JP7280905B2 - Crisprcpf1の結晶構造 - Google Patents
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Description
本願は、2016年1月22日に出願された米国仮特許出願第62/281,947号明細書及び2016年3月31日に出願された米国仮特許出願第62/316,240号明細書の利益及びそれらに対する優先権を主張する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)から付与された助成金第MH100706号、MH110049及びDK097768に基づく連邦政府の支援を受けて行われた。連邦政府は本発明に一定の権利を有する。
-ダイレクトリピート配列に連結した第1のガイド配列であって、前記第1の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドRNAを含む第1のV型CRISPR-Casポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列;
-ダイレクトリピート配列に連結したガイド配列であって、前記第2の標的配列とハイブリダイズ可能なガイド配列を含む第2のガイドRNAを含む第2のV型CRISPR-Casポリヌクレオチド配列をコードするポリヌクレオチド配列、
及び
-少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、且つ1つ以上の突然変異を含むCpf1エフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド配列、を含み、
転写されると、第1及び第2のガイドRNAが第1及び第2のCRISPR複合体のそれぞれ第1及び第2の標的配列への配列特異的結合を導き、第1のCRISPR複合体は、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列を含む第1のガイドRNAと複合体を形成したCpf1酵素を含み、第2のCRISPR複合体は、第2の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含む第2のガイドRNAと複合体を形成したCpf1酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列はDNA又はRNAであり、及び第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍にDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する。詳細な実施形態において、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍にDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導くと、5’オーバーハングが生じる。詳細な実施形態において、5’オーバーハングは高々200塩基対である。詳細な実施形態において、5’オーバーハングは高々100塩基対、又は高々50塩基対である。詳細な実施形態において、5’オーバーハングは少なくとも26又は少なくとも30塩基対である。詳細な実施形態において、5’オーバーハングは1~100、1~34塩基対又は34~50塩基対である。詳細な実施形態において、5’オーバーハングは少なくとも1、少なくとも10、又は少なくとも15塩基対である。詳細な実施形態において、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍にDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導くと、平滑末端切断が生じる。詳細な実施形態において、Cpf1突然変異はR1226Aである。詳細な実施形態において、本発明は、1つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達することを含む、細胞の目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1及び第2の標的配列の操作によってオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を提供し、このベクターは、I.第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列を含む第1のガイドRNAに作動可能に連結された第1の調節エレメント;II.第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列を含む第2のガイドRNAに作動可能に連結された第2の調節エレメント;及びIII.Cpf1酵素をコードする酵素コード配列に作動可能に連結された第3の調節エレメント、を含み、ここで成分I、II、及びIIIは系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、第1及び第2のガイド配列が第1及び第2のCRISPR複合体のそれぞれ第1及び第2の標的配列への配列特異的結合を導き、第1のCRISPR複合体は、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列を含む第1のガイドRNAと複合体を形成したCpf1酵素を含み、第2のCRISPR複合体は、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列を含む第2のガイドRNAと複合体を形成したCpf1酵素を含み、Cpf1酵素をコードするポリヌクレオチド配列はDNA又はRNAであり、及び第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍にDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それによりオフターゲット改変を最小限に抑えることによって生物又は非ヒト生物を改変する。詳細な実施形態において、本発明は、遺伝子産物をコードする二本鎖DNA分子を含有してそれを発現する細胞に、1つ以上の突然変異を有するCpf1エフェクタータンパク質と、DNA分子のそれぞれ第1の鎖及び第2の鎖を標的とする2つのガイドRNAとを含む、それによってガイドRNAが、遺伝子産物をコードするDNA分子を標的化し、且つCpf1エフェクタータンパク質が、遺伝子産物をコードするDNA分子の第1の鎖及び第2の鎖の各々にニックを入れ、それによって遺伝子産物の発現が変化する;及び、ここでCpf1エフェクタータンパク質と2つのガイドRNAとは天然では一緒に存在しない、エンジニアリングされた、天然に存在しないCRISPR-Cas系を導入することによってオフターゲット改変を最小限に抑えることによって目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を提供する。
I.第1のCpf1ガイドRNAポリヌクレオチド配列であって、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第1のポリヌクレオチド配列;II.第2のCpf1ガイドRNAポリヌクレオチド配列であって、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第2のポリヌクレオチド配列;III.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、且つ1つ以上の突然変異を含むCpf1酵素をコードするポリヌクレオチド配列;及びIV.第1のオーバーハングセットを含む修復鋳型、を含み、転写されると、第1及び第2のガイド配列が第1及び第2のCRISPR複合体のそれぞれ第1及び第2の標的配列への配列特異的結合を導き、第1のCRISPR複合体は、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列を含む第1のガイドRNAと複合体を形成したCpf1酵素を含み、第2のCRISPR複合体は、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列を含む第2のガイドRNAと複合体を形成したCpf1酵素を含み、Cpf1酵素をコードするポリヌクレオチド配列はDNA又はRNAであり、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍にDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて、第2のオーバーハングセットを有する二本鎖切断を誘導し、第1のオーバーハングセットは第2のオーバーハングセットと適合性を有してマッチし、及びライゲーションによって修復鋳型がDNA二重鎖に導入され、それによって生物が改変される。
I.第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第1のポリヌクレオチド;II.第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む第2のポリヌクレオチド;及びIII.Cpf1酵素をコードする配列と1つ以上の核局在化配列とを含む第3のポリヌクレオチド、を含むキット又は組成物であって、第1の標的配列がDNA二重鎖の第1の鎖上にあり、且つ第2の標的配列がDNA二重鎖の逆鎖上にあり、第1及び第2のガイド配列が二重鎖の前記標的配列にハイブリダイズしたとき、第1のポリヌクレオチド及び第2のポリヌクレオチドの5’末端が二重鎖の少なくとも1塩基対だけ互いにオフセットし、及び任意選択で、I、II及びIIIの各々が同じ又は異なるベクターに提供される、キット又は組成物を提供する。本発明は更に、本明細書に記載される方法における本明細書に記載されるとおりのキットの使用に関する。本発明は更に、薬剤として用いられる、より詳細には、標的配列に対応する遺伝子座の欠陥によって引き起こされる疾患の治療又は予防に用いられる本明細書に記載されるとおりの組成物を提供する。
CRISPR-Cpf1の結晶化及び結晶構造の特徴付け:本発明の結晶は、バッチ法、液体架橋法、透析法、蒸気拡散法、及びハンギングドロップ法を含むタンパク質結晶学技術によって得ることができる。一般に、本発明の結晶は、実質的に純粋なCRISPRCpf1及びそれが結合する核酸分子を、沈殿に必要な濃度よりも僅かに低い濃度の沈殿剤を含有する水性緩衝液中に溶解することによって成長させる。沈殿条件が生じるよう制御された蒸発によって水を除去し、結晶の成長が止まるまでこの条件が維持される。
(a)例えば、CRISPR-Cpf1系結合ドメインにおける、又はそれに代えて又は加えて、Cpf1オルソログ間の差異に基づき異なるドメインにおける、実施例3(「結晶構造表」)のCRISPR-Cpf1結晶構造など、CRISPR-Cpf1結晶構造からの又はそれに関連する原子のサブセットの三次元座標を含むデータを、又はCpf1に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、任意選択で1つ又は複数のCRISPR-Cpf1系複合体からの構造情報と共に、プログラミングされたコンピュータに前記入力装置を用いて入力し、それによりデータセットを作成するステップ;
(b)前記プロセッサを使用して、前記コンピュータデータ記憶システムに記憶された構造、例えば、CRISPR-Cpf1系に結合するか若しくは推定上結合する又はそれに結合することが所望される化合物の構造のコンピュータデータベースと、又はCpf1オルソログに関して(例えば、Cpf1として又はCpf1オルソログ間で異なるドメイン又は領域に関して)又は実施例3(「結晶構造表」)のCRISPR-Cpf1結晶構造など、CRISPR-Cpf1結晶構造に関して又はニッカーゼに関して又は機能性基に関して、前記データセットを比較するステップ;
(c)コンピュータ方法を用いて、1つ又は複数の構造-例えば、所望の構造に結合し得るCRISPR-Cpf1構造、特定のCRISPR-Cpf1構造に結合し得る所望の構造、CRISPR-Cpf1結晶構造の他の部分からのデータ及び/又はCpf1オルソログからのデータに例えば基づき操作され得るCRISPR-Cpf1系の一部分、トランケート型Cpf1、新規ニッカーゼ又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基-CRISPR-Cpf1系を前記データベースから選択するステップ;
(d)コンピュータ方法を用いて、選択された1つ又は複数の構造のモデルを構築するステップ;及び
(e)選択された1つ又は複数の構造を前記出力装置に出力するステップ;
及び任意選択で、選択された構造のうちの1つ以上を合成するステップ;
及び更に任意選択で、前記合成された選択の1つ又は複数の構造をCRISPR-Cpf1系として又はそれにおいて試験するステップを含み;又は、前記方法は、実施例3(「結晶構造表」)のCRISPR-Cpf1結晶構造など、CRISPR-Cpf1結晶構造の少なくとも2つの原子、例えば、CRISPR-Cpf1結晶構造の結晶構造表の少なくとも2つの原子の座標又はCRISPR-Cpf1結晶構造の少なくともサブドメインの座標(「選択の座標」)を提供するステップ、結合分子を含む候補の構造又は例えば、CRISPR-Cpf1結晶構造の他の部分からのデータ及び/又はCpf1オルソログからのデータに基づき操作され得るCRISPR-Cpf1系の一部分の構造、又は機能性基の構造を提供するステップ、及び候補の構造を選択の座標にフィッティングし、それにより所望の構造に結合し得るCRISPR-Cpf1構造、特定のCRISPR-Cpf1構造に結合し得る所望の構造、操作され得るCRISPR-Cpf1系の一部分、トランケート型Cpf1、新規ニッカーゼ、又は特定の機能性基、又は機能性基を付加する位置又は機能性基-CRISPR-Cpf1系を含む生成物データを、その出力と共に入手するステップ;及び任意選択で、前記生成物データから1つ又は複数の化合物を合成するステップを含み、及び更に任意選択で、前記合成された1つ又は複数の化合物をCRISPR-Cpf1系として又はそれにおいて試験するステップを含む。
Zetsche et al.(2015)が、Cpf1の個別的な領域について記載している。第一にC末端RuvC様ドメイン、これは唯一機能的に特徴付けられたドメインである。第二にN末端α-ヘリックス領域、及び第三に、RuvC様ドメインとα-ヘリックス領域との間に位置する混合α及びβ領域。
高分子結晶構造における秩序が低い領域(限定はされないが、ディスオーダー領域又は非構造化領域を含む)、特にタンパク質の溶媒露出領域内にある秩序が低い領域(限定はされないがループを含む)は、構造又は機能を容認し難いほど不安定化させることなく改変し得る領域を示す。B因子、温度因子、熱因子、デバイ・ワラー因子、原子変位パラメータ及び類似の用語は、結晶構造における(例えば、温度依存性原子振動又は結晶格子における静的ディスオーダーの結果としての)その平均位置からの原子の変位の指標となる値に関する。従ってタンパク質の溶媒露出領域の骨格原子の平均より高いB因子は、局所移動度が比較的高い領域又はタンパク質構造若しくは機能を容認し難いほど不安定化させることなく改変し得る領域の指標となる。従って、本明細書に記載されるCpf1酵素の特定のものにおいて、Cpf1酵素は、全タンパク質又は溶媒露出領域を含むタンパク質ドメインと比較して平均より高いB因子を持つ1つ以上の骨格原子を有する溶媒露出領域で1つ以上の置換、挿入、欠失又は他の改変によって改変される。Cpf1酵素の特定のものにおいて、酵素は、1つ以上の残基を含むタンパク質の平均B因子と比べて50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%、又は200%超高いB因子を持つCα原子を有する前記1つ以上の残基で改変される。Cpf1酵素の特定のものにおいて、酵素は、1つ以上の残基を含むタンパク質ドメイン(例えばC末端RuvC様ドメイン、N末端αヘリックス領域、又は前記N末端ドメインとC末端ドメインとの間のα及びβ混合領域)の平均B因子と比べて50%、60%、70%、80%、90%、100%、110%、120%、130%、140%、150%、160%、170%、180%、190%、200%又は200%超高いB因子を持つCα原子を有する前記残基で改変される。Cpf1酵素の特定のものにおいて、酵素は、AsCpf1(アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6)のアミノ酸位置付番を基準として、L117、T118、D119、T150、T151、T152、R341、N342、E343、T398、G399、K400、D451、Q452、P453、L454、P455、T456、T457、L458、K459、V486、D487、E488、S489、N490、E491、V492、D493、P494、E506、M507、E508、Q571、K572、G573、R574、Y575、T621、E649、K650、E651、D665、T737、D749、F750、K815、N848、V1108、K1109、T1110、G1111、S1124、A1195、A1196、A1197、N1198、L1244、N1245及び/又はG1246において1つ以上の置換、挿入、欠失又は他の改変によって改変される。
Cpf1タンパク質がヌクレアーゼ活性を有する場合、Cpf1タンパク質は、低下したヌクレアーゼ活性、例えば、野生型酵素と比較したとき少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、又は100%のヌクレアーゼ不活性化を有するように改変することができ;又は別の言い方をすれば、Cpf1酵素は有利には、非突然変異型又は野生型Cpf1酵素又はCRISPR酵素の約0%のヌクレアーゼ活性、又は非突然変異型又は野生型Cpf1酵素、例えば非突然変異型又は野生型アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6(AsCpf1)Cpf1酵素又はCRISPR酵素の約3%又は約5%又は約10%以下のヌクレアーゼ活性を有する。これは、Cpf1及びそのオルソログのヌクレアーゼドメインに突然変異を導入することによって可能である。
従って、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質-ガイドRNA複合体が全体として2つ以上の機能性ドメインと会合し得ることもまた想定される。例えば、核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した2つ以上の機能性ドメインがあってもよく、又はガイドRNAと(1つ以上のアダプタータンパク質を介して)会合した2つ以上の機能性ドメインがあってもよく、又は核酸ターゲティングエフェクタータンパク質と会合した1つ以上の機能性ドメイン及びガイドRNAと(1つ以上のアダプタータンパク質を介して)会合した1つ以上の機能性ドメインがあってもよい。
一態様において、本発明は、オフターゲット効果の低下をもたらす1つ以上の突然変異を有する本明細書に記載されるとおりの天然に存在しない又はエンジニアリングされたCRISPR酵素、好ましくはクラス2 CRISPR酵素、好ましくはV型又はVI型CRISPR酵素、例えば好ましくは、限定はされないが、本明細書の他の部分に記載されるとおりのCpf1、即ち、標的遺伝子座に改変を生じさせるのに用いられるが、しかしガイドRNAと複合体化したときなどの、オフターゲットに向けた活性は低下又は消失させる改良されたCRISPR酵素、並びにガイドRNAと複合体を形成したときなどの、CRISPR酵素の活性を増加させるための改良されたCRISPR酵素を提供する。本明細書において以下に記載するとおりの突然変異酵素は、本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係る方法のいずれにおいても用いられ得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、産物、組成物及び使用のいずれも、同様に以下に更に詳述するとおりの突然変異CRISPR酵素に適用可能である。本明細書に記載されるとおりの態様及び実施形態において、Cpf1をCRISPR酵素として参照するとき又は読めるとき、機能性CRISPR-Cas系の再構成は、好ましくはtracr配列を必要とせず又はそれに依存せず、及び/又はダイレクトリピートはガイド(標的又はスペーサー)配列の5’(上流)側にあることが理解されるべきである。
a)本明細書に定義するとおりのエンジニアリングされたCRISPRタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント;及び任意選択で、
b)ガイド配列、ダイレクトリピート配列を含むガイドRNAを含む1つ以上の核酸分子をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2の調節エレメントを含み、任意選択で構成成分(a)及び(b)は同じ又は異なるベクターに位置する。
CRISPR-Cas複合体構成成分又は前記構成成分を含むか若しくはそれをコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列を細胞に送達するように作動可能に構成された送達系であって、前記CRISPR-Cas複合体は細胞において作動可能である、送達系
を含む天然に存在しないエンジニアリングされた組成物も提供し、
CRISPR-Cas複合体構成成分又は細胞における転写及び/又は翻訳のためCRISPR-Cas複合体構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド配列は、
(I)本明細書に記載の天然に存在しないCRISPR酵素(例えば、エンジニアリングされたCpf1);
(II)以下を含むCRISPR-CasガイドRNA:
ガイド配列、
ダイレクトリピート配列、
を含み、ここで:
CRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び/又はそれによってCRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
a)本明細書における本発明の構築物のいずれか1つの天然に存在しないCRISPR酵素をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された第1の調節エレメント;及び
b)ガイドRNAの1つ以上をコードする1つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に連結された第2の調節エレメントであって、ガイドRNAがガイド配列とダイレクトリピート配列とを含む、第2の調節エレメント、
を含む1つ以上のベクターを含む、エンジニアリングされた天然に存在しないクラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復(CRISPR)-CRISPR関連(Cas)(CRISPR-Cas)ベクター系も提供し、ここで:
構成成分(a)及び(b)は同じ又は異なるベクター上に位置し、
CRISPR複合体が形成され;
ガイドRNAが標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的化し、酵素がポリヌクレオチド遺伝子座を変化させ、及び
CRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上のオフターゲット遺伝子座を改変する能力が低下し、及び/又はそれによってCRISPR複合体内の酵素は非改変酵素と比較したとき1つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が増加する。
I.CRISPR-Cas系ガイドRNA(gRNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)HSC内の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
(b)ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
II.任意選択で少なくとも1つ以上の核局在化配列を含む、CRISPR酵素、
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を、例えばそれを含有する粒子にHSCを接触させることによって、HSCに送達するステップを含み、
ここで、ガイド配列は標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導き、及び
ここでCRISPR複合体は、(1)標的配列にハイブリダイズするガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、
及び本方法は、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させる粒子を介して、HDR鋳型を送達するステップもまた含み、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってもよく;任意選択で本方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でHSC集団を拡大するステップ、1つ又は複数の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変されたHSCの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変されたHSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
I.第1のCRISPR-Cas(例えば、Cpf1)系RNA(RNA)ポリヌクレオチド配列であって、
(a)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、
(b)第1のダイレクトリピート配列、及び
を含む第1のポリヌクレオチド配列、
II.第2のCRISPR-Cas(例えば、Cpf1)系ガイドRNAポリヌクレオチド配列であって、
(a)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、
(b)第2のダイレクトリピート配列、及び
を含む第2のポリヌクレオチド配列、及び
III.少なくとも1つ以上の核局在化配列を含み、且つ1つ以上の突然変異を含むCRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列[(a)、(b)及び(c)は5’から3’への方向に並ぶ];又は
IV.I.~III.の1つ以上の1つ又は複数の発現産物、例えば第1及び第2のダイレクトリピート配列、CRISPR酵素;
[転写されると、第1及び第2のガイド配列がそれぞれ第1及び第2のCRISPR複合体と第1及び第2の標的配列との配列特異的結合を誘導し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNA又はRNAであり、及び第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する]を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む粒子をHSCに接触させることによる送達するステップを含む、HSCの目的のゲノム遺伝子座であって、例えば異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1及び第2の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、;及びこの方法は、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく;及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でこのHSC集団を拡大するステップ、1つ以上の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変HSCの集団を拡大するステップを含み、及び任意選択で改変HSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップとを含む、前記ゲノム遺伝子座のコードエレメント、非コードエレメント又は調節エレメント内の標的配列の操作を含む方法。本発明の一部の方法において、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第1及び第2のガイド配列、第1及び第2のダイレクトリピート配列の一部又は全部がRNAである。本発明のさらなる実施形態において、CRISPR酵素をコードする配列、第1及び第2のガイド配列、第1及び第2のダイレクトリピート配列をコードするポリヌクレオチドはRNAであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される;しかし、送達は粒子によることが有利である。本発明の特定の実施形態において、第1及び第2のダイレクトリピートは100%の同一性を共有する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、1つ以上のベクターを含むベクター系内に含まれ得る。好ましい実施形態において、第1のCRISPR酵素は、その酵素が相補鎖ニッキング酵素となるような1つ以上の突然変異を有し、第2のCRISPR酵素は、その酵素が非相補鎖ニッキング酵素となるような1つ以上の突然変異を有する。或いは、第1の酵素が非相補鎖ニッキング酵素であってもよく、及び第2の酵素が相補鎖ニッキング酵素であってもよい。本発明の好ましい方法において、第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導することにより、5’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態において、5’オーバーハングは高々200塩基対、好ましくは高々100塩基対、又はより好ましくは高々50塩基対である。本発明の実施形態において、5’オーバーハングは少なくとも26塩基対、好ましくは少なくとも30塩基対、又はより好ましくは34~50塩基対である。
I.第1の調節エレメントであって、
(a)第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、及び
(b)少なくとも1つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第1の調節エレメント、
II.第2の調節エレメントであって、
(a)第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、及び
(b)少なくとも1つ以上のダイレクトリピート配列
に機能的に連結している第2の調節エレメント、
III.CRISPR酵素(例えば、Cpf1)をコードする酵素コード配列に機能的に連結している第3の調節エレメント、及び
V.I.~IV.の1つ以上の1つ又は複数の発現産物、例えば第1及び第2のダイレクトリピート配列、CRISPR酵素;
[転写されると、構成成分I、II、III及びIVが系の同じ又は異なるベクターに位置し、且つ第1及び第2のガイド配列がそれぞれ第1及び第2の標的配列に対する第1及び第2のCRISPR複合体の配列特異的結合を誘導し、第1のCRISPR複合体が、(1)第1の標的配列にハイブリダイズする第1のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、第2のCRISPR複合体が、(1)第2の標的配列にハイブリダイズする第2のガイド配列と複合体を形成したCRISPR酵素を含み、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列がDNA又はRNAであり、及び第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍でDNA二重鎖の一方の鎖の切断を誘導し、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍で他方の鎖の切断を誘導して二本鎖切断を生じさせ、それにより生物又は非ヒト生物を改変する]を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を含む1つ以上の粒子をHSCに接触させることにより送達するステップを含む、例えばHSCの目的のゲノム遺伝子座であって、異常タンパク質発現又は疾患条件若しくは状態に関連する突然変異に関連する目的のゲノム遺伝子座におけるDNA二重鎖の逆鎖上にある第1及び第2の標的配列の操作によって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し;及びこの方法は、任意選択で、例えば、HDR鋳型を含有するHSCと接触する粒子を介するか、又はHDR鋳型を含有する別の粒子にHSCを接触させることにより、HDR鋳型を送達するステップもまた含むことができ、ここでHDR鋳型は正常型又は低度異常型のタンパク質の発現をもたらし;「正常」は野生型に関するものであり、及び「異常」は病態又は疾患状態を引き起こすタンパク質発現であってよく;及び任意選択でこの方法は、生物又は非ヒト生物からHSCを単離又は入手するステップ、任意選択でこのHSC集団を拡大するステップ、1つ以上の粒子とHSCとの接触を実施して改変されたHSC集団を入手するステップ、任意選択で改変HSCの集団を拡大するステップ、及び任意選択で改変HSCを生物又は非ヒト生物に投与するステップを含み得る。
二本鎖切断点又は鎖のうちの一方における一本鎖切断点は、有利には、修正が起こるように標的位置に十分に近くなければならない。ある実施形態において、その距離は50、100、200、300、350又は400ヌクレオチド以下である。理論によって拘束されることを望むものではないが、切断点が標的位置に十分に近く、末端リセクションの間にエキソヌクレアーゼの媒介による除去を受ける領域内に切断点がなければならないと考えられる。鋳型核酸配列は末端リセクション領域内の配列の修正にのみ用いられ得るため、標的位置と切断点との間の距離が大き過ぎる場合、末端リセクションに突然変異が含まれないことになり得るとともに、ひいては修正されないことになり得る。
遺伝子をDNAレベルで突然変異させることにより発現を永久的に消失させるCRISPR-Cas媒介性遺伝子ノックアウトと異なり、CRISPR-Casノックダウンは人工転写因子を用いて遺伝子発現を一時的に低下させることが可能である。AsCpf1タンパク質によるD908A、E993A、D1263Aなど、Cpf1タンパク質の両方のDNA切断ドメインにある鍵となる残基を突然変異させると、触媒的に不活性なCpf1が生成される。触媒的に不活性なCpf1はガイドRNAと複合体を形成し、当該のガイドRNAのターゲティングドメインによって特定されるDNA配列に局在化するが、しかしながら、これは標的DNAを切断しない。AsCpf1タンパク質など、不活性Cpf1タンパク質をエフェクタードメイン、例えば転写抑制ドメインと融合させると、ガイドRNAによって特定される任意のDNA部位へとそのエフェクターをリクルートすることが可能になる。特定の実施形態において、Cpf1を転写抑制ドメインに融合させて遺伝子のプロモーター領域にリクルートしてもよい。特に遺伝子抑制について、本明細書では、内因性転写因子の結合部位を遮断すれば、遺伝子発現を下方制御する助けとなり得ることが企図される。別の実施形態において、不活性Cpf1をクロマチン修飾タンパク質と融合させてもよい。クロマチン状態が変化すると、標的遺伝子の発現の低下が起こり得る。
本開示及び当該技術分野における知識から、CRISPR-Cas系、特に本明細書に記載される新規CRISPR系、又はその構成成分又はその核酸分子(例えばHDR鋳型を含む)又はその構成成分をコードし又は提供する核酸分子は、本明細書に概略的にも詳細にも記載される送達系によって送達し得る。
インビボでのゲノム改変を媒介するため、本発明のCpf1をコードする核酸分子、例えばDNAをベクター、例えばウイルスベクターにパッケージングする方法としては、以下が挙げられる:
・NHEJ媒介遺伝子ノックアウトを達成するため:
・シングルウイルスベクター:
・2つ以上の発現カセットを含むベクター:
・プロモーター-Cpf1コード核酸分子-ターミネーター
・プロモーター-gRNA1-ターミネーター
・プロモーター-gRNA2-ターミネーター
・プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界まで)
・ダブルウイルスベクター:
・Cpf1の発現をドライブするための1つの発現カセットを含むベクター1
・プロモーター-Cpf1コード核酸分子-ターミネーター
・1つ以上のガイドRNAの発現をドライブするためのもう1つの発現カセットを含むベクター2
・プロモーター-gRNA1-ターミネーター
・プロモーター-gRNA(N)-ターミネーター(ベクターのサイズ限界まで)
・相同依存性修復を媒介するため。
・上記に記載されるシングル及びダブルウイルスベクター手法に加えて、相同依存性修復鋳型の送達のため更なるベクターを使用することができる。
-AAV ITRはプロモーターとして役立ち得る:これは、追加のプロモーターエレメント(ベクター内で場所をとり得る)の必要性がなくなる点で有利である。空いた追加の空間を使用して、追加のエレメント(gRNAなど)の発現をドライブすることができる。また、ITR活性は比較的弱いため、Cpf1の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。
-偏在発現には、使用し得るプロモーターとしては、CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、フェリチン重鎖又は軽鎖等が挙げられる。
-U6又はH1などのPol IIIプロモーター
-gRNAを発現させるためのPol IIプロモーター及びイントロンカセットの使用。
Cpf1及び1つ以上のガイドRNAは、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス、アデノウイルス又は他のプラスミド又はウイルスベクタータイプを使用して、詳細には、例えば、米国特許第8,454,972号明細書(アデノウイルス用の製剤、用量)、同第8,404,658号明細書(AAV用の製剤、用量)及び同第5,846,946号明細書(DNAプラスミド用の製剤、用量)並びにレンチウイルス、AAV及びアデノウイルスが関わる臨床試験及びそのような臨床試験に関する刊行物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、AAVについて、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,454,972号明細書及びAAVが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。アデノウイルスについては、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第8,404,658号明細書及びアデノウイルスが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。プラスミド送達については、投与経路、製剤及び用量は、米国特許第5,846,946号明細書及びプラスミドが関わる臨床試験にあるとおりであってもよい。用量は、平均70kgの個体(例えば男性成人ヒト)に基づくか、又はそれに当てはめてもよく、異なる体重及び種の患者、対象、哺乳動物用に調整することができる。投与頻度は、患者又は対象の年齢、性別、全般的な健康、他の条件並びに対処される特定の状態又は症状を含めた通常の要因に応じて、医学又は獣医学実務者(例えば、医師、獣医師)の範囲内である。ウイルスベクターは、目的の組織に注射することができる。細胞型特異的ゲノム改変について、Cpf1の発現は細胞型特異的プロモーターによってドライブすることができる。例えば、肝臓特異的発現にはアルブミンプロモーターが用いられてもよく、及びニューロン特異的発現には(例えばCNS障害を標的化するため)シナプシンIプロモーターが用いられてもよい。
低毒性(これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心が不要な精製方法に起因し得る)及び
宿主ゲノムに組み込まれないため、挿入突然変異誘発を引き起こす確率の低さ。
レンチウイルスは、有糸分裂細胞及び分裂終了細胞の両方でその遺伝子の感染能及び発現能を有する複合的レトロウイルスである。最も一般的には、公知のレンチウイルスはヒト免疫不全ウイルス(HIV)であり、これは他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を用いて広範囲の細胞型を標的化する。
RNA送達:CRISPR酵素、例えばCpf1、及び/又は本RNAのいずれか、例えばガイドRNAはまた、RNAの形態で送達することもできる。Cpf1 mRNAはインビトロ転写を用いて作成することができる。例えば、Cpf1 mRNAは、以下のエレメント:βグロビン-ポリAテール(120以上の一連のアデニン)由来のT7_プロモーター-コザック配列(GCCACC)-Cpf1-3’UTRを含有するPCRカセットを用いて合成することができる。このカセットは、T7ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドRNAはまた、T7_プロモーター-GG-ガイドRNA配列を含有するカセットからのインビトロ転写を用いて転写することもできる。
幾つかのタイプの粒子送達系及び/又は製剤が、多様な生物医学的適用において有用であることが知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性の点で一単位として挙動する小さい物体として定義される。粒子は、更に直径に基づき分類される。粗粒子は2,500~10,000ナノメートルの範囲を包含する。微粒子は100~2,500ナノメートルのサイズを有する。超微粒子、又はナノ粒子は、概して1~100ナノメートルのサイズである。100nm限度の基準は、粒子をバルク材料と区別する新規特性が典型的には100nm未満の臨界長さスケールで生じるという事実である。
適切な場合、本明細書における粒子又はナノ粒子への言及は同義的であり得ることが理解されるであろう。CRISPR酵素mRNA及びガイドRNAは、粒子又は脂質エンベロープを使用して同時に送達し得る;例えば、本発明のCRISPR酵素及びRNA(例えば複合体としての)は、7C1など、Dahlman et al.,国際公開第2015089419 A2号パンフレット及びその引用文献にあるとおりの粒子によって送達することができ(例えば、James E.Dahlman and Carmen Barnes et al.Nature Nanotechnology(2014)published online 11 May 2014,doi:10.1038/nnano.2014.84を参照)、例えば、送達粒子は脂質又はリピドイド及び親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質及び親水性ポリマーを含み、例えばカチオン性脂質には、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)又は1,2-ジテトラデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DMPC)が含まれ、及び/又は親水性ポリマーには、エチレングリコール又はポリエチレングリコール(PEG)が含まれ;及び/又は粒子は、コレステロール(例えば、製剤1=DOTAP 100、DMPC 0、PEG 0、コレステロール 0;製剤番号2=DOTAP 90、DMPC 0、PEG 10、コレステロール 0;製剤番号3=DOTAP 90、DMPC 0、PEG 5、コレステロール 5からの粒子)を更に含み、粒子は効率的な多段階プロセスを用いて形成され、ここでは初めに、エフェクタータンパク質及びRNAを、例えば1:1モル比で、例えば室温で、例えば30分間、例えば無菌ヌクレアーゼフリー1×PBS中において共に混合し;及びそれとは別に、製剤に適用し得るとおりDOTAP、DMPC、PEG、及びコレステロールをアルコール、例えば100%エタノール中に溶解し;及び、これらの2つの溶液を共に混合して、複合体を含有する粒子を形成する)。
エキソソームは、RNA及びタンパク質を輸送する内因性のナノ小胞であり、これはRNAを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低下させるため、Alvarez-Erviti et al.(2011,Nat Biotechnol 29:341)はエキソソーム産生に自己由来の樹状細胞を使用した。ニューロン特異的RVGペプチドに融合したエキソソーム膜タンパク質Lamp2bを発現するように樹状細胞をエンジニアリングすることにより、脳への標的化が達成された。精製エキソソームに電気穿孔によって外因性RNAが負荷された。静脈内注射されるRVG標的化エキソソームが、GAPDH siRNAを脳内のニューロン、ミクログリア、オリゴデンドロサイトに特異的に送達し、特異的遺伝子ノックダウンが得られた。RVGエキソソームに予め曝露してもノックダウンは減弱しなかったとともに、他の組織における非特異的取込みは観察されなかった。アルツハイマー病の治療標的であるBACE1の強力なmRNA(60%)及びタンパク質(62%)ノックダウンによって、エキソソーム媒介siRNA送達の治療可能性が実証された。
本発明に係る送達又は投与は、リポソームで実施することができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲む単層又は多重膜脂質二重層及び比較的不透過性の外側の親油性リン脂質二重層からなる球形の小胞構造である。リポソームは、生体適合性であり、非毒性であり、親水性及び親油性の両方の薬物分子を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、且つ生体膜及び血液脳関門(BBB)を越えてそのロードを輸送するため、薬物送達担体として大いに注目を集めてきた(例えば、レビューについては、Spuch and Navarro,Journal of Drug Delivery,vol.2011,Article ID 469679,12 pages,2011.doi:10.1155/2011/469679を参照のこと)。
アミノ脂質2,2-ジリノレイル-4-ジメチルアミノエチル-[1,3]-ジオキソラン(DLin-KC2-DMA)などの他のカチオン性脂質を利用して、例えばSiRNAと同様に、CRISPR Cas又はその構成成分又はそれをコードする1つ又は複数の核酸分子を封入してもよく(例えば、Jayaraman,Angew.Chem.Int.Ed.2012,51,8529-8533を参照)、従って本発明の実施に用い得る。以下の脂質組成を有する予め形成された小胞が企図され得る:アミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール及び(R)-2,3-ビス(オクタデシルオキシ)プロピル-1-(メトキシポリ(エチレングリコール)2000)プロピルカルバメート(PEG-脂質)、それぞれモル比40/10/40/10、及び約0.05(w/w)のFVII siRNA/総脂質比。70~90nmの範囲の狭い粒径分布及び0.11±0.04の低い多分散性指数(n=56)が確実となるように、粒子を最大3回まで80nm膜で押し出し、その後ガイドRNAに加えた。極めて強力なアミノ脂質16を含有する粒子を使用してもよく、ここで4つの脂質構成成分16、DSPC、コレステロール及びPEG-脂質のモル比(50/10/38.5/1.5)はインビボ活性を増強させるため更に最適化され得る。
超荷電タンパク質は、異常に高い理論上の正味正電荷又は負電荷を有するエンジニアリングされた又は天然に存在するタンパク質の一クラスであり、1つ又は複数のCRISPR Cas系又はその1つ又は複数の構成成分又はそれをコードする1つ又は複数の核酸分子の送達に用いられ得る。超負電荷及び超正電荷の両方のタンパク質とも、熱的又は化学的に誘導される凝集に耐える著しい能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳類細胞に侵入することも可能である。プラスミドDNA、RNA、又は他のタンパク質など、これらのタンパク質と関連付けるカーゴが、インビトロ及びインビボの両方でこれらの巨大分子を哺乳類細胞に機能的に送達することを可能にし得る。David Liuの研究室は、2007年に超荷電タンパク質の作成及び特徴付けを報告した(Lawrence et al.,2007,Journal of the American Chemical Society 129,10110-10112)。
更に別の実施形態において、CRISPR Cas系の送達に細胞透過性ペプチド(CPP)が企図される。CPPは、(ナノサイズ粒子から化学的小分子及び大型DNA断片に至るまでの)様々な分子カーゴの細胞取込みを促進する短鎖ペプチドである。用語「カーゴ」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、治療剤、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子を含めた粒子、リポソーム、発色団、小分子及び放射性物質からなる群を含む。本発明の態様では、カーゴにはまた、CRISPR Cas系の任意の構成成分又は機能性CRISPR Cas系全体も含まれ得る。本発明の態様は、所望のカーゴを対象に送達する方法を更に提供し、この方法は、(a)本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴとを含む複合体を調製するステップ、及び(b)複合体を対象に経口的に、関節内に、腹腔内に、くも膜下腔内に、動脈内に(intrarterially)、鼻腔内に、実質内に、皮下に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、又は局所的に投与するステップを含む。カーゴは、共有結合を介した化学的連結によるか、又は非共有結合性の相互作用によるかのいずれかでペプチドと会合している。
別の実施形態において、植込み型デバイスもまた、CRISPR Cas系又はその1つ又は複数の構成成分又はそれをコードする1つ又は複数の核酸分子の送達に企図される。例えば、米国特許出願公開第20110195123号明細書は、薬物を局所的に長時間溶出する植込み型医療器具を、幾つかのタイプのかかるデバイス、治療の実施態様及び植え込み方法を含めて開示しており、それが提供される。デバイスは、例えばデバイス本体として用いられるマトリックスなどのポリマー基質、及び薬物、及び場合によっては金属又は更なるポリマーなどの追加的な足場材料、及び可視性及びイメージングを増強する材料を含む。植込み型送達デバイスは局所的な長期間にわたる放出を提供するのに有利であってよく、ここで薬物は、腫瘍、炎症、変性などの罹患範囲の細胞外マトリックス(ECM)に直接又は症候性の対象のため、又は損傷した平滑筋細胞に、又は予防のため放出される。薬物の一種は上記に開示されるとおりRNAであり、このシステムは本発明のCRISPR Cas系に使用及び/又は応用することができる。一部の実施形態において植え込み方法は、小線源照射療法及び針生検を含め、現在他の治療向けに開発及び使用されている既存の植え込み手技である。そのような場合、この発明に記載される新規インプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、同じ治療手技中に数個のデバイスが植え込まれる。
DNA、例えばトリヌクレオチドリピートを標的とする核酸ターゲティング系を使用して、かかるリピートの存在に関して患者又は患者の試料をスクリーニングすることができる。このリピートは核酸ターゲティング系のRNAの標的であることができ、その核酸ターゲティング系によるこのリピートへの結合がある場合、当該の結合を検出して、それによりかかるリピートの存在を示すことができる。従って、核酸ターゲティング系を使用して、リピートの存在に関して患者又は患者試料をスクリーニングすることができる。次に、患者に好適な1つ又は複数の化合物を投与して状態に対応し得る;又は、核酸ターゲティング系を投与して結合させ、挿入、欠失、又は突然変異を生じさせて、状態を緩和し得る。
CRISPR酵素mRNA及びガイドRNAはまた、別々に送達されてもよい。CRISPR酵素に発現する時間を与えるため、CRISPR酵素mRNAをガイドRNAより先に送達してもよい。CRISPR酵素mRNAはガイドRNA投与の1~12時間前(好ましくは約2~6時間前)に投与されてもよい。
一部の実施形態では、CRISPR酵素は誘導性系の一成分を形成し得る。この系の誘導可能な性質により、エネルギーの形態を用いた遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間的制御が可能となり得る。エネルギーの形態としては、限定はされないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター(Tet-On又はTet-Off)、小分子2ハイブリッド転写活性化システム(FKBP、ABA等)、又は光誘導性系(フィトクロム、LOVドメイン、又はクリプトクロム)が含まれる。一実施形態において、CRISPR酵素は、配列特異的に転写活性の変化を導く光誘導性転写エフェクター(LITE)の一部であり得る。光の構成成分には、CRISPR酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体(例えばシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)由来)、及び転写活性化/抑制ドメインが含まれ得る。誘導性DNA結合タンパク質及びその使用方法の更なる例は、米国仮特許出願第61/736,465号明細書及び米国仮特許出願第61/721,283号明細書、及び国際公開第2014/018423 A2号パンフレット及びUS8889418、US8895308、US20140186919、US20140242700、US20140273234、US20140335620、WO2014093635(本明細書によって全体として参照により援用される)に提供される。
一態様において、本発明は、少なくとも1つの不安定化ドメイン(DD)と会合した、本明細書の他の部分に記載されるとおりのCpf1を提供し;及び、簡略にするため、少なくとも1つの不安定化ドメイン(DD)と会合したかかるCRISPR酵素は、本明細書では「DD-CRISPR酵素」と称する。本明細書の他の部分に記載されるとおりの本発明に係るCRISPR酵素のいずれも、本明細書において以下に記載するとおりの不安定化ドメインを有する又はそれと会合したものとして使用し得ることが理解されるべきである。本明細書の他の部分に記載されるとおりの方法、生成物、組成物及び使用のいずれも、以下に更に詳述するとおりの不安定化ドメインと会合したCRISPR酵素に等しく適用可能である。本明細書に記載されるとおりの態様及び実施形態において、Cpf1をCRISPR酵素と称する又はそのように読む場合、機能性CRISPR-Cas系の再構成は好ましくは不要であり、又はtracr配列に依存せず、及び/又はダイレクトリピートはガイド(標的又はスペーサー)配列の5’側(上流側)にあることが理解されるべきである。
・用量調整可能であること(例えばオン・オフを切り替える系と対照的、可変的なCRISPR-Cas系又は複合体活性を実現することができる)。
・直交性であること、例えば、リガンドがそのコグネイトDDにのみ影響を及ぼすため、2つ以上の系を独立に操作することができ、及び/又はCRISPR酵素が1つ以上のオルソログに由来することができる。
・輸送可能であること、例えば、種々の細胞型又は細胞株で機能し得る。
・高速であること。
・時間的制御性があること。
・Casの分解が可能であることにより、バックグラウンド又はオフターゲットCas又はCas毒性又は過剰なCas蓄積を低減可能であること。
- 例えばインビボでの、自然のプロセシング(例えばプロテアソーム分解);
- 例えばエキソビボ/細胞培養下、以下によるモップアップ:
- 好ましい結合パートナーの提供;又は
- XS基質(Casを伴わないDD)の提供
によって除去し得る。
本発明者らは、本明細書に定義するとおりのCRISPR酵素が活性を失うことなく2つ以上のRNAガイドを利用し得ることを明らかにしている。これにより、本明細書に定義するとおりのCRISPR酵素、系又は複合体を使用した複数のDNA標的、遺伝子又は遺伝子座のターゲティングが、本明細書に定義するとおりの単一の酵素、系又は複合体によって可能となる。ガイドRNAはタンデムに配置されてもよく、任意選択で本明細書に定義するとおりのダイレクトリピートなどのヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。これらの異なるガイドRNAの位置はタンデムであり、活性に影響を及ぼさない。
I.2つ以上のCRISPR-Cas系ポリヌクレオチド配列であって、
(a)ポリヌクレオチド遺伝子座における第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、
(b)ポリヌクレオチド遺伝子座における第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、
(c)ダイレクトリピート配列、を含むポリヌクレオチド配列、
及び
II.Cpf1酵素又はそれをコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、
転写されると、第1及び第2のガイド配列が第1及び第2のCpf1 CRISPR複合体のそれぞれ第1及び第2の標的配列への配列特異的結合を導き、
第1のCRISPR複合体が、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列と複合体を形成したCpf1酵素を含み、
第2のCRISPR複合体が、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列と複合体を形成したCpf1酵素を含み、及び
第1のガイド配列が第1の標的配列の近傍にDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列の近傍に他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断を誘導し、それにより生物又は非ヒト又は非動物生物が改変される、組成物が提供される。同様に、例えば各1つの標的に特異的な、且つ本明細書に記載されるとおりの組成物又はCRISPR系若しくは複合体中でタンデムに配置された、3つ以上のガイドRNAを含む組成物を想定することができる。
細胞内のゲノムにおける遺伝子の全てのコピーが編集された後は、それ以上当該細胞においてCRISRP/Cpf1p発現が続行する必要はない。実際、発現が持続すれば、意図しないゲノム部位でオフターゲット効果が起こる場合等、望ましくないこともある。従って時限的発現が有用となり得る。誘導性発現は一つの手法を提供するが、更に本出願人らは、CRISPRベクターそれ自体の中の非コードガイド標的配列の使用に頼る自己不活性化CRISPR系をエンジニアリングしている。従って、発現開始後、CRISPR-Cas系はそれ自体の破壊をもたらし得るが、しかし破壊が完了する前に、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間があり得る(二倍体細胞における通常の点突然変異では、これに必要となるのは高々2つの編集である)。単純に、自己不活性化CRISPR-Cas系は、CRISPR酵素それ自体のコード配列を標的化するか、又は以下の1つ以上に存在するユニーク配列に相補的な1つ以上の非コードガイド標的配列を標的化する追加的なRNA(即ち、ガイドRNA)を含む:
(a)非コードRNAエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
(b)Cpf1エフェクタータンパク質遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
(c)Cpf1エフェクタータンパク質コード配列におけるATG翻訳開始コドンから100bp以内、
(d)例えばAAVゲノムにおける、ウイルス送達ベクターの逆方向末端反復配列(iTR)内。
I.2つ以上のCRISPR-Cas系ポリヌクレオチド配列であって、
(a)ポリヌクレオチド遺伝子座の第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列、
(b)ポリヌクレオチド遺伝子座の第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列、
(c)ダイレクトリピート配列、
を含むポリヌクレオチド配列、及び
II.Cpf1酵素又はそれをコードする第2のポリヌクレオチド配列
を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物が提供され、
第1及び第2のガイド配列は、転写されると、それぞれ第1及び第2の標的配列への第1及び第2のCpf1 CRISPR複合体の配列特異的結合を導き、
第1のCRISPR複合体は、第1の標的配列にハイブリダイズ可能な第1のガイド配列と複合体を形成したCpf1酵素を含み、
第2のCRISPR複合体は、第2の標的配列にハイブリダイズ可能な第2のガイド配列と複合体を形成したCpf1酵素を含み、
第1のガイド配列が第1の標的配列近傍におけるDNA二重鎖の一方の鎖の切断を導き、且つ第2のガイド配列が第2の標的配列近傍における他方の鎖の切断を導いて二本鎖切断が誘導され、それにより生物又は非ヒト若しくは非動物生物が改変される。同様に、例えば各々が1つの標的に特異的な、且つ本明細書に記載されるとおりの組成物又はCRISPR系又は複合体においてタンデムに配置された2つより多いガイドRNAを含む組成物を想定することができる。
一態様において、本発明は、上記の方法及び組成物に開示されるエレメントの任意の1つ以上を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に教示されるとおりのベクター系とキットの使用説明書とを含む。要素は個々に又は組み合わせで提供されてもよく、及び任意の好適な容器、例えば、バイアル、ボトル、又はチューブに提供されてもよい。本キットは、本明細書に記載されるとおりのgRNA及び未結合の保護鎖を含み得る。本キットは、保護鎖がガイド配列に少なくとも部分的に結合したgRNA(即ちpgRNA)を含み得る。従って本キットは、本明細書に記載されるとおりの部分的に二本鎖ヌクレオチド配列の形態のpgRNAを含み得る。一部の実施形態において、本キットは1つ以上の言語、例えば2つ以上の言語による説明書を含む。取扱説明書は本明細書に記載される適用及び方法に特異的であってもよい。
本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するのに用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター又は送達系を提供し、及び、改変後はCRISPRにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる方法で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、CRISPR系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本CRISPR発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
一態様において、本発明は、本明細書に記載される触媒的に不活性なCasタンパク質、好ましくは不活性Cpf1(dCpf1)を含むエンジニアリングされた天然に存在しないCRISPR-Cas系、及び蛍光インサイチュハイブリダイゼーション(FISH)などの検出方法におけるこの系の使用を提供する。DNA二本鎖切断を生じさせる能力を欠くdCpf1を高感度緑色蛍光タンパク質(eEGFP)などの蛍光タンパク質などのマーカーと融合させて、小さいガイドRNAと共発現させることにより、インビボで挟動原体、動原体及びテロメアリピートを標的化し得る。dCpf1系を使用してヒトゲノムの反復配列及び個々の遺伝子の両方を可視化することができる。標識されたdCpf1 CRISPR-cas系のかかる新規適用は、細胞のイメージング及び機能的核構造の研究において、特に核内低分子容積又は複合体三次元構造を含む場合に重要であり得る(Chen B,Gilbert LA,Cimini BA,Schnitzbauer J,Zhang W,Li GW,Park J,Blackburn EH,Weissman JS,Qi LS,Huang B.2013.「最適化CRISPR/Cas系によるヒト生細胞のゲノム遺伝子座の動的イメージング(Dynamic imaging of genomic loci in living human cells by an optimized CRISPR/Cas system)」.Cell 155(7):1479-91.doi:10.1016/j.cell.2013.12.001)。
CRISPR Cpf1系及びその使用方法は、DNAのターゲティング及び任意選択で遺伝子改変に有益であり、これはDNAの由来に関わらない。従ってDNAは、原核生物DNA、真核生物DNA又はウイルスDNAであり得る。細胞内又は細胞外での真核生物DNAのターゲティングに関する種々の適用について、本明細書の他の部分に詳述される。詳細な実施形態では、Cpf1系を使用して原核生物DNAなどの微生物DNAが標的化される。これは、酵母又は真菌などの生物における目的の分子の組換え産生のコンテクストにおいて有益であり得る。これに関連して、本発明は、宿主細胞における目的の化合物の組換え産生方法を想定し、この方法は、前記化合物の産生を確実にするための酵母、真菌又は細菌などの宿主細胞の遺伝子改変へのCpf1系の使用を含む。本願は更に、これらの方法によって得られる化合物を想定する。それに加えて又は代えて、これは、細菌DNA又はウイルスDNAの検出及び/又は改変のコンテクストにおいて有益であり得る。詳細な実施形態において、本方法は、細菌DNA又はウイルスDNAの特異的検出及び/又は改変が関わる。
詳細な実施形態において、Cpf1エフェクタータンパク質は夾雑DNAのターゲティング及び切断に使用される。例えば、詳細な実施形態において、真核生物DNAは試料中の夾雑物であり、例えばここで真核生物の組織又は体液試料中にあるウイルスDNA又は細菌DNAなどの非真核生物DNAの検出が有益である。真核生物DNAのターゲティングは、真核生物(例えばヒト)特異的ガイド配列を使用することにより確実となる。このような方法には、真核生物DNAのターゲティング前に試料中に存在する細胞の溶解が関わることも又は関わらないこともある。真核生物DNAを選択的に切断した後、当該技術分野において公知の方法によってそれを試料中に存在するインタクトなDNAと分離し得る。従って、本発明は、真核生物(例えばヒト)DNAを試料から選択的に除去する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載されるCRISPR-Cpf1系で真核生物DNAを選択的に切断することを含む。また、本明細書には、真核生物DNAの選択的なターゲティングを可能にする本明細書に記載されるCRISPR-Cpf1系の1つ以上の成分を含む、本方法を実施するためのキットも提供される。同様に、夾雑DNAの種特異的除去を確実にし得ることが想定される。
一態様において、本発明は、真核細胞内の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、これはインビボ、エキソビボ又はインビトロであってもよい。一部の実施形態において、本方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団を試料採取するステップ、及び1つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は任意の段階でエキソビボで行われ得る。この1つ又は複数の細胞が、更には非ヒト動物又は植物に再導入されてもよい。再導入される細胞について、細胞は幹細胞であることが特に好ましい。
本発明は核酸を使用して標的DNA配列を結合する。核酸はタンパク質と比べて作製するのがはるかに容易で安価であり、且つ相同性が求められるストレッチの長さに応じて特異性を変化させることができるため、これは有利である。例えば、複数のフィンガーを複雑に三次元配置させる必要はない。用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」は同義的に使用される。これらの用語は、デオキシリボヌクレオチドであれ又はリボヌクレオチドであれ、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチド、又はその類似体を指す。ポリヌクレオチドは任意の三次元構造を有することができ、既知又は未知の任意の機能を果たし得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定的な例である:遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって定義される複数の遺伝子座(1つの遺伝子座)、エクソン、イントロン、メッセンジャーRNA(mRNA)、トランスファーRNA、リボソームRNA、低分子干渉RNA(siRNA)、低分子ヘアピンRNA(shRNA)、マイクロRNA(miRNA)、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離DNA、任意の配列の単離RNA、核酸プローブ、及びプライマー。この用語はまた、合成骨格を有する核酸様構造も包含し、例えば、Eckstein,1991;Baserga et al.,1992;Milligan,1993;国際公開第97/03211号パンフレット;国際公開第96/39154号パンフレット;Mata,1997;Strauss-Soukup,1997;及びSamstag,1996を参照のこと。ポリヌクレオチドは、1つ以上の改変ヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造の改変はポリマーをアセンブルする前又はその後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド構成成分で中断されていてもよい。ポリヌクレオチドは、重合後に、標識構成成分とのコンジュゲーションによるなどして更に改変されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、当業者によって理解される当該技術分野の用語であり、突然変異体又は変異体形態とは区別されるものとして天然に存在するとおりの、典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の呈示を意味するものと解釈されなければならない。用語「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」は同義的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この用語は、核酸分子又はポリペプチドに言及するとき、核酸分子又はポリペプチドが、自然中ではそれと天然に結び付いている、且つ自然中に見られるとおりの少なくとも1つの他の構成成分を少なくとも実質的に含まないことを意味する「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型の対合のいずれかによって核酸が別の核酸配列と1つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。「相補性」は、従来のワトソン・クリック塩基対合又は他の非従来型のいずれかによって核酸が別の核酸配列と1つ又は複数の水素結合を形成する能力を指す。パーセント相補性は、核酸分子中で第2の核酸配列と水素結合を形成(例えばワトソン・クリック塩基対合)することのできる残基のパーセンテージを示す(例えば、10個のうち5、6、7、8、9、10個は、それぞれ、50%、60%、70%、80%、90%、100%の相補性である)。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が第2の核酸配列中の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。「実質的に相補的」は、本明細書で使用されるとき、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50ヌクレオチド、又はそれ以上の領域にわたって少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%、又は100%である相補性の程度を指し、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする2つの核酸を指す。本明細書で使用されるとき、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列と相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、且つ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は概して配列依存性であり、幾つもの要因に応じて異なる。一般に、配列が長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Tijssen(1993),Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I,Second Chapter “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”,Elsevier,N.Y.に詳述されている。ポリヌクレオチド配列に言及する場合、相補配列又は部分的相補配列も想定される。これらは、好ましくは、高度にストリンジェントな条件下で参照配列とハイブリダイズ可能なものである。概して、ハイブリダイゼーション速度を最大にするには、比較的低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件(熱融点(Tm)より約20~25℃低い)が選択される。Tmは、特定の標的配列の50%が規定のイオン強度及びpHの溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。概して、ハイブリダイズした配列の少なくとも約85%のヌクレオチド相補性を要求する場合、Tmより約5~15℃低くなるよう高度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約70%のヌクレオチド相補性を要求する場合、Tmより約15~30℃低くなるよう中程度にストリンジェントな洗浄条件が選択される。高度に許容的な(極めて低いストリンジェンシーの)洗浄条件はTmより50℃も低いものであってよく、ハイブリダイズした配列間に高レベルのミスマッチが許容される。当業者は、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的パラメーターもまた、標的配列とプローブ配列との間の特定の相同性レベルからの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるよう変更し得ることを認識するであろう。好ましい高度にストリンジェントな条件は、50%ホルムアミド、5×SSC、及び1% SDS中42℃でのインキュベーション、又は5×SSC及び1% SDS中65℃でのインキュベーションと、0.2×SSC及び0.1% SDS中65℃での洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、1つ以上のポリヌクレオチドが反応することによりヌクレオチド残基の塩基間の水素結合によって安定した複合体を形成する反応を指す。水素結合は、ワトソン・クリック塩基対合、フーグステイン(Hoogstein)結合によるか、又は任意の他の配列特異的様式で起こり得る。複合体には、二重鎖構造を形成する2本の鎖、多重鎖複合体を形成する3本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組み合わせが含まれ得る。ハイブリダイゼーション反応は、PCRの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断など、より大規模なプロセスで一ステップを構成し得る。所与の配列とハイブリダイズ可能な配列は、その所与の配列の「相補体」と称される。本明細書で使用されるとき、用語「ゲノム遺伝子座(genomic locus)」又は「遺伝子座(locus)」(複数形loci)は、染色体上の遺伝子又はDNA配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードする一続きのDNA若しくはRNA、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子的遺伝単位であるRNA鎖を指す。本発明の目的上、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域を含むと(かかる調節配列がコード配列及び/又は転写配列に隣接しているか否かに関わらず)見なし得る。従って、遺伝子には、必ずしも限定されないが、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位などの翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位及び遺伝子座制御領域が含まれる。本明細書で使用されるとき、「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、機能的遺伝子産物の合成に遺伝子からの情報が用いられる過程である。遺伝子発現の産物は、多くの場合にタンパク質であるが、rRNA遺伝子又はtRNA遺伝子などの非タンパク質コード遺伝子では、産物は機能性RNAである。遺伝子発現の過程は、あらゆる既知の生命-真核生物(多細胞生物を含む)、原核生物(細菌及び古細菌)、及びウイルスによって生存のための機能性産物の産生に用いられている。本明細書で使用されるとき、遺伝子又は核酸の「発現」には、細胞遺伝子発現のみならず、クローニング系及び任意の他のコンテクストにおける1つ又は複数の核酸の転写及び翻訳もまた包含される。本明細書で使用されるとき、「発現」はまた、ポリヌクレオチドがDNA鋳型から(mRNA又は他のRNA転写物などに)転写される過程及び/又は転写されたmRNAが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される過程も指す。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称される。ポリヌクレオチドがゲノムDNAに由来する場合、発現には真核細胞におけるmRNAのスプライシングが含まれ得る。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指して同義的に使用される。ポリマーは線状又は分枝状であってよく、それは修飾アミノ酸を含んでもよく、及びそれは非アミノ酸が割り込んでいてもよい。これらの用語はまた、改変されているアミノ酸ポリマー(例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他任意の、標識成分とのコンジュゲーションなどの操作)も包含する。本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」には、グリシン及びD又はLの両方の光学異性体、及びアミノ酸類似体及びペプチド模倣体を含め、天然及び/又は非天然又は合成のアミノ酸が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」は、タンパク質配列のうち残りのタンパク質鎖と独立に存在し及び機能し得る一部分を指す。本発明の態様に記載されるとおり、配列同一性は配列相同性と関係する。相同性比較は目測で行われてもよく、又はより通例では、容易に利用可能な配列比較プログラムの助けを借りて行われてもよい。これらの市販のコンピュータプログラムは、2つ以上の配列間のパーセント(%)相同性を計算することができ、また2つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列が共有する配列同一性も計算することができる。
本発明の方法を用いることにより、目的の突然変異のモデル又は疾患モデルによるなどの、目的の遺伝的又は後成的条件のモデル化及び/又は研究に使用し得る植物、動物又は細胞を作り出すことができる。本明細書で使用されるとき、「疾患」は、対象における疾患、障害、又は徴候を指す。例えば、本発明の方法を用いて、疾患に関連する1つ以上の核酸配列に改変を含む動物若しくは細胞、又は疾患に関連する1つ以上の核酸配列の発現が変化している植物、動物若しくは細胞を作り出すことができる。かかる核酸配列は疾患関連タンパク質配列をコードしてもよく、又は疾患関連制御配列であってもよい。従って、本発明の実施形態において植物、対象、患者、生物又は細胞は、非ヒトの対象、患者、生物又は細胞であり得ることが理解される。従って、本発明は、本方法により作製された植物、動物若しくは細胞、又はその子孫を提供する。子孫は、作製された植物又は動物のクローンであってもよく、又は更に望ましい形質をその子孫に遺伝子移入させるため同じ種の他の個体と交配させることによる有性生殖から生じてもよい。細胞は、多細胞生物、特に動物又は植物の場合にインビボ又はエキソビボであってよい。細胞が培養下にある例では、適切な培養条件が満たされる場合、且つ好ましくは細胞がこの目的に好適に適合する場合(例えば幹細胞)、細胞系が樹立され得る。本発明によって作製される細菌細胞系もまた想定される。ひいては細胞系もまた想定される。
本明細書に記載されるCRISPRタンパク質及び系は、効率的で対費用効果の高い機能性ゲノムスクリーニングの実施に用いることができる。かかるスクリーニングは、ゲノムワイドライブラリベースのCRISPRエフェクタータンパク質を用いることができる。かかるスクリーニング及びライブラリにより、遺伝子の機能、遺伝子が関与する細胞経路、及び遺伝子発現の任意の変化が如何に特定の生物学的過程をもたらし得るかを決定することが可能となり得る。本発明の利点は、CRISPR系がオフターゲット結合及びその結果として生じる副作用を回避することである。これは、標的DNAに対して高度な配列特異性を有するように構成された系を用いて達成される。本発明の好ましい実施形態において、CRISPRエフェクタータンパク質複合体はCpf1エフェクタータンパク質複合体である。
別の態様において、本発明は、遺伝子の機能的評価及びスクリーニング方法を提供する。機能ドメインを正確に送達するため、遺伝子を活性化若しくは抑制するため又は目的の特定の遺伝子座上のメチル化部位を正確に変化させることによりエピジェネティック状態を変化させるための本発明のCRISPR系の使用は、単細胞又は細胞集団に適用される1つ以上のガイドRNAを伴うか、又は複数のガイドRNA(gRNA)を含むライブラリの投与又は発現を含む、エキソビボ又はインビボで細胞のプール内のゲノムに適用されるライブラリを伴うことができ、及びここでスクリーニングはCpf1エフェクタータンパク質の使用を更に含み、ここでCpf1エフェクタータンパク質を含むCRISPR複合体は、異種機能ドメインを含むように改変される。ある態様において、本発明は、ライブラリの宿主への投与又は宿主におけるインビボ発現を含む、ゲノムのスクリーニング方法を提供する。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するアクチベーターを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはCpf1エフェクタータンパク質に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはCpf1エフェクタータンパク質のN末端又はC末端に付加される。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでアクチベーターはgRNAループに付加される。ある態様において、本発明は、宿主に投与される又は宿主で発現するリプレッサーを更に含む、本明細書に考察されるとおりの方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に考察されるとおりの方法を提供し、ここでスクリーニングは、遺伝子活性化、遺伝子阻害、又は遺伝子座における切断に影響を及ぼし、及びそれを検出することを含む。
本明細書に記載される1つ又は複数のCpf1エフェクタータンパク質系は、例えば、遺伝子発現、薬剤耐性、及び疾患の好転に必要な機能性エレメントの重要な最小限の特徴及び個別的な脆弱性を決定するための、細胞表現型と併せたゲノム遺伝子座における飽和又はディープスキャニング突然変異誘発の実施に用いることができる。飽和又はディープスキャニング突然変異誘発とは、ゲノム遺伝子座内であらゆる又は本質的にあらゆるDNA塩基が切断されることを意味する。Cpf1エフェクタータンパク質ガイドRNAのライブラリが細胞集団に導入される。このライブラリは、各細胞がシングルガイドRNA(gRNA)を受け取るように導入され得る。本明細書に記載されるとおり、ライブラリがウイルスベクターの形質導入によって導入される場合、低い感染多重度(MOI)が用いられる。ライブラリは、ゲノム遺伝子座において(プロトスペーサー隣接モチーフ)(PAM)配列の上流にある全ての配列を標的化するgRNAを含み得る。ライブラリは、ゲノム遺伝子座内の1000塩基対毎にPAM配列の上流に少なくとも100個の非重複ゲノム配列を含み得る。ライブラリは、少なくとも1つの異なるPAM配列の上流の配列を標的化するgRNAを含み得る。1つ又は複数のCpf1エフェクタータンパク質系は2つ以上のCpf1タンパク質を含み得る。異なるPAM配列を認識するオルソログ又はエンジニアリングされたCpf1エフェクタータンパク質を含め、本明細書に記載されるとおりの任意のCpf1エフェクタータンパク質を用いることができる。gRNAに関するオフターゲット部位の頻度は500未満であり得る。オフターゲットスコアを作成して、最も低いオフターゲット部位のgRNAを選択し得る。単一の実験で同じ部位を標的化するgRNAを用いることにより、gRNA標的部位における切断に関連すると決定された任意の表現型を確認し得る。標的部位の検証はまた、本明細書に記載されるとおりの改変Cpf1エフェクタータンパク質、及び目的のゲノム部位を標的化する2つのgRNAを用いることにより行ってもよい。理論によって拘束されないが、標的部位は、検証実験で表現型の変化が観察された場合に真のヒットである。
一部の実施形態における本発明は、細胞又は生物を改変する方法を包含する。細胞は原核細胞又は真核細胞であってもよい。細胞は哺乳類細胞であってもよい。哺乳類細胞は、非ヒト霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類又はマウス細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚類又はエビなどの非哺乳類真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はコメなどの作物植物であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木又は野菜であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、抗体、デンプン、アルコール又は他の所望の細胞産出物などの生物学的産物の産生向上のため細胞及び細胞の子孫を変化させるようなものであり得る。本発明によって細胞に導入される改変は、産生される生物学的産物を変える変化が細胞及び細胞の子孫に含まれるようなものであり得る。
本発明は、少なくとも1つのナノ粒子複合体によって送達されるCRISPR複合体の少なくとも1つの構成成分、例えばRNAに関する。一部の態様において、本発明は、1つ以上のポリヌクレオチド、例えば、又は本明細書に記載されるとおりの1つ以上のベクター、その1つ以上の転写物、及び/又はそれから転写されるもの又はタンパク質を、宿主細胞に送達するステップを含む方法を提供する。一部の態様において、本発明は、かかる方法によって作製される細胞、及びかかる細胞を含むか、又はそれから作製される動物を更に提供する。一部の実施形態では、ガイド配列と組み合わせた(及び任意選択でそれと複合体を形成した)CRISPR酵素が細胞に送達される。哺乳類細胞又は標的組織における核酸の導入には、従来のウイルスベース及び非ウイルスベースの遺伝子導入方法を用いることができる。かかる方法を用いて、CRISPR系の構成成分をコードする核酸を培養下の細胞に、又は宿主生物中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系には、DNAプラスミド、RNA(例えば本明細書に記載されるベクターの転写物)、ネイキッド核酸、及び送達ビヒクルと複合体を形成した核酸、例えばリポソームが含まれる。ウイルスベクター送達系にはDNA及びRNAウイルスが含まれ、これは細胞への送達後にエピソームゲノム又は組込みゲノムのいずれかを有する。遺伝子療法手順のレビューに関しては、Anderson,Science 256:808-813(1992);Nabel & Felgner,TIBTECH 11:211-217(1993);Mitani & Caskey,TIBTECH 11:162-166(1993);Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993);Miller,Nature 357:455-460(1992);Van Brunt,Biotechnology 6(10):1149-1154(1988);Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36(1995);Kremer & Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1):31-44(1995);Haddada et al.,in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler and Boehm(eds)(1995);及びYu et al.,Gene Therapy 1:13-26(1994)を参照のこと。
Cpf1エフェクタータンパク質系(例えば単一の又は多重化した)は、作物ゲノミクスにおける近年の進歩と併せて用いることができる。本明細書に記載される系を使用して、効率的で且つ対費用効果の高い植物遺伝子又はゲノムの探索又は編集又は操作を-例えば、植物遺伝子又はゲノムの迅速な調査及び/又は選択及び/又は探索及び/又は比較及び/又は操作及び/又は形質転換のため、実施することができ;例えば、1つ又は複数の形質又は1つ又は複数の特徴を作出し、同定し、開発し、最適化し、又は1つ又は複数の植物に付与し、又は植物ゲノムを形質転換することができる。従って、植物の生産の向上、新規組み合わせの形質又は特徴を有する新規植物、又は形質が増強された新規植物があり得る。Cpf1エフェクタータンパク質系は、植物に関して、部位特異的組込み(SDI)又は遺伝子編集(GE)又は任意の準逆育種(NRB)又は逆育種(RB)技術において使用することができる。本明細書に記載されるCpf1エフェクタータンパク質系を利用する態様は、植物におけるCRISPR-Cas(例えばCRISPR-Cas9)系の使用と同様であってもよく、アリゾナ大学(University of Arizona)ウェブサイト「CRISPR-PLANT」(http://www.genome.arizona.edu/crispr/)(後援Penn State及びAGI)が挙げられる。本発明の実施形態(emodiments)は、植物におけるゲノム編集で、又はRNAi若しくは同様のゲノム編集技法が既に用いられているところで用いることができる;例えば、Nekrasov,「容易になった植物ゲノム編集:CRISPR/Cas系を使用したモデル及び作物植物における標的突然変異誘発(Plant genome editing made easy:targeted mutagenesis in model and crop plants using the CRISPR/Cas system)」,Plant Methods 2013,9:39(doi:10.1186/1746-4811-9-39);Brooks,「CRISPR/Cas9系を使用した第一世代のトマトにおける効率的遺伝子編集(Efficient gene editing in tomato in the first generation using the CRISPR/Cas9 system)」,Plant Physiology September 2014 pp 114.247577;Shan,「CRISPR-Cas系を使用した作物植物の標的ゲノム改変(Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system)」,Nature Biotechnology 31,686-688(2013);Feng,「CRISPR/Cas系を使用した植物における効率的なゲノム編集(Efficient genome editing in plants using a CRISPR/Cas system)」,Cell Research(2013)23:1229-1232.doi:10.1038/cr.2013.114;オンライン発行 20 August 2013;Xie,「CRISPR-Cas系を使用した植物におけるRNAガイド下ゲノム編集(RNA-guided genome editing in plants using a CRISPR-Cas system)」,Mol Plant.2013 Nov;6(6):1975-83.doi:10.1093/mp/sst119.Epub 2013 Aug 17;Xu,「コメにおけるアグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介CRISPR-Cas系を使用した遺伝子ターゲティング(Gene targeting using the Agrobacterium tumefaciens-mediated CRISPR-Cas system in rice)」,Rice 2014,7:5(2014)、Zhou et al.,「木本多年生植物ポプラ属(Populus)の外交配における両アレルCRISPR突然変異へのSNPの利用により、4-クマル酸:CoAリガーゼ特異性及び冗長性が明らかになる(Exploiting SNPs for biallelic CRISPR mutations in the outcrossing woody perennial Populus reveals 4-coumarate:CoA ligase specificity and Redundancy)」,New Phytologist(2015)(Forum)1-4(www.newphytologist.comにおいてオンラインでのみ入手可能);Caliando et al,「宿主ゲノムを安定に担持するCRISPRデバイスを使用した標的DNA分解(Targeted DNA degradation using a CRISPR device stably carried in the host genome)」,NATURE COMMUNICATIONS 6:6989,DOI:10.1038/ncomms7989,www.nature.com/naturecommunications DOI:10.1038/ncomms7989;米国特許第6,603,061号明細書-アグロバクテリウム属媒介性植物形質転換方法(Agrobacterium-Mediated Plant Transformation Method);米国特許第7,868,149号明細書-植物ゲノム配列及びその使用(Plant Genome Sequences and Uses Thereof)及び米国特許出願公開第2009/0100536号明細書-農業形質が増強されたトランスジェニック植物(Transgenic Plants with Enhanced Agronomic Traits)(これらの各々の内容及び開示は全て、本明細書において全体として参照により援用される)を参照のこと。本発明の実施では、Morrell et al「作物ゲノミクス:進展と応用(Crop genomics:advances and applications)」,Nat Rev Genet.2011 Dec 29;13(2):85-96の内容及び開示;その各々が、本明細書における実施形態が植物に関してどのように用いられ得るかに関してを含め、参照により本明細書に援用される。従って、本明細書において動物細胞への言及はまた、特に明らかでない限り、適宜修正して植物細胞にも適用し得る;及び、オフターゲット効果が低下した本明細書における酵素及びかかる酵素を利用する系は、本明細書に記載するものを含め、植物適用(applciations)に用いることができる。
ある態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む非ヒト真核生物;好ましくは多細胞真核生物を提供する。他の態様において、本発明は、記載される実施形態のいずれかに係る真核生物宿主細胞を含む真核生物;好ましくは多細胞真核生物を提供する。これらの態様の一部の実施形態における生物は、動物;例えば哺乳類であってもよい。また、生物は、昆虫などの節足動物であってもよい。生物はまた、植物であってもよい。更に、生物は真菌であってもよい。
家畜におけるウイルス標的には、一部の実施形態において、例えばブタマクロファージ上のブタCD163が含まれ得る。CD163は、PRRSv(アルテリウイルスであるブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス)による感染に関連する(ウイルスの細胞への侵入を介すると考えられている)。PRRSvが特にブタ肺胞マクロファージ(肺に見られる)に感染すると、飼育ブタの生殖障害、体重減少及び高死亡率を含めた被害をもたらす、以前は不治であったブタ症候群(「ミステリーブタ病」又は「青耳病」)が引き起こされる。マクロファージ活性が失われることによる免疫不全に起因して、流行性肺炎、髄膜炎及び耳浮腫などの日和見感染症が見られることが多い。また、抗生物質の使用増加及び金銭的損失に起因して、経済的及び環境的影響も大きい(毎年推定6億6千万ドル)。
明らかなとおり、本系を用いていかなる目的のポリヌクレオチド配列も標的化し得ることが想定される。本発明は、標的細胞をインビボ、エキソビボ又はインビトロで改変するために用いられる、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチド、又は前記組成物の構成成分をコードする1つ以上のポリヌクレオチドを含むベクター若しくは送達系を提供し、及び改変後はCRISPRにより改変された細胞の子孫又は細胞株が変化した表現型を保持するように細胞を変化させる形で行われ得る。改変された細胞及び子孫は、CRISPR系が所望の細胞型にエキソビボ又はインビボ適用された植物又は動物などの多細胞生物の一部であり得る。本CRISPR発明は、療法的治療方法であり得る。療法的治療方法には、遺伝子又はゲノム編集、又は遺伝子療法が含まれ得る。
本出願人らの結晶構造は、Cpf1によるRNAガイド下DNAターゲティングの分子機構の理解に向けた重要なステップを提供する。この結晶構造を用いて、標的DNA上のPAM配列のCpf1媒介認識を決定することができる。従って、本発明は、1つ以上のアミノ酸残基を改変すること、及び改変されたCpf1活性を同定することを含むCpf1の改変方法を含む。本方法の詳細な実施形態では、PAM感受性(sensistivity)に影響を及ぼすことを目的として、本明細書に記載されるとおりPAM配列と相互作用すると同定された残基が改変される。或いは、Cpf1結晶構造に基づきcrRNA:DNA二重鎖間のミスマッチ耐性が調査される。本明細書において想定される方法には、合理的エンジニアリング及び/又はランダム突然変異誘発が関わり得る。詳細な実施形態では、同定されたCpf1ドメインのうちの1つ以上をエンジニアリングすることにより、PAM特異性をプログラムし、標的部位認識の忠実度を向上させ、及びCpf1ゲノムエンジニアリングプラットフォームの多用途性を高めることが可能になる。
本発明は、いずれも本発明の実施に有用な、その成分及び複合体を含めたCRISPR系、並びに、方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子、AAVを含めたかかる成分及び複合体の送達、並びに量及び製剤に関することを含めたその作製及び使用の態様に基づき更に例示及び展開することができ、これらに関しては以下が挙げられる:米国特許第8,999,641号明細書、同第8,993,233号明細書、同第8,945,839号明細書、同第8,932,814号明細書、同第8,906,616号明細書、同第8,895,308号明細書、同第8,889,418号明細書、同第8,889,356号明細書、同第8,871,445号明細書、同第8,865,406号明細書、同第8,795,965号明細書、同第8,771,945号明細書及び同第8,697,359号明細書;米国特許出願公開第2014-0310830号明細書(米国特許出願第14/105,031号明細書)、同第2014-0287938 A1号明細書(米国特許出願第14/213,991号明細書)、同第2014-0273234 A1号明細書(米国特許出願第14/293,674号明細書)、同第2014-0273232 A1号明細書(米国特許出願第14/290,575号明細書)、同第2014-0273231号明細書(米国特許出願第14/259,420号明細書)、同第2014-0256046 A1号明細書(米国特許出願第14/226,274号明細書)、同第2014-0248702 A1号明細書(米国特許出願第14/258,458号明細書)、同第2014-0242700 A1号明細書(米国特許出願第14/222,930号明細書)、同第2014-0242699 A1号明細書(米国特許出願第14/183,512号明細書)、同第2014-0242664 A1号明細書(米国特許出願第14/104,990号明細書)、同第2014-0234972 A1号明細書(米国特許出願第14/183,471号明細書)、同第2014-0227787 A1号明細書(米国特許出願第14/256,912号明細書)、同第2014-0189896 A1号明細書(米国特許出願第14/105,035号明細書)、同第2014-0186958号明細書(米国特許出願第14/105,017号明細書)、同第2014-0186919 A1号明細書(米国特許出願第14/104,977号明細書)、同第2014-0186843 A1号明細書(米国特許出願第14/104,900号明細書)、同第2014-0179770 A1号明細書(米国特許出願第14/104,837号明細書)及び同第2014-0179006 A1号明細書(米国特許出願第14/183,486号明細書)、同第2014-0170753号明細書(米国特許出願第14/183,429号明細書);欧州特許第2 784 162 B1号明細書及び同第2 771 468 B1号明細書;欧州特許出願第2 771 468号明細書(EP13818570.7号明細書)、同第2 764 103号明細書(EP13824232.6号明細書)、及び同第2 784 162号明細書(EP14170383.5号明細書);及び国際公開第2014/093661号パンフレット(PCT/US2013/074743号明細書)、同第2014/093694号パンフレット(PCT/US2013/074790号明細書)、同第2014/093595号パンフレット(PCT/US2013/074611号明細書)、同第2014/093718号パンフレット(PCT/US2013/074825号明細書)、同第2014/093709号パンフレット(PCT/US2013/074812号明細書)、同第2014/093622号パンフレット(PCT/US2013/074667号明細書)、同第2014/093635号パンフレット(PCT/US2013/074691号明細書)、同第2014/093655号パンフレット(PCT/US2013/074736号明細書)、同第2014/093712号パンフレット(PCT/US2013/074819号明細書)、同第2014/093701号パンフレット(PCT/US2013/074800号明細書)、同第2014/018423号パンフレット(PCT/US2013/051418号明細書)、同第2014/204723号パンフレット(PCT/US2014/041790号明細書)、同第2014/204724号パンフレット(PCT/US2014/041800号明細書)、同第2014/204725号パンフレット(PCT/US2014/041803号明細書)、同第2014/204726号パンフレット(PCT/US2014/041804号明細書)、同第2014/204727号パンフレット(PCT/US2014/041806号明細書)、同第2014/204728号パンフレット(PCT/US2014/041808号明細書)、同第2014/204729号パンフレット(PCT/US2014/041809号明細書)。また、それぞれ2013年1月30日;2013年3月15日;2013年3月28日;2013年4月20日;2013年5月6日及び2013年5月28日に出願された米国仮特許出願第61/758,468号明細書;同第61/802,174号明細書;同第61/806,375号明細書;同第61/814,263号明細書;同第61/819,803号明細書及び同第61/828,130号明細書も参照される。また、2013年6月17日に出願された米国仮特許出願第61/836,123号明細書も参照される。加えて、各々2013年6月17日に出願された米国仮特許出願第61/835,931号明細書、同第61/835,936号明細書、同第61/836,127号明細書、同第61/836,101号明細書、同第61/836,080号明細書及び同第61/835,973号明細書が参照される。更に、2013年8月5日に出願された米国仮特許出願第61/862,468号明細書及び同第61/862,355号明細書;2013年8月28日に出願された同第61/871,301号明細書;2013年9月25日に出願された同第61/960,777号明細書及び2013年10月28日に出願された同第61/961,980号明細書が参照される。更にまた、各々2014年6月10日(6/10/14)に出願されたPCT特許出願PCT/US2014/041803号明細書、PCT/US2014/041800号明細書、PCT/US2014/041809号明細書、PCT/US2014/041804号明細書及びPCT/US2014/041806号明細書;2014年6月11日に出願されたPCT/US2014/041808号明細書;及び2014年10月28日に出願されたPCT/US2014/62558号明細書、及び各々2013年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/915,150号明細書、同第61/915,301号明細書、同第61/915,267号明細書及び同第61/915,260号明細書;2013年1月29日及び2013年2月25日に出願された同第61/757,972号明細書及び同第61/768,959号明細書;2013年6月17日に出願された同第61/835,936号明細書、同第61/836,127号明細書、同第61/836,101号明細書、同第61/836,080号明細書、同第61/835,973号明細書、及び同第61/835,931号明細書;両方ともに2014年6月11日に出願された同第62/010,888号明細書及び同第62/010,879号明細書;各々2014年6月10日に出願された同第62/010,329号明細書及び同第62/010,441号明細書;各々2014年2月12日に出願された同第61/939,228号明細書及び同第61/939,242号明細書;2014年4月15日に出願された同第61/980,012号明細書;2014年8月17日に出願された同第62/038,358号明細書;各々2014年9月25日に出願された同第62/054,490号明細書、同第62/055,484号明細書、同第62/055,460号明細書及び同第62/055,487号明細書;及び2014年10月27日に出願された同第62/069,243号明細書が参照される。また、2014年9月25日に出願された米国仮特許出願第62/055,484号明細書、同第62/055,460号明細書、及び同第62/055,487号明細書;2014年4月15日に出願された同第61/980,012号明細書;及び2014年2月12日に出願された同第61/939,242号明細書も参照される。特に米国を指定するPCT出願、2014年6月10日に出願されたPCT/US14/41806号明細書が参照される。2014年1月22日に出願された米国仮特許出願第61/930,214号明細書が参照される。各々2013年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/915,251号明細書;同第61/915,260号明細書及び同第61/915,267号明細書が参照される。2014年4月15日に出願された米国仮特許出願第61/980,012号明細書が参照される。特に米国を指定するPCT出願、2014年6月10日に出願されたPCT/US14/41806号明細書が参照される。2014年1月22日に出願された米国仮特許出願第61/930,214号明細書が参照される。各々2013年12月12日に出願された米国仮特許出願第61/915,251号明細書;同第61/915,260号明細書及び同第61/915,267号明細書が参照される。
・「CRISPR/Cas系を用いた多重ゲノムエンジニアリング(Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems)」.Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,& Zhang,F.Science Feb 15;339(6121):819-23(2013);
・「CRISPR-Cas系を用いた細菌ゲノムのRNAガイド下編集(RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems)」.Jiang W.,Bikard D.,Cox D.,Zhang F,Marraffini LA.Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9(2013);
・「複数の遺伝子に突然変異を有するマウスのCRISPR/Cas媒介性ゲノムエンジニアリングによるワンステップ生成(One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering)」.Wang H.,Yang H.,Shivalila CS.,Dawlaty MM.,Cheng AW.,Zhang F.,Jaenisch R.Cell May 9;153(4):910-8(2013);
・「哺乳類内因性転写及び後成状態の光学制御(Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states)」.Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Hsu PD,Heidenreich M,Cong L,Platt RJ,Scott DA,Church GM,Zhang F.Nature.Aug 22;500(7463):472-6.doi:10.1038/Nature12466.Epub 2013 Aug 23(2013);
・「ゲノム編集特異性を増強するためのRNAガイド下CRISPR Cas9による二重ニッキング(Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity)」.Ran,FA.,Hsu,PD.,Lin,CY.,Gootenberg,JS.,Konermann,S.,Trevino,AE.,Scott,DA.,Inoue,A.,Matoba,S.,Zhang,Y.,& Zhang,F.Cell Aug 28.pii:S0092-8674(13)01015-5(2013-A);
・「RNAガイド下Cas9ヌクレアーゼのDNAターゲティング特異性(DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases)」.Hsu,P.,Scott,D.,Weinstein,J.,Ran,FA.,Konermann,S.,Agarwala,V.,Li,Y.,Fine,E.,Wu,X.,Shalem,O.,Cradick,TJ.,Marraffini,LA.,Bao,G.,& Zhang,F.Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647(2013);
・「CRISPR-Cas9系を用いたゲノムエンジニアリング(Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system)」.Ran,FA.,Hsu,PD.,Wright,J.,Agarwala,V.,Scott,DA.,Zhang,F.Nature Protocols Nov;8(11):2281-308(2013-B);
・「ヒト細胞におけるゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウトスクリーニング(Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells)」.Shalem,O.,Sanjana,NE.,Hartenian,E.,Shi,X.,Scott,DA.,Mikkelson,T.,Heckl,D.,Ebert,BL.,Root,DE.,Doench,JG.,Zhang,F.Science Dec 12.(2013).[Epub ahead of print];
・「ガイドRNAと標的DNAとを有する複合体におけるcas9の結晶構造(Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA)」.Nishimasu,H.,Ran,FA.,Hsu,PD.,Konermann,S.,Shehata,SI.,Dohmae,N.,Ishitani,R.,Zhang,F.,Nureki,O.Cell Feb 27,156(5):935-49(2014);
・「哺乳類細胞におけるCRISPRエンドヌクレアーゼCas9のゲノムワイドな結合(Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells)」.Wu X.,Scott DA.,Kriz AJ.,Chiu AC.,Hsu PD.,Dadon DB.,Cheng AW.,Trevino AE.,Konermann S.,Chen S.,Jaenisch R.,Zhang F.,Sharp PA.Nat Biotechnol.Apr 20.doi:10.1038/nbt.2889(2014);
・「ゲノム編集及び癌モデリングのためのCRISPR-Cas9ノックインマウス(CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling)」.Platt RJ,Chen S,Zhou Y,Yim MJ,Swiech L,Kempton HR,Dahlman JE,Parnas O,Eisenhaure TM,Jovanovic M,Graham DB,Jhunjhunwala S,Heidenreich M,Xavier RJ,Langer R,Anderson DG,Hacohen N,Regev A,Feng G,Sharp PA,Zhang F.Cell 159(2):440-455 DOI:10.1016/j.cell.2014.09.014(2014);
・「ゲノムエンジニアリングに向けたCRISPR-Cas9の開発及び適用(Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering)」,Hsu PD,Lander ES,Zhang F.,Cell.Jun 5;157(6):1262-78(2014)
・「CRISPR/Cas9系を用いたヒト細胞における遺伝子スクリーニング(Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system)」,Wang T,Wei JJ,Sabatini DM,Lander ES.,Science.January 3;343(6166):80-84.doi:10.1126/science.1246981(2014);
・「CRISPR-Cas9媒介性遺伝子不活性化のための高活性sgRNAの合理的設計(Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation)」,Doench JG,Hartenian E,Graham DB,Tothova Z,Hegde M,Smith I,Sullender M,Ebert BL,Xavier RJ,Root DE.,(オンライン発行 3 September 2014)Nat Biotechnol.Dec;32(12):1262-7(2014);
・「CRISPR-Cas9を用いた哺乳類脳における遺伝子機能のインビボ探索(In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9)」,Swiech L,Heidenreich M,Banerjee A,Habib N,Li Y,Trombetta J,Sur M,Zhang F.,(オンライン発行 19 October 2014)Nat Biotechnol.Jan;33(1):102-6(2015);
・「エンジニアリングされたCRISPR-Cas9複合体によるゲノム規模の転写活性化(Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex)」,Konermann S,Brigham MD,Trevino AE,Joung J,Abudayyeh OO,Barcena C,Hsu PD,Habib N,Gootenberg JS,Nishimasu H,Nureki O,Zhang F.,Nature.Jan 29;517(7536):583-8(2015)
・「誘導性ゲノム編集及び転写調節のためのスプリットCas9アーキテクチャ(A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation)」,Zetsche B,Volz SE,Zhang F.,(オンライン発行 02 February 2015)Nat Biotechnol.Feb;33(2):139-42(2015);
・「腫瘍成長及び転移マウスモデルにおけるゲノムワイドなCRISPRスクリーニング(Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis)」,Chen S,Sanjana NE,Zheng K,Shalem O,Lee K,Shi X,Scott DA,Song J,Pan JQ,Weissleder R,Lee H,Zhang F,Sharp PA.Cell 160,1246-1260,March 12,2015(マウスにおける多重スクリーニング)、及び
・「黄色ブドウ球菌Cas9を用いたインビボゲノム編集(In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9)」,Ran FA,Cong L,Yan WX,Scott DA,Gootenberg JS,Kriz AJ,Zetsche B,Shalem O,Wu X,Makarova KS,Koonin EV,Sharp PA,Zhang F.,(オンライン発行 01 April 2015),Nature.Apr 9;520(7546):186-91(2015)
・Shalem et al.,「CRISPR-Cas9を用いたハイスループット機能ゲノミクス(High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9)」,Nature Reviews Genetics 16,299-311(May 2015)
・Xu et al.,「改良CRISPR sgRNA設計の配列決定因子(Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design)」,Genome Research 25,1147-1157(August 2015)
・Parnas et al.,「初代免疫細胞におけるゲノムワイドなCRISPRスクリーニングによる調節ネットワークの分析(A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks)」,Cell 162,675-686(July 30,2015)
・Ramanan et al.,「ウイルスDNAのCRISPR/Cas9切断はB型肝炎ウイルスを効率的に抑制する(CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus)」,Scientific Reports 5:10833.doi:10.1038/srep10833(June 2,2015)
・Nishimasu et al.,「黄色ブドウ球菌Cas9の結晶構造(Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9)」,Cell 162,1113-1126(Aug.27,2015)
・Zetsche et al.(2015),「Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system」Cell 163,759-771(Oct.22,2015)doi:10.1016/j.cell.2015.09.038.Epub Sep.25,2015
・Shmakov et al.(2015),「Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems」Molecular Cell 60,385-397(Nov.5,2015)doi:10.1016/j.molcel.2015.10.008.Epub Oct 22,2015
・Yamano et al.,「Crystal structure of Cpf1 in complex with guide RNA and target RNA」Cell 165,949-962(May 5,2016)doi:10.1016/j.cell.2016.04.003.Epub Apr.21,2016
・Gao et al,「Engineered Cpf1 Enzymes with Altered PAM Specificities」bioRxiv 091611;doi:http://dx.doi.org/10.1101/091611 Epub Dec.4,2016
この各々が参照により本明細書に援用され、本発明の実施において考慮されてもよく、及び以下に簡単に考察する:
・Cong et al.は、サーモフィラス菌(Streptococcus thermophilus)Cas9及びまた化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9の両方に基づき、真核細胞で使用されるII型CRISPR/Cas系をエンジニアリングし、Cas9ヌクレアーゼが低分子RNAの指図を受けてヒト及びマウス細胞で正確なDNA切断を誘導し得ることを実証した。この著者らの研究は更に、ニッキング酵素に変換されるCas9を使用して、最小限の変異原活性を有する真核細胞での相同性組換え修復を促進し得ることを示した。加えて、この著者らの研究は、複数のガイド配列を単一のCRISPR配列にコードすることによって哺乳類ゲノム内の内在性ゲノム遺伝子座部位でいくつかを同時に編集することが可能となり得ることを実証し、RNAガイドヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性及び広範な適用性を実証した。このようにRNAを使用して細胞における配列特異的DNA切断をプログラムすることが可能となり、ゲノムエンジニアリングツールの新しいクラスが定義された。これらの研究は更に、他のCRISPR遺伝子座が哺乳類細胞に移植可能である可能性があり、哺乳類ゲノム切断も媒介し得ることを示した。重要なことに、CRISPR/Cas系のいくつかの側面を更に改良してその効率及び多用途性を高め得ることが想定され得る。
・Jiang et al.は、デュアルRNAと複合体を形成したクラスター化等間隔短鎖回分リピート(CRISPR)関連Cas9エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌(Streptococcus pneumoniae)及び大腸菌(Escherichia coli)のゲノムに正確な突然変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位におけるデュアルRNA:Cas9誘導切断によって非突然変異細胞を死滅させることに頼ったもので、選択可能マーカー又は対抗選択系の必要性が回避される。この研究は、単一及び複数のヌクレオチド変化が生じるように短鎖CRISPR RNA(crRNA)の配列を変えることによってデュアルRNA:Cas9特異性を再プログラム化すると、鋳型の編集が行われることを報告した。この研究は、2つのcrRNAを同時に使用すると突然変異誘発の多重化が可能であることを示した。更に、この手法を組換えと組み合わせて用いたとき、肺炎連鎖球菌(S.pneumoniae)では、記載される手法を用いて回収された細胞のほぼ100%が所望の突然変異を含み、大腸菌(E.coli)では回収された細胞の65%が突然変異を含んだ。
・Wang et al.(2013)はCRISPR/Cas系を用いることにより、胚性幹細胞における逐次的組換え及び/又は及び/又は時間のかかる単一突然変異を有するマウスの交雑による複数の段階で従来作成された複数の遺伝子に突然変異を保有するマウスを一段階で作成した。CRISPR-Cas系は機能的に重複する遺伝子及び上位遺伝子相互作用のインビボ研究を大幅に加速させ得る。
・Konermann et al.(2013)は、CRISPR Cas9酵素及びまた転写活性化因子様エフェクターに基づくDNA結合ドメインの光学的及び化学的調節を可能にする多用途の且つロバストな技術が当該技術分野で必要とされていることに対処した。
・Ran et al.(2013-A)は、Cas9ニッカーゼ突然変異体を対のガイドRNAと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するという手法を記載した。これは、微生物CRISPR-Cas系のCas9ヌクレアーゼがガイド配列によって特異的なゲノム遺伝子座に標的化されるが、ガイド配列はDNA標的との幾らかのミスマッチに耐えることができるため、従って望ましくないオフターゲット突然変異誘発を促進し得るという問題に対処する。ゲノム中の個々のニックは高いフィデリティーで修復されるため、二本鎖切断には適切にオフセットしたガイドRNAによる同時のニッキングが必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数が大きくなる。この著者らは、対のニッキングを使用して細胞系におけるオフターゲット活性を50~1,500分の1に減らし、オンターゲット切断効率を犠牲にすることなしにマウス接合体における遺伝子ノックアウトを促進し得ることを実証した。この多用途戦略により、高い特異性が要求される多種多様なゲノム編集適用が可能となる。
・Hsu et al.(2013)は、標的部位の選択を知らせ、且つオフターゲット効果を回避するためのヒト細胞におけるSpCas9ターゲティングの特異性を特徴付けた。この研究は、700個を超えるガイドRNA変異体並びに293T及び293FT細胞の100個を超える予測ゲノムオフターゲット遺伝子座におけるSpCas9誘導インデル突然変異レベルを評価した。この著者ら、SpCas9が、ミスマッチの数、位置及び分布に感受性を示して配列依存的に種々の位置におけるガイドRNAと標的DNAとの間のミスマッチに耐えること。この著者らは更に、SpCas9媒介性切断がDNAメチル化の影響を受けないこと、SpCas9及びgRNAの投与量を滴定してオフターゲット改変を最小限に抑え得ることを示した。加えて、哺乳類ゲノムエンジニアリング適用を促進するため、この著者らは、標的配列の選択及び検証並びにオフターゲット解析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールの提供を報告した。
・Ran et al.(2013-B)は、哺乳類細胞における非相同末端結合(NHEJ)又は相同性組換え修復(HDR)を用いたCas9媒介性ゲノム編集用並びに下流機能研究のための改変細胞系作成用の一組のツールを記載した。オフターゲット切断を最小限に抑えるため、この著者らは更に、対のガイドRNAを含むCas9ニッカーゼ突然変異体を使用した二重ニッキング戦略を記載した。この著者らによって提供されるプロトコルから、標的部位の選択、切断効率の評価及びオフターゲット活性の分析に関する指針が実験的に導かれた。この研究は、標的設計から始めて、僅か1~2週間以内に遺伝子改変を達成し得るとともに、2~3週間以内に改変クローン細胞系を誘導し得ることを示した。
・Shalem et al.は、ゲノムワイドな規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を記載した。この著者らの研究は、64,751個のユニークなガイド配列で18,080個の遺伝子を標的化するゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウト(GeCKO)ライブラリの送達が、ヒト細胞におけるネガティブ選択及びポジティブ選択の両方のスクリーニングを可能にしたことを示した。第一に、この著者らは、GeCKOライブラリを使用した、癌及び多能性幹細胞における細胞生存にとって不可欠な遺伝子の同定を示した。次に、この著者らは黒色腫モデルにおいて、その欠損が突然変異体プロテインキナーゼBRAFを阻害する治療薬ベムラフェニブに対する耐性に関わる遺伝子をスクリーニングした。この著者らの研究は、最も上位にランク付けされた候補に、以前検証された遺伝子NF1及びMED12並びに新規ヒットNF2、CUL3、TADA2B、及びTADA1が含まれたことを示した。この著者らは、同じ遺伝子を標的化する独立したガイドRNA間における高度な一致及び高率のヒット確認を観察し、従ってCas9によるゲノム規模スクリーニングの有望さを実証した。
・Nishimasu et al.は、2.5Åの分解能でsgRNA及びその標的DNAと複合体形成する化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9の結晶構造を報告した。この構造から、標的認識ローブとヌクレアーゼローブとで構成された、それらの界面にある正電荷の溝にsgRNA:DNAヘテロ二本鎖を受け入れる2ローブ構成が明らかになった。認識ローブはsgRNA及びDNAの結合に決定的に重要であるのに対し、ヌクレアーゼローブはHNH及びRuvCヌクレアーゼドメインを含み、これらのドメインは標的DNAのそれぞれ相補鎖及び非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブはまた、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含む。この高分解能構造解析及び付随する機能解析により、Cas9によるRNAガイド下DNAターゲティングの分子機構が明らかになることで、ひいては新規の多用途ゲノム編集技術の合理的な設計への道が開かれつつある。
・Wu et al.は、マウス胚性幹細胞(mESC)においてシングルガイドRNA(sgRNA)を負荷した化膿性連鎖球菌(Streptococcus pyogenes)由来の触媒不活性Cas9(dCas9)のゲノムワイドな結合部位をマッピングした。この著者らは、試験した4つのsgRNAの各々が、多くの場合にsgRNAにおける5ヌクレオチドシード領域及びNGGプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)によって特徴付けられる数十個ないし数千個のゲノム部位にdCas9を標的化することを示した。クロマチンが接触不可能であることにより、一致するシード配列を含む他の部位に対するdCas9結合が減少し;従ってオフターゲット部位の70%が遺伝子と会合する。この著者らは、触媒活性Cas9を形質移入したmESCにおける295個のdCas9結合部位の標的シーケンシングから、バックグラウンドレベルを上回って突然変異した部位は1つのみ同定されたことを示した。この著者らは、Cas9結合及び切断の2状態モデルを提案しており、このモデルではシードの一致が結合を引き起こすが、切断には標的DNAとの広範な対合が必要である。
・Platt et al.はCre依存性Cas9ノックインマウスを樹立した。この著者らは、ニューロン、免疫細胞、及び内皮細胞においてガイドRNAのアデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性、レンチウイルス媒介性、又は粒子媒介性送達を用いたインビボ並びにエキソビボゲノム編集を実証した。
・Hsu et al.(2014)は、細胞の遺伝子スクリーニングを含めたヨーグルトからゲノム編集に至るまでのCRISPR-Cas9の歴史を広く考察するレビュー論文である。
・Wang et al.(2014)は、ゲノム規模のレンチウイルスシングルガイドRNA(sgRNA)ライブラリを使用するポジティブ選択及びネガティブ選択の両方に好適なプールされた機能喪失型遺伝子スクリーニング手法に関する。
・Doench et al.は、6個の内因性マウス遺伝子及び3個の内因性ヒト遺伝子のパネルの可能な全ての標的部位にわたってタイリングするsgRNAのプールを作成し、その標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を抗体対比染色及びフローサイトメトリーによって定量的に評価した。この著者らは、PAMの最適化により活性が向上することを示し、また、sgRNAを設計するためのオンラインツールも提供した。
・Swiech et al.は、AAV媒介性SpCas9ゲノム編集により脳における遺伝子機能の逆遺伝学研究が可能となり得ることを実証している。
・Konermann et al.(2015)は、複数のエフェクタードメイン、例えば、転写アクチベーター、機能及びエピゲノム調節因子をステム又はテトラループなどのガイド上の適切な位置にリンカーを伴い及び伴わず付加する能力を考察している。
・Zetsche et al.は、Cas9酵素が2つにスプリットされることができ、ひいては活性化のためのCas9のアセンブリを制御し得ることを実証している。
・Chen et al.は、マウスにおけるゲノムワイドなインビボCRISPR-Cas9スクリーニングによって肺転移の調節遺伝子が明らかになることを実証することによる多重スクリーニングに関する。
・Ran et al.(2015)はSaCas9及びそのゲノム編集能力に関し、生化学アッセイからは推定できないことを実証している。
・Shalem et al.(2015)は、触媒的に不活性なCas9(dCas9)の融合物を用いて発現を合成的に抑制(CRISPRi)又は活性化(CRISPRa)する方法について記載し、アレイ化及びプール化されたスクリーニングを含めたゲノム規模のスクリーニング、ゲノム遺伝子座を不活性化させるノックアウト手法及び転写活性を調節するストラテジーにCas9を用いる進歩を示している。
・Xu et al.(2015)は、CRISPRベースのスクリーニングにおけるシングルガイドRNA(sgRNA)の効率に寄与するDNA配列特徴を評価した。この著者らは、CRISPR/Cas9ノックアウトの効率及び切断部位におけるヌクレオチド優先度を調査した。この著者らはまた、CRISPRi/aの配列優先度がCRISPR/Cas9ノックアウトのものと実質的に異なることも見出した。
・Parnas et al.(2015)は、ゲノムワイドなプールCRISPR-Cas9ライブラリを樹状細胞(DC)に導入することにより、細菌リポ多糖(LPS)による腫瘍壊死因子(Tnf)の誘導を制御する遺伝子を同定した。Tlr4シグナル伝達の既知の調節因子及びこれまで知られていない候補が同定され、LPSに対するカノニカルな応答への個別的な効果を有する3つの機能モジュールに分類された。
・Ramanan et al(2015)は、感染細胞におけるウイルスエピソームDNA(cccDNA)の切断を実証した。HBVゲノムは感染ヘパトサイトの核に、共有結合閉環状DNA(cccDNA)と呼ばれる3.2kbの二本鎖エピソームDNA種として存在し、cccDNAは、現在の治療法によってはその複製が阻害されないHBVライフサイクルの主要な構成成分である。この著者らは、HBVの高度に保存された領域を特異的に標的化するsgRNAがウイルス複製をロバストに抑制し、cccDNAを枯渇させることを示した。
・Nishimasu et al.(2015)は、5’-TTGAAT-3’PAM及び5’-TTGGGT-3’PAMを含有する、シングルガイドRNA(sgRNA)及びその二本鎖DNA標的との複合体中のSaCas9の結晶構造を報告した。SaCas9とSpCas9の構造比較により、構造的保存及び多様性の両方が明らかとなり、それらの特徴的なPAM特異性及びオルソロガスsgRNA認識が説明された。
・Zetsche et al.(2015)は、推定クラス2 CRISPRエフェクターであるCpf1の特徴付けを報告した。Cpf1はCas9と異なる特徴を有してロバストなDNA干渉を媒介することが実証された。この干渉機構の同定により、CRISPR-Cas系に関する我々の理解が深まり、そのゲノム編集適用が進歩する。
・Shmakov et al.(2015)は、3つの異なるクラス2 CRISPR-Cas系の特徴付けを報告した。同定された系のうちの2つのエフェクター、C2c1及びC2c3は、Cpf1と遠縁のRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを含む。第3の系、C2c2は、2つの予想HEPN RNアーゼドメインを有するエフェクターを含む。
・Gao et al.(2016)は、構造誘導型飽和突然変異誘発スクリーニングを用いてCpf1のターゲティング範囲を増加させることを報告した。AsCpf1変異体が、それぞれTYCV/CCCC及びTATV PAMを有する標的部位を切断することのできる突然変異S542R/K607R及びS542R/K548V/N552Rによってエンジニアリングされ、インビトロ及びヒト細胞における活性が増進した。
タンパク質調製:完全長AsCpf1をコードする遺伝子を改変pCold-GSTベクター(TaKaRa)のNdel及びXhol部位間にクローニングした。このタンパク質を20℃で大腸菌(Escherichia coli)Rosetta2(DE3)(Novagen)において発現させて、Ni-NTA Superflow樹脂(QIAGEN)によって精製した。溶出したタンパク質をTEVプロテアーゼと共に4℃で一晩インキュベートしてGSTタグを取り除き、Ni-NTA、Mono S(GE Healthcare)及びHiLoad Superdex 200 16/60(GE Healthcare)カラムで更にクロマトグラフィー精製した。ネイティブタンパク質についても同様のプロトコルを用いてSeMet標識タンパク質を調製した。PCR増幅鋳型を使用してcrRNAをT7ポリメラーゼによってインビトロ転写し、10%変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動で精製した。標的DNAはSigma-Aldrichから購入した。精製したCpf1タンパク質をcrRNA及びDNAと混合し(モル比1:1.5:2)、次にこの複合体を、10m_Mトリス-HCl、pH8.0、150mM NaCl及び1mM DTTを含有する緩衝液中、Superdex 200 Increaseカラム(GE Healthcare)を使用して精製した。
crRNA(24nt+SL)、標的DNA(24nt+10nt)及び非標的DNAのセグメント(10nt、TTTA PAM)と複合体化した突然変異D908Aを含むAsCpf1から、CRISPR-Cpf1複合体結晶構造を得た。
P212121:2.6A res(Insドメインはディスオーダー)
P41212:3.2A res
アシダミノコッカス属(Acidaminococcus)Cpf1の結晶構造は、AsCpf1結晶構造付属表に特徴付けられる。
Cpf1は、crRNAによって特異的ゲノム遺伝子座に標的化され得る微生物CRISPR-Cas系由来のRNAガイド下ヌクレアーゼである。本出願人らは、2.4A分解能におけるcrRNA及びその標的DNAと複合体化したAsCpf1の結晶構造を報告する(図1~図15)。
Cpf1-crRNA-DNA三元複合体の全体構造:本出願人らは、24ヌクレオチド(nt)+SL crRNA及び24+10nt標的DNA、10nt非標的DNA(TTTA PAM)と複合体化した完全長AsCpf1の結晶構造を、SeMet標識タンパク質を用いたSAD(単波長異常分散)法によって2.4A分解能で解いた。
試料調製。完全長AsCpf1(残基1~1307)をコードする遺伝子を改変pE-SUMOベクター(LifeSensors)のNdeI及びXhoI部位間にクローニングした。このAsCpf1タンパク質を20℃で大腸菌(Escherichia coli)Rosetta2(DE3)(Novagen)において発現させて、Ni-NTA Superflow樹脂(QIAGEN)及びHiTrap SP HPカラム(GE Healthcare)でクロマトグラフィー精製した。このタンパク質をTEVプロテアーゼと共に4℃で一晩インキュベートしてHis6-SUMOタグを取り除き、次にNi-NTAカラムに通過させた。このタンパク質をHiLoad Superdex 200 16/60カラム(GE Healthcare)で更にクロマトグラフィー精製した。セレノメチオニン(SeMet)標識AsCpf1タンパク質を大腸菌(E.coli)B834(DE3)(Novagen)において発現させて、ネイティブタンパク質と同様のプロトコルを用いて精製した。crRNAはGene Designから購入した。標的及び非標的DNA鎖はSigma-Aldrichから購入した。精製したAsCpf1タンパク質をcrRNA、標的DNA鎖、及び非標的DNA鎖(モル比、1:1.5:2.3:3.4)と混合し、次に再構成したAsCpf1-crRNA-標的DNA複合体を、10mMトリス-HCl(pH8.0)、150mM NaCl及び1mM DTTからなる緩衝液中、Superdex 200 Increaseカラム(GE Healthcare)でゲルろ過クロマトグラフィーによって精製した。
cggggctggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggtaacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcgagctcggtacccggggatcctttcgagctcggtacccggggatcctTTagagaagtcatttaataaggccactgttaaaaagcttggcgtaatcatggtcatagcagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccggaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggc
crRNAオリゴ
GTGGCCTTATTAAATGACTTCTCATCTACAAGAGTAGAAATTACCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTC
NGSプライマー
DNMT1-1_For GCTTAGAGCAGGCGTGCTGCA
DNMT1-1_Rev CTCAAACGGTCCCCAGAGGGTT
DNMT1-2_For TGAACGTTCCCTTAGCACTCTGCC
DNMT1-2_Rev CCTTAGCAGCTTCCTCCTCC
<<文献リスト>>
Claims (19)
- CRISPR-Cpf1系であって、
(a)Nucドメイン中に1つ以上の突然変異を含む改変されたCpf1エフェクタータンパク質、ここで、前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、ニッカーゼである、または前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質をコードする核酸の形態で提供される、および
(b)ダイレクトリピート配列に連結されたガイド配列を含むCpf1ガイド、ここで、前記ガイド配列は、標的配列にハイブリダイズ可能である、または、前記Cpf1ガイドをコードする核酸の形態で提供される、
を含み、
前記Cpf1エフェクタータンパク質は、アシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpf1のR1226に対応するアミノ酸残基に突然変異を含む、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記CRISPR-Cpf1系は、前記Cpf1ガイドおよび前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質を含む、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記CRISPR-Cpf1系は、前記Cpf1ガイドおよび前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質をコードするmRNAを含む、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記CRISPR-Cpf1系は、前記Cpf1ガイドおよび前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質をコードする1つ以上のベクターを含む、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、改変されたアシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)Cpf1である、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、改変されたラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)Cpf1である、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、改変されたフランシセラ・ノビシダ(Franscisella novicida)Cpf1である、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、改変されたアシダミノコッカス属種(Acidaminococcus sp.)BV3L6 Cpf1である、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、改変されたラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)ND2006 Cpf1、または改変されたラクノスピラ科細菌(Lachnospiraceae bacterium)MA2020 Cpf1である、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記突然変異はR1226Aである、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、少なくとも1つの核局在化シグナル(NLS)に融合している、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、少なくとも2つのNLSに融合している、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記改変されたCpf1エフェクタータンパク質は、異種タンパク質ドメインに融合している、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項13に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記異種タンパク質ドメインは、以下の活性:メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写解除因子活性、ヒストン修飾活性、ヌクレアーゼ活性、一本鎖RNA切断活性、二本鎖RNA切断活性、一本鎖DNA切断活性、二本鎖DNA切断活性、又は核酸結合活性、
の1つ以上を有する、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項13に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記異種タンパク質ドメインは、転写リプレッサー、転写アクチベーター、ヌクレアーゼドメイン、DNAメチルトランスフェラーゼ、タンパク質アセチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアセチラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、タンパク質デアミナーゼ、タンパク質キナーゼ、又はタンパク質ホスファターゼである、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記CRISPR-Cpf1系は、それぞれが異なる標的配列を標的化する2つ以上のCpf1ガイドを含む、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系であって、
前記CRISPR-Cpf1系は、前記標的配列の少なくとも5ヌクレオチドと重複する鋳型ポリヌクレオチドをさらに含む、
CRISPR-Cpf1系。 - 請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系を含む単離された非ヒト真核細胞。
- 非ヒト真核細胞中の標的鎖および非標的鎖を含む二本鎖DNA分子を改変するインビトロの方法であって、
請求項1に記載のCRISPR-Cpf1系を非ヒト真核細胞に送達するステップを含み、
ここで、前記Cpf1ガイドは、非ヒト真核細胞の核中のプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)に隣接する二本鎖DNA分子の標的解列へのCRISPR-Cpf1複合体の配列特異的結合を導き、
CRISPR-Cpf1複合体が非標的鎖を切断するが、標的鎖を切断しない、
方法。
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