가된 바와 같이, 4, 3, 2 또는 1개 이하의 오프-표적 부위(들)에서 인델을 생성하는 가이드 RNA가 제공된다. 일부 구현예에서, 오프-표적 부위(들)는 표적 세포 (예를 들어, 간세포) 게놈의 단백질 암호화 영역에서 발생하지 않는다.
일부 구현예에서, 표적 DNA에서 삽입/결실 ("인델") 돌연변이 및 상동성 지시된 복구 (HDR) 이벤트의 형성과 같은 유전자 편집 이벤트를 검출하는 것은 태그된 프라이머를 사용한 선형 증폭을 사용하고 태그된 증폭 산물을 단리한다 (이하, "LAM-PCR" 또는 "선형 증폭 (LA)" 방법으로 지칭됨).
일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 체액, 예를 들어, 혈청, 혈장, 혈액 또는 소변과 같은 샘플에서 글리콜레이트 수준 및/또는 옥살레이트 수준을 측정함으로써 측정된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA의 효능은 혈청 또는 혈장 내 글리콜레이트 수준 및/또는 소변 내 옥살레이트 수준을 측정함으로써 측정된다. 혈청 또는 혈장 내 글리콜레이트 수준의 증가 및/또는 소변 내 옥살레이트 수준의 감소는 효과적인 가이드 RNA를 나타낸다. 일부 구현예에서, 소변 옥살레이트는 0.7 mmol/24시간/1.73 m2 미만으로 감소된다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트 및 옥살레이트의 수준은 세포 배양 배지 또는 혈청 또는 혈장을 사용한 효소-연결된 면역흡착 검정 (ELISA) 검정을 사용하여 측정된다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트 및 옥살레이트의 수준은 편집을 측정하는 데 사용되는 동일한 시험관내 또는 생체내 시스템 또는 모델에서 측정된다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트 및 옥살레이트의 수준은 세포, 예를 들어, 1차 인간 간세포에서 측정된다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트 및 옥살레이트의 수준은 HUH7 세포에서 측정된다. 일부 구현예에서, 글리콜레이트 및 옥살레이트의 수준은 HepG2 세포에서 측정된다.
II. 치료 방법
본원에 개시된 gRNA 및 관련 방법 및 조성물은 LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB)를 유도하고 LDHA 유전자의 발현을 감소시키는 데 유용하다. 본원에 개시된 gRNA 및 관련 방법 및 조성물은 고수산뇨증의 치료 및 예방 및 고수산뇨증의 증상 예방에 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA는 옥살산칼슘 생성, 기관에서의 옥살산칼슘 침착, 원발성 고수산뇨증 (PH1, PH2 및 PH3 포함), 전신성 옥살산증을 포함한 옥살산증 및 혈뇨의 치료 및 예방에 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA는 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는데 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA는 말기 신장 질환 (ESRD)을 예방하는데 유용하다. 본원에 개시된 gRNA의 투여는 혈청 또는 혈장 글리콜레이트를 증가시키고 옥살레이트 생성 또는 축적을 감소시켜 더 적은 옥살레이트가 소변으로 배설되도록 할 것이다. 따라서, 하나의 양상에서, 치료/예방의 효과는 혈청 또는 혈장 글리콜레이트를 측정하여 평가할 수 있고, 여기서, 글리콜레이트 수준의 증가는 효과를 나타낸다. 일부 구현예에서, 치료/예방의 효과는 소변 옥살레이트와 같은 샘플에서 옥살레이트를 측정하여 평가할 수 있고, 여기서, 소변 옥살레이트의 감소는 효과를 나타낸다.
건강한 대상체의 소변에서 정상적인 1일 옥살레이트 배설물은 약 45 mg 미만이고, 24시간당 약 45 mg을 초과하는 농도는 임상 고수산뇨증으로 간주된다 (예를 들어, 문헌 (Bhasin et al., World J Nephrol 2015 May 6; 4(2): 235-244; and Cochat P., Rumsby G. (2013). N Engl J Med 369:649-658) 참조). 따라서, 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA 및 조성물의 투여는 대상체가 임상 고수산뇨증과 관련된 소변 옥살레이트의 수준을 더 이상 나타내지 않도록 옥살레이트의 수준을 감소시키는 데 유용하다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA 및 조성물의 투여는 대상체의 소변 옥살레이트를 24시간의 기간 내에 약 45 또는 40 mg 미만으로 감소시킨다. 일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA 및 조성물의 투여는 대상체의 소변 옥살레이트를 24시간의 기간 내에 약 35 mg 미만, 약 30 mg 미만, 약 25 mg 미만, 약 20 mg 미만, 약 15 mg 미만 또는 약 10 mg 미만으로 감소시킨다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 gRNA, 조성물 또는 약제학적 제형 중 임의의 하나 이상은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 약제를 제조하는 데 사용하기 위한 것이다. 일부 구현예에서, 치료 및/또는 예방은 약제/조성물의 단일 용량, 예를 들어, 1회 치료로 달성된다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 고수산뇨증이다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA, 조성물 또는 약제 학적 제형 중 임의의 하나 이상을 투여하는 단계 포함하여, 대상체에서 질환 또는 장애를 치료 또는 예방하는 방법을 포함한다. 일부 구현예에서, 질환 또는 장애는 고수산뇨증이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 gRNA, 조성물 또는 약제학적 제형은, 예를 들어, 단일 용량으로, 1회 투여된다. 일부 구현예에서, 단일 용량은 지속적인 치료 및/또는 예방을 달성한다. 일부 구현예에서, 방법은 지속적인 치료 및/또는 예방을 달성한다. 본원에 사용된 바와 같은 지속적인 치료 및/또는 예방은 적어도 i) 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15주; ii) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월; 또는 iii) 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10년에 걸쳐 연장되는 치료 및/또는 예방을 포함한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 gRNA, 조성물 또는 약제학적 제형의 단일 용량은 대상체의 수명 기간 동안 본원에 기재된 임의의 징후를 치료 및/또는 예방하기에 충분하다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA, 조성물 또는 약제학적 제형 중 임의의 하나 이상을 포함, 투여 또는 전달하는 단계를 포함하여 표적 DNA를 변형시키는 (예를 들어, 이중 가닥 파괴 생성) 방법 또는 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 표적 DNA는 LDHA 유전자이다. 일부 구현예에서, 표적 DNA는 LDHA 유전자의 엑손에 있다. 일부 구현예에서, 표적 DNA는 LDHA 유전자의 엑손 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8에 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 gRNA, 조성물 또는 약제학적 제형 중 임의의 하나 이상을 포함, 투여 또는 전달하는 단계를 포함하여 표적 유전자의 조절을 위한 방법 또는 사용을 포함한다. 일부 구현예에서, 조절은 LDHA 표적 유전자의 편집이다. 일부 구현예에서, 조절은 LDHA 표적 유전자에 의해 암호화된 단백질의 발현에서의 변화이다.
일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 유전자 편집을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 표적 LDHA 유전자 내에서 이중-가닥 파괴를 초래한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 DSB의 비-상동성 단부 결합 동안 인델 돌연변이의 형성을 초래한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 표적 LDHA 유전자에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실을 초래한다. 일부 구현예에서, 표적 LDHA 유전자에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은 비-기능적 단백질을 초래하는 프레임 시프트 돌연변이 또는 조기 정지 코돈을 유도한다. 일부 구현예에서, 표적 LDHA 유전자에서 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은 표적 유전자 발현의 녹다운 또는 제거를 유도한다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 DSB의 상동성 지시된 복구를 포함한다.
일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 LDHA 유전자 조절을 초래한다. 일부 구현예에서, LDHA 유전자 조절은 유전자 발현에서의 감소이다. 일부 구현예에서, 방법 또는 사용은 표적 유전자에 의해 암호화된 단백질의 감소된 발현을 초래한다.
일부 구현예에서, LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB)를 유도하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 제공한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192의 임의의 하나 이상의 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 LDHA 유전자에서 DSB를 유도하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, LDHA 유전자를 변형하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 제공한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전은 LDHA 유전자를 변형시키기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 제공한다. 일부 구현예에서, 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전은 고수산뇨증을 치료 또는 예방하기 위해 투여된다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, 고수산뇨증은 원발성 고수산뇨증이다. 일부 구현예에서, 원발성 고수산뇨증은 1형 (PH1), 2형 (PH2), 또는 3형 (PH3)이다. 일부 구현예에서, 고수산뇨증 특발성이다.
일부 구현예에서, 옥살산칼슘 생성 및/또는 침착을 감소 또는 제거하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 투여하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, PH1, PH2, 또는 PH3을 포함하는 원발성 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 투여하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 전신성 옥살산증을 포함한 옥살산증을 치료 또는 예방하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 투여하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 혈뇨를 치료 또는 예방하는 방법이 제공되고, 이는 서열번호 1 내지 84의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 가이드 RNA, 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전을 투여하는 단계를 포함한다. 가이드 RNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전은 소변에서 옥살레이트 수준을 감소시키기 위해 투여된다. gRNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 gRNA 또는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081의 임의의 하나 이상의 sgRNA, 또는, 예를 들어, 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로 나타낸 이의 변형된 버전은 혈청 또는 혈장에서 혈청 글리콜레이트를 증가시키기 위해 투여된다. gRNA는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제 또는 Cas 뉴클레아제 (예를 들어, Cas9)와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA 또는 벡터와 함께 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, Cas 뉴클레아제와 같은 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제와 함께 표 1의 가이드 서열을 포함하는 gRNA는 DSB를 유도하고, 복구 동안 비-상동 말단 결합 (NHEJ)은 LDHA 유전자의 돌연변이를 유도한다. 일부 구현예에서, NHEJ는 뉴클레오티드(들)의 결실 또는 삽입을 유발하고, 이는 LDHA 유전자에서 프레임 시프트 또는 넌센스 돌연변이를 유도한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 가이드 RNA를 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 투여하면 대상체에서 글리콜레이트의 수준 (예를 들어, 혈청 또는 혈장 수준)이 증가하므로 옥살레이트 축적을 예방한다.
일부 구현예에서, 혈청 글리콜레이트를 증가시키면 소변 옥살레이트의 감소를 초래한다. 일부 구현예에서, 소변 옥살 레이트의 감소는 기관에서의 옥살산칼슘 형성 및 침착을 감소 또는 제거한다.
일부 구현예에서, 대상체는 포유류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 일부 구현예에서, 대상체는 소, 돼지, 원숭이, 양, 개, 고양이, 어류 또는 가금류이다.
일부 구현예에서, 표 1의 가이드 서열 중 임의의 하나 이상 또는 표 2로부터의 하나 이상의 sgRNA (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서)를 포함하는 가이드 RNA의 용도는 고수산뇨증을 갖는 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위해 제공된다.
일부 구현예에서, 가이드 RNA, 조성물, 및 제형은 정맥내로 투여된다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA, 조성물, 및 제형은 간 순환으로 투여된다.
일부 구현예에서, 본원에 제공된 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 단일 투여는 돌연변이 단백질의 발현을 녹다운하기에 충분하다. 다른 구현예에서, 본원에 제공된 가이드 RNA를 포함하는 조성물의 1회 초과의 투여는 치료 효과를 최대화하는데 유익할 수 있다.
일부 구현예에서, 치료는 고수산뇨증 질환 진행을 늦추거나 중단시킨다.
일부 구현예에서, 치료는 말기 신장 질환 (ESRD)의 진행을 늦추거나 중단시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 콩팥 및/또는 간 이식의 필요성을 늦추거나 중단시킨다. 일부 구현예에서, 치료는 고수산뇨증 증상의 개선, 안정화, 또는 변화를 늦추는 것을 초래한다.
A. 병용 요법
일부 구현예에서, 본 발명은 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 하나의 gRNA 를 포함하는 병용 요법을 상기 기재된 바와 같이 고수산뇨증 및 이의 증상을 완화시키는 데 적합한 추가 요법과 함께 포함한다.
일부 구현예에서, 고수산뇨증에 대한 추가 요법은 비타민 B6, 수화, 신장 투석, 또는 간 또는 콩팥 이식이다. 일부 구현예에서, 추가 요법은 LDHA 유전자를 파괴하는 또 다른 제제, 예를 들어 LDHA 유전자에 지시된 siRNA이다. 일부 구현예에서, LDHA 유전자에 지시된 siRNA는 DCR-PHXC이다. 일부 구현예에서, 예컨대 고수산뇨증이 PH1에 의해 야기되는 경우, 추가 요법은, 예를 들어, HAO1 유전자에 지시된 siRNA와 같은 HAO1 유전자를 파괴하는 제제이다. 일부 구현예에서, HAO1 siRNA는 루마시란 (ALN-GO1; Alnylam)이다.
일부 구현예에서, 병용 요법은 HAO1 또는 LDHA를 표적화하는 siRNA와 함께 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 하나의 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, siRNA는 LDHA의 발현을 추가로 감소 또는 제거할 수 있는 임의의 siRNA이다. 일부 구현예에서, siRNA는 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 하나의 gRNA 뒤에 투여된다. 일부 구현예에서, siRNA는 본원에 제공된 임의의 gRNA 조성물로 치료한 후 정기적으로 투여된다.
일부 구현예에서, 병용 요법은 LDHA를 표적화하는 안티센스 뉴클레오티드와 함께 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 하나의 gRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 안티센스 뉴클레오티드는 LDHA의 발현을 추가로 감소 또는 제거할 수 있는 임의의 안티센스 뉴클레오티드이다. 일부 구현예에서, 안티센스 뉴클레오티드는 (예를 들어, 본원에 제공된 조성물에서) 표 1에 개시된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 하나의 gRNA 뒤에 투여된다. 일부 구현예에서, 안티센스 뉴클레오티드는 본원에 제공된 임의의 gRNA 조성물로 처리 후 정기적으로 투여된다.
B. gRNA 조성물의 전달
지질 나노입자 (LNP)는 뉴클레오티드 및 단백질 카고 (cargo)의 전달을 위한 잘 알려진 수단이고, 본원에 개시된 가이드 RNA, 조성물 또는 약제학적 제형의 전달에 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, LNP는 핵산, 단백질, 또는 단백질과 함께 핵산을 전달한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 하나의 gRNA를 대상체에게 전달하는 방법을 포함하고, 여기서, gRNA는 LNP와 회합된다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP는 또한 Cas9 또는 Cas9를 암호화하는 mRNA와 회합된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 개시된 임의의 하나의 gRNA 및 LNP를 포함하는 조성물을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 Cas9 또는 Cas9를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함한다.
일부 구현예에서, LNP는 양이온성 지질을 포함한다. 일부 구현예에서, LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트)로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트 또는 또 다른 이온화 가능한 지질을 포함한다. 예를 들어, WO/2017/173054 및 본원에 기재된 참조문헌을 참조한다. 일부 구현예에서, LNP는 약 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 또는 6.5의 양이온성 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P)의 몰 비를 포함한다. 일부 구현예에서, LNP 지질과 관련하여 용어 양이온성 및 이온화 가능은 상호교환 가능하고, 예를 들어, 이온화 가능한 지질은 pH에 따라 양이온성이다.
일부 구현예에서, 본원에 개시된 gRNA와 회합된 LNP는 질환 또는 장애를 치료하기 위한 약제를 제조하는데 사용하기 위한 것이다.
전기천공은 카고 전달을 위한 잘 알려진 수단이고, 임의의 전기 천공 방법은 본원에 개시된 임의의 하나의 gRNA를 전달을 위해 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전기천공은 본원에 개시된 임의의 하나의 gRNA 및 Cas9 또는 Cas9를 암호화하는 mRNA를 전달하는 데 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 본원에 개시된 임의의 하나의 gRNA를 생체외 세포에 전달하는 방법을 포함하고, 여기서, gRNA는 LNP와 회합되거나 LNP와 회합되지 않는다. 일부 구현예에서, gRNA/LNP 또는 gRNA는 또한 Cas9 또는 Cas9를 암호화하는 mRNA와 회합된다.
일부 구현예에서, 본원에 기재된 가이드 RNA 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 벡터에서 암호화되고, 지질 나노입자로 제형화되거나 이를 통해 투여된다; 예를 들어, 2017년 3월 30일에 출원되고 2017년 5월 10일에 공개된 "CRISPR/CAS 구성요소를 위한 지질 나노입자 제형"이라는 명칭의 WO/2017/173054를 참조하고, 상기 특허는 그 내용이 그 전체가 본원에 참조로 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 본원에 기재된 가이드 서열 중 임의의 하나 이상을 포함하는 임의의 가이드 RNA를 암호화하는 DNA 또는 RNA 벡터를 포함한다. 일부 구현예에서, 가이드 RNA 서열 이외에, 벡터는 가이드 RNA를 암호화하지 않는 핵산을 추가로 포함한다. 가이드 RNA를 암호화하지 않는 핵산은 프로모터, 인핸서, 조절 서열, 및 Cas9와 같은 뉴클레아제일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 핵산을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들)을 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 sgRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들) 및 Cas9 또는 Cpf1과 같은 Cas 뉴클레아제일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 벡터는 crRNA를 암호화하는 하나 이상의 뉴클레오티드 서열(들), trRNA, 및 Cas9와 같은 Cas 단백질일 수 있는 RNA-가이드된 DNA 뉴클레아제를 암호화하는 mRNA를 포함한다. 하나의 구현예에서, Cas9는 스트렙토코커스 피로게네스 (즉, Spy Cas9)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA (sgRNA일 수 있음)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 자연 발생 CRISPR/Cas 시스템으로부터의 반복 서열의 전부 또는 일부가 측면에 있는 가이드 서열을 포함하거나 이로 이루어진다. crRNA, trRNA, 또는 crRNA 및 trRNA를 포함하거나 이로 이루어진 핵산은 벡터 서열을 추가로 포함할 수 있고, 여기서, 벡터 서열은 crRNA, trRNA 또는 crRNA 및 trRNA와 함께 자연적으로 발견되지 않는 핵산을 포함하거나 이로 이루어진다.
이 설명 및 예시적인 구현예는 제한적인 것으로 간주되어서는 안된다. 이 명세서 및 첨부된 청구범위의 목적을 위해, 달리 나타내지 않는 한, 명세서 및 청구범위에 사용된 수량, 백분율, 또는 비율을 표현하는 모든 숫자 및 기타 수치는 아직 비변형된 범위 내에서 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형된 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 하기 명세서 및 첨부된 청구범위에 기재된 수치 파라미터는 얻고자 하는 원하는 성질에 따라 변할 수 있는 근사치이다. 적어도 청구 범위에 대한 등가 원칙의 적용을 제한하려는 시도가 아니라, 각 수치 파라미터는 적어도 보고된 유효 자릿수와 일반적인 반올림 기술을 적용하여 해석되어야 한다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the" 및 임의의 단어의 임의의 단수 사용은 명시적이고 명확하게 하나의 대상으로 제한되지 않는 한 복수 대상을 포함한다는 점에 유의한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하다" 및 이의 문법적 변형은 비제한적인 것으로 의도되어, 목록에 있는 항목의 인용이 나열된 항목에 대체되거나 추가될 수 있는 다른 유사한 항목을 배제하지 않도록 한다.
실시예
다음 실시예는 특정 개시된 구현예를 예시하기 위해 제공되고, 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1 - 재료 및 방법
뉴클레아제 mRNA의 시험관내 전사 ("IVT")
N1-메틸 슈도-U를 포함하는 캡핑 및 폴리아데닐화 스트렙토코커스 피오게네스 ("Spy") Cas9 mRNA는 선형화된 플라스미드 DNA 주형 및 T7 RNA 폴리머라제를 사용하여 시험관내 전사에 의해 생성되었다. T7 프로모터 및 전사를 위한 서열을 포함하는 플라스미드 DNA (본원에 기재된 mRNA를 포함하는 mRNA를 생성하기 위한) (예시적인 ORF에 대해 아래 표 24의 서열번호 501-515 참조)는 37℃에서 항온처리하여 다음 조건에서 XbaI로 분해를 완료함으로써 선형화되었다: 200 ng/μL 플라스미드, 2 U/μL XbaI (NEB) 및 1x 반응 완충액. 반응을 65℃에서 20분 동안 가열함으로써 XbaI를 비활성화시켰다. 선형화된 플라스미드를 실리카 맥시 스핀 컬럼 (Epoch Life Sciences)을 사용하여 효소 및 완충액 염으로부터 정제하고, 아가로스 겔로 분석하여 선형화를 확인하였다. Cas9 변형된 mRNA를 생성하기 위한 IVT 반응은 다음 조건에서 37℃에서 4시간 동안 항온처리되었다: 50 ng/μL 선형화된 플라스미드; 각각 2 mM의 GTP, ATP, CTP, 및 N1-메틸 슈도-UTP (Trilink); 10 mM ARCA (Trilink); 5 U/μL T7 RNA 폴리머라제 (NEB); 1 U/μL Murine RNase 억제제 (NEB); 0.004 U/μL 무기 이. 콜리 피로포스파타제 (NEB); 및 1x 반응 완충액. 4시간 항온처리 후, TURBO DNase (ThermoFisher)를 최종 농도 0.01 U/μL로 첨가하고, 반응물을 추가 30분 동안 항온처리하여 DNA 주형을 제거하였다. Cas9 mRNA는 제조사의 프로토콜 (ThermoFisher)에 따라 MegaClear 전사 클립-업 키트를 사용하여 효소와 뉴클레오티드로부터 정제되었다. 대안적으로, Cas9 mRNA는 LiCl 침전 방법으로 정제되었고, 일부 경우에는 접선 유동 여과에 의한 추가 정제가 이어졌다. 전사체 농도는 260 nm (Nanodrop)에서 흡광도를 측정하여 결정하고, 전사체는 Bioanlayzer (Agilent)에 의한 모세관 전기영동으로 분석하였다.
실시예에서 사용된 Cas9 mRNA의 전사를 위한 서열은 표 24에 나타낸 바와 같이 서열번호 501 내지 515로부터 선택된 서열을 포함한다.
[표 24] 예시적인 Cas9 mRNA 서열
지질 나노입자 (LNP) 제형
일반적으로, 지질 나노입자 성분은 다양한 몰 비로 100% 에탄올에 용해되었다. RNA 카고 (예를 들어, Cas9 mRNA 및 sgRNA)를 25 mM 시트레이트, 100 mM NaCl, pH 5.0에 용해시켜 대략 0.45 mg/mL의 RNA 카고 농도를 생성하였다. 실시예 2 내지 4에서 사용된 LNP는 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트)로도 불리는 이온화 가능한 지질 ((9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트, 콜레스테롤, DSPC, 및 PEG2k-DMG를 각각 50:38:9:3 몰 비로 함유하였다. LNP는 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰 비가 약 6이고 gRNA 대 mRNA의 비가 중량 기준으로 1:1로 제형화되었다.
LNP는 2 부피의 RNA 용액 및 1 부피의 물과 함께 에탄올 중에서 지질의 충돌 제트 혼합을 사용하는 교차-유동 기술을 사용하여 준비되었다. 에탄올에서 지질은 2 부피의 RNA 용액과 혼합 교차를 통해 혼합되었다. 제4 스트림의 물은 인라인 티 (inline tee)를 통해 교차의 출구 스트림과 혼합되었다 (WO2016010840 도 2 참조). LNP를 실온에서 1시간 동안 유지하고, 물로 추가로 희석하였다 (대략 1:1 v/v). 희석된 LNP는 평평한 시트 카트리지 (Sartorius, 100kD MWCO)에서 접선 유동 여과를 사용하여 농축한 다음, PD-10 탈염 컬럼 (GE)을 사용하여 50 mM Tris, 45 mM NaCl, 5% (w/v) 수크로스, pH 7.5 (TSS)로 완충액 교환하였다. 이어서, 생성된 혼합물을 0.2 μm 멸균 필터를 사용하여 여과하였다. 최종 LNP는 추가로 사용할 때까지 4℃ 또는 -80℃에서 보관하였다.
인간 LDHA 가이드 디자인 및 사이노몰구스 상동성 가이드 디자인을 사용하는 인간 LDHA
관심 영역에서 PAM을 식별하기 위해 인간 참조 게놈 (예를 들어, hg38) 및 사용자 정의된 관심 게놈 영역 (예를 들어, LDHA 단백질 암호화 엑손)을 사용하여 초기 가이드 선택을 인실리코로 수행하였다. 식별된 각 PAM에 대해, 분석을 수행하고 통계를 보고하였다. gRNA 분자를 추가로 선택하고, 당업계에 알려진 다수의 기준 (예를 들어, GC 함량, 예측된 표적상 (on-target) 활성 및 잠재적인 오프-표적 활성)에 기초하여 순위를 매겼다.
총 84개의 가이드 RNA는 단백질 엑소닉 암호화 영역을 표적화하는 인간 LDHA (ENSG00000134333)에 대해 디자인되었다. 가이드 및 상응하는 게놈 좌표가 상기 제공된다 (표 1). 40개의 가이드 RNA는 사이노몰구스 LDHA와 100% 상동성을 갖는다.
추가 가이드는 드 보노 사이노몰구스 마카크 LDHA 전사체에 대해 디자인되었다. 미가공 (raw) 데이터는 모리셔스-기원 암컷 사이노몰구스 마카크로부터 간 샘플의 공개된 전사체 서열분석으로부터 얻었다 (NCBI SRA ID: SRR1758956; Peng et al. (2015), Nucleic Acids Research, Volume 43, Issue D1, Pages D737-D742). 드 보노 전사체 어셈블리는 Trinity (v2.8.4; Grabherr et al. (2011), Nature Biotechnology, 29: 644-652) 및 SPAdes (v3.13.0; Bankevich et al. (2012), Journal of Computational Biology, 19:5)를 사용하여 수행되었다. 두 방법 모두 LDHA 전사체를 어셈블링할 수 있었는데, 이는 이들의 서열을 LDHA 단백질 (UniProt ID: Q9BE24)과 BLAST (Altschul et al. (1990), Journal of Molecular Biology, 215:3, 403-410)와 비교하여 식별되었다. 시험관내 Cas9 (mRNA/단백질) 및 가이드 RNA 전달.
1차 인간 간 간세포 (PHH) (Gibco, Lot# Hu8298 또는 Hu8296) 및 1차 사이노몰구스 간 간세포 (PCH) (Gibco, Lot# Cy367 또는 In Vitro ADMET Laboratories, Inc. Lot# 10281011)를 해동시키고 보충제 (Gibco, Cat. CM7500)와 함께 간세포 해동 배지에 재현탁시킨 다음, 원심 분리하였다. 상청액을 버리고 펠릿화된 세포를 간세포 플레이팅 배지와 보충 팩 (Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM3000)에 재현탁시켰다. 세포를 계수하고, PHH의 경우 33,000개 세포/웰 및 PCH의 경우 50,000개 세포/웰의 밀도로 Bio-coat 콜라겐 I 코팅된 96-웰 플레이트 (ThermoFisher, Cat. 877272)에 플레이팅하였다. 플레이팅된 세포를 37℃ 및 5% CO2 분위기에서 조직 배양 인큐베이터에서 5시간 동안 침강 및 부착되도록 하였다. 항온처리 후, 세포를 단층 형성에 대해 확인하였고, 간세포 배양 배지 (Takara, Cat. Y20020 및/또는 Invitrogen, Cat. A1217601 및 CM4000)로 1회 세척 하였다.
dgRNA를 사용하는 연구를 위해, 개별 crRNA 및 trRNA는 동일한 양의 시약을 혼합하고 95℃에서 2분 동안 항온처리하고 실온으로 냉각시킴으로써 사전- 어닐링되었다. 사전-어닐링된 crRNA 및 trRNA로 이루어진 이중 가이드 (dgRNA)를 Spy Cas9 단백질과 함께 배양하여 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성하였다. 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 (Lipofectamine) RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150)로 형질감염시켰다. 세포는 Spy Cas9 (10 nM), 개별 가이드 (10 nM), 트레이서 (tracer) RNA (10 nM), 리포펙타민 RNAiMAX (1.0 μL/웰) 및 OptiMem을 포함하는 RNP로 형질감염시켰다.
sgRNA를 사용하는 연구를 위해, 가이드를 Spy Cas9 단백질과 함께 항온처리하여 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성하였다. RNP 형질감염을 사용하는 연구에서, 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 RNAiMAX (ThermoFisher, Cat. 13778150)로 형질감염시켰다. 세포는 Spy Cas9 (10 nM), sgRNA (10 nM), 리포펙타민 RNAiMAX (1.0 μL/웰) 및 OptiMem을 함유하는 RNP로 형질감염시켰다. 전기천공을 이용하는 연구에서, 세포는 Lonza 4D-Nucleofector 코어 유닛 (Cat. AAF-1002X), 96-웰 셔틀 장치 (Shuttle Device) (Cat. AAM 10015), 및 P3 1차 세포 키트 (Cat. V4XP-3960)를 사용하여 Spy Cas9 (2 uM) 및 sgRNA (4 uM)를 함유하는 RNP로 전기천공하였다.
1차 인간 및 사이노몰구스 간세포는 또한 아래에 추가로 설명되는 바와 같이 LNP로 처리되었다. LNP로 처리하기 전에 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 항온처리하였다. LNP를 3% 사이노몰구스 혈청을 함유하는 배지에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하고, 여기에 추가로 제공된 양으로 세포에 투여하였다.
Cas9 mRNA 및 gRNA의 리포펙션은 지질 성분이 50% 지질 A, 9% DSPC, 38% 콜레스테롤 및 3% PEG2k-DMG의 몰 비로 100% 에탄올에서 재구성된 사전-혼합된 지질 제형을 사용하였다. 이어서, 지질 혼합물을 약 6.0의 지질 아민 대 RNA 포스페이트 (N:P) 몰 비로 RNA 카고 (예를 들어, Cas9 mRNA 및 gRNA)와 혼합하였다. 리포펙션은 6% 사이노몰구스 혈청과 gRNA 대 mRNA의 비가 중량 기준으로 1:1로 수행되었다.
게놈 DNA 단리
PHH 및 PCH 형질감염된 세포를 형질감염 후 72 또는 96시간에 수확 하였다. gDNA는 제조업체의 프로토콜에 따라 50 μL/웰 BuccalAmp DNA 추출 용액 (Epicentre, Cat. QE09050)을 사용하여 96-웰 플레이트의 각 웰로부터 추출되었다. 모든 DNA 샘플은 본원에 기재된 바와 같이 PCR 및 후속 NGS로 분석되었다.
표적상 절단 효율을 위한 차세대 서열분석 ("NGS") 및 분석
게놈의 표적 위치에서 편집의 효율을 정량적으로 결정하기 위해, 심층 서열분석을 사용하여 유전자 편집에 의해 도입된 삽입 및 삭제의 존재를 식별하였다. 관심 유전자 (예를 들어, LDHA) 내의 표적 부위 주변에 PCR 프라이머를 디자인하고 관심 게놈 영역을 증폭시켰다. 프라이머 서열 디자인은 현장에서 표준으로 수행되었다.
제조업체의 프로토콜 (Illumina)에 따라 추가 PCR을 수행하여 서열분석을 위한 화학 물질을 추가하였다. 앰플리콘은 Illumina MiSeq 기기에서 서열분석되었다. 판독치는 품질 스코어가 낮은 항목을 제거한 후 참조 게놈 (예를 들어, hg38)에 정렬되었다. 판독치를 포함하는 생성된 파일은 참조 게놈 (BAM 파일)에 매핑되었고, 여기서, 관심 표적 영역과 겹치는 판독치가 선택되었고 야생형 판독치의 수와 삽입 또는 결실을 포함하는 판독치의 수 ("인델")가 계산되었다.
편집 백분율 (예를 들어, "편집 효율" 또는 "편집 퍼센트")은 야생형을 포함한 총 서열 판독치의 수에 대한 삽입 또는 결실 ("인델")이 있는 서열 판독치의 총 수로서 정의된다.
웨스턴 블롯에 의한 락테이트 데하이드로게나제 A (LDHA) 단백질 분석
1차 인간 간세포를 실시예 3에 추가로 기재된 바와 같이 표 1로부터의 선택 가이드로 제형화된 LNP로 처리하였다. LNP는 3% 사이노몰구스 혈청을 함유하는 배지 (Takara, Cat. Y20020)에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 LNP를 인간 간세포에 첨가하였다. 형질감염 21일 후, 배지를 제거하고, 세포를 50 μL/웰 RIPA 완충액 (Boston Bio Products, Cat. BP-115)과 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma, Cat. 11697498001), 1 mM DTT, 및 250 U/ml 벤조나제 (Benzonase) (EMD Millipore, Cat. 71206-3)로 이루어진 새로 첨가된 프로테아제 억제제 혼합물로 용해시켰다. NaCl (1 M 최종 농도)이 첨가될 때 세포는 30분 동안 얼음에 유지시켰다. 세포 용해물을 완전히 혼합하고, 얼음 위에서 30분 동안 유지하였다. 전체 세포 추출물 ("WCE")을 PCR 플레이트로 옮기고 원심 분리하여 펠렛 파편으로 만들었다. 브래드포드 (Bradford) 검정 (Bio-Rad, Cat. 500-0001)을 사용하여 용해물의 단백질 함량을 평가하였다. 브래드포드 검정 절차는 제조업체의 프로토콜에 따라 완료되었다. 추출물은 사용하기 전에 -20℃에서 보관되었다.
AGT-결핍 마우스는 실시예 4에 추가로 기재된 바와 같이 선택 가이드로 제형화된 LNP로 처리하였다. 치료후 마우스로부터 간을 수확하고 단백질 추출을 위해 60 mg 부분을 사용하였다. 샘플을 비드 튜브 (MP Biomedical, Cat. 6925-500)에 넣고, 600 μL/샘플의 RIPA 완충액 (Boston Bio Products, Cat. BP-115)과 완전 프로테아제 억제제 칵테일 (Sigma, Cat. 116974500)로 이루어진 새로 첨가된 프로테아제 억제제 혼합물로 용해하고 5.0 m/초로 균질화하였다. 이어서, 샘플을 4℃에서 10분 동안 14,000 RPM에서 원심분리하고, 액체를 새 튜브로 옮겼다. 최종 원심분리는 14,000 RPM에서 10분 동안 수행되었고, 샘플은 상기 기재된 바와 같이 브래드포드 검정을 사용하여 정량화되었다.
LDHA 단백질 수준을 평가하기 위해 웨스턴 블롯을 수행하였다. 용해물을 Laemmli 완충액과 혼합하고, 95℃에서 10분 동안 변성시켰다. 블롯은 제조업체의 프로토콜에 따라 10% Bis-Tris 겔 (Thermo Fisher Scientific, Cat. NP0302BOX)에서 NuPage 시스템을 사용하여 실행한 다음, 0.45 μm 니트로셀룰로오스 막 (Bio-Rad, Cat. 1620115) 상에 습식 전달하였다. 전이 막을 물로 완전히 헹구고, Ponceau S 용액 (Boston Bio Products, Cat. ST-180)으로 염색하여 완전하고 균일한 전이를 확인하였다. 블롯은 실온에서 실험실 로커에서 30분 동안 TBS 중 5% 분유를 사용하여 차단되었다. 블롯은 TBST로 헹구고, TBST에서 1:1000으로 토끼 α-LDHA 폴리클로날 항체 (세포 용해물의 경우 Sigma, Cat. SAB2108638 또는 마우스 간 용해물의 경우 Genetex, Cat. GTX101416)로 프로브되었다. 시험관내 세포 용해물을 사용한 블롯의 경우, TBST에서 1:1000으로 로딩 대조군 (Novus, Cat. NB600-501)으로 베타-액틴을 사용하고, LDHA 1차 항체와 동시에 항온처리하였다. 생체내 마우스 간 추출물을 사용한 블롯의 경우, GAPDH를 TBST에서 1:1000으로 로딩 대조군 (Abcam, ab8245)으로서 사용하고, LDHA 1차 항체와 동시에 항온처리하였다. 블롯을 백에 밀봉하고, 실험실 로커에서 4℃에서 밤새 보관하였다. 항온처리 후, 블롯을 TBST에서 각각 5분 동안 3회 헹구고, 실온에서 30분 동안 TBST에서 각각 1:12,500으로 마우스 및 토끼 (Thermo Fisher Scientific, Cat. PI35518 및 PISA535571)에 대한 2차 항체로 프로브되었다. 항온처리 후, 블롯을 TBST에서 각각 5분 동안 3회, PBS로 2회 헹구었다. 블롯을 Licor Odyssey 시스템을 사용하여 시각화하고 분석하였다.
면역조직화학적 염색에 의한 락테이트 데하이드로게나제 A (LDHA) 단백질 분석
마우스 간의 시각적 LDHA 단백질 분석을 위해, 표준 면역조화학적 염색이 Lecia Bond Rxm에서 수행되었다. 항원 복구 (HIER)를 위해, 슬라이드를 94℃에서 25분 동안 pH 9 EDTA-기반 완충액에서 가열한 다음, 1:500에서 30분 항체 항온처리 (Abcam Cat. Ab52488)를 수행하였다. 항체 결합은 HRP-접합된 2차 중합체를 사용하여 검출한 다음, 디아미노벤지딘으로 발색 시각화를 수행하였다.
마우스 근육 및 간으로부터 LDH 활성 측정
락테이트 데하이드로게나제 활성을 위해 생화학적 방법 (예를 들어, Wood KD et al., Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2019 Sep 1;1865(9):2203-2209; PMC6613992)이 사용되었다. 락테이트 데하이드로게나제 활성의 측정을 위해, 조직을 빙냉 용해 완충액 (25 mM HEPES, pH 7.3, 0.1% Triton-X-100)에서 프로브 초음파 처리로 균질화하여 10% wt/vol 용해물을 제공하였다. LDH 활성은 락테이트의 존재하에 NAD를 NADH로 감소시키면서 340 nm에서 흡광도의 증가에 의해 측정되었다. LDG의 락테이트 대 피루베이트 활성은 20 mM 락테이트, 100 mM Tris-HCL, pH 9.0, 2 mM NAD+, 0.01% 간 용해물로 측정되었다. 소 혈청 알부민 (BSA)을 표준으로 하는 쿠마시 플러스 (Cooomassie Plus) 단백질 분석 키트 (Pierce, Rockford, IL)를 사용하여 조직 용해물에서 단백질 농도를 측정하였다.
마우스 샘플로부터 옥살레이트, 크레아티닌, 피루베이트, 및 락테이트 측정
옥살레이트 측정을 위해, -80℃에서 저장하기 전에 소변 수집의 일부를 HCl로 1과 2 사이의 pH로 산성화하여 저온 저장 및/또는 알칼리화와 관련된 옥살로겐시스로 발생할 수 있는 임의의 가능한 옥살레이트 결정화를 방지하였다. 남은 산성화되지 않은 소변은 크레아티닌 측정을 위해 -80℃에서 냉동되었다. 질량 분석법 또는 ICMS (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)와 결합된 이온 크로마토그래피 이전에 거대 분자를 제거하기 위해 10,000 공칭 분자량 한계를 갖는 나노-sep 원심분리 필터 (VWR International, Batavia, IL)를 통해 혈장 제제를 여과하였다. 원심분리 필터는 필터 장치에 포획된 임의의 오염 미량 유기산을 제거하기 위해 샘플 여과 전에 10 mM HCl로 세척되었다. 간 조직은 유기산 분석을 위해 10% (wt/vol) 트리클로로아세트산 (TCA)으로 추출하였다. 이들 유기산은 동일한 부피의 1,1,2-트리클로로트리플루오로에탄 (Freon)-트리옥틸아민 (3:1, vol/vol; Aldrich, Milwaukee, WI)으로 격렬하게 볼텍싱하고, 상 분리를 촉진하기 위해 4℃에서 원심분리하고, 분석을 위해 상부 수성 층을 수집하여 TCA를 제거한 후 ICMS로 측정하였다. 이전에 기재된 바와 같이, 소변 크레아티닌은 화학 분석기로 측정하고, 소변 옥살레이트는 ICMS로 측정하였다.
다음 질량/전하 비 및 콘 전압에서 선택된-이온 모니터링 (SIM)을 사용하여 락테이트 (SIM 89.0, 35V) 및 13C3-락테이트 (SIM 92.0, 35V)를 정량화하였다. 피루베이트 AS11-HC 4 μm, 2 x 150 mm, 30℃의 제어된 온도에서 음이온 교환 컬럼 및 Dionex™ ERS™ 500 음이온 전기분해 재생 억제기를 사용하여 IC/MS로 측정되었다. 0.38 ml/분의 유속에서 60분에 걸쳐 0.5 mM로부터 80 mM 까지 KOH 구배를 사용하여 샘플 음이온을 분리하였다. 질량 분석기 (MSQ-PLUS)는 ESI 네거티브 모드, 니들 전압 1.5 V, 500℃ 소스 온도에서 작동하고, 컬럼 용리액은 MSQ에 들어가기 전에 제로 데드 부피 혼합 티 (tee)를 사용하여 0.38 ml/분에서 50% 아세토니트릴과 혼합하였다. 피루베이트 (SIM 87.0, 30 V)를 위해 다음 질량/충전 비 및 콘 전압에서 선택된-이온 모니터링 (SIM)을 사용하였다.
실시예 2 - 스크리닝 및 가이드 적격성 평가
1차 간세포에서 LDHA 가이드의 교차 스크리닝
인간 LDHA를 표적화하는 가이드 및 사이노몰구스 원숭이에서 상동성을 갖는 가이드를 실시예 1에 기재된 바와 같이 1차 인간 (RNP 형질감염을 통해) 및 사이노몰구스 간세포 (RNP 전기천공을 통해)로 형질감염시켰다. 퍼센트 편집은 각 세포 유형에 걸쳐 각 가이드 서열을 포함하는 sgRNA에 대해 결정되었다. 두 세포주에서 표 1의 가이드 서열에 대한 스크리닝 데이터는 아래에 나열되어 있다 (표 4-5).
표 4는 1차 인간 간세포에 RNP로 형질감염된 LDHA에 대한 % 편집, % 삽입 (Ins) 및 % 결실 (Del)에 대한 중복 샘플의 평균 및 표준 편차를 나타낸다. N = 2.
[표 4]
표 5는 1차 사이노몰구스 간세포에서 RNP로 전기천공된 시험된 LDHA sgRNA에 대한 % 편집, % 삽입 (Ins) 및 % 결실 (Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. N = 2.
[표 5]
표 6은 30 nM 농도의 sgRNA에서 리포펙션을 사용하여 1차 사이노몰구스 간세포에서 시험된 LDHA sgRNA에 대한 다중 염색체 위치에 걸친 % 편집에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. N = 2.
[표 6]
1차 인간 및 1차 사이노몰구스 간세포 편집 데이터에 기초하여, 가이드 서열의 서브세트가 추가로 평가되었다. 이 서브세트는 표 7 및 8에 제공되고, 1차 간세포 스크린으로부터 상응하는 편집 데이터가 재현된다.
[표 7]
[표 8]
LDHA 가이드의 오프-표적 분석
생화학적 방법 (예를 들어, 문헌 (Cameron et al., Nature Methods. 6, 600-606; 2017) 참조)을 사용하여 LDHA를 표적화하는 Cas9에 의해 절단된 잠재적인 오프-표적 게놈 부위를 결정하였다. 이 실험에서, 인간 LDHA를 표적화하는 10개의 변형된 sgRNA (및 알려진 오프-표적 프로파일을 가진 2개의 대조군 가이드)는 단리된 HEK293 게놈 DNA를 사용하여 스크리닝되었고, 잠재적인 오프-표적 결과는 도 1에 플롯되었다. 검정은 시험된 sgRNA에 대한 잠재적인 오프-표적 부위를 식별하였다.
잠재적인 오프-표적 부위를 검증하기 위한 표적화된 서열분석
상기 사용된 생화학적 방법과 같은 알려진 오프-표적 검출 검정에서, 다수의 잠재적인 오프-표적 부위는 전형적으로 다른 문맥에서, 예를 들어, 관심있는 1차 세포에서 검증될 수 있는 잠재적 부위에 대해 "광범위한 네트를 캐스팅"하기 위해 디자인에 의해 회수된다. 예를 들어, 생화학적 방법은 전형적으로 검정이 세포 환경이 없는 정제된 고분자량 게놈 DNA를 사용하고 사용된 Cas9 RNP의 용량에 따라 달라지므로 잠재적인 오프-표적 부위의 수를 과도하게 나타낸다. 따라서, 이들 방법에 의해 식별된 잠재적인 오프-표적 부위는 식별된 잠재적인 오프-표적 부위의 표적화된 서열분석을 사용하여 검증될 수 있다.
하나의 접근법에서, 1차 간세포는 Cas9 mRNA 및 관심 sgRNA (예를 들어, 평가를 위한 잠재적인 오프-표적 부위를 갖는 sgRNA)를 포함하는 LNP로 처리된다. 이어서, 1차 간세포를 용해하고 잠재적인 오프-표적 부위(들) 측면에 있는 프라이머를 사용하여 NGS 분석을 위한 앰플리콘을 생성한다. 특정 수준에서 인델의 식별은 잠재적인 오프-표적 부위를 검증할 수 있는 반면, 잠재적인 오프-표적 부위에서 발견된 인델의 결핍은 사용되었던 오프-표적 검정에서 위양성을 나타낼 수 있다.
1차 인간 및 사이노몰구스 간세포에서 Spy Cas9 mRNA 및 sgRNA를 포함하는 지질 나노입자 (LNP) 제형의 교차 스크리닝
인간 LDHA를 표적화하는 변형된 sgRNA의 지질 나노입자 (LNP) 제형 및 사이노에서 상동성인 것들은 용량 반응 검정에서 1차 인간 간세포 및 1차 사이노몰구스 간세포에서 시험되었다. LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화되었다. 1차 인간 및 사이노몰구스 간세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 플레이팅하였다. LNP로 처리하기 전에 두 세포주를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 항온처리하엿다. LNP는 6% 사이노몰구스 혈청을 포함하는 배지에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, LNP를 300 ng Cas9 mRNA에서 시작하는 8 포인트 3배 용량 반응 곡선으로 인간 또는 사이노몰구스 간세포에 첨가하였다. 세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위해 처리 96시간 후에 용해시켰다. 두 세포주에서 가이드 서열에 대한 용량 반응 곡선 데이터를 도 2 및 3에 나타낸다. 22 nM 농도에서의 퍼센트 편집은 아래 표 9 및 10에 나열되어 있다.
표 9는 1차 인간 간세포에서 LNP를 통해 Spy Cas9와 함께 전달된 22 nM에서 시험된 LDHA sgRNA에 대한 % 편집, % 삽입 (Ins) 및 % 결실 (Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다.
[표 9]
표 10은 1차 사이노몰구스 간세포에서 LNP를 통해 Spy Cas9와 함께 전달된 22 nM에서 시험된 LDHA sgRNA에 대한 % 편집, % 삽입 (Ins) 및 % 결실 (Del)에 대한 평균 및 표준 편차를 나타낸다. 이들 샘플은 3회 생성되었다.
[표 10]
리포펙션을 사용하여 1차 사이노몰구스 간세포에서 Spy Cas9 mRNA 및 sgRNA의 교차 스크리닝. LDHA를 표적화하는 변형된 sgRNA는 용량 반응 검정에서 1차 사이노몰구스 간세포에서 시험되었다. 리포펙션 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조되었다. 1차 사이노몰구스 간세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 플레이팅하였다. 세포는 리포펙션 전에 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 항온처리하였다. 리포펙션 샘플은 6% 사이노몰구스 혈청을 포함하는 배지에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 리포펙션 샘플을 53 nM sgRNA (n = 2)에서 시작하는 8 포인트 3배 용량 반응 곡선으로 사이노몰구스 간세포에 첨가하였다. 세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 분석을 위해 처리 96시간 후에 용해시켰다. 가이드 서열에 대한 용량 반응 곡선 데이터는 도 12a 내지 12c에 나타낸다. 53 nM 농도에서의 % 편집은 아래 표 11에 나열되어 있다.
[표 11]
실시예 3. 표현형 분석
세포내 락테이트 데하이드로게나제 A의 웨스턴 블롯 분석
인간 LDHA를 표적화하는 변형된 sgRNA의 지질 나노입자 (LNP) 제형을 1차 인간 간세포에 투여하여 웨스턴 블로팅을 위해 샘플을 생성하였다. LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화되었다. 1차 인간 간세포를 실시예 1에 기재된 바와 같이 플레이팅 하였다. 세포를 LNP로 처리하기 전에 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 항온처리하였다. LNP는 6% 사이노몰구스 혈청을 포함하는 배지에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 LNP를 샘플 당 25 nM의 sgRNA 농도로 인간 간세포에 첨가하였다. 형질감염 후 96시간에, 세포의 일부를 수집하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 NGS 서열분석을 위해 처리하였다. 나머지 세포를 형질감염 21일 후 수확하고, 전체 세포 추출물 (WCE)을 제조하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다.
이들 세포에 대한 편집 데이터는 표 12에 제공된다.
[표 12]
WCE는 LDHA 단백질의 감소를 위해 웨스턴 블롯에 의해 분석되었다. 전장 LDHA 단백질은 332개의 아미노산과 36.6 kD의 예상 분자량을 갖는다. 이 분자량에서의 밴드는 대조군 레인 (미처리된 세포)에서 관찰되었지만 처리된 레인 어디에서도 관찰되지 않았다 (도 4).
락테이트 데하이드로게나제 A의 전사체 분석
LDHA를 표적화하는 선택된 변형된 sgRNA를 리포펙션에 의해 1차 인간 및 사이노몰구스 간세포에 투여하여 qPCR용 샘플을 생성하였다. 리포펙션 샘플은 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화되었다. 1차 간세포는 실시예 1에 기재된 바와 같이 플레팅하였다. 세포는 지질 패킷으로 처리하기 전에 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 항온처리하였다. 리포펙션 샘플은 6% 사이노몰구스 혈청을 포함하는 배지에서 37℃에서 10분 동안 항온처리하였다. 항온처리 후 지질 패킷을 여러 농도로 간세포에 첨가하였다. 리포펙션 96시간 후, 세포를 수집하고, 실시예 1에 기재된 바와 같이 RNA에 대해 처리하였다. 15 nM 가이드에서 1차 인간 및 사이노몰구스 간세포에서의 평균 LDHA 전사체 감소는 아래 표 13에 포함되고, 전체-용량 반응 데이터는 도 13a 및 13b에 표시된다.
[표 13]
실시예 4. PH1의 마우스 모델에서 Ldha의 생체내 편집
야생형 및 AGT 결핍 마우스 (Agxt1 -/-) 둘 다, 예를 들어, 간 AGXT mRNA 및 단백질이 결여된 널 돌연변이 마우스가 이 연구에 사용되었다. AGT-결핍 마우스는 고수산뇨증 및 결정뇨 (crystalluria)를 나타내므로 이전에 문헌 (Salido et al., Proc Natl Acad Sci USA. 2006 Nov 28;103(48):18249-54)에 의해 기재된 바와 같이 PH1의 표현형 모델을 나타낸다. 야생형 마우스를 사용하여 AGT-결핍 마우스에서 시험할 제형을 결정하였다.
LNP를 제형화하기 전에, 뮤린 Ldha를 표적화하는 dgRNA를 포함하는 RNP는 인간 및 사이노몰구스 LDHA-표적화 gRNA에 대해 실시예 2에 기재된 바와 유사하게 편집 효율에 대해 스크리닝되었다. dgRNA 스크린으로부터 활성 gRNA를 식별한 후, 이러한 gRNA를 기반으로 한 더 작은 변형된 sgRNA 세트를 생체내에서 추가 평가를 위해 합성하였다.
그룹 평균 체중을 기준으로 투여 용액을 제조하기 위해, 동물의 체중을 측정하고 체중에 따라 그룹화하였다. 뮤린 Ldha (아래 표 14 참조)를 표적화하는 변형된 sgRNA를 포함하는 LNP는 동물 당 0.2 mL의 부피 (체중 킬로그램 당 대략 10 mL)로 측면 꼬리 정맥을 통해 투여되었다. LNP는 실시예 1에 기재된 바와 같이 제형화되었다. 처리 1주 후, 야생형 마우스를 안락사시키고, 간 조직을 DNA 추출 및 뮤린 Ldha의 편집 분석을 위해 수집하였다. 아래 표 14에 나타낸 바와 같이, 용량-의존적 편집 수준이 처리된 마우스에서 관찰되었다.
[표 14]
LNP가 생체내 마우스 Ldha 유전자를 편집할 수 있음을 확립한 후, G009439를 포함하는 LNP를 총 mRNA 카고에 대한 용량 반응 (0, 0.25, 0.5, 1, 및 2 mpk)으로 AGT-결핍 마우스에 투여하였다. 이들 마우스는 대사 케이지에 수용되었고, 예를 들어, 문헌 (Liebow et al., J Am Soc Nephrol. 2017 Feb;28(2):494-503)에 기재된 바와 같이 옥살레이트 수준에 대해 다양한 시점에서 소변을 수집하였다. Ldha 유전자의 편집과 옥살레이트의 분비는 LNP의 용량이 증가함에 따라 각각 증가 및 감소하는 것으로 나타났다. % 편집 및 배설된 ug 소변 옥살레이트/mg 크레아티닌은 아래 표 15에 포함되고, 도 14a 내지 14c에 표시된다.
[표 15]
LNP가 생체내 옥살레이트 분비를 감소시킬 수 있음을 확립한 후, G009439를 포함하는 LNP를 총 mRNA 카고에 대해 2 mpk의 용량으로 AGT-결핍 마우스에게 투여하였다 (n=4). 도 5에 나타낸 바와 같이, 소변 옥살레이트 수준은 처리 1주 후 감소되었고, 이러한 감소 수준은 연구가 종료된 시점으로부터 투여 후 적어도 5주까지 지속되었다. 대조군 (PBS 주입) 동물 (n=4)에서는 감소가 관찰되지 않았다. 각 처리된 동물의 퍼센트 편집은 표 16에 보고되고, 소변 옥살레이트의 % 감소는 표 18에서 치료후 매주 나타낸다.
동일한 연구에서, AGT-결핍 마우스는 뮤린 Hao1을 표적화하는 sgRNA (G000723)를 포함하는 LNP (2 mpk (n=4)의 용량으로)를 투여하였다. 또한 도 5 및 표 17에 나타낸 바와 같이, 옥살레이트 수준은 이러한 gRNA를 포함하는 LNP로 처리한 1주일 후에 감소되었고, 이러한 감소 수준은 투여 후 적어도 5주까지 지속되었다.
G000723:
mC*mA*mC*GUGAGCCAUGCACUGCAGUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU (서열번호 85) * = PS 연결; 'm' = 2'-O-Me 뉴클레오티드
[표 16]
[표 17]
[표 18]
LNP 치료 후 최대 5주까지 AGT-결핍 마우스에서 지속적인 소변 옥살레이트 감소를 입증한 후, 투여 후 15주 까지 소변 옥살레이트를 추적하기 위한 추가 연구가 수행되었다. G009439를 포함하는 LNP는 0.3 mpk (n=4) 및 1 mpk (n=4)의 용량으로 AGT-결핍 마우스에 투여되었다. 이들 마우스를 대사 케이지에 수용하고 상기 기재된 바와 같이 옥살레이트 수준에 대해 다양한 시점에서 소변을 수집하였다. 표 19는 AGT-결핍 마우스에 대한 편집 결과를 나타낸다. 0.3 mpk 용량에서 달성된 평균 % 편집은 33.42였고, 표준 편차는 11.95였다. 1 mpk 용량에서 달성된 평균 % 편집은 75.68이었고, 표준 편차는 7.35였다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 소변 옥살레이트 수준은 처리 후 감소되었고, 이러한 감소 수준은 연구가 종료된 시점으로부터 투여 후 적어도 15주까지 지속되었다. 도 6에 묘사된 데이터는 표 20에 나타낸다. 대조군 (PBS 주입) 동물 (n=3)에서는 감소가 관찰되지 않았다 (데이터는 나타내지 않음).
처리된 마우스로부터의 간 샘플을 처리하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 웨스턴 블롯에서 실행하였다. LDHA 단백질의 퍼센트 감소는 Licor Odyssey Image Studio Ver 5.2 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. GAPDH는 로딩 대조군으로서 사용되었고, LDHA와 동시에 프로브되었다. LDHA에 대한 밴드를 포함하는 전체 영역과 비교하여 각 샘플 내의 GAPDH에 대한 밀도측정 값에 대한 비를 계산하였다. LDHA 단백질의 퍼센트 감소는 비가 음성 대조군 레인에 대해 표준화된 후에 결정되었다. 결과는 표 19에 나타내고 도 7에 나타내었다.
처리된 마우스와 비처리된 마우스에서 LDHA 단백질은 실시예 1에 기재되고 도 8에 도시된 바와 같이 면역조직화학적 염색을 통해 추가로 특성화되었다. LDHA 염색에서의 점진적 감소는 대조군 마우스와 비교하여 0.3 mpk-투여된 마우스 및 1 mpk-투여된 마우스에서 관찰되었다. 도 9는 표 19의 편집 수준과 단백질 수준 사이의 R2 값이 0.95인 상관관계를 나타낸다.
[표 19]
[표 20]
처리된 마우스로부터의 간 및 근육 샘플을 실시예 1에 기재된 바와 같이 LDH 활성에 대해 처리하였다. 1 mpk의 Ldha LNP로 처리한 마우스로부터의 간 샘플에서 LDH 활성의 감소가 관찰되었다. 처리된 마우스와 대조군 마우스로부터의 고유 활성 (μmol/min/mg 단백질)은 아래 표 21과 도 15a 및 15b에 표시된 데이터에 포함되어 있다.
[표 21]
처리된 마우스로부터의 간 및 혈장 샘플도 실시예 1에 기재된 바와 같이 피루베이트에 대해 분석되었다. 피루베이트는 락테이트 데하이드로게나제에 의해 락테이트로 전환된 대사산물이다 (Urbanska K et al, Int J Mol Sci. 2019 Apr 27;20(9)). 피루베이트 농도는 1 mpk-처리된 마우스로부터 간 샘플에서 상승하는 것으로 입증되었지만, 처리된 마우스와 대조군 마우스 간에 혈장 피루베이트 농도의 차이가 거의 관찰되지 않았다. 이들 데이터는 표 22에 포함되어 있고 도 16a 및 16b에 나타낸다.
[표 22]
LNP 처리 후 최대 15주 까지 AGT-결핍 마우스에서 지속적인 소변 옥살레이트 감소를 입증한 후, LDHA 녹다운 후 락테이트를 제거하는 손상된 신장 기능을 가진 마우스의 능력을 결정하기 위한 추가 연구가 수행되었다. 5/6 신장절제술 또는 샴 수술을 받은 C51Bl6 수컷 마우스는 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)로부터 입수했다. 수술 1주 후, 동물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 기준선 락테이트 수준에 대해 채혈하였다. 이어서, 동물에게 2 mpk (n=6)의 용량으로 G009439를 함유하는 LNP를 투여하였다. 투여 2주 후, 동물에게 복강내 전달된 포스페이트 완충 식염수 (농도 200 mg/mL, ~18 mM) pH 7.4에 용해된 2 g/kg의 락트산나트륨을 포함하는 락테이트 챌린지를 투여하였다 동물은 챌린지 전과 챌린지 후 15, 30, 60 및 180분에 꼬리-출혈이 있었다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 혈액 샘플을 락테이트 수준에 대해 분석하였다. 샴 수술 및 비히클 처리 마우스와 비교하여, 신장 절제술 및 LDHA LNP를 받은 마우스에서 락테이트 제거율의 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 아래 표 23은 도 17에서도 나타낸 바와 같이 동물 그룹에 걸쳐 평균 혈장 피루베이트를 상세히 보여준다.
[표 23]
SEQUENCE LISTING
<110> INTELLIA THERAPEUTICS, INC.
<120> COMPOSITIONS AND METHODS FOR LACTATE DEHYDROGENASE (LDHA) GENE
EDITING
<130> 01155-0025-00PCT
<150> US 62/738,956
<151> 2018-09-28
<150> US 62/834,334
<151> 2019-04-15
<150> US 62/841,740
<151> 2019-05-01
<160> 2082
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
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<220>
<223> Synthetic
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<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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cccgauuccg uuaccuaaug 20
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<223> Synthetic
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ggcuggggca cgucagcaag 20
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<223> Synthetic
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ccccauuagg uaacggaauc 20
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<223> Synthetic
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<220>
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cuccaagcug gucauuauca 20
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guccaauaug gcaacucuaa 20
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ggcuacacau ccugggcuau 20
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<223> Synthetic
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uaccuucauu aagauacuga 20
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gcuggggcac gucagcaaga 20
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cuuuaucagu cccuaaaucu 20
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agccgugaua augaccagcu 20
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cccccauuag guaacggaau 20
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uuuaaaauug cagcuccuuu 20
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acauucauuc cacuccauac 20
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ccuuaaucau gguggaaacu 20
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<223> Synthetic
<400> 46
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<210> 47
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 47
ccuuugccag agacaaucuu 20
<210> 48
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 48
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 49
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 88
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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000
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 109
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 110
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 112
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 113
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 114
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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ucuuuggugu ucuaaggaaa 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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gcuuauuguu ucaaauccag 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 119
acuuccaaua acacgguuuu 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 120
cccauuaagc ugucaugggu 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 121
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<210> 122
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 122
aagacucugc acccagauuu 20
<210> 123
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 123
agacucugca cccagauuua 20
<210> 124
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 124
ccaguuucca ccaugauuaa 20
<210> 125
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 125
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 126
auagagaccc uuaaucaugg 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 127
uccauagaga cccuuaauca 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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uaagggucuc uauggaauaa 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 129
agauaaggaa caguggaaag 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 130
cagaauaaga uuacaguugu 20
<210> 131
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 131
agaauaagau uacaguuguu 20
<210> 132
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 132
aacaacugua aucuuauucu 20
<210> 133
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 133
gaauaagauu acaguuguug 20
<210> 134
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 134
caacaacugu aaucuuauuc 20
<210> 135
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 135
aagauuacag uuguuggggu 20
<210> 136
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 136
guuguugggg uuggugcugu 20
<210> 137
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 137
ugccaucagu aucuuaauga 20
<210> 138
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 138
guccuucauu aagauacuga 20
<210> 139
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 139
caguaucuua augaaggacu 20
<210> 140
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 140
ugucaucgaa gacaaauuga 20
<210> 141
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 141
gucaucgaag acaaauugaa 20
<210> 142
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 142
agacaaucuu ugguguucua 20
<210> 143
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 143
agaacaccaa agauugucuc 20
<210> 144
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 144
ggcuggggca cgucaacaag 20
<210> 145
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 145
gcuggggcac gucaacaaga 20
<210> 146
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 146
gggagaaagc cgucuuaauu 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 147
uaaagauguu cacguuacgc 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 148
gggcuguauu uuacaacauu 20
<210> 149
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 149
uacguggcuu ggaagauaag 20
<210> 150
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 150
acuuaucuuc caagccacgu 20
<210> 151
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 151
ugcaaccacu uccaauaaca 20
<210> 152
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 152
agccagauuc cguuaccuga 20
<210> 153
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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gccagauucc guuaccugau 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 154
ccagauuccg uuaccugaug 20
<210> 155
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 155
ccccaucagg uaacggaauc 20
<210> 156
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 156
cccacccaug acagcuuaau 20
<210> 157
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 157
acccacccau gacagcuuaa 20
<210> 158
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 158
agcugucaug gguggguccu 20
<210> 159
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 159
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<210> 160
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 160
cugucauggg uggguccuug 20
<210> 161
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 161
gggugggucc uuggggaaca 20
<210> 162
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 162
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<210> 163
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 163
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 169
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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uuaccugaug ggggaaagac 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 174
uaccugaugg gggaaagacu 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 175
cucccagucu uucccccauc 20
<210> 176
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 176
aacucaaagg cuacacaucc 20
<210> 177
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 177
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<210> 178
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 178
ggcuacacau ccugggccau 20
<210> 179
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 179
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<210> 180
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 180
aucugcuaca gagaguccaa 20
<210> 181
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 181
cccuuaauca ugguggaaac 20
<210> 182
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 182
ccuugcauuu ugggacagaa 20
<210> 183
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 183
ccauucuguc ccaaaaugca 20
<210> 184
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 184
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<210> 185
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 185
auaucuugac cuacguggcu 20
<210> 186
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 186
uauuggaagu gguugcaauc 20
<210> 187
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 187
ucuuucccag agacaaucuu 20
<210> 188
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 188
ggugguugag agugcuuaug 20
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<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 189
ccucaguguu ccuugcauuu 20
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 190
cucaguguuc cuugcauuuu 20
<210> 191
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 191
ccaaaaugca aggaacacug 20
<210> 192
<211> 20
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 192
acguagguca agauauccac 20
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<400> 193
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000
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<400> 199
000
<210> 200
<211> 22
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 200
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<210> 201
<211> 80
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 201
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugcuuuu 80
<210> 202
<211> 68
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 202
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uuggcaccga 60
gucggugc 68
<210> 203
<211> 76
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 203
guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60
ggcaccgagu cggugc 76
<210> 204
<400> 204
000
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<400> 205
000
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000
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000
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<400> 209
000
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000
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000
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000
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<400> 234
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<400> 235
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<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
<400> 300
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
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<400> 301
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<400> 302
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<400> 303
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<400> 305
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<400> 309
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ggcaccgagu cggugcuuuu 80
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<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n is a, c, g, or u
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nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 20
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000
<210> 2000
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000
<210> 2001
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2001
acauagaccu accuuaauca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2002
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000
<210> 2003
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000
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000
<210> 2005
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2005
ccuaucauac agugcuuaug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2006
<400> 2006
000
<210> 2007
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2007
uagaccuacc uuaaucaugg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2008
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2008
uacagagagu ccaauagccc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2009
<400> 2009
000
<210> 2010
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000
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2014
uacacuuugg gggauccaaa guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2015
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000
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000
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000
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2023
uauuucuuuu agugccugua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2024
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000
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000
<210> 2026
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000
<210> 2027
<211> 102
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2027
cuuuuuauca gucccuaaau cuguuuuaga gcuagaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag 60
uccguuauca acuugaaaaa guggcaccga gucggugcuu uu 102
<210> 2028
<400> 2028
000
<210> 2029
<400> 2029
000
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000
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<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2032
uuuagggacu gauaaagaua guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2033
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000
<210> 2045
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2045
ccuuaaucau gguggaaacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2046
<400> 2046
000
<210> 2047
<400> 2047
000
<210> 2048
<211> 99
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2048
gaaggugacu cugacuucug uuuuagagcu agaaauagca aguuaaaaua aggcuagucc 60
guuaucaacu ugaaaaagug gcaccgaguc ggugcuuuu 99
<210> 2049
<400> 2049
000
<210> 2050
<400> 2050
000
<210> 2051
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<210> 2059
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000
<210> 2060
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000
<210> 2061
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000
<210> 2062
<400> 2062
000
<210> 2063
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2063
cgguuuauua accccaagug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2064
<400> 2064
000
<210> 2065
<400> 2065
000
<210> 2066
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000
<210> 2067
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2067
accgcgaugg gugagcccuc guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2068
<400> 2068
000
<210> 2069
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2069
accgcacgcu ucagugccuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2070
<400> 2070
000
<210> 2071
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2071
guguaaguau agccuccuga guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2072
<400> 2072
000
<210> 2073
<400> 2073
000
<210> 2074
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2074
ggaaaggcca gccccacuug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2075
<400> 2075
000
<210> 2076
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2076
ugccacaaag cucgagccca guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2077
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2077
gguguaagua uagccuccug guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2078
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2078
uccugagggc ucacccaucg guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2079
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2079
aggaaaggcc agccccacuu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2080
<400> 2080
000
<210> 2081
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<400> 2081
gaggaaaggc cagccccacu guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
<210> 2082
<211> 100
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(20)
<223> n, if present, may repeat up to 20 times; if present, n is a, c,
g, or u
<400> 2082
nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60
cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 100
Claims (216)
- LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB) 또는 단일-가닥 파괴 (SSB)를 유도하는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - LDHA 유전자의 발현을 감소시키는 방법으로서, 조성물을 세포에 전달하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 이를 필요로 하는 대상체에게 조성물을 투여하여 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는, 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 고수산뇨증으로 야기된 말기 신장 질환 (ESRD)을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 고수산뇨증으로 야기된 (ESRD)를 치료 또는 예방하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는, 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 옥살산칼슘 생성 및 침착, 원발성 고수산뇨증, 옥살산증, 혈뇨 중 임의의 하나를 치료 또는 예방하고, 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는 방법으로서, 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하여 옥살산칼슘 생성 및 침착, 원발성 고수산뇨증, 옥살산증, 혈뇨 중 임의의 하나를 치료 또는 예방하고, 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는, 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 혈청 글리콜레이트 농도를 증가시키는 방법으로서, 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는, 혈청 글리콜레이트 농도를 증가시키는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 대상체의 소변에서 옥실레이트를 감소시키는 방법으로서, 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 조성물은 다음을 포함하는, 대상체의 소변에서 옥살레이트를 감소시키는 방법:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산이 투여되는, 방법.
- 다음을 포함하는 조성물:
a. 다음을 포함하는 가이드 RNA:
i. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열; 또는
ii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
iii. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열; 또는
iv. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 어느 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
v. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vi. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 또는
vii. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열; 및 임의로
b. RNA-가이드된 DNA 결합제 또는 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 핵산. - 다음을 포함하는 짧은-단일 가이드 RNA (짧은-sgRNA)를 포함하는 조성물:
i. 다음을 포함하는 가이드 서열:
1. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나; 또는
2. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
3. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일; 또는
4. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나; 또는
5. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나; 또는
6. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나; 또는
7. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나; 및
ii. 헤어핀 영역을 포함하는 sgRNA의 보존된 부분으로서, 여기서, 상기 헤어핀 영역은 적어도 5 내지 10개의 뉴클레오티드가 결여되어 있고 임의로 상기 짧은-sgRNA는 5' 단부 변형 및 3' 단부 변형 중 하나 이상을 포함하는, 보존된 부분. - 청구항 10에 있어서, 서열번호 202의 서열을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 또는 11에 있어서, 5' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 3' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 13 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 5' 단부 변형 및 3' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 14중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 3' 꼬리 (tail)를 포함하는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 3' 꼬리는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 15에 있어서, 상기 3' 꼬리는 약 1 내지 2개, 1 내지 3개, 1 내지 4개, 1 내지 5개, 1 내지 7개, 1 내지 10개, 적어도 1 내지 2개, 적어도 1 내지 3개, 적어도 1 내지 4개, 적어도 1 내지 5개, 적어도 1 내지 7개, 또는 적어도 1 내지 10개의 뉴클레오티드를 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 17 중 어느 한 항에 있어서, 상기 짧은-sgRNA는 3' 꼬리를 포함하지 않는, 조성물.
- 청구항 10 내지 18 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 영역에서의 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 3' 단부 변형, 및 상기 헤어핀 영역에서의 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 3' 단부 변형, 상기 헤어핀 영역에서의 변형, 및 5' 단부 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 5' 단부 변형, 및 상기 헤어핀 영역에서의 변형을 포함하는, 조성물.
- 청구항 10 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤어핀 영역은 적어도 5개의 연속 뉴클레오티드가 결여된 것인, 조성물.
- 청구항 10 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 5 내지 10개의 결여된 뉴클레오티드는
a. 헤어핀 1 내에 있거나;
b. 헤어핀 1 내에 있고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "N"이거나;
c. 헤어핀 1 내에 있고 헤어핀 1의 3' 바로 인접한 2개의 뉴클레오티드이거나;
d. 헤어핀 1의 적어도 일부를 포함하거나;
e. 헤어핀 2 내에 있거나;
f. 헤어핀 2의 적어도 일부를 포함하거나;
g. 헤어핀 1 및 헤어핀 2 내에 있거나;
h. 헤어핀 1의 적어도 일부를 포함하고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하거나;
i. 헤어핀 2의 적어도 일부를 포함하고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하거나;
j. 헤어핀 1의 적어도 일부를 포함하고 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하고 헤어핀 2의 적어도 일부를 포함하거나;
k. 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 임의로 포함하는 헤어핀 1 또는 헤어핀 2 내에 있거나;
l. 연속적이거나;
m. 연속적이며 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이에 "N"을 포함하거나;
n. 연속적이며 헤어핀 1의 적어도 일부 및 헤어핀 2의 일부에 걸쳐 있거나;
o. 연속적이며 헤어핀 1의 적어도 일부와 헤어핀 1과 헤어핀 2 사이의 "N"에 걸쳐 있거나;
p. 연속적이며 헤어핀 1의 적어도 일부 및 헤어핀 1의 3' 바로 인접한 2개의 뉴클레오티드에 걸쳐 있거나;
q. 5 내지 10개의 뉴클레오티드로 이루어지거나;
r. 6 내지 10개의 뉴클레오티드로 이루어지거나;
s. 5 내지 10개의 연속 뉴클레오티드로 이루어지거나;
t. 6 내지 10개의 연속 뉴클레오티드로 이루어지거나;
u. 서열번호 400의 뉴클레오티드 54 내지 58로 이루어진, 조성물. - 청구항 10 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 넥서스 영역을 포함하는 sgRNA의 보존된 부분을 포함하며, 상기 넥서스 영역은 적어도 하나의 뉴클레오티드가 결여되어 있는, 조성물.
- 청구항 25에 있어서, 상기 넥서스 영역에 결여된 뉴클레오티드는 다음 중 임의의 하나 이상을 포함하는, 조성물:
a. 상기 넥서스 영역에서 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 뉴클레오티드;
b. 상기 넥서스 영역에서 적어도 또는 정확히 1 내지 2개의 뉴클레오티드, 1 내지 3개의 뉴클레오티드, 1 내지 4개의 뉴클레오티드, 1 내지 5개의 뉴클레오티드, 1 내지 6개의 뉴클레오티드, 1 내지 10개의 뉴클레오티드, 또는 1 내지 15개의 뉴클레오티드; 및
c. 상기 넥서스 영역에서 각각의 뉴클레오티드. - 변형된 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 포함하는 조성물으로서,
다음 a를 포함하고 다음 b를 추가로 포함하는, 조성물:
a. 다음을 포함하는 가이드 서열:
1. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나; 또는
2. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 가이드 서열 중 임의의 하나의 적어도 17, 18, 19, 또는 20개의 인접 뉴클레오티드; 또는
3. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일; 또는
4. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80 중 임의의 하나; 또는
5. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48 중 임의의 하나; 또는
6. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나; 또는
7. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나; 그리고
b. 다음으로부터 선택된 하나 이상의 변형:
1. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
2. 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
3. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위 및 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
4. i) 2개 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
5. i) 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 가이드 영역 YA 부위는 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 8에 또는 그 뒤에 있는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및 임의로;
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
6. i) 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 가이드 영역 YA 부위는 상기 가이드 영역의 3' 말단 뉴클레오티드의 13개의 뉴클레오티드 내에 있는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
7. i) 5' 단부 변형 및 3' 단부 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
8. i) 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 가이드 영역 YA 부위의 변형은 상기 가이드 영역 YA 부위의 5'에 위치한 적어도 하나의 뉴클레오티드가 포함하지 않는 변형을 포함하는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8 중 하나 이상에서의 YA 변형; 또는
9. i) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
ii) 보존된 영역 YA 부위 1 및 8에서 YA 변형; 또는
10. i) 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형으로서, 여기서, 상기 YA 부위는 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 8에 또는 그 뒤에 있는, YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) H1-1 및 H2-1 중 하나 이상에서의 변형; 또는
11. i) 보존된 영역 YA 부위 2, 3, 4, 및 10 중 하나 이상에서의 YA 변형;
ii) 보존된 영역 YA 부위 1, 5, 6, 7, 8, 및 9 중 하나 이상에서의 YA 변형; 및
iii) H1-1 및 H2-1 중 하나 이상에서의 변형; 또는
12. i) 5' 말단으로부터 뉴클레오티드 6에 또는 그 뒤에 위치한 하나 이상의 뉴클레오티드에서 YA 변형과 같은 변형;
ii) 하나 이상의 가이드 서열 YA 부위에서의 YA 변형;
iii) B3, B4, 및 B5 중 하나 이상에서의 변형으로서, 여기서, B6은 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나 2'-OMe 이외의 변형을 포함하는, 변형;
iv) LS10에서의 변형으로서, 여기서, LS10은 2'-플루오로 이외의 변형을 포함하는, 변형; 및/또는
v) N2, N3, N4, N5, N6, N7, N10, 또는 N11에서의 변형; 및
여기서, 다음 중 적어도 하나는 참이다:
a. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
b. 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
c. 하나 이상의 가이드 영역 YA 부위 및 하나 이상의 보존된 영역 YA 부위에서의 YA 변형;
d. 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 8 내지 11, 13, 14, 17, 또는 18 중 적어도 하나는 2'-플루오로 변형을 포함하지 않거나;
e. 5' 말단의 5' 단부로부터 뉴클레오티드 6 내지 10 중 적어도 하나는 포스포로티오에이트 연결을 포함하지 않거나;
f. B2, B3, B4, 또는 B5 중 적어도 하나는 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나;
g. LS1, LS8, 또는 LS10 중 적어도 하나는 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나;
h. N2, N3, N4, N5, N6, N7, N10, N11, N16, 또는 N17 중 적어도 하나는 2'-OMe 변형을 포함하지 않거나;
i. H1-1은 변형을 포함하거나;
j. H2-1은 변형을 포함하거나;
k. H1-2, H1-3, H1-4, H1-5, H1-6, H1-7, H1-8, H1-9, H1-10, H2-1, H2-2, H2-3, H2-4, H2-5, H2-6, H2-7, H2-8, H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14, 또는 H2-15 중 적어도 하나는 포스포로티오에이트 연결을 포함하지 않는다. - 청구항 27에 있어서, 서열번호 450을 포함하는, 조성물.
- 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 대상체에서 LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB) 또는 단일-가닥 파괴 (SSB)를 유도하는데 사용하기 위한, 조성물.
- 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 세포 또는 대상체에서 LDHA 유전자의 발현을 감소시키는데 사용하기 위한, 조성물.
- 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 고수산뇨증을 치료 또는 예방하는 데 사용하기 위한, 조성물.
- 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 혈청 및/또는 혈장 글리콜레이트 농도를 증가시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
- 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 소변 옥살레이트 농도를 감소시키는 데 사용하기 위한, 조성물.
- 청구항 9 내지 28 중 어느 한 항에 있어서, 옥살레이트 생성, 기관에서의 옥살산칼슘 침착, 원발성 고수산뇨증, 전신성 옥살산증을 포함한 옥살산증, 혈뇨, 말기 신장 질환 (ESRD)을 치료 또는 예방 및/또는 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하는 데 사용하기 위한, 조성물.
- 청구항 1 내지 8 중 어느 한 항에 있어서, 다음을 추가로 포함하는, 방법:
a. 세포 또는 대상체에서 상기 LDHA 유전자 내에 이중-가닥 파괴 (DSB) 유도;
b. 세포 또는 대상체에서 상기 LDHA 유전자의 발현 감소;
c. 대상체에서 고수산뇨증 치료 또는 예방;
d. 대상체에서 원발성 고수산뇨증 치료 또는 예방;
e. 대상체에서 PH1, PH2, 및/또는 PH3 치료 또는 예방;
f. 대상체에서 장성 고수산뇨증 치료 또는 예방;
g. 대상체에서 고-옥살레이트 식품 섭취와 관련된 고수산뇨증 치료 또는 예방;
h. 대상체에서 혈청 및/또는 혈장 글리콜레이트 농도 증가;
i. 대상체에서 소변 옥살레이트 농도 감소;
j. 옥살레이트 생성 감소;
k. 기관에서의 옥살산칼슘 침착 감소;
l. 고수산뇨증 감소;
m. 전신성 옥살산증을 포함한 옥살산증 치료 또는 예방;
n. 혈뇨 치료 또는 예방;
o. 말기 신장 질환 (ESRD) 예방; 및/또는
p. 콩팥 또는 간 이식의 필요성 지연 또는 개선. - 청구항 1 내지 8 또는 29 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 혈청 및/또는 혈장 글리콜레이트 수준을 증가시키는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 8 또는 29 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 LDHA 유전자의 편집을 초래하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 37에 있어서, 상기 편집이 편집된 집단의 백분율 (퍼센트 편집)로서 계산되는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 38에 있어서, 상기 퍼센트 편집은 상기 집단의 30%와 99% 사이인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 38에 있어서, 상기 퍼센트 편집은 상기 집단의 30%와 35% 사이, 35%와 40% 사이, 40%와 45% 사이, 45%와 50% 사이, 50%와 55% 사이, 55%와 60% 사이, 60%와 65% 사이, 65%와 70% 사이, 70%와 75% 사이, 75%와 80% 사이, 80%와 85% 사이, 85%와 90% 사이, 90%와 95% 사이, 또는 95%와 99% 사이인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 8 또는 29 내지 35 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 소변 옥살레이트 농도를 감소시키는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 41에 있어서, 소변 옥살레이트의 감소는 콩팥, 간, 방광, 심장, 피부 또는 눈에서 콩팥 결석 및/또는 옥살산칼슘 침착을 감소시키는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 42 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 다음으로부터 선택되는, 방법 또는 조성물:
a. 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192;
b. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80;
c. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48;
d. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184; 및
e. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123. - 청구항 1 내지 43 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 다음을 포함하는 sgRNA를 포함하는, 방법 또는 조성물:
a. 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나; 또는
b. 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081 중 임의의 하나; 또는
c. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 및 80으로부터 선택된 가이드 서열; 또는
c. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 및 48로부터 선택된 가이드 서열;
d. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184로부터 선택된 가이드 서열; 및
e. 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123으로부터 선택된 가이드 서열. - 청구항 1 내지 44 중 어느 한 항에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 1 내지 8 중 임의의 하나에 있는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 1 또는 2에 있는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 3에 있는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 4에 있는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 5 또는 6에 있는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 45에 있어서, 상기 표적 서열은 상기 인간 LDHA 유전자의 엑손 7 또는 8에 있는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 LDHA의 양성 가닥의 표적 서열에 상보적인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 LDHA의 음성 가닥의 표적 서열에 상보적인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 50 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 가이드 서열은 상기 LDHA 유전자의 양성 가닥에서 제1 표적 서열에 상보적이고, 상기 조성물은 상기 LDHA 유전자의 음성 가닥에서 제2 표적 서열에 상보적인 제2 가이드 서열을 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 53 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192 중 임의의 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고, 서열번호 200의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 서열번호 200의 뉴클레오티드는 이의 3' 단부에서 상기 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 54 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192 중 임의의 하나로부터 선택된 가이드 서열을 포함하고, 서열번호 201, 서열번호 202, 서열번호 203, 또는 서열번호 400 내지 450 중 임의의 하나의 뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 여기서, 서열번호 201의 뉴클레오티드는 이의 3' 단부에서 상기 가이드 서열을 따르는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 55 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 단일 가이드 (sgRNA)인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 56에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나를 포함하는 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 56에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 및 1081 중 임의의 하나, 또는 이의 변형된 버전을 포함하고, 임의로 상기 변형된 버전은 서열번호 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 58 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 300의 패턴에 따라 변형되고, 상기 N은 집합적으로 표 1의 가이드 서열 (서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192) 중 임의의 하나인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 59에 있어서, 서열번호 300에서 각각의 N은 임의의 천연 또는 비천연 뉴클레오티드이고, 여기서, 상기 N은 가이드 서열을 형성하고, 상기 가이드 서열은 Cas9를 LDHA 유전자에 표적화하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 60 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192의 가이드 서열 중 임의의 하나 및 서열번호 201, 서열번호 202, 또는 서열번호 203의 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 56 내지 61 중 어느 한 항에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열과 적어도 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 94%, 93%, 92%, 91%, 또는 90% 동일한 가이드 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 62에 있어서, 상기 sgRNA는 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 1001, 1005, 1007, 1008, 1014, 1023, 1027, 1032, 1045, 1048, 1063, 1067, 1069, 1071, 1074, 1076, 1077, 1078, 1079, 1081, 2001, 2005, 2007, 2008, 2014, 2023, 2027, 2032, 2045, 2048, 2063, 2067, 2069, 2071, 2074, 2076, 2077, 2078, 2079, 및 2081로부터 선택된 서열을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 63 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 적어도 하나의 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형은 2'-O-메틸(2'-O-Me) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 또는 65에 있어서, 뉴클레오티드 사이에 포스포로티오에이트 (PS) 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 66 중 어느 한 항에 있어서, 2'-플루오로 (2'-F) 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 67 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 5' 단부에서 처음 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 68 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 3' 단부에서 마지막 5개의 뉴클레오티드 중 하나 이상에서 변형을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 69 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 처음 4개의 뉴클레오티드 사이에 PS 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 70 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 마지막 4개의 뉴클레오티드 사이에 PS 결합을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 71 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 5' 단부에서 처음 3개의 뉴클레오티드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 72 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA의 3' 단부에서 마지막 3개의 뉴클레오티드에서 2'-O-Me 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 64 내지 73 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 300의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법 또는 조성물,
- 청구항 1 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 지질 나노입자 (LNP)와 회합되는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 76에 있어서, 상기 LNP는 양이온성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 77에 있어서, 상기 양이온성 지질은 3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 (9Z,12Z)-옥타데카-9,12-디에노에이트로도 불리는 (9Z,12Z)-3-((4,4-비스(옥틸옥시)부타노일)옥시)-2-((((3-(디에틸아미노)프로폭시)카보닐)옥시)메틸)프로필 옥타데카-9,12-디에노에이트인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 76 내지 78 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 중성 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 79에 있어서, 상기 중성 지질은 DSPC인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 76 내지 80 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 헬퍼 (helper) 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 81에 있어서, 상기 헬퍼 지질은 콜레스테롤인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 76 내지 82 중 어느 한 항에 있어서, 상기 LNP는 스텔스 (stealth) 지질을 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 83에 있어서, 상기 스텔스 지질은 PEG2k-DMG인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 84 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 85 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 RNA-가이드된 DNA 결합제를 암호화하는 mRNA를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 85 또는 86에 있어서, 상기 RNA-가이드된 DNA 결합제는 Cas9인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 87 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약제학적 제형이고, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 1인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 2인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 3인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 4인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 5인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 6인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 7인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 8인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 9인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 10인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 11인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 12인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 13인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 14인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 15인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 16인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 17인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 18인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 19인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 20인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 21인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 22인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 23인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 24인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 25인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 26인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 27인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 28인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 29인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 30인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 31인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 32인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 33인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 34인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 35인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 36인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 37인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 38인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 39인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 40인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 41인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 42인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 43인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 44인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 45인, 방법 또는 조성물.
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- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 49인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 50인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 51인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 52인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 53인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 54인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 55인, 방법 또는 조성물.
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- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 61인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 62인, 방법 또는 조성물.
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- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 64인, 방법 또는 조성물.
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- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 67인, 방법 또는 조성물.
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- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 70인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 71인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 72인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 73인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 74인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 75인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 76인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 77인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 78인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 79인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 80인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 81인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 82인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 83인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 84인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 103인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 109인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 123인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 133인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 149인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 156인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 서열번호 1 내지 84 및 100 내지 192로부터 선택된 서열은 서열번호 166인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 2, 9, 13, 16, 22, 24, 25, 27, 30, 31, 32, 33, 35, 36, 40, 44, 45, 53, 55, 57, 60, 61-63, 65, 67, 69, 70, 71, 73, 76, 78, 79, 80, 82-84, 103, 109, 123, 133, 149, 156, 및 166 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 100 내지 102, 104 내지 108, 110 내지 122, 124 내지 132, 134 내지 148, 150 내지 155, 157 내지 165, 및 167 내지 192 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 62, 66, 68, 70, 73, 75, 76, 77, 78, 80, 103, 109, 123, 133, 149, 153, 156, 및 184 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 서열은 서열번호 1, 5, 7, 8, 14, 23, 25, 27, 32, 45, 48, 103, 및 123 중 임의의 하나를 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 86 내지 90 중 임의의 하나를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 89를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1001 또는 2001을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1005 또는 2005를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1007 또는 2007을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1008 또는 2008을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1014 또는 2014를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1023 또는 2023을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1027 또는 2027을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1032 또는 2032를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1045 또는 2045를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1048 또는 2048을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1063 또는 2063을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1067 또는 2067을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1069 또는 2069를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1071 또는 2071을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1074 또는 2074를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1076 또는 2076을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1077 또는 2077을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1078 또는 2078을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1079 또는 2079를 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 88 중 어느 한 항에 있어서, 상기 가이드 RNA는 서열번호 1081 또는 2081을 포함하는 sgRNA인, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 205 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 단일 용량으로 투여되는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 206 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 1회 투여되는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 206 또는 207에 있어서, 상기 단일 용량 또는 1회 투여는
a. DSB를 유도하고/하거나;
b. LDHA 유전자의 발현을 감소시키고/시키거나;
c. 고수산뇨증을 치료 또는 예방하고/하거나;
d. 고수산뇨증으로 야기된 ESRD의 치료 또는 예방하고/하거나;
e. 옥살산칼슘 생성 및 침착을 치료 또는 예방하고/하거나;
f. 원발성 고수산뇨증 (PH1, PH2, 및 PH3을 포함)을 치료 또는 예방하고/하거나;
g. 옥살산증을 치료 또는 예방하고/하거나;
h. 혈뇨를 치료 및 예방하고/하거나;
i. 장성 고수산뇨증을 치료 또는 예방하고/하거나;
j. 고-옥살레이트 식품 섭취와 관련된 고수산뇨증을 치료 또는 예방하고/하거나;
k. 콩팥 또는 간 이식의 필요성을 지연 또는 개선하고/하거나;
l. 혈청 글리콜레이트 농도를 증가시키고/시키거나;
m. 소변에서 옥살레이트를 감소시키는, 방법 또는 조성물. - 청구항 208에 있어서, 상기 단일 용량 또는 1회 투여는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15주 동안 a) 내지 m) 중 임의의 하나 이상을 달성하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 208에 있어서, 상기 단일 용량 또는 1회 투여는 지속 효과를 달성하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 208 중 어느 한 항에 있어서, 지속 효과를 달성하는 단계를 추가로 포함하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 210 또는 211에 있어서, 상기 지속 효과는 적어도 1개월, 적어도 3개월, 적어도 6개월, 적어도 1년, 또는 적어도 5년 지속되는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 212 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 치료적으로 관련된 소변 내 옥살레이트의 감소를 초래하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 213 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 치료 범위 내의 소변 옥살레이트 수준을 초래하는, 방법 또는 조성물.
- 청구항 1 내지 214 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여는 정상 범위의 100, 120, 또는 150% 내의 옥살레이트 수준을 초래하는, 방법 또는 조성물.
- 고수산뇨증을 가진 인간 대상체를 치료하기 위한 약제의 제조를 위한 청구항 9 내지 215 중 어느 한 항의 조성물 또는 제형의 용도.
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WO2014093694A1 (en) | 2012-12-12 | 2014-06-19 | The Broad Institute, Inc. | Crispr-cas nickase systems, methods and compositions for sequence manipulation in eukaryotes |
MX2015007743A (es) | 2012-12-17 | 2015-12-07 | Harvard College | Ingenieria del genoma humano guiada por ácido robonucleico. |
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US20150376586A1 (en) | 2014-06-25 | 2015-12-31 | Caribou Biosciences, Inc. | RNA Modification to Engineer Cas9 Activity |
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