BR112019011509A2 - rnas guias modificados - Google Patents
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Abstract
esta descrição refere-se a rnas guias simples e duplos modificados tendo atividade in vitro e in vivo melhorada em métodos de edição de gene.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para RNAS GUIAS MODIFICADOS.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS [001] O presente pedido contém uma listagem de sequências que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e é incorporada por referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 7 de dezembro de 2017, é denominada 01155-0004-00PCT_SeqList.txt e tem 118.877 bytes de tamanho.
[002] Este pedido reivindica o benefício de prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos No. 62/431.756, que foi depositado em 8 de dezembro de 2016, e que é incorporado por referência em sua totalidade.
[003] Esta divulgação refere-se ao campo da edição de genes usando sistemas CRISPR/Cas, uma parte do sistema imune procariótico que reconhece e corta elementos genéticos exógenos. O sistema CRISPR/Cas conta com uma única nuclease, denominada proteína 9 associada a CRISPR (Cas9), que induz rupturas específicas de sítio no DNA. A Cas9 é guiada para sequências de DNA específicas por pequenas moléculas de RNA denominadas RNA guia (gRNA). RNA guia compreende trRNA (também conhecido como tracrRNA) e crisprRNA (crRNA). O trRNA e o crRNA podem estar contidos dentro de um RNA guia único (sgRNA) ou em duas moléculas de RNA separadas de um RNA guia duplo (dgRNA). Cas9 em combinação com trRNA e crRNA ou um sgRNA é denominada complexo de ribonucleoproteína Cas9 (RNP).
[004] Os oligonucleotídeos, e em particular o RNA, são por vezes degradados nas células e no soro por divagem com endonuclease ou exonuclease. Melhores métodos e composições para prevenir tal degradação, melhorar a estabilidade de gRNAs e aumentar a eficiência de edição genética são desejados, especialmente para aplicações tePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 14/390
2/177 rapêuticas.
SUMÁRIO [005] Em algumas modalidades, ferramentas de edição de genoma terapêutico são fornecidas que compreende RNAs guia modificados. Os RNAs guias modificados aqui descritos podem melhorar a estabilidade do RNA guia e do complexo RNA guia / Cas9 e melhorar a atividade de Cas9 (por exemplo, SpyCas9 e equivalentes) para clivar o DNA alvo. Em algumas modalidades, o RNA guia é um sgRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia é um dgRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia é um tracrRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia é um crRNA.
[006] Os RNAs guia descritos no presente documento compreendem pelo menos um nucleotídeo modificado. As modificações podem incluir ligação 2'-O-metil (2'-O-Me), 2'-O-(2-metoxietil) (2'-O-moe), 2'fluoro (2'-F), fosforotioato (PS) entre nucleotídeos, substituições G-C e ligações abásicas invertidas entre nucleotídeos e seus equivalentes. Modalidades da invenção incluem:
[007] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é englobado que compreende uma modificação na extremidade 5' e uma ou mais modificações em um ou mais dos seguintes: a região de haste superior; a região de grampo 1; e a região de grampo 2, em que a modificação da extremidade 5' compreende pelo menos duas ligações de fosforotioato nos primeiros sete nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5'. Em alguns casos, a modificação é um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação é um nucleotídeo modificado 2'-fluoro (2'-F).
[008] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em US1 a US12 e/ou uma modificação em H1-1 e/ou uma modificação em H2-1. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em H1-1 a H1-12 e/ou H2-1 a H2-15. Em algumas moda
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3/177 lidades, o sgRNA compreende uma ou mais modificações em cada uma das regiões de haste superior, região de grampo 1 e região de grampo 2. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende um nucleotídeo modificado entre as regiões de grampo 1 e de grampo 2. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma modificação na região de haste inferior.
[009] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma modificação no terminal 5' e/ou no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma modificação de extremidade 3' no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em pelo menos dois dos últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma modificação de extremidade 5' no terminal 5'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em pelo menos dois dos primeiros quatro nucleotideos na extremidade 5' do terminal 5'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma modificação de extremidade 3' no terminal 3' e uma modificação de extremidade 5' no terminal 5'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em pelo menos dois dos últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3' e em pelo menos dois dos primeiros quatro nucleotideos na extremidade 5' do terminal 5'. Em alguns casos, essas modificações são ligações 2'-O-Me, 2'-F, 2'-O-moe ou fosforotioato (PS) que ligam os nucleotideos. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende ligações de PS entre pelo menos dois dos últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3' e/ou pelo menos dois dos primeiros quatro nucleotideos na extremidade 5' do terminal 5'. Em alguns casos, o sgRNA compreende terminal 5' e terminal 3' com mais de uma modificação como descrito aqui, como, com ligações de PS e modificações de 2'-O-Me.
[0010] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma mo
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4/177 dificação na região de protuberância. Em algumas modalidades, 50% dos nucleotídeos na região de protuberância são modificados, em que a modificação é 2'-O-Me ou 2'-F.
[0011] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma modificação na região de nexo. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em N15, N16, N17 e/ou N18 na região de nexo, em que a modificação é 2'-O-Me ou 2'-F. Em alguns casos, N16, N17 e N18 estão ligados a ligações de PS.
[0012] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende pelo menos os três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e os três últimos nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são modificados.
[0013] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações no terminal 3' e/ou terminal 5'. Em alguns casos, os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' estão ligados com ligações de fosforotioato (PS). Em algumas modalidades, a modificação de 5' e 3' compreende 2'-O-Me ou 2'-O-moe. Em algumas modalidades, a modificação de 5' e 3' compreende 2'-F. Em algumas modalidades, a modificação de 5' e/ou 3' compreende ligações de PS ligando nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação de 5' e/ou 3' compreende um ou mais de 2'-O-Me, 2'-O-moe, 2'-F e PS que ligam os nucleotídeos.
[0014] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações nos primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'. Em alguns casos, estas modificações estão ligando a ligação de PS (isto é, ligações de PS que ligam os primeiros quatro e os últimos quatro nucleotídeos). Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende modificações de 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos
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5/177 na extremidade 5' do terminal 5' e nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0015] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações nos primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3', em que as modificações são pelo menos ligações de PS ligando os quatro nucleotídeos, e ainda em que os três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem 2'-O-Me, 2'-O-moe, ou modificações de 2'-F.
[0016] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12, em que a modificação é 2'-OMe ou 2'-F.
[0017] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em cada um dos nucleotídeos na região de protuberância, em que a modificação é 2'-O-Me ou 2'-F.
[0018] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em cada um dos nucleotídeos na região de haste superior, em que a modificação é 2'-O-Me ou 2'-F.
[0019] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em cada um dos nucleotídeos na região de grampo 1, em que a modificação é 2'-O-Me ou 2'-F.
[0020] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em cada um dos nucleotídeos na região de grampo 2, em que a modificação é 2'-O-Me ou 2'-F.
[0021] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nas seguintes posições:
a. os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';
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6/177
b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e/ou LS12 na região de haste inferior;
c. B1 e/ou B2 na região de protuberância;
d. cada nucleotídeo na região de haste superior;
e. N16, N17 e/ou N18 na região de nexo;
f. cada nucleotídeo na região de grampo 1;
g. cada nucleotídeo na região de grampo 2; e
h. os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0022] Em algumas modalidades, B3-B6 são modificados com 2'O-Me. Em alguns casos, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações de 2'-F em LS9 e LS10. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende 2'-F modificações em N15, N16, N17 e N18. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende 2'-F modificações em H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende 2'-F modificações no segundo ao último, terceiro ao último e quarto ao último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'.
[0023] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F nas seguintes posições:
a. LS9 e LS10 na região de haste inferior;
b. N15, N16, N17 e N18 na região de nexo; e
c. H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15 na região de grampo 2.
[0024] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-F no penúltimo, terceiro ao último e quarto ao
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7/177 último nucleotídeo no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-0-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e nucleotídeos modificados com 2'-0-Me ou 2'-F nos três dos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0025] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me opcionais em LS1 e/ou LS6;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. Nucleotídeo modificado opcional 2'-O-Me entre grampo 1 e grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'; e opcionalmente [0026] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0027] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros
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8/177 nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1-LS6;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'; e opcionalmente [0028] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0029] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS2-LS5;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e LS6;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' e opcionalmente [0030] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5'
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9/177 do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0031] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3', [0032] e opcionalmente que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0033] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS9 e LS10;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1
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10/177 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3', [0034] e opcionalmente que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0035] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS8, LS10 e LS12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-F em LS7, LS9 e LS11;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3', e opcionalmente [0036] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0037] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que
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11/177 compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3', e opcionalmente [0038] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' [0039] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS9 e LS10;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
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12/177
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3', e opcionalmente [0040] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0041] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
d. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-8;
f. nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-9 - H2-15;
g. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último, terceiro do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; e
h. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no último nucleotídeo no terminal 3', e opcionalmente [0042] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0043] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-2, H1-4,
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13/177
H1-6, H1-8, H1-10 e H1-12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-F em H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9e H1-11;
e. um nucleotídeo modificado 2'-F entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; e H2-14;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 e H2-15;
h. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; e
i. Nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no terceiro do último e último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3', [0044] e opcionalmente que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
[0045] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende:
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 e H2-15; e
b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2- 12 e H2-14, e opcionalmente [0046] que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'; e opcionalmente que adicionalmente compreende:
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c. nucleotideos modificados com 2'-O-Me no último e terceiro a último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'; e/ou
d. nucleotideos modificados com 2'-F no penúltimo, quarto ao último e/ou último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'.
[0047] Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 228-353, incluindo as modificações da Tabela 4. Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 228-332, incluindo as modificações da Tabela 4. Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende qualquer das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, incluindo as modificações da Tabela 4. Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende a SEQ ID No. 240. Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende a SEQ ID No.240, incluindo as modificações da Tabela 4. Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende a SEQ ID No.242. Em algumas modalidades, um sgRNA é englobado que compreende a SEQ ID No: 358. Em modalidades adicionais, um sgRNA que compreende ácidos nucléicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75, ou 70% de identidade com os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que a modificação em cada nucleotídeo do sgRNA que corresponde a um nucleotídeo do identificador de sequência de referência na Tabela 4, é idêntica ou equivalente à modificação mostrada no identificador de sequência de referência na Tabela 4, opcionalmente que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotideos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende pelo menos três ligações de PS ligando os nucleotideos na região de grampo 1. Em algu
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15/177 mas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende pelo menos três ligações de PS ligando os nucleotídeos na região de grampo 2. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende pelo menos três ligações de PS ligando os nucleotídeos na região de haste superior. Em algumas modalidades, o sgRNA forma um complexo ribonucleoproteico com Cas9 de S. pyogenes.
LEGENDAS DAS FIGURAS [0048] A FIG 1 mostra a percentagem de edição como medida pela sequência de nova geração (NGS) do gene de transtirretina de camundongo (TTR) após transfecção de células Neuro2A com crRNAs modificados em conjunto com Cas9 mRNA e trRNA não modificado (TR000002).
[0049] A FIG 2 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com trRNAs modificados juntamente com crRNA não modificado (CR000686) e Cas9 mRNA.
[0050] A FIG 3 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com Cas9 mRNA e crRNAs e trRNAs tendo pares G-C não encontrados em sequências parentais.
[0051] A FIG 4 mostra a percentagem de edição medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com crRNAs e trRNAs modificados em conjunto com Cas9 mRNA. Desvios padrão seguem o valor.
[0052] A FIG 5 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com sgRNAs modificados em conjunto com Cas9 mRNA.
[0053] A FIG 6 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com crRNAs modificados e trRNA não modificado
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16/177 (TR000002) em conjunto com Cas9 mRNA. O asterisco indica um guia duplo que, por motivos técnicos, não mostrou atividade nesse experimento. Este guia duplo foi testado novamente no experimento representado na Figura 9, em que mostrou atividade de edição.
[0054] A FIG 7 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com crRNA não modificado (CR000686) e trRNAs modificados em conjunto com Cas9 mRNA.
[0055] A FIG 8 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com Cas9 mRNA e emparelhamentos de crRNA e trRNA com emparelhamentos G-C ou incompatibilidades G-U não encontrados nas sequências parentais.
[0056] A FIG 9 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com crRNAs modificados e trRNAs modificados em conjunto com Cas9 mRNA. Desvios padrão seguem o valor.
[0057] A FIG 10 mostra a percentagem de edição medida por NGS do gene de TTR de camundongo após transfecção de células Neuro2A com sgRNAs modificados em conjunto com Cas9 mRNA.
[0058] A Fig. 11 mostra a percentagem de edição como medida por NGS do gene do Fator VII de camundongo (FVII) após transfecção de células Neuro2A com gRNA modificados em conjunto com Cas9 mRNA.
[0059] As Figuras 12A e 12B mostram a percentagem de edição medida por NGS de TTR de camundongo (FIG 12A) ou FVII (FIG 12B) após transfecção de células Neuro2A com crRNAs modificados e trRNA não modificado juntamente com Cas9 mRNA.
[0060] As Figuras 13A e 13B mostram a percentagem de edição medida por NGS de TTR de camundongo (FIG 13A) ou FVII (FIG 13B)
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17/177 após transfecção de células Neuro2A com trRNAs modificados e crRNA não modificado em conjunto com Cas9 mRNA.
[0061] As Figuras 14A, 14B, 14C e 14D mostram níveis de interferon alfa (IFN-alfa, 14A), interleucina 6 (IL-6, 14B), proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1, 14C) e fator de necrose tumoral alfa (TNFalfa, 14D) no soro após administração in vivo de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs.
[0062] As Figuras 15A, 15B e 15C mostram resultados in vivo após a administração de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs. A FIG 15A mostra a percentagem da edição total no fígado. A FIG 15B mostra níveis de TTR no soro. A FIG 15C mostra a média e o desvio padrão para os resultados da FIG 15A. A FIG 15D resume modificações ao sgRNA G000209 (SEQ ID NO: 228). A FIG 15E resume modificações ao sgRNA G000267 (SEQ ID NO: 234). Nas Figuras 15D e 15E, os nucleotídeos em negrito são modificados com 2'-O-Me.
[0063] As Figuras 16A, 16B, 16C e 16D mostram níveis de interferon alfa (IFN-alfa, 16A), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa, 16B), interleucina 6 (IL-6, 16C) e proteína quimiotática de monócito 1 (MCP1, 16D) no soro após administração in vivo de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs.
[0064] As Figuras 17A, 17B, 17C e 17D mostram resultados in vivo após a administração de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs. A FIG 17A mostra a percentagem da edição total no fígado. A FIG 17B mostra a média e o desvio padrão para os resultados da FIG 17A. A FIG 17C mostra níveis de TTR no soro. A FIG 17D mostra a média e o desvio padrão para os resultados da FIG 17B.
[0065] As Figuras 18A, 18B e 18C mostram resultados in vivo após a administração de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs. A FIG 18A mostra a percentagem da edição total no fígado. A FIG 18B resume os dados de edição do fígado. A FIG 18C mostra ní
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18/177 veis de TTR no soro. MPK = miligramas por quilograma; BLOD = abaixo do nível de detecção.
[0066] As Figuras 19A, 19B, 19C e 19D mostram níveis de interferon alfa (IFN-alfa, 19A), proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1, 19B), interleucina 6 (IL-6, 19C) e fator de necrose tumoral alfa. (TNFalfa, 19D) no soro após administração in vivo de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs.
[0067] As Figuras 20A e 20B mostram a edição no fígado do locus FVII (FIG 20A) e do locus TTR (FIG 20B) após a administração in vivo de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs.
[0068] As Figuras 21 A, 21B e 21C mostram esquemas de urn sgRNA anotado (SEQ ID NO: 341) (FIG 21 A), dgRNA CR000686 não anotado (SEQ ID NO: 1) e TR000002 (SEQ ID NO: 188) (FIG 21B), e dgRNA CR000686 anotado (SEQ ID NO: 1) e TR000002 (SEQ ID NO: 188) (FIG 21C).
[0069] As Figuras 22A, 22B e 22C mostram resultados in vivo após a administração de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs. A FIG 22A mostra a percentagem da edição total do locus de TTR no fígado. A FIG 22B resume os dados de edição do fígado. A FIG 22C mostra os níveis de TTR no soro.
[0070] As Figuras 23A, 23B e 23C mostram resultados in vivo após a administração de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs. A FIG 23A mostra a percentagem da edição total do locus de TTR no fígado. A FIG 23B resume os dados de edição do fígado. A figura 23C mostra os níveis de TTR no soro.
[0071] As Figuras 24A, 24B e 24C mostram edição em hepatócitos primários de murganho após administração de LNPs que compreende Cas9 mRNA e sgRNAs. A FIG 24A mostra a percentagem de edição da edição total do locus TTR. A FIG 24B mostra transformações normalizadas da percentagem de edição como uma função da dose de
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19/177 mRNA usada para calcular EC50. A FIG 240 mostra valores EC50 para as LNPs testados.
DESCRIÇÃO DETALHADA [0072] São aqui fornecidos RNAs guias modificados, incluindo RNAs guias duplos e únicos para uso em métodos de edição de genes. As guias modificadas são mais estáveis e apresentam eficácia in vitro e in vivo melhorada, quando comparadas às suas contrapartes não modificadas. Sequências de RNAs guias de engenharia e testados são mostradas na Tabela 4.
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Tabela 4
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| crRNA | ||||
| 1 | CR000686 | não modificado | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGC UGUUUUG | |
| 2 | CR003393 | CR686-1 | superior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 3 | CR003394 | CR686-2 | superior parcial | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAmUm GmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 4 | CR003395 | CR686-3 | superior parcial | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGC mUmGmUmUmUmUmG |
| 5 | CR003396 | CR686-4 | superior parcial | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGC UGUmUmUmUmG |
| 6 | CR003397 | CR686-5 | inferior | CCAG U CCAG CG AGG CAAAGG mG m U m U m U m U m AG A GCUAUGCUGUUUUG |
| 7 | CR003398 | CR686-6 | caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 8 | CR003399 | CR686-7 | caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGmUUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 9 | CR003400 | CR686-8 | caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUmUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 10 | CR003401 | CR686-9 | caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUmUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 11 | CR003402 | CR686-10 | caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUmUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 12 | CR003403 | CR686-11 | caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUmAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 13 | CR003404 | CR686-12 | inferior parcial | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGmUmUmUmUAGAGC UAUGCUGUUUUG |
| 14 | CR003405 | CR686-13 | inferior parcial | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUmUmUUAGAGCUAU GCUGUUUUG |
| 15 | CR003406 | CR686-GC1 | GC inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGGCGCAGAGCUAUGC UGUUUUG |
| 16 | CR003407 | CR686-GC3 | GC superior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGCUAUGC UGGCGCG |
| 17 | CR003408 | CR686-GC5 | GC superior Inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGGCGCAGAGCUAUGC UGGCGCG |
| 18 | CR003409 | CR686 all OMe | mCmCmAmGmUmCmCmAmGmCmGmAmGmGmCmA mAmAmGmGmGmUmUmUmUmAmGmAmGmCmUmAm UmGmCmUmGmUmUmUmUmG | |
| 19 | CR003393mod only | superior | GUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG | |
| 20 | CR003394mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG | |
| 21 | CR003395mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
21/177
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 22 | CR003396mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG | |
| 23 | CR003397mod only | inferior | mGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 24 | CR003398mod only | caminhando para inferior | mGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 25 | CR003399mod only | caminhando para inferior | GmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 26 | CR003400 mod only | caminhando para inferior | GUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 27 | CR003401 mod only | caminhando para inferior | GUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 28 | CR003402mod only | caminhando para inferior | GUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 29 | CR003403mod only | caminhando para inferior | GUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 30 | CR003404 mod only | inferior parcial | GmUmUmUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 31 | CR003405 mod only | inferior parcial | GUmUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG | |
| 32 | CR003721 | CR686-14 | superior e inferior | CCAG UCCAGCG AGGCAAAGG mG U U U m U m AG AmG m CmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 33 | CR003722 | CR686-15 | combo inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUmUmAGAGCUA UGCUGUUUUG |
| 34 | CR003723 | CR686-16 | combo superior, inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUmAGAmGmC mUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 35 | CR003724 | CR686-17 | combo inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUmAGAGCUAU GCUGUUUUG |
| 36 | CR003725 | CR686-18 | combo superior, inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGUUUUAGAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 37 | CR003726 | CR686-19 | caminhando para nexo | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAmGAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 38 | CR003727 | CR686-20 | caminhando para nexo | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGmAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 39 | CR003728 | CR686-21 | caminhando para nexo | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAfGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 40 | CR003729 | CR686-22 | caminhando para nexo | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGfAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 41 | CR003730 | CR686-23 | 2'F caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGfUUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 42 | CR003731 | CR686-24 | 2'F caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUfUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 43 | CR003732 | CR686-25 | 2'F caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUfUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
23/177
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 44 | CR003733 | CR686-26 | 2'F caminhando para inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUfUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 45 | CR003734 | CR686-27 | 2'F combo inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGfGfUfUfUfUfAGAmGmC mUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 46 | CR003735 | CR686-28 | inferior alt | CCAG UCCAGCG AGGCAAAGGf G m Uf U m Uf U m AG AmG mCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 47 | CR003736 | CR686-29 | inferior alt | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGmGfUmUfUmUfAGAmG mCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 48 | CR003737 | CR686-GC6 | GC inferior | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUCUCAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 49 | CR003738 | CR686-GC7 | Caminhando para inferior C | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGCUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 50 | CR003739 | CR686-GC8 | Caminhando para inferior C | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUCUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 51 | CR003740 | CR686-GC9 | Caminhando para inferior C | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUCUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 52 | CR003741 | CR686-GC10 | Caminhando para inferior C | CCAGUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUCAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 53 | CR003721mod only | CR686-14-mod only | superior e inferior | mGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mUmUmG |
| 54 | CR003722mod only | CR686-15-mod only | combo inferior | mGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 55 | CR003723mod only | CR686-16-mod only | combo superior, inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
| 56 | CR003724mod only | CR686-17-mod only | combo inferior | mGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 57 | CR003725mod only | CR686-18-mod only | combo superior, inferior | mG U U U U AG AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 58 | CR003726mod only | CR686-19-mod only | caminhando para nexo | G U U U U AmG AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 59 | CR003727mod only | CR686-20-mod only | caminhando para nexo | G U U U U AG m AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 60 | CR003728mod only | CR686-21-mod only | caminhando para nexo | GUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 61 | CR003729mod only | CR686-22-mod only | caminhando para nexo | GUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 62 | CR003730mod only | CR686-23-mod only | 2'F caminhando para inferior | Gf U U U U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 63 | CR003731mod only | CR686-24-mod only | 2'F caminhando para inferior | G Uf U U U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 64 | CR003732mod only | CR686-25-mod only | 2'F caminhando para inferior | G U Uf U U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 65 | CR003733mod only | CR686-26-mod only | 2'F caminhando para inferior | G U U Uf U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 66 | CR003734mod only | CR686-27-mod only | 2'F combo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
| 67 | CR003735mod only | CR686-28-mod only | inferior alt | fG m Uf U m Uf U m AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m UmUmUmG |
| 68 | CR003736mod only | CR686-29-mod only | inferior alt | mGf U m Uf U m Uf AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m UmUmUmG |
| 69 | CR003737mod only | CR686-GC6mod only | GC inferior | G U C U C A G A m G m C m U m A m U m G m C m U m G m U m U m U m UmG |
| 70 | CR003738mod only | CR686-GC7mod only | Caminhando para inferior C | G C U U U AG AmG m C m U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 71 | CR003739mod only | CR686-GC8mod only | Caminhando para inferior C | G U C U U AG AmG m C m U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 72 | CR003740mod only | CR686-GC9mod only | Caminhando para inferior C | G U U C U AG AmG m C m U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 73 | CR003741mod only | CR686-GC10mod only | Caminhando para inferior C | G U U UCAG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 74 | CR000705 | não modificado | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGC UGUUUUG | |
| 75 | CR004188 | CR705-1 | superior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmCmUm AmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 76 | CR004189 | CR705-2 | superior parcial | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAmUm GmCmUmGmUmUmUmUmG |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 77 | CR004190 | CR705-3 | superior parcial | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGC mUmGmUmUmUmUmG |
| 78 | CR004191 | CR705-4 | superior parcial | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGC UGUmUmUmUmG |
| 79 | CR004192 | CR705-5 | inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGmUmUmUmUmAGA GCUAUGCUGUUUUG |
| 80 | CR004193 | CR705-6 | caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 81 | CR004194 | CR705-7 | caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGmUUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 82 | CR004195 | CR705-8 | caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUmUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 83 | CR004196 | CR705-9 | caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUmUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 84 | CR004197 | CR705-10 | caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUmUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 85 | CR004198 | CR705-11 | caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUmAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 86 | CR004199 | CR705-14 | superior e inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUmUmAGAmGmC mUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 87 | CR004200 | CR705-15 | combo inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUmUmAGAGCUA UGCUGUUUUG |
27/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 40/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 88 | CR004201 | CR705-16 | combo superior, inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 89 | CR004202 | CR705-17 | combo inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGAGCUAU GCUGUUUUG |
| 90 | CR004203 | CR705-18 | combo superior, inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 91 | CR004204 | CR705-19 | caminhando para nexo | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAmGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 92 | CR004205 | CR705-20 | caminhando para nexo | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGmAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 93 | CR004206 | CR705-21 | caminhando para nexo | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAfGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 94 | CR004207 | CR705-22 | caminhando para nexo | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGfAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 95 | CR004208 | CR705-23 | 2'F caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGfUUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 96 | CR004209 | CR705-24 | 2'F caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUfUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 97 | CR004210 | CR705-25 | 2'F caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUfUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 98 | CR004211 | CR705-26 | 2'F caminhando para inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUfUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
28/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 41/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 99 | CR004212 | CR705-27 | 2'F combo inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 100 | CR004213 | CR705-28 | inferior alt | UUACAGCCACGUCUACAGCAfGmUfUmUfUmAGAmG mCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 101 | CR004214 | CR705-29 | inferior alt | UUACAGCCACGUCUACAGCAmGfUmUfUmUfAGAmG mCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 102 | CR004215 | CR705-GC1 | GC inferior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGGCGCAGAGCUAUGC UGUUUUG |
| 103 | CR004216 | CR705-GC3 | GC superior | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAUGC UGGCGCG |
| 104 | CR004188mod only | CR705-1-mod only | superior | GUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 105 | CR004189mod only | CR705-2-mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 106 | CR004190mod only | CR705-3-mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
| 107 | CR004191mod only | CR705-4-mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG |
| 108 | CR004192mod only | CR705-5-mod only | inferior | mGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 109 | CR004193mod only | CR705-6-mod only | caminhando para inferior | mGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
29/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 42/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 110 | CR004194mod only | CR705-7-mod only | caminhando para inferior | GmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 111 | CR004195mod onlymod only | CR705-8-mod only | caminhando para inferior | GUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 112 | CR004196mod only | CR705-9-mod only | caminhando para inferior | GUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 113 | CR004197mod only | CR705-10-mod only | caminhando para inferior | GUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 114 | CR004198mod only | CR705-11-mod only | caminhando para inferior | GUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 115 | CR004199mod only | CR705-14-mod only | superior e inferior | mGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mllmllmG |
| 116 | CR004200mod only | CR705-15-mod only | combo inferior | mGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 117 | CR004201mod only | CR705-16-mod only | combo superior, inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
| 118 | CR004202mod only | CR705-17-mod only | combo inferior | mGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 119 | CR004203mod only | CR705-18-mod only | combo superior, inferior | mG U U U U AG AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 120 | CR004204mod only | CR705-19-mod only | caminhando para nexo | G U U U U AmG AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
30/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 43/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 121 | CR004205mod only | CR705-20-mod only | caminhando para nexo | GUUUUAGmAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmU mllmG |
| 122 | CR004206mod only | CR705-21-mod only | caminhando para nexo | GAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 123 | CR004207mod only | CR705-22-mod only | caminhando para nexo | GfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 124 | CR004208mod only | CR705-23-mod only | 2'F caminhando para inferior | GfUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 125 | CR004209mod only | CR705-24-mod only | 2'F caminhando para inferior | GUfUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 126 | CR004210mod only | CR705-25-mod only | 2'F caminhando para inferior | GUUfUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 127 | CR004211mod only | CR705-26-mod only | 2'F caminhando para inferior | GUUUfUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 128 | CR004212mod only | CR705-27-mod only | 2'F combo inferior | fGf Uf Uf Uf Uf AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m U m UmUmG |
| 129 | CR004213mod only | CR705-28-mod only | inferior alt | fG m Uf U m Uf U m AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m UmUmUmG |
| 130 | CR004214mod only | CR705-29-mod only | inferior alt | mGf U m Uf U m Uf AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m UmUmUmG |
| 131 | CR000657 | não modificado | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGC UGUUUUG |
31/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 44/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 132 | CR004218 | CR657-1 | superior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 133 | CR004219 | CR657-2 | superior parcial | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAmUm GmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 134 | CR004220 | CR657-3 | superior parcial | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGC mUmGmUmUmUmUmG |
| 135 | CR004221 | CR657-4 | superior parcial | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGC UGUmUmUmUmG |
| 136 | CR004222 | CR657-5 | inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGmUmUmUmUmAGA GCUAUGCUGUUUUG |
| 137 | CR004223 | CR657-6 | caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 138 | CR004224 | CR657-7 | caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGmUUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 139 | CR004225 | CR657-8 | caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUmUUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 140 | CR004226 | CR657-9 | caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUmUUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 141 | CR004227 | CR657-10 | caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUmUAGAGCUAUG CUGUUUUG |
| 142 | CR004228 | CR657-11 | caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUmAGAGCUAUG CUGUUUUG |
32/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 45/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 143 | CR004229 | CR657-14 | superior e inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUmUmAGAmGm CmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 144 | CR004230 | CR657-15 | combo inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUmUmAGAGCUA UGCUGUUUUG |
| 145 | CR004231 | CR657-16 | combo superior, inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAmGmC mUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 146 | CR004232 | CR657-17 | combo inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGAGCUAU GCUGUUUUG |
| 147 | CR004233 | CR657-18 | combo superior, inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUAGAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 148 | CR004234 | CR657-19 | caminhando para nexo | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAmGAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 149 | CR004235 | CR657-20 | caminhando para nexo | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGmAmGmCm UmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 150 | CR004236 | CR657-21 | caminhando para nexo | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAfGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 151 | CR004237 | CR657-22 | caminhando para nexo | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGfAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 152 | CR004238 | CR657-23 | 2'F caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGfUUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 153 | CR004239 | CR657-24 | 2'F caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUfUUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
33/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 46/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 154 | CR004240 | CR657-25 | 2'F caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUfUUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 155 | CR004241 | CR657-26 | 2'F caminhando para inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUfUAGAmGmCmU mAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 156 | CR004242 | CR657-27 | 2'F combo inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGAmGmC mUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 157 | CR004243 | CR657-28 | inferior alt | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCfGmUfUmUfUmAGAmG mCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 158 | CR004244 | CR657-29 | inferior alt | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCmGfUmUfUmUfAGAmG mCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 159 | CR004245 | CR657-GC1 | GC inferior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGGCGCAGAGCUAUGC UGUUUUG |
| 160 | CR004246 | CR657-GC3 | GC superior | CAGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGCUAUGC UGGCGCG |
| 161 | CR004218mod only | CR657-1-mod only | superior | GUUUUAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 162 | CR004219mod only | CR657-2-mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAmUmGmCmUmGmUmUmUmUmG |
| 163 | CR004220mod only | CR657-3-mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAUGCmUmGmUmUmUmUmG |
| 164 | CR004221mod only | CR657-4-mod only | superior parcial | GUUUUAGAGCUAUGCUGUmUmUmUmG |
34/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 47/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 165 | CR004222mod only | CR657-5-mod only | inferior | mGmUmUmUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 166 | CR004223mod only | CR657-6-mod only | caminhando para inferior | mGUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 167 | CR004224mod only | CR657-7-mod only | caminhando para inferior | GmUUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 168 | CR004225mod only | CR657-8-mod only | caminhando para inferior | GUmUUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 169 | CR004226mod only | CR657-9-mod only | caminhando para inferior | GUUmUUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 170 | CR004227mod only | CR657-10-mod only | caminhando para inferior | GUUUmUAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 171 | CR004228mod only | CR657-11-mod only | caminhando para inferior | GUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 172 | CR004229mod only | CR657-14-mod only | superior e inferior | mGUUUmUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmU mllmllmG |
| 173 | CR004230mod only | CR657-15-mod only | combo inferior | mGUUUmUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
| 174 | CR004231mod only | CR657-16-mod only | combo superior, inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUm UmUmG |
| 175 | CR004232mod only | CR657-17-mod only | combo inferior | mGUUUUmAGAGCUAUGCUGUUUUG |
35/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 48/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 176 | CR004233mod only | CR657-18-mod only | combo superior, inferior | mG U U U U AG AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 177 | CR004234mod only | CR657-19-mod only | caminhando para nexo | G U U U U AmG AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 178 | CR004235mod only | CR657-20-mod only | caminhando para nexo | G U U U U AG m AmG m Cm U m Am U mG mCm U mG m U m U m U mllmG |
| 179 | CR004236mod only | CR657-21-mod only | caminhando para nexo | GUUUUAfGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 180 | CR004237mod only | CR657-22-mod only | caminhando para nexo | GUUUUAGfAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUmUmUm UmG |
| 181 | CR004238mod only | CR657-23-mod only | 2'F caminhando para inferior | Gf U U U U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 182 | CR004239mod only | CR657-24-mod only | 2'F caminhando para inferior | G Uf U U U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 183 | CR004240mod only | CR657-25-mod only | 2'F caminhando para inferior | G U Uf U U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 184 | CR004241mod only | CR657-26-mod only | 2'F caminhando para inferior | G U U Uf U AG AmG mCm U m Am U mG m Cm U mG m U m U m U m UmG |
| 185 | CR004242mod only | CR657-27-mod only | 2'F combo inferior | fGf Uf Uf Uf Uf AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m U m UmUmG |
| 186 | CR004243mod only | CR657-28-mod only | inferior alt | fG m Uf U m Uf U m AG AmG mCm U m Am U mG mCm U mG m U m UmUmUmG |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 49/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 187 | CR004244mod only | CR657-29-mod only | inferior alt | mGfUmUfUmUfAGAmGmCmUmAmUmGmCmUmGmUm UmUmUmG |
| trRNA | ||||
| 188 | TR000002 | não modificado | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU UUU | |
| 189 | TR000110 | TR2-V2-1 | cauda encurtada | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 190 | TR000111 | TR2-V2-2 | Superior, grampos | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCmGmG mUmGmCmUmllmUmU |
| 191 | TR000112 | TR2-V2-3 | superior apenas | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCG AGUCGGUGCUUUU |
| 192 | TR000113 | TR2-V2-4 | grampo 1 | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGGCAC CGAGUCGGUGCUUUU |
| 193 | TR000114 | TR2-V2-5 | grampo 2 | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
37/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 50/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 194 | TR000115 | TR2-V2-6 | superior, grampo 2 | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGmGmCmA mCmCmGmAmGmllmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 195 | TR000116 | TR2-V2-7 | ambos grampos | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmC mAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmllmUmU mU |
| 196 | TR000117 | TR2-V2-8 | caminhando para inferior | AACAGCAUAGCAAGUmUmAAAAUAAGGCUAGUCCG UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU UUU |
| 197 | TR000118 | TR2-V2-9 | caminhando para inferior | AACAGCAUAGCAAGUUAmAmAAUAAGGCUAGUCCG UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU UUU |
| 198 | TR000119 | TR2-V2-10 | caminhando para inferior | AACAGCAUAGCAAGUUAAAmAmUAAGGCUAGUCCG UUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU UUU |
| 199 | TR000120 | TR2-V2-11 | nexo parcial | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGmU mUmAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC UUUU |
| 200 | TR000121 | TR2-V2-12 | nexo parcial | AACAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA mUmCmAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCU UUU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 51/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 201 | TR000122 | TR2-GC1 | GC inferior | AACAGCAUAGCAAGUUGCGCUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU U |
| 202 | TR000123 | TR2-GC3 | GC superior | GCCAGCAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 203 | TR000124 | TR2-GC5 | GC inferior superior | GCCAGCAUAGCAAGUUGCGCUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU U |
| 204 | TR000125 | TR2 all OMe | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCmAmAmGmUmUm AmAmAmAmUmAmAmGmGmCmUmAmGmUmCmCmG mUmUmAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAm GmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUm GmCmUmUmUmUmUmUmU | |
| 205 | TR000126 | TR2-V2-13 | inferior | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUmAmAm AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmllmGmCmUmUmUmU |
| 206 | TR000127 | TR2-V2-14 | inferior | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmA mUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmUmUmUmU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 52/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 207 | TR000128 | TR2-V2-15 | inferior | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAm AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmllmUmUmU |
| 208 | TR000129 | TR2-V2-16 | inferior alt | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUmUfAmAfAm AfUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCm GmGmllmGmCmUmUmUmU |
| 209 | TR000130 | TR2-V2-17 | inferior alt | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfA mUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCm GmGmllmGmCmUmUmUmU |
| 210 | TR000131 | TR2-V2-18 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCmAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 211 | TR000132 | TR2-V2-19 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUmCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 212 | TR000133 | TR2-V2-20 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAmUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 53/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 213 | TR000134 | TR2-V2-21 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUmAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 214 | TR000135 | TR2-V2-22 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUmUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 215 | TR000136 | TR2-V2-23 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGmUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 216 | TR000137 | TR2-V2-24 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUfCfAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 217 | TR000138 | TR2-V2-25 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUfAfUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
| 218 | TR000139 | TR2-V2-26 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGfUfUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 54/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 219 | TR000140 | TR2-V2-27 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA mGmGmCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAm AmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmUmllmUmU |
| 220 | TR000141 | TR2-V2-28 | caminhando para nexo | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUmCmCmGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAm AmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmUmllmUmU |
| 221 | TR000142 | TR2-V2-29 | protuberância walk | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCmAmAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmUmllmUmU |
| 222 | TR000143 | TR2-V2-30 | protuberância walk | mAmAmCmAmGmCmAmUmAmGmCAAmGmUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmUmUmUmU |
| 223 | TR000144 | TR2-GC6 | GC inferior | AACAGCAUAGCAAGUUGAGAUAAGGCUAGUCCGUU AUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUU U |
| 224 | TR000145 | TR2-GC7 | Caminhando para GC inferior | AACAGCAUAGCAAGUUAAAGUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 225 | TR000146 | TR2-GC8 | Caminhando para GC inferior | AACAGCAUAGCAAGUUAAGAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 55/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 226 | TR000147 | TR2-GC9 | Caminhando para GC inferior | AACAGCAUAGCAAGUUAGAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| 227 | TR000148 | TR2-GC10 | Caminhando para GC inferior | AACAGCAUAGCAAGUUGAAAUAAGGCUAGUCCGUUA UCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
| sgRNA | ||||
| 228 | G000209 | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGC U AG AAAU AGCAAG U U AAAAU AAGGCU AG UCCG U U AU CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU* mU*U | ||
| 229 | G000262 | G209-1 | grampo 2 | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGC U AG AAAU AGCAAG U U AAAAU AAGGCU AG UCCG U U AU CAACU UG AAAAAG U mG mG mCm AmCm CmG m AmG m U mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 230 | G000263 | G209-2 | grampos | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGC U AG AAAU AGCAAG U U AAAAU AAGGCU AG UCCG U U AU CAm AmCm U m U mG m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm AmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU* mU |
| 231 | G000264 | G209-3 | tetralaço | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAGC UAmGmAmAmAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCC GUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGC mU*mU*mU*U |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 56/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 232 | G000265 | G209-4 | superior | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmG mCmUmAGAAAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAGGCUA GUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCG GUGCmU*mU*mU*U |
| 233 | G000266 | G209-5 | superior e laço | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCG AGUCGGUGCmU*mU*mU*U |
| 234 | G000267 | G209-6 | superior, laço, grampos | mC*mC*mA*GUCCAGCGAGGCAAAGGGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 235 | G000262mod only | G209-1-mod only | grampo 2 | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCU AGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 236 | G000263mod only | G209-2-mod only | grampos | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGCU AGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmG mUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmllmG mCmlTmlTmirmU |
| 237 | G000264mod only | G209-3-mod only | tetralaço | GUUUUAGAGCUAmGmAmAmAUAGCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACC GAGUCGGUGCmU*mU*mU*U |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 57/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 238 | G000265mod only | G209-4-mod only | superior | GUUUUAGAmGmCmUmAGAAAmUmAmGmCAAGUUA AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGG CACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U |
| 239 | G000266mod only | G209-5-mod only | superior e laço | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAA GUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU*mU*U |
| 240 | G000267mod only | G209-6-mod only | superior, laço, grampos | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm GmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmG mUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 241 | G000211 | mod de extremidade | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGC U AG AAAU AGCAAG U U AAAAU AAGGCU AG UCCG U U AU CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU* mU*U | |
| 242 | G000282 | mod6 | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG m CAAG U U AAAAU AA GGCUAG UCCG U U AUCAmAmCm Um UmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmU*mU*mU*mU | |
| 243 | G000201 | não mod | UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAGCUAGAAA UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUU GAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 58/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 244 | G000331 | G211-7 | cr inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 245 | G000332 | G211-8 | cr inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 246 | G000333 | G211-9 | cr inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGfUfUfUfUmA GAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 247 | G000334 | G211-10 | tr inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmA mUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 248 | G000335 | G211-11 | tr inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAm AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 249 | G000336 | G211-12 | tr inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfA mUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 250 | G000337 | G211-13 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAA AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 251 | G000338 | G211-14 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAf AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 60/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 252 | G000339 | G211-15 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAm AfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 253 | G000340 | G211-16 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAA AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 254 | G000341 | G211-17 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAf AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 255 | G000342 | G211-18 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAm AfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 61/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 256 | G000343 | G211-19 | Cr protuberante | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAmGmA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 257 | G000344 | G211-20 | Tr protuberante | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 258 | G000345 | G211-21 | nexo | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUfAfUfCfAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 259 | G000346 | G211-22 | nexo | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAm AmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 62/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 260 | G000347 | G211-23 | tudo inferior | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAfGfUfUfUfUfAmG mAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGm UmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmA mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 261 | G000348 | G211-24 | no PS | mUmUmACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmC m U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U AAAAU AAGG CU AG UCCG U U AU CAm AmCm U m U mG m Am Am Am Am A mGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmU mGmCmUmUmUmU |
| 262 | G000349 | G211-25 | 2 OMe PS | mU*mU*ACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGmC m U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U AAAAU AAGG CU AG UCCG U U AU CAm AmCm U m U mG m Am Am Am Am A mGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmU mGmCmUmUWmU |
| 263 | G000350 | G211-26 | 2'F grampo | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG m CAAG U U AAAAU AA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGfUfCfGfGfUfGf CfU*fU*fU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 63/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 264 | G000351 | G211-27 | Alt grampo | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGmAfAmAfAmAfG mUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGmUfGmCfU*mU* fU*mU |
| 265 | G000331mod only | G211-7-mod only | cr inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 266 | G000332mod only | G211-8-mod only | cr inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 267 | G000333mod only | G211-9-mod only | cr inferior | mGfUfUfUfUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmG mCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCm UmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 268 | G000334mod only | G211-10-mod only | tr inferior | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
51/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 64/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 269 | G000335mod only | G211-11-mod only | tr inferior | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 270 | G000336mod only | G211-12-mod only | tr inferior | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 271 | G000337mod only | G211-13-mod only | tudo inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmA mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 272 | G000338mod only | G211-14-mod only | tudo inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG U m U m Af Af Am Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm AmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 273 | G000339mod only | G211-15-mod only | tudo inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG Uf U m Af Am Af Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm A mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 274 | G000340mod only | G211-16-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmA mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
52/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 65/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 275 | G000341mod only | G211-17-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG U m U m Af Af Am Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm AmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 276 | G000342mod only | G211-18-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG Uf U m Af Am Af Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm A mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 277 | G000343mod only | G211-19-mod only | Cr protuberante | GUUUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 278 | G000344mod only | G211-20-mod only | Tr protuberante | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCm AmAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 279 | G000345mod only | G211-21-mod only | nexo | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA G U U AAAAU AAGG CU AG UCCG U Uf Af Uf Cf Am AmCm U m UmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmA mGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 280 | G000346mod only | G211-22-mod only | nexo | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 66/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 281 | G000347mod only | G211-23-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAm G m Cm Am AmG m U m U m Af Af Am Am U AAG G C U AG U CCG UUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC mU*mU*mU*mU |
| 282 | G000348mod only | G211-24-mod only | no PS | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm G m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm Am CmCmG m AmG mUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 283 | G000349mod only | G211-25-mod only | 2 OMe PS | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm G m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm Am CmCmG m AmG mUmCmGmGmUmGmCmUmU*mU*mU |
| 284 | G000350mod only | G211-26-mod only | 2'F grampo | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm G m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm Am CmCmG m AmG fUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU |
| 285 | G000351mod only | G211-27-mod only | Alt grampo | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGm AfAmAfAmAfGmUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGm UfGmCfU*mU*fU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 67/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 286 | G000208 | mod de extremidade | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAGC U AG AAAU AGCAAG U U AAAAU AAGGCU AG UCCG U U AU CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU* mU*U | |
| 287 | G000373 | mod6 | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmU*mU*mU*mU | |
| 288 | G000352 | G208-7 | cr inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 289 | G000353 | G208-8 | cr inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 290 | G000354 | G208-9 | cr inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGfUfUfUfUmA GAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAA AUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 68/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 291 | G000355 | G208-10 | tr inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAAAmA mUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 292 | G000356 | G208-11 | tr inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAfAm AmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 293 | G000357 | G208-12 | tr inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAmAfA mUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmA mAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 294 | G000358 | G208-13 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAA AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 69/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 295 | G000359 | G208-14 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAf AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 296 | G000360 | G208-15 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCmGUUUUmAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAm AfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 297 | G000361 | G208-16 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAA AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 298 | G000362 | G208-17 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUmUmAfAf AmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGm AmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 70/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 299 | G000363 | G208-18 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAGA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUfUmAfAm AfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 300 | G000364 | G208-19 | Cr protuberante | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAmGmA mGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAU AAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 301 | G000365 | G208-20 | Tr protuberante | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmGmUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmC mGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 302 | G000366 | G208-21 | nexo | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUfAfUfCfAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 71/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 303 | G000367 | G208-22 | nexo | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAm AmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 304 | G000368 | G208-23 | tudo inferior | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCfGfUfUfUfUfAm GmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCmAmAmG mUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmA mAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAm CmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 305 | G000369 | G208-24 | no PS | mCmAmGGGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAm AmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCmGmGm UmGmCmUmUmUmU |
| 306 | G000370 | G208-25 | 2 OMe PS | mC*mAG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmGm CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmAm AmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCmGmGm UmGmCmUmU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 72/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 307 | G000371 | G208-26 | 2'F grampo | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGfUfCfGfGfUfGf CfU*fU*fU*mU |
| 308 | G000372 | G208-27 | Alt grampo | mC*mA*mG*GGCUCUUGAAGAUCUCCGUUUUAGAmG mCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAA GGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGmAfAmAfAmAfG mUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGmUfGmCfU*mU* fU*mU |
| 309 | G000352mod only | G208-7-mod only | cr inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 310 | G000353mod only | G208-8-mod only | cr inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 311 | G000354mod only | G208-9-mod only | cr inferior | mGfUfUfUfUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmG mCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCm UmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG mAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 73/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 312 | G000355mod only | G208-10-mod only | tr inferior | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 313 | G000356mod only | G208-11-mod only | tr inferior | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 314 | G000357mod only | G208-12-mod only | tr inferior | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAA GUfUmAfAmAfAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 315 | G000358mod only | G208-13-mod only | tudo inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmA mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 316 | G000359mod only | G208-14-mod only | tudo inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG U m U m Af Af Am Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm AmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmC mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 317 | G000360mod only | G208-15-mod only | tudo inferior | mGUUUUmAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG Uf U m Af Am Af Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm A mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 74/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 318 | G000361mod only | G208-16-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUmUmAAAmAmUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmA mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 319 | G000362mod only | G208-17-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG U m U m Af Af Am Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm AmCm U m U mG m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm AmC mCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 320 | G000363mod only | G208-18-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAG Uf U m Af Am Af Am U AAGGC U AG UCCG U U AUCAm A mCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCm CmGmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 321 | G000364mod only | G208-19-mod only | Cr protuberante | G U UUUAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGm CAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 322 | G000365mod only | G208-20-mod only | Tr protuberante | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCm AmAmGmUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmC mUmUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCm GmAmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 323 | G000366mod only | G208-21-mod only | nexo | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA G U U AAAAU AAGG CU AG UCCG U Uf Af Uf Cf Am AmCm U m U mG m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm AmCmCmG m A mGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 75/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 324 | G000367mod only | G208-22-mod only | nexo | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAmUmCmAmAmCmU mUmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 325 | G000368mod only | G208-23-mod only | tudo inferior | fGfUfUfUfUfAmGmAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAm GmCmAmAmGmUmUmAfAfAmAmUAAGGCUAGUCCG UUAmUmCmAmAmCmUmUmGmAmAmAmAmAmGmU mGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmGmUmGmC mU*mU*mU*mU |
| 326 | G000369mod only | G208-24-mod only | no PS | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm G m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm Am CmCmG m AmG mUmCmGmGmUmGmCmUmUmUmU |
| 327 | G000370mod only | G208-25-mod only | 2 OMe PS | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm G m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm Am CmCmG m AmG mUmCmGmGmUmGmCmUmU*mU*mU |
| 328 | G000371mod only | G208-26-mod only | 2'F grampo | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUm G m Am Am Am Am AmG m U mG mG mCm Am CmCmG m AmG fUfCfGfGfUfGfCfU*fU*fU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 76/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 329 | G000372mod only | G208-27-mod only | Alt grampo | G U U U U AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAA GUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAfAmCfUmUfGm AfAmAfAmAfGmUfGmGfCmAfCmCfGmAfGmUfCmGfGm UfGmCfU*mU*fU*mU |
| 330 | G000269 | mod de extremidade | mC*mC*mC*AUACUCCUACAGCACCAGUUUUAGAGC U AG AAAU AGCAAG U U AAAAU AAGGCU AG UCCG U U AU CAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCmU*mU* mU*U | |
| 331 | G000283 | mod6 | mC*mC*mC*AUACUCCUACAGCACCAGUUUUAGAmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG m CAAG U U AAAAU AA GGCUAG UCCG U U AUCAmAmCm Um UmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmU*mU*mU*mU | |
| 332 | G000285 | não mod | CCCAUACUCCUACAGCACCAGUUUUAGAGCUAGAAA UAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAACUU GAAAAAGUGGCACCGAGUCGGUGCUUUU | |
| 342 | G000537 | G211-33 | 5'end 3xOMePS | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG m CAAG U U AAAAU AA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGm GmUmGmCmUmUmUmU |
64/177
Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 77/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 343 | G000538 | G211-34 | 3'end 3xOMePS | m U m U mACAG CCACG U C UACAG GAG U U U UAGAmG m CmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUAAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUWmlTmU |
| 344 | G000539 | G211-35 | 5xOMePS | mU*mU*mA*mC*mA*GCCACGUCUACAGCAGUUUUA G AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U AA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUm CmGmGmUmG*mC*mU*mU*mU*mU |
| 345 | G000541 | G211-37 | 3xOMePS+2PS | mU*mU*mA*C*A*GCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAm GmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmllmCmGm GmUmG*mC*mU*mU*mU*mU |
| 346 | G000542 | G211-38 | 3xOMePS+7PS | mU*mU*mA*C*A*G*C*C*A*C*GUCUACAGCAGUUUUA G AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U AA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmlTm C*mG*mG*mU*mG*mC*mU*mU*mU*mU |
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Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 78/390
| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 347 | G000543 | G211-39 | invd abasic | (invd)UUACAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmGm Cm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U AAAAU AAG GCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAmA mAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmGmG mUmGmCmUmUmUmU(invd) |
| 348 | G000544 | G211-40 | invd abasic + 3xOMePS | (invd)mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUA GAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAA AAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAm AmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUm CmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU(invd) |
| 349 | G000564 | G211-42 | 3xMOE-PS | moeU*moeU*moeA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUU AG AmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U A AAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmA mAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmU mCmGmGmUmGmCmoeU*moeU*moeU*mU |
| 350 | G000545 | G211-43 | US laço PS | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmA*mG*mA*mA*mA*mUmAmGmCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAm AmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 351 | G000546 | G211-44 | H1 laço PS | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG m CAAG U U AAAAU AA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU*mG*mA*mA*m A*mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 352 | G000547 | G211-45 | H2 laço PS | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG m CAAG U U AAAAU AA GGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmAm AmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG*mA*mG*mU*mCm GmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 353 | G000548 | G211-46 | todos laços PS | mU*mU*mA*CAGCCACGUCUACAGCAGUUUUAGAmG mCmUmA*mG*mA*mA*mA*mUmAmGmCAAGUUAAAA UAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmU*mG*mA*m A*mA*mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmG*mA*mG*m U*mCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU |
| 354 | Mod6 (com modificações não mostradas na listagem de sequência) | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAm G mCm U m AmG m Am Am Am U m AmG mCAAG U U AAAAU A AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU N = qualquer nucleotídeo | ||
| 355 | Apenas região invariável | GUUUUAGAGCUAGAAAUAGCAAGUUAAAAUAAGGC UAGUCCGUUAUCAACUUGAAAAAGUGGCACCGAGU CGGUGCUUUU |
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| SEQ ID NO | Nome | Alias | Descrição | Sequência |
| 356 | Mod6 padrão; Apenas região invariável | GUUUUAGAmGmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCA AGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUm UmGmAmAmAmAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGm AmGmUmCmGmGmUmGmCmU*mU*mU*mU | ||
| 357 | Região variável e invariável | NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAGCUAGAA AUAGCAAGUUAAAAUAAGGCUAGUCCGUUAUCAAC U UG AAAAAG UGG CACCG AG UCGGUGCUUUU | ||
| 358 | Mod6 com modificações mostradas na listagem de sequência | mN*mN*mN*NNNNNNNNNNNNNNNNNGUUUUAGAm GmCmUmAmGmAmAmAmUmAmGmCAAGUUAAAAUA AGGCUAGUCCGUUAUCAmAmCmUmUmGmAmAmA mAmAmGmUmGmGmCmAmCmCmGmAmGmUmCmG mGmUmGmCmU*mU*mU*mU N = qualquer nucleotídeo |
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69/177 [0073] RNA guia e gRNA são usados aqui de forma intercambiável para se referir coletivamente a um sgRNA, um trRNA (também conhecido como tracrRNA), ou um crRNA (também conhecido como um CRISPR RNA). O crRNA e o trRNA podem estar associados a uma molécula de RNA (RNA guia único [sgRNA]) ou em duas moléculas de RNA separadas (RNA guia duplo [dgRNA]). RNA guia ou gRNA refere-se a cada tipo.
[0074] As sequências de trRNA podem ser de ocorrência natural ou a sequência de trRNA pode incluir modificações ou variações em comparação com sequências de ocorrência natural.
[0075] Eficiência de edição ou porcentagem de edição ou edição percentual como usado aqui é o número total de leituras de sequência com inserções ou deleções de nucleotídeos na região-alvo de interesse sobre o número total de sequências lidas após divagem por uma Cas RNP.
[0076] Grampo, como usado aqui, descreve uma volta de ácidos nucléicos que é criada quando um filamento de ácido nucléico se dobra e forma pares de bases com outra seção do mesmo filamento. Um grampo pode formar uma estrutura que compreende um laço ou uma forma em U. Em algumas modalidades, um grampo pode ser constituído por um laço de RNA. Os grampos podem ser formados com duas sequências complementares em uma única molécula de ácido nucléico ligadas umas às outras, com um dobramento ou enrugamento da molécula. Em algumas modalidades, os grampos compreendem estruturas de laço de haste ou haste.
[0077] Regiões, como aqui utilizadas, descrevem grupos conservados de ácidos nucléicos. As regiões também podem ser referidas como módulos ou domínios. As regiões de um gRNA podem desempenhar funções particulares, por exemplo, no direcionamento da atividade de endonuclease do RNP, por exemplo como descrito em
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Briner AE et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014). As regiões de um gRNA são descritas nas Tabelas 1-3.
[0078] Ribonucleoproteína (RNP) ou complexo RNP, como usado aqui, descreve um gRNA, por exemplo, junto com uma nuclease, tal como uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o RNP compreende Cas9 e gRNA.
[0079] Laço de haste, como é usado no presente documento, descreve uma estrutura secundária de nucleotídeos que formam uma haste de base emparelhada que termina em um laço de ácidos nucléicos desemparelhados. Uma haste pode ser formada quando duas regiões da mesma cadeia de ácido nucleico são pelo menos parcialmente complementares em sequência quando lidas em sentidos opostos. Laço, como usado aqui, descreve uma região de nucleotídeos que não baseiam o par (isto é, não são complementares) que podem obstruir uma haste. Um tetralaço descreve uma volta de 4 nucleotídeos. Como usado aqui, a haste superior de um sgRNA pode compreender um tetralaço.
[0080] Em certas modalidades envolvendo dgRNA, uma região de haste como usada aqui descreve uma estrutura secundária de nucleotídeos que forma uma região de base emparelhada entre certas regiões de um crRNA e trRNA (por exemplo, as regiões inferior e superior de cada RNA). A região de haste de um dgRNA também pode ser referida na técnica como uma região de mastro de bandeira.
[0081] Tratamento, como aqui utilizado, abrange qualquer administração ou aplicação de um terapêutico para doença em um objeto, e inclui inibição da doença, impedindo o seu desenvolvimento, aliviando um ou mais sintomas da doença, curando a doença ou prevenindo a recorrência de um ou mais sintomas da doença.
1. Tipos de Modificações
A. Modificações de 2'-O-metila
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71/177 [0082] Acredita-se que os açúcares modificados controlem o franzimento de anéis de açúcar de nucleotídeo, uma propriedade física que influencia a afinidade de ligação de oligonucleotídeo para cadeias complementares, formação de dúplex e interação com nucleases. As substituições nos anéis de açúcar podem, portanto, alterar a confirmação e o enrugamento desses açúcares. Por exemplo, modificações de 2'-O-metil (2'-O-Me) podem aumentar a afinidade de ligação e estabilidade de nucleases de oligonucleotídeos, embora tal como mostrado nos Exemplos, o efeito de qualquer modificação em uma dada posição em um oligonucleotídeo necessite de ser determinado empiricamente.
[0083] Os termos mA, mC, mil ou mG podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido modificado com 2'-O-Me.
[0084] A modificação de um ribonucleotídeo como 2'-O-metil ribonucleotídeo pode ser descrita da seguinte maneira:
RNA
B. Modificações com 2'-O-(2-metoxietil) [0085] Em algumas modalidades, a modificação pode ser 2'-O-(2metoxietil) (2'-O-moe). A modificação de um ribonucleotídeo como um 2'-O-moe ribonucleotídeo pode ser descrita da seguinte forma:
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[0086] Os termos moeA, moeC, moeU ou moeG podem ser usados para denotar um nucleotídeo que foi modificado com 2'-O-moe.
C. Modificações com 2'-fluoro [0087] Outra modificação química que tem mostrado influenciar os anéis de açúcar de nucleotídeo é a substituição de halogênio. Por exemplo, a substituição de 2'-fluoro (2'-F) em anéis de açúcar de nucleotídeo pode aumentar a afinidade de ligação do oligonucleotídeo e estabilidade de nuclease.
[0088] Neste pedido, os termos fA, fC, fU ou fG podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido substituído por 2'F.
[0089] A substituição de 2'-F pode ser representada da seguinte forma:
RNA
Composição natural de RNA
2T-Rh A
S ubstitú içâo com 2'F
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D. Modificações com fosforotioato [0090] Vínculo ou ligação de fosforotioato (PS) refere-se a uma ligação em que um enxofre é substituído por um oxigênio de fosfato sem ligação a ponte em uma ligação de fosfodiéster, por exemplo, nas ligações entre bases de nucleotídeos. Quando os fosforotioatos são utilizados para gerar oligonucleotídeos, os oligonucleotídeos modificados podem também ser referidos como S-oligos.
[0091] Um * pode ser usado para descrever uma modificação de PS. Neste pedido, os termos A*, C*, U* ou G* podem ser utilizados para denotar um nucleotídeo que está ligado ao nucleotídeo seguinte (por exemplo, 3') com uma ligação de PS.
[0092] Neste pedido, os termos mA*, mC*, mU*, ou mG* podem ser usados para denotar um nucleotídeo que foi substituído com 2'-O-Me e que é ligado ao nucleotídeo seguinte (por exemplo, 3') com uma ligação de PS. Da mesma forma, os termos fA*, fC*, fU* ou fG* podem ser usados para denotar um nucleotídeo que tenha sido substituído por 2'-F e que esteja ligado ao nucleotídeo seguinte (por exemplo, 3') com uma ligação de PS. Equivalentes de uma ligação ou ligação de PS são abrangidos pelas modalidades aqui descritas.
[0093] O diagrama abaixo mostra a substituição de S- em um oxigênio de fosfato sem ligação em ponte, gerando uma ligação de PS em vez de uma ligação de fosfodiéster:
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Fosfodièster
ό X i
X y
Fosforotíaato (PS)
Ligação de fosfodiéster Ligação de fosfotioato de RNA natural modificada (PS)
E. Substituições de G-C [0094] Em algumas modalidades, gRNAs são modificados com substituições de sequência que não compreendem modificações químicas. Em algumas modalidades, os gRNA modificados são manipulados com emparelhamentos G-C (por exemplo, nas regiões de haste inferior e/ou superior) que não são encontrados na sequência de gRNA parental. Em algumas modalidades, os gRNAs modificados são manipulados com incompatibilidades G-U (GU wobbles ou emparelhamentos de incompatibilidade) que não são encontrados na sequência de gRNA parental.
F. Modificações abásicas invertidas [0095] Os nucleotideos abásicos referem-se àqueles que não possuem bases nitrogenadas. A estrutura abaixo mostra um oligonucleotídeo com um sítio abásico (também conhecido como apurínico) que não possui uma base:
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[0096] Bases invertidas referem-se àquelas com ligações que são invertidas da ligação normal de 5' para 3' (isto é, uma ligação de 5' para 5' ou uma ligação de 3' para 3'). Por exemplo:
Ligação de aiigonucleotideo Ligação de oiigonicieotideo Abásíca invertida 3’ normal invertida [0097] Um nucleotídeo abásico pode ser anexado com uma ligação invertida. Por exemplo, um nucleotídeo abásico pode ser ligado ao nucleotídeo terminal 5' através de uma ligação 5' a 5', ou um nucleotídeo abásico pode ser ligado ao nucleotídeo 3' terminal através de uma ligação 3' a 3'. Um nucleotídeo abásico invertido no nucleotídeo 5' ou 3' terminal também pode ser designado por uma capa final invertida. Neste pedido, os termos invd indicam uma ligação nucleotídica invertida abásica.
[0098] As modificações acima e seus equivalentes estão incluídos no escopo das modalidades descritas aqui.
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2. Composições de RNA Guia [0099] Composições que compreende RNA guia são englobadas. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um trRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um crRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um crRNA e um trRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um crRNA e trRNA em uma molécula de RNA como um sgRNA. Em algumas modalidades, o RNA guia compreende um crRNA e trRNA em duas moléculas de RNA como um dgRNA. Em um dgRNA, as duas moléculas de RNA podem se associar via emparelhamento de bases.
[00100] Em algumas modalidades, o RNA guia compreende uma região terminal 5'. Em algumas modalidades, o RNA guia não compreende uma região terminal 5'. Em algumas modalidades, a região terminal 5' compreende uma região espaçadora como descrito em Briner AE et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014) para sgRNA (mas aplicável neste caso a todos os RNAs guia). Em algumas modalidades, a região terminal 5' compreende uma modificação de extremidade 5'. Uma região de terminal 5' com ou sem uma região espaçadora pode estar associada a um crRNA, trRNA, sgRNA e/ou dgRNA. A região espaçadora é também às vezes referida aqui, e por outros, como uma região-guia, domínio guia ou domínio alvo. Uma sequência-alvo como aqui usada refere-se a uma sequência de ácido nucleico à qual a região / domínio guia dirige uma nuclease para divagem. Em algumas modalidades, uma proteína spyCas9 pode ser dirigida por uma região / domínio guia para uma sequência-alvo de uma molécula de ácido nucleico alvo pelos nucleotídeos presentes na região espaçadora. Em algumas modalidades, o RNA guia não compreende uma região espaçadora.
[00101] Em algumas modalidades, os RNAs guia descritos aqui compreendem ou consistem em qualquer uma das sequências mos
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77/177 tradas na Tabela 4. Note, no entanto, que quando uma sequência mostra uma região-guia / espaçadora, deve ser reconhecido que a composição pode compreender esta região ou não. Além disso, RNAs guia são abrangidos os quais compreendem as modificações de qualquer uma das sequências apresentadas na Tabela 4 e identificadas na mesma por SEQ ID No., isto é os nucleotídeos podem ser iguais ou diferentes, mas o padrão de modificação mostrado pode ser o mesmo ou semelhante a um padrão de modificação de uma sequência guia da Tabela 4. Um padrão de modificação inclui a posição relativa e identidade de modificações do gRNA ou uma região do gRNA (por exemplo, região de terminal 5', região de haste inferior, região de protuberância, região de haste superior, região de nexo, região de grampo 1, região de grampo 2, região de terminal 3'). Em algumas modalidades, o padrão de modificação contém pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% das modificações de qualquer uma das sequências mostradas na coluna de sequências da Tabela 4, ou cerca de uma ou mais regiões da sequência. Em algumas modalidades, o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico ao padrão de modificação de qualquer uma das sequências mostradas na coluna de sequências da Tabela 4. Em algumas modalidades, o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico em uma ou mais regiões da sequência mostradas na Tabela 4, por exemplo, uma região de terminal 5', região de haste inferior, região de protuberância, região de haste superior, região de nexo, região de grampo 1, região de grampo 2 e/ou região de terminal 3'. Por exemplo, em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico ao padrão de modificação de uma sequên
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78/177 cia sobre a região do terminal 5'. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico em relação à haste inferior. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico à protuberante. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico à haste superior. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico ao nexo. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico ao grampo 1. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95 %, 96%, 97%, 98% e 99% idêntico sobre grampo
2. Em algumas modalidades, um RNA guia é englobado em que o padrão de modificação é pelo menos 50%, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% e 99% idênticos sobre o terminal 3'. Em algumas modalidades, o padrão de modificação difere do padrão de modificação de uma sequência da Tabela 4, ou uma região (por exemplo, terminal 5', haste inferior, protuberância, haste superior, nexo, grampo 1, grampo 2, terminal 3') de tal uma sequência, em 0, 1,2,
3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o gRNA compreende modificações que diferem das modificações de uma sequência da Tabela 4, em 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos. Em algumas modalidades, o gRNA compreende modificações que diferem das modificações de uma região (por exemplo, terminal 5', haste inferior, protube
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79/177 rância, haste superior, nexo, grampo 1, grampo 2, terminal 3') de uma sequência da Tabela 4, a 0, 1,2, 3, 4, 5 ou 6 nucleotídeos.
[00102] Em algumas modalidades, o gRNA compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metila (2'-O-Me). Em algumas modalidades, o gRNA compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-(2metoxietil) (2'-O-moe). Em algumas modalidades, o gRNA compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, o gRNA compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
[00103] Em algumas modalidades, o gRNA compreende uma modificação de extremidade 5', uma modificação de extremidade 3', ou modificações de extremidade 5' e 3'. Em algumas modalidades, a modificação da extremidade 5' compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação da extremidade 5' compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me), 2'-O-(2-metoxietil) (2'-O-moe), e/ou 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, a modificação da extremidade 5' compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato (PS) e um ou mais de um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me), 2'-O-(2-metoxietil) (2'O-moe) e/ou com 2'-fluoro (2'-F). A modificação de extremidade pode compreender uma modificação de fosforotioato (PS), 2'-O-metil (2'-OMe), 2'-O-(2-metoxietil) (2'-O-moe), e/ou 2'-fluoro (2'-F). Modificações de extremidade equivalentes são também abrangidas pelas modalidades aqui descritas. Em algumas modalidades, o gRNA compreende uma modificação de extremidade em combinação com uma modificação de uma ou mais regiões do gRNA.
A. Composições de sgRNAs [00104] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção compreendem gRNA que compreende um crRNA e trRNA que dirigem uma nuclease, tal como Cas9 para uma sequência de
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DNA alvo. Em algumas modalidades nts, os gRNAs aqui descritos podem estar associados a uma molécula de RNA (RNA guia único ou sgRNA).
[00105] Em algumas modalidades, a invenção compreende um sgRNA que compreende ou consiste em qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 228-332.
[00106] Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende qualquer uma das sequências modificadas de SEQ ID Nos: 235-240, 265-285, e 309-329 é fornecido. Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende qualquer uma das sequências modificadas de SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que o sgRNA adicionalmente compreende uma sequência espaçadora de 5' (sequência-guia) que é complementar a uma sequência-alvo e direciona uma Cas9 para o seu alvo, para que a divagem seja englobada. Em alguns casos, a invenção compreende sgRNA que compreende ácidos nucléicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, ou 70% de identidade com os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência.
1. Domínios de sgRNAs [00107] Briner AE et al., Molecular Cell 56: 333-339 (2014) descreve domínios funcionais de sgRNAs, aqui referidos como domínios, incluindo o domínio espaçador responsável por direcionar, a haste inferior, a protuberância, haste superior (que pode incluir um tetralaço), o nexo, e os domínios grampo 1 e grampo 2. Vide, Briner et al. na página 334, Figura 1A.
[00108] Tabela 1 e FIG. 21A proporciona uma descrição dos domínios de um sgRNA tal como aqui utilizado. Na Tabela 1, o n entre regiões representa um número variável de nucleotídeos, por exemplo,
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81/177 de 0 a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais. Em algumas modalidades, n é igual a 0. Em algumas modalidades, n é igual a 1.
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Tabela 1: Regiões de sgRNA (vista linear, 5' a 3')
| LS1-6 | B1-2 | US1-12 | B3-6 | |||||
| terminal 5' (n) | haste inferior | n | protuberância | n | haste superior | n | protuberância | n |
(continua abaixo)
| LS7-12 | N1-18 | H1-1 através H1-12 | H2-1 através H2-15 | ||||
| haste inferior | n | nexo | n | grampo 1 | n | grampo 2 | terminal 3' |
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a) região de terminal 5' [00109] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende nucleotídeos no terminal 5' como mostrado na Tabela 1. Em algumas modalidades, o terminal 5' do sgRNA compreende uma região espaçadora ou guia que funciona para direcionar uma proteína Cas a uma sequência de nucleotídeo alvo. Em algumas modalidades, o terminal 5' não compreende uma região espaçadora ou guia. Em algumas modalidades, o terminal 5' compreende um nucleotídeo espaçador e adicional que não funcionam para direcionar uma proteína Cas para uma região nucleotídica alvo.
[00110] Em algumas modalidades, a região-guia compreende os primeiros 1-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 nucleotídeos na extremidade 5' do sgRNA. Em algumas modalidades, a região-guia compreende 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 5, 6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 17 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 18 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 19 nucleotídeos.
[00111] Em algumas modalidades, a seleção da região-guia é determinada com base em sequências alvo dentro do gene de interesse para edição. Por exemplo, em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma região-guia que é complementar às sequências alvo de um gene de interesse.
[00112] Em algumas modalidades, a sequência-alvo no gene de interesse pode ser complementar à região-guia do sgRNA. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade ou identidade entre uma região-guia de um sgRNA e sua sequência-alvo correspondente no gene de interesse pode ser cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%,
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75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em algumas modalidades, a região-guia de um sgRNA e a região-alvo de um gene de interesse podem ser 100% complementares ou idênticas. Em outras modalidades, a região-guia de um gRNA e a região-alvo de um gene de interesse podem conter pelo menos um erro de emparelhamento. Por exemplo, a região-guia de um sgRNA e a sequência-alvo de um gene de interesse podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 incompatibilidades, em que o comprimento total da sequência-alvo é pelo menos cerca de 17, 18, 19, 20 ou mais pares de bases. Em algumas modalidades, a região-guia de um sgRNA e a região-alvo de um gene de interesse podem conter 1-6 incompatibilidades em que a sequência guia compreende pelo menos cerca de 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotideos. Em algumas modalidades, a região-guia de um sgRNA e a região-alvo de um gene de interesse podem conter 1,2, 3, 4, 5 ou 6 incompatibilidades em que a sequência guia compreende cerca de 20 nucleotideos. O terminal 5' pode compreender nucleotideos que não são considerados regiões guia (isto é, não funcionam para direcionar uma proteína cas9 a um ácido nucleico alvo).
b) haste inferior [00113] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma região de haste inferior (LS) que, quando visto linearmente, é separado por uma protuberância e regiões de haste superior. Vide a Tabela 1.
[00114] Em algumas modalidades, as regiões de haste inferior compreendem 1-12 nucleotideos, por exemplo em uma modalidade, as regiões de haste inferior compreendem LS1-LS12. Em algumas modalidades, a região de haste inferior compreende menos nucleotideos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Em algumas modalidades, a região de haste inferior compreende mais nucleotideos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Quando a região de haste inferior compreende menos ou mais nucleotideos do que os
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85/177 mostrados no esquema da Tabela 1 e a FIG. 21 A, o padrão de modificação, como será evidente para o versado na técnica, deve ser mantido.
[00115] Em algumas modalidades, a região de haste inferior tem nucleotídeos que são complementares na sequência de ácido nucléico quando lidos em direções opostas. Em algumas modalidades, a complementaridade na sequência de ácido nucléico da haste inferior conduz a uma estrutura secundária de uma haste no sgRNA (por exemplo, as regiões podem emparelhar uma com a outra). Em algumas modalidades, as regiões de haste inferior podem não ser perfeitamente complementares umas às outras quando lidas em direções opostas.
c) Protuberância [00116] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma região de protuberância que compreende seis nucleotídeos, B1-B6. Quando visualizada linearmente, a região de protuberância é separada em duas regiões. Vide a Tabela 1. Em algumas modalidades, a região de protuberância compreende seis nucleotídeos, em que os dois primeiros nucleotídeos são seguidos por uma região de haste superior, seguidos pelos últimos quatro nucleotídeos da protuberância. Em algumas modalidades, a região de protuberância compreende menos nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Em algumas modalidades, a região de protuberância compreende mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Quando a região de protuberância compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema da Tabela 1 e a FIG. 21 A, o padrão de modificação, como será evidente para o versado na técnica, deve ser mantido.
[00117] Em algumas modalidades, a presença de uma protuberância resulta em uma dobra direcional entre os módulos de haste superior e inferior em um sgRNA.
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d) haste superior [00118] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma região superior do haste que compreende 12 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de haste superior compreende uma sequência de laço. Em alguns casos, o laço é um tetralaço (laço formado por quatro nucleotídeos).
[00119] Em algumas modalidades, a região de haste superior compreende menos nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e FIG. 21 A. Em algumas modalidades, a região de haste superior compreende mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Quando a região de haste superior compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema da Tabela 1 e a FIG. 21 A, o padrão de modificação, como será evidente para o versado na técnica, deve ser mantido.
[00120] Em algumas modalidades, a região de haste superior tem nucleotídeos que são complementares na sequência de ácido nucléico quando lidos em direções opostas. Em algumas modalidades, a complementaridade na sequência de ácido nucléico da haste superior conduz a uma estrutura secundária de uma haste no sgRNA (por exemplo, as regiões podem emparelhar uma com a outra). Em algumas modalidades, as regiões de haste superior podem não ser perfeitamente complementares umas às outras quando lidas em direções opostas.
e) Nexo [00121] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma região de nexo que está localizado entre a região de haste inferior e a região de grampo 1. Em algumas modalidades, o nexo compreende 18 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de nexo compreende os nucleotídeos N1 a N18 como mostrado na Tabela 1 e a FIG. 21A.
[00122] Em algumas modalidades, a região de nexo compreende
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87/177 menos nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e FIG. 21 A. Em algumas modalidades, a região de nexo compreende mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Quando a região de nexo compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema da Tabela 1 e a FIG. 21 A, o padrão de modificação, como será evidente para o versado na técnica, deve ser mantido.
[00123] Em algumas modalidades, a região de nexo tem nucleotídeos que são complementares na sequência de ácido nucléico quando lidos em direções opostas. Em algumas modalidades, a complementaridade na sequência de ácido nucléico conduz a uma estrutura secundária de uma haste e/ou laço de haste no sgRNA (por exemplo, certos nucleotídeos na região de nexo podem emparelhar a base uns com os outros). Em algumas modalidades, as regiões do nexo podem não ser perfeitamente complementares umas às outras quando lidas em direções opostas.
f) Grampo [00124] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende uma ou mais regiões de grampo. Em algumas modalidades, a região de grampo está a jusante de (por exemplo, 3' para) a região de nexo. Em algumas modalidades, a região de nucleotídeos imediatamente a jusante da região de nexo é denominada grampo 1 ou H1. Em algumas modalidades, a região dos nucleotídeos 3' a para grampo 1 é denominada de grampo 2 ou H2. Em algumas modalidades, a região de grampo compreende o grampo 1 e o grampo 2. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende apenas grampo 1 ou grampo 2.
[00125] Em algumas modalidades, a região de grampo 1 compreende 12 ácidos nucleicos imediatamente a jusante da região de nexo. Em algumas modalidades, a região de grampo 1 compreende os nucleotídeos H1-1 a H1-12, como mostrado na Tabela 1 e a FIG. 21 A.
[00126] Em algumas modalidades, a região de grampo 2 compre
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88/177 ende 15 ácidos nucleicos a jusante da região de grampo 1. Em algumas modalidades, a região de grampo 2 compreende os nucleotídeos H2-1 a H2-15 como mostrado na Tabela 1 e a FIG. 21 A.
[00127] Em algumas modalidades, um ou mais nucleotídeos estão presentes entre as regiões de grampo 1 e de grampo 2. Os um ou mais nucleotídeos entre a região de grampo 1 e grampo 2 podem ser modificados ou não modificados. Em algumas modalidades, o grampo 1 e grampo 2 estão separados por um nucleotídeo. Em algumas modalidades, as regiões de grampo compreendem menos nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Em algumas modalidades, as regiões de grampo compreendem mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 1 e a FIG. 21 A. Quando uma região de grampo compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema da Tabela 1 e a FIG. 21 A, o padrão de modificação, como será evidente para o versado na técnica, deve ser mantido.
[00128] Em algumas modalidades, uma região de grampo tem nucleotídeos que são complementares na sequência de ácido nucleico quando lidos em direções opostas. Em algumas modalidades, as regiões em grampo podem não ser perfeitamente complementares umas às outras quando lidas em direções opostas (por exemplo, o topo ou laço do grampo compreende nucleotídeos não emparelhados).
[00129] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende a substituição de grampo 1 com nucleotídeos n, em que n é um número inteiro entre 1 e 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 e 2 Em algumas modalidades, a região de grampo 1 de um sgRNA é substituída por 2 nucleotídeos.
g) Região do terminal 3' [00130] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende nucleotídeos após a (s) região (ões) de grampo (s). Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20
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89/177 ou mais nucleotídeos, por exemplo, que não estão associados à estrutura secundária de um de grampo. Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 1,2, 3 ou 4 nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo. Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 4 nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo. Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 1, 2 ou 3 nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo.
2. Modificações de sgRNAs [00131] Em algumas modalidades, a invenção compreende um sgRNA que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões: os nucleotídeos no terminal 5'; a região de haste inferior; a região de protuberância; a região da haste superior; a região de nexo; a região de grampo 1; a região de grampo 2; e os nucleotídeos no terminal 3'.
[00132] Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'O-(2-metoxietil) (2'-O-moe). Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
[00133] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em 1,2, 3 ou 4 dos primeiros 4 nucleotídeos na sua extremidade 5'. Em algumas modalidades, os primeiros três ou quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três ou quatro nucleotídeos no terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com ligações de fosforotioato (PS). Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-O-Me. Em algumas modali
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90/177 dades, a modificação compreende 2'-F. Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-O-moe.
[00134] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em 1, 2, 3 ou 4 dos primeiros 4 nucleotídeos na extremidade 5'. Em algumas modalidades, o sgRNA compreende modificações em 1, 2, 3 ou 4 dos primeiros 4 nucleotídeos na extremidade 3'. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com uma ligação de PS, e os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me ou 2'-O-moe.
[00135] Em algumas modalidades, os quatro primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no O terminal 3' compreende modificações de 2'-F.
[00136] Em algumas modalidades, um sgRNA é fornecido em que LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12 são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada um dos nucleotídeos na região de protuberância do sgRNA é modificado com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada um dos nucleotídeos na região de haste superior do sgRNA é modificado com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, N16, N17 e N18 na região de nexo do sgRNA são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada um dos nucleotídeos na região de grampo 1 do sgRNA é modificado com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada um dos nucleotídeos na região de grampo 2 do sgRNA é modificado com 2'-O-Me.
[00137] Em algumas modalidades, o sgRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos seguintes nucleotídeos: os três primeiros nucleotídeos no terminal 5'; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e
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LS12; B1 e B2 na região de protuberância; cada um dos nucleotídeos na região de haste superior do sgRNA; N16, N17 e N18 na região de nexo; cada um dos nucleotídeos na região de grampo 1; cada um dos nucleotídeos na região de grampo 2; e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00138] Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende ácidos nucleicos modificados com 2'O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, LS9 e LS10 são modificados com 2'-F. Em algumas modalidades, N15, N16, N17 e N18 são modificados com 2'-F. Em algumas modalidades, H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, HS-14 e H2-15 são modificados com 2'-F. Em algumas modalidades, o segundo ao último, o terceiro ao último e o quarto ao último nucleotídeo no terminal 3' são modificados com 2'-F [00139] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-F nos seguintes nucleotídeos: LS9 e LS10 na região de haste inferior; N15, N16, N17 e N18 na região de nexo; e H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H213, HS-14 e H2-15 na região de grampo 2. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-F no penúltimo, terceiro ao último e quarto ao último nucleotídeo no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende ácidos nucleicos modificados com 2'
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Ο-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos três dos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00140] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e LS6; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H112; um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00141] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1-LS6; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me em n entre grampo 1 e grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00142] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados
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93/177 com 2'-F em LS2-LS5; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e LS6; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; urn nucleotideo modificado com 2'-O-Me em n entre grampo 1 e grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00143] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; um nucleotideo modificado com 2'-O-Me em n entre grampo 1 e grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os I quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00144] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS8, LS10 e LS12; nucleotídeos modificados com 2'-O-F em LS7, LS9 e LS11; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; um nucleotideo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotí
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94/177 deos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00145] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00146] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12; nucleotídeos modificados com 2'-F em LS9 e LS10; nucleotídeos modificados com 2'O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
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95/177 [00147] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12; um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H21 - H2-8; nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-9 - H2-15; nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último, terceiro do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; e um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no último nucleotídeo no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00148] Em algumas modalidades, um RNA guia único (sgRNA) é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5'; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 e H1-12; nucleotídeos modificados com 2'-F em H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9 e H1-11; um nucleotídeo modificado 2'-F entre Grampo 1 e Grampo 2; nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; e H2-14; nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H211; H2-13 e H2-15; nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; e 2'-O-Me modificado nucleotídeo no terceiro do último e último nucleotídeo no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
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96/177 [00149] Divulgado aqui, em algumas modalidades, é um RNA guia único (sgRNA) que compreende modificações de 2'-O-Me nos nucleotídeos LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13e H2-15; e modificações de 2'-F em LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H22, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2- 12 e H2-14. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me no último e terceiro ao último nucleotídeo no terminal 3'; e nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo para o último e terceiro para o último nucleotídeo no terminal 3'. [00150] Divulgado aqui, em algumas modalidades, é um sgRNA que compreende os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 228-232. Divulgado aqui, em algumas modalidades, é um sgRNA que compreende os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329. Divulgado aqui, em algumas modalidades, é um sgRNA compreende ácidos nucléicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75, ou 70% de identidade com os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência. Em algumas modalidades, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00151] Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende uma modificação de extremidade 5' e uma ou mais modificações em um ou mais dos: a região de haste superior; a região de grampo 1; e a
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97/177 região de grampo 2 é fornecida, em que a modificação da extremidade 5' compreende pelo menos duas ligações de fosforotioato nos primeiros sete nucleotídeos do terminal 5'.
[00152] Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende uma modificação de extremidade 5' e uma ou mais modificações em um ou mais de: a região de haste superior; a região de grampo 1; e a região de grampo 2 é fornecida, em que a modificação da extremidade 5' compreende uma ou mais ligações de fosforotioato na extremidade 5' do RNA. Em algumas modalidades, uma ou mais ligações de fosforotioato ligam os nucleotídeos terminais 5'.
[00153] Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende uma modificação de extremidade 5' e uma ou mais modificações em um ou mais de: a região de haste superior; a região de grampo 1; e a região de grampo 2 é fornecida, em que a modificação da extremidade 5' compreende uma ou mais ligações de fosforotioato dentro dos primeiros sete nucleotídeos do terminal 5'.
[00154] Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende qualquer uma das sequências de sgRNA modificado de SEQ ID Nos: 228-332 é fornecido.
[00155] Em algumas modalidades, um sgRNA que compreende ou consiste em qualquer uma das sequências de sgRNA modificado de SEQ ID Nos: 235-240, 265-285, e 309-329 é fornecido.
[00156] Em algumas modalidades, a invenção compreende um sgRNA que compreende qualquer uma das sequências modificadas de SEQ ID Nos: 235-240, 265-285, e 309-329, em que o sgRNA adicionalmente compreende uma sequência espaçadora 5' que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequência-alvo, e direciona uma Cas9 a seu alvo para divagem.
[00157] Em algumas modalidades, a invenção compreende um sgRNA que compreende nucleotídeos tendo pelo menos 99, 98, 97,
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96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75, ou 70% de identidade com os nucleotideos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência. Ou seja, os nucleotideos A, U, C e G podem diferir em 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% em comparação com o que é mostrado nas sequências, mas a modificação permanece inalterada. [00158] Em algumas modalidades, a invenção compreende um sgRNA que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões: os nucleotideos no terminal 5'; a região de haste inferior; a região de protuberância; a região da haste superior; a região de nexo; a região de grampo 1; a região de grampo 2; e os nucleotideos no terminal 3'.
[00159] Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotideos. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo abásico invertido.
[00160] Em algumas modalidades, um sgRNA é fornecido que compreende nucleotideos modificados com 2'-O-Me em: os primeiros três nucleotideos no terminal 5'; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12 na haste inferior; B1 e B2 na região de protuberância; cada um dos nucleotideos na região de haste superior; N16, N17 e N18 na região de nexo; cada um dos nucleotideos na região de grampo 1; um nucleotídeo entre o grampo 1 e o grampo 2; cada um dos nucleotideos na região de grampo 2; e os últimos quatro nucleotideos no terminal 3'. Em uma modalidade, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de PS entre os primeiros quatro nucleotideos no terminal 5' e três liga
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99/177 ções de PS entre os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00161] Em algumas modalidades, um sgRNA é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em: os três primeiros nucleotídeos no terminal 5'; LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12 na haste inferior; B1-B6 na região de protuberância; cada um dos nucleotídeos na região de haste superior; N16, N17 e N18 na região de nexo; cada um dos nucleotídeos na região de grampo 1; um nucleotídeo entre o grampo 1 e o grampo 2; cada um dos nucleotídeos na região de grampo 2; e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em uma modalidade, o sgRNA adicionalmente compreende três ligações de PS entre os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS entre os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00162] Em algumas modalidades, um sgRNA é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em: LS9 e LS10 na haste inferior; 15-N18 na região de nexo; H2-9-HS-15 na região de grampo 2; e o segundo ao último, o terceiro ao último e o quarto ao último nucleotídeos na região de terminal 3'.
[00163] Em algumas modalidades, um sgRNA é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em: cada nucleotídeo na haste inferior; 15-N18 na região de nexo; H2-9-HS-15 na região de grampo 2; e o segundo ao último, o terceiro ao último e o quarto ao último nucleotídeo na região de terminal 3'.
[00164] Em algumas modalidades, é fornecido um RNA guia único (sgRNA) que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1- 10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13, H2-15 e o último e terceiro a ultimo nucleotídeos a terminal 3'; e modificações com 2'-F em LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2- 12, H2-14, e o segundo ao último e quarto ao último nucleotídeo no terminal 3'.
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| [00165] [00166] | Cada uma das seguintes modalidades são abrangidas: Modalidade 01. Um RNA guia único (sgRNA) que compre- |
ende uma ou mais modificações em uma ou mais das seguintes regi-
| ões: | a. o terminal 5'; b. a região de haste inferior; c. a região de protuberância; d. a região da haste superior; e. a região de nexo; f. a região de grampo 1; g. a região de grampo 2; e h. o terminal 3'. |
| [00167] | Modalidade 02. O sgRNA da modalidade 1, em que a modi- |
ficação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-
| Me). [00168] | Modalidade 03. O sgRNA da modalidade 1, em que a modi- |
ficação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F).
| [00169] | Modalidade 04. O sgRNA da modalidade 1, em que a modi- |
ficação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
| [00170] | Modalidade 05. O sgRNA de qualquer uma das modalida- |
des 1-3, em que os primeiros três ou quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três ou quatro nucleotídeos no terminal 3' são modificados.
| [00171] | Modalidade 06. O sgRNA de qualquer uma das modalida- |
des 1-5, em que os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com ligações de fosforotioato (PS).
| [00172] | Modalidade 07. O sgRNA da modalidade 5, em que a modi- |
ficação compreende 2'-O-Me.
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101/177 [00173] Modalidade 08. O sgRNA da modalidade 5, em que a modificação compreende 2'-F.
[00174] Modalidade 09. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-7, em que os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me.
[00175] Modalidade 10. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-8, em que os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com uma ligação de PS e em que os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-F.
[00176] Modalidade 11.0 sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-10, em que LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12 são modificados com 2'-O-Me.
[00177] Modalidade 12. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-11, em que cada um dos nucleotídeos na região de protuberância é modificado com 2'-O-Me.
[00178] Modalidade 13. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-12, em que cada um dos nucleotídeos na região de haste superior é modificado com 2'-O-Me.
[00179] Modalidade 14. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-13, em que N16, N17 e N18 na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
[00180] Modalidade 15. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-14, em que cada um dos nucleotídeos na região de grampo 1 é modificado com 2'-O-Me.
[00181] Modalidade 16. O sgRNA de qualquer uma das modalida
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102/177 des 1-15, em que cada um dos nucleotídeos na região de grampo 2 é modificado com 2'-O-Me.
[00182] Modalidade 17. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me nos seguintes nucleotídeos:
a. os primeiros três nucleotídeos no terminal 5';
b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12 na região de haste inferior;
c. B1 e B2 na região de protuberância;
d. cada nucleotídeo na região de haste superior;
e. N16, N17 e N18 na região de nexo;
f. cada nucleotídeo na região de grampo 1;
g. cada nucleotídeo na região de grampo 2; e
h. os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00183] Modalidade 18. O sgRNA da modalidade 17, em que B3-B6 são modificados com 2'-O-Me.
[00184] Modalidade 19. O sgRNA da modalidade 17, que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00185] Modalidade 20. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-10, em que LS9 e LS10 são modificados com 2'-F.
[00186] Modalidade 21. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-10 e 20, em que N15, N16, N17 e N18 são modificados com 2'F.
[00187] Modalidade 22. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-10 e 20-21, em que H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15 são modificados com 2'-F.
[00188] Modalidade 23. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 1-10 e 21-22, em que o segundo ao último, o terceiro ao último e o
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103/177 quarto ao último nucleotídeos no terminal 3' são modificados com 2'-F. [00189] Modalidade 24. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F nas seguintes posições:
a. LS9 e LS10 na região de haste inferior;
b. N15, N16, N17 e N18 na região de nexo; e
c. H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15 na região de grampo 2.
[00190] Modalidade 25. O sgRNA da modalidade 24, que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo a último, terceiro a último e quarto a últimos nucleotídeos no terminal 3'.
[00191] Modalidade 26. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 24 ou 25, que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00192] Modalidade 27. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 24-26, que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos três dos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00193] Modalidade 28. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e LS6;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
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f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00194] Modalidade 29. O sgRNA da modalidade 28 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00195] Modalidade 30. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1-LS6;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00196] Modalidade 31. O sgRNA da modalidade 30 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00197] Modalidade 32. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS2-LS5;
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c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e LS6;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00198] Modalidade 33. O sgRNA da modalidade 32 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00199] Modalidade 34. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00200] Modalidade 35. O sgRNA da modalidade 34 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando
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106/177 os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00201] Modalidade 36. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS9 e LS10;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00202] Modalidade 37. O sgRNA da modalidade 36 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00203] Modalidade 38. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. 2'- nucleotídeos modificados por Ο-Me em LS8, LS10 e LS12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-F em LS7, LS9 e LS11;
e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
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f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00204] Modalidade 39. O sgRNA da modalidade 32 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00205] Modalidade 40. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00206] Modalidade 41. O sgRNA da modalidade 40 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos ao terminal 3' [00207] Modalidade 42. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
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a. nucleotideos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotideos no terminal 5';
b. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12;
c. nucleotideos modificados com 2'-F em LS9 e LS10;
d. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
e. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
g. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; e
h. nucleotideos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotideos no terminal 3'.
[00208] Modalidade 43. O sgRNA da modalidade 43 adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotideos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotideos no terminal 3'.
[00209] Modalidade 44. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotideos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotideos no terminal 5';
b. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;
d. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;
e. nucleotideos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-8;
f. nucleotideos modificados com 2'-F em H2-9 - H2-15;
g. nucleotideos modificados com 2'-F no segundo do último, terceiro do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; e
h. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no último nucle
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109/177 otídeo no terminal 3'.
[00210] Modalidade 45. O sgRNA da modalidade 44 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00211] Modalidade 46. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos no terminal 5';
b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;
c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 e H1-12;
d. nucleotídeos modificados com 2'-F em H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9e H1-11;
e. um nucleotídeo modificado 2'-F entre Grampo 1 e Grampo 2;
f. nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; e H2-14;
g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 e H2-15;
h. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; e
i. Nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no terceiro e último nucleotídeo no terminal 3'.
[00212] Modalidade 47. O sgRNA da modalidade 46 que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos ao terminal 3'.
[00213] Modalidade 48. Um RNA guia único (sgRNA) que compreende
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a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 e H2-15; e
b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2- 12 e H2-14.
[00214] Modalidade 49. O sgRNA da modalidade 48, que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00215] Modalidade 50. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 48-49, que adicionalmente compreende
a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me no último e terceiro ao último nucleotídeo no terminal 3'; e
b. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo para o último e terceiro para o último nucleotídeo no terminal 3'.
[00216] Modalidade 51. Um sgRNA que compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 228-332.
[00217] Modalidade 52. Um sgRNA que compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309329.
[00218] Modalidade 53. Um sgRNA que compreende ácidos nucleicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que o padrão de modificação é idêntico ao o padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência.
[00219] Modalidade 54. O sgRNA de qualquer uma das modalidades 51-53, que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três
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111/177 ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
B. Composições de dgRNAs [00220] Em algumas modalidades, as composições e métodos da invenção compreendem gRNA que compreende um crRNA e trRNA que direcionam uma nuclease, como Cas9 para uma sequência de DNA alvo. Em algumas modalidades, os gRNAs estão associados, mas em duas moléculas de RNA separadas (RNA guia dual ou dgRNA).
[00221] Tabela 2 e FIG. 21C proporciona uma descrição de domínios de um RNAp tal como aqui utilizado. A região de terminal 5' pode compreender uma região espaçadora no ou perto do terminal 5' do crRNA e funciona para direcionar uma Cas9 a uma região-alvo no DNA, por exemplo, como aqui descrito. Na Tabela 2, o n entre regiões representa um número variável de nucleotídeos, por exemplo, de 0 a 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais. Em algumas modalidades, n é igual a 0. Qualquer um dos dgRNAs aqui descritos pode incluir um n entre qualquer domínio.
[00222] Tabela 3 e FIG. 21C fornecem uma descrição de domínios de um trRNA, tal como aqui utilizado. Na Tabela 3, o n entre regiões representa um número variável de nucleotídeos, por exemplo, de 0 a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais. Em algumas modalidades, n é igual a 0. Qualquer um dos dgRNAs aqui descritos pode incluir um n entre qualquer domínio.
1. Domínios de dgRNAs [00223] Como descrito em Briner 2014, os dgRNAs podem ser desenvolvidos com base em domínios funcionais específicos, aqui referidos como domínios, incluindo o espaçador responsável pelo direcionamento, domínios de haste inferior, a protuberância, a haste superior, o nexo e grampo. Em dgRNAs, o crRNA compreende alguns componentes do gRNA e o trRNA compreende alguns componentes do
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112/177 gRNA.
[00224] Regiões de crRNAs são fornecidas na Tabela 2 e FIG 21C. Regiões de trRNAs são fornecidas na Tabela 3 e na FIG. 21C. A FIG 21C mostra um esquema de urn dgRNA exemplar.
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Tabela 2: Regiões de crRNA (vista linear, 5' para 3')
| LS1-6 | B1-2 | US1-14 | ||||
| terminal 5' (n) | haste inferior | n | protuberância | n | haste superior | terminal 3' |
Tabela 3: Regiões de trRNA (vista linear, 5' para 3')
| US1-11 | B1-4 | N1-18 | H1-1 através H1-12 | H2-1 através H2-15 | ||||||
| terminal 5' (n) | haste superior | n | protuberância | n | nexo | n | grampo 1 | n | grampo 2 | terminal 3' |
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a) Região de terminal 5' [00225] Em algumas modalidades, o dgRNA compreende nucleotídeos no terminal 5' do crRNA e trRNA como mostrado nas Tabelas 2-3 e FIG 21C.
[00226] Em algumas modalidades, o terminal 5' do crRNA compreende uma região espaçadora ou guia que funciona para direcionar uma proteína Cas para uma sequência de nucleotídeos alvo. Em algumas modalidades, o terminal 5' não compreende uma região espaçadora ou guia. Em algumas modalidades, o terminal 5' compreende um espaçador e nucleotídeos adicionais que não funcionam para direcionar uma proteína Cas para uma região nucleotídica alvo.
[00227] Em algumas modalidades, a região-guia compreende os primeiros 1-10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleotídeos na extremidade 5' do crRNA. Em algumas modalidades, a região-guia compreende 20 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 5, 6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 17 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 18 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia pode compreender 19 nucleotídeos.
[00228] Em algumas modalidades, a seleção da região-guia é determinada com base em sequências alvo dentro do gene de interesse para edição. Por exemplo, em algumas modalidades, o crRNA compreende uma região-guia que é complementar às sequências alvo de um gene de interesse.
[00229] Em algumas modalidades, a sequência-alvo no gene de interesse pode ser complementar à região-guia do crRNA. Em algumas modalidades, o grau de complementaridade ou identidade entre uma região-guia de um RNAr e a sua sequência-alvo correspondente
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115/177 no gene de interesse pode ser cerca de 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% em algumas modalidades, a região-guia de um crRNA e a região-alvo de um gene de interesse podem ser 100% complementares ou idênticas. Em outras modalidades, a região-guia de um RNAr e a região-alvo de um gene de interesse podem conter pelo menos um erro de emparelhamento. Por exemplo, a região-guia de um crRNA e a sequência-alvo de um gene de interesse podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 incompatibilidades, em que o comprimento total da sequência-alvo é pelo menos cerca de 17, 18, 19, 20 ou mais pares de bases. Em algumas modalidades, a região-guia de um crRNA e a região-alvo de um gene de interesse podem conter 1-6 incompatibilidades em que a sequência guia compreende pelo menos cerca de 17, 18, 19, 20 ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região-guia de um crRNA e a região-alvo de um gene O interesse pode conter 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 incompatibilidades em que a sequência guia compreende cerca de 20 nucleotídeos.
[00230] Em algumas modalidades, o trRNA compreende um terminal 5'. Em algumas modalidades, o trRNA compreende um terminal 5' que forma, em parte, a haste superior de um dgRNA. O terminal 5' do trRNA não é complementar a uma região do gene-alvo.
b) Haste inferior [00231] Em algumas modalidades, o dgRNA compreende uma região de haste inferior (LS). A região de haste inferior compreende uma região de haste inferior de crRNA e uma região de haste inferior de trRNA que se associa como representado na FIG. 21C. Em algumas modalidades, a região de haste inferior do crRNA é pelo menos parcialmente complementar à região da haste inferior do trRNA. Em algumas modalidades, a região de haste inferior do crRNA é totalmente complementar à região de haste inferior do trRNA.
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116/177 [00232] Em algumas modalidades, a região de haste inferior do crRNA e trRNA cada um compreende 6 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de haste inferior do crNN e trRNA compreende cada um compreendendo menos nucleotídeos do que os mostrados nas Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C. Em algumas modalidades, a região de haste inferior compreende mais nucleotídeos do que os mostrados nas Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C. Quando a região de haste inferior compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema das Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C, os padrões de modificação, como será evidente para o versado na técnica, são mantidos. Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos na haste inferior do crRNA difere do número de nucleotídeos na haste inferior do trRNA.
c) Protuberância [00233] Em algumas modalidades, o dgRNA compreende uma região de protuberância (B). Em algumas modalidades, o crRNA compreende uma região de protuberância e o trRNA compreende uma região de protuberância. Em algumas modalidades, cada região de protuberância compreende 1-4 nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de protuberância do crRNA compreende dois nucleotídeos, e a região de protuberância do trRNA compreende quatro nucleotídeos.
[00234] Em algumas modalidades, a região de protuberância crRNA está localizada entre a região de haste inferior e a região de haste superior do crRNA. Em algumas modalidades, a região de protuberância do crRNA compreende dois nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de protuberância do crRNA compreende os nucleotídeos B1 e B2, como mostrado na Tabela 2 e FIG. 21C.
[00235] Em algumas modalidades, a região de protuberância trRNA está localizada entre a região de haste superior e a região de haste inferior do trRNA. Em algumas modalidades, a região de protuberância do trRNA compreende quatro nucleotídeos. Em algumas modalidades,
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117/177 a região de protuberância do trRNA compreende os nucleotídeos B1 a B4, como mostrado na Tabela 3 e FIG. 21C.
[00236] Em algumas modalidades, a presença de uma protuberância resulta em uma dobra direcional entre os módulos de hastes superior e inferior em um dgRNA. A protuberância de crRNA e a protuberância de trRNA podem ser parcialmente complementares. A protuberância de crRNA e a protuberância de trRNA podem não ter complementaridade.
[00237] Em algumas modalidades, as regiões de protuberância do crRNA e trRNA compreendem mais nucleotídeos do que os mostrados nas Tabelas 2 e 3 e FIG. 21C. Quando a região de protuberância compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema das Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C, os padrões de modificação, como será evidente para o versado na técnica, são mantidos. Em algumas modalidades, o número de nucleotídeos na protuberância do crRNA difere do número de nucleotídeos na protuberância do trRNA.
d) Haste superior [00238] Em algumas modalidades, o dgRNA compreende uma região de haste superior (US). A região de haste superior compreende uma região de haste superior de crRNA e uma região de haste superior de trRNA que se associa como representado na FIG. 21C. Em algumas modalidades, a região de haste superior do crRNA é pelo menos parcialmente complementar à região de haste superior do trRNA. Em algumas modalidades, a região de haste superior do crRNA é totalmente complementar à região de haste superior do trRNA.
[00239] Em algumas modalidades, a região de haste superior do crRNA compreende quatorze nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de haste superior do trRNA compreende onze nucleotídeos. Em algumas modalidades, as regiões de haste superior do RNAr e RNAt compreendem cada uma menos nucleotídeos do que os mostra
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118/177 dos nas Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C. Em algumas modalidades, as regiões de haste superior do crRNA e trRNA compreendem mais nucleotídeos do que os mostrados nas Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C. Quando a região de haste superior compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados no esquema das Tabelas 2 e 3 e a FIG. 21C, os padrões de modificação, como será evidente para o versado na técnica, são mantidos.
[00240] Em algumas modalidades, a haste superior do crRNA compreende nucleotídeos US1 a US14, como mostrado na Tabela 2 e FIG. 21C.
[00241] Em algumas modalidades, a haste superior do trRNA compreende nucleotídeos US1 a US11 como mostrado na Tabela 3 e FIG. 21C.
e) Nexo [00242] Em algumas modalidades, o dgRNA compreende um trRNA que compreende uma região de nexo. Em algumas modalidades, o nexo está entre a região de haste inferior e a região em grampo 1 do trRNA. Em algumas modalidades, o nexo está localizado imediatamente a jusante da haste inferior do trRNA. Em algumas modalidades, o nexo compreende dezoito nucleotídeos. Em algumas modalidades, a região de nexo do trRNA compreende os nucleotídeos N1-N18, como mostrado na Tabela 3 e FIG. 21C. Em algumas modalidades, o nexo compreende menos nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 3 e FIG. 21C. Em algumas modalidades, a região de nexo do trRNA compreende mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 3 e a FIG. 21C. Quando a região de nexo compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 3 e a FIG. 21C, os padrões de modificação, como será evidente para o versado na técnica, são mantidos.
[00243] Em algumas modalidades, a região de nexo tem nucleotí
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119/177 deos que são complementares na sequência de ácido nucleico quando lida em direções opostas. Em algumas modalidades, a complementaridade na sequência de ácido nucleico conduz a uma estrutura secundária de uma cadeia haste e/ou laço de haste no sgRNA (por exemplo, certos nucleotídeos na região de nexo podem emparelhar a base uns com os outros). Em algumas modalidades, as regiões do nexo podem não ser perfeitamente complementares umas às outras quando lidas em direções opostas.
f) Grampo [00244] Em algumas modalidades, a região de grampo do trRNA é a jusante da região de nexo. Em algumas modalidades, a região de nucleotídeos imediatamente a jusante da região de nexo é denominada grampo 1. Em algumas modalidades, a região de nucleotídeos imediatamente a jusante da região do grampo 1 é denominada grampo 2. Em algumas modalidades a região de grampo compreende grampo 1 e grampo 2. Em alguns casos, grampo 1 e grampo 2 são separados por um ou mais nucleotídeos n. Em algumas modalidades, n = 1. Em algumas modalidades, o trRNA compreende apenas grampo 1 ou grampo 2.
[00245] A substituição da região de grampo 1 de um trRNA com 2 nucleotídeos foi mostrada para permitir a atividade de edição de uma Cas RNP (vide US20150376586, Fig. 16). Em algumas modalidades, o trRNA compreende a substituição de grampo 1 por nucleotídeos n, em que n é um número inteiro entre 1 e 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 e 2. Em algumas modalidades, a região de grampo 1 de um trRNA é substituída por 2 nucleotídeos.
[00246] Em algumas modalidades, grampo 1 do trRNA compreende doze nucleotídeos imediatamente a jusante da região de nexo. Em algumas modalidades, a região de grampo 1 do trRNA compreende os nucleotídeos H1-1 a H1-12, como mostrado na Tabela 3 e na FIG.
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21C.
[00247] Em algumas modalidades, nucleotídeos sem grampo estão presentes entre as regiões de grampo 1 e de grampo 2 do trRNA. Em algumas modalidades, um a dois nucleotídeos sem grampo residem entre o grampo 1 e o grampo 2.
[00248] Em algumas modalidades, grampo 2 do trRNA compreende quinze nucleotídeos após (3' para) grampo 1. Em algumas modalidades, a região de grampo 2 do trRNA compreende nucleotídeos H2-1 a H2-15, como mostrado na Tabela 3 e FIG. 21C. Em algumas modalidades, a região de grampo 2 do trRNA compreende os nucleotídeos H2-1 a H2-15 como mostrado na Tabela 3, e o n entre o grampo 1 e o grampo 2 é 1 ou 2.
[00249] Em algumas modalidades, uma região de grampo do trRNA compreende mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 3 e FIG. 21C. Quando uma região em grampo compreende menos ou mais nucleotídeos do que os mostrados na Tabela 3 e a FIG. 21C, os padrões de modificação, como será evidente para o versado na técnica, são mantidos.
[00250] Em algumas modalidades, uma região de grampo tem nucleotídeos que são complementares na sequência de ácido nucleico quando lidos em direções opostas. Em algumas modalidades, as regiões em grampo podem não ser perfeitamente complementares umas às outras quando lidas em direções opostas (por exemplo, o topo ou laço do grampo compreende nucleotídeos não emparelhados).
[00251] Em algumas modalidades, o trRNA compreende a substituição de grampo 1 com nucleotídeos n, em que n é um inteiro entre 1 e 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 e 2 Em algumas modalidades, a região de grampo 1 de um trRNA é substituída por 2 nucleotídeos.
q) Terminal 3' [00252] Em algumas modalidades, o dgRNA compreende um trRNA
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121/177 que compreende uma região de terminal 3' que compreende nucleotídeos adicionais após (3' para) a região de grampo (s). Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 ou 20 ou mais nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo. Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 1,2, 3 ou 4 nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo. Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 4 nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo. Em algumas modalidades, a região de terminal 3' compreende 1, 2 ou 3 nucleotídeos que não estão associados à estrutura secundária de um grampo.
2. Modificações de dgRNAs [00253] Em algumas modalidades, um dgRNA compreende um crRNA modificado e um trRNA não modificado. Em algumas modalidades, um dgRNA compreende um crRNA não modificado e um trRNA modificado. Em algumas modalidades, tanto o crRNA como o trRNA de um dgRNA compreendem modificações.
[00254] Em algumas modalidades, os gRNAs descritos no presente são em duas moléculas de RNA separadas (guia duplo ou dgRNA). Vide, Tabelas 2, 3 e FIG. 21C.
[00255] Em algumas modalidades, a invenção compreende um dgRNA que compreende ou consiste em a) qualquer uma das sequências de crRNA de SEQ ID Nos: 1-187; e b) qualquer uma das sequências de trRNA descritas nas SEQ ID Nos: 188-227.
[00256] Em algumas modalidades, um dgRNA que compreende qualquer uma das sequências de crRNA modificado de 1-187 é fornecido.
[00257] Em algumas modalidades, um dgRNA que compreende qualquer uma das sequências de trRNA modificado de 188-227 é fornecido.
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122/177 [00258] Em algumas modalidades, um dgRNA que compreende qualquer uma das sequências de crRNA modificado de SEQ ID Nos: 19-31, 53-73, e 104-130 é fornecido. Em algumas modalidades, a invenção compreende um dgRNA que compreende qualquer uma das sequências modificadas de SEQ ID Nos: 19-31, 53-73 e 104-130, em que o crRNA adicionalmente compreende uma sequência espaçadora 5' que é pelo menos parcialmente complementar a uma sequênciaalvo, e direciona uma Cas9 a seu alvo para divagem.
[00259] Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA que compreende qualquer uma das sequências descritas em SEQ ID Nos: 1-187. Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA que compreende ou consiste em qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 19-31, 53-73 e 104-130. Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA que compreende qualquer uma das sequências descritas nas SEQ ID Nos: 19-31, 53-73 e 104-130 e uma região espaçadora.
[00260] Em algumas modalidades, a invenção compreende um trRNA que compreende ou consiste em qualquer uma das sequências descritas em SEQ ID Nos: 188-277.
[00261] Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA que compreende nucleotideos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75, ou 70% de identidade com os nucleotideos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-187, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência. Ou seja, os nucleotideos A, U, C e G podem diferir em 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75 ou 70% em comparação com o que é mostrado nas sequências, mas a modificação permanece inalterada.
[00262] Em algumas modalidades, a invenção compreende um trRNA que compreende nucleotideos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96,
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95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75, ou 70% de identidade com os nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-277, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência. Ou seja, os nucleotídeos A, U, C e G podem diferir em 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% em comparação com o que é mostrado nas sequências, mas a modificação em cada nucleotideo permanece inalterada.
3. crRNAs, trRNAs e dgRNAs com modificações [00263] Em algumas modalidades, o crRNA compreende um ou mais nucleotídeos modificados dentro de um ou mais do terminal 5', haste inferior, protuberância, haste superior e terminal 3'.
[00264] Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-OMe.
[00265] Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-F. [00266] Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) ligando um ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação é de três ligações de PS ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00267] Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotideo abásico invertido.
[00268] Em algumas modalidades, um crRNA é fornecido que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em cada nucleotideo na haste superior. Em algumas modalidades, US-1 a US-14 do crRNA são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, LS1 e LS6 do crRNA são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, LS5 do crRNA é modificado com 2'-O-Me.
[00269] Em algumas modalidades, um crRNA que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em cada um dos nucleotídeos na haste superior, e LS1 e LS6 na haste inferior é fornecido. Em algumas
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124/177 modalidades, o crRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-O-moe na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'. [00270] Em algumas modalidades, um crRNA que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em cada um dos nucleotídeos na haste superior, LS1, LS5 e LS6 na haste inferior é fornecido. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-O-moe na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00271] Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1, LS2 e LS6 na haste inferior. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em cada um dos B1 e B2 na região de protuberância. Em algumas modalidades, a invenção compreende um crRNA que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1, LS2 e LS6 na haste inferior, e em cada um dos B1 e B2 na região de protuberância. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-O-moe na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00272] Em algumas modalidades, o crRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos nucleotídeos LS1 e LS6 na região de haste inferior; cada um dos ácidos nucleicos na região de protuberância; e cada um dos ácidos nucleicos na região de haste superior. Em algumas modalidades, o nucleotídeo LS5 do crRNA também é modificado com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, LS2, LS3 e LS4 do crRNA não são modificados. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-O-moe na região de terminal 5' e/ou 3', por exem
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125/177 pio, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00273] Em algumas modalidades, o crRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-Fluoro (2'-F) em LS1, LS2 e LS6 na região de haste inferior, e cada um dos nucleotídeos na região de protuberância. Em algumas modalidades, o crRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-Fluoro (2'-F) em LS1, LS2 e LS6 na região de haste inferior, e em B1 e B2 na região de protuberância. Em algumas modalidades, o crRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-Fluoro (2'F) em LS1-LS6 na região de haste inferior, e cada um dos nucleotídeos na região de protuberância. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-O-moe na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00274] Em algumas modalidades, a invenção compreende um trRNA que compreende um ou mais nucleotídeos modificados dentro de uma ou mais das seguintes regiões: o terminal 5', a região de haste superior; a região de protuberância; a região de haste inferior; a região de nexo; a região de grampo 1; a região interveniente entre as regiões de grampo 1 e de grampo 2; a região de grampo 2; e a região de terminal 3'.
[00275] Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-OMe.
[00276] Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-F. [00277] Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) ligando um ou mais nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação é de três ligações de PS ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00278] Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo abásico invertido.
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126/177 [00279] Em algumas modalidades, o trRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em cada ácido nucleico na haste superior; B1 e B2 na região de protuberância; LS1 e LS2 na região de haste inferior; N3, N4, N5, N15, N16, N17 e N18 na região de nexo; cada nucleotídeo na região de grampo 1; um nucleotídeo entre a região de grampo 1 e de grampo 2; e cada nucleotídeo na região de grampo 2. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-O-moe na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00280] Em algumas modalidades, o trRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em cada ácido nucleico na haste superior; cada nucleotídeo na região de protuberância; LS1, LS2, LS5 e LS6 na região de haste inferior; N3-N5, N10-N18 na região de nexo; cada nucleotídeo na região de grampo 1; um nucleotídeo entre a região de grampo 1 e de grampo 2; e cada nucleotídeo na região de grampo 2. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-Omoe na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00281] Em algumas modalidades, o trRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em N15 a N18 na região de nexo. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-F na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação de extremidade 5' e/ou 3'.
[00282] Em algumas modalidades, o trRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em LS4 e LS5 na região de haste inferior, e N13-N18 na região de nexo. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende um ou mais nucleotídeos modificados com 2'F na região de terminal 5' e/ou 3', por exemplo, em uma modificação
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127/177 de extremidade 5' e/ou 3'.
[00283] Em algumas modalidades, o trRNA compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1, LS3 e LS5 na haste inferior, e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS2, LS4 e LS6 no haste inferior.
[00284] Divulgado aqui, em algumas modalidades, é um crispr RNA (crRNA) que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões: os primeiros cinco nucleotídeos no terminal 5'; a região de haste inferior; a região de protuberância; a região da haste superior; e os últimos cinco nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos. Em algumas modalidades, os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' são ligados a ligações de fosforotioato (PS). Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-O-Me. Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-F. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com uma ligação de PS, e em que os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' compreende modificações de 2'-OMe. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com uma ligação de PS, e em que os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' compreende modificações de 2'-F. Em algumas modalidades, LS1 e LS6 são modi
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128/177 ficados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada um dos nucleotídeos na região de haste superior é modificado com 2'-O-Me.
[00285] Em algumas modalidades, a invenção compreende um crispr RNA (crRNA) que compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me nos seguintes nucleotídeos: LS1 e LS6 na região de haste inferior; e cada nucleotídeo na região de haste superior. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e os ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, LS1, LS2 e LS6 são modificados com 2'F. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo na região de protuberância é modificado com 2'-F.
[00286] Divulgado aqui, em algumas modalidades, é um crispr RNA (crRNA) que compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-F nos seguintes nucleotídeos: LS1, LS2 e LS6 na região de haste inferior; e cada nucleotídeo na região de protuberância. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e os ácidos nucleicos modificados com 2'-OMe ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'.
[00287] Em algumas modalidades, um crRNA que compreende os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-187 é fornecido. Em algumas modalidades, é proporcionado um crRNA que compreen
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129/177 de os ácidos nucléicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 19-31, 5373, 104-130 e 161-187. Em algumas modalidades, um crRNA que compreende ácidos nucléicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 19-31, 53-73, 104-130 e 161187, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência, fornecido. Em algumas modalidades, o crRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00288] Está também incluído um tracr RNA (trRNA) que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões: os primeiros cinco nucleotídeos no terminal 5'; a região da haste superior; a região de protuberância; a região de haste inferior; a região de nexo; a região de grampo 1; a região de grampo 2; e os últimos cinco nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-O-Me). Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F). Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com ligações de fosforotioato (PS). Em algumas modalidades, os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-O-Me. Em algumas modalidades, a modificação compreende 2'-F. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com uma ligação de PS, e em que os três
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130/177 primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' compreende modificações de 2'-O-Me. Em algumas modalidades, os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com uma ligação de PS, e em que os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' compreende modificações de 2'-F. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo na região de haste superior é modificado com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, B1 e B2 dentro da região de protuberância são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, N3, N4, N5, N15, N16, N17 e N18 na região de nexo são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo na região de grampo 1 é modificado com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, cada nucleotídeo na região de grampo 2 é modificado com 2'-O-Me.
[00289] Em algumas modalidades, a invenção compreende um tracr RNA (trRNA) que compreende ácidos nucléicos modificados com 2'-OMe nos seguintes nucleotídeos: cada nucleotídeo na haste superior; B1 e B2 dentro da região de protuberância; N3, N4, N5, N15, N16, N17 e N18 na região de nexo; cada nucleotídeo na região de grampo 1; e cada nucleotídeo na região de grampo 2. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e ácidos nucléicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F no último três nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, N15, N16, N17 e N18 são modificados com 2'-F. Em algumas modalidades, LS1, LS3 e LS5 são modificados com 2'-F, e LS2, LS4 e LS6 são modificados com 2'-O-Me. Em algumas modalidades, o trRNA adicional
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131/177 mente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende ácidos nucleicos modificados com 2'-0-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e ácidos nucleicos modificados com 2'-0-Me ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'.
[00290] Em algumas modalidades, um trRNA que compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-227 é fornecido. Em algumas modalidades, um trRNA que compreende ácidos nucleicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-227, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência, é fornecido. Em algumas modalidades, o trRNA adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00291] Em alguns casos, é fornecido um guia duplo que compreende um crRNA e um trRNA, em que o crRNA compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-187, e em que o trRNA compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-227.
[00292] Um guia duplo que compreende um crRNA divulgado aqui e um trRNA divulgado no presente é englobado, como se fosse um guia duplo que compreende um crRNA divulgado aqui e um trRNA não modificado. Em algumas modalidades, é fornecido um guia duplo que compreende um crRNA não modificado e um trRNA modificado aqui divulgado.
[00293] Em algumas modalidades, e as seguintes são englobadas:
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132/177 [00294] Modalidade 55. Um crispr RNA (crRNA) que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões:
a. os primeiros cinco nucleotídeos no terminal 5';
b. a região de haste inferior;
c. a região de protuberância;
d. a região da haste superior; e
e. os últimos cinco nucleotídeos no terminal 3'.
[00295] Modalidade 56. O crRNA da modalidade 55, em que a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-OMe).
[00296] Modalidade 57. O crRNA da modalidade 55, em que a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F).
[00297] Modalidade 58. O RNAt da modalidade 55, em que a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
[00298] Modalidade 59. O RNAr de qualquer das modalidades 5558, em que os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' são modificados.
[00299] Modalidade 60. O gRNA de qualquer uma das modalidades 55-58, em que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' são ligados a ligações de fosforotioato (PS).
[00300] Modalidade 61. O gRNA da modalidade 59, em que a modificação compreende 2'-O-Me.
[00301] Modalidade 62. O gRNA da modalidade 59, em que a modificação compreende 2'-F.
[00302] Modalidade 63. O gRNA de qualquer uma das modalidades 55-62, em que os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' são ligados com uma li
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133/177 gação de PS e em que os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me.
[00303] Modalidade 64. O gRNA de qualquer uma das modalidades 55-62, em que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' são ligados com uma ligação de PS e em que os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-F.
[00304] Modalidade 65. O crRNA de qualquer uma das modalidades 55-60, em que LS1 e LS6 são modificados com 2'-O-Me.
[00305] Modalidade 66. O RNAr de qualquer uma das modalidades 55-60 e 65, em que cada um dos nucleotídeos na região de haste superior é modificado com 2'-O-Me. Modalidade 67. Um CRISPR RNA (crRNA) que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em:
a. LS1 e LS6 na região de haste inferior; e
b. cada nucleotídeo na região de haste superior.
[00306] Modalidade 68. O RNAr da modalidade 67, que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00307] Modalidade 69. O gRNA da modalidade 67 ou 68, que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'.
[00308] Modalidade 70. O RNAr de qualquer das modalidades 5560, em que LS1, LS2 e LS6 são modificados com 2'-F.
[00309] Modalidade 71. O RNAr de qualquer das modalidades 5560 e 70, em que cada nucleotídeo na região de protuberância é modi
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134/177 ficado com 2'-F.
[00310] Modalidade 72. Um crispr RNA (crRNA) que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em:
a. LS1, LS2 e LS6 na região de haste inferior; e
b. cada nucleotídeo na região de protuberância.
[00311] Modalidade 73. O RNAt de qualquer das modalidades 7072, que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00312] Modalidade 74. O gRNA da modalidade 72 ou 73, que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'.
[00313] Modalidade 75. Um crRNA que compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1 - 187.
[00314] Modalidade 76. Um crRNA que compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 19-31, 53-73, 104-130 e 161-187.
[00315] Modalidade 77. Um crRNA que compreende ácidos nucleicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91,90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ. ID Nos: 19-31, 53-73, 104-130 e 161-187, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência.
[00316] Modalidade 78. O gRNA de qualquer uma das modalidades 75-77, que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos ao terminal 3'.
[00317] Modalidade 79. Um tracr RNA (trRNA) que compreende
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135/177 uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões:
a. os primeiros cinco nucleotídeos no terminal 5';
b. a região da haste superior;
c. a região de protuberância;
d. a região de haste inferior;
e. a região de nexo;
f. a região de grampo 1;
g. a região de grampo 2; e
h. os últimos cinco nucleotídeos no terminal 3'.
[00318] Modalidade 80. O trRNA da modalidade 79, em que a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-OMe).
[00319] Modalidade 81. O trRNA da modalidade 79, em que a modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F).
[00320] Modalidade 82. O trRNA da modalidade 79, em que a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
[00321] Modalidade 83. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-82, em que os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' estão ligados com ligações de fosforotioato (PS).
[00322] Modalidade 84. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-82, em que os três primeiros nucleotídeos no terminal 5' e os três últimos nucleotídeos no terminal 3' são modificados.
[00323] Modalidade 85. O trRNA da modalidade 84, em que a modificação compreende 2'-O-Me.
[00324] Modalidade 86. O trRNA da modalidade 84, em que a modificação compreende 2'-F.
[00325] Modalidade 87. O trRNA de qualquer uma das modalidades
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79-86, em que os primeiros quatro nucleotideos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' estão ligados com uma ligação de PS e em que os três primeiros nucleotideos no terminal 5' e os últimos três nucleotideos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me.
[00326] Modalidade 88. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-86, em que os primeiros quatro nucleotideos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' são ligados com uma ligação de PS e em que os primeiros três nucleotideos no terminal 5' e os últimos três nucleotideos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-F.
[00327] Modalidade 89. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-84, em que cada nucleotídeo na região de haste superior é modificado com 2'-O-Me.
[00328] Modalidade 90. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-84 e 89, em que B1 e B2 dentro da região de protuberância são modificados com 2'-O-Me.
[00329] Modalidade 91. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-84 e 89-90, em que N3, N4, N5, N15, N16, N17 e N18 na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
[00330] Modalidade 92. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-84 e 89-91, em que cada nucleotídeo na região de grampo 1 T^modificado com 2'-O-Me.
[00331] Modalidade 93. O trRNA de qualquer uma das modalidades 79-84 e 89-92, em que cada nucleotídeo na região de grampo 2 é modificado com 2'-O-Me.
[00332] Modalidade 94. Um tracr RNA (trRNA) compreendendo nucleotideos modificados com 2'-O-Me em:
a. cada nucleotídeo na haste superior;
b. B1 e B2 dentro da região de protuberância;
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c. N3, N4, N5, N15, N16, N17 e N18 na região de nexo;
d. cada nucleotídeo na região de grampo 1; e
e. cada nucleotídeo na região de grampo 2.
[00333] Modalidade 95. O trRNA da modalidade 94, que compreende adicionalmente três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00334] Modalidade 96. O gRNA da modalidade 94 ou 95, que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e ácidos nucleicos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'.
[00335] Modalidade 97. O trRNA de qualquer das modalidades 7984, em que N15, N16, N17 e N18 são modificados com 2'-F.
[00336] Modalidade 98. O trRNA de qualquer das modalidades 7984 e 97, em que LS1, LS3 e LS5 são modificados com 2'-F e LS2, LS4 e LS6 são modificados com 2'-O-Me.
[00337] Modalidade 99. O trRNA de qualquer uma das modalidades 87-98, que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00338] Modalidade 100. O trRNA da modalidade 98 ou 99, que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos no terminal 5', e nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos últimos três nucleotídeos no terminal 3'.
[00339] Modalidade 101. Um trRNA que compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-227.
[00340] Modalidade 102. Um trRNA que compreende ácidos nucleicos possuindo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85,
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80, 75 ou 70% de identidade com os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ. ID Nos: 188-227, em que o padrão de modificação é idêntico ao padrão de modificação mostrado no identificador de sequência de referência.
[00341] Modalidade 103. O trRNA de qualquer uma das modalidades 101- 102, que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
[00342] Modalidade 104. Guia duplo que compreende um crRNA e um trRNA, em que o crRNA compreende os nucleotídeos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-187, e em que o trRNA compreende os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-227.
[00343] Modalidade 105. Guia duplo que compreende um crRNA de qualquer uma das modalidades 55-78 e um trRNA de qualquer uma das modalidades 79-103.
[00344] Modalidade 106. Guia duplo que compreende um crRNA de qualquer uma das modalidades 55-78 e um trRNA não modificado.
[00345] Modalidade 107. Uma guia dual que compreende um crNN n modificado e um trRNA de qualquer uma das modalidades 79-103.
C. Modificações nos nucleotídeos terminais [00346] Em algumas modalidades, os nucleotídeos terminais 5' ou 3' de qualquer um dos RNAs guia descritos no presente são modificados. Em algumas modalidades, os 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos terminais (ou seja, últimos) na região de terminal 3' do RNA guia, incluindo, por exemplo, o sgRNA, o dgRNA, o crRNA, trRNA, ou ambos crRNA e trRNA são modificados. Em algumas modalidades, os 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos terminais (ou seja, últimos) na região de terminal 3' do RNA guia compreendem mais do que uma modificação. Em algumas modalidades, pelo menos um dos 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nuPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 151/390
139/177 cleotídeos terminais (ou seja, últimos) na região de terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, pelo menos dois dos 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos terminais (ou seja, últimos) na região de terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, pelo menos três dos nucleotídeos terminais (isto é, último) 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 na região de terminal 3' são modificados. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de PS.
[00347] Em algumas modalidades, a extremidade 5' da região de terminal 5' é modificada, por exemplo, os primeiros 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos do sgRNA, o dgRNA, crRNA, trRNA, ou ambos crRNA e trRNA são modificados. Em algumas modalidades, os primeiros 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos na região de terminal 3' do RNA guia compreendem mais do que uma modificação. Em algumas modalidades pelo menos um dos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos terminais (isto é, primeiros) na extremidade 5' são modificados. Em algumas modalidades, pelo menos dois dos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos terminais na extremidade 5' são modificados. Em algumas modalidades, pelo menos três dos 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 nucleotídeos terminais na extremidade 5' são modificados. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de PS.
[00348] Em algumas modalidades, ambos os terminais 5' e 3' (por exemplo, extremidades) do RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, ou ambos, crRNA e trRNA são modificados. Em algumas modalidades, apenas o terminal 5' do RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA ou ambos, crRNA e trRNA, é modificado. Em algumas modalidades, apenas o terminal 3' do RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA ou ambos, crRNA e trRNA, é modificado.
[00349] Em algumas modalidades, o gRNA compreende modificações em 1,2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos primeiros 7 nucleotídeos em uma ex
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140/177 tremidade 5' do gRNA. Em algumas modalidades, o gRNA compreende modificações em 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos 7 nucleotídeos terminais em uma extremidade 3'. Em algumas modalidades, 2, 3 ou 4 dos primeiros 4 nucleotídeos na extremidade 5' e/ou 2, 3 ou 4 dos nucleotídeos 4 terminais na extremidade 3' são modificados. Em algumas modalidades, 2, 3 ou 4 dos primeiros 4 nucleotídeos na extremidade 5' estão ligados com ligações de fosforotioato (PS).
[00350] Em algumas modalidades, a modificação do terminal 5' e/ou terminal 3' compreende uma modificação de 2'-O-metil (2'-O-Me) ou 2'O-(2-metoxietil) (2'-O-moe) de um nucleotídeo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma modificação de 2'-fluoro (2'-F) para um nucleotídeo. Em algumas modalidades, a modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos. Em algumas modalidades, a modificação compreende um nucleotídeo abásico invertido. Em algumas modalidades, a modificação compreende mais de uma modificação selecionada de 2'-O-Me, 2'-O-moe, 2'-fluoro (2'-F), uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos, e um nucleotídeo abásico invertido. Em algumas modalidades, uma modificação equivalente é englobada.
[00351] Em algumas modalidades, o RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, ou ambos crRNA e trRNA compreende um ou mais ligações de fosforotioato (PS) entre o primeiro um, dois, três, quatro, cinco, seis, ou sete nucleotídeos no terminal 5'. Em algumas modalidades, o RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA ou ambos, crRNA e trRNA, compreende uma ou mais ligações de PS entre os últimos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete nucleotídeos no terminal 3'. Em algumas modalidades, o RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, ou ambos, crRNA e trRNA, compreende uma ou mais ligações de PS entre os últimos um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete nucleotídeos em ambos os terminal 5' e o
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141/177 terminal 3'. Em algumas modalidades, para além das ligações de PS, os nucleotídeos terminais 5' e 3' podem compreender nucleotídeos modificados com 2'-O-Me, 2'-O-moe ou 2'-F.
[00352] Em algumas modalidades, o RNA guia, por exemplo, sgRNA, dgRNA, crRNA, trRNA, ou ambos, crRNA e trRNA, compreende nucleotídeos modificados nos terminais 5' e 3' e nucleotídeos modificados em uma ou mais outras regiões descritas nas Tabelas. 1-3 e FIG 21Aou 21C.
[00353] Em algumas modalidades, o crRNA, trRNA, ou ambos crRNA e trRNA compreende nucleotídeos modificados que não estão nas extremidades 5' ou 3'. Padrões específicos de modificações são descritos abaixo e na Tabela 4.
3. Entrega de gRNAs e Proteína Cas [00354] Em algumas modalidades, além de pelo menos um gRNA, as composições aqui fornecidas compreendem ainda uma nuclease. Em algumas modalidades, a nuclease é uma proteína Cas. Em algumas modalidades, o gRNA juntamente com uma proteína Cas é chamado de Cas RNP. Em algumas modalidades, a proteína Cas é do sistema CRISPR/Cas Tipo II. Em algumas modalidades, a proteína Cas é Cas9. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é uma Cas9 do tipo selvagem. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 é derivada da proteína Cas9 de Streptococcus pyogenes, por exemplo, uma Cas9 de S. pyogenes. Em algumas modalidades, a proteína Cas9 não é derivada de S. pyogenes, mas funciona da mesma maneira que Cas9 de S. pyogenes, de tal forma que o gRNA que é específico de Cas9 de S. pyogenes direcionará o Cas9 sem S. pyogenes para o seu sítio alvo. Em algumas modalidades, o Cas induz uma quebra de duplo filamento no DNA alvo. Os equivalentes da proteína Cas9 de S. pyogenes estão englobados pelas modalidades aqui descritas.
[00355] Cas9 engloba modificado e variantes do mesmo. Versões
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142/177 modificadas de Cas9 tendo um domínio catalítico, ou RuvC ou HNH, que é inativo são denominadas nickases. As nickases cortam apenas uma cadeia no DNA alvo, criando assim uma quebra de filamento simples. Uma ruptura de cadeia simples pode também ser conhecida como um nick. Em algumas modalidades, as composições e métodos compreendem nickases. Em algumas modalidades, as composições e métodos compreendem uma nickase Cas9 que induz um nick em vez de uma quebra de duplo filamento no DNA alvo.
[00356] Em algumas modalidades, a proteína Cas pode ser modificada para conter apenas um domínio de nuclease funcional. Por exemplo, a proteína Cas pode ser modificada de tal modo que um dos domínios nuclease seja mutado ou totalmente ou parcialmente deletado para reduzir a sua atividade de divagem de ácido nucléico. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é utilizada com um domínio RuvC com atividade reduzida. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é utilizada com um domínio RuvC inativo. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada com um domínio HNH com atividade reduzida. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada com um domínio HNH inativo.
[00357] Em algumas modalidades, um aminoácido conservado dentro de um domínio de nuclease de proteína Cas é substituído para reduzir ou alterar a atividade da nuclease. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode compreender uma substituição de aminoácido no domínio de nuclease semelhante a RuvC ou RuvC. Exemplos de substituições de aminoácidos no domínio de nuclease tipo RuvC ou RuvC incluem D10A (com base na proteína Cas9 de S. pyogenes). Em algumas modalidades, a proteína Cas pode compreender uma substituição de aminoácido no domínio de nuclease de tipo HNH ou do tipo HNH. Exemplos de substituições de aminoácidos no domínio da nuclease de HNH ou do tipo HNH incluem E762A, H840A, N863A,
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H983A e D986A (com base na proteína Cas9 de S. pyogenes).
[00358] Em algumas modalidades, o complexo RNP descrito no presente documento compreende uma nickase e um par de RNAs guia que são complementares aos filamentos de senso e antissenso da sequência-alvo, respectivamente. Nesta modalidade, os RNA guia dirigem a nickase para uma sequência-alvo e introduzem uma quebra de duplo filamento (DSB), gerando um corte nos filamentos opostos da sequência-alvo (isto é duplo nick). Em algumas modalidades, o uso de duplo nick pode melhorar a especificidade e reduzir os efeitos fora do alvo. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada em conjunto com dois RNAs guia separados direcionados a filamentos opostos de DNA para produzir um duplo nick no DNA alvo. Em algumas modalidades, uma nickase Cas é usada em conjunto com dois RNAs guia separados que são selecionados para estarem próximos para produzir um duplo nick no DNA alvo.
[00359] Em algumas modalidades, são utilizadas proteínas Cas quiméricas, em que um domínio ou região da proteína é substituído por uma porção de uma proteína diferente. Em algumas modalidades, um domínio de nuclease Cas pode ser substituído por um domínio de uma nuclease diferente, tal como Fok1. Em algumas modalidades, uma proteína Cas pode ser uma nuclease modificada.
[00360] Em algumas modalidades, a proteína Cas compreende uma proteína de fusão que compreende uma Cas9 cataiiticamente inativa ligada a um domínio funcional heterólogo (vide, por exemplo, WO2014152432). Em algumas modalidades, a Cas9 inativa cataliticamente é de S. pyogenes. Em algumas modalidades, a Cas9 inativa cataliticamente compreende mutações que inativam a Cas9. Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo é um domínio que modifica a expressão gênica, histonas ou DNA. Em algumas modalidades, o domínio funcional heterólogo é um domínio de ativação
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144/177 transcricional ou um domínio repressor transcricional.
A. PAM [00361] Em algumas modalidades, a sequência-alvo pode ser adjacente ao PAM. Em algumas modalidades, o PAM pode ser adjacente a, ou dentro de 1, 2, 3 ou 4, nucleotídeos da extremidade 3' da sequência-alvo. O comprimento e a sequência do PAM podem depender da proteína Cas utilizada. Por exemplo, o PAM pode ser selecionado a partir de um consenso ou uma sequência PAM particular para uma proteína Cas9 específica ou ortólogo de Cas9, incluindo os divulgados na Figura 1 de Ran et al., Nature 520:186-191 (2015), que é incorporada aqui por referência. Em algumas modalidades, o PAM pode compreender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 nucleotídeos de comprimento. Exemplos de sequências PAM exemplificativas não limitativas incluem NGG, NAG, NGA, NGAG, NGCG, NNGRRT, TTN, NGGNG, NG, NAAAN, NNAAAAW, NNNNACA, GNNNCNNA e NNNNGATT (em que N definido como qualquer nucleotídeo e W definido como qualquer um dos nucleotídeos; A ou T e R é definido como A ou G). Em algumas modalidades, a sequência PAM pode ser NGG. Em algumas modalidades, a sequência PAM pode ser NGGNG. Em algumas modalidades, a sequência PAM pode ser NNAAAAW.
B. Entrega de gRNA modificado [00362] As nanopartículas lipídicas (LNPs) são um meio bem conhecido para entrega de cargas de nucleotídeos e proteínas, e podem ser usadas para entrega do gRNA, mRNA, Cas9 e RNPs divulgados aqui. Em algumas modalidades, as LNPs entregam ácido nucléico, proteína ou ácido nucléico juntamente com proteína.
[00363] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a entrega de qualquer um dos gRNAs divulgados aqui para um objeto, em que o gRNA está associado com uma LNP. Em algumas modalidades, gRNA/LNP também estão associados a uma Cas9
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145/177 ou a um mRNA codificador de Cas9.
[00364] Em algumas modalidades, a invenção compreende uma composição que compreende qualquer um dos gRNAs divulgados e uma LNP. Em algumas modalidades, a composição adicionalmente compreende uma Cas9 ou um mRNA codificando Cas9.
[00365] Em algumas modalidades, as LNPs compreendem lipídios catiônicos. Em algumas modalidades, as LNPs compreendem octadeca-9,12-dienoato de (9Z, 12Z)-3-((4,4-bis(octilóxi)butanoil)óxi)-2-((((3(dietilamino)propóxi)carbonil)óxi)metil)propila, também denominado (9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato de 3-((4,4-bis(octiIóxi)butanoiI)óxi)-2((((3-(dietilamino)propóxi)carbonil)óxi)metil)propila. Em algumas modalidades, as LNPs compreendem razões molares de uma amina lipídica catiônica para fosfato de RNA (N:P) de cerca de 4,5.
[00366] Em algumas modalidades, LNPs associadas com os gRNAs divulgados aqui são para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
[00367] Eletroporação é um meio bem conhecido para a entrega de carga, e qualquer metodologia de eletroporação pode ser usada para a entrega de qualquer um dos gRNAs aqui divulgados. Em algumas modalidades, a eletroporação pode ser utilizada para administrar qualquer um dos gRNAs aqui divulgados e Cas9 ou um mRNA codificando Cas9.
[00368] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para a entrega de qualquer um dos gRNAs divulgados aqui para uma célula ex vivo, em que o gRNA está associado com uma LNP ou não associado a uma LNP. Em algumas modalidades, gRNA/LNP ou gRNA também estão associados a uma Cas9 ou a um mRNA codificador de Cas9.
4. Métodos de Modulação Genética [00369] Em algumas modalidades, a invenção compreende uma
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146/177 formulação farmacêutica que compreende qualquer um dos gRNAs aqui divulgados em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a invenção compreende uma formulação farmacêutica que compreende qualquer um dos gRNAs aqui divulgados e uma LNP em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a invenção compreende uma formulação farmacêutica que compreende qualquer um dos gRNAs aqui divulgados, uma proteína Cas9 ou um mRNA que codifica uma proteína Cas9 e uma LNP em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a formulação farmacêutica é para uso na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método de tratamento de um paciente humano que compreende a administração de qualquer um dos gRNAs ou formulações farmacêuticas aqui descritas.
[00370] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método ou uso de modificar um DNA alvo que compreende administrar ou entregar uma proteína Cas ou Cas mRNA e qualquer um ou mais dos gRNAs divulgados no presente documento.
[00371] Em algumas modalidades, a invenção compreende um método ou uso para a modulação de um gene-alvo que compreende administrar ou entregar uma proteína Cas ou Cas mRNA e qualquer um ou mais dos gRNAs divulgados no presente documento. Em algumas modalidades, a modulação está editando o gene-alvo. Em algumas modalidades, a modulação é uma alteração na expressão da proteína codificada pelo gene-alvo.
[00372] Em algumas modalidades, o método ou uso resulta na edição genética. Em algumas modalidades, o método ou uso resulta em uma quebra de duplo filamento dentro do gene-alvo. Em algumas modalidades, o método ou uso resulta na formação de mutações de indel
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147/177 durante a junção de extremidade não homóloga do DSB. Em algumas modalidades, o método ou uso resulta em uma inserção ou deleção de nucleotideos em um gene-alvo. Em algumas modalidades, a inserção ou deleção de nucleotideos em um gene-alvo conduz a uma mutação de deslocamento de enquadramento ou códon de paragem prematura que resulta em uma proteína não funcional. Em algumas modalidades, a inserção ou deleção de nucleotideos em um gene-alvo conduz a uma neutralização ou eliminação da expressão do gene-alvo. Em algumas modalidades, o método ou uso compreende reparação dirigida por homologia de um DSB. Em algumas modalidades, o método ou uso adicionalmente compreende a entrega à célula de um molde, em que pelo menos uma parte do modelo incorpora-se em um DNA alvo em ou próximo a um sítio de quebra de duplo filamento induzido pela proteína Cas.
[00373] Em algumas modalidades, o método ou uso resulta em modulação genética. Em algumas modalidades, a modulação genética é um aumento ou diminuição na expressão genética, uma alteração no estado de metilação do DNA ou modificação de uma subunidade das histonas. Em algumas modalidades, o método ou uso resulta em expressão aumentada ou diminuída da proteína codificada pelo genealvo.
[00374] Em algumas modalidades, qualquer um dos gRNAs divulgados no presente documento pode ser útil na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
A. Medidas de Modulação Genética [00375] A eficácia dos gRNAs modificados pode ser testada in vitro e in vivo. Em algumas modalidades, a invenção compreende um ou mais dos gRNAs aqui divulgados, em que o gRNA resulta em modulação genética quando fornecido a uma célula em conjunto com Cas9. Em algumas modalidades, a eficácia do gRNA pode ser medida em
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148/177 ensaios in vitro ou in vivo.
1. Medição in vitro da eficácia de Cas [00376] Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas RNP que compreende um sgRNA modificado é comparada com a atividade de uma Cas RNP que compreende um sgRNA não modificado.
[00377] Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas RNP que compreende um dgRNA que compreende um trRNA modificado é comparada com a atividade de uma Cas RNP que compreende um dgRNA que compreende um trRNA não modificado.
[00378] Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas RNP que compreende um dgRNA que compreende um crRNA modificado é comparada com a atividade de uma Cas RNP que compreende um dgRNA que compreende um crRNA não modificado.
[00379] Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas RNP que compreende um dgRNA que compreende um crRNA modificado e um trRNA modificado é comparada com a atividade de uma Cas RNP que compreende um crRNA não modificado e um trRNA não modificado.
[00380] Em algumas modalidades, a eficiência de um gRNA no aumento ou diminuição da expressão da proteína alvo é determinada medindo a quantidade de proteína alvo. Em algumas modalidades, a invenção compreende qualquer um dos gRNAs aqui descritos, em que o gRNA aumenta ou diminui a quantidade de proteína produzida a partir do gene-alvo. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método de modulação da expressão de proteína que compreende a administração de qualquer um dos gRNA aqui divulgados a um objeto, em que o gRNA dirige Cas9 para o gene que codifica a proteína alvo, e a expressão de proteína alvo é aumentada ou diminuída em comparação com um controle de gRNA que não tem como alvo Cas9 para esse gene.
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149/177 [00381] Em algumas modalidades, a eficiência de edição com gRNAs específicos é determinada pela edição presente no local de destino no genoma após a entrega de Cas9 e o gRNA (sgRNA ou dgRNA que compreende um crRNA e trRNA). Em algumas modalidades, a eficiência de edição com gRNAs específicos é medida por sequenciamento de próxima geração. Em algumas modalidades, a percentagem de edição da região-alvo de interesse é determinada. Em algumas modalidades, o número total de leituras de sequências com inserções ou eliminações de nucleotídeos na região-alvo de interesse em relação ao número total de leituras de sequência é medido após a entrega de um gRNA e Cas9. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para aumentar a eficiência da edição genética que compreende, administrar ou entregar qualquer um dos gRNAs modificados aqui descritos a uma célula, em que a porcentagem de edição genética é aumentada em comparação com um controle de gRNA que não é similarmente modificado.
[00382] Em algumas modalidades, a eficiência de edição com gRNAs específicos é medida pela presença de inserções ou deleções de nucleotídeos introduzidos pela edição genética bem-sucedida. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método para criar inserções ou deleções de nucleotídeos em genes que compreende, administrar ou entregar qualquer um dos gRNAs modificados aqui descritos a uma célula, em que os nucleotídeos são inseridos ou eliminados em comparação com um gRNA de controle que é não similarmente modificado. Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas9 e gRNAs é testada em ensaios bioquímicos. Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas9 e gRNAs é testada em um ensaio de divagem livre de células. Em algumas modalidades, a atividade de uma Cas9 e gRNAs é testada em células Neuro2A.
[00383] Em algumas modalidades, Cas 9 e sgRNA ou dgRNA que
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150/177 compreende crRNA e/ou trRNA modificado mostra atividade similar, maior ou reduzida em comparação com sgRNA ou dgRNA não modificados que compreende crRNA e trRNA não modificados. Em algumas modalidades, Cas9 e sgRNA ou dgRNA modificados que compreendem crRNA e/ou trRNA modificados apresentam atividade aumentada em comparação com o sgRNA ou dgRNA não modificados que compreende crRNA e trRNA não modificados.
2. Medição in vivo da eficácia de Cas [00384] Em algumas modalidades, a atividade de gRNAs modificados é medida após a dosagem in vivo de LNPs que compreende gRNAs modificados e proteína Cas ou mRNA codificando a proteína Cas.
[00385] Em algumas modalidades, a eficácia in vivo de um gRNA ou composição aqui fornecida é determinada pela edição de eficácia medida em DNA extraído do tecido (por exemplo, tecido do fígado) após a administração de gRNA e Cas9.
3. Medição in vivo da ativação do sistema imunológico [00386] Modificações ao gRNA, como aqui divulgadas, podem reduzir a resposta imune do indivíduo à dosagem in vivo de gRNAs. Em algumas modalidades, a ativação da resposta imune do objeto é medida por concentrações no soro de citocina (s) a seguir a dosagem in vivo de sgRNA ou dgRNA que compreende trRNA e crRNA juntamente com mRNA ou proteína Cas9 (por exemplo, formulado em uma LNP). Em algumas modalidades, a citocina é interferon-alfa (IFN-alfa), interleucina 6 (IL-6), proteína quimiotática de monócitos 1 (MCP-1) e/ou fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa). Em algumas modalidades, a invenção compreende um método de redução da resposta imune de um objeto à entrega de um gRNA que compreende, administrar qualquer um dos gRNAs aqui divulgados, em que o gRNA produz uma resposta reduzida pelo sistema imunológico do objeto após a adminis
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151/177 tração. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método de redução da ativação do sistema imune do objeto após administração em comparação com um gRNA de controle que não é modificado de modo semelhante.
[00387] Em algumas modalidades, a administração de Cas RNP ou Cas9 mRNA juntamente com o gRNA modificado (por exemplo, sgRNA ou dgRNA) produz concentrações séricas mais baixas de citocinas imunes em comparação com a administração de sgRNA não modificado. Em algumas modalidades, a invenção compreende um método de redução da concentração de citocinas imunes de um objeto que compreende, administrar qualquer um dos gRNAs aqui divulgados, em que o gRNA produz uma concentração mais baixa de citocinas imunes no soro de um objeto em comparação com um gRNA de controle que não é modificado de forma semelhante.
[00388] Esta descrição e modalidades exemplares não devem ser consideradas limitativas. Para os propósitos desta especificação e reivindicações anexas, salvo indicação em contrário, todos os números expressando quantidades, porcentagens ou proporções, e outros valores numéricos usados na especificação e reivindicações, devem ser entendidos como sendo modificados em todas as instâncias pelo termo cerca de, na medida em que eles já não são tão modificados. Consequentemente, a menos que indicado em contrário, os parâmetros numéricos apresentados na seguinte descrição e reivindicações anexas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas que se pretende obter. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a aplicação da doutrina dos equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve pelo menos ser interpretado à luz do número de dígitos significativos relatados e pela aplicação de técnicas comuns de arredondamento.
[00389] Nota-se que, tal como utilizado nesta especificação e nas
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152/177 reivindicações anexas, as formas singulares um/uma, e o/a, e qualquer uso singular de qualquer palavra, incluem referências plurais a menos que expressamente e inequivocamente limitadas para um referente. Como aqui utilizado, o termo incluir e as suas variantes gramaticais pretendem ser não limitativas, de tal modo que a recitação de itens em uma lista não seja à exclusão de outros itens semelhantes que possam ser substituídos ou adicionados aos itens listados.
EXEMPLOS [00390] Os exemplos seguintes são fornecidos para ilustrar certas modalidades divulgadas e não devem ser interpretados como limitando o âmbito desta divulgação de qualquer forma.
Exemplo 1 - Materiais e Métodos
A. RNA guia sintético (gRNA) [00391] O gRNA em ambos os formatos dual (dgRNA, isto é, crRNA e trRNA) e guia único (sgRNA) foram sintetizados quimicamente por vendedores comerciais com nucleotídeos e ligações modificados, conforme fornecido na Tabela 4.
B. Transcrição in vitro (IVT) de Cas9 mRNA [00392] O Cas9 mRNA encapsulado e poliadenilado contendo N1metil pseudo-U foi gerado por transcrição in vitro usando um molde de DNA de plasmídeo linearizado e RNA polimerase de T7. O DNA de plasmídeo contendo um promotor de T7 e uma região de 100 nucleotídeos (nt) poli (A/T) foi linearizado por Xbal e obtido de um fabricante comercial. A reação de IVT para gerar mRNA modificado com Cas9 foi incubada a 37 QC durante 4 horas nas seguintes condições: 50 ng/pL de plasmídeo linearizado; 2 mM de cada um de GTP, ATP, CTP e N1metil pseudo-UTP (Trilink); ARCA 10 mM (Trilink); Polimerase de 5 U/pL de T7 RNA (NEB); 1 U/pL de inibidor da RNAase de Murino (NEB); 0,004 U/pL de pirofosfatase de E. coli inorgânica (NEB); e 1x tampão de reação. Após 4 h de incubação, adicionou-se TURBO
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DNase (ThermoFisher) a uma concentração final de 0,01 U/pL e a reação foi incubada durante mais 30 minutos para remover o molde de DNA. O Cas9 mRNA foi purificado a partir de enzima e nucleotídeos usando protocolos padrão, incluindo colunas de ligação de silica, como um kit de limpeza de transcrição MegaClear (ThermoFisher) ou etapas de precipitação usando LiCI seguido por EtOH com NaOAc. A concentração da transcrição foi determinada medindo a absorbância da luz a 260 nm (Nanodrop) e o transcrito foi analisado por eletroforese capilar por Bioanlayzer (Agilent).
C. transfecções de mRNA e gRNA Cas9 em células Neuro2A [00393] A linhagem celular de camundongo Neuro2A foi cultivada em meio DMEM suplementado com 10% de soro bovino fetal e plaqueada a uma densidade de 15.000 células / poço em uma placa de 96 poços 24 horas antes da transfecção. No dia da transfecção, o meio foi aspirado das células e substituído por meio fresco. A lipofectamina-2000 (Invitrogen) foi diluída 1:50 (v/v) em Opti-MEM (Invitrogen). mRNA Cas9 e o RNA guia único foram diluídos separadamente em Opti-MEM. Para o formato de dupla guia, crRNA e trRNA foram diluídos em conjunto na razão molar 1:1 em Opti-MEM. Ambos Cas9 mRNA e gRNA foram misturados separadamente 1:1 (v/v) com Lipofectamina-2000 diluída, produzindo dois lipoplexos. Após 5 minutos de incubação, lipoplexos foram adicionados em sucessão às células, para uma concentração final de 100 ng de Cas9 mRNA/poço e 0,4 μΙ_ de reagente de lipofecção total. Guias foram testadas em dois níveis de dose para cada experiência, incluindo 25 nM e 2,5 nM, 16,7 nM e 1,67 nM, 10 nM e 1 nM, 8,3 nM e 0,83 nM, e 3 nM e 0,3 nM. Para guia dual, esta concentração inclui quantidades equimolares de crRNA e trRNA, tal que, por exemplo, 25 nM de crRNA e 25 nM de trRNA produzem 25 nM de guia dual total. As células foram lisadas 24 horas após a transfecção e os lisados foram utilizados diretamente na reação de PCR
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154/177 que foi analisada para edição por NGS.
Cas9 mRNA com 1xNLS (SEQ ID NO: 359):
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUG UGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUAC UCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAG UGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUC CUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGG AGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGG CUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUC GCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAG GUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGG UGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAA CAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCU ACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGA CCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCC GCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUC CGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACC AACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCC AAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCG AAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUU UUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUU UCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACU CUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCAC AAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAA CCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAAC ACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCG GUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUC GUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGA CCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCU AGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAA
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GAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAG GAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCC CCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGC CAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAU CGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCA CUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAU CAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGA UAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACU UCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGC CUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGU GAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCC GGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAA CCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGA AGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGA CAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGA UCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGAC AUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUC GCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUU CGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUG GUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGA UAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUG GCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGC CUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACA GGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCG CCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCG ACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAU CGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCC AGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUC AAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAA ACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAA
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AAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUC GGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUU UCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGC GACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGG UCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGC GAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCG AGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAA ACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCG CAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGA UAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAAC UUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAG AGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACG CUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAA UCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGA AGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCG AAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGA AAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUC GAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCA GGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGU CAAU AU UG UG AAG AAAACCG AAG UGCAAACCGGCGG AU U U UCAA AGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCA CGCAAG AAAG AC UGGG ACCCG AAG AAG U ACGG AGG AU U CG AU U CGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGA GAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGG GGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUU GAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUC UGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAU GGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAG GAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUA UCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUA
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ACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUG GAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAU CCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUA AGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUC CACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCA AGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACC AAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUG GACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGA UGGCGGUGGAUCUCCGAAAAAGAAGAGAAAGGUGUAAUGAGCU AGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAAGA GAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUUUU UCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUUUC UUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAAAA AUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG
Cas9 mRNA com 2xNLS e marcador HA (SEQ ID NO: 360):
GGGUCCCGCAGUCGGCGUCCAGCGGCUCUGCUUGUUCGUGUG UGUGUCGUUGCAGGCCUUAUUCGGAUCCAUGGAUAAGAAGUAC UCAAUCGGGCUGGAUAUCGGAACUAAUUCCGUGGGUUGGGCAG UGAUCACGGAUGAAUACAAAGUGCCGUCCAAGAAGUUCAAGGUC CUGGGGAACACCGAUAGACACAGCAUCAAGAAAAAUCUCAUCGG AGCCCUGCUGUUUGACUCCGGCGAAACCGCAGAAGCGACCCGG CUCAAACGUACCGCGAGGCGACGCUACACCCGGCGGAAGAAUC GCAUCUGCUAUCUGCAAGAGAUCUUUUCGAACGAAAUGGCAAAG GUCGACGACAGCUUCUUCCACCGCCUGGAAGAAUCUUUCCUGG UGGAGGAGGACAAGAAGCAUGAACGGCAUCCUAUCUUUGGAAA CAUCGUCGACGAAGUGGCGUACCACGAAAAGUACCCGACCAUCU ACCAUCUGCGGAAGAAGUUGGUUGACUCAACUGACAAGGCCGA CCUCAGAUUGAUCUACUUGGCCCUCGCCCAUAUGAUCAAAUUCC
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GCGGACACUUCCUGAUCGAAGGCGAUCUGAACCCUGAUAACUC CGACGUGGAUAAGCUUUUCAUUCAACUGGUGCAGACCUACAACC AACUGUUCGAAGAAAACCCAAUCAAUGCUAGCGGCGUCGAUGCC AAGGCCAUCCUGUCCGCCCGGCUGUCGAAGUCGCGGCGCCUCG AAAACCUGAUCGCACAGCUGCCGGGAGAGAAAAAGAACGGACUU UUCGGCAACUUGAUCGCUCUCUCACUGGGACUCACUCCCAAUU UCAAGUCCAAUUUUGACCUGGCCGAGGACGCGAAGCUGCAACU CUCAAAGGACACCUACGACGACGACUUGGACAAUUUGCUGGCAC AAAUUGGCGAUCAGUACGCGGAUCUGUUCCUUGCCGCUAAGAA CCUUUCGGACGCAAUCUUGCUGUCCGAUAUCCUGCGCGUGAAC ACCGAAAUAACCAAAGCGCCGCUUAGCGCCUCGAUGAUUAAGCG GUACGACGAGCAUCACCAGGAUCUCACGCUGCUCAAAGCGCUC GUGAGACAGCAACUGCCUGAAAAGUACAAGGAGAUCUUCUUCGA CCAGUCCAAGAAUGGGUACGCAGGGUACAUCGAUGGAGGCGCU AGCCAGGAAGAGUUCUAUAAGUUCAUCAAGCCAAUCCUGGAAAA GAUGGACGGAACCGAAGAACUGCUGGUCAAGCUGAACAGGGAG GAUCUGCUCCGGAAACAGAGAACCUUUGACAACGGAUCCAUUCC CCACCAGAUCCAUCUGGGUGAGCUGCACGCCAUCUUGCGGCGC CAGGAGGACUUUUACCCAUUCCUCAAGGACAACCGGGAAAAGAU CGAGAAAAUUCUGACGUUCCGCAUCCCGUAUUACGUGGGCCCA CUGGCGCGCGGCAAUUCGCGCUUCGCGUGGAUGACUAGAAAAU CAGAGGAAACCAUCACUCCUUGGAAUUUCGAGGAAGUUGUGGA UAAGGGAGCUUCGGCACAAAGCUUCAUCGAACGAAUGACCAACU UCGACAAGAAUCUCCCAAACGAGAAGGUGCUUCCUAAGCACAGC CUCCUUUACGAAUACUUCACUGUCUACAACGAACUGACUAAAGU GAAAUACGUUACUGAAGGAAUGAGGAAGCCGGCCUUUCUGUCC GGAGAACAGAAGAAAGCAAUUGUCGAUCUGCUGUUCAAGACCAA CCGCAAGGUGACCGUCAAGCAGCUUAAAGAGGACUACUUCAAGA AGAUCGAGUGUUUCGACUCAGUGGAAAUCAGCGGGGUGGAGGA CAGAUUCAACGCUUCGCUGGGAACCUAUCAUGAUCUCCUGAAGA
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UCAUCAAGGACAAGGACUUCCUUGACAACGAGGAGAACGAGGAC
AUCCUGGAAGAUAUCGUCCUGACCUUGACCCUUUUCGAGGAUC GCGAGAUGAUCGAGGAGAGGCUUAAGACCUACGCUCAUCUCUU CGACGAUAAGGUCAUGAAACAACUCAAGCGCCGCCGGUACACUG GUUGGGGCCGCCUCUCCCGCAAGCUGAUCAACGGUAUUCGCGA UAAACAGAGCGGUAAAACUAUCCUGGAUUUCCUCAAAUCGGAUG GCUUCGCUAAUCGUAACUUCAUGCAAUUGAUCCACGACGACAGC CUGACCUUUAAGGAGGACAUCCAAAAAGCACAAGUGUCCGGACA GGGAGACUCACUCCAUGAACACAUCGCGAAUCUGGCCGGUUCG CCGGCGAUUAAGAAGGGAAUUCUGCAAACUGUGAAGGUGGUCG ACGAGCUGGUGAAGGUCAUGGGACGGCACAAACCGGAGAAUAU CGUGAUUGAAAUGGCCCGAGAAAACCAGACUACCCAGAAGGGCC AGAAAAACUCCCGCGAAAGGAUGAAGCGGAUCGAAGAAGGAAUC AAGGAGCUGGGCAGCCAGAUCCUGAAAGAGCACCCGGUGGAAA ACACGCAGCUGCAGAACGAGAAGCUCUACCUGUACUAUUUGCAA AAUGGACGGGACAUGUACGUGGACCAAGAGCUGGACAUCAAUC GGUUGUCUGAUUACGACGUGGACCACAUCGUUCCACAGUCCUU UCUGAAGGAUGACUCGAUCGAUAACAAGGUGUUGACUCGCAGC GACAAGAACAGAGGGAAGUCAGAUAAUGUGCCAUCGGAGGAGG UCGUGAAGAAGAUGAAGAAUUACUGGCGGCAGCUCCUGAAUGC GAAGCUGAUUACCCAGAGAAAGUUUGACAAUCUCACUAAAGCCG AGCGCGGCGGACUCUCAGAGCUGGAUAAGGCUGGAUUCAUCAA ACGGCAGCUGGUCGAGACUCGGCAGAUUACCAAGCACGUGGCG CAGAUCUUGGACUCCCGCAUGAACACUAAAUACGACGAGAACGA UAAGCUCAUCCGGGAAGUGAAGGUGAUUACCCUGAAAAGCAAAC UUGUGUCGGACUUUCGGAAGGACUUUCAGUUUUACAAAGUGAG AGAAAUCAACAACUACCAUCACGCGCAUGACGCAUACCUCAACG CUGUGGUCGGUACCGCCCUGAUCAAAAAGUACCCUAAACUUGAA UCGGAGUUUGUGUACGGAGACUACAAGGUCUACGACGUGAGGA AGAUGAUAGCCAAGUCCGAACAGGAAAUCGGGAAAGCAACUGCG
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AAAUACUUCUUUUACUCAAACAUCAUGAACUUUUUCAAGACUGA AAUUACGCUGGCCAAUGGAGAAAUCAGGAAGAGGCCACUGAUC GAAACUAACGGAGAAACGGGCGAAAUCGUGUGGGACAAGGGCA GGGACUUCGCAACUGUUCGCAAAGUGCUCUCUAUGCCGCAAGU CAAU AU UG UG AAG AAAACCG AAG UGCAAACCGGCGG AU U U UCAA AGGAAUCGAUCCUCCCAAAGAGAAAUAGCGACAAGCUCAUUGCA CGCAAG AAAG AC UGGG ACCCG AAG AAG U ACGG AGG AU U CG AU U CGCCGACUGUCGCAUACUCCGUCCUCGUGGUGGCCAAGGUGGA GAAGGGAAAGAGCAAAAAGCUCAAAUCCGUCAAAGAGCUGCUGG GGAUUACCAUCAUGGAACGAUCCUCGUUCGAGAAGAACCCGAUU GAUUUCCUCGAGGCGAAGGGUUACAAGGAGGUGAAGAAGGAUC UGAUCAUCAAACUCCCCAAGUACUCACUGUUCGAACUGGAAAAU GGUCGGAAGCGCAUGCUGGCUUCGGCCGGAGAACUCCAAAAAG GAAAUGAGCUGGCCUUGCCUAGCAAGUACGUCAACUUCCUCUA UCUUGCUUCGCACUACGAAAAACUCAAAGGGUCACCGGAAGAUA ACGAACAGAAGCAGCUUUUCGUGGAGCAGCACAAGCAUUAUCUG GAUGAAAUCAUCGAACAAAUCUCCGAGUUUUCAAAGCGCGUGAU CCUCGCCGACGCCAACCUCGACAAAGUCCUGUCGGCCUACAAUA AGCAUAGAGAUAAGCCGAUCAGAGAACAGGCCGAGAACAUUAUC CACUUGUUCACCCUGACUAACCUGGGAGCCCCAGCCGCCUUCA AGUACUUCGAUACUACUAUCGAUCGCAAAAGAUACACGUCCACC AAGGAAGUUCUGGACGCGACCCUGAUCCACCAAAGCAUCACUG GACUCUACGAAACUAGGAUCGAUCUGUCGCAGCUGGGUGGCGA UGGCUCGGCUUACCCAUACGACGUGCCUGACUACGCCUCGCUC GGAUCGGGCUCCCCCAAAAAGAAACGGAAGGUGGACGGAUCCC CGAAAAAGAAGAGAAAGGUGGACUCCGGAUGAGAAUUAUGCAGU CUAGCCAUCACAUUUAAAAGCAUCUCAGCCUACCAUGAGAAUAA GAGAAAGAAAAUGAAGAUCAAUAGCUUAUUCAUCUCUUUUUCUU UUUCGUUGGUGUAAAGCCAACACCCUGUCUAAAAAACAUAAAUU UCUUUAAUCAUUUUGCCUCUUUUCUCUGUGCUUCAAUUAAUAAA
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AAAUGGAAAGAACCUCGAGAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAUCUAG
D. hepatócitos hepáticos primários [00394] Hepatócitos primários de fígado de camundongo (PMH) (Gibco) foram cultivados de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, protocolo 11.28.2012). Resumidamente, as células foram descongeladas e ressuspensas em meio de descongelação de hepatócitos com suplementos (Gibco, Cat. CM7000) seguindo-se centrifugação a 100 g durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado e as células peletizadas ressuspensas em meio de revestimento de hepatócitos mais pacote de suplemento (Invitrogen, Cat. A1217601 e CM3000). As células foram contadas e plaqueadas em placas de 96 poços revestidas com colágeno Bio-coat I (ThermoFisher, Cat. 877272) a uma densidade de 15.000 células / poço e incubadas durante 5 horas a 37QC e 5% de atmosfera de CO2 para permitir a formação de monocamada. Após 5 horas, 0 meio de plaqueamento foi removido e substituído por meio de cultura de hepatócito suplementado (Invitrogen, Cat. A1217601 e CM4000) contendo mRNA Cas9 formulada com LNP e RNA guia mais soro de camundongo a 3%. As LNPs foram diluídas a partir de um nível de dose inicial de 100 ng de mRNA Cas9 e aproximadamente 30 nM de RNA guia por poço, realizando diluições em série até 0,1 ng de mRNA e 0,03 nM de guia por poço. As células foram incubadas durante aproximadamente 48 horas a 37 e 5% de atmosfera de CO2 antes da lise celular e análise NGS como aqui descrito.
E. Formulação de nanopartículas de lipídios (LNP) [00395] As LNPs foram formuladas com uma razão molar de amina lipídica catiônica para fosfato de RNA (N:P) de cerca de 4,5. Os componentes das nanopartículas lipídicas foram dissolvidos em etanol a 100% com as seguintes razões molares: lipídio catiônico a 45% molar
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162/177 (12,7 mM) (por exemplo, octadeca-9,12-dienoato de (9Z,12Z)-3-((4,4bis(octilóxi)butanoil)óxi)-2-((((3(dietilamino)propóxi)carbonil)óxi)metil)propila, também denominado (9Z, 12Z)-octadeca-9,12-dienoato)de 3-((4,4-bis(octiIóxi)butanoiI)óxi)-2((((3-(dietilamino)propóxi)carbonil)óxi)metil)propila; 44 % em mol (12,4 mM) de lipídio auxiliar (por exemplo, colesterol); 9 % em mol de lipídio neutro (2,53 mM) (por exemplo, DSPC); e 2% em mol (0,673 mM) de PEG (por exemplo, PEG2k-DMG). A carga de RNA foi preparada em 25 mM de tampão de acetato de sódio, pH 4,5, resultando em uma concentração de carga de RNA de aproximadamente 0,45 mg/mL.
[00396] As LNPs foram formadas por mistura microfluídica das soluções de lipídios e RNA usando um instrumento Precision Nanosystems NanoAssemblrTM Benchtop, de acordo com o protocolo do fabricante. Manteve-se uma razão de 2:1 de solvente aquoso para orgânico durante a mistura, utilizando taxas de fluxo diferenciais.
[00397] Procedimento de Formulação de LNP A: Após mistura, as LNPs foram coletadas, diluídas em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS, aproximadamente 1:1), e depois o tampão restante foi trocado para PBS (100 vezes o excesso do volume da amostra), durante a noite a 4 QC, sob agitação suave, utilizando um cassete de diálise Slide-a-LyzerTM G2 de 10 kDa (ThermoFisher Scientific). As LNPs foram concentradas usando filtro de spin Amicon de 10 kDa (centrifugação a 4000g a 4 QC) para alcançar a concentração desejada. A mistura resultante foi então filtrada usando um filtro estéril de 0,2 μιτι. O filtrado resultante foi armazenado a 2-8 QC.
[00398] Procedimento de Formulação de LNP B: Após mistura, as LNPs foram coletadas, diluídas em 50 mM de Tris a pH 7,5 (aproximadamente 1:1), e depois as LNPs foram trocadas para 50 mM de Tris a pH 7,5 (excesso de 100 vezes do volume da amostra), de um dia para o outro a 4 sob agitação suave utilizando um cassete de diálise Slide
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163/177 a-LyzerTM G2 de 10 kDa (ThermoFisher Scientific). As LNPs foram concentradas usando filtro de spin Amicon de 10 kDa (centrifugação a 4000g a 4 QC) para atingir o dobro da concentração desejada. Estas LNPs concentradas foram misturadas 1:1 com 50 mM de Tris, 90 mM de NaCI, 10% de sacarose a pH 7,5 (2X TSS). A mistura resultante foi então filtrada usando um filtro estéril de 0,2 μΜ. O filtrado resultante foi armazenado a -80 QC.
[00399] Procedimento de Formulação de LNP C: A carga de RNA foi preparada em 25 mM de citrato de sódio, 100 mM de cloreto de sódio a pH 5 resultando em uma concentração de carga de RNA de aproximadamente 0,45 mg/mL. Após a mistura, as LNPs foram coletadas em água na razão de 3:1. As LNPs foram incubadas durante uma hora à temperatura ambiente e misturadas 1: 1 com água. Em seguida, elas foram trocadas por tampão em 1X TSS (50mM de Tris, 45mM de NaCI, 5% sacarose a pH 7,5) em colunas PD-10 (GE Healthcare), usando o protocolo do fabricante. As LNPs foram concentradas usando filtro de spin Amicon de 10 kDa (centrifugação a 4000g a 4 QC) para alcançar a concentração desejada. A mistura resultante foi então filtrada usando um filtro estéril de 0,2 μιτι. O filtrado resultante foi armazenado a -80 QC.
F. Sequenciamento de Próxima Geração (NGS) e Análise para Eficiência de Clivagem no Alvo [00400] Para determinar quantitativamente a eficiência de edição no local de destino no genoma, foi utilizado o sequenciamento profundo para identificar a presença de inserções e deleções introduzidas pela edição genética.
[00401] Os iniciadores de PCR foram desenhados em torno do local alvo (por exemplo, TTR, FVII) e a área genômica de interesse foi amplificada. Sequências de iniciadores são fornecidas abaixo na Tabela
5.
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Tabela 5
| Guia | Gene | Iniciador Direto (5'-3') | SEQ ID | Iniciador Reverso (5'-3') | SEQ ID |
| Para experimentos com guias baseados em domínios alvo CR000686/G000209 | TTR | AGTCAATAAT CAGAATCAGC AGGT | 333 | AGAAGGCACTTC TTCTTTATCTAAG GT | 337 |
| Para experimentos com guias baseados em domínios alvo CR000705/G000211 | TTR | GlI IIGTTCC AGAGTCTATC ACCG | 334 | ACACGAATAAGA GCAAATGGGAAC | 338 |
| Para experimentos com guias baseados em domínios alvo G000269/ G000285 | TTR | ATTACCAGCT TAGCATCCTG TGAA | 335 | ACACGGTTTATA GAGCAAGAACAC | 339 |
| Para experimentos com guias baseados em domínios alvo CR000657/G000208 | FVII | AGCACATGA GACCTTCTGT TTCTC | 336 | GACATAGGTGTG ACCCTCACAATC | 340 |
[00402] PCR adicional foi realizada de acordo com os protocolos do fabricante (Illumina) para adicionar a química necessária ao sequenciamento. Os amplicons foram sequenciados em um instrumento Illumina MiSeq. As leituras foram alinhadas com o genoma de referência humano (por exemplo, hg38) após a eliminação daqueles com escores de baixa qualidade. Os arquivos resultantes contendo as leituras foram mapeados para o genoma de referência (arquivos BAM), onde leituras que sobrepunham à região de interesse foram selecionadas e o número de leituras de tipo selvagem versus o número de leituras que contêm uma inserção, substituição ou exclusão foi calculado.
[00403] A porcentagem de edição (por exemplo, a eficiência de edição ou percentagem de edição) é definida como o número total de leituras de sequência com inserções ou exclusões sobre o número total de leituras de sequência, incluindo o tipo selvagem.
G. Entrega de LNP In vivo [00404] Foram utilizados camundongos fêmeas CD-1, variando en
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165/177 tre 6 a 10 semanas de idade em cada estudo. Os animais foram pesados e agrupados de acordo com o peso corporal para preparar soluções de dosagem com base no peso médio do grupo. As LNPs foram administradas através da veia lateral da cauda em um volume de 0,2 mL por animal (aproximadamente 10 mL por quilograma de peso corporal). Os animais foram observados aproximadamente 6 horas após a dose quanto a efeitos adversos. O peso corporal foi medido às 24 horas após a administração, e os animais foram eutanasiados em vários momentos por ex-sang ui nação via punção cardíaca sob anestesia com isofluorano. O sangue foi coletado em tubos separadores de soro ou em tubos contendo citrato de sódio tamponado para plasma como aqui descrito. Para estudos envolvendo edição in vivo, o tecido hepático foi coletado do lobo mediano de cada animal para extração e análise de DNA.
H. Análise de indução de citocinas [00405] Para esta análise, cerca de 50-100 pL de sangue foram coletados por veia da cauda para medições de citocinas séricas. Deixouse o sangue coagular à temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas e depois centrifugou-se a 1000xg durante 10 minutos antes de recolher o soro. Um ensaio multiplex de esferas magnéticas baseado em Luminex (Affymetrix ProcartaPlus, número de catálogo Exp040-00000-801) medindo IL-6, TNF-alfa, IFN-alfa e MCP-1 foi utilizado para análise de citocinas em amostras coletadas. Os reagentes e padrões do kit foram preparados conforme indicado no protocolo do fabricante. Foram adicionados 25 pL de soro de camundongo aos poços contendo 25 pL das esferas magnéticas revestidas com o anticorpo diluído. A placa foi incubada durante 2 horas à temperatura ambiente e depois lavada. Anticorpo diluído de biotina (50 pL) foi adicionado às esferas e incubado por 1 hora em temperatura ambiente. As esferas foram lavadas novamente antes da adição de 50 pL de estreptavi
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166/177 dina-PE diluída a cada poço, seguido de incubação por 30 minutos. As esferas foram lavadas novamente e depois suspensas em 100 mL de tampão de lavagem e lidas no instrumento Bio-Plex 200 (Bio-Rad). Os dados foram analisados utilizando o pacote de análise Bioplex Manager ver. 6.1 com concentrações de citocina calculadas a partir de uma curva padrão usando um ajuste de curva logística de cinco parâmetros.
I. Isolamento do DNA Genômico [00406] Para os estudos in vivo, o DNA genômico foi extraído de 10 mg de tecido usando um kit de extração baseado em esferas, Kit de Amostras Múltiplas de DNA MagMAX-96 (ThermoFisher, Cat # 4413020) de acordo com o protocolo do fabricante, que inclui a homogeneização do tecido em tampão de lise (aproximadamente 400 pL I 10 mg de tecido). Todas as amostras de DNA foram normalizadas para 100 ng/pL de concentração para PCR e posterior análise NGS, como descrito aqui.
J. Análise ELISA de J. Transtiretina (TTR) [00407] O sangue foi coletado e o soro foi isolado como indicado. Os níveis séricos totais de TTR foram determinados utilizando um kit ELISA de Prá-albumina de camundongo (Transtirretina) (Aviva Systems Biology, Cat. OKIA00111). Os reagentes e padrões do kit foram preparados de acordo com o protocolo do fabricante. Diluiu-se o soro de camundongo até uma diluição final de 10 000 vezes com 1 x diluente de ensaio. Isto foi feito realizando duas diluições sequenciais de 50 vezes resultando numa diluição de 2500 vezes. Uma etapa final de diluição de 4 vezes foi realizada para uma diluição total da amostra de 10.000 vezes. Ambas as diluições da curva padrão (100 pL cada) e amostras de soro diluídas foram adicionadas a cada poço da placa de ELISA pré-revestida com anticorpo de captura. A placa foi incubada à temperatura ambiente durante 30 minutos antes da lavagem. Conju
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167/177 gado enzima-anticorpo (100 mL por poço) foi adicionado a uma incubação de 20 minutos. O conjugado de anticorpo não ligado foi removido e a placa foi lavada novamente antes da adição da solução de substrato cromogênico. A placa foi incubada durante 10 minutos antes da adição de 100 pL da solução de paragem, por exemplo, ácido sulfúrico (aproximadamente 0,3 Μ). A placa foi lida em um leitor de placas SpectraMax M5 com uma absorbância de 450 nm. Os níveis séricos de TTR foram calculados pelo software SoftMax Pro ver. 6.4.2 usando uma curva logística de quatro parâmetros fora da curva-padrão. Os valores séricos finais foram ajustados para a diluição do ensaio.
Exemplo 2. gRNA modificado por engenharia e teste in vitro [00408] Os gRNAs modificados foram projetados no formato de dupla guia (dgRNA), como mostrado na Tabela 4. Consequentemente, ambos os crRNAs e trRNAs foram projetados e quimicamente sintetizados para permitir o emparelhamento de componentes modificados e não modificados formando dgRNA. Estes pares foram transfectados para células Neuro2A em concentrações como indicado nas figuras e a eficiência de edição (por exemplo, percentagem de edição) foi medida por NGS, como descrito no Exemplo 1.
[00409] Certos crRNAs modificados da Tabela 4 tendo como alvo o gene de TTR de camundongo foram transfectados com Cas9 mRNA e trRNA não modificado (TR000002). Guias testados incluíram SEQ ID Nos: 1-18. Como mostrado na Figura 1, alguns dos crRNAs modificados (juntamente com o trRNA não modificado) conferiram atividade similar ou aumentada em comparação com o controle não modificado, enquanto outros crRNAs modificados diminuíram a atividade.
[00410] Em paralelo, trRNAs modificados da Tabela 4 foram transfectados com Cas9 mRNA juntamente com um crRNA não modificado (CR000686) tendo como alvo a mesma sequência do gene de TTR de camundongo. Guias testados incluíram SEQ ID Nos: 188 - 200 e 204.
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Como mostrado na Figura 2, muitos dos trRNAs modificados (juntamente com o crRNA não modificado) conferiram atividade similar ou aumentada em comparação com o controle não modificado, enquanto alguns dos trRNAs modificados diminuíram atividade.
[00411] Além de substituir nucleotídeos quimicamente modificados, alguns dos pares de crRNA e trRNA testados foram também manipulados com substituições de sequência, por exemplo, resultando em pares de G-C não encontrados nas sequências parentais. Guias testados incluíram SEQ ID Nos: 15 e 201; 16 e 202; 1 e 188. Como mostrado na Figura 3, um tal emparelhamento (SEQ ID Nos: 16 e 202) resultou em atividade semelhante ou aumentada em comparação com o controle não modificado, enquanto dois dos emparelhamentos diminuíram a atividade.
[00412] Em seguida, pares de crRNAs modificados e trRNAs modificados da Tabela 4 foram testados. Como mostrado na Figura 4, alguns dos emparelhamentos de crRNA modificado com trRNA modificado conferiram atividade semelhante ou aumentada em comparação com os controles não modificados, enquanto alguns dos pares diminuíram a atividade. Na Figura 4, os cabeçalhos das colunas descrevem diferentes trRNA usados no experimento, e os cabeçalhos das fileiras descrevem diferentes crRNA usados. Para determinar a combinação usada no experimento, basta corresponder coluna à fileira. TR000002 e CR000686 são os controles não modificados (vide as células inferiores direitas).
[00413] Com base nos desenhos de dgRNA, RNAs guias únicos correspondentes (sgRNAs) foram projetados com aspectos de alguns dos crRNAs e trRNAs modificados, conforme representado na Tabela 4 e na Figura 15D. Estes sgRNAs, SEQ ID Nos: 228 - 234, também foram testados em células Neuro2A e, como mostrado na Figura 5, cada um dos sgRNAs modificados apresentou atividades comparável
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169/177 aos controles contendo apenas modificações nas extremidades 5' e 3' (G0000209; SEQ ID NO: 228).
[00414] Um conjunto similar de experimentos foi conduzido para guias adicionais de dgRNAs representados na Tabela 4 e na Figura 6. Guias testados incluíram SEQ ID Nos: 32-47, e 1. crRNAs modificados que também visaram ao gene de TTR de camundongo foram transfectados com Cas9 mRNA e trRNA não modificado (TR000002). Como mostrado na Figura 6, alguns dos crRNAs modificados (juntamente com o trRNA não modificado) conferiram atividade semelhante ou aumentada em comparação com o controle não modificado (CR000686), enquanto outros crRNAs modificados diminuíram a atividade.
[00415] Em paralelo, como mostrado na Figura 7, trRNAs modificados da Tabela 4 foram transfectados com Cas9 mRNA juntamente com um crRNA não modificado (CR000686) tendo como alvo a mesma sequência do gene de TTR de camundongo. Guias testados incluíram SEQ ID Nos: 205 - 222 e 1. Como mostrado na Figura 7, muitos dos trRNAs modificados (juntamente com o crRNA não modificado) conferiram atividade similar ou aumentada em comparação com o controle não modificado (TR000002), enquanto alguns dos trRNAs modificados diminuíram a atividade.
[00416] Além de substituir nucleotídeos quimicamente modificados, alguns dos pares de crRNA e trRNA testados da Tabela 4 também foram projetados com substituições de sequência, por exemplo, resultando em emparelhamentos de C-G ou incompatibilidades de G-U (GU wobbles) não encontradas nas sequências parentais. Como mostrado na Figura 8, algumas das modificações e emparelhamentos conferiram atividade semelhante ou melhorada em comparação com o controle não modificado, enquanto algumas (por exemplo, GU wobbles ou emparelhamentos G-U) diminuíram a atividade. A Figura 8 mostra resultados utilizando guias de trRNA mostrados nas SEQ ID
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Nos: 223-227 e 188 com guias de crRNA mostrados nas SEQ ID Nos: 48-52, e 1.
[00417] Em seguida, empareihamentos selecionados dos crRNAs modificados e trRNAs modificados da Tabela 4 foram testados como mostrado na Figura 9. Alguns dos emparelhamentos de crRNA modificado com trRNA modificado conferiram atividade similar ou aumentada em comparação com os controles não modificados, enquanto alguns dos emparelhamentos diminuíram a atividade. Na Figura 9, os cabeçalhos das colunas descrevem diferentes trRNA usados no experimento, e os cabeçalhos das fileiras descrevem diferentes crRNA usados. Para determinar a combinação usada no experimento, basta corresponder a coluna à fileira. Controles não modificados são TR000002 e CR000686.
[00418] Alguns dos gRNAs modificados (dgRNAs e sgRNAs) da Tabela 4 também foram testados em um ensaio puramente bioquímico (ou seja, ensaio de divagem livre de células). Curiosamente, muitos dos gRNAs modificados que eram em grande parte inativos nas células Neuro2A estavam ativos no ensaio bioquímico, indicando que tais ensaios bioquímicos podem não ser preditivos de atividade modificada de gRNA nas células (dados não mostrados).
Exemplo 3. Teste adicional de gRNAs modificados para outros alvos [00419] Tendo estabelecido que certas modificações afetaram a atividade do gRNA, foi testado em seguida se essas modificações afetariam a atividade ao direcionar (1) uma sequência separada no mesmo gene ou (2) uma sequência em um gene diferente. Em conformidade, os gRNA dirigidos a outra sequência no gene de TTR de camundongo, assim como uma sequência no gene de Fator-VII (FVII) de camundongo, foram manipuladas e sintetizadas tendo determinados padrões de modificação testados no Exemplo 2 (vide Tabela 4). Estes
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171/177 gRNAs foram transfectados em células Neuro2A nas concentrações indicadas nas figuras e a eficiência de edição (por exemplo, percentagem de edição) foi medida por NGS, como descrito no Exemplo 1.
[00420] crRNAs modificados da Tabela 4, tendo como alvo o gene de TTR de camundongo (sequência diferente do alvo no Exemplo 2) ou o gene de FVII de camundongo, foram transfectados com Cas9 mRNA e trRNA não modificado (TR000002). Os guias testados incluíam os mostrados nas Figuras 12A e 12B. Alguns dos crRNAs modificados (juntos com trRNA não modificado) conferiu atividade semelhante ou aumentada em comparação com os controles não modificados, enquanto outros crRNAs modificados diminuíram a atividade.
[00421] Em paralelo, trRNAs modificados da Tabela 4 foram transfectados com Cas9 mRNA juntamente com um crRNA não modificado tendo como alvo a mesma sequência do gene de TTR de camundongo (CR000705; sequência diferente como direcionada no Exemplo 2) ou a mesma sequência que o gene FVII de camundongo (CR000657). Como mostrado nas Figuras 13A e 13B, muitos dos trRNAs modificados (juntamente com os crRNAs não modificados) conferiram atividade similar ou aumentada em comparação com os controles não modificados, enquanto alguns dos trRNAs modificados diminuíram a atividade. Esses dados mostram que certos padrões de modificação tendem a ter efeitos semelhantes sobre as diferentes sequências.
[00422] Com base nos projetos de dgRNA descritos acima, RNAs guias únicos correspondentes (sgRNAs) foram projetados com aspectos de alguns dos crRNAs e trRNAs modificados. Vide, Tabela 4. Estes sgRNAs também foram testados em células Neuro2A. Os resultados são mostrados na Figura 10 (camundongo TTR) e na Figura 11 (camundongo FVII). Esses experimentos mostram que alguns padrões de modificação resultam em efeitos similares, mesmo quando se dirigem a genes diferentes.
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Exemplo 4. Teste de gRNA modificado in vivo [00423] Após o teste in vitro, sgRNAs modificados foram entregues aos animais em seis estudos separados, a fim de determinar se as modificações conferiram quaisquer benefícios para a edição in vivo.
[00424] LNPs foram formuladas com Cas9 mRNA IVT juntamente com sgRNA quimicamente modificado (tendo como alvo TTR ou FVII), como descrito no Exemplo 1. A razão de mRNA:sgRNA foi de aproximadamente 1:1, em peso dos componentes de RNA. Salvo indicação em contrário, o Cas9 mRNA utilizado nos estudos descritos neste exemplo tinha a sequência da SEQ ID NO: 360 e as LNPs foram formuladas utilizando o Procedimento de Formulação LNP descrito acima.
[00425] Em um experimento, camundongos (n = 5 por grupo) receberam uma dose única de LNP a 2 mg/kg e o sangue foi coletado quatro horas após a dose para análise de citocinas séricas. 7 dias após a dose na necropsia, fígados e sangue foram coletados para medições da eficiência de edição de NGS e análise da TTR sérica, respectivamente. Cada um dos sgRNAs nesta experiência teve como alvo a mesma sequência no gene de TTR, sendo a única diferença entre os sgRNAs as modificações feitas em cada (vide Figuras 14A-D e 15A-E; Tabela 4 SEQ ID Nos: 228 - 234). O G000209 (dois lotes testados) serviu como controle menos modificado, possuindo apenas modificações de 2'-O-metila e ligações de fosforotioato nos e entre os três nucleotídeos terminais nos terminais 5' e 3' do sgRNA, respectivamente. (Vide a Figura 15D).
[00426] Os resultados mostrados nas Figuras 14A-D mostram que os sgRNAs mais fortemente modificados tenderam a induzir menos de uma resposta para cada uma das citocinas analisadas, em comparação com os controles G000209 menos modificados. Os sgRNAs mais fortemente modificados também conferiram maior eficiência de edição
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173/177 nos fígados dos animais tratados, com percentagem de edição chegando a ~ 60% para dois dos sgRNAs mais fortemente modificados (por exemplo, G000263 e G000267) em comparação com ~ 44-47% para os controles menos modificados (lotes G000209) (Figura 15A). Importante, as eficiências de edição correlacionadas com alterações fenotípicas como knockdown sérico de TTR foram comparáveis ou significativamente maiores do que os controles menos modificados (vide, por exemplo, os lotes G000263 e G000267 vs G000209 nas Figuras 15A-15B). As diferenças entre o G000209 modificado no final e o G000267 altamente modificado estão resumidas na Figura 15D e 15E (os nucleotídeos modificados com 2'-O-Me são apresentados a negrito e * representa ligações de fosforotioato).
[00427] Em outro estudo in vivo, três sgRNAs tendo como alvo uma sequência separada no gene de TTR de camundongo foram testados. Os camundongos (n = 5 por grupo) receberam uma dose única de LNP a 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,3 mg/kg. O sangue foi coletado quatro horas após a dose para análise de citocinas séricas. 7 dias após a dose na necropsia, fígados e sangue foram coletados para medições da eficiência de edição de NGS e análise da TTR sérica, respectivamente. Neste estudo, cada um dos sgRNAs teve como alvo a mesma sequência no gene de TTR (uma sequência diferente daquela foi direcionada no estudo in vivo anterior) com um sgRNA sendo completamente não modificado (G000201 (SEQ ID NO: 243)), outro tendo apenas modificações de extremidade (G000211 (SEQ ID NO: 241)), com modificações de 2'-O-metil e ligações de fosforotioato nos e entre os três nucleotídeos terminais nos terminais 5' e 3' do sgRNA, respectivamente), e um terceiro sgRNA com o mesmo padrão de modificação que G000267 no estudo in vivo anterior (G000282 (SEQ ID NO: 242)).
[00428] Como mostrado nas Figuras 16A-16D, cada um dos sgRNAs resultou em respostas similares de uma maneira dependente da
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174/177 dose para cada uma das citocinas testadas. Para a eficiência de edição, o sgRNA não modificado (G000201 (SEQ ID NO: 243)) conferiu pouca edição in vivo, enquanto o sgRNA altamente modificado (G000282 (SEQ ID NO: 242)) conferiu níveis que atingiram ~ 60% com uma dose de 2mg/kg, que foi significativamente maior do que os níveis alcançados com o sgRNA menos modificado (G000211 (SEQ ID NO: 241)) (Figura 17A e B). Como no estudo in vivo anterior, os níveis de edição se correlacionaram com a quantidade de knockdown de TTR sérico (Figura 17C e D).
[00429] Um estudo semelhante ao segundo estudo in vivo foi realizado com outro conjunto de três sgRNAs tendo como alvo ainda uma sequência diferente de TTR no gene de TTR de camundongo (tendo como alvo uma sequência diferente daquela direcionada nos dois estudos anteriores in vivo). Os camundongos (n = 5 por grupo) receberam uma dose única de LNP a 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,3 mg/kg. O sangue foi coletado quatro horas após a dose para análise de citocinas séricas. 7 dias após a dose na necropsia, fígados e sangue foram coletados para medições da eficiência de edição de NGS e análise de TTR sérica, respectivamente. Neste estudo, cada um dos sgRNAs teve como alvo a mesma sequência no gene de TTR (uma sequência diferente da que foi alvo nos dois estudos in vivo anteriores) com um sgRNA completamente não modificado (G000285; SEQ ID NO: 332), outro tendo apenas modificações de extremidade (G000269 (SEQ ID NO: 330)), com modificações de 2'-O-metil e ligações de fosforotioato nos e entre os três nucleotídeos terminais nas extremidades 5' e 3' do sgRNA, respectivamente), e um terceiro sgRNA possuindo o mesmo padrão de modificação que G000267 e G000282 nos dois estudos in vivo anteriores (G000283 (SEQ ID NO: 331)).
[00430] No presente estudo, o sgRNA não modificado (G000285 (SEQ ID NO: 332)) conferiu pouca edição in vivo, enquanto o sgRNA
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175/177 altamente modificado (G000283 (SEQ ID NO: 331)) conferiu níveis que atingiram ~ 60% com uma dose de 2 mg/kg, que foi significativamente maior do que os níveis alcançados com o sgRNA menos modificado (G000269 (SEQ ID NO: 330)) (Figuras 18A-18B). Como nos estudos anteriores in vivo, os níveis de edição se correlacionaram com a quantidade de knockdown de TTR sérico (Figura 18C).
[00431] Em um quarto estudo in vivo, os efeitos de modificações em gRNAs foram avaliados para outro gene (FVII). Para a comparação no estudo, dois dos sgRNAs testados no primeiro estudo in vivo foram incluídos (G000209 e G000267). Aos camundongos (n = 5 por grupo) foi administrada uma dose única de LNP a 2 mg/kg, 1 mg/kg ou 0,3 mg/kg e o sangue foi coletado quatro horas após a dose para análise de citocinas no soro. 6 dias após a dose na necropsia, os fígados foram coletados para medidas de eficiência de edição da NGS. Neste estudo, cada um dos sgRNAs teve como alvo a mesma sequência nos genes TTR ou FVII, com um sgRNA para cada um tendo apenas modificações de extremidade (G000208 (SEQ ID NO: 286)) para FVII, G000209 para TTR, ambos com modificações de 2'-O-metil e ligações de fosforotioato entre os três terminais nucleotídeos em ambas as extremidades 5' e 3' do sgRNA, respectivamente), e um segundo sgRNA com os mesmos padrões de modificação como G000267, G000282, e G000283 no estudos anterior in vivo (G000373 (SEQ ID NO: 287) para FVII; G000267 (SEQ ID NO: 234) para TTR).
[00432] Como mostrado nas Figuras 19A-19D, cada um dos sgRNAs resultou em respostas similares de uma maneira dependente da dose para cada uma das citocinas testadas. Para eficiência de edição, o sgRNA mais fortemente modificado tendo como alvo FVII (G000373 (SEQ ID NO: 287)) teve um aumento na eficiência de edição em comparação com a versão menos modificada (G000208 (SEQ ID NO: 286)) em cada uma das doses testadas (Figura 18A). Estes resultados
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176/177 foram também observados para os gRNA dirigidos ao TTR (Figuras 20A-20B).
[00433] Em outro estudo in vivo, dez sgRNAs adicionais tendo como alvo a mesma sequência no gene de TTR de camundongo como G000282 foram testados. O G000282 também foi incluído no estudo para fins comparativos. Os camundongos (n = 5 por grupo) receberam uma dose única de LNP a 1 mg/kg ou 0,5 mg/kg. As LNPs utilizadas neste estudo foram formuladas utilizando o Procedimento de Formulação de LNP B descrito acima. Sete (7) dias após a dose na necropsia, fígados e sangue foram coletados para as medições da eficiência de edição de NGS e análise de TTR sérica, respectivamente. Neste estudo, cada um dos sgRNAs teve como alvo a mesma sequência no gene de TTR. O padrão de modificação de cada sgRNA testado variou e incluiu modificações de 2'-OMe, 2'-F e PS no terminal 5', terminal 3', grampo 1, grampo 2, nexo, haste inferior, protuberância e haste superior do sgRNA. Os resultados deste estudo são mostrados nas Figuras 22A-22C, incluindo % de edição (Figura 22A), edição média e desvio padrão (Figura 22B), e níveis séricos de TTR (Figura 22C). Estes mesmos sgRNAs foram testados em hepatócitos de camundongo primários, de acordo com os métodos aqui descritos. Os resultados deste estudo de edição de TTR de resposta à dose são mostrados nas Figuras 24A-24C, incluindo % de edição (Figura 24A), curvas de doseresposta (Figura 24B) e valores de EC50 (Figura 24C).
[00434] Em outro estudo in vivo, treze sgRNAs tendo como alvo a mesma sequência no gene de TTR de camundongo como G000282 foram testados. O G000282 também foi incluído no estudo para fins comparativos. Os camundongos (n = 5 por grupo) receberam uma dose única de LNP a 1 mg/kg. As LNPs utilizadas neste estudo foram formuladas utilizando o Procedimento de Formulação de LNP C descrito acima. O Cas9 mRNA utilizado neste estudo teve a sequência de
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SEQ ID NO: 359. O sangue foi coletado quatro horas após a dose para análise de citocinas no soro. 7 dias após a dose na necropsia, fígados e sangue foram coletados para medições da eficiência de edição de NGS e análise da TTR sérica, respectivamente. Neste estudo, cada um dos sgRNAs teve como alvo a mesma sequência no gene de TTR. Os sgRNAs testados incluem modificações adicionais de 2'-0Me e PS nos terminais 5', 3', grampo 1, grampo 2 e haste superior do sgRNA. Os resultados deste estudo são mostrados nas Figuras 23A-23C, incluindo % de edição (Figura 23A), % de edição média (Figura 23B) e níveis séricos de TTR (Figura 23C).
Claims (216)
- REIVINDICAÇÕES1. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação de extremidade 5' e uma ou mais modificações em um ou mais de:a. a região da haste superior;b. a região de grampo 1; ec. a região de grampo 2, em que a modificação da extremidade 5' compreende pelo menos duas ligações de fosforotioato (PS) nos primeiros sete nucleotídeos na extremidade 5' da extremidade 5'.
- 2. RNA guia único de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-0-Me).
- 3. RNA guia único de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F).
- 4. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
- 5. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-4, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma ou mais modificações na região de haste superior.
- 6. RNA guia único de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que compreende modificações em US1 a US12.
- 7. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma ou mais modificações na região de grampo 1.
- 8. RNA guia único de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma modificação emPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 191/3902/34H1-1.
- 9. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-8, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma ou mais modificações na região de grampo 2.
- 10. RNA guia único de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma modificação em H2-1.
- 11. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-10, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende modificações em H1-1 a H1-12.
- 12. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-11, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende modificações em H2-1 a H2-15.
- 13. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-12, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende uma ou mais modificações em cada uma das regiões de haste superior, região de grampo 1 e região de grampo 2.
- 14. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-13, caracterizado pelo fato de que o sgRNA compreende um nucleotídeo modificado entre as regiões de grampo 1 e de grampo 2.
- 15. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-14, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma região de haste inferior que compreende uma modificação.
- 16. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma região de terminal 3' que compreende uma modificação.
- 17. RNA guia único de acordo com a reivindicação 16, que adicionalmente compreende uma modificação de extremidade 3' noPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 192/3903/34 terminal 3'.
- 18. RNA guia único de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois dos últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3' são modificados.
- 19. RNA guia único de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois dos últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3' são modificados com 2'-OMe, 2'-F ou 2'-O-moe.
- 20. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 17-19, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende ligações de fosforotioato (PS) entre um ou mais dos últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 21. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-20, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma região de protuberância que compreende uma modificação.
- 22. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-21, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma região de nexo que compreende uma modificação.
- 23. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-22, caracterizado pelo fato de que pelo menos os primeiros três nucleotideos na extremidade 5' do terminal 5' e os três nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3' são modificados.
- 24. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-23, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotideos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotideos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados a ligações de fosforotioato (PS).
- 25. RNA guia único de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as modificações de extremidade comprePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 193/3904/34 endem 2'-0-Me.
- 26. RNA guia único de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que as modificações de extremidade compreendem 2'-F.
- 27. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem modificações de 2'-0-Me.
- 28. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-26, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos no terminal 5' terminal e os últimos três nucleotídeos no terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me, 2'-F e/ou 2'-Omoe.
- 29. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-28, caracterizado pelo fato de que LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e/ou LS12 são modificados com 2'-O-Me.
- 30. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizado pelo fato de que cada um dos nucleotídeos na região de protuberância é modificado com 2'-O-Me.
- 31. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-29, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% dos nucleotídeos na região de protuberância são modificados com 2'-OMe.
- 32. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-31, caracterizado pelo fato de que cada um dos nucleoPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 194/3905/34 tídeos na região de haste superior é modificado com 2'-0-Me.
- 33. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizado pelo fato de que N16, N17 e/ou N18 na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
- 34. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-32, caracterizado pelo fato de que N15, N16, N17 e/ou N18 na região de nexo são modificados.
- 35. RNA guia único de acordo com a reivindicação 33 ou reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que as modificações na região de nexo são selecionadas de 2'-O-Me e 2'F.
- 36. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 32-35, caracterizado pelo fato de que N16, N17 e N18 são ligados a ligações de PS.
- 37. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-36, caracterizado pelo fato de que cada um dos nucleotídeos na região de grampo 1 é modificado com 2'-O-Me.
- 38. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-37, caracterizado pelo fato de que cada um dos nucleotídeos na região de grampo 2 é modificado com 2'-O-Me.
- 39. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nas seguintes posições:a. os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e/ou LS12 na região de haste inferior;c. B1 e/ou B2 na região de protuberância;d. cada nucleotídeo na região de haste superior;e. N16, N17 e/ou N18 na região de nexo;f. cada nucleotídeo na região de grampo 1;Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 195/3906/34g. cada nucleotídeo na região de grampo 2; eh. os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.
- 40. RNA guia único de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que B3-B6 são modificados com 2'-O-Me.
- 41. RNA guia único de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 42. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que LS9 e LS10 são modificados, por exemplo, com 2'-F ou 2'-OMe.
- 43. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que N15, N16, N17 e N18 são modificados, por exemplo, com 2'-F ou 2'-OMe.
- 44. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15 são modificados com 2'-F.
- 45. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado pelo fato de que o segundo ao último, o terceiro ao último e o quarto ao último nucleotídeos no terminal 3' são modificados com 2'-F.
- 46. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F nas seguintes posições:a. LS9 e LS10 na região de haste inferior;b. N15, N16, N17 e N18 na região de nexo; ec. H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15 na região de grampo 2.
- 47. RNA guia único de acordo com a reivindicação 46, caPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 196/3907/34 racterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-F no penúltimo, terceiro ao último e quarto aos últimos nucleotídeos no terminal 3'.
- 48. RNA guia único de acordo com a reivindicação 46 ou reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 49. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 46-48, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-0-Me ou 2'-F nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e 2'-O- Me ou nucleotídeos modificados com 2'-F nos três dos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 50. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende:a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; ee. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 51. RNA guia único de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e/ou LS6.
- 52. RNA guia único de acordo com a reivindicação 50 ou reivindicação 51, caracterizado pelo fato de que adicionalmente comPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 197/3908/34 preende um nucleotideo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2.
- 53. RNA guia único (sgRNA) que compreende:a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS1-LS6;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;e. um nucleotideo modificado com 2'-O-Me entre o grampo 1 e o grampo 2;f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eg. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 54. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende:a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS2-LS5;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1 e LS6;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;f. um nucleotideo modificado com 2'-O-Me entre o grampo 1 e o grampo 2;g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eh. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 55. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 198/3909/34a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5'; b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre o grampo 1 e o grampo 2;f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eg. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 56. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendea. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS7, LS8, LS11 e LS12;d. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS9 e LS10;e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre o grampo 1 e o grampo 2;g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eh. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 57. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendea. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeirosPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 199/39010/34 nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS8, LS10 e LS12;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-F em LS7, LS9 e LS11;e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre o grampo 1 e o grampo 2;g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eh. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 58. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende:a. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;e. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre o grampo1 e o grampo 2;f. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eg. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 59. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendea. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeirosPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 200/39011/34 nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em LS1, LS6, LS7, LS8, LS11 e LS12;c. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS9 e LS10;d. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;f. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre o grampo 1 e o grampo 2;g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-15; eh. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 60. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendea. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-1 - H1-12;d. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me entre Grampo 1 e Grampo 2;e. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1 - H2-8;f. nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-9 - H2-15;g. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último, terceiro do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; eh. um nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'.
- 61. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendea. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 201/39012/34b. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em US1-US12;c. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10 e H1-12;d. nucleotídeos modificados com 2'-F em H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9e H1-11;e. um nucleotídeo modificado com 2'-F entre o de grampo 1 e de grampo 2;f. nucleotídeos modificados com 2'-F em H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2-12; e H2-14;g. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11; H2-13 e H2-15;h. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo do último e quarto do último nucleotídeo no terminal 3'; ei. Nucleotídeo modificado com 2'-O-Me no terceiro e último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'.
- 62. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-61, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 63. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 50-61, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos uma ligação de fosforotioato (PS) dentro dos primeiros sete nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5'.
- 64. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreendea. nucleotídeos modificados com 2'-O-Me LS8, LS10, LS12, H1-2, H1-4, H1-6, H1-8, H1-10, H1-12, H2-1, H2-3, H2-5, H2-7, H2-9, H2-11, H2-13 e H2-15; ePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 202/39013/34b. nucleotídeos modificados com 2'-F em LS7, LS9, LS11; H1-1, H1-3, H1-5, H1-7, H1-9, H1-11, H1-13, H2-2, H2-4, H2-6, H2-8, H2-10, H2- 12 e H2-14.
- 65. RNA guia único de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 66. RNA guia único de acordo com a reivindicação 64 ou reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende a. nucleotídeos modificados com 2'-0-Me no último e terceiro a último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'; eb. nucleotídeos modificados com 2'-F no segundo ao último e no quarto ao último nucleotídeo na extremidade 3' do terminal 3'.
- 67. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 228-332, incluindo as modificações da Tabela 4.
- 68. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, incluindo as modificações da Tabela 4.
- 69. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID No: 240.
- 70. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID No. 240, incluindo as modificações da Tabela 4.
- 71. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende a SEQ ID No: 242, incluindo as modificações da Tabela 4.
- 72. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende as modificações da SEQ ID No: 242, como representado na Tabela 4.
- 73. RNA guia único caracterizado pelo fato de que comprePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 203/39014/34 ende a SEQ ID No: 358.
- 74. RNA guia único caracterizado pelo fato de que compreende ácidos nucleicos possuindo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com os ácidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID. Nos: 235-240, 265-285 e 309-329, em que a modificação em cada nucleotídeo do sgRNA que corresponde a um nucleotídeo do identificador de sequência de referência na Tabela 4, idêntica ou equivalente modificação mostrada na referência identificador de sequência na Tabela 4.
- 75. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 66-74, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos no terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos no terminal 3'.75. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-74, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos três ligações de PS ligando os nucleotídeos na região de grampo 1.
- 76. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-75, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos três ligações de PS ligando os nucleotídeos na região de grampo 2.
- 77. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-76, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende pelo menos três ligações de PS ligando os nucleotídeos na região de haste superior.
- 78. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-77, caracterizado pelo fato de que o sgRNA forma um complexo de ribonucleoproteína com uma Cas9 de S. pyogenes.
- 79. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreendePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 204/39015/34 modificações de 2'-O-Me em cada nucleotídeo na região de haste superior.
- 80. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende modificações de 2'-O-Me em um, dois, três ou quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez ou onze dos seguintes nucleotideos: US1, US2, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 e US12.
- 81. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende modificações de 2'-O-Me a 50% ou mais dos nucleotideos nas regiões de grampo 1 e de grampo 2.
- 82. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende modificações de 2'-O-Me em cada nucleotídeo na região de haste superior e modificações de 2'-O-Me a 50% ou mais dos nucleotideos nas regiões de grampo 1 e de grampo 2.
- 83. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em modificações de 2'-O-Me em cada nucleotídeo, iniciando em H2-1 ou H2-2 até o último nucleotídeo do terminal 3'.
- 84. RNA guia caracterizado pelo fato de que inclui ou consiste em uma modificação 2'-O-Me em LS1 e/ou LS6 e nenhuma modificação em LS2-LS5.
- 85. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende nucleotideos modificados com 2'-O-Me em 2 ou mais de LS8, LS9, LS10, LS11 e/ou LS12.
- 86. RNA guia de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que pelo menos LS8 e LS10 são modificados com 2'O-Me.
- 87. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-86, que compreende adicionalmente modificações de 2'-O-Me a 50% ou mais dos nucleotdeos na regio do nexo.
- 88. RNA guia de acordo com a reivindicação 87, caracterizado pelo fato de que pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%,Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 205/39016/3485%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % dos nucleotídeos na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
- 89. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende modificações de 2'-O-Me em até 50% dos nucleotídeos na região de nexo.
- 90. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende modificações de 2'-O-Me em quatro ou mais nucleotídeos na região de nexo.
- 91. RNA guia de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que pelo menos um, dois, três, quatro ou cinco dos nucleotídeos N2-N6 na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
- 92. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em dez ou mais nucleotídeos na região de nexo.
- 93. RNA guia de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo fato de que pelo menos N2-N6 são modificados com 2'-OMe.
- 94. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende modificações de 2'-O-Me a 50% ou mais dos nucleotídeos na região de protuberância.
- 95. RNA guia de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % dos nucleotídeos na região de protuberância são modificados com 2'-O-Me.
- 96. RNA guia de acordo com a reivindicação 94, caracterizado pelo fato de que B2, B3 e/ou B4 são modificados com 2'-O-Me.
- 97. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em três ou mais nucleotídeos na região de protuberância.
- 98. RNA guia de acordo com a reivindicação 97, caracteriPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 206/39017/34 zado pelo fato de que B2, B3 e/ou B4 são modificados com 2'-O-Me.
- 99. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende os nucleotídeos da SEQ ID NO: 357 com o padrão de modificação do RNA guia de qualquer reivindicação precedente.
- 100. RNA guia caracterizado pelo fato de que compreende os nucleotídeos da SEQ ID NO: 356 com o padrão de modificação do RNA guia de qualquer reivindicação precedente.
- 101. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente modificações de 2'-O-Me nos primeiros trs, quatro ou cinco nucletidos na extremidade 5' da regio 5' terminal.
- 102. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente modificações de 2'-O-Me nas t três, últimos quatro ou cinco últimos nucleotídeos na extremidade 3' da região 3' do terminal.
- 103. RNA guia de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que o último nucleotídeo na extremidade 3' da região de terminal 3' não é modificado.
- 104. RNA guia de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que apenas o segundo a último e o terceiro a último nucleotídeo na extremidade 3' da região de terminal 3' são modificados.
- 105. RNA guia de acordo com a reivindicação 102, caracterizado pelo fato de que apenas o segundo ao timo, o terceiro ao timo e o quarto ao timo nucleotídeo na região de terminal 3' s modificados.
- 106. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ligações de PS entre os primeiros três, quatro ou cinco nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5'.
- 107. RNA guia de acordo com a reivindicação 106, caractePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 207/39018/34 rizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' são ligados a ligações de PS.
- 108. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente as ligações de PS entre os últimos três, quatro ou cinco nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 109. RNA guia de acordo com a reivindicação 108, caracterizado pelo fato de que os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' estão ligados a ligações de PS.
- 110. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que os primeiros três ou quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e os últimos três ou quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem Modificações de 2'-O-Me.
- 111. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que os primeiros três ou quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' são ligados a ligações de PS, e os últimos três ou quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' está ligado a ligações de PS.
- 112. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que os primeiros três ou quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' compreendem modificações de 2'-O-Me e são ligados a ligações de PS, e os três últimos ou quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me e estão ligados a ligações de PS.
- 113. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que pelo menos dois dos nucleotídeos LS8, LS9, LS10, LS11 e LS12 compreendem modificações de 2'-O-Me.
- 114. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicaPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 208/39019/34 ções 79-100, caracterizado pelo fato de que pelo menos LS8 e LS10 são modificados com 2'-O-Me.
- 115. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% dos nucleotídeos na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
- 116. RNA guia de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % dos nucleotídeos na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
- 117. RNA guia de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que pelo menos N2-N6 são modificados com 2'-OMe.
- 118. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que pelo menos dez dos nucleotídeos na região de nexo são modificados com 2'-O-Me.
- 119. RNA guia de acordo com a reivindicação 115, caracterizado pelo fato de que pelo menos N2-N6 são modificados com 2'-OMe.
- 120. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% dos nucleotídeos na região de protuberância são modificados com 2'-O-Me.
- 121. RNA guia de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo fato de que pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99 % dos nucleotídeos na região de protuberância são modificados com 2'-O-Me.
- 122. RNA guia de acordo com a reivindicação 121, caracterizado pelo fato de que B2, B3 e/ou B4 são modificados com 2'-O-Me.
- 123. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-100, caracterizado pelo fato de que pelo menos três dos nucleotídeos na região de protuberância são modificados com 2'-O-Me.Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 209/39020/34
- 124. RNA guia de acordo com a reivindicação 123, caracterizado pelo fato de que B2, B3 e/ou B4 são modificados com 2'-O-Me.
- 125. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-124, caracterizado pelo fato de que o RNA guia T^l/sum RNAg.
- 126. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79-125, caracterizado pelo fato de que o RNA guia é um dgRNA.
- 127. RNA guia de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que pelo menos 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% dos nucleotídeos nas regiões de de grampo 1 e de grampo 2 são modificados com 2'-OMe.
- 128. RNA guia de acordo com qualquer uma das reivindicações 79 a 127, caracterizado pelo fato de que o gRNA forma um complexo ribonucleoproteico com uma Cas9 de S. pyogenes.
- 129. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em nucleotídeos modificados com 2'-OMe em:a. os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. cada nucleotídeo na região de haste superior;c. cada nucleotídeo na região de grampo 1;d. o nucleotídeo entre o de grampo 1 e o de grampo 2;e. cada nucleotídeo na região de grampo 2; ef. os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 130. RNA guia único de acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente ligações de PS ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 131. RNA guia único caracterizado pelo fato de que possuiPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 210/39021/34 o padrão de modificação mostrado na SEQ ID NO: 350, 351, 352 ou 353, como representado na Tabela 4.
- 132. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em nucleotídeos modificados com 2'-OMe em:a. os primeiros três, quatro, cinco ou sete nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. cada nucleotídeo na região de haste superior;c. cada nucleotídeo na região de grampo 1;d. o nucleotídeo entre o de grampo 1 e o de grampo 2;e. cada nucleotídeo na região de grampo 2; ef. os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 133. RNA guia único (sgRNA) caracterizado pelo fato de que compreende ou consiste em nucleotídeos modificados com 2'-OMe em:a. os primeiros três, quatro, cinco ou sete nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. cada um dos nucleotídeos US1, US2, US3, US4, US5, US6, US7, US8, US9, US10, US11 e US12;c. cada um dos nucleotídeos H1-1, H1-2, H1-3, H1-4, H1-5,H1-6, H1-7, H1-8, H1-9, H1-10, H1-11 e H1- 12;d. o nucleotídeo entre o de grampo 1 e o de grampo 2;e. cada um dos nucleotídeos H2-1, H2-2, H2-3, H2-4, H2-5, H2-6, H2-7, H2-8, H2-9, H2-10, H2-11, H2-12, H2-13, H2-14 e H2-15; ef. os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 134. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 129-133, caracterizado pelo fato de que adicionalmentePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 211/39022/34 compreende ligações de PS ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 135. RNA guia único caracterizado pelo fato de que possui o padrão de modificação da SEQ ID NO: 350, 351, 352 ou 353, como mostrado na Tabela 4.
- 136. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 129-135, caracterizado pelo fato de que o sgRNA forma um complexo de ribonucleoproteína com uma Cas9 de S. pyogenes.
- 137. RNA crispr (crRNA) caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões:a. os primeiros cinco nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. a região de haste inferior;c. a região de protuberância;d. a região da haste superior; ee. os últimos cinco nucleotídeos na extremidade 3' do crRNA.
- 138. RNA crispr de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma modificação de extremidade 5', caracterizado pelo fato de que a modificação da extremidade 5' compreende uma ou mais ligações de fosforotioato dentro dos primeiros sete nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5'.
- 139. RNA crispr de acordo com a reivindicação 136, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende uma modificação de extremidade 5', caracterizado pelo fato de que a modificação da extremidade 5' compreende pelo menos duas ligações de fosforotioato nos primeiros sete nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5'.Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 212/39023/34
- 140. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-139, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-O-metil (2'-OMe).
- 141. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-140, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'-F).
- 142. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-141, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
- 143. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-142, caracterizado pelo fato de que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são modificados.
- 144. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-143, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados a ligações de fosforotioato (PS).
- 145. RNA crispr de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende 2'-O-Me.
- 146. RNA crispr de acordo com a reivindicação 143, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende 2'-F.
- 147. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-146, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 213/39024/34 minai 3' compreendem modificações de 2'-O-Me.
- 148. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-146, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem modificações de 2'-F.
- 149. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-148, caracterizado pelo fato de que LS1 e LS6 são modificados com 2'-O-Me.
- 150. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-149, caracterizado pelo fato de que cada um dos nucleotídeos na região de haste superior é modificado com 2'-O-Me.
- 151. RNA crispr (crRNA) caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em:a. LS1 e LS6 na região de haste inferior; eb. cada nucleotídeo na região de haste superior.
- 152. RNA crispr de acordo com a reivindicação 151, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 153. RNA crispr de acordo com a reivindicação 151 ou da reivindicação 152, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e 2'-O-Me ou nucleotídeos modificados em 2 '-F nos três últimos nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 154. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindiPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 214/39025/34 cações 137-153, caracterizado pelo fato de que LS1, LS2 e LS6 são modificados com 2'-F.
- 155. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-154, caracterizado pelo fato de que cada nucleotídeo na região de protuberância é modificado com 2'-F.
- 156. RNA crispr (crRNA) caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-F em:a. LS1, LS2 e LS6 na região de haste inferior; eb. cada nucleotídeo na região de protuberância.
- 157. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-156, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 158. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-157, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-0-Me ou 2'-F nos primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e 2'-O- Me ou nucleotídeos 2'-F modificados nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 159. RNA crispr caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-187, incluindo as modificações da Tabela 4.
- 160. RNA crispr caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 19-31, 53-73, 104-130 e 161-187, incluindo as modificações da Tabela 4.
- 161. RNA crispr caracterizado pelo fato de que compreende ácidos nucléicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com qualquer uma das SEQPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 215/39026/34ID Nos: 19- 31, 53-73, 104-130 e 161-187, em que a modificação em cada nucleotídeo do crRNA que corresponde a um nucleotídeo do identificador de sequência de referência na Tabela 4, idêntica ou equivalente modificação mostrada na referência identificador de sequência na Tabela 4.
- 162. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 159-161, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 163. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-162, caracterizado pelo fato de que o RNAr combinado com um RNAt forma um complexo de ribonucleoproteína com uma Cas9 de S. pyogenes.
- 164. RNA tracr (trRNA) caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais modificações dentro de uma ou mais das seguintes regiões:a. os primeiros cinco nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5';b. a região da haste superior;c. a região de protuberância;d. a região de haste inferior;e. a região de nexo;f. a região de grampo 1;g. a região de grampo 2; eh. os últimos cinco nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 165. RNA tracr de acordo com a reivindicação 164, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende umPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 216/39027/34 nucleotídeo modificado com 2'-O-metila (2'-O-Me).
- 166. RNA tracr de acordo com a reivindicação 164 ou da reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende um nucleotídeo modificado com 2'-fluoro (2'F).
- 167. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-166, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma modificação compreende uma ligação de fosforotioato (PS) entre nucleotídeos.
- 168. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-167, caracterizado pelo fato de que os quatro primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' estão ligados a ligações de fosforotioato (PS).
- 169. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-168, caracterizado pelo fato de que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são modificados.
- 170. RNA tracr de acordo com a reivindicação 169, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende 2'-O-Me.
- 171. RNA tracr de acordo com a reivindicação 169, caracterizado pelo fato de que a modificação compreende 2'-F.
- 172. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-171, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem modificações de 2'-O-Me.
- 173. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindiPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 217/39028/34 cações 164-171, caracterizado pelo fato de que os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' são ligados com uma ligação de PS, e em que os primeiros três nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e os últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3' compreendem modificações de 2'-F.
- 174. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-173, caracterizado pelo fato de que cada nucleotídeo na região de haste superior é modificado com 2'-0-Me.
- 175. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-174, caracterizado pelo fato de que B1 e B2 dentro da região de protuberância são modificados com 2'-0-Me.
- 176. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-175, caracterizado pelo fato de que N3, N4, N5, N15, N16, N17 e/ou N18 na região de nexo são modificados com 2'-0-Me.
- 177. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-176, caracterizado pelo fato de que cada nucleotídeo na região de grampo 1 é modificado com 2'-0-Me.
- 178. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-177, caracterizado pelo fato de que cada nucleotídeo na região de grampo 2 é modificado com 2'-O-Me.
- 179. RNA tracr (trRNA) caracterizado pelo fato de que compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me em:a. cada nucleotídeo na haste superior;b. B1 e/ou B2 dentro da região de protuberância;c. N3, N4, N5, N15, N16, N17 e/ou N18 na região de nexo;d. cada nucleotídeo na região de grampo 1; ee. cada nucleotídeo na região de grampo 2.
- 180. RNA tracr de acordo com a reivindicação 179, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações dePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 218/39029/34 fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 181. RNA tracr de acordo com a reivindicação 179 ou da reivindicação 180, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e 2'-O-Me ou ácidos nucleicos modificados em 2'-F nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 182. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-181, caracterizado pelo fato de que N15, N16, N17 e N18 são modificados com 2'-F.
- 183. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-182, caracterizado pelo fato de que LS1, LS3 e LS5 são modificados com 2'-F e LS2, LS4 e LS6 são modificados com 2'-O-Me.
- 184. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-183, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos na extremidade 3'. do terminal 3'.
- 185. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-184, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende nucleotídeos modificados com 2'-O-Me ou 2'-F nos três primeiros nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5', e 2'-O- Me ou nucleotídeos 2'-F modificados nos últimos três nucleotídeos na extremidade 3' do terminal 3'.
- 186. RNA tracr caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 188-227, incluindo as modificações da Tabela 4.Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 219/39030/34
- 187. RNA tracr caracterizado pelo fato de que compreende ácidos nucleicos tendo pelo menos 99, 98, 97, 96, 95, 94, 93, 92, 91, 90, 85, 80, 75 ou 70% de identidade com qualquer uma das SEQ ID Nos: 188- 227, em que a modificação em cada nucleotídeo do trRNA que corresponde a um nucleotídeo do identificador de sequência de referência na Tabela 4, é idêntica ou equivalente à modificação mostrada no identificador de sequência de referência na Tabela 4.
- 188. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações186-187, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende três ligações de fosforotioato (PS) ligando os primeiros quatro nucleotídeos na extremidade 5' do terminal 5' e três ligações de PS ligando os últimos quatro nucleotídeos ao terminal 3'. fim do terminal 3'.
- 189. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-188, caracterizado pelo fato de que o trRNA combinado com um crRNA forma um complexo de ribonucleoproteína com uma Cas9 de S. pyogenes.
- 190. Guia duplo que compreende um crRNA e um trRNA, caracterizado pelo fato de que o crRNA compreende qualquer uma das SEQ ID Nos: 1-187 como representado na Tabela 4, e em que o trRNA compreende os cidos nucleicos de qualquer uma das SEQ ID Nos: 188- 227 como mostrado na Tabela 4.
- 191. Guia duplo caracterizado pelo fato de que compreende um crRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 137163 e um trRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 164-189.
- 192. Guia duplo caracterizado pelo fato de que compreende um crRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 137163 e um trRNA não modificado.
- 193. Guia duplo caracterizado pelo fato de que compreendePetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 220/39031/34 um crRNA não modificado e um trRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 137-189.
- 194. Guia duplo de acordo com qualquer uma das reivindicações 190-193, caracterizado pelo fato de que a guia dual forma um complexo de ribonucleoproteína com uma Cas9 de S. pyogenes.
- 195. Composição de LNP caracterizada pelo fato de que compreende um sgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1-78 e 129-136.
- 196. Composição de LNP caracterizada pelo fato de que compreende um gRNA que compreende ou consiste no RNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1-193.
- 197. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um sgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 178 e 129-136, associado a uma nanopartícula lipídica (LNP).
- 198. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um crRNA como definido em qualquer das reivindicações 137163, associado a uma nanopartícula lipídica (LNP).
- 199. Composição caracterizada pelo fato de que compreende um trRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 164-189, associado a uma nanopartícula lipídica (LNP).
- 200. Composição que compreende o sgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1-78 e 129-136, o gRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 79-128, o crRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 137-163, o trRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 164. -189, o dgRNA de qualquer uma das reivindicações 190-194, ou a composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 195-199, caracterizada pelo fato de que adicionalmente compreende uma nuclease ou um mRNA que codifica a nuclease.
- 201. Composição de acordo com a reivindicação 200, caPetição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 221/39032/34 racterizada pelo fato de que a nuclease é uma proteína Cas.
- 202. Composição de acordo com a reivindicação 201, caracterizada pelo fato de que a proteína Cas é uma Cas9.
- 203. Composição de acordo com a reivindicação 202, caracterizado pelo fato de que a Cas9 é uma Cas9 de S. pyogenes.
- 204. Composição de qualquer uma das reivindicações 200-203, caracterizada pelo fato de que a nuclease é uma nickase.
- 205. Composição de qualquer uma das reivindicações 200-204, caracterizada pelo fato de que a nuclease é modificada.
- 206. Composição de acordo com a reivindicação 205, caracterizada pelo fato de que a nuclease modificada compreende um sinal de localização nuclear (NLS).
- 207. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações 200-206, caracterizada pelo fato de que compreende um mRNA que codifica a nuclease.
- 208. Formulação farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende o sgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1 -78 e 129-136, o gRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 79-128, o crRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 137-163, o trRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 164-189, o dgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 190-194, ou a composição como definida em qualquer uma das reivindicações 195-207 e um veículo farmaceuticamente aceitável.
- 209. Método para modificar um DNA alvo, caracterizado pelo fato de que compreende liberar uma proteína Cas ou um ácido nucleico que codifica uma proteína Cas e qualquer um ou mais dos seguintes, para uma célula:a. sgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 1-78 e 129-136;Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 222/39033/34b. o RNA g como definido em qualquer uma das reivindicações 79-128;c. o gRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 137-163;d. trRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 164-189;e. o dgRNA como definido em qualquer uma das reivindicações 190-194;f. a composição como definido em qualquer uma das reivindicações 195-207; oug. formulação farmacêutica como definido na reivindicação 208.
- 210. Método de acordo com a reivindicação 209, caracterizado pelo fato de que o método resulta em uma inserção ou deleção em um gene.
- 211. Método de acordo com a reivindicação 209, caracterizado pelo fato de que adicionalmente compreende a entrega na célula de um molde, em que pelo menos uma parte do molde incorpora um DNA alvo no em ou próximo a uma quebra de duplo filamento induzida pela proteína Cas.
- 212. RNA guia único de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-78 e 129-136, caracterizado pelo fato de que é para uso na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio.
- 213. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-163, caracterizado pelo fato de que é para uso na preparação de medica para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
- 214. RNA tracr de acordo com qualquer uma das reivindicações 164-189, caracterizado pelo fato de que é para uso na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio.Petição 870190052301, de 04/06/2019, pág. 223/39034/34
- 215. RNA crispr de acordo com qualquer uma das reivindicações 137-163 em combinação com crRNA de qualquer uma das reivindicações 164-189, caracterizado pelo fato de que é para uso na preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio.
- 216. Formulação farmacêutica de acordo com a reivindicação 208, caracterizada pelo fato de que é para uso na preparação de um medicamento para tratar uma doença ou distúrbio.
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